KR20200016594A - 폴리갈라신 d 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리갈라신 D를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 특히 폐암 세포 주기 진행을 정지시켜 폐암 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 한다. 더욱이, 기존 폐암 치료용 항암제에 비해 부작용이 적은 천연 치료제이며, 도라지 추출물에 비해 폐암 세포 증식 억제 효과가 뛰어나다는 이점이 있다.

Description

폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {A pharmaceutical compositon for preventing or treating lung cancer comprising polygalacin D or pharmaceutically acceptable salts thereof}

본 발명은 폴리갈라신 D를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

폐암은 남성과 여성 모두에게 암과 관련된 사망의 주요 원인이며 지난 수십년간 발병률이 증가해왔다. 폐암은 임상적으로 소세포 폐암(Small-Cell Lung Cancer, SCLC)과 비소세포 폐암(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC)으로 분류된다. 폐암 사례의 80% 이상이 NSCLC인 것으로 밝혀졌다. NSCLC는 조직학적 분류에 따라 편평 상피암(squamous carcinoma), 선암(adenocarcinoma) 및 대세포암(large cell carcinoma)으로 더 분류된다. 또한, 유전 표지자를 이용하여 NSCLC를 아형으로 분류하는 것은 치료 과정 선택과 관련하여 매우 중요하다.

편평상피암은 주로 기관지와 같은 큰 기도에 위치한다. 대세포암은 폐의 어느 부위에서나 발생할 수 있으며 그 성장과 전이는 공격적이다. 화학 요법은 대부분의 폐암의 주요 치료 옵션이다. 그러나 시스플라틴(cisplatinum)과 같은 전통적인 약물 치료는 부작용과 약물 내성으로 인해 이상적으로 고려되지 않는다. 그러므로, 연구는 새로운 화학 약물 발견에 초점을 맞춘다. 역으로, 천연 약물은 독성이 낮은 다양한 범위의 화합물처럼 신약의 원천이 될 수 있는 확실한 장점을 갖는다.

Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC. (P. grandiflorum)은 동아시아 국가 내에 잘 알려진 약용 식물이다. p. grandiflorum은 플라티코딘(platycodin) D, D2, D2, 데아피오플라티코딘(deapioplatycodin) D, D2, 폴리갈라신 D(polygalacin D, PGD) 및 플라티코닉 산 A (platyconic acid A)와 같은 풍부한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 식물로 보고되어왔다.

PGD는 트리테르페노이드 사포닌으로 분류되고 P.grandiflorum의 주요 화학 성분 중 하나이다. PGD는 잘 알려진 항암제인 플라티코딘 D와 유사한 구조를 가지고 있다.

그러나, PGD의 항암효과 및 생리적 활성에 대한 연구 결과는 거의 없다.

그러므로 도라지 추출물의 유효 성분 중 하나인 폴리갈라신 D를 활용하여 폐암 치료 및 예방에 뛰어난 효능을 보이고 천연 원료를 사용하여 부작용과 약물 내성을 줄일 수 있는 폐암 예방 또는 치료용 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 폴리갈라신 D를 이용하여 기존 항암제에 비해 항암 효과가 현저히 뛰어나고, 폐암치료에 따른 다양한 부작용을 감소시킬 수 있는 폐암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 PGD는 PI3K/Akt 신호 경로 조절을 통해 세포 생존을 억제한다.

또한, 본 발명에 따른 PGD는 카스파아제-3 및 -9 뿐만 아니라 PARP의 절단을 유도하고, 서비빈, cIAP-1 및 cIAP-2와 같은 IAP 단백질의 발현 수준을 감소시켜 세포 사멸을 유의미하게 유도한다.

이에 더하여, 본 발명에 따른 PGD는 TIMP-1, CDK2, 사이클린 A 및 E의 발현을 감소시켜 G1기에서 PGD의 세포 주기를 정지시킨다. 상기 G1기에서의 세포 주기 정지는 GSK-3β에 대한 PGD의 영향에 기인한 것일 수 있으며 업스트림 Akt 및 PGD에 의해 유도된 세포 사멸은 Akt 인산화 억제에 기인한 것일 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 PGD는 폐암 세포 사멸 및 폐암 세포 주기 정지를 유도하여 폐암 세포의 생존 능력을 감소시킨다.

