KR20200031676A - 안정된 항체 조성물 및 이들을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 안정된 액체 재조합 단백질, 예를 들면, 항원 결합 단백질, 조성물 및 5%보다 적은 산소를 포함하는 공간부분 가스를 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물, 그리고 이들을 생산하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 안정된 액체 재조합 단백질 조성물 및 21%보다 적은 산소를 포함하는 공간부분 가스를 포함하는 밀봉된 용기에서 약물 산물의 공간부분에서 산소 수준을 제어하기 위한 방법을 제공한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 액체 항체 조성물, 그리고 용기의 공간부분에서 산화 가스의 수준을 최소화하고 및/또는 제어함으로써 이런 조성물을 생산하는 방법에 관계하는데, 여기서 상기 조성물은 투여에 앞서 충전되고 보관된다.
배경
단일특이적 및 이중특이적 항체를 비롯한 항체 치료제가 암 및 자가면역 장애의 치료를 비롯한, 다양한 질환과 장애의 치료를 위해 계속 개발되고 있다. 항체 효능은 특정한 표적을 향해 지향된 항체 분자의 생산에서 정밀화로 인해 증가하고 있다. 작은 용적 투여의 경우에 높은 농도에서, 또는 고효능 치료제의 경우에 낮은 농도에서 보관되는 지에 상관없이, 항체 분자는 약물 산물 용기, 예를 들면, 바이알에서 충전되고 보관되고, 그리고 주입기를 통해 투여되는 액체 제제 내에 있을 때 산화에 감수성일 수 있다. 산화 또는 다른 분해성 과정에 기인한 생물학적으로 활성 작용제의 상실을 최소화하기 위해 안정된 조성물을 유지하는 중요성은 International Conference on Harmonisation of Technical Requirements For Registration of Pharmaceuticals For Human Use (ICH)에 의해 강조된다. ICH 설명서 (Q6A 및 Q6B)에 따르면, 만약 약물 물질이 온당한 분석적 방법론을 통해 증명된 바와 같이, 특정한 제제에서 및 신약 허가 신청서에서 제안된 특정한 보관 조건 하에 분해되지 않으면, 분해 산물 검사가 규제 당국에 의한 승인 시에 축소되거나 또는 제거될 수 있다.
약물 산물 용기의 공간부분에서 "공기"를 대체하기 위한 질소 또는 비활성 가스 (가령, 아르곤)의 이용이 당해 분야에서 논의되었다. EP1174148은 2 mg/ml의 농도에서 Fab 단편 조성물의 제조를 논의하는데, 여기서 각 바이알의 가스 공간부분은 실험실 규모 동결건조 챔버 (다시 말하면, 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 표준에 적합하지 않음)에서 반복된 주기를 통해 질소로 일소되었다. EP1174148은 질소 퍼지 이후에 공간부분 가스의 산소 농도를 언급하지 않을 뿐만 아니라 공간부분에서 산소 함량을 미리 규정된 목표 수준으로 제어하기 위한 보도를 제공하지 않고, 고분자량 (HMW) 불순물의 존재에서 유의미한 백분율 증가가 가속 안정성 보관 조건 (가령, 40 ℃에서 1 개월 동안) 하에 관찰되었다. 여러 실례에서, 40 ℃에서 1 개월 후 HMW 종류에서 증가는 300%를 초과하였고 (표 1), 반면 40 ℃에서 3 개월 동안 보관은 HMW 종류에서 14-배보다 많은 증가를 발생시켰다 (표 4). 유사하게, US 2016/0129028은 다당류의 안정성을 유지하기 위한 질소 오버레이 과정의 이용을 논의하고, 그리고 US 2012/0183531은 히스티딘 완충액의 산화에 기인한 황색 형성을 예방하거나 또는 저해하기 위해 질소 또는 비활성 가스를 이용한, 단백질 약물 산물의 공간부분에서 산소의 감소 또는 대체를 논의한다. 산화에 기인한 약물 산물의 분해의 발생 또는 충격을 감소시키는 신뢰할 수 있는 방법이 제약 산업에서 요구된다.
발명의 간단한 요약
첫 번째 양상에서, 본 발명은 액체 제제에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질 또는 항체) 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물을 제공하는데, 여기서 상기 가스는 부피로 5%보다 적은 산소를 포함하고, 그리고 상기 재조합 단백질은 45℃에서 보관될 때 최소한 28 일의 기간 동안 안정된다. 이러한 문맥에서, 최소한 28 일 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 2% 이내의 증가를 지칭한다.
일부 경우에, 가스는 부피로 2% 이내의 산소, 부피로 1% 이내의 산소, 부피로 1%보다 적은 산소, 또는 부피로 0.1% 이내의 산소를 포함한다.
일정한 구체예에서, 약물 산물의 액체 제제는 약 2 mg/ml 내지 200 mg/ml 사이의 농도에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질)을 내포한다. 일부 구체예에서, 약물 산물의 액체 제제는 150-200 mg/ml 사이의 농도에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질)을 내포한다. 일부 구체예에서, 약물 산물의 액체 제제는 10 mg/ml보다 적은, 5 mg/ml보다 적은, 또는 2 mg/ml보다 적은 농도에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질)을 내포한다.
일부 구체예에서, 약물 산물은 45℃에서 보관될 때 최소한 3 개월의 기간 동안 안정되는 재조합 단백질을 내포하는데, 여기서 최소한 3 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 10% 이내의 증가를 지칭한다. 일부 경우에, 재조합 단백질의 안정성은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 5% 이내의 증가, 또는 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 1%보다 적은 증가를 지칭한다.
다른 양상에서, 본 발명은 액체 제제에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질 또는 항체) 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물을 제공하는데, 여기서 상기 가스는 부피로 1%보다 적은 산소를 포함하고, 그리고 상기 재조합 단백질은 5℃에서 보관될 때 최소한 31 개월의 기간 동안 안정된다. 이러한 문맥에서, 최소한 31 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 주요 충전 변이체 종류의 백분율에서 10% 이내의 변화를 지칭한다.
다른 양상에서, 본 발명은 액체 제제에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질) 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물을 제공하는데, 여기서 상기 가스는 부피로 1%보다 적은 산소를 포함한다. 일부 구체예에서, 가스는 부피로 0.1% 이내의 산소를 포함한다. 일부 구체예에서, 재조합 단백질은 액체 제제에서 5 mg/ml보다 적은 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 단백질은 액체 제제에서 약 2 mg/ml의 농도로 존재한다. 일부 구체예에서, 재조합 단백질은 액체 제제에서 2 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 또는 약 1 mg/ml보다 적은 농도로 존재한다.
상기 또는 본원에서 논의된 약물 산물의 다양한 구체예에서, 재조합 단백질은 항원 결합 단백질이다. 일부 경우에, 항원 결합 단백질은 항체이다. 일부 경우에, 항체는 단일특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 경우에, 약물 산물 용기는 바이알이다. 일정한 구체예에서, 바이알은 벤트 레그를 포함하는 마개, 예를 들면, 고무 마개를 포함한다. 일부 경우에, 약물 산물은 주입기를 통해 더욱 투여되거나, 또는 주입기 또는 주사 장치로 이전된다.
다른 양상에서, 본 발명은 액체 제제에서 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질 또는 항체) 및 감소된 산소 함량을 갖는 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기를 포함하고: (a) 재조합 단백질의 액체 제제를 내포하는 하나 또는 그 이상의 용기를 대기압 하에 진공 챔버 내로 부하하고; (b) 상기 챔버를 0.05 bar 내지 0.15 bar의 첫 번째 압력에서 배기시키고; (c) 상기 챔버를 800 mbar 내지 1000 mbar의 두 번째 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고; 그리고 (d) 하나 또는 그 이상의 용기를 밀봉된 진공 챔버 내부에 밀봉하고, 여기서 상기 방법은 15-25℃ 범위의 온도에서 수행되고, 그리고 상기 밀봉된 용기는 부피로 5%보다 적은 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 용기를 밀봉하기에 앞서, 단계 (b)와 (c)를 1회 또는 그 이상의 추가 횟수로 반복하는 것을 더욱 포함한다.
일부 경우에, 첫 번째 압력은 약 0.1 bar이고 및/또는 두 번째 압력은 0.2 bar 내지 0.1 bar, 또는 0.1 bar 내지 0.12 bar이다. 일부 구체예에서, 챔버에서 압력은 피라니 진공 게이지를 통해 계측된다. 일부 구체예에서, 온도는 약 19℃이다.
추가 구체예에서, 마개는 불활성 가스 오버레이에 앞서 부분적으로 막히고, 이후 불활성 가스 오버레이 과정후 완전히 막히고 밀봉될 수 있다. 일부 경우에, 밀봉된 용기는 부피로 2%보다 적은 산소, 부피로 1%보다 적은 산소, 또는 부피로 0.1% 이내의 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 방법에 따라서 제조된 약물 산물에서 액체 제제는 2 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도에서 재조합 단백질을 내포한다. 다른 구체예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 방법에 따라서 제조된 약물 산물에서 액체 제제는 150-200 mg/ml의 농도에서 재조합 단백질을 내포한다. 일부 구체예에서, 상기 또는 본원에서 논의된 방법에 따라서 제조된 약물 산물에서 액체 제제는 10 mg/ml보다 적은, 5 mg/ml보다 적은, 또는 2 mg/ml보다 적은 농도에서 재조합 단백질을 내포한다.
