CN111051340A - 稳定的抗体组合物及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有诸如抗原结合蛋白的稳定的液体重组蛋白、组合物和包含少于5％的氧气的顶部空间气体；以及生产所述药品的方法。因此，本发明提供了用于在密封容器中控制药品的顶部空间中的氧气水平的方法，所述密封容器含有稳定的液体重组蛋白组合物和包含少于21％的氧气的顶部空间气体。

Description

稳定的抗体组合物及其生产方法
技术领域
本发明涉及液体抗体组合物以及通过最小化和/或控制容器顶部空间中的氧化气体的水平来生产此类组合物的方法，所述容器在施用前填充和储存有所述组合物。
技术背景
正在继续开发包括单特异性和双特异性抗体在内的抗体治疗剂用于治疗多种疾病和疾患，包括癌症和自身免疫性疾病的治疗。随着针对特定靶标的抗体分子生产的改进，抗体效力也得到了提高。无论是以高浓度储存以用于小体积施用还是以较低浓度储存以用于高效治疗，当存在于填充和储存在药品容器诸如小瓶并通过注射器施用的液体制剂中时，抗体分子都容易被氧化。人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)强调了保持稳定的组成以最大程度地减少由于氧化或其它降解过程引起的生物活性剂损失的重要性。根据ICH规范(Q6A和Q6B)，如果药物物质如通过适当的分析方法所证明的，在特定制剂中以及在新药申请中提出的特定储存条件下不降解，则可在监管机构批准后减少或消除降解产物测试。
现有技术中已经讨论了氮气或惰性气体(例如，氩气)用于替代药品容器的顶部空间中的“空气”。EP1174148讨论了浓度为2mg/ml的Fab片段组合物的制备，其中在实验室规模的冻干室中通过反复循环用氮气吹扫每个小瓶的气体顶部空间(即，不适合于良好生产规范(GMP)标准)。EP1174148既未提及氮气吹扫后的顶部空间气体的氧气浓度，也未提供将顶部空间中的氧气含量控制在预定目标水平的指导，但在高分子量(HMW)杂质存在的情况下，在加速稳定性储存条件下(例如，40℃持续1个月)观察到显著的百分比增加。在几个实例中，在40℃下放置1个月后，HMW物质的增加超过300％(表1)，而在40℃下储存三个月产生超过14倍的HMW物质的增加(表4)。类似地，US 2016/0129028讨论了氮覆盖方法用于保持多糖稳定性，US 2012/0183531讨论了使用氮气或惰性气体减少或替代蛋白质药品的顶部空间中的氧气，以防止或抑制由于组氨酸缓冲剂的氧化而导致的黄色形成。制药工业中需要减少由于氧化而引起的药品降解的发生率或影响的可靠方法。
发明内容
在第一方面，本发明提供了药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白或抗体)和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于5体积％的氧气，并且重组蛋白在45℃储存时可稳定至少28天的时期。在此上下文中，稳定至少28天是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过2％。
在一些情况下，气体包含不超过2体积％的氧气，不超过1体积％的氧气，少于1体积％的氧气或不超过0.1体积％的氧气。
在某些实施方案中，药品的液体制剂含有浓度为约2mg/ml至200mg/ml的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白)。在一些实施方案中，药品的液体制剂含有浓度为约150-200mg/ml的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白)。在一些实施方案中，药品的液体制剂含有浓度低于10mg/ml、低于5mg/ml或低于2mg/ml的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白)。
在一些实施方案中，药品含有重组蛋白，该重组蛋白在45℃下储存时稳定至少三个月，其中稳定至少三个月是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过10％。在一些情况下，重组蛋白的稳定性是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过5％，或者在此期间高分子量物质的百分比增加少于1％。
在另一个方面，本发明提供了药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白或抗体)和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于1体积％的氧气，并且重组蛋白在5℃储存时可稳定至少31个月的时期。在此上下文中，稳定至少31个月是指在此期间主要电荷变体物质(main charge variantspecies)的百分比的变化不超过10％。
在另一个方面，本发明提供了药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白)和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于1体积％的氧气。在一些实施例中，气体包含不超过0.1体积％的氧气。在一些实施方案中，重组蛋白以低于5mg/ml的浓度存在于液体制剂中。在一些实施方案中，重组蛋白以低于约2mg/ml的浓度存在于液体制剂中。在一些实施方案中，重组蛋白以低于2mg/ml的浓度、约1.5mg/ml或1mg/ml的浓度存在于液体制剂中。
在上文或本文中论述的药品的各种实施方案中，重组蛋白是抗原结合蛋白。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体。在一些情况下，抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在一些情况下，药品容器是小瓶。在某些实施方案中，小瓶包括塞子，诸如橡胶塞子，所述塞子包括排气柱。在一些情况下，药品进一步通过注射器施用或被转移至注射器或注射装置。
在另一个方面，本发明提供了在密封容器中制备药品的方法，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白(例如，抗原结合蛋白或抗体)和包含具有降低的氧气含量的气体的顶部空间，所述方法包括：(a)在大气压下将一个或多个含有重组蛋白液体制剂的容器装载至真空室中；(b)以0.05巴至0.15巴的第一压力对室抽气；(c)在800毫巴至1000毫巴的第二压力下用非氧化性气体给室充气；以及(d)将一个或多个容器密封在密封的真空室内，其中在15-25℃的范围内的温度下进行所述方法，并且所述密封的容器包含具有少于5体积％的氧气的顶部空间的气体。
在一些实施方案中，所述方法还包括在密封一个或多个容器之前，额外重复步骤(b)和(c)一次或多次。
在一些情况下，第一压力为约0.1巴，和/或第二压力为0.2巴至0.1巴或0.1巴至0.12巴。在一些实施方案中，通过皮拉尼真空计测量室中的压力。在一些实施方案中，温度为约19℃。
在另外的实施方案中，可在惰性气体覆盖之前将塞子部分塞住，然后在惰性气体覆盖处理之后将其完全塞住并密封。在一些情况下，密封容器包含具有少于2体积％的氧气、少1体积％的氧气或不超过过0.1体积％的氧气的顶部空间气体。
在一些实施方案中，根据上文或本文论述的方法制备的药品中的液体制剂含有浓度为2mg/ml至200mg/ml的重组蛋白。在其它实施方案中，根据上文或本文论述的方法制备的药品中的液体制剂含有浓度为150-200mg/ml的重组蛋白。在一些实施方案中，根据上文或本文论述的方法制备的药品中的液体制剂含有浓度低于10mg/ml、低于5mg/ml或低于2mg/ml的重组蛋白。
在上文或本文中论述的方法的各种实施方案中，重组蛋白是抗原结合蛋白或抗体。在一些情况下，抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在一些情况下，本发明方法中使用的药品容器是小瓶。在另外的实施方案中，小瓶包括具有排气柱的用于冻干产品的橡皮塞(可在惰性气体覆盖之前将其部分塞住，然后在惰性气体覆盖处理之后将其完全塞住并密封)。
在另一个方面，本发明提供了控制包含液体药物制剂的密封容器的顶部空间中的氧气含量的方法，其中所述方法包括：(a)确定密封容器的顶部空间中所需的最终氧气含量；(b)通过方程式(I)计算氧气减少的第一周期后的结束时氧气含量％：
Figure BDA0002393315910000051
其中O2,起始％是第一周期开始时的氧气含量％，P真空是在氧气减少的第一周期中施加的抽气压力，P充气是高于P真空但低于1巴的压力，O2,结束％是第一周期结束时的氧气含量％；(c)任选地将方程式(I)应用于其它周期，其中O2,起始％是前一周期结束时的氧气含量％，直至达到所需的最终氧气含量；以及(d)通过以下在密封容器中制备药品：(i)通过以下来进行一次或多次氧气减少周期：P真空(其中P真空是0.05巴至0.15巴的压力)下对真空室中的未密封的容器进行抽气，并在800毫巴至1000毫巴的充气压力下用非氧化性气体对真空室中的未密封容器充气；以及(ii)将容器密封在密封的冻干室内。