도 1a 및 도 1b는 0, 10, 20, 40 μM PGD 농도로 48시간 처리 후 세포 생존률을 MTS 분석으로 평가한 결과를 나타낸 것으로, 도 1a는 A549 암 세포주 및 H460 암 세포주, 도 1b는 정상 기도 기관지 세포주 BEAS-2B 내의 세포 증식에 대한 PGD의 효과를 확인한 것이다.
도 2a, 도 2b, 도 2c는 A549 암 세포주에 대한 실험 결과이며, 도 2d, 도 2e, 도 2f는 H460 암 세포주에 대한 실험 결과이다. 이 때, 도 2a, 도 2b, 도 2d 및 도 2E는 A549 암 세포주 및 H460 암 세포주 내의 세포 사멸 및 핵 응축에 대한 PGD의 효과를 나타낸 것이며, 도 2c 및 도 2f는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 처리 후 세포 사멸률을 유세포분석기로 평가한 것을 나타낸 것이다.
도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 동안 배양한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 3a 및 도 3b는 A549 세포, 도 3c 및 도 3d는 H460 세포 내의 세포 사멸-관련 단백질 발현에 대한 PGD의 효과를 확인한 것이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 동안 배양한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 4a 및 도 4b는 A549 세포, 도 4c 및 도 4d는 H460 세포 내의 IAP 족 단백질 발현에 대한 PGD의 효과를 확인한 것이다.
도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 처리 후 세포 주기 분포를 유세포분석기로 평가한 것으로, 도 5a 및 도 5b는 A549 세포, 도 5c 및 도 5d는 H460 세포 내의 세포 주기 진행에 대한 PGD의 효과를 나타낸 것이다,
도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 동안 배양한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a 및 도 6b는 A549 세포, 도 6c 및 도 6d는 H460 세포 내의 세포 주기 진행-관련 단백질 발현에 대한 PGD의 효과를 확인한 것이다.
도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d는 표시된 농도의 PGD 및 1 μM PTX(임상적인 항암제)로 48시간 동안 배양한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것으로, 도 7a 및 도 7b는 A549 세포, 도 7c 및 도 7d는 H460 세포 내의 PI3K/Akt 경로에 대한 PGD의 효과를 확인한 것이다.
도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d는 PI3-키나아제 억제제 LY294002를 사용하거나, 사용하지 않고 예비처리한 후, 48시간 동안 20 μM PGD의 존재 또는 부재 하에 추가 배양한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 8a 및 도 8b는 PGD 처리한 A549 세포, 도 8c 및 도 8d는 H460 세포 내의 서비빈의 발현 및 PARP의 절단에 대한 Akt의 약리학적 억제를 확인한 것이다.
도 9는 PGD Normal, 10, 20 또는 40 μM 또는 PG 0.05, 0.1, 0.5 μg/ml으로 48시간 처리 후 MTS 분석으로 평가한 결과를 나타낸 것으로, A549 세포 내의 세포 독성에 대한 PGD 및 PG 처리 효과를 나타낸 것이며, A549 세포를 2 x 10⁴ 세포/ml의 밀도로 96-웰 배양 평판 내에 밤새 플레이트하였다.

본 발명은 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, ‘폴리갈라신 D'는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

본 발명에 있어서, '약학적으로 허용가능한 염'은 개체에게 비교적 비독성이고 무해한 유효 작용을 갖는 농도로서 이염에 기인한 부작용이 폴리갈라신 D의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미하며, 폴리갈라신 D로 표시되는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 모두 포함한다. 구체적으로 약학적으로 허용되는 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 있다.

상기 유리산으로는 무기산과 유기산이 사용될 수 있으며 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등이 사용될 수 있고 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 후마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등이 사용될 수 있다.

상기 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염이 있으며, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염이 유용하다.

본 발명에 있어서, '폐암'은 폐에 생긴 악성 종양을 의미하며, 폐를 구성하는 조직 자체에서 암세포가 생겨난 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생긴 뒤 혈관이나 림프관을 타고 폐로 옮겨 와서 증식하는 전이성 폐암을 포함한다. 상기 원발성 폐암은 암세포의 크기와 형태를 기준으로 비소세포 폐암과 소세포폐암을 포함한다. 상기 비소세포 폐암은 선암, 편평상피세포암, 대세포암을 포함한다. 폐암 가운데 80~85%는 비소세포 폐암인 것으로 알려져있다.

