KR20200015324A - Ｃｄｋ７ 저해제 ｂｓ１８１ 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Ｃｄｋ７ 저해제 ｂｓ１８１ 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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본 발명은 CDK7 저해제 (cyclin-dependant kinase 7 inhibitor)인 하기 화학식 (Ⅰ)의 BS-181 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 백혈병 (leukemia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 CDK7 저해제 BS-181을 약리학적 농도로 인간 T-ALL 세포주인 Jurkat 세포에를 처리하면, 주로 외인성 TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/DR5 (death receptor 5) 상향조절-매개 에폽토시스 유도를 통해 항암활성 (IC50 = 14.5 μM)을 나타낸다. 비록, BS-181 처리에 의해, 외인성 에폽토시스 유도와는 별개로, 내인성 BAK-의존적 미토콘드리아-매개성 에폽토시스 경로가 개시될 수 있지만, 내인성 에폽토시스보다는 외인성 에폽토시스에 의한 세포사멸이 BS-181의 Jurkat T 세포에 대한 세포독성의 주요 기전임을 확인하였으므로, 본 발명의 CDK7 저해제 BS-181은 백혈병, 특히 급성 T 림프구성 백혈병의 치료를 위한 의약용도로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 CDK7 저해제 (cyclin-dependant kinase 7 inhibitor)인 하기 화학식 (Ⅰ)의 BS-181 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 백혈병 (leukemia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
인간 급성 T 림프구성 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)은 T 세포 계통 림프아구의 악성 형질 전환에 의해 생성되는 공격적인 종양이며, 모든 급성 림프구성 백혈병의 약 20 %를 차지한다 [1,2]. 최근 위험-적응 화학요법 (risk-adapted chemotherapy)의 발전으로 인해 소아와 성인 T-ALL의 전반적인 생존율이 향상되었지만, 고위험군의 T-ALL에서는 화학요법에 대한 저항성 및 조기 재발이 발생할 수 있어 예후가 좋지 않고 생존율이 낮다 [3,4]. T-ALL 및 기타 고위험 백혈병의 화학 요법 치료에서 전반적인 생존율을 향상시키기 위해 약물 내성과 부작용을 최소화할 수 있는 새로운 항암제에 대한 요구가 높다 [5].
세포주기 진행은 사이클린-의존성 인산화효소(cyclin-dependent kinases, CDKs) 패밀리에 의해 양성적으로 조절된다. CDK 패밀리에는 세 종류의 간기 CDKs (CDK2, CDK4, CDK6), 한 종류의 유사분열 CDK (CDK1), 조절 CDK (CDK7, CDK-activating kinase complex의 촉매 subunit), 및 두 종류의 전사 CDKs (CDK8, CDK9)가 포함된다 [5-8]. 종양세포의 통제되지 않은 증식과 관련하여, CDKs의 촉매 활성은 종종 CDKs, CDK 저해제 (CDK inhibitors) 및 사이클린 (cyclins)과 같은 이들의 조절 단백질의 유전 및 후생적인 변화로 인해 증가한다 [9-13]. 따라서, CDK는 항암제 및 화학 요법 치료제의 개발을 위한 매력적인 표적으로 떠오르고 있다 [8,9,14].
다른 CDK 패밀리와 비교하여, 세포주기에서 CDK7의 역할은 cyclin H 및 MAT1과 함께 CDK1, CDK2, CDK4의 인산화를 담당하는 CDK-activating kinase (CAK) complex를 형성한다는 점 및 CAK complex가 전사인자 TFIIH의 일부로서 존재하고 RNA pol II-지시 유전자의 전사 개시를 위해 RNA pol II의 가장 큰 서브유닛의 C-말단 도메인을 인산화시킨다는 점에서 독특하다. 또한, CAK 또는 TFIIH-관련 CAK는 몇몇 다른 전사 인자를 인산화시켜 그들의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다 [15-17]. 이러한 이전 연구는 CDK7이 세포주기의 진행과 전사의 필수 조절 인자로서 종양의 중요한 치료 표적이 될 수 있음을 시사한다.
최근, pyrazolo [1,5-a] pyrimidine-유도 화합물인 BS-181은 특이적인 CDK7 저해제 (CDK7 inhibitor)로 알려져 있으며, 위암을 포함한 고형종양에 대한 세포독성 효과가 G1 cell cycle arrest 및 미토콘드리아-의존적 에폽토시스와 관련이 있다는 보고가 있다 [18,19]. 그러나, BS-181의 항암활성을 명확히 하기 위해서는 세포주기 정지와 에폽토시스의 상관관계에 대한 추가 조사가 필요하다. 더구나, BS-181에 의한 에폽토시스 유도에 외인성 에폽토시스 경로가 관여한다는 사실은 전혀 알려지지 않았으며, 고형암 세포에서 관찰되는 BS-181의 항암활성이 T-ALL 및 다른 백혈병 세포에도 나타날 수 있는지에 대한 여부도 불분명하다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 CDK7 저해제인 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
(Ⅰ)
상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 백혈병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 (extrinsic apoptosis) 유도용 시약 조성물을 제공한다.
상기 세포는 T 세포 (T-cell)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 인 비트로 (in vitro) 상에서, 세포에 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 유도 방법을 제공한다.