如果对药品顶部空间中的氧气含量％的要求较低(例如，低于约2％)，则执行多个氧气减少周期以达到目标氧气含量水平。通过方程式(II)定义在使用相同的真空压力和充气压力进行多个氧气减少周期之后的氧气含量％。
Figure BDA0002393315910000052
其中O2,起始％是第一周期开始时的氧气含量％，P真空是在该氧气减少周期中施加的抽气压力，P充气是用惰性气体充气的压力，O2,结束％是多个周期结束时的氧气含量％；并且n为施加到产品上的总氧气减少周期数。因此，通过求解方程式(II)获得在小瓶的顶部空间中达到最终氧气水平所需的氧气减少周期数。
在上文或本文论述的方法的各种实施方案中，非氧化性气体选自由以下组成的组：氮气、氩气、氦气、氙气、氖气、氪气和氡气。在一个实施方案中，非氧化性气体是氮气。在一个实施方案中，非氧化性气体是氩气。
可将上文或本文论述的各种实施方案以与本发明一致的任何方式组合。其它实施方案将根据随后的详细描述的评述变得显而易见。
附图说明
图1举例说明对于在5℃下储存31个月后的双特异性抗体的液体制剂，作为顶部空间氧气含量的函数的通过CEX-UPLC获得的主要电荷变体物质的百分比变化。
图2举例说明对于根据本文论述的方法，使用氮气覆盖在45℃下储存28天后的双特异性抗体的液体制剂，作为顶部空间氧气含量的函数的高分子量物质的百分比增加。
图3举例说明对于根据本文论述的方法，使用氮气覆盖在45℃下储存3个月后的双特异性抗体的液体制剂，作为顶部空间氧气含量的函数的高分子量物质的百分比增加。
图4举例说明对于根据本文论述的方法，使用氩气覆盖在45℃下储存3个月后的双特异性抗体的液体制剂，作为顶部空间氧气含量的函数的高分子量物质的百分比增加。
具体实施方式
在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意是限制性的，因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。如本文中所用，术语“约”在关于特定的所引用的数值使用时，意指所述值可与所引用的值相差不超过1％。举例来说，如本文中所用，表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然与本文中所描述的那些相似或等效的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利公共出版物通过引用整体并入本文。
定义
如本文中所用，术语“重组蛋白”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有蛋白质，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的蛋白质。
术语“抗原结合分子”或“抗原结合蛋白”包括抗体和抗体的抗原结合片段，包括例如，单特异性和双特异性抗体。
如本文中所用，术语“抗体”意指包含至少一个与特定抗原特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。如本文中所用，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)以及其多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着称为框架区(FR)的更保守的区域。各个VH和VL通常由按下列顺序从氨基端至羧基端排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4组成。在本发明的不同实施方案中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然或人工修饰的。可基于两个或更多个CDR的并排分析来定义氨基酸共有序列。
如本文中所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文中所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术(诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术)例如从完整的抗体分子衍生而来，所述重组基因工程技术涉及编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操作和表达。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA库(包括，例如，噬菌体-抗体库)获得或可以合成。可以化学地或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)诸如CDR3肽))或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。其它工程改造的分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、纳米抗体(例如，单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也包含在本文中所用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可具有任何尺寸或氨基酸组成，并且通常将包含至少一个与一个或多个框架序列相邻或与其同框的CDR。在具有VH结构域(与VL结构域缔合的)的抗原结合片段中，VH与VL结构结构域可以以任何适当的排布相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且包含VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可包含单体VH或VL结构结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3以及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上面列出的任何示例性构型，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接，或者可以通过全部或部分铰链或接头连接。铰链区可包含至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸，所述氨基酸可在单个多肽分子的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以以彼此非共价结合缔合的方式包含以上列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，和/或具有一个或多个单体VH或VL(例如，通过一个或多个二硫键)。
与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够与单独的抗原或相一抗原上的不同表位特异性结合。可使用本领域可用的常规技术，使任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，适于在本发明抗体的抗原结合片段的情况下使用。
如本文中所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以例如在CDR中，特别是在CDR3中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”不意图包括其中源自另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已被移植至人框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是重组人抗体。如本文中所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下文中进一步描述的)、从重组、组合人抗体库分离的抗体(在下文中进一步描述的)、从对于人免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经受体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列而言为转基因的动物时，为体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关，但可以不天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
人抗体可以以两种与铰链异质性缔合的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。即使在亲和纯化后，也很难分离出这些形式。
第二种形式在各种完整的IgG同种型中的出现频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可将第二种形式的出现显著降低(Angal等(1993)Molecular Immunology 30:105)至通常使用人IgG1铰链观察到的水平。本发明包括在铰链、CH2区或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，所述突变例如在所需抗体形式的产生中、提高所述抗体形式的产率是所需的。