본 발명에 있어서, '예방'은 상기 조성물의 투여에 의해 폐암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, '치료'는 상기 조성물의 투여에 의해 폐암을 낫게 하는 행위를 모두 의미하는 것으로, 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 폴리갈라신 D를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 폐암 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로 폐암 세포는 비정상적으로 증식하는 특징이 있으며, 비정상적으로 증식된 폐암 세포는 주변 조직을 파괴하여 폐암을 더욱 악화시키는 바, 폴리갈라신 D를 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 폐암 세포의 증식을 억제하고 폐암 세포의 세포 사멸을 유도하여 효과적으로 폐암을 치료할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아 고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰 로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량%로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.

상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium car bonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등 이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 비경구투여는 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 사용하여 이루어질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.

용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 있어서 사용되는 용어 '투여'는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명 의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육 또는 피하 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 또 다른 예로 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 폐암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, '개선'은 상기 조성물의 투여에 의해 폐암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, '건강기능식품'이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병 방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계된 식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

시약

RPMI-1640, 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 Hyclone Laboratories inc.,(Logan, UT, USA)로부터 구입하였다. 소혈청알부민(Bovine serum albumin), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 (MTS), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) 및 디메틸 술폭사이드 (DMSO)를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. TIMP-1 (마우스, 단일클론성, sc-365905), Cdk2 (마우스, 단일클론성, sc-6248), 사이클린 A (래빗, 다클론성, sc-751), 사이클린 E (래빗, 다클론성, sc-198), P-GSK3β (마우스, 단일클론성, sc-81495), GSK3β (마우스, 단일클론성, sc-81462), PI3K (래빗, 다클론성, sc-602) 및 β-액틴 (마우스, 단일클론성, sc-47778)을 Santa Cruz Biotechnology Inc., (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 절단된 PARP (래빗, 다클론성, #9541s), 서바이빈 (래빗, 단일클론성, #2808s), Cdk4 (래빗, 단일클론성, #12790s), 사이클린 D (래빗, 단일클론성, #2978s), p-Akt (래빗, 단일클론성, #4058s) 및 Akt (래빗, 다클론성, #9272s)를 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. 카스파아제-3 (활성, 래빗, 다클론성, ALX-210-807-c100), 카스파아제-9 (활성, 래빗, 다클론성, ALX-210-816-c100), cIAP-1 (래빗, 단일클론성, ALX-803- 335-c100) 및 cIAP-2 (랫, 단일클론성, ALX-803-341-c100)을 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)로부터 구입하였고 1:1,000으로 희석하였다. 1차 항체는 1:1,000으로 희석되었다. 퍼옥시다아제가 결합된 2차 항체(rabbit, monoclonal, sc-2357; mouse, polyclonal, sc-2005; rat, polyclonal sc-2006; dilution 1:2,000)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 강화된 화학발광(chemiluminescent, ECL) 키트는 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)로부터 얻었다.

세포 배양 및 증식 분석

인간 폐암 세포 NCI-A549 및 H460은 한국세포주은행(한국, 서울)으로부터 얻었고 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 내에서 성장시켰다. 인관 기관지 상피 세포주인 BEAS-2B를 American Type Culture Collection (CRL-9609; ATCC, Manassas, vA, USA)에서 구입하였고 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 기관지 상피 세포 기본 배지 (bronchial epithelial cell basal medium (BEBM)) 내에 유지시켰다. 세포주를 37℃에서 5% CO2의 분위기로 습식 배양기 내에 유지시켰다. 세포 증식에 대한 PGD의 효과는 MTS 분석을 이용하여 결정하였다. 세포(2x10³/웰)를 96-웰 배양 평판에 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 다양한 농도(0, 10, 20, 40 μM)의 PGD를 첨가하고 세포를 48시간 동안 배양하였다. 각 배양 웰의 광학 밀도(OD)를 마이크로플레이트 판독기(Titertek Multiskan; Flow Laboratories, North Ryde, NSW, Australia)를 사용하여 490nm에서 평가하였다. 세포 증식은 다음 공식을 사용하여 계산하였다: (처리된 세포의 평균 흡광도 값 / 처리되지 않은 세포의 평균 흡광도 값) x 100

DAPI 염색

세포 핵 형태를 DAPI 염색 후 형광 현미경으로 평가하였다. A549 및 H460 세포를 48시간 동안 PGD로 처리하였다. 상기 세포를 인산 완충 식염수 (phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하고 얼음으로 차갑게 한 70% 에탄올로 고정시키고, DAPI로 염색하고, 암실 에서 37℃에서 5분간 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 세척하고 형광 현미경(Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)을 사용하여 시각화하였다.