상기 세포는 T 세포인 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분인 CDK7 저해제 BS-181을 약리학적 농도로 인간 T-ALL 세포주인 Jurkat 세포에를 처리하면, 주로 외인성 TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/DR5 (death receptor 5) 상향조절-매개 에폽토시스 유도를 통해 항암활성 (IC50 = 14.5 μM)을 나타낸다. 비록, BS-181 처리에 의해, 외인성 에폽토시스 유도와는 별개로, 내인성 BAK-의존적 미토콘드리아-매개성 에폽토시스 경로가 개시될 수 있지만, 내인성 에폽토시스보다는 외인성 에폽토시스에 의한 세포사멸이 BS-181의 Jurkat T 세포에 대한 세포독성의 주요 기전임을 확인하였으므로, 본 발명의 CDK7 저해제 BS-181은 백혈병, 특히 급성 T 림프구성 백혈병의 치료를 위한 의약용도로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 공벡터 (JT/Neo) 또는 BCL-2 발현 벡터 (JT/BCL-2)로 트랜스펙션된 Jurkat T 세포 클론들 (JT/Neo 세포 및 JT/BCL-2 세포)에 있어서, CDK7 저해제 BS-181 처리에 의해 유도되는 세포 생존력 감소, 세포주기분포의 변화 및 에폽토시스에 의한 세포사멸을 보여주는 결과이다.
도 2는 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에 있어서, BS-181에 의해 유도되는 △Ψm 상실 및 BAK 활성화, 에폽토시스 조절인자들 [BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BAK, BID, BIM isoforms (BIMEL and BIML), XIAP, caspase-9, caspase-8, caspase-3, PARP]과 외인성 에폽토시스 조절인자들 (DR5 및 TRAIL)의 변화, 및 세포표면 TRAIL 및 분비 TRAIL의 증가를 보여주는 결과이다.
도 3은 BS-181이 처리된 JT / Neo 세포 및 JT / BCL-2 세포에 있어서, 세포주기 조절인자들인 CDKs 및 Cyclins 수준, 그리고 CDKs에 의해 유발되는 Rb 인산화의 감소를 보여주는 결과이다.
도 4는 JT/Neo 세포에 있어서, BS-181 처리에 의해 유도되는 에폽토시스성 sub-G1 세포의 축척 및 Δψm 상실에 미치는 hydroxyurea (HU) 혹은 paclitaxel (PTX)의 영향을 보여주는 결과이다.
도 5. FADD- 및 카스파제-8-양성 야생형 Jurkat T 세포 (클론 A3), FADD-결v핍 Jurkat T 세포 (클론 I2.1) 및 카스파제-8-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I9.2)에 있어서, 세포 생존력, 세포주기 분포, ΔΨm 상실, 그리고 DR5, TRAIL, BID, FADD, 카스파제-9, 카스파아제-8, 카스파아제-3, PARP, GAPDH 의 발현 수준에 미치는 BS-181의 차별 효과를 보여주는 결과이다.
도 6은 FADD- 및 카스파제-8-양성 야생형 Jurkat T 세포 (클론 A3), FADD-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I2.1) 및 카스파제-8-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I9.2)에 대한 BS-181의 세포독성에 미치는 rTRAIL의 시너지 효과를 나타낸다.
도 7은 A3 세포에 있어서 BS-181 혹은 재조합 TRAIL의 단독 투여, 그리고 BS-181 및 rTRAIL과의 병용 처리가 세포주기분포, △ Ψm 상실 및 에폽토시스 유도에 미치는 영향 조사의 결과를 나타낸다.
도 8은 정상인의 활성화되지 않은 말초혈액 T 세포, PHA-활성화된 T 세포의 IL-2-의존성 증식 및 Jurkat T 세포 (E6.1)의 증식에 미치는 BS-181의 효과를 보여주는 결과이다.
도 2는 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에 있어서, BS-181에 의해 유도되는 △Ψm 상실 및 BAK 활성화, 에폽토시스 조절인자들 [BCL-2, BCL-XL, MCL-1, BAK, BID, BIM isoforms (BIMEL and BIML), XIAP, caspase-9, caspase-8, caspase-3, PARP]과 외인성 에폽토시스 조절인자들 (DR5 및 TRAIL)의 변화, 및 세포표면 TRAIL 및 분비 TRAIL의 증가를 보여주는 결과이다.
도 3은 BS-181이 처리된 JT / Neo 세포 및 JT / BCL-2 세포에 있어서, 세포주기 조절인자들인 CDKs 및 Cyclins 수준, 그리고 CDKs에 의해 유발되는 Rb 인산화의 감소를 보여주는 결과이다.
도 4는 JT/Neo 세포에 있어서, BS-181 처리에 의해 유도되는 에폽토시스성 sub-G1 세포의 축척 및 Δψm 상실에 미치는 hydroxyurea (HU) 혹은 paclitaxel (PTX)의 영향을 보여주는 결과이다.
도 5. FADD- 및 카스파제-8-양성 야생형 Jurkat T 세포 (클론 A3), FADD-결v핍 Jurkat T 세포 (클론 I2.1) 및 카스파제-8-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I9.2)에 있어서, 세포 생존력, 세포주기 분포, ΔΨm 상실, 그리고 DR5, TRAIL, BID, FADD, 카스파제-9, 카스파아제-8, 카스파아제-3, PARP, GAPDH 의 발현 수준에 미치는 BS-181의 차별 효과를 보여주는 결과이다.