本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文中所用，“分离的”抗体意指已被鉴定并且与其自然环境的至少一种组分分开的和/或从所述组分回收的抗体。例如，就本发明而言，已经与生物体的至少一种组分或天然存在或天然产生该抗体的组织或细胞分离或从所述组分或组织或细胞取出的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历了至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。
本发明还包括结合特定抗原的单臂抗体。如本文中所用，“单臂抗体”意指包含单个抗体重链和单个抗体轻链的抗原结合分子。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合部位相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有不止一个表位。因此，不同的抗体可与抗原上的不同区域结合并且可具有不同的生物作用。表位可以是构象性的或线性的。构象表位是由来自线性多肽链的不同区段的在空间上紧靠的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本同一的”表示当与另一种核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或缺失最佳比对时，如通过如下论述的任何公知的序列同一性算法(诸如FASTA、BLAST或Gap)所测量的，在至少约95％，更优选至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸核碱基中存在核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可编码与参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本相似的”是指两个肽序列，当例如通过使用默认缺口权重的GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时，共享至少95％序列同一性，甚至更优选至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置相异在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的氨基酸。通常，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列彼此相异在于保守取代的情况下，可向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正取代的保守性质。进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，通过引用并入本文。具有相似化学性质的侧链的氨基酸分的组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。另外，保守替换是Gonnet等(1992)Science 256:1443-1445(通过引用并入本文)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“中等保守”替换是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性度量来匹配相似序列。例如，GCG软件包含诸如Gap和Bestfit之类的程序，可将所述程序与默认参数一起使用，以确定紧密相关的多肽(诸如来自生物体的不同物种的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG 6.1版。还可使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)，利用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一个优选算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如，Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-402，每篇文献通过引用并入本文。
包含重组蛋白的药品和组合物
本发明的药品包括密封容器(例如，小瓶)，其中顶部空间中的气体具有与氧化性气体的大气浓度相比降低的氧化性气体(例如，氧气)浓度。本发明的药品基于发明人的方法发现，所述方法用于降低药品容器顶部空间中的氧化性气体的水平，所述容器含有重组蛋白(例如，抗原结合蛋白或抗体)的液体药物制剂。与标准冻干技术相比，液体组合物上方的顶部空间气体的抽气和充气需要对真空室中的压力进行精细控制，以最大程度地减少或消除液体组合物的起泡或飞溅，所述起泡或飞溅可导致材料损失或蒸发，这可能导致活性剂(例如，抗体)浓度的变化。对于其中活性剂以低浓度(例如，约2mg/ml)存在的高效组合物而言，材料的损失或浓度的变化尤其成问题。高浓度制剂稳定性的变化是有问题的，因为氧化降解产物可能导致复杂的纯度/杂质分布，可能导致免疫原性问题。
本发明的药品可在一些实施方案中含有具有少于5体积％的氧化性气体(例如，氧气)的顶部空间气体。药品容器的顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的浓度在各种实施方案中可以低于4.5％、低于4％、低于3.5％、低于3％、低于2.5％、低于2％或低于1.5％。在一个实施方案中，顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的浓度低于约1％。在一个实施方案中，顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的浓度不超过约0.5％。在一个实施方案中，顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的浓度不超过约0.1％。在各种实施方案中，药品容器的顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的浓度低于0.9％、低于0.8％、低于0.7％、低于0.6％、低于0.5％、低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％或低于0.1％。在一些情况下，顶部空间气体中的氧气浓度为约0.01％至约1.5％。在一些情况下，顶部空间气体中的氧气浓度为约0.75％至约1.25％。在一些情况下，顶部空间气体中的氧气浓度为约0.05％至约0.15％。
本文所述的容器可以是具有足够的体积以容纳所需量的药物制剂和顶部空间的小瓶、烧瓶等。容器可由多种合适的材料制成，所述材料相对于要容纳在其中的药物制剂表现出惰性特性，并且是充分不可渗透的以防止药物制剂的泄漏或周围空气的渗透。示例性材料包括玻璃(例如，聚碳酸酯聚苯乙烯聚丙烯玻璃)、聚合物(例如，塑料、铂固化硅酮管)和金属(例如，不锈钢316L)。在一些实施例中，容器是1型玻璃小瓶。另外，根据需要，容器可以被配置为可重复使用的部件或一次性使用的一次性部件。带有一个或多个排气柱的橡胶塞的多种设计是可用的，并适合与冻干瓶一起使用，该冻干瓶适用于本文所述的方法。包含一个排气柱(单个排气孔)、“两柱”(两个排气点)、“三柱”(三个排气点)和十字形结构(四个排气点)或甚至更多个排气孔的塞子是商购可得的。在气体覆盖/氧气减少处理中通过一个或多个朝向外部空气空间开口的充气孔部分塞住可在冻干室的小瓶中使用的塞子，然后在进行一个或多个氧气减少周期后完全塞住并与容器连接在一起密封。
本发明的药品包括包含本发明的抗原结合分子(例如，抗体)的液体药物组合物。本发明的药物组合物可使用合适的载体、赋形剂以及提供适当的转移、递送、耐受等的其它试剂进行配制。许多适当的制剂可见于所有药物化学家已知的处方集：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中。例如，赋形剂可包括稳定剂、缓冲剂、张力剂(tonicifier)、表面活性剂、有机溶剂、盐或其组合。在一些实施方案中，稳定剂选自由以下组成的组：多元醇、糖、氨基酸、非离子型表面活性剂及其组合。在一些实施方案中，张力剂选自由以下组成的组：糖、氨基酸、盐及其组合。在一些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、碳酸盐及其组合。
液体组合物中的抗原结合分子(例如，抗体)浓度可根据分子的效力和从药品容器中施用的剂量而变化。在一些情况下，浓度可在约1mg/ml至约200mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约1mg/ml至约10mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约1mg/ml至约5mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约0.1mg/ml至约2mg/ml的范围内。在各种实施方案中，浓度低于约25mg/ml、低于约20mg/ml、低于约15mg/ml、低于约10mg/ml或低于约5mg/ml。在各种实施方案中，液体组合物中抗原结合分子的浓度不超过约5mg/ml、不超过约4mg/ml、不超过约3mg/ml、不超过约2mg/ml或不超过约1mg/ml。在一个实施方案中，浓度低于约2mg/ml。在一个实施方案中，浓度低于约1mg/ml。