세포 사멸(apoptosis) 검출

세포 사멸 정도를 제조사의 지시에 따라 Muse 세포 분석기 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 평가하였다. A549 및 H460 세포를 6-웰 평판(10⁵ 세포/well)에 접종하고 48시간동안 PGD(0, 10, 20 및 40 μM)로 처리하였다. 수확한 세포를 1 ml PBS로 세척하였고 150 μl의 FBS 없는 배지에 재현탁시키고 150 μl의 Muse™ Annexin V Dead Cell 키트를(EMD Millipore) 첨가하였다. 그 후 세포를 암실 내에 상온에서 20분간 배양하였다. 샘플을 Muse 세포 분석기(EMD Millipore)로 평가하였다.

세포 주기 분석

A549 및 H460 세포를 6-웰 평판(10⁵ 세포/well)에 접종하고 48시간동안 PGD(0, 10, 20 및 40 μM)로 처리하였다. 수확한 세포를 1 ml PBS로 세척하였고 3시간 동안 얼음으로 차갑게 한 70% EtOH로 고정시켰다. 고정 후에 세포를 PBS로 세척하였고 200 μl의 PBS 내에 현탁시켰다. Muse™ 세포 주기 시약 (200 μl; EMD Millipore) 을 첨가하였고 세포를 암실 내에 상온에서 30분간 배양하였다. 샘플을 Muse 세포 분석기(Merck Millipore)로 평가하였다.

웨스턴 블로팅

세포 추출물을 SDS 겔 전기 영동에 적용한 후 불화 폴리비닐리덴 막 (PVDF; EMD Millipore) 상에 전사시켰다. 상기 막을 5% 탈지 우유로 1시간 동안 차단하고 1차 항체로 조사하였다. 일련의 세척 후에, 상기 막을 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 접합된 2차 항체와 함께 추가로 배양하였다. 그 후 단백질을 ECL prime 웨스턴 블로팅 검출 시약 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)으로 보충하였다. 밴드는 ImageQuant LAS 4000 mini biomolecular imager (GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 평가하였다.

통계적 분석

통계 분석을 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 사용하여 수행하였고, 뒤이어 다중 비교를 위해 쉐페 검사(Scheffe's test)를 하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (n = 5)로 나타내었다. 모든 계산은 SPSS 통계 23 소프트웨어(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다. P가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의미한 차이를 나타내는 것으로 간주하였다.

제조예. PGD 제조

PGD 건조 뿌리의 제조를 위해 P.grandiflorum(5kg)을 7일간 상온에서 메탄올로 3번 추출하였다. 용매의 농축을 통해 물에 현탁시킨 갈색 시럽상 추출물(1.4kg)를 얻었고 에틸 아세테이트(63g) 및 n-부탄올(130g)로 연속하여 분리하였다. n-부탄올 층을 H₂0 내에 현탁시켰고, H₂O로 안정화시킨 Diaion HP-20 컬럼에 부었다(Φ = 5.0x100 cm; Mitsubishi Chemicals Corp., Tokyo, Japan). 상기 컬럼을 H₂O(2리터)로 세척한 후 MeOH(5리터)로 희석시켰다.

실험예 1. PGD의 농도에 따른 폐암 세포의 생존률 분석

폐암 세포주 증식에 대한 PGD의 효과를 결정하기 위해 MTS 분석이 수행되었다. 폐암 세포에 PGD의 농도를 증가시키면서 처리한 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. (PGD 농도=0, 10, 20, 40μM). 도 1a에 따라, PGD는 용량에 의존하는 방식으로 처리된 폐암 세포주의 성장을 방해하였다. PGD의 IC₅₀ 농도는 A549 세포 내에서 26.49 ± 1.45 μM이었고 H460 세포 내에서 20.52 ± 0.30 μM이었다. 도 1b에 따라, 40 μM에서 PGD의 처리는 정상 기도 기관지 세포주에서 세포 생존률을 70% 미만으로 감소시켰다. 추가 실험은 20 μM 이하에서 PGD를 사용하여 수행하였다.