도 6은 FADD- 및 카스파제-8-양성 야생형 Jurkat T 세포 (클론 A3), FADD-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I2.1) 및 카스파제-8-결핍 Jurkat T 세포 (클론 I9.2)에 대한 BS-181의 세포독성에 미치는 rTRAIL의 시너지 효과를 나타낸다.
도 7은 A3 세포에 있어서 BS-181 혹은 재조합 TRAIL의 단독 투여, 그리고 BS-181 및 rTRAIL과의 병용 처리가 세포주기분포, △ Ψm 상실 및 에폽토시스 유도에 미치는 영향 조사의 결과를 나타낸다.
도 8은 정상인의 활성화되지 않은 말초혈액 T 세포, PHA-활성화된 T 세포의 IL-2-의존성 증식 및 Jurkat T 세포 (E6.1)의 증식에 미치는 BS-181의 효과를 보여주는 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
최근 20 년 동안, 새로운 항암 치료제로서 CDK 저해제에 대한 집중적인 연구가 이루어졌다. 광범위한 특이성을 가진 1 세대 CDK 저해제는 임상 시험에서 낮은 효능을 보였으나, 좁은 범위의 CDK를 표적으로 하는 2 세대 CDK 저해제는 임상 결과로서 유망한 화학요법제로 인식되고 있으며, 최근에는 CDK4/6에 대한 특이적인 저해제인 palbociclib 및 ribociclib 등이 유방암의 화학요법 치료제로 FDA의 승인을 얻은 바 있다 [36-38]. 또한, CDK 저해제의 표적을 CDK7, CDK8 및 CDK9 등과 같은 비전형적 CDKs (non-canonical CDKs)로 확장하려는 노력과 함께, 표적 CDK에 대해 보다 특이적인 효능을 갖는 3 세대 CDK 저해제를 개발하기 위한 시도가 추가적으로 진행되고 있다. BS-181은 in vitro 실험계의 CDK7 (CAK의 촉매 서브 유닛) 활성을 낮은 나노몰 농도에서도 선택적으로 억제하는 것으로 확인되었으며, 구조-기반 컴퓨터-보조 약물 설계 기술을 이용하여 3 세대 CDK 저해제로 개발되었다 [18].
본 발명에서는, BS-181의 항암활성이 Jurkat T 세포 (JT/Neo)에서 TRAIL 및 DR5의 상향조절을 통한 외인성 에폽토시스의 유도에 기인한다는 것을 최초로 발견하였다. BS-181은 유방암세포에서 G1 cyclin (cyclin D1)과 항-에폽토시스 단백질 (MCL-1과 XIAP)의 하향조절로 인한 G1-정지와 에폽토시스를 유도하고 [18], 위암세포에서 cyclin D1과 XIAP의 하향조절로 인한 G1-정지와 에폽토시스를 일으킨다고 보고된 바 있다 [19]. 이와 대조적으로, Jurkat T 세포에 있어서, BS-181 처리에 따른 G1-정지는 BS-181에 의해 유도되는 에폽토시스가 BCL-2의 과발현에 의해 저해되는 JT/BCL-2 세포에서는 관찰되었으나, JT/Neo 세포에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, BS-181 처리에 따른 에폽토시스 유도가 G1-세포에서 우선적으로 야기될 수 있음을 시사함으로, 후기 G1-정지제인 HU [32,33] 또는 전중기-정지제인 PTX [39]이 BS-181에 의한 에폽토시스 유도에 미치는 영향을 JT/Neo 세포에서 조사하였다. 그 결과, BS-181에 의해 유발된 에폽토시스는 HU에 의해 현저하게 증가하였으나, PTX에 의해서는 다소 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 15 μM BS-181로 처리한 JT/Neo 세포를 FITC-Annexin V 및 DAPI로 염색한 다음, paraformaldehyde로 Fix하고, RNase로 처리 및 PI 염색을 진행하였으며, 이때 DAPI 로는 염색되지 않고 FITC-Annexin V로만 염색되는 초기 에폽토시스 세포들의 PI 염색에 따른 세포주기분포를 유세포 분석기로 조사한 결과에서도, FITC-Annexin V에 의해 염색된 초기 에폽토시스 세포들은 40.1 %의 apoptotic sub-G1 세포 및 35.4 %의 G1 세포로 확인되어, 이러한 결과들은 JT/Neo 세포에 있어서 BS-181 처리에 의해 유도되는 에폽토시스 반응이, CDKs-매개 Rb 인산화의 저해로 인해 세포주기진행이 S기 진입에 실패하여 late G1 기에 정지된 세포들에서 우선적으로 유도됨을 확인해준다.
한편, BS-181이 처리된 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에서 CDK7 및 cyclin H의 수준은 현저한 변화가 없었지만, G1-cyclins (cyclin D1, cyclin D3)와 G1-CDK (CDK4, CDK2), 그리고 M-CDK 및 M-cyclin인 CDK1 및 cyclin B1의 수준은 현저히 감소하는 것으로 나타났다. 특히, CDK7에 의한 CDK1 (Thr-161)과 CDK2 (Thr-160) 및 CDK1/2-, CDK4/6에 의한 Rb의 인산화는 JT/Neo 세포 보다 JT/BCL-2 세포에서 더 명백하게 감소하는 것으로 확인되었다. G1-checkpoint에서 세포주기 진행을 차단하는 Rb의 기능이 CDKs에 의해 과인산화될 경우에는 소실되어 G1/S 전환을 허용하는 것으로 알려져 있기 때문에 [40], 이러한 연구결과들은 JT/BCL-2 세포에서 관찰되는 BS-181 처리에 따른 G1-정지는 CDKs에 의한 Rb 과인산화가 CDK7 저해제로 작용하는 BS-181 존재 하에서는 실패한 결과 때문임을 확인해 준다.