상기 또는 본원에서 논의된 방법의 다양한 구체예에서, 재조합 단백질은 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 일부 경우에, 항체는 단일특이적 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
일부 경우에, 본 발명의 방법에서 이용된 약물 산물 용기는 바이알이다. 추가 구체예에서, 바이알은 벤트 레그를 갖는, 동결건조된 산물용 고무 마개를 포함한다 (이것은 불활성 가스 오버레이에 앞서 부분적으로 막히고, 이후 불활성 가스 오버레이 과정후 완전히 막히고 밀봉될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 액체 제약학적 제제를 내포하는 밀봉된 용기의 공간부분에서 산소 함량을 제어하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 밀봉된 용기의 공간부분에서 원하는 최종 산소 함량을 결정하고; (b) 산소 환원의 첫 번째 주기 이후에 종료 산소 함량 %를 방정식 (I)을 통해 계산하고:
(I)
여기서 %O2,시작은 첫 번째 주기의 시작 시점에서 산소 함량 %이고, P진공은 산소 환원의 첫 번째 주기에서 적용된 배기 압력이고, P환기는 P진공보다 높지만 1 bar보다 낮은 압력이고, 그리고 %O2 . 종료는 첫 번째 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이고; (c) 원하는 최종 산소 함량이 도달될 때까지, 방정식 (I)을 추가 주기 (여기서 %O2,시작은 선행 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이다)에 임의선택적으로 적용하고; 그리고 (d) 하기에 의해 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조함: (i) 진공 챔버에서 개봉된 용기를 P진공에서 배기시킴으로써 산소 환원의 하나 또는 그 이상의 주기를 수행하고, 여기서 P진공은 0.05 bar 내지 0.15 bar의 압력이고, 그리고 진공 챔버에서 개봉된 용기를 800 mbar 내지 1000 mbar의 환기 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고; 그리고 (ii) 용기를 밀봉된 동결건조 챔버 내부에 밀봉함.
만약 약물 산물의 공간부분에서 산소 %에 대한 요건이 낮으면 (가령, 대략 2% 미만), 산소 함량의 목표 수준을 달성하기 위해 복수 산소 환원 주기가 수행된다. 동일한 진공 압력 및 환기 압력을 이용한 복수 산소 환원 주기 후 산소 함량 %는 방정식 (II)를 통해 규정된다.
(II)
여기서 %O2,시작은 첫 번째 주기의 시작 시점에서 산소 함량 %이고, P진공은 산소 환원의 주기에서 적용된 배기 압력이고, P환기는 불활성 가스로 환기의 압력이고, 그리고 %O2.최종은 복수 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이고; 그리고 n은 산물에 적용된 전체 산소 환원 주기의 횟수이다. 이런 이유로, 바이알의 공간부분에서 최종 산소 수준을 달성하는데 필요한 산소 환원 주기의 횟수는 방정식 (II)를 해결함으로써 획득된다.
상기 또는 본원에서 논의된 방법의 다양한 구체예에서, 비-산화 가스는 질소, 아르곤, 헬륨, 크세논, 네온, 크립톤 및 라돈으로 구성된 군에서 선택된다. 한 구체예에서, 비-산화 가스는 질소이다. 한 구체예에서, 비-산화 가스는 아르곤이다.
상기 또는 본원에서 논의된 다양한 구체예는 본 발명과 일치하는 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 다른 구체예는 뒤이은 상세한 설명에 관한 리뷰로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 5 ℃에서 31 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 CEX-UPLC에 의한 주요 충전 변이체 종류에서 변화 %를 도해한다.
도 2는 본원에서 논의된 방법에 따라서, 질소 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 28 일의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
도 3은 본원에서 논의된 방법에 따라서, 질소 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 3 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
도 4는 본원에서 논의된 방법에 따라서, 아르곤 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 3 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
도 1은 5 ℃에서 31 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 CEX-UPLC에 의한 주요 충전 변이체 종류에서 변화 %를 도해한다.
도 2는 본원에서 논의된 방법에 따라서, 질소 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 28 일의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
도 3은 본원에서 논의된 방법에 따라서, 질소 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 3 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
도 4는 본원에서 논의된 방법에 따라서, 아르곤 오버레이를 이용하여 45 ℃에서 3 개월의 보관 이후에 이중특이적 항체의 액체 제제에 대한 산소 공간부분 함량의 함수로서 고분자량 종류에서 증가 %를 도해한다.
상세한 설명
본 발명을 설명하기에 앞서, 본 발명은 설명된 특정 방법과 실험 조건에 한정되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 이런 방법과 조건이 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 특정한 구체예를 단지 설명하기 위한 것이고, 그리고 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.
별도로 규정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 특정 언급된 수치 값과 관련하여 이용될 때 용어 "약"은 상기 값이 언급된 값으로부터 1% 이내에서 변할 수 있다는 것을 의미한다. 가령, 본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99 및 101, 그리고 중간에 모든 값 (가령, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
비록 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법과 재료가 본 발명의 실시 또는 검사에서 이용될 수 있긴 하지만, 바람직한 방법과 재료가 지금부터 설명된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
정의
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리되는 모든 단백질, 예를 들면, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 단백질을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "항원 결합 분자" 또는 "항원 결합 단백질"은 예로서, 단일특이적 및 이중특이적 항체를 비롯한, 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 이것과 상호작용하는 최소한 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 디설피드 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 무거운 (H) 사슬 및 2개의 가벼운 (L) 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이들의 다합체 (가령, IgM)를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)을 포함한다. VH와 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명된 더욱 보존되는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDRs)으로 명명된 초가변성의 영역으로 더욱 세분화될 수 있다. 각 VH와 VL은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구체예에서, 항체 (또는 이의 항원 결합 부분)의 FRs는 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인위적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 또는 그 이상의 CDRs의 병렬 분석에 근거하여 규정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한, 완전 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연발생, 효소적으로 획득가능, 합성, 또는 유전적으로 가공된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 예로서, 임의의 적합한 표준 기술, 예를 들면, 단백질분해 소화, 또는 항체 가변 및 임의선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작과 발현을 수반하는 재조합 유전공학 기술을 이용하여 완전 항체 분자로부터 도출될 수 있다. 이런 DNA는 알려져 있고 및/또는 예로서, 상업적인 공급원, DNA 라이브러리 (가령, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 가용하거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는 염기서열결정되고, 그리고 예로서, 하나 또는 그 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 형상으로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 창출하고, 아미노산을 변형하거나, 부가하거나 또는 결실시키고, 기타 등등을 위해, 화학적으로 또는 분자생물학 기술을 이용함으로써 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 무제한적 실례는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 그리고 (vii) 항체의 초가변 영역 (가령, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예를 들면, CDR3 펩티드)을 모의하는 아미노산 잔기, 또는 제약된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 구성되는 최소 인식 단위. 다른 가공된 분자, 예를 들면, 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-합체된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (가령, 일가 나노바디, 이가 나노바디 등), 작은 모듈식 면역약제 (SMIPs), 그리고 상어 가변 IgNAR 도메인 역시 본원에서 이용된 바와 같은 표현 "항원 결합 단편" 내에 포괄된다.
항체의 항원 결합 단편은 전형적으로, 최소한 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 그리고 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 또는 이들과 인프레임으로 존재하는 최소한 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연관된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH와 VL 도메인은 임의의 적합한 배열에서 서로에 상대적으로 위치될 수 있다. 가령, 가변 영역은 이합체성이고, 그리고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이합체를 내포할 수 있다. 대안으로, 항체의 항원 결합 단편은 단위체성 VH 또는 VL 도메인을 내포할 수 있다.
일정한 구체예에서, 항체의 항원 결합 단편은 최소한 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 최소한 하나의 가변 도메인을 내포할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는, 가변과 불변 도메인의 무제한의 예시적인 형상은 하기를 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 그리고 (xiv) VL-CL. 상기 열거된 예시적인 형상 중에서 어느 것을 비롯한, 가변과 불변 도메인의 임의의 형상에서, 가변과 불변 도메인은 서로 직접적으로 연결될 수 있거나, 또는 완전한 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 유연한 또는 반-유연한 연쇄를 유발하는 최소한 2개 (가령, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 게다가, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 서로 및/또는 하나 또는 그 이상의 단위체성 VH 또는 VL 도메인과의 비공유 연관 (가령, 디설피드 결합(들)에 의한)으로, 상기 열거된 가변과 불변 도메인 형상 중에서 어느 것의 동종이합체 또는 이종이합체 (또는 다른 다합체)를 포함할 수 있다.
완전 항체 분자에서처럼, 항원 결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적 (가령, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 전형적으로, 최소한 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것인데, 여기서 각 가변 도메인은 별개의 항원에 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 개시된 예시적인 이중특이적 항체 형식을 비롯한, 임의의 다중특이적 항체 형식이 당해 분야에서 가용한 일과적인 기술을 이용하여, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 이용을 위해 적합될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 예로서, CDRs 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기 (가령, 시험관내에서 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해, 또는 생체내에서 체성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 다른 포유류 종, 예를 들면, 생쥐의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위에 합체된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항체는 일부 구체예에서, 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들면, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체 (아래에 더욱 설명됨), 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (아래에 더욱 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자도입된 동물 (가령, 생쥐)로부터 단리된 항체 (참조: 가령, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), 또는 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리되는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이런 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역을 갖는다. 일정한 구체예에서, 하지만, 이런 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자도입된 동물이 이용될 때, 생체내 체성 돌연변이유발)에 종속되고, 그리고 따라서, 상기 재조합 항체의 VH와 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH와 VL 서열로부터 유래되고 이들에 관련되긴 하지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이질성과 연관되는 2가지 형태에서 존재할 수 있다. 한 형태에서, 면역글로불린 분자는 대략 150-160 kDa의 안정된 4개 사슬 작제물을 포함하는데, 여기서 이들 이합체는 사슬간 중쇄 디설피드 결합에 의해 묶인다. 두 번째 형태에서, 이합체는 사슬간 디설피드 결합을 통해 연결되지 않고, 그리고 공유적으로 연계된 경쇄와 중쇄 (절반 항체)로 구성된 약 75-80 kDa의 분자가 형성된다. 이들 형태는 친화성 정제 이후에도, 분리하기가 극히 어렵다.
다양한 무손상 IgG 아이소타입에서 두 번째 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 아이소타입과 연관된 구조적 차이에 기인하지만 이것에 한정되지 않는다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서 단일 아미노산 치환은 두 번째 형태의 출현 (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105)을, 인간 IgG1 힌지를 이용할 때 전형적으로 관찰되는 수준까지 유의미하게 감소시킬 수 있다. 본 발명은 힌지, CH2 또는 CH3 영역에서 한 가지 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포괄하는데, 이들은 예로서, 생산 동안, 원하는 항체 형태의 수율을 향상시키는데 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "단리된 항체"는 이의 자연 환경의 최소한 한 가지 성분으로부터 확인되고 분리되고 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 가령, 생물체의 최소한 한 가지 성분으로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 또는 자연적으로 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 또는 이전된 항체는 본 발명을 위해 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 또한, 재조합 세포 내에 원지에서 항체를 포함한다. 단리된 항체는 최소한 1회의 정제 또는 단리 단계에 종속되었던 항체이다. 일정한 구체예에 따라서, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실제적으로 없을 수 있다.