液体组合物中的抗原结合分子(例如，抗体)的浓度可根据从药品容器中施用的体积和剂量而变化。在一些情况下，浓度可在约1mg/ml至约200mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约10mg/ml至约200mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约50mg/ml至约100mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约100mg/ml至约150mg/ml的范围内。在一些情况下，浓度可在约150mg/ml至约200mg/ml的范围内。在一个实施方案中，浓度高于约10mg/ml。在另一个实施方案中，浓度高于约50mg/ml。在另一个实施方案中，浓度高于约100mg/ml。在一个实施方案中，浓度高于约150mg/ml。
向患者施用的抗原结合分子的剂量可根据患者的年龄和大小、目标疾病、疾患、施用途径等而变化。优选剂量通常根据体重或身体表面积来计算。当本发明的抗原结合分子用于成年患者的治疗目的时，通常以约0.01至约20mg/kg的体重，更优选约0.02至约7mg/kg的体重、约0.03至约5mg/kg的体重或约0.05至约3mg/kg的体重的单一剂量静脉内施用本发明的抗原结合分子可以是有利的。根据疾患的严重程度，可调整治疗的频率和持续时间。可凭经验确定施用抗原结合分子的有效剂量和时间表；例如，可通过定期评估来监测患者的疾病进展，并相应地调整剂量。此外，可使用本领域公知的方法进行剂量的种间类推(例如，Mordenti等,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器经皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔递送装置易于应用于本发明的药物组合物的递送。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可更换笔芯。一旦笔芯内的所有药物组合物已经被施用并且笔芯是空的，那么空的笔芯可以随手丢弃，并且替换为含有药物组合物的新笔芯。然后笔递送装置可以重复使用。在一次性的笔递送装置中，没有可更换的笔芯。相反，一次性笔递送装置预先填充有保留在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦排空贮存器的药物组合物，那么整个装置被丢弃。
可注射液体制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射的制剂可通过公共已知的方法来制备。例如，可在常规用于注射的无菌水性介质中制备可注射制剂。作为用于注射的水性介质，例如有生理盐水(一种含有葡萄糖和其它辅助剂的渗溶液)等，可将它们与适当的增溶剂诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯加合物(50mol))]等结合使用。可将由此制备的注射液填充或转移至适当的容器或装置(例如，安瓿瓶、注射器、注射装置或注射笔)中。
抗原结合分子的稳定性
减少本发明的药品容器的顶部空间中的氧化性气体(例如，氧气)的量有利地影响在容器内的液体组合物中配制的抗原结合分子的稳定性。氧化是蛋白质治疗剂(包括抗体和双特异性抗原结合分子)的主要降解途径。当活性物质的任何损失对在限定的储存期后组合物中剩余的活性剂的量具有不成比例的更大影响时，在低浓度下这种降解的影响是明显的。这种降解的表现包括高分子量(HMW)种的增加和电荷变体物质的百分比变化。可使用本领域已知的标准尺寸排阻色谱技术检测HMW物种的数量或百分比的变化(例如，Lu等，MAbs,5(1):102-113,2013)。可使用本领域已知的标准阳离子交换色谱技术检测电荷变体物质的数量或百分比的变化(例如，Chumsae等，Journal of Chromatography B,850:285-294,2007)。本发明药品中抗原结合分子的稳定性可通过将HMW或电荷变体物质的数量或百分比的变化测量为对应于特定储存条件的时间和温度参数的函数来确定。在一些情况下，储存条件可与通常在其下在制造与使用之间维持药品的那些条件相当。在其它情况下，存储条件可以是旨在在较短的时期内获得长期稳定性的指标的加速条件。
在本发明组合物的各种实施方案中，抗原结合分子(例如，抗体)在45℃下储存时保持稳定至少28天的时期。在此上下文中，稳定性可以例如指在储存期间，HMW物质的百分比增加不超过约2％。在一些情况下，在储存期间，HMW物质的百分比增加不超过约1.5％或不超过约1％。在一些情况下，抗原结合分子在45℃下稳定至少3个月的时期。在这些较长的储存条件下，稳定性可以例如指在储存期间，HMW物质的百分比增加不超过约10％。在一些情况下，在这些较长的存储条件下的稳定性可以指在储存期间HMW物质的增加不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过1％。在其它实施方案中，抗原结合分子(例如，抗体)在5℃下储存时保持稳定至少31个月的时期。在此上下文中，稳定性可以例如指在储存期间，电荷变体物质的百分比变化不超过约10％。在一些情况下，储存期可以为12个月、18个月、24个月、30个月或36个月。
在生产特定的治疗性蛋白质产品的整个过程中，某些产品质量属性可基于其潜在的临床影响来鉴定。相关质量属性可根据其对纯度、安全性和/或功效的潜在影响而被视为关键质量属性(CQA)。高分子量(HMW)物质和电荷变体只是许多产品CQA中的两个，可在制造过程中改变所述两个CQA。在制造过程中(包括在将产品填满容器中之后以及在容器存储期间中)，监测蛋白质的这些质量属性的变化。对氧化敏感的药品是指由于氧化水平升高而导致的产品CQA高于或低于该特定CQA的阈值的变化，所述变化可影响产品的纯度、安全性和/或功效。对氧化敏感的药品还指由于氧化水平升高而导致的可影响产品的纯度、安全性和/或功效的产品的变化。
在一些情况下，稳定性可以指产品CQA高于或低于预定阈值的变化，所述变化可影响产品的纯度、安全性和/或功效。
抗原结合分子的结合性质
如本文中所用，在抗原结合分子、抗体、免疫球蛋白、抗体结合片段或含Fc的蛋白质与例如预定抗原(诸如细胞表面蛋白或其片段)的结合的上下文中的术语“结合”，通常是指至少两个实体或分子结构之间的相互作用或缔合，诸如抗体-抗原相互作用。
例如，当在BIAcore 3000仪中使用抗原(作为配体)和抗体、Ig、抗体结合片段或含Fc的蛋白质(作为分析物(或抗配体))，通过例如表面等离振子共振(SPR)技术测定时，结合亲和力通常对应于约10-7M或更小，诸如约10-8M或更小，诸如10-9M的KD值。还常规地使用基于细胞的结合策略，诸如荧光激活细胞分选(FACS)结合测定，并且FACS数据与其它方法(诸如放射性配体竞争结合和SPR)具有很好的相关性(Benedict,CA,J ImmunolMethods.1997,201(2):223-31；Geuijen,CA等J Immunol Methods.2005,302(1-2):68-77)。
因此，本发明的抗体或抗原结合蛋白与预定抗原或细胞表面分子(受体)结合，所述预定抗原或细胞表面分子具有为所述抗体或抗原结合蛋白对非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力的至多1/10的对应于KD值的亲和力。根据本发明，等于针对非特异性抗原的结合亲和力或为其1/10的对应于KD值的抗体的亲和力可被认为是不可检测的结合，然而，这种抗体可以与第二抗原结合臂配对以产生本发明的双特异性抗体。
术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，或抗体或抗体结合片段与抗原结合的解离平衡常数。KD与结合亲和力之间存在反比关系，因此KD值越小，亲和力越高，即越强。因此，术语“较高的亲和力”或“较强的亲和力”涉及较高的形成相互作用的能力，因此涉及较小的KD值，相反，术语“较低的亲和力”或“较弱的亲和力”涉及较低的形成相互作用的能力，因此涉及较大的KD值。在一些情况下，与特定分子(例如抗体)与另一种相互作用伴侣分子(例如抗原Y)的结合亲和力相比，所述分子(例如抗体)与其相互作用的伴侣分子(例如抗原X)的较高的结合亲和力(或KD)可以表示为通过将较大的KD值(较低或较弱的亲和力)除以较小的KD(较高或较强的亲和力)所测定的结合比率，例如视情况表示为结合亲和力的5倍或10倍。
术语“kd”(秒-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数，或抗体或抗体结合片段的解离速率常数。所述值也称为koff值。
术语“ka”(M-1x秒-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，或抗体或抗体结合片段的结合速率常数。