본 발명에서, Jurkat T 세포에 대한 BS-181 세포 독성에서 외인성 세포 사멸의 기여는 JT/Neo 세포에 BS-181 처리 후 DR5 수준의 상승을 보여주는 웨스턴블로팅뿐만 아니라, 세포 표면의 TRAIL 상승 및 세포 외 TRAIL의 상승을 나타내는 표면면역형광염색 및 ELISA 분석데이터에 의해 처음 예측되었다. 이러한 예측은 외인성 세포 사멸을 유도할 수 없는 FADD-결핍 Jurkat I2.1 세포와 caspase-8-결핍 Jurkat I9.2 세포가 [34,41], 모두 10 μM BS-181의 세포독성 효과에 대해 저항성을 가지는 반면, wild-type Jurkat A3 세포는 67%의 세포 생존율을 나타내는 연구결과에 의해 확인되었다. 10 μM BS-181로써 처리한 I2.1 및 I9.2 세포는 모두 에폽토시스를 일으키지 못했지만, 15 μM BS-181로 처리 시 BAK-매개 미토콘드리아 경로를 통해 내재적 에폽토시스를 성공적으로 일으켰으며, 이때 관찰되는 sub-G1 비율은 A3 세포 경우의 ~ 28 % 수준까지 증가하였다.
결론적으로, CDK7 저해제인 BS-181을 약리학적 농도로 인간 T-ALL 세포주 Jurkat 세포를 처리하면, 주로 외인성 TRAIL/DR5 상향조절-매개 에폽토시스 유도를 통해 항암활성 (IC50 = 14.5 μM)을 나타낸다. 비록, BS-181 처리에 의해, 외인성 에폽토시스 유도와는 별개로, 내인성 BAK-의존적 미토콘드리아-매개성 에폽토시스 경로가 개시될 수 있지만, 내인성 에폽토시스 보다는 외인성 에폽토시스에 의한 세포사멸이 BS-181의 Jurkat T 세포에 대한 세포독성의 주요 기전임을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 (Ⅰ)의 BS-181 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 백혈병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
(Ⅰ)
상기 화학식 (I)의 화합물은 염기-부가 염 또는 산-부가 염의 형태로 존재할 수 있다. 상기 부가 염은 본 발명의 일부에 포함된다. 상기 염은 유리하게는 약학적으로 허용가능한 산에 의해 제조되지만, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물을 정제하거나 분리하는데 유용한 다른 산들의 염도 역시 본 발명의 일부에 포함된다. 상기 산은, 예를 들어, 피크르산, 옥살산 또는 광학활성산, 예컨대, 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 만델산 또는 캠퍼설폰산, 및 생리학적으로 허용가능한 염, 예컨대, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 설페이트, 히드로겐 설페이트, 디히드로겐 포스페이트, 말레이트, 푸마레이트, 2-나프탈렌설포네이트 또는 파라-톨루엔설포네이트를 형성하는 산일수 있다. 생리학적으로 허용가능한 염에 대해서는, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use by Stahl and Wermuth (Wiley-VCH, 2002)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 용도로서 상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병인 것이 바람직하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 백혈병의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 건강 기능 식품의 용도로서 상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병인 것이 바람직하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강 기능 식품은 백혈병, 바람직하게는 급성 T 림프구성 백혈병의 예방과 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.
본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g을 사용한다.
상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 유도용 시약 조성물을 제공한다.
상기 세포는 T 세포일 수 있으며, 예를 들어, 생체로부터 분리된 프라이머리 T 세포, T 세포주, 형질전환 T 세포주 등을 포함하는 개념이다.
상기 외인성 에폽토시스는 BAK-의존적 미토콘드리아성 에폽토시스로서 내인성 에폽토시스와는 구별되는 것으로서, TRAIL/DR5-상향조절에 의해 활성화된 외인성 에폽토시스인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 인 비트로 상에서, 세포에 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 유도 방법을 제공한다.
상기 유도 방법에 있어서, 세포 배양 및 시약 처리 등의 과정은 본 발명의 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 공지된 바에 따라 수행될 수 있으며, 시약의 처리 농도는 본 발명의 명세서에 기재된 BS-181의 처리 농도를 참고로 실험자가 절절히 조절할 수 있을 것이다.