실험예 2. 세포 사멸의 원인 분석을 위한 핵 응축 관찰

실험예 1의 A549 및 H460 세포의 감소된 생존률이 세포 사멸에 의한 결과임을 확인하기 위해, NSCLC 세포 주 내의 PGD의 세포 사멸 효과를 조사한 결과를 도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 2e 및 도 2f에 나타내었다. 본 발명에서 페메트렉시드(pemetrexed, PTX)를 PGD의 세포 사멸 효과를 평가하기 위한 대조군 시약으로 사용하였다. PTX는 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)의 임상 치료에 널리 사용되어왔다. 도 2c 및 도 2f에 나타난 바와 같이, PGD로 처리한 후 핵 응축이 A549 및 H460 세포에서 관찰되었다. 또한, 도 2a, 도 2b, 도 2d 및 도 2e에 나타난 바와 같이, PGD 처리는 초기 및 후기 세포 사멸 세포의 비율을 증가시켰다. 전체적으로, NSCLC 세포의 PGD에 의해 억제된 증식은 세포 사멸에 의한 것이다.

실험예 3. PGD의 세포 사멸 유발 메커니즘 규명을 위한 웨스턴 블롯 분석

PGD가 유도한 세포 사멸의 메커니즘을 설명하기 위해, 세포 사멸 경로에 관여하는 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 조사한 결과를 도 3a, 도 3b, 도 3c 및 도 3d에 나타내었다. 그 결과 PGD 처리는 A549 및 H460 세포 모두에서 카스파아제-3 및 -9 뿐만 아니라 PARP(Poly (ADP-ribose) polymerase)의 절단을 유발하는 것으로 나타났다(도 3a 및 도 3c에서 첫째줄과 두 번째 및 세 번째 줄을 비교). 절단된 카스파아제-3 및 -9 뿐만 아니라 PARP의 발현 수준은 처리되지 않은 세포와 비교할 때 현저하게 증가하였다.

실험예 4. PGD 농도에 따른 IAP 족 단백질 발현 수준 확인을 위한 웨스턴 블롯 분석

본질적으로 프로그램되어 있는 세포 사멸에 중요한 역할을 하는 IAP 족 단백질(IAP family of protein)의 발현에 대한 PGD의 효과를 더 조사하기 위해, NSCLC 세포를 다양한 농도의 PGD로 처리한 후, 서비빈(survivin), c-IAP-1 및 c-IAP-2를 포함하는 IAP 족 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정한 결과를 도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d에 나타내었다. 서비빈, c-IAP-1 및 c-IAP-2의 발현은 처리되지 않은 세포에 비해 특히 최고 농도의 PGD에서 감소하였다. 도 4a, 도 4b, 도 4c 및 도 4d에 나타난 바와 같이 A549 세포 내의 c-IAP-2의 발현 및 H460 세포 내의 서비빈 및 c-IAP-2의 발현은 검출할 수 없는 수준으로 감소하였다. 그 결과, PGD는 세포 사멸 단백질과 IAP 족 단백질을 조절함으로써 세포 사멸 효과를 발휘할 수 있었다.

실험예 5. PGD 농도에 따른 NSCLS 세포 증식 억제 효과 확인을 위한 유세포 분석

NSCLC 세포 증식 억제에 대한 PGD의 효과를 결정하기 위해, G0/G1, S 및 G2/M 단계 내의 세포 수를 유세포분석기(flow cytometry)로 평가하고 그 결과를 도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 나타내었다. PGD에 의한 처리는 A549 및 H460 세포 내의 세포 주기의 진행을 억제하였다. 도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d에 나타난 바와 같이, G0/G1기 세포의 백분율은 PGD 처리된 A549 및 H460 세포를 처리되지 않은 세포와 비교할 때 유의미하게 증가하였다. 또한, PGD 처리는 두 세포주 모두 G0 하위 기의 백분율이 유의미하게 증가하였다. 또한 PGD는 S 및 G2/M기 세포의 백분율을 감소시켰다.