术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数，或抗体或抗体结合片段的结合平衡常数。通过将ka除以kd获得结合平衡常数。
术语“EC50”或“EC50”是指半最大有效浓度，其包括在指定的暴露时间后诱导基线与最大值之间的一半反应的抗体浓度。EC50基本上代表观察到其最大作用的50％时的抗体浓度。在某些实施例中，EC50值等于产生如通过例如FACS结合测定法所测定的与表达CD3或肿瘤相关抗原的细胞的半最大结合的本发明抗体的浓度。因此，对于增加的EC50或半最大有效浓度值，观察到减小的或较弱的结合。
在一个实施方案中，减少的结合可被定义为使得能够与半最大量的靶细胞结合的增加的EC50抗体浓度。
在另一个实施方案中，EC50值代表通过T细胞的细胞毒性活性引发靶细胞的半最大耗尽的本发明的抗体的浓度。因此，对于减小的EC50或半最大有效浓度值，观察到增强的细胞毒性活性(例如T细胞介导的肿瘤细胞杀伤)。
双特异性抗原结合分子
本发明的抗原结合分子(例如，抗体)可以是单特异性、双特异性或多特异性的。多特异性抗体可对一个靶多肽的不同表位具有特异性或者可包含对不止一个靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见，例如，Tutt等1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等.,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。可将本发明的抗体与另一种功能分子例如另一种肽或蛋白质连接或共表达。例如，可将抗体或其片段与一个或多个其它分子实体(诸如另一抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式)以产生具有第二或额外的结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
如本文中所用，表述“抗原结合分子”意指与特定抗原特异性结合的蛋白质、多肽或分子复合物，其包含单独的或与一个或多个另外的CDR和/或框架区(FR)组合的至少一个互补决定区(CDR)或由其组成。在某些实施方案中，抗原结合分子是抗体或抗体片段，如那些术语在本文其它地方所定义的那样。
如本文中所用，表述“双特异性抗原结合分子”意指包含至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包含至少一个单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地与特定抗原特异性结合的CDR。
在本发明的某些示例性实施方案中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包含重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。在包含第一和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)的上下文下，第一抗原结合结构域的CDR可用前缀“A1”指定，而第二抗原结合结构域的CDR可以用前缀“A2”指定。因此，第一抗原结合结构域的CDR在本文中可被称为A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；而第二抗原结合结构域的CDR在本文中可被称为A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以直接或间接地彼此连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。或者，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可各自连接至单独的多聚化结构域。一个多聚化结构域与另一个多聚化结构域的缔合促进了两个抗原结合域之间的缔合，从而形成了双特异性抗原结合分子。如本文中所用，“多聚化结构域”是具有与相同或相似结构或构造的第二多聚化结构域缔合的能力的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化结构域可以是包含免疫球蛋白CH3的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分(包含CH2-CH3结构域)，例如，选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG以及每个同种型组内的任何同种异型的的Fc结构域。
本发明的双特异性抗原结合分子通常将包含两个多聚化结构域，例如，两个Fc结构域，其各自分别是单独的抗体重链的一部分。第一和第二多聚化结构域可属于同一IgG同种型，诸如，例如，IgG1/IgG1、IgG2/IgG2、IgG4/IgG4。或者，第一和第二多聚化结构域可属于不同的IgG同种型，诸如，例如，IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施方案中，多聚化结构域是包含至少一个半胱氨酸残基的Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列。在其它实施方案中，多聚化结构域是半胱氨酸残基或短的含半胱氨酸的肽。其它多聚化结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序或由其组成的肽或多肽。
任何双特异性抗体形式或技术均可用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，可将具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段与一个或多个其它分子实体(诸如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段)功能性连接(例如，通过化学偶合、基因融合、非共价缔合或其它方式)以产生双特异性抗原结合分子。可在本发明的说明书中使用的特定示例性双特异性形式包括但不限于，例如，基于scFv的双特异性形式或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(DVD)-Ig、Quadroma、结入孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有结入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见，例如，Klein等.2012,mAbs 4:6,1-11以及其中引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的上下文中，多聚化结构域(例如，Fc结构域)与Fc结构域的野生型、天然存在的形式相比可包含一个或多个氨基酸变化(例如，插入、缺失或取代)。例如，本发明包括在Fc结构域中包含一个或多个修饰的双特异性抗原结合分子，所述修饰导致在Fc与FcRn之间具有改变的(例如，增强的或减弱的)结合相互作用的经修饰的Fc结构域。在一个实施方案中，双特异性抗原结合分子在CH2或CH3区中包含修饰，其中所述修饰增强Fc结构域在酸性环境(例如，在其中pH的范围为约5.5至约6.0的内体中)中与FcRn的亲和力。此类Fc修饰的非限制性实例包括：例如，位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)、252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如，L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如，308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
本发明还包括包含第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域的双特异性抗原结合分子，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此相异在于至少一个氨基酸，并且其中与不存在氨酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异减弱所述双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig CH3结构域结合蛋白质A而第二Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白质A结合的突变，诸如H95R修饰(按IMGT外显子编号；H435R，按EU编号)。第二CH3结构域还可包含Y96F修饰(按IMGT；Y436F，按EU)。参见，例如，美国专利第8,586,713号。可在第二CH3内发现的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下的D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I，按EU)；在IgG2抗体的情况下的N44S、K52N和V82I(按IMGT；N384S、K392N和V422I，按EU)；以及在IgG4抗体的情况下的Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I，按EU)。