본 발명은 또한, 특이적 항원에 결합하는 외팔 항체를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "외팔 항체"는 단일 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자를 의미한다.
용어 "에피토프"는 파라토프로서 알려져 있는, 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정인자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상에서 상이한 구역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체형태적 또는 선형일 수 있다. 입체형태적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산되는 것이다. 일정한 환경에서, 에피토프는 항원 상에서 당류, 포스포릴 기, 또는 술포닐 기의 모이어티를 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때, 용어 "실제적인 동일성" 또는 "실제적으로 동일한"은 다른 핵산 (또는 이의 상보성 가닥)과 온당한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 맞추어 최적으로 정렬될 때, 아래에 논의된 바와 같은 서열 동일성의 임의의 널리 알려진 알고리즘, 예를 들면, FASTA, BLAST 또는 Gap에 의한 계측에서, 뉴클레오티드 염기의 최소한 약 95%, 그리고 더욱 바람직하게는 최소한 약 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다는 것을 지시한다. 참조 핵산 분자에 실제적인 동일성을 갖는 핵산 분자는 일정한 사례에서, 참조 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 동일한 또는 실제적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "실제적인 유사성" 또는 "실제적으로 유사한"은 2개의 펩티드 서열이 예로서, 디폴트 갭 가중을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 최소한 95% 서열 동일성, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환에 의해 다르다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (가령, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실제적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 또는 그 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로 다른 경우에, 서열 동일성 퍼센트 또는 유사성의 정도는 상기 치환의 보존성 본성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 당업자에게 널리 공지된다. 참조: 가령, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 (본원에서 참조로서 편입됨). 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 실례는 하기를 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-내포 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루타민산염, 그리고 (7) 황-내포 측쇄는 시스테인 및 메티오닌임. 바람직한 보존성 아미노산 치환 기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타민산염-아스파르트산염, 그리고 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존성 대체는 본원에서 참조로서 편입되는 Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445에서 개시된 PAM250 대수 우도 행렬에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도로 보존성" 대체는 PAM250 대수 우도 행렬에서 비음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로서 또한 지칭되는, 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 전형적으로, 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 계측된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존성 아미노산 치환을 비롯한, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 배정된 유사성의 척도를 이용하여 유사한 서열을 정합시킨다. 가령, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련된 폴리펩티드, 예를 들면, 생물체의 상이한 종으로부터 상동성 폴리펩티드 사이에 또는 야생형 단백질 및 이의 돌연변이단백질 사이에 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 파라미터에서 이용될 수 있는 프로그램, 예를 들면, Gap 및 Bestfit를 내포한다. 참조: 가령, GCG 버전 6.1. 폴리펩티드 서열은 또한, GCG 버전 6.1에서 프로그램인, 디폴트 또는 권장된 파라미터를 이용한 FASTA를 이용하여 비교될 수 있다. FASTA (가령, FASTA2 및 FASTA3)는 조회와 검색 서열 사이에 최고 겹침의 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다 (Pearson (2000) 위와 같음). 상이한 생물체로부터 다수의 서열을 내포하는 데이터베이스에 본 발명의 서열을 비교할 때, 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 이용한 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 참조: 가령, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (이들은 각각 본원에서 참조로서 편입됨).
재조합 단백질을 포함하는 약물 산물 및 조성물
본 발명의 약물 산물은 밀봉된 용기 (가령, 바이알)를 포함하는데, 여기서 공간부분에서 가스는 산화 가스 (가령, 산소)의 대기 농도와 비교하여 감소된 농도의 산화 가스를 갖는다. 본 발명의 약물 산물은 재조합 단백질 (가령, 항원 결합 단백질 또는 항체)의 액체 제약학적 제제를 내포하는 약물 산물 용기의 공간부분에서 산화 가스의 수준을 감소시키기 위한 방법에 관한 본 발명자들의 발견에 근거된다. 표준 동결건조 기술과는 대조적으로, 액체 조성물 위에서 공간부분 가스의 배기와 환기는 재료의 손실을 유발할 수 있는 액체 조성물의 발포 또는 튀김, 또는 활성제 (가령, 항체)의 농도에서 변화를 유발할 수 있는 증발을 최소화하거나 또는 제거하기 위해 진공 챔버에서 압력의 미세 조정을 필요로 한다. 재료의 손실 또는 농도에서 변화는 활성제가 낮은 농도 (가령, 약 2 mg/ml)에서 존재하는 고효능 조성물의 경우에 특히 문제가 된다. 높은 농도 제제의 안정성에서 변화는 문제가 되는데, 그 이유는 산화 분해 산물이 복잡한 순도/불순물 프로필을 유발하여, 면역원성 우려를 아마도 야기할 수 있기 때문이다.
본 발명의 약물 산물은 일부 구체예에서 부피로 5%보다 적은 산화 가스 (가령, 산소)를 갖는 공간부분 가스를 내포할 수 있다. 약물 산물 용기의 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 농도는 다양한 구체예에서 4.5%보다 적거나, 4%보다 적거나, 3.5%보다 적거나, 3%보다 적거나, 2.5%보다 적거나, 2%보다 적거나, 또는 1.5%보다 적을 수 있다. 한 구체예에서, 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 농도는 약 1%보다 적다. 한 구체예에서, 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 농도는 약 0.5% 이내이다. 한 구체예에서, 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 농도는 약 0.1% 이내이다. 다양한 구체예에서, 약물 산물 용기의 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 농도는 0.9%보다 적거나, 0.8%보다 적거나, 0.7%보다 적거나, 0.6%보다 적거나, 0.5%보다 적거나, 0.4%보다 적거나, 0.3%보다 적거나, 0.2%보다 적거나, 또는 0.1%보다 적다. 일부 경우에, 공간부분 가스에서 산소의 농도는 약 0.01% 내지 약 1.5%이다. 일부 경우에, 공간부분 가스에서 산소의 농도는 약 0.75% 내지 약 1.25%이다. 일부 경우에, 공간부분 가스에서 산소의 농도는 약 0.05% 내지 약 0.15%이다.
본원에서 설명된 용기는 원하는 양의 제약학적 제제 및 공간부분을 수용하기 위한 충분한 용적을 갖는 바이알, 플라스크 등일 수 있다. 용기는 그 안에 내포되는 제약학적 제제에 대하여 비활성 특징을 전시하고, 그리고 제약학적 제제의 누출 또는 주위 공기의 침투를 예방할 만큼 충분히 불투과성인 다양한 적합한 물질로부터 형성될 수 있다. 예시적인 물질은 유리 (가령, 폴리카보네이트 폴리스티렌 폴리프로필렌 유리), 중합체 (가령, 플라스틱, 백금 처리된 실리콘 배관) 및 금속 (가령, 스테인리스강 316L)을 포함한다. 일부 구체예에서, 용기는 유형 1 유리 바이알이다. 추가적으로, 용기는 원하는 대로, 재활용가능 성분, 또는 단일 이용 일회용 성분으로서 설정될 수 있다. 벤트 레그(들)를 갖는 고무 마개에 대한 복수 설계가 가용하고, 그리고 본원에서 설명된 방법에서 이용을 위해 적합된 동결건조 바이알용으로 적합하다. 1개의 벤트 레그 (단일 벤트), '2개-레그' (2개 벤트 포인트), '3개-레그' (3개 벤트 포인트), 그리고 십자형 (4개 벤트-포인트) 또는 심지어 더욱 많은 벤트를 포함하는 마개가 상업적으로 가용하다. 동결건조 챔버에서 바이알에서 이용을 위한 마개는 벤트(들)가 가스 오버레이/산소 환원 과정 동안 외부 공간에 열린 상태에서 부분적으로 막히고, 그리고 이후, 하나 또는 그 이상의 산소 환원 주기 이후에 완전히 막히고 용기와 접속하여 밀봉될 수 있다.
본 발명의 약물 산물은 본 발명의 항원 결합 분자 (가령, 항체)를 포함하는 액체 제약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 향상된 전송, 전달, 내성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제 및 기타 작용제로 조제된다. 다수의 적절한 제제가 모든 약사에게 공지된 처방집에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 가령, 부형제는 안정제, 완충액, 강장제, 계면활성제, 유기 용매, 염 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 안정제는 폴리올, 당, 아미노산, 비이온성 계면활성제, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 강장제는 당, 아미노산, 염, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 완충액은 히스티딘, 인산염, 구연산염, 숙신산염, 아세트산염, 탄산염, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
액체 조성물에서 항원 결합 분자 (가령, 항체)의 농도는 상기 분자의 효능 및 약물 산물 용기로부터 투여되는 용량에 따라서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 5 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 0.1 mg/ml 내지 약 2 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 다양한 구체예에서, 농도는 약 25 mg/ml보다 적거나, 약 20 mg/ml보다 적거나, 약 15 mg/ml보다 적거나, 약 10 mg/ml보다 적거나, 또는 약 5 mg/ml보다 적다. 다양한 구체예에서, 액체 조성물에서 항원 결합 분자의 농도는 약 5 mg/ml 이내, 약 4 mg/ml 이내, 약 3 mg/ml 이내, 약 2 mg/ml 이내, 또는 약 1 mg/ml 이내이다. 한 구체예에서, 농도는 약 2 mg/ml보다 적다. 한 구체예에서, 농도는 약 1 mg/ml보다 적다.