실험예 6. PGD의 세포 주기 정지 메커니즘 평가를 위한 웨스턴 블롯 분석

PGD의 세포 주기 정지의 효과에 대한 근본적인 메커니즘을 평가하기 위해, 세포 주기 진행과 관련된 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정한 결과를 도 6a, 도 6b, 도 6c 및 도 6d에 나타내었다. PGD는 양쪽 세포 주 모두에서 TIMP-1, Cdk2, Cdk4, 사이클린(cyclin) A, D 및 E와 같은 세포 주기의 발현과 관련된 단백질의 발현 수준을 감소시켰다. 또한, 도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d에 나타난 바와 같이, PGD는 세포 주기 진행에도 관여하는 GSK3β의 인산화를 감소시켰다. 이러한 결과는 세포 주기 정지와 관련된 세포 성장에 대한 PGD의 방해 효과가 세포 주기 진행에 관련된 단백질 발현이 감소한 결과로서 유도된 것임을 의미한다.

실험예 6. PGD 농도에 따른 PGD의 억제 활성 및 PI3K/Akt 신호 경로 간의 상관관계 확인을 위한 웨스턴 블롯

PI3K/Akt 신호 경로가 세포 생존에 있어 결정적인 역할을 수행한다는 이전의 연구가 보고되었다. 세포 성장에 대한 PGD의 억제 활성이 PI3K/Akt 신호 경로와 관련이 있는지를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 도 7a, 도 7b, 도 7c 및 도 7d에 나타내었다. PGD의 처리는 Akt의 인산화를 감소시켰으나, 총 Akt는 동일하게 유지되었다. 또한, PI3K의 발현은 처리하지 않은 군에 비해 PGD 최고 농도에서 감소하였다. 또한, 도 8a, 도 8b, 도 8c 및 도 8d에 나타난 것처럼, LY294002(PI3K의 억제제)와의 동시 처리는 서비빈의 발현을 감소시키고 PARP의 분열을 증가시켰다.

비교실험예1. A549 세포 내의 세포 독성에 대한 PGD 및 PG 처리의 효과 비교를 위한 MTS 분석

A549 세포를 2x10⁴ 세포/ml의 농도에서 96-웰 배양 평판 내에 밤새 배양하였다. Normal, 10, 20 또는 40 μM의 PGD 또는 0.05, 0.1, 0.5 μg/mL의 PG로 48시간 처리한 후 MTS 분석을 통해 세포 생존력을 평가한 결과를 도 9에 나타내었다. P가 0.05 미만인 경우 정상 그룹과 비교하였다. 처치된 그룹간의 유의미한 차이를 다중 비교를 위한 쉐페 테스트에 의해 결정하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 0.05μg/ml PG 처리된 A549 세포 생존률은 100%에 달했으나, 40 μM PGD 처리된 A549 세포 생존률은 40% 이하였다. 그러므로 종래의 PG 추출물보다 PGD의 폐암 세포 사멸 촉진 효과가 현저하게 뛰어남을 확인할 수 있었다.

검토

본 발명의 실시예 및 실험예를 통하여, 플라티코딘 D와 유사한 구조를 갖는, P.grandiflorum 내에 함유된 트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponon)인 PGD의 A549 및 H460 세포주와 같은 NSCLC 세포의 세포 증식에 대한 잠재적 억제 효과를 조사하였다. 플라티코돈 사포닌의 구조-활성 관계는 이들의 생물학적 활성에 관한 중요한 정보를 제공하며 생물학적 활동이 비슷할 것으로 기대되지만, PGD의 항암 활성과 그 메커니즘은 여전히 불분명하다. 본 발명의 제조예 및 실험예는 PGD가 세포 사멸 및 세포 주기 정지를 유도하여 폐암 세포 생존률을 크게 감소시키는 결과를 보여주었다. 본 발명은 또한 PGD가 PI3K/Akt 신호 경로 조절을 통해 세포 생존을 억제한다는 것을 보여주었다. 세포 사멸은 암세포의 전반적 성장을 억제하는 화학적 억제제의 주요 목표 중 하나이다. 카스파아제는 세포 사멸에 관해 명확한 프로테아제이다. 카스파아제-3 및 카스파아제-9의 활성화는 PARP의 절단을 유도하여, 결국 세포 사멸을 초래한다. IAP는 카스파아제를 결합 및 억제하거나 카스파아제와는 독립적인 메커니즘을 통해 세포 사멸을 방지하는 구조적으로 연관된 단백질의 그룹이다. 특히, cIAP는 세포 증식의 양성 조절자이며 cIAP의 발현은 심화된 질환 단계. 좋지 않은 환자 예후 및 편평 세포 암종(squasmous cell carinoma)과 관련이 있다. 서비빈은 IAP 족의 일원 중 하나이며 암 세포 진행에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 도 1a 및 도 1b에서 확인하였듯이, PGD는 세포 생존력을 용량 의존적으로 현저하게 감소시켰고 A549 및 H640 세포 내에서 각각 26.49 ± 1.45 μM 및 20.52 ± 0.30 μM의 IC₅₀ 값을 나타냈다. 또한, PGD는 DNA 손상, 카스파아제-3 및 -9 뿐만 아니라 PARP의 절단 및 서비빈, cIAP-1 및 cIAP-2와 같은 IAP 단백질의 발현 수준 감소와 동반하여 유의미하게 세포 사멸을 유도하였다(도 2 내지 4 참조). 이러한 결과는 NSCLC 세포 주 에 대한 PGD의 항증식 효과가 카스파아제-3 및 -9 뿐만 아니라 PARP와 같은 세포 사멸과 관련된 단백질의 활성 및 서비빈, cIAP-1 및 cIAP-2와 같은 IAP 단백질 족의 방해로부터 유도된 것임을 나타냈다.