상기 세포는 T 세포일 수 있으며, 예를 들어, 생체로부터 분리된 프라이머리 T 세포, T 세포주, 형질전환 T 세포주 등을 포함하는 개념이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 기재된 사항에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. 시약 및 항체
BS-181은 Selleckchem 사 (Houston, TX, USA)로 부터 구입하였다. 재조합 인간 TNF-related apoptosis-inducing ligand (rTRAIL)은 PeproTech 사 (London, UK)으로부터 구입하였다. 인간 TRAIL ELISA kit는 Koma Biotech 사 (Seoul, Korea)로부터 구입하였으며, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6), 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 3-(4,5-dimethythaizol-2-yl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) 및 전중기-정지제인 paclitaxel (PTX)은 Sigma 사 (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 후기 G1-정지제인 hydroxyurea (HU)는 Calbiochem 사 (san Diego, CA, USA)로부터 구입하였고, ECL western blot kit은 Amersham 사 (Arlington Heights, IL, USA)로 부터, 그리고 Immobilon-P 막은 Millipore Corporation (Bedford, MA, USA)으로부터 구입하였다. 항-caspase-3 항체는 BD Transduction Laboratories (Franklin, NJ, USA)에서, 항-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), 항-BCL-2, 항-BCL-XL, 항-CDK1, 항-CDK2, 항-CDK7, 항-Cyclin H, 항-FADD 항체들은 Santa Cruz Biotechnology사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 또한, 항-BID, 항-caspase-8, 항-caspase-9, 항-p-CDK1 (Tyr-15), 항-p-CDK1 (Thr-161), 항-p-CDK2 (Thr-160), 항-death receptor 5 (DR5), 항-p-retinoblastoma (Rb) (Ser-795), 항-p-Rb (Thr-821/826), 및 항-TRAIL 항체들은 Cell Signaling Technology사 (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 항-BAK (Ab-1) 항체는 Calbiochem사 (San Diego, CA, USA)에서, 항-BAG3 항체는 Abcam사 (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였다.
1.2. 세포 배양
인간 급성 백혈병 Jurkat T 세포클론 wild-type A3, Fas-associated death domain (FADD)-결핍 Jurkat T 세포클론 I2.1, caspase-8-결핍 Jurkat T 세포클론 I9.2, U937 및 인간 자궁경부암 HeLa 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포의 배양에는 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Gaithersburg, MD, USA)에 10 % FBS, 20 mM HEPES (pH 7.0), 50 μM 2-mercaptoethanol 및 100 μg/ml gentamicin을 첨가하여 사용하였다. HeLa 세포는 DMEM (Hyclone)에 10 % FBS, 20 mM HEPES (pH 7.0) 및 100 μg/ml gentamycin을 첨가하여 사용하였다. 공벡터 (JT/Neo) 혹은 BCL-2 발현벡터 (JT/BCL-2)를 안정적으로 전이시킨 Jurkat T 세포클론 JT/Neo와 JT/BCL-2 세포들은 Dr. Dennis Taub (Gerontology Research Center, NIA/NIH, Baltimore, MD, USA)로부터 제공받았다. 이들 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포들의 배양에는 10 % FBS, 20 mM HEPES (pH 7.0), 50 μM β-mercaptoethanol, 100 μg/ml gentamicin 및 400 μg/ml G418을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하였다 [44].
1.3. 세포 독성 측정
BS-181의 세포독성은 MTT 법 [45]으로 측정하였다.
1.4. 유세포 분석
BS-181로 처리한 Jurkat T 세포의 세포주기분석은 유세포 분석기 (FACS Calibur, BD Sciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 선행연구에서 사용한 방법 [46]에 따라 수행하였다. 또한, Annexin V-FITC apoptosis kit을 이용한 괴사성 세포의 분석은 선행 연구방법 [46]에 준하여 진행하였다. 또한, BS-181을 처리한 세포를 Annexin V-FITC apoptosis kit의 PI 용액 대신에 DAPI 용액 (1 μM)을 사용한 FITC-Annexin V/DAPI로 일차 염색한 후에 1 % paraformaldehyde로 고정 (Fixation)시켰으며, 뒤이어서 50 μg/ml RNase로 처리하여 RNA를 제거하고, 0.025 % Digitonin로서 세포막의 투과성을 높인 다음 PI (25 μg/ml)로 이차 염색하였다. 염색된 세포들을 유세포 분석기 (Attune NxT, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA)로 분석하여, DAPI 로는 염색되지 않고 FITC-Annexin V로만 염색되는 초기 에폽토시스 세포들의 PI 염색에 따른 세포주기분포 양상을 분석하였다.
BS-181 처리에 수반되는 미토콘드리아 막전위 (Δψm)의 상실은 DiOC6 염색법 [47,48]에 따라 진행하였다. BS-181 처리에 따른 BAK 활성화는 선행연구의 방법 [49]을 이용하여 수행하였다. 또한, BS-181을 처리한 세포의 표면에 발현되는 TRAIL 분자의 확인을 위해, 세포 (5 × 106)를 회수한 다음 1× PBS + 2 % FBS 용액으로 세척한 후, 항-TRAIL 항체 (1 : 250)로 4 ℃에서 45 분 동안 처리하였으며, 이어서 Alexafluor 488-labeled 항-토끼IgG (1 : 500) 을 4 ℃에서 30 분간 처리하고, 1 % paraformaldehyde/PBS 용액으로 고정시킨 다음, 세포를 세척하여 TRIL-양성 세포들을 FACS Calibur (BD Science, Franklin Lakes, NJ, USA)로 분석하였다.