액체 조성물에서 항원 결합 분자 (가령, 항체)의 농도는 약물 산물 용기로부터 투여되는 용적 및 용량에 따라서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 100 mg/ml 내지 약 150 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 일부 경우에, 농도는 약 150 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위에서 변할 수 있다. 한 구체예에서, 농도는 약 10 mg/ml보다 크다. 다른 구체예에서, 농도는 약 50 mg/ml보다 크다. 다른 구체예에서, 농도는 약 100 mg/ml보다 적다. 한 구체예에서, 농도는 약 150 mg/ml보다 크다.
환자에게 투여되는 항원 결합 분자의 용량은 환자의 연령과 크기, 표적 질환 상태, 투여 루트 등에 따라서 변할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로, 체중 또는 체표면적에 따라서 계산된다. 본 발명의 항원 결합 분자가 성인 환자에서 치료 목적에 이용될 때, 통상적으로 약 0.01 내지 약 20 mg/체중 kg, 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/체중 kg의 단일 용량에서 본 발명의 항원 결합 분자를 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 질환의 심각도에 따라서, 치료의 빈도와 지속 기간이 조정될 수 있다. 항원 결합 분자를 투여하기 위한 효과적인 용량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있다; 예를 들면, 환자 진행이 주기적 사정에 의해 모니터링될 수 있고, 그리고 용량이 그에 따라서 조정될 수 있다. 게다가, 용량의 종간 척도화가 당해 분야에서 널리 알려진 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (가령, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut . Res. 8:1351).
본 발명의 제약학적 조성물은 표준 바늘 및 주입기로 피하 또는 정맥내 전달될 수 있다. 이에 더하여, 피하 전달에 대하여, 펜 전달 장치가 본 발명의 제약학적 조성물을 전달하는데 쉽게 적용된다. 이런 펜 전달 장치는 재활용가능 또는 일회용일 수 있다. 재활용가능 펜 전달 장치는 일반적으로, 제약학적 조성물을 내포하는 교체가능 카트리지를 활용한다. 일단 카트리지 내에 모든 제약학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비게 되면, 비어 있는 카트리지는 쉽게 폐기되고 제약학적 조성물을 내포하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 펜 전달 장치는 이후, 재활용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체가능 카트리지가 없다. 더 정확히 말하면, 일회용 펜 전달 장치는 상기 장치 내에 보관소에서 유지된 제약학적 조성물로 미리 채워진다. 일단 제약학적 조성물이 보관소에서 비워지면, 전체 장치가 폐기된다.
주사가능 액체 제조물은 정맥내, 피하, 피내와 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 약형을 포함할 수 있다. 이들 주사가능 제조물은 공개적으로 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 가령, 주사가능 제조물은 주사에 전통적으로 이용되는 무균 수성 매체에서 제조될 수 있다. 주사에 대한 수성 매체로서, 예로서 생리 식염수, 글루코오스 및 다른 보조 작용제를 내포하는 등장성 용액 등이 있는데, 이들은 온당한 가용화제, 예를 들면, 알코올 (가령, 에탄올), 다가알코올 (가령, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [가령, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소첨가된 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가물)] 등과 조합으로 이용될 수 있다. 이렇게 제조된 주사는 온당한 용기 또는 장치 (가령, 앰풀, 주입기, 주사 장치 또는 펜)에 충전되거나 또는 이것으로 이전될 수 있다.
항원 결합 분자의 안정성
본 발명의 약물 산물 용기의 공간부분에서 산화 가스 (가령, 산소)의 양의 감소는 이들 용기 내에서 액체 조성물에서 조제된 항원 결합 분자의 안정성에 유리하게 충격을 준다. 산화는 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 비롯한, 단백질 치료제의 주요 분해 경로이다. 이런 분해의 충격은 낮은 농도에서 확연한데, 이때 활성 물질의 임의의 손실은 규정된 보관 기간 후 조성물 내에 남아있는 활성제의 양에 대한 불균형하게 더욱 큰 효과를 갖는다. 이런 분해의 현성은 고분자량 (HMW) 종류에서 증가 및 충전 변이체 종류의 백분율에서 변화를 포함한다. HMW 종류의 양 또는 백분율에서 변화는 당해 분야에서 공지된 표준 크기 배제 크로마토그래피 기술을 이용하여 검출될 수 있다 (가령, Lu et al., MAbs, 5(1):102-113, 2013). 충전 변이체 종류의 양 또는 백분율에서 변화는 당해 분야에서 공지된 표준 양이온 교환 크로마토그래피 기술을 이용하여 검출될 수 있다 (가령, Chumsae, et al., Journal of Chromatography B, 850:285-294, 2007). 본 발명의 약물 산물에서 항원 결합 분자의 안정성은 HMW 또는 충전 변이체 종류의 양 또는 백분율에서 변화를, 특정한 보관 조건에 상응하는 시간과 온도 파라미터의 함수로서 계측함으로써 확인될 수 있다. 일부 경우에, 보관 조건은 약물 산물이 제조 및 이용 사이에 통상적으로 유지될 조건에 필적할 수 있다. 다른 경우에, 보관 조건은 더욱 짧은 기간 내에 더욱 긴-기간 안정성의 지시를 획득하는 것으로 의미되는 가속화된 조건일 수 있다.
본 발명의 조성물의 다양한 구체예에서, 항원 결합 분자 (가령, 항체)는 45℃에서 보관될 때 최소한 28 일의 기간 동안 안정된 상태로 남아있다. 이러한 문맥에서, 안정성은 예로서 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 2% 이내의 증가를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, HMW 종류에서 백분율 증가는 보관 기간에 걸쳐 약 1.5% 이내, 또는 약 1% 이내이다. 일부 경우에, 항원 결합 분자는 45℃에서 보관될 때 최소한 3 개월의 기간 동안 안정된 상태로 남아있다. 이들 더욱 긴 보관 조건 하에, 안정성은 예로서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류에서 약 10% 이내의 증가를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 이들 더욱 긴 보관 조건 하에 안정성은 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류에서 약 5% 이내, 약 4% 이내, 약 3% 이내, 약 2% 이내, 또는 약 1% 이내의 증가를 지칭할 수 있다. 다른 구체예에서, 항원 결합 분자 (가령, 항체)는 5℃에서 보관될 때 최소한 31 개월의 기간 동안 안정된 상태로 남아있다. 이러한 문맥에서, 안정성은 예로서, 보관 기간에 걸쳐 충전 변이체 종류의 백분율에서 10% 이내의 변화를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 보관 기간은 12 개월, 18 개월, 24 개월, 30 개월 또는 36 개월일 수 있다.
특정 치료적 단백질 산물을 제조하는 과정 내내, 일정한 산물 품질 속성이 그들의 잠재적인 임상적 충격에 근거하여 확인될 수 있다. 유관한 품질 속성은 순도, 안전성 및/또는 효력에 대한 그들의 잠재적인 충격에 따라서 주요 품질 속성 (CQAs)으로 간주될 수 있다. 고분자량 (HMW) 종류 및 충전 변이체는 제조 공정 동안 변경될 수 있는 많은 산물 CQAs 중에서 단지 2가지일 뿐이다. 단백질은 산물을 용기 내로 충전한 후 및 용기 보관 동안을 비롯한, 제조 공정 동안 이들 품질 속성에서 변화에 대해 모니터링된다. 산화에 민감한 약물 산물은 상기 산물의 순도, 안전성 및/또는 효력에 영향을 줄 수 있는 증가된 산화 수준에 기인한 특정 CQA에 대한 역치 초과 또는 미만에서 상기 산물의 CQA에서 변화를 지칭한다. 산화에 민감한 약물 산물은 또한, 증가된 산화 수준에 기인한 상기 산물의 순도, 안전성 및/또는 효력에 영향을 줄 수 있는 상기 산물에서 변화를 지칭한다.
일부 경우에, 안정성은 산물의 순도, 안전성 및/또는 효력에 영향을 줄 수 있는 미리 결정된 역치 초과 또는 미만에서 산물 CQAs에서 변화를 지칭할 수 있다.
항원 결합 분자의 결합 성질
본원에서 이용된 바와 같이, 예로서 미리 결정된 항원, 예를 들면, 세포 표면 단백질 또는 이의 단편에 항원 결합 분자, 항체, 면역글로불린, 항체 결합 단편, 또는 Fc-내포 단백질의 결합의 맥락에서 용어 "결합"은 전형적으로, 최소한 2개의 실체 또는 분자 구조 사이에 상호작용 또는 연관, 예를 들면, 항체-항원 상호작용을 지칭한다.
가령, 결합 친화성은 전형적으로, 예로서 항원을 리간드로서, 그리고 항체, Ig, 항체 결합 단편, 또는 Fc-내포 단백질을 피분석물 (또는 항리간드)로서 이용하여 BIAcore 3000 기기에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 결정될 때, 약 10-7 M 또는 그 이하, 예를 들면, 약 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 약 10-9 M 또는 그 이하의 KD 값에 상응한다. 세포-기초된 결합 전략, 예를 들면, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 결합 검정 또한, 일과적으로 이용되고, 그리고 FACS 데이터는 다른 방법, 예를 들면, 방사리간드 경쟁 결합 및 SPR과 충분히 상관한다 (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).
따라서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단백질은 비특이적 항원 (가령, BSA, 카제인)에 결합에 대한 이의 친화성보다 최소한 10 배 낮은 KD 값에 상응하는 친화성으로 미리 결정된 항원 또는 세포 표면 분자 (수용체)에 결합한다. 본 발명에 따르면, 비특이적 항원과 동등하거나 또는 이것보다 10 배 이내로 낮은 KD 값에 상응하는 항체의 친화성은 비록 이런 항체가 본 발명의 이중특이적 항체의 생산을 위한 두 번째 항원 결합 팔과 대합될 수도 있긴 하지만, 비-검출가능 결합으로 고려될 수 있다.