또한, 세포 성장에 대한 PGD의 저해 효과는 세포 주기 진행의 정지와 관련이 있다. 본 발명의 실험 결과는 PGD로 처리하면 S 및 G2/M 기에 있는 세포의 비율이 감소하고 G0/G1 기에 있는 세포의 비율이 증가하였다. 이러한 결과는 증식 분석 결과와 일치했다. 메탈로프로테이네아제-1(metalloproteinases-1, TIMP-1)의 조직 억제제는 초기에는 매트릭스 메탈로프로테이네아제(MMPS)가 내인성 억제제로 특성화되었다. TIMP-1은 인간 암의 몇 종류 내에 과발현되고 세포 분열을 촉진시킨다. 세포 주기의 진행은 사이클린 및 사이클린-의존적 키나아제(CDKs)에 의해 조절된다. 특히 사이클린 D1과 CDK 4는 G에서 S기까지의 세포 주기 전이에 중요한 역할을 수행한다. 사이클린 D1과 CDK4의 과발현은 다양한 암 세포에서 관찰되어왔고 종양 진행 및 전이 위험과 강하게 연관되었다. CDK2는 G1/S 전이에 필수적인 단백질 키나아제이며 그 활성은 G1/S기 내에서 제한된다. CDK2는 사이클린 E와 복합체를 형성하고 이 복합체는 G1기의 S기로의 진행을 유도한다. 상기 CDK2/사이클린 E 복합체는 또한 G1기에서 S기로의 전이를 촉진시키는 사이클린 A 발현을 증가시킨다. 사이클린 A는 사이클린 E대신 CDK2와 결합하고 이 CDK2/사이클린 A 복합체는 DNA 복제를 시작하는데, 이는 S기로의 진행을 위해 필요하다. 본 발명의 PGD는 TIMP-1, CDK2, 사이클린 A 및 E의 발현을 감소시켰고 이러한 결과는 G0/G1 기에서 PGD의 세포 주기 정지 효과에 관한 것이었다.

또한, 본 발명의 발명자들은 전술한 PGD의 효과와 관련된 예상 메커니즘을 조사하였다. PI3K/Akt 경로는 세포 증식, 주기 진행, 전이, 생존 및 세포 사멸에 포함된 잘 알려진 필수 경로이며 거의 모든 종류의 암의 가장 중요한 종양 형성 표적 중 하나이다. 또한 이 경로는 DNA 손상에 의해 유발된 세포 사멸에 대한 내성을 증가시킨다. 또한 알려진 다운스트림 표적인 GSK-3β의 증가된 인산화 수준은 사이클린 D 및 cMyc의 발현을 유도하며, 이는 세포 주기 진행 및 이동의 G1/S 상 확인 지점에서 역할을 수행한다. 그러므로 PGD에 의해 유도된 G1 정지는 GSK-3β에 대한 PGD의 영향에 기인한 것일 수 있으며 업스트림 Akt 및 PGD에 의해 유도된 세포 사멸은 Akt 인산화 억제에 기인한 것일 수 있다.

이상과 같이 재료 및 방법, 제조예 및 비교실험예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실험예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (4)

1. 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 비소세포 폐암인 것인 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리갈라신 D는 도라지로부터 추출한 것인, 폐암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 폴리갈라신 D 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 폐암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

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