1.5. 세포 용해물 제조와 웨스턴 블롯 분석
세포용해물은 5 × 106 Jurkat T 세포를 선행연구에서 설명한 바와 같이 300 μl의 세포용해 완충용액에서 용해시켜 제조하였다 [46]. 확보한 세포 용해물은 단백질 양으로 20-25 μg 정도의 범위에서 일정량씩 취하여 4-12 % NuPAGE gradient gel을 사용하여 전기영동하고, Immobilon-P 막에 전기전달시켰다. 이후, ECL western blot kit을 사용하여 membrane 상의 단백질들을 분석하였다. 필요한 경우, ImageQuant TL software (Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여 웨스턴 블롯 상의 단백질밴드의 정량을 진행하였으며, 각 밴드의 정량값은 GAPDH 단백질 밴드의 정량값을 기준으로 표준화하였다.
1.6. 가용성 TRAIL의 ELISA에 의한 측정
BS-181에 처리된 Jurkat T 세포의 배양 상등액에 함유된 가용성 TRAIL은 ELISA kit (Koma Biotech Inc. Seoul, Korea)을 이용하여 제조사의 실험치침에 따라 분석하였다. 모든 샘플을 3 반복으로 수행하였으며, 마이크로 플레이트 광학밀도측정기를 사용하여 광학밀도를 측정하였으며, 이를 표준곡선과 비교하여 TRAIL 농도를 측정하였다. 측정결과는 pg/mL로 표기하였다.
1.7. 통계 분석
별도로 명시하지 않는 한, 본 실시예의 각 결과는 적어도 세 가지 별도의 실험결과의 평균을 제시해준다. 실험값은 이들 실험결과의 평균값 ± 표준 편차로 표현하였다. 통계적 유의성은 Student 's t-test를 사용하여 계산하였다. P 값 < 0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
2. 결 과
2.1. Jurkat 클론 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에 대한 BS-181의 세포독성 및 에폽토시스 유도 효과
BS-181의 세포독성이 BCL-2에 의해 제어되는 미토콘드리아-의존 에폽토시스 경로에 의한 것인지 확인하기 위하여, JT/Neo와 JT/BCL-2 세포에 대한 BS-181의 세포독성 효과를 비교하였다. BS-181 (5 ~ 20 μM)을 20 시간 동안 처리한 JT/Neo 세포에서의 세포독성은 농도-의존적으로 증가하여 IC50 값이 14.4 μM로 나타난 반면, BCL-2가 과발현된 JT/BCL-2 세포에 있어서는 BS-181의 세포독성이 나타나지 않았다 (도 1의 A). 마찬가지로, JT/Neo 세포를 10 및 15 μM 농도의 BS-181로 24 시간 처리하였을 때, sub-G1 세포의 비율은 23.2 %와 54.8 %로 각각 증가하였으나, JT/BCL-2 세포의 경우는 sub-G1 세포의 증가가 관찰되지 않았다 (도 1의 B). 이와 같은 조건에서, BS-181 처리에 따른 G1 세포주기 정지는 JT/Neo 세포와는 달리 JT/BCL-2 세포에서만 관찰되었다. 이러한 결과는, BS-181 처리에 의한 에폽토시스가 G1-정지 세포에서 우선적으로 유도되므로, G1 세포의 에폽토시스가 BCL-2 과발현에 의해 차단될 경우에만 BS-181에 의한 G1-정지 세포의 증가가 관찰될 수 있음을 시사한다.
또한, 15 μM BS-181로 처리한 JT/Neo 세포를 FITC-Annexin V 및 PI로 염색 후 유세포 분석기로 분석한 결과, FITC-Annexin V로만 염색된 초기 에폽토시스 세포와 FITC-Annexin V와 PI 모두에 의해 염색된 후기 에폽토시스 세포의 수는 각각 38.0 %와 9.1 %로 증가한 반면, PI로만 염색된 괴사 세포는 거의 확인되지 않았다 (도 1의 C). 에폽토시스-진행 세포에 나타나는 형태적 변화로는 세포의 수축과 세포막의 외부층으로의 포스파티딜세린의 노출이 알려져 있는 반면, 괴사-진행 세포의 형태적 변화로는 세포질 팽창, 세포기관 팽창 및 이에 수반되는 원형질막 파괴 등이 알려져 있다 [20]. BS-181을 처리한 JT/Neo 세포에서 FITC-Annexin V로만 염색된 초기 에폽토시스 세포와 FITC-Annexin V와 PI 모두로 염색된 후기 에폽토시스 세포의 forward scatter 분포를 비교하였을 때, BS-181에 의해 유도되는 초기와 후기 에폽토시스 세포에서 공통적으로 세포크기의 감소를 반영하는 forward scatter의 감소가 나타났다 (도 1의 D). 이에 반해, JT/BCL-2 세포에서는 BS-181 처리 후에도 초기 혹은 후기 에폽토시스 세포의 증가가 관찰되지 않았다.
이러한 연구 결과는 Jurkat T 세포에 대한 BS-181의 세포독성이 G1-정지 세포에서 우선적으로 유도될 수 있는 에폽토시스에 주로 기인함과, 또한 BS-181 처리에 의한 에폽토시스 유도는 과발현된 BCL-2에 의해 저해되지만 G1-정지는 과발현된 BCL-2에 의해 저해되지 않음을 보여준다.