용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수, 또는 항원에 결합하는 항체 또는 항체 결합 단편의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD 및 결합 친화성 사이에는 역 관계가 있고, 이런 이유로 KD 값이 더욱 작을수록, 친화성이 더욱 높다, 다시 말하면, 더욱 강하다. 따라서, 용어 "더욱 높은 친화성" 또는 "더욱 강한 친화성"은 상호작용을 형성하는 더욱 높은 능력 및 이런 이유로, 더욱 작은 KD 값에 관계하고, 그리고 반대로 용어 "더욱 낮은 친화성" 또는 "더욱 약한 친화성"은 상호작용을 형성하는 더욱 낮은 능력 및 이런 이유로, 더욱 큰 KD 값에 관계한다. 일부 상황에서, 다른 상호작용 파트너 분자 (가령, 항원 Y)에 특정 분자 (가령, 항체)의 결합 친화성과 비교하여, 상호작용 파트너 분자 (가령, 항원 X)에 특정 분자 (가령, 항체)의 더욱 높은 결합 친화성 (또는 KD)은 더욱 큰 KD 값 (더욱 낮은, 또는 더욱 약한 친화성)을 더욱 작은 KD (더욱 높은, 또는 더욱 강한 친화성)로 나눔으로써 결정된 결합 비율로서 표현될 수 있다, 예를 들면, 경우에 따라서 5-배 또는 10-배 큰 결합 친화성으로서 표현될 수 있다.
용어 "kd" (초-1 또는 1/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수, 또는 항체 또는 항체 결합 단편의 해리 속도 상수를 지칭한다. 상기 값은 k오프 값으로서 또한 지칭된다.
용어 "ka" (M-1 x 초-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수, 또는 항체 또는 항체 결합 단편의 결합 속도 상수를 지칭한다.
용어 "KA" (M-1 또는 1/M)은 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수, 또는 항체 또는 항체 결합 단편의 결합 평형 상수를 지칭한다. 결합 평형 상수는 ka를 kd로 나눔으로써 획득된다.
용어 "EC50" 또는 "EC50"은 반극대 효과적인 농도를 지칭하는데, 이것은 특정된 노출 시간 후 기준선 및 최대 사이의 중간에 반응을 유도하는 항체의 농도를 포함한다. EC50은 본질적으로, 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체의 농도를 나타낸다. 일정한 구체예에서, EC50 값은 예로서, FACS 결합 검정에 의해 결정될 때, CD3 또는 종양-연관된 항원을 발현하는 세포에 반극대 결합을 제공하는 본 발명의 항체의 농도와 같다. 따라서, 감소된 또는 더욱 약한 결합이 증가된 EC50, 또는 반극대 효과적인 농도 값에서 관찰된다.
한 구체예에서, 감소된 결합은 반극대 양의 표적 세포에 결합을 가능하게 하는 증가된 EC50 항체 농도로서 규정될 수 있다.
다른 구체예에서, EC50 값은 T 세포 세포독성 활성에 의한 표적 세포의 반극대 고갈을 이끌어 내는 본 발명의 항체의 농도를 나타낸다. 따라서, 증가된 세포독성 활성 (가령, T 세포-매개된 종양 세포 사멸)이 감소된 EC50, 또는 반극대 효과적인 농도 값에서 관찰된다.
이중특이적 항원 결합 분자
본 발명의 항원 결합 분자, 예를 들면, 항체는 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 내포할 수 있다. 참조: 가령, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. 본 발명의 항체는 다른 기능 분자, 예를 들면, 다른 펩티드 또는 단백질에 연결되거나 또는 이것과 공동발현될 수 있다. 가령, 항체 또는 이의 단편은 하나 또는 그 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결되어 (가령, 화학적 연계, 유전자 융합, 비공유 연관 또는 다른 것에 의해), 두 번째 또는 추가 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 생산될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "항원 결합 분자"는 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가 CDRs 및/또는 프레임워크 영역 (FRs)과 조합으로, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 단백질, 폴리펩티드 또는 분자 복합체를 의미한다. 일정한 구체예에서, 항원 결합 분자는 본원의 다른 곳에서 규정된 바와 같은 항체 또는 항체의 단편이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "이중특이적 항원 결합 분자"는 최소한 첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 분자 복합체를 의미한다. 이중특이적 항원 결합 분자 내에 각 항원 결합 도메인은 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가 CDRs 및/또는 FRs와 조합으로, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 CDR을 포함한다.
본 발명의 일정한 예시적인 구체예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체의 각 항원 결합 도메인은 중쇄 가변 도메인 (HCVR) 및 경쇄 가변 도메인 (LCVR)을 포함한다. 첫 번째와 두 번째 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자 (가령, 이중특이적 항체)의 맥락에서, 첫 번째 항원 결합 도메인의 CDRs는 접두사 "A1"로 표시될 수 있고, 그리고 두 번째 항원 결합 도메인의 CDRs는 접두사 "A2"로 표시될 수 있다. 따라서, 첫 번째 항원 결합 도메인의 CDRs는 본원에서 A1-HCDR1, A1-HCDR2 및 A1-HCDR3으로서 지칭될 수 있고; 그리고 두 번째 항원 결합 도메인의 CDRs는 본원에서 A2-HCDR1, A2-HCDR2 및 A2-HCDR3으로서 지칭될 수 있다.
첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 결합 도메인은 서로 직접적으로 또는 간접적으로 연결되어 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 대안으로, 첫 번째 항원 결합 도메인 및 두 번째 항원 결합 도메인은 각각, 별개의 다합체화 도메인에 연결될 수 있다. 한 다합체화 도메인의 다른 다합체화 도메인과의 연관은 이들 2개의 항원 결합 도메인 사이에 연관을 용이하게 하고, 따라서 이중특이적 항원 결합 분자를 형성한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "다합체화 도메인"은 동일한 또는 유사한 구조 또는 구성의 두 번째 다합체화 도메인과 상종하는 능력을 갖는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 아미노산이다. 가령, 다합체화 도메인은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 다합체화 성분의 무제한적 실례는 면역글로불린의 Fc 부분 (CH2-CH3 도메인 포함), 예를 들면, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4뿐만 아니라 각 아이소타입 군 내에 임의의 알로타입에서 선택되는 IgG의 Fc 도메인이다.
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자는 전형적으로, 2개의 다합체화 도메인, 예를 들면, 별개의 항체 중쇄의 각각의 개별적인 부분인 2개의 Fc 도메인을 포함할 것이다. 첫 번째와 두 번째 다합체화 도메인은 동일한 IgG 아이소타입, 예를 들면, 예로서 IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4일 수 있다. 대안으로, 첫 번째와 두 번째 다합체화 도메인은 상이한 IgG 아이소타입, 예를 들면, 예로서 IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 등일 수 있다.
일정한 구체예에서, 다합체화 도메인은 최소한 하나의 시스테인 잔기를 내포하는 1 내지 약 200개 아미노산 길이의 Fc 단편 또는 아미노산 서열이다. 다른 구체예에서, 다합체화 도메인은 시스테인 잔기, 또는 짧은 시스테인-내포 펩티드이다. 다른 다합체화 도메인은 류신 지퍼, 나선-루프 모티프, 또는 이중 코일 모티프를 포함하거나 또는 이것으로 구성되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
임의의 이중특이적 항체 형식 또는 기술이 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는데 이용될 수 있다. 가령, 첫 번째 항원 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 단편은 한 가지 또는 그 이상의 다른 분자 실체, 예를 들면, 두 번째 항원 결합 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 연결되어 (가령, 화학적 연계, 유전자 융합, 비공유 연관 또는 다른 것에 의해) 이중특이적 항원 결합 분자가 생산될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 특정한 예시적인 이중특이적 형식은 예로서, scFv-기초된 또는 디아바디 이중특이적 형식, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 쿠아드로마, 노브-인투-홀, 공통 경쇄 (가령, 노브-인투-홀을 갖는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 그리고 Mab2 이중특이적 형식을 제한 없이 포함한다 (전술한 형식에 관한 리뷰를 위해, 가령 Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 그리고 그 안에 인용된 참고문헌을 참조한다).
본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 맥락에서, 다합체화 도메인, 예를 들면, Fc 도메인은 Fc 도메인의 야생형, 자연발생 버전과 비교하여 한 가지 또는 그 이상의 아미노산 변화 (가령, 삽입, 결실 또는 치환)을 포함할 수 있다. 가령, 본 발명은 Fc 및 FcRn 사이에 변형된 결합 상호작용 (가령, 증강된 또는 축소된)을 갖는 변형된 Fc 도메인을 유발하는, Fc 도메인에서 한 가지 또는 그 이상의 변형을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 CH2 또는 CH3 영역에서 변형을 포함하는데, 여기서 상기 변형은 산성 환경에서 (가령, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에서 변하는 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화성을 증가시킨다. 이런 Fc 변형의 무제한적 실례는 예로서, 위치 250 (가령, E 또는 Q); 250 및 428 (가령, L 또는 F); 252 (가령, L/Y/F/W 또는 T), 254 (가령, S 또는 T) 및 256 (가령, S/R/Q/E/D 또는 T)에서 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (가령, L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (가령, H/F 또는 Y)에서 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서 변형; 또는 위치 307 또는 308 (가령, 308F, V308F) 및 434에서 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 428L (가령, M428L) 및 434S (가령, N434S) 변형; 428L, 259I (가령, V259I) 및 308F (가령, V308F) 변형; 433K (가령, H433K) 및 434 (가령, 434Y) 변형; 252, 254 및 256 (가령, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (가령, T250Q 및 M428L); 그리고 307 및/또는 308 변형 (가령, 308F 또는 308P)을 포함한다.
본 발명은 또한, 첫 번째 CH3 도메인 및 두 번째 Ig CH3 도메인을 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는데, 여기서 첫 번째와 두 번째 Ig CH3 도메인은 최소한 하나의 아미노산에 의해 서로 상이하고, 그리고 여기서 최소한 하나의 아미노산 차이는 이러한 아미노산 차이를 결여하는 이중특이적 항체와 비교하여, 단백질 A에 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, 첫 번째 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 그리고 두 번째 Ig CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소시키거나 또는 전폐하는 돌연변이, 예를 들면, H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링에 의해; EU 넘버링에 의해 H435R)을 내포한다. 두 번째 CH3은 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의해 Y436F)을 더욱 포함할 수 있다. 참조: 가령, US 특허 번호 8,586,713. 두 번째 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가 변형은 하기를 포함한다: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N 및 V82I (IMGT; EU에 의해 N384S, K392N 및 V422I); 그리고 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I).