在某些实施方案中，Fc结构域可以是嵌合的，组合源自不止一种免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合Fc结构域含源自人IgG1、人IgG2或人IgG4 CH2区的CH2序列的一部分或全部和源自人IgG1、人IgG2或人IgG4的CH3序列的一部分或全部。嵌合Fc结构域还可含嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可包含与源自人IgG1，人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合的源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列。可包含在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的特定实例从N端至C端包含：[IgG4 CH1]-[IgG4上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4 CH2]-[IgG4 CH3]。可包含在本文所述的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一个实例从N端至C端包含：[IgG1 CH1]-[IgG1上铰链]-[IgG2下铰链]-[IgG4CH2]-[IgG1CH3]。在2014年8月28日公开的美国公开2014/0243504(其通过引用整体并入本文)中描述了可包含在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些和其它实例。具有这些一般结构排布的嵌合Fc结构域及其变体可具有改变的Fc受体结合，继而影响Fc效应子功能。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特征的抗体和双特异性抗原结合分子。例如，本发明的抗体可以与中性pH相比在酸性pH下表现出与抗原的结合减弱。或者，本发明的抗体可以与中性pH相比在酸性pH下表现出与抗原的结合增加。表述“酸性pH”包括小于约6.2，例如，约6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小的pH值。如本文中所用，表述“中性pH”意指约7.0至约7.4的pH。表述“中性pH”包括约7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些情况下，“与中性pH相比在酸性pH下与......结合减弱”以抗体在酸性pH下与其抗原结合的KD值与所述抗体在中性pH下与其抗原的结合的KD值的比率(或反之亦然)表示。例如，如果抗体或其抗原结合片段表现出约3.0或更大的酸性/中性KD比率，则出于本发明的目的，抗体或其抗原结合片段可被认为表现出“与中性pH相比在酸性pH下与MUC16的结合减弱”。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比率可为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。
可以例如通过筛选与中性pH相比在酸性pH下与特定抗原的结合减弱(或增强)的抗体群体来获得具有pH依赖性结合特性的抗体。另外，抗原结合结构域在氨基酸水平上的修饰可产生具有pH依赖性特征的抗体。例如，通过用组氨酸残基取代抗原结合结构域的一个或多个氨基酸(例如，CDR内的)，可获得相对于中性pH在酸性pH下抗原结合减弱的抗体。
包含Fc变体的抗体
根据本发明的某些实施方案，抗体和双特异性抗原结合分子包括Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如与中性pH相比在酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变，其中所述一个或多个突变增强Fc结构域在酸性环境(例如，在其中pH的范围为约5.5至约6.0的内体中)中与FcRn的亲和力。当向动物施用时，此类突变可导致抗体的血清半衰期延长。此类Fc修饰的非限制性实例包括：例如，位置250(例如，E或Q)、250和428(例如，L或F)、252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如，308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
例如，本发明包括抗体和双特异性抗原结合分子，所述分子和双特异性抗原结合分子包括Fc结构域，所述Fc结构域包含选自由以下各项组成的组的一对或多对或一组或多组突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；以及433K和434F(例如，H433K和N434F)。前述Fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其它突变的所有可能的组合均涵盖在本发明的范围内。
抗原结合结构域的制备和双特异性分子的构建
对特定抗原特异的抗原结合结构域可通过本领域已知的任何抗体生成技术来制备。一旦获得，可使用常规方法相对于彼此适当地排列对两种不同抗原特异的两个不同抗原结合结构域，以产生本发明的双特异性抗原结合分子。在某些实施方案中，本发明的多特异性抗原结合分子的一个或多个单个组件(例如，重链和轻链)源自嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。制备此类抗体的方法是本领域公知的。例如，可使用VELOCIMMUNETM技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的一个或多个重链和/或轻链。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其它人抗体生成技术)，首先分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对特定抗原的高亲和力嵌合抗体。对抗体进行表征并选择其所需特征，包括亲和力、选择性、表位等。用所需的人恒定区替换小鼠恒定区，以产生可被掺入本发明的双特异性抗原结合分子的完全人重链和/或轻链。
可将基因工程改造的动物用于制造人双特异性抗原结合分子。例如，可使用不能重排和表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的遗传修饰小鼠，其中该小鼠仅表达由与内源性小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因可操作地连接的人免疫球蛋白序列编码的一个或两个人轻链可变结构域。这样的遗传修饰小鼠可用于产生完全人双特异性抗原结合分子，其包含与相同轻链缔合的两条不同的重链，所述轻链包含源自两个不同的人轻链可变区基因区段之一的可变域。(参见，例如，US 2011/0195454)。完全人是指这样的抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域，其在抗体或其抗原结合片段或免疫球蛋白结构域的每条多肽的全长上包含由源自人序列的DNA编码的氨基酸序列。在一些情况下，完全人序列源自对于人是内源的蛋白质。在其它情况下，完全人蛋白质或蛋白质序列包含嵌合序列，其中每个组件序列均源自人序列。尽管不受任何一种理论的束缚，但例如，与任何野生型人免疫球蛋白区域或结构域相比，嵌合蛋白或嵌合序列通常被设计成使组件序列的连接处的免疫原性表位的产生减少至最少。
减少药品容器顶部空间中氧化性气体的方法
本发明的方法通过使由氧化降解引起的电荷变体和/或聚集体减少至最少，为药品提供了更大的稳定性和保存期限。本发明的方法包括抽气药品容器顶部空间中的气体，以及随后用非氧化性气体(例如，氮气或氩气)对顶部空间进行充气，以降低氧气和/或其它氧化性气体(诸如臭氧、过氧化物、氯、氟、一氧化氮、二氧化氮、一氧化二氮或其组合)的浓度。该方法可以在真空室(例如，冻干室)中进行。在一个实施方案中，真空室装有皮拉尼真空计(导热系数计)以精确地测量压力，从而将压力控制在本文确定的范围内。在各种实施方案中，所述方法在无菌条件下和/或在满足药品生产的良好生产规范(GMP)标准的条件下进行。
本发明的方法可用于在密封容器中制备药品，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白或抗原结合蛋白(例如，抗体或双特异性抗原结合分子)。制备药品以在药品容器的顶部空间中包含浓度降低的氧气和/或其它氧化性气体。根据本发明在密封容器中制备药品的方法包括(a)在大气压力下将一个或多个含有重组蛋白或抗原结合蛋白(例如，抗体)的液体制剂的容器装载至真空室中，(b)在约0.05巴至约0.15巴的第一压力下对室抽气，(c)在约800毫巴至约1000毫巴的第二压力下用非氧化性气体对室进行充气，以及(d)将所述一个或多个容器密封在密封的真空室内。在一些实施方案中，在密封一个或多个容器之前，将所述方法步骤(b)和(c)重复一次或多次，以进一步降低顶部空间中的氧化性气体的浓度。在各种实施方案中，本发明的方法可用于产生在容器顶部空间中具有少于5体积％的氧气(或其它氧化性气体)的药品。在一些情况下，氧化性气体浓度降低至低于4％、低于3％、低于2％或低于1％。在一些实施方案中，所述氧化性气体(例如，氧气)的浓度不超过0.5％，不超过0.4％，不超过0.3％，不超过0.2％或不超过0.1％。