2.2. JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에서 BS-181 처리에 따른 ΔΨm 감소, BAK 활성화, caspase 활성화, 가용성 및 막 결합 TRAIL 및 DR5 발현 유도
BS-181 처리에 의해 유도되는 에폽토시스와 과 BCL-2 과발현에 의해 차단되는 미토콘드리아 손상과의 관련성을 조사하기 위해, BS-181이 처리된 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포의 미토콘드리아 막전위 (Δψm) 상실을 DiOC6 염색 후 flow cytometry로 비교 분석하였다. BS-181을 10 혹은 15 μM 농도로 처리한 JT/Neo 세포의 경우는 Δψm 상실은 각각 27.0 % 및 66.0 %로 나타난 반면, JT/BCL-2 세포의 경우는 BS-181에 의한 Δψm 상실이 거의 관찰되지 않았다 (도 2의 A). Δψm 의 유도와 관련하여 미토콘드리아 외막의 투과화를 유도하는 다중도메인 친-에폽토시스 BCL-2 계열 단백질 (BAK, BAX)의 중합체화가 중요하다. 그러나, BCL-2, BCL-XL 및 MCL-1과 같은 항-에폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질들은 BH3-유일 친-에폽토시스 BCL-2 패밀리 단백질들 (BAD, BID, BIM)을 직접적 혹은 간접적으로 불활성화함으로써 BAK- 또는 BAX-매개 미토콘드리아 외막 손상을 차단한다 [21,22]. BS-181을 10 혹은 15 μM 농도로 처리한 JT/Neo 세포에서 BAK 활성화 비율은 각각 25.1 %와 58.1 %로 나타났으나, JT/BCL-2 세포에서는 BAK 활성화가 관찰되지 않았다 (도 2의 B). 이러한 조건하에서, BS-181로 처리된 JT/Neo 세포의 BCL-2, BCL-XL 및 MCL-1 발현 수준은 비교적 일정하게 나타났다 (도 2의 C). 한편, BIM의 활성화 [23] 혹은 BAK의 발현증가는 관찰되지 않았다. 내인성 에폽토시스 유도에 있어서는 BAK 활성화 및 그에 따른 Δψm 상실이 먼저 선행되고, 이에 따라 미토콘드리아 시토크롬 c 단백질의 세포질로의 방출이 야기되며, 그 결과로서 caspase-9/caspase-3 활성화가 일어난다는 선행 연구결과들 [24-26]과 부합하여, BS-181로 처리된 JT/Neo 세포에서는 BAK 활성화, Δψm 상실, caspase-9/caspase-3 활성화 및 PARP의 절단이 관찰되는 반면, 이러한 BS-181 유도 에폽토시스 반응들이 JT/BCL-2 세포에서는 관찰되지 않았다. 이와 같은 연구결과는 BCL-2에 의해 차단되는 내인성 BAK-의존 미토콘드리아-매개 에폽토시스 경로가 BS-181 처리에 의한 Jurkat T 세포의 세포사멸에 관여함을 입증한다.
DR5 혹은 TRAIL의 발현 증가에 의해 유발되는 외인성 에폽토시스 경로는 caspase-8 활성화 및 활성 capase-8에 의한 BID (22 kDa)의 절단으로부터 생성되는 절단형-BID (tBID, 15 kDa)의 작용을 통해 BAK 활성화를 유도할 수 있으므로 [27,28], BS-181을 처리한 JT/Neo 및 JT/BCL-2 세포에서 외인성 에폽토시스 경로의 구성분자들의 발현 수준을 비교조사 하였다. 도 2의 D에서 나타난 바와 같이, BS-181을 처리한 JT/Neo 세포에서는 DR5의 발현증가와 일치하게, caspase-8 활성화 및 tBID로의 절단을 반영하는 BID 발현 수준의 현저한 감소가 관찰되었다. 또한, BS-181을 처리한 JT/Neo 세포에서는 총 세포 TRAIL, 막 결합 TRAIL 및 분비된 가용성 TRAIL의 수준이 증가되는 것으로 나타났지만, JT/BCL-2 세포에서는 총 세포 TRAIL의 발현수준이 JT/Neo 세포의 경우에 비해 약 ~ 28 배 정도 더 높음에도 불구하고, BS-181 처리 후 이러한 증가가 관찰되지 않았다 (도 2의 D, E 및 F). 아울러, JT/BCL-2 세포에서는 BS-181 처리에 따른 DR5의 발현증가는 확인되었으나, caspase-8 활성화, BID 절단, caspase-9/caspase-3 활성화 및 PARP 절단은 모두 과발현된 BCl-2에 의해 차단되어 관찰되지 않았다.
이러한 결과는, BS-181 처리에 의해 JT/Neo 세포에서 유도되는 내인성 미토콘드리아-의존적 에폽토시스 반응이 TRAIL/DR5-상향조절에 의해 활성화되는 외인성 에폽토시스 반응에 후속으로 연계되어 일어남을 시사한다.
2.3. JT/Neo 세포에 있어서 BS-181에 의해 유도된 caspase-8 활성화, BID 절단, BAK 활성화, Δψm 상실 및 caspase-9 활성화에 미치는 late G
1
-정지제 hydroxyures (HU) 혹은 prometaphase-정지제 paclitaxel (PTX)의 영향
BS-181 처리에 의해 유발되는 에폽토시스 현상이 CDK7 활성의 저해에 수반되는 G1-정지와 관련이 있는지를 조사하기 위해, CDK7에 의해 인산화되는 CDK1 (Thr-161) 및 CDK2 (Thr-160) [29], 그리고 CDKs 인산화 기질인 Rb [30,31]의 인산화에 미치는 BS-181의 영향을 JT/Neo와 JT/BCL-2 세포에서 비교 조사하였다.