일정한 구체예에서, Fc 도메인은 하나 이상의 면역글로불린 아이소타입으로부터 유래된 키메라, 조합 Fc 서열일 수 있다. 가령, 키메라 Fc 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 CH2 영역으로부터 유래된 CH2 서열 중에서 일부 또는 전부, 그리고 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4로부터 유래된 CH3 서열 중에서 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 키메라 Fc 도메인은 또한, 키메라 힌지 영역을 내포할 수 있다. 가령, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 진술된 임의의 항원 결합 분자 내에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 특정 실례는 N 말단으로부터 C 말단으로 하기를 포함한다: [IgG4 CH1] - [IgG4 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. 본원에서 진술된 임의의 항원 결합 분자 내에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 다른 실례는 N 말단으로부터 C 말단으로 하기를 포함한다: [IgG1 CH1] - [IgG1 상부 힌지] - [IgG2 하부 힌지] - [IgG4 CH2] - [IgG1 CH3]. 본 발명의 임의의 항원 결합 분자 내에 포함될 수 있는 키메라 Fc 도메인의 이런 저런 실례는 2014년 8월 28일자 공개된 US 공보 2014/0243504에서 설명되는데, 이것은 본원에 전체적으로 편입된다. 이들 일반적인 구조적 배열을 갖는 키메라 Fc 도메인 및 이들의 변이체는 변경된 Fc 수용체 결합을 가질 수 있고, 이것은 차례로, Fc 작동체 기능에 영향을 준다.
pH-의존성 결합
본 발명은 pH-의존성 결합 특징을 갖는 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 가령, 본 발명의 항체는 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 항원에 감소된 결합을 전시할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 항체는 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 항원에 증강된 결합을 전시할 수 있다. 표현 "산성 pH"는 약 6.2보다 작은, 예를 들면, 약 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, 또는 그 이하의 pH 값을 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
일정한 사례에서, "중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 ... 감소된 결합"은 산성 pH에서 항원에 결합하는 항체의 KD 값 대 중성 pH에서 항원에 결합하는 항체의 KD 값의 비율 (또는 그 반대)의 면에서 표현된다. 가령, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 만약 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약 3.0 또는 그 이상의 산성/중성 KD 비율을 전시하면 본 발명을 위해 "중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 MUC16에 감소된 결합"을 전시하는 것으로 간주될 수 있다. 일정한 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 산성/중성 KD 비율은 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 또는 그 이상일 수 있다.
pH-의존성 결합 특징을 갖는 항체는 예로서, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 특정 항원에 감소된 (또는 증강된) 결합에 대해 항체의 개체군을 선별검사함으로써 획득될 수 있다. 추가적으로, 아미노산 수준에서 항원 결합 도메인의 변형은 pH-의존성 특징을 갖는 항체를 산출할 수 있다. 가령, 항원 결합 도메인 (가령, CDR 내에)의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH에 비하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 갖는 항체가 획득될 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항체
본 발명의 일정한 구체예에 따라서, 이들 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자는 예로서, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체에 항체 결합을 증강하거나 또는 축소시키는 한 가지 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 가령, 본 발명은 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항체를 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이(들)는 산성 환경에서 (가령, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에서 변하는 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화성을 증가시킨다. 이런 돌연변이는 동물에게 투여될 때, 항체의 혈청 반감기에서 증가를 유발할 수 있다. 이런 Fc 변형의 무제한적 실례는 예로서, 위치 250 (가령, E 또는 Q); 250 및 428 (가령, L 또는 F); 252 (가령, L/Y/F/W 또는 T), 254 (가령, S 또는 T) 및 256 (가령, S/R/Q/E/D 또는 T)에서 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (가령, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (가령, H/F 또는 Y)에서 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서 변형; 또는 위치 307 또는 308 (가령, 308F, V308F) 및 434에서 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 428L (가령, M428L) 및 434S (가령, N434S) 변형; 428L, 259I (가령, V259I) 및 308F (가령, V308F) 변형; 433K (가령, H433K) 및 434 (가령, 434Y) 변형; 252, 254 및 256 (가령, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (가령, T250Q 및 M428L); 그리고 307 및/또는 308 변형 (가령, 308F 또는 308P)을 포함한다.
가령, 본 발명은 하기와 같이 구성된 군에서 선택되는 돌연변이의 하나 또는 그 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항체 및 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다: 250Q 및 248L (가령, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (가령, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (가령, M428L 및 N434S); 그리고 433K 및 434F (가령, H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이, 그리고 본원에서 개시된 항체 가변 도메인 내에 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범위 내에서 예기된다.
항원 결합 도메인의 제조 및 이중특이적 분자의 구성
특정 항원에 대해 특이적인 항원 결합 도메인은 당해 분야에서 공지된 임의의 항체 산출 기술에 의해 제조될 수 있다. 일단 획득되면, 2가지 상이한 항원에 대해 특이적인 2개의 상이한 항원 결합 도메인이 일과적인 방법을 이용하여, 서로에 상대적으로 온당하게 배열되어 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자가 생산될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 개별 성분 (가령, 중쇄와 경쇄) 중에서 하나 또는 그 이상이 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체로부터 유래된다. 이런 항체를 만들기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 공지된다. 가령, 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 중에서 하나 또는 그 이상은 VELOCIMMUNE™ 기술을 이용하여 제조될 수 있다. VELOCIMMUNE™ 기술 (또는 임의의 다른 인간 항체 산출 기술)을 이용하여, 인간 가변 영역 및 생쥐 불변 영역을 갖는, 특정 항원에 대한 높은 친화성 키메라 항체가 초기에 단리된다. 이들 항체는 특징화되고, 그리고 친화성, 선택성, 에피토프 등을 비롯한 바람직한 특징에 대해 선별된다. 생쥐 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역으로 대체되어 완전 인간 중쇄 및/또는 경쇄가 산출되고, 이들은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 내로 통합될 수 있다.
유전적으로 가공된 동물이 인간 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는데 이용될 수 있다. 가령, 내인성 생쥐 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 재배열하고 발현할 수 없는 유전적으로 변형된 생쥐가 이용될 수 있는데, 여기서 상기 생쥐는 내인성 생쥐 카파 좌위에서 생쥐 카파 불변 유전자에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 서열에 의해 인코딩된 단지 하나 또는 2개의 인간 경쇄 가변 도메인을 발현한다. 이런 유전적으로 변형된 생쥐는 2개의 상이한 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절 중에서 한 가지로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 동일한 경쇄와 상종하는 2가지 상이한 중쇄를 포함하는 완전 인간 이중특이적 항원 결합 분자를 생산하는데 이용될 수 있다 (참조: 가령, US 2011/0195454). 완전 인간은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역글로불린 도메인의 각 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 인간 서열로부터 유래된 DNA에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편 또는 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 일부 경우에, 완전 인간 서열은 인간에 내인성인 단백질로부터 유래된다. 다른 경우에, 완전 인간 단백질 또는 단백질 서열은 각 성분 서열이 인간 서열로부터 유래되는 키메라 서열을 포함한다. 임의의 한 가지 이론에 한정됨 없이, 키메라 단백질 또는 키메라 서열은 일반적으로, 예로서 임의의 야생형 인간 면역글로불린 영역 또는 도메인과 비교하여, 성분 서열의 접합부에서 면역원성 에피토프의 창출을 최소화하도록 설계된다.
약물 산물 용기의 공간부분에서 산화 가스를 감소시키는 방법
본 발명의 방법은 산화 분해에 의해 유발되는 충전 변이체 및/또는 응집을 최소화함으로써 더욱 큰 안정성 및 보관 수명을 갖는 약물 산물을 제공한다. 본 발명의 방법은 약물 산물 용기의 공간부분에서 가스의 배기, 그리고 산소 및/또는 다른 산화 가스, 예를 들면, 오존, 과산화물, 염소, 플루오르, 산화질소, 이산화질소, 아산화질소, 또는 이들의 조합의 농도를 감소시키기 위한, 비-산화 가스 (가령, 질소 또는 아르곤)로 공간부분의 차후 환기를 포함한다. 이들 방법은 진공 챔버 (가령, 동결건조 챔버)에서 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 진공 챔버는 압력을 정확하게 계측하고, 그리고 따라서, 압력을 본원에서 확인된 범위 내에서 제어하기 위한 피라니 진공 게이지 (열전도율 게이지)가 구비된다. 다양한 구체예에서, 이들 방법은 무균 조건 하에 및/또는 제약학적 약물 산물 생산을 위한 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 표준을 충족시키는 조건 하에 수행된다.
본 발명의 방법은 액체 제제에서 재조합 단백질 또는 항원 결합 단백질 (가령, 항체 또는 이중특이적 항원 결합 분자)을 내포하는 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조하는데 이용될 수 있다. 약물 산물은 약물 산물 용기의 공간부분에서 감소된 농도의 산소 및/또는 다른 산화 가스를 내포하도록 조제된다. 본 발명에 따라서 약물 산물을 밀봉된 용기에서 제조하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 재조합 단백질 또는 항원 결합 단백질 (가령, 항체)의 액체 제제를 내포하는 하나 또는 그 이상의 용기를 대기압 하에 진공 챔버 내로 부하하고, (b) 챔버를 약 0.05 bar 내지 약 0.15 bar의 첫 번째 압력에서 배기시키고, (c) 챔버를 약 800 mbar 내지 약 1000 mbar의 두 번째 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고, 그리고 (d) 하나 또는 그 이상의 용기를 밀봉된 진공 챔버 내부에 밀봉함. 일부 구체예에서, 공간부분에서 산화 가스의 농도를 더욱 감소시키기 위해 용기(들)를 밀봉하기에 앞서, 제법 단계 (b)와 (c)가 1회 또는 그 이상 반복된다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법은 용기 공간부분에서 부피로 5%보다 적은 산소 (또는 다른 산화 가스)를 갖는 약물 산물을 생산하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에, 산화 가스 농도는 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하까지 감소된다. 일부 구체예에서, 산화 가스 (가령, 산소) 농도는 0.5% 이내, 0.4% 이내, 0.3% 이내, 0.2% 이내, 또는 0.1% 이내이다.