在一些实施方案中，可预先确定氧气(或其它氧化性气体)的最终期望浓度，并且可相应地调整以上论述的抽气/充气过程的周期数以实现所需最终浓度。例如，在一个实施方案中，控制密封药品容器的顶部空间中的氧气含量的方法包括：(a)确定密封容器的顶部空间中的所需最终氧气含量；(b)通过方程式(I)计算在氧气减少的第一周期之后的结束时氧气含量％：
Figure BDA0002393315910000281
其中O2,起始％是第一周期开始时的氧气含量％，P真空是在氧气减少的第一周期中施加的抽气压力，P充气是高于P真空但低于1巴的压力，O2,结束％是第一周期结束时的氧气含量％；(c)任选地将方程式(I)应用于其它周期，其中O2,起始％是前一周期结束时的氧气含量％，直至达到所需最终氧气含量；以及(d)通过以下在密封容器中制备药品：(i)通过以下来进行一个或多个氧气减少周期：在P真空(其中P真空是0.05巴至0.15巴的压力)下对真空室中的未密封的容器进行抽气，并在800毫巴至1000毫巴的充气压力下用非氧化性气体对真空室中的未密封容器充气；以及(ii)密封容器。
在各种实施方案中，将压力维持在水的蒸气压以上以避免含有重组蛋白或抗原结合蛋白的液体制剂蒸发。在各种实施方案中，真空室的抽气和/或充气在约0.02巴至约0.2巴的压力下进行。在一个实施方案中，抽气在约0.1巴的压力下进行，充气在约800毫巴至约1000毫巴的压力下进行充气。在真空室的充气中使用的非氧化性气体可以选自：例如，氮气、氩气、氦气、氙气、氖气、氪气和氡气。在一个实施方案中，非氧化性气体是氮气。在另一个实施方案中，非氧化性气体是氩气。在各种实施方案中，所述方法在约5℃至45℃的范围内或约10℃至37℃的范围内的温度下进行。在各种实施方案中，所述方法在约15℃至25℃的范围内的温度下进行。在一些情况下，温度为约15℃、约16℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃或约25℃。在一实施方案中，将所有周期的温度维持在约19℃。
根据本发明的方法密封在药品容器内的重组蛋白或抗原结合蛋白组合物可以是以上或本文论述的各种组合物中的任何一种。例如，抗原结合蛋白(例如，抗体)的液体组合物可用各种赋形剂(包括缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、表面活性剂等)配制，并且蛋白质可以以约0.1mg/ml至约200mg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，抗体或其它抗原结合蛋白的浓度为约1mg/ml至约25mg/ml、1mg/ml至约15mg/ml或约1mg/ml至约10mg/ml。在一些情况下，所述浓度低于10mg/ml、低于5mg/ml、低于2mg/ml或低于1mg/ml。
如上所论述的，在降低一个或多个容器内的顶部空间气体的氧化性气体含量之后，将所述一个或多个容器完全封闭/塞住并最终密封。塞子可由多种材料(例如，聚合物、橡胶)制成，并表现出与容器接合所需的弹性体性质(例如，足够的刚性、延展性)。在一些实施方案中，塞子由合成橡胶形成。在一些实施方案中，塞子由丁基橡胶形成。塞子可包含一个或多个排气孔或排气柱。塞子可适于形成并保持弹性体密封，并且在一些实施方案中，可以是适于常规冻干程序的塞子。因此，在气体覆盖/氧气减少处理中用一个或多个朝向外部空域开口的排气孔部分塞住可在冻干室中的小瓶中使用的塞子，然后在进行一次或多次氧气减少周期后完全塞住并与容器连接在一起密封。FDA指南“Lyophilization ofParenteral(7/93)’以及Bhambhani和Medi,“Selection of Containers/Closures forUse in Lyophilization Applications:Possibilities and Limitations,”AmericanPharmaceutical Review,2010年5月1日(其内容由此通过引用整体并入)中提供了冻干系统、封闭帽和塞子的构造的实例。
实施例
提出下面的实施例以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和描述，并且不旨在限制本发明人认为是其发明的发明范围。已试图确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例1：减少药品顶部空间中的氧气
在本实施例中，将标准GMP冻干室用作真空室，该室装有用于测量的皮拉尼真空计和用于控制压力的针阀。在两个周期的过程中，将液体制剂中浓度为2mg/ml的双特异性抗体包装在装有排气柱橡胶塞并覆盖有氮气的小瓶中，以将顶部空间的氧气存在从～21％降低至约0.25％。
表1：非氧化性气体覆盖处理
Figure BDA0002393315910000301
一旦将小瓶放入室中，就抽真空(步骤6)以从室中除去气体(其开始时是含～21％的氧气的空气)。压力(100,000微巴)高于水的蒸气压，以避免蒸发、泡沫形成和潜在的飞溅，并使用皮拉尼真空计进行测量。在普通冻干条件下，存在达到低得多的压力(约150微巴)的真空，因此可使用电容式压力计控制压力。然而，电容式压力计仅在压力低于2000微巴时才是准确的，而不能用于控制100,000微巴时的压力。
达到100,000微巴的压力后，将氮气填充室中，以替换排出的空气。
第二次重复该处理进一步降低氧气水平(下面的第2周期步骤3-4)。一旦达到所需氧气水平，就将小瓶塞住(下面的第2周期步骤5)。
表2:非氧化性气体覆盖处理，续
Figure BDA0002393315910000311
氧气含量方程：
Figure BDA0002393315910000312
P＝压力
根据上面实施例1中论述的方法进行示例计算：
周期1
P真空＝100毫巴
P充气＝912毫巴
％O2，起始＝21％(从室内的空气开始)
Figure BDA0002393315910000321
％O2，结束＝2.3％
周期2
P真空＝100毫巴
P充气＝900毫巴
％O2，起始＝2％
Figure BDA0002393315910000322
％O2，结束＝0.25％
实施例2：药品的稳定性测试
采用不同的顶部空间氧气的浓度，对使用实施例1中论述的方法制备的各种药品进行了稳定性分析，并将其与其中顶部空间氧气处于或接近大气水平(～21％)的对照进行了比较。在一些情况下(在本文中指出的)，在该方法的充气部分中，用氩气替代氮气。使用尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UPLC)检测高分子量(HMW)物质，并使用阳离子交换超高效液相色谱(CEX-UPLC)检测电荷变体物质。
如图1所示，通过氮覆盖将顶部空间氧气含量从21％降低至低于1％减少了在5℃下储存31个月后通过CEX-UPLC观察到的双特异性抗体的降解。在氧气含量为21％的情况下，主要电荷变体物质的百分比变化为约46.25％，而在氧气含量<1％的情况下，在储存期间百分比变化降低至约8.75％。
如图2所示，通过氮覆盖将顶部空间氧气含量从21％降低至0.1％，如通过在45℃下储存28天后HMW物质存在的百分比增加的减少所显示的，提高了第二种双特异性抗体的稳定性。在氧气含量为21％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约8.62％。在氧气含量为15％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约8.53％。在氧气含量为10％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约4.74％。在氧气含量为5％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约1.42％，在氧气含量为0.1％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约0.24％。
图3举例说明了在降低顶部空间氧气含量的氮气覆盖处理后，在45℃下储存3个月后观察到的针对第二双特异性抗体的HMW物质存在的百分比增加的降低。在氧气含量为5％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约9.66％。在氧气含量为2％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约7.27％。在氧气含量为1％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约4.54％，在氧气含量低于1％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约0.34％氧气。