일부 구체예에서, 산소 (또는 다른 산화 가스)의 최종 원하는 농도는 미리 결정될 수 있고, 그리고 상기 논의된 배기 /환기 과정의 주기의 횟수는 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 그에 맞추어 조정될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 밀봉된 약물 산물 용기의 공간부분에서 산소 함량을 제어하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 밀봉된 용기의 공간부분에서 원하는 최종 산소 함량을 결정하고; (b) 산소 환원의 첫 번째 주기 이후에 종료 산소 함량 %를 방정식 (I)을 통해 계산하고:
(I)
여기서 %O2,시작은 첫 번째 주기의 시작 시점에서 산소 함량 %이고, P진공은 산소 환원의 첫 번째 주기에서 적용된 배기 압력이고, P환기는 P진공보다 높지만 1 bar보다 낮은 압력이고, 그리고 %O2 . 종료는 첫 번째 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이고; (c) 원하는 최종 산소 함량이 도달될 때까지, 방정식 (I)을 추가 주기 (여기서 %O2,시작은 선행 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이다)에 임의선택적으로 적용하고; 그리고 (d) 하기에 의해 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조함: (i) 진공 챔버에서 개봉된 용기를 P진공에서 배기시킴으로써 산소 환원의 하나 또는 그 이상의 주기를 수행하고, 여기서 P진공은 0.05 bar 내지 0.15 bar의 압력이고, 그리고 진공 챔버에서 개봉된 용기를 800 mbar 내지 1000 mbar의 환기 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고; 그리고 (ii) 용기를 밀봉함.
다양한 구체예에서, 압력은 재조합 단백질 또는 항원 결합 단백질을 내포하는 액체 제제의 증발을 방지하기 위해 물의 증기압보다 위에서 유지된다. 다양한 구체예에서, 진공 챔버의 배기 및/또는 환기는 약 0.02 bar 내지 약 0.2 bar의 압력에서 일어난다. 한 구체예에서, 배기는 약 0.1 bar의 압력에서 일어나고, 그리고 환기는 약 800 mbar 내지 약 1000 mbar의 압력에서 일어난다. 진공 챔버의 환기에서 이용되는 비-산화 가스는 예로서, 질소, 아르곤, 헬륨, 크세논, 네온, 크립톤 및 라돈에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 비-산화 가스는 질소이다. 다른 구체예에서, 비-산화 가스는 아르곤이다. 다양한 구체예에서, 이들 방법은 약 5-45℃ 범위 또는 약 10-37℃ 범위의 온도에서 수행된다. 다양한 구체예에서, 이들 방법은 약 15-25℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 온도는 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 또는 약 25℃이다. 한 구체예에서, 모든 주기의 온도는 약 19℃에서 유지된다.
본 발명의 방법에 따라서 약물 산물 용기 내에 밀봉된 재조합 단백질 또는 항원 결합 단백질 조성물은 상기 또는 본원에서 논의된 다양한 조성물 중에서 어느 것일 수 있다. 가령, 항원 결합 단백질 (가령, 항체)의 액체 조성물은 완충액, 장성 조절제, 안정제, 계면활성제 등을 비롯한 다양한 부형제로 조제될 수 있고, 그리고 상기 단백질은 약 0.1 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 범위에서 변하는 농도에서 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 다른 항원 결합 단백질의 농도는 약 1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml, 1 mg/ml 내지 약 15 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml이다. 일부 경우에, 농도는 10 mg/ml보다 적거나, 5 mg/ml보다 적거나, 2 mg/ml보다 적거나, 또는 1 mg/ml보다 적다.
앞서 논의된 바와 같이, 용기(들) 내에서 공간부분 가스의 산화 가스 함량을 감소시킨 후, 용기(들)는 완전히 밀폐되거나/마개로 막히고, 그리고 최종적으로 밀봉된다. 마개는 다양한 재료 (가령, 중합체, 고무)로 만들어질 수 있고, 그리고 용기와의 맞물림을 위해 필요에 따라 탄성중합체 성질 (가령, 충분한 경축, 전성)을 전시할 수 있다. 일부 구체예에서 마개는 합성 고무로 형성된다. 일부 구체예에서 마개는 부틸 고무로 형성된다. 마개는 하나 또는 그 이상의 벤트, 또는 벤트 레그를 포함할 수 있다. 마개는 탄성중합성 밀봉을 형성하고 유지하기 위해 적합될 수 있고, 그리고 일부 구체예에서, 전통적인 동결건조 절차에 적합된 마개일 수 있다. 따라서, 동결건조 챔버에서 바이알에서 이용을 위한 마개는 벤트(들)가 가스 오버레이/산소 환원 과정 동안 외부 공간에 열린 상태에서 부분적으로 막히고, 그리고 이후, 하나 또는 그 이상의 산소 환원 주기 이후에 완전히 막히고 용기와 접속하여 밀봉될 수 있다. 동결건조 시스템, 밀폐 캡 및 마개 형상의 실례는 FDA Guide "Lyophilization of Parenteral (7/93)' and Bhambhani and Medi, "Selection of Containers/Closures for Use in Lyophilization Applications: Possibilities and Limitations," American Pharmaceutical Review, May 1, 2010에서 제공되는데, 이의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법과 조성물을 어떻게 만들고 이용하는 지에 관한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 진술되고, 그리고 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차가 고려되어야 한다. 별도로 지시되지 않으면, 분율은 중량에 의한 분율이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 그리고 압력은 대기압이거나 또는 이에 가깝다.
실시예
1: 약물 산물 공간부분에서 산소의 감소
본 실시예에서, 압력을 계측하기 위한 피라니 진공 게이지 및 압력을 제어하기 위한 니들 밸브가 구비된 표준 GMP 동결건조 챔버가 진공 챔버로서 이용되었다. 액체 제제에서 2 mg/ml의 농도에서 이중특이적 항체가 공간부분 산소의 존재를 ~21%에서 약 0.25%로 감소시키기 위한 2-주기 과정에서 질소 오버레이로, 벤트 레그 고무 마개가 구비된 바이알에서 포장되었다.
| 단계 번호 | 시기 | 선반 온도 유지/램프 (℃) | 선반 온도 램프 비율 | 챔버 압력 | 단계 시간 (hh:mm) |
| 1 | 시작 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 |
| 2 | 출입구 잠금 / 잠금 해제 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 |
| 3 | 환기 | 해당 없음 | 해당 없음 | +0.02까지 | 해당 없음 |
| 4 | 부하 | +19 | 해당 없음 | 대기압 | 00:01 |
| 5 | 안정화 | +19 | 해당 없음 | 대기압 | 00:05 |
| 6 | 진공 개시 | +19 | 해당 없음 | 100,mbar (피라니, 진공 밸브 제어) | 00:01 |
| 7 | 환기 (N2) | +19 | 해당 없음 | 912 mbar | 해당 없음 |
| 8 | 종료 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 |
일단 바이알이 챔버 내에 배치되면, 챔버로부터 가스 (이것은 시작 시점에 ~21% 산소를 내포하는 공기이다)를 제거하기 위해 진공이 빼내졌다 (단계 6). 압력 (100,000 μbar)은 증발, 거품 형성 및 잠재적인 튀김을 방지하기 위해 물의 증기압을 초과하고, 그리고 피라니 게이지로 계측된다. 일상적인 동결건조 조건 하에, 훨씬 낮은 압력 (대략 150 μbar)까지 진공이 존재하고, 따라서 압력이 정전용량 압력계를 이용하여 제어된다. 하지만, 정전용량 압력계는 단지 약 2000 μbar 아래의 압력에서만 정확하고, 그리고 100,000 μbar에서는 압력을 제어하는데 이용될 수 없다.
100,000 μbar 압력에 도달한 후, 질소가 배기된 공기를 대체하여 챔버 내로 채워졌다.
상기 과정은 산소 수준을 더욱 감소시키기 위해 재차 반복되었다 (아래의 2번째 주기 단계 3-4). 일단 원하는 산소 수준이 도달되면, 바이알은 마개로 막혔다 (아래의 2번째 주기 단계 5).
| 단계 번호 | 시기 | 선반 온도 유지하다/램프 (℃) | 선반 온도 램프 비율 | 챔버 압력 | 단계 시간 (hh:mm) |
| 1 | 시작 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 |
| 2 | 안정화 | +19 | 해당 없음 | 대기압 | 00:05 |
| 3 | 안정화 | +19 | 해당 없음 | 100 mbar (피라니, 진공 밸브 제어) | 00:01 |
| 4 | 환기전 (N2) | +19 | 해당 없음 | 912 mbar | 00:01 |
| 5 | 마개로 막기 | +19 | 해당 없음 | 912 mbar | (30 초 동안 130 bar) |
| 6 | 양하 | +19 | 해당 없음 | 대기압 | 해당 없음 |
| 7 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 | 해당 없음 |
산소 함량 방정식:
P = 압력
실시예 1에서 상기 논의된 과정으로부터 실례 계산:
주기 1
P 진공 = 100 mbar
P 환기 = 912 mbar
%02,시작 = 21% (챔버 내에 공기로 시작)
%0 2 , 종료 = 
%0 2 , 종료 = 2.3 %
주기 2
P 진공 = 100 mbar
P 환기 = 900 mbar
%02,시작 = 2%
%0 2 , 종료 = 
%0 2 , 종료 = 0.25 %
실시예
2: 약물 산물의 안정성 검사
안정성 분석이 다양한 농도의 공간부분 산소를 갖는, 실시예 1에서 논의된 과정을 이용하여 제조된 다양한 약물 산물에서 수행되었고, 그리고 공간부분 산소가 대기 수준 (~21%)에서 또는 이와 가깝게 있는 대조와 대비되었다. 일부 경우 (본원에서 언급된)에 질소가 상기 과정의 환기 부분에서 아르곤으로 대체되었다. 고분자량 (HMW) 종류가 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피 (SE-UPLC)를 이용하여 검출되었고, 그리고 충전 변이체 종류가 양이온 교환 초고성능 액체 크로마토그래피 (CEX-UPLC)를 이용하여 검출되었다.