图4举例说明除在覆盖处理中用氩气替换氮气外，与图3中相同的在45℃下储存3个月的第二种双特异性抗体的顶部空间氧气含量。在氧气含量为5％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约16.72％。在氧气含量为2％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约13.05％。在氧气含量为1％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加了约7.68％，在氧气含量低于1％的情况下，在储存期间HMW物质的百分比增加不可检测。
本发明的范围不受本文所描述的特定实施方案的限制。实际上，对本领域技术人员来说，本发明的各种修改，除了本文所述的那些以外，根据前面的描述将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围之内。

Claims (47)

1.一种稳定的液体药品，所述稳定的液体药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于5体积％的氧气，并且所述重组蛋白在45℃下储存时稳定至少28天的时期，其中稳定至少28天是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过2％。
2.如权利要求1所述的药品，其中所述气体包含不超过2体积％的氧气。
3.如权利要求2所述的药品，其中所述气体包含不超过1体积％的氧气。
4.如权利要求3所述的药品，其中所述气体包含少于1体积％的氧气。
5.如权利要求4所述的药品，其中所述气体包含不超过0.1体积％的氧气。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药品，其中所述液体制剂含有浓度低于10mg/ml的所述重组蛋白。
7.如权利要求6所述的药品，其中所述重组蛋白的浓度低于5mg/ml。
8.如权利要求7所述的药品，其中所述重组蛋白的浓度低于2mg/ml。
9.如权利要求1至5中任一项所述的药品，其中所述液体制剂含有浓度为1mg/ml至200mg/ml的所述重组蛋白。
10.如权利要求1至9中任一项所述的药品，其中所述重组蛋白在45℃下储存时稳定至少三个月的时期，其中稳定至少三个月是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过10％。
11.如权利要求10所述的药品，其中稳定至少三个月是指在此期间高分子量物质的百分比增加不超过5％。
12.如权利要求11所述的药品，其中稳定至少三个月是指在此期间高分子量物质的百分比增加低于1％。
13.一种稳定的液体药品，所述稳定的液体药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于5体积％的氧气，并且所述重组蛋白在45℃下储存时稳定至少28天的时期，其中稳定是指至少一种产品CQA的变化高于或低于预定阈值。
14.一种药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于1体积％的氧气，并且所述重组蛋白在5℃下储存时稳定至少31个月的时期，其中稳定至少31个月是指在此期间主要电荷变体物质的百分比变化不超过10％。
15.一种药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含少于1体积％的氧气。
16.如权利要求15所述的药品，其中所述气体包含不超过0.1体积％的氧气。
17.如权利要求1至16中任一项所述的药品，其中所述重组蛋白是抗原结合蛋白。
18.如权利要求17所述的药品，其中所述抗原结合蛋白是单特异性抗体。
19.如权利要求17所述的药品，其中所述抗原结合蛋白是双特异性抗体。
20.如权利要求1至19中任一项所述的药品，其中所述容器是小瓶。
21.如权利要求20所述的药品，其中所述小瓶包括具有一个或多个排气柱的塞子。
22.一种在密封容器中制备药品的方法，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含具有降低的氧气含量的气体的顶部空间，所述方法包括：
(a)在大气压下将一个或多个含有所述重组蛋白的液体制剂的容器装载至真空室中；
(b)在0.05巴至0.15巴的第一压力下对所述室抽气；
(c)在大于第一压力但低于1巴的第二压力下用非氧化性气体对所述室充气；以及
(d)密封所述一个或多个容器，
其中所述方法在5-45℃的范围内的温度下进行，并且所述密封容器包含具有少于5体积％的氧气的顶部空间气体。
23.如权利要求22所述的方法，所述方法还包括在密封所述一个或多个容器之前，额外重复步骤(b)和(c)一次或多次。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第一压力为约0.1巴。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述第二压力为约800毫巴至约1000毫巴。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述温度在约15-25℃的范围内。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述温度为约19℃。
28.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述密封容器包括具有少于2体积％的氧气的顶部空间气体。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述密封容器包括具有少于1体积％的氧气的顶部空间气体。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述密封容器包括具有不超过0.1体积％的氧气的顶部空间气体。
31.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述液体制剂含有浓度为1mg/ml至200mg/ml的所述重组蛋白。
32.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述液体制剂含有浓度低于10mg/ml的所述重组蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述重组蛋白的浓度低于5mg/ml。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述重组蛋白的浓度低于2mg/ml。
35.如权利要求22至34中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白是抗原结合蛋白。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是单特异性抗体。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是双特异性抗体。
38.如权利要求22至37中任一项所述的方法，其中所述容器是小瓶。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述小瓶包括具有一个或多个排气柱的塞子。
40.如权利要求39所述的方法，其中在步骤(b)和/或步骤(c)期间将所述一个或多个排气柱部分封闭。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中在步骤(d)期间将所述一个或多个排气柱完全封闭。
42.如权利要求22所述的方法，其中通过皮拉尼真空计测量所述室中的压力。
43.如权利要求22至42中任一项所述的方法，其中所述非氧化性气体是氮气。
44.如权利要求22至42中任一项所述的方法，其中所述非氧化性气体是氩气。
45.如权利要求22至42中任一项所述的方法，其中所述非氧化性气体选自由以下组成的组：氦气、氙气、氖气、氪气和氡气。
46.一种控制含有液体药物制剂的密封容器的顶部空间中的氧气含量的方法，所述方法包括：
(a)确定所述密封容器的顶部空间中的所需最终氧气含量；
(b)通过方程式(I)计算在氧气减少的第一周期之后的结束时氧气含量％：
Figure FDA0002393315900000061
其中O2,起始％是所述第一周期开始时的氧气含量％，P真空是在所述氧气减少的第一周期中施加的抽气压力，P充气是高于P真空但低于1巴的压力，以及O2,结束％是所述第一周期结束时的氧气含量％；
(c)任选地将方程式(I)应用于其它周期，其中O2,起始％是所述前一周期结束时的氧气含量％，直至达到所述所需的最终氧气含量；以及
(d)通过以下在所述封容器中制备药品：(i)通过以下来进行一个或多个氧气减少周期：在P真空下对真空室中的未密封容器抽气，其中P真空为0.05巴至0.15巴的压力，以及在800毫巴至1000毫巴的充气压力下用非氧化性气体对所述真空室中的所述未密封容器进行充气；以及(ii)密封所述容器。
47.一种药品，所述药品包括密封容器，所述密封容器含有在液体制剂中的重组蛋白和包含气体的顶部空间，其中所述气体包含受控的和预定的氧气水平，并且其中所述容器包括具有一个或多个排气柱的塞子。
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