도 1에서 예시된 바와 같이, 질소 오버레이를 통해 공간부분 산소 함량을 21%로부터 1%보다 적게 감소시키는 것은 5 ℃에서 31 개월의 보관 이후에 CEX-UPLC에 의해 관찰된 이중특이적 항체의 분해를 감소시켰다. 21% 산소에서, 주요 충전 변이체 종류에서 변화 백분율은 약 46.25%이었고, 반면 <1% 산소에서, 변화 백분율은 보관 기간에 걸쳐 약 8.75%까지 감소되었다.
도 2에서 예시된 바와 같이, 질소 오버레이를 통해 공간부분 산소 함량을 21%로부터 0.1%로 감소시키는 것은 45 ℃에서 28 일의 보관 이후에, HMW 종류의 존재에서 백분율 증가에서 감소에 의해 증명되는 바와 같이, 두 번째 이중특이적 항체의 안정성을 증가시켰다. 21% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 8.62%의 증가가 있었다. 15% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 8.53%의 증가가 있었다. 10% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 4.74%의 증가가 있었다. 5% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 1.42%의 증가가 있었고, 그리고 0.1% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 0.24%의 증가가 있었다.
도 3은 공간부분 산소 함량을 감소시키기 위한 질소 오버레이 과정 이후에, 45 ℃에서 3 개월의 보관 후 관찰된 두 번째 이중특이적 항체에 대한 HMW 종류의 존재에서 백분율 증가에서 감소를 도해한다. 5% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 9.66%의 증가가 있었다. 2% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 7.27%의 증가가 있었다. 1% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 4.54%의 증가가 있었고, 그리고 1%보다 적은 산소에서, 산소 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 0.34%의 증가가 있었다.
도 4는 오버레이 과정에서 질소가 아르곤으로 대체된 점을 제외하고, 도 3에서처럼 45℃에서 3 개월 동안 보관된 두 번째 이중특이적 항체에 대한 동일한 공간부분 산소 함량을 도해한다. 5% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 16.72%의 증가가 있었다. 2% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 13.05%의 증가가 있었다. 1% 산소에서, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류의 백분율에서 약 7.68%의 증가가 있었지만, 1%보다 적은 산소에서는, 보관 기간에 걸쳐 HMW 종류에서 검출가능한 증가가 없었다.
본 발명은 본원에서 설명된 특정한 구체예에 의해 범위에서 한정되지 않는다. 실제로, 본 명세서에서 설명된 것들 이외에, 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이런 변형은 첨부된 청구항의 범위에 들어가는 것으로 의도된다.
Claims (47)
- 액체 제제에서 재조합 단백질 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 안정된 액체 약물 산물, 여기서 상기 가스는 부피로 5%보다 적은 산소를 포함하고, 그리고 상기 재조합 단백질은 45℃에서 보관될 때 최소한 28 일의 기간 동안 안정되고, 여기서 최소한 28 일 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 2% 이내의 증가를 지칭함.
- 청구항 1에 있어서, 가스는 부피로 2% 이내의 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 2에 있어서, 가스는 부피로 1% 이내의 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 3에 있어서, 가스는 부피로 1%보다 적은 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 4에 있어서, 가스는 부피로 0.1% 이내의 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 액체 제제는 재조합 단백질을 10 mg/ml보다 적은 농도에서 내포하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 6에 있어서, 재조합 단백질의 농도는 5 mg/ml보다 적은 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 7에 있어서, 재조합 단백질의 농도는 2 mg/ml보다 적은 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 액체 제제는 재조합 단백질을 1 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도에서 내포하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 1 내지 9 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질은 45℃에서 보관될 때 최소한 3 개월의 기간 동안 안정되고, 여기서 최소한 3 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 10% 이내의 증가를 지칭하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 10에 있어서, 최소한 3 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 5% 이내의 증가를 지칭하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 11에 있어서, 최소한 3 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 고분자량 종류의 백분율에서 1%보다 적은 증가를 지칭하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 액체 제제에서 재조합 단백질 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 안정된 액체 약물 산물, 여기서 상기 가스는 부피로 5%보다 적은 산소를 포함하고, 그리고 상기 재조합 단백질은 45℃에서 보관될 때 최소한 28 일의 기간 동안 안정되고, 여기서 안정은 미리 결정된 역치 초과 또는 미만에서 최소한 하나의 산물 CQA에서 변화를 지칭함.
- 액체 제제에서 재조합 단백질 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물, 여기서 상기 가스는 부피로 1%보다 적은 산소를 포함하고, 그리고 상기 항원 결합 단백질은 5℃에서 보관될 때 최소한 31 개월의 기간 동안 안정되고, 여기서 최소한 31 개월 동안 안정은 상기 기간에 걸쳐 주요 충전 변이체 종류의 백분율에서 10% 이내의 변화를 지칭함.
- 액체 제제에서 재조합 단백질 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물, 여기서 상기 가스는 부피로 1%보다 적은 산소를 포함함.
- 청구항 15에 있어서, 가스는 부피로 0.1% 이내의 산소를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 1 내지 16 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질은 항원 결합 단백질인 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 17에 있어서, 항원 결합 단백질은 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 17에 있어서, 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 1 내지 19 중에서 어느 한 항에 있어서, 용기는 바이알인 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 청구항 20에 있어서, 바이알은 하나 또는 그 이상의 벤트 레그를 갖는 마개를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 산물.
- 액체 제제에서 재조합 단백질 및 감소된 산소 함량을 갖는 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 재조합 단백질의 액체 제제를 내포하는 하나 또는 그 이상의 용기를 대기압 하에 진공 챔버 내로 부하하고;
(b) 챔버를 0.05 bar 내지 0.15 bar의 첫 번째 압력에서 배기시키고;
(c) 챔버를 첫 번째 압력보다 크지만 1 bar보다 낮은 두 번째 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고; 그리고
(d) 하나 또는 그 이상의 용기를 밀봉하고,
여기서 상기 방법은 5-45℃ 범위의 온도에서 수행되고, 그리고 밀봉된 용기는 부피로 5%보다 적은 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함함. - 청구항 22에 있어서, 하나 또는 그 이상의 용기를 밀봉하기에 앞서 단계 (b)와 (c)를 1회 또는 그 이상의 추가 횟수로 반복하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 또는 23에 있어서, 첫 번째 압력은 약 0.1 bar인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 24 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 압력은 약 800 mbar 내지 약 1000 mbar인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 25 중에서 어느 한 항에 있어서, 온도는 약 15-25℃의 범위 안에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 26에 있어서, 온도는 약 19℃인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 27 중에서 어느 한 항에 있어서, 밀봉된 용기는 부피로 2%보다 적은 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 28에 있어서, 밀봉된 용기는 부피로 1%보다 적은 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 29에 있어서, 밀봉된 용기는 부피로 0.1% 이내의 산소를 갖는 공간부분 가스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 30 중에서 어느 한 항에 있어서, 액체 제제는 재조합 단백질을 1 mg/ml 내지 200 mg/ml의 농도에서 내포하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 30 중에서 어느 한 항에 있어서, 액체 제제는 재조합 단백질을 10 mg/ml보다 적은 농도에서 내포하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 32에 있어서, 재조합 단백질의 농도는 5 mg/ml보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 33에 있어서, 재조합 단백질의 농도는 2 mg/ml보다 적은 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질은 항원 결합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 35에 있어서, 항원 결합 단백질은 단일특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 35에 있어서, 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 37 중에서 어느 한 항에 있어서, 용기는 바이알인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 38에 있어서, 바이알은 하나 또는 그 이상의 벤트 레그를 갖는 마개를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 39에 있어서, 하나 또는 그 이상의 벤트 레그는 단계 (b) 및/또는 단계 (c) 동안 부분적으로 밀폐되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 39 또는 40에 있어서, 하나 또는 그 이상의 벤트 레그는 단계 (d) 동안 완전히 밀폐되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22에 있어서, 챔버 내에 압력은 피라니 진공 게이지를 통해 계측되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 42 중에서 어느 한 항에 있어서, 비-산화 가스는 질소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 42 중에서 어느 한 항에 있어서, 비-산화 가스는 아르곤인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22 내지 42 중에서 어느 한 항에 있어서, 비-산화 가스는 헬륨, 크세논, 네온, 크립톤 및 라돈으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 액체 제약학적 제제를 내포하는 밀봉된 용기의 공간부분에서 산소 함량을 제어하는 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 밀봉된 용기의 공간부분에서 원하는 최종 산소 함량을 결정하고;
(b) 산소 환원의 첫 번째 주기 이후에 종료 산소 함량 %를 방정식 (I)을 통해 계산하고:
(I)
여기서 %O2,시작은 첫 번째 주기의 시작 시점에서 산소 함량 %이고, P진공은 산소 환원의 첫 번째 주기에서 적용된 배기 압력이고, P환기는 P진공보다 높지만 1 bar보다 낮은 압력이고, 그리고 %O2 . 종료는 첫 번째 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이고;
(c) 원하는 최종 산소 함량이 도달될 때까지, 방정식 (I)을 추가 주기 (여기서 %O2,시작은 선행 주기의 종료 시점에서 산소 함량 %이다)에 임의선택적으로 적용하고; 그리고
(d) 하기에 의해 밀봉된 용기에서 약물 산물을 제조함: (i) 진공 챔버에서 개봉된 용기를 P진공에서 배기시킴으로써 산소 환원의 하나 또는 그 이상의 주기를 수행하고, 여기서 P진공은 0.05 bar 내지 0.15 bar의 압력이고, 그리고 진공 챔버에서 개봉된 용기를 800 mbar 내지 1000 mbar의 환기 압력에서 비-산화 가스로 환기시키고; 그리고 (ii) 용기를 밀봉함. - 액체 제제에서 재조합 단백질 및 가스를 포함하는 공간부분을 내포하는 밀봉된 용기를 포함하는 약물 산물, 여기서 상기 가스는 제어되고 미리 결정된 산소 수준을 포함하고, 그리고 여기서 상기 용기는 하나 또는 그 이상의 벤트 레그를 갖는 마개를 포함함.
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