BS-181처리에 의한 G1-정지는 JT/BCL-2 세포에서만 확인되었지만, CDK7의 작용에 의한 CDK2 (Thr-160) 및 CDK1 (Thr-161)의 활성화 인산화뿐만 아니라, CDK1/2의 작용에 의한 Rb (Thr-821/826)와 CDK4/6의 작용에 의한 Rb (Ser-795)의 인산화는 JT/BCL-2 세포와 JT/Neo 세포에서 공통적으로 억제되는 것으로 나타났다 (도 3). 이러한 조건에서, G1-cyclins (cyclin D1, cyclin D3)와 G1-CDK (CDK4, CDK2), 그리고 M-CDK 및 M-cyclin인 CDK1 및 cyclin B1의 수준도 감소하는 것으로 나타났는데, JT/Neo 세포에 비해 JT/BCL-2 세포에서 더 크게 감소하는 경향으로 나타났다. 이러한 연구결과는 JT/BCL-2 세포에서 관찰되는 BS-181 처리에 따른 G1-정지는 CDKs에 의한 Rb 과인산화가 CDK7 저해제로 작용하는 BS-181 존재 하에서는 실패한 결과 때문임을 나타낸다.
BS-181 처리에 의한 JT/Neo 세포의 에폽토시스 유도가 G1-세포주기정지에 기인하는지를 추가적으로 구명하고자, DNA 합성에 요구되는 deoxyribonucleotides를 ribonucleotides로부터 전환시키는 ribonucleotide reductase의 효소활성을 억제하는 작용을 통해 세포주기진행을 late G1에 정지시키는 약제로 알려진 hydroxyurea (HU) [32,33]와 복합처리하거나, prometaphase-정지제인 paclitaxel (PTX) [39]를 복합처리하여, HU에 의한 late G1-정지가 BS-181-매개 에폽토시스 유도를 촉진할 수 있는지를, 또한 PTX에 의한 prometaphase-정지가 BS-181-매개 에폽토시스를 저해할 수 있는지를 조사하였다. 그 결과, 15 μM BS-181 단독처리한 경우에 비해 15 μM BS-181 + 1 mM HU로 복합처리한 경우는 sub-G1 비율이 2.0 배, Δψm 상실이 2.0 배 증가되었다 (도 4의 A 및 B). 이에 반해, 15 μM BS-181 + 0.5 μM PTX로 복합처리한 경우는 sub-G1 비율 및 Δψm 상실이 오히려 감소되는 것으로 나타났다 (도 4의 C 및 D).
또한, 15 μM BS-181로 처리한 JT/Neo 세포를 FITC-Annexin V/DAPI로 일차 염색한 후에 paraformaldehyde로 Fix하였으며, 뒤이어서 RNase로 처리한 다음 propidium iodide (PI)로 이차 염색하였다. 이때, DAPI 로는 염색되지 않고 FITC-Annexin V로만 염색되는 초기 에폽토시스 세포들을 대상으로 PI 염색에 따른 세포주기를 유세포 분석기로 조사한 결과, FITC-Annexin V에 의해 염색된 세포들은 apoptotic sub-G1 세포가 40.1 %, G1 세포가 35.4 %, 그리고 S 및 G2/M 세포가 각각 13.8 % 와 9.6 %로 나타났다 (도 4의 E).
이러한 결과는 JT/Neo 세포에 있어서 BS-181 처리에 의해 유도되는 에폽토시스 반응이, CDK-매개 Rb 인산화의 저해로 인해 세포주기진행이 S기 진입에 실패하여 late G1 기에 정지된 세포들에서 우선적으로 유도됨을 확인해준다.
2.4. Jurkat 클론 wild-type A3, FADD-결핍 Jurkat 클론 I2.1 및 caspase-8-결핍 Jurkat 클론 I9.2에서 BS-181에 의한 에폽토시스 반응
BS-181에 의해 유도되는 내인성 미토콘드리아-의존 에폽토시스와 외인성 TRAIL/DR5-의존적 에폽토시스와의 상호관련성을 더 조사하기 위해, A3, I2.1 및 I9.2 세포들을 대상으로 BS-181의 세포독성 및 에폽토시스 유도능을 비교하였다. A3 세포를 5, 10 및 15 μM 농도의 BS-181로 20 시간 처리하였을 때 세포 생존율은 각각 92 %, 67 % 및 46 % 수준으로 감소된 반면, 동일한 처리조건에서 I2.1 및 I9.2 세포의 생존율은 10 μM 농도까지는 BS-181의 세포독성에 의해 유의한 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, 15 μM 농도에서는 세포생존율이 다소 감소되었으나 A3 세포에 비해 훨씬 낮은 정도로 감소되었다 (도 5의 A).
A3, I2.1 및 I9.2 세포에 있어서 15 μM BS-181 처리에 의해 유도되는 sub-G1 세포의 비율은 각각 47.2 %, 13.4 % 및 13.2 %로 나타났으며, Δψm 상실은 각각 46.0 %, 14.4 % 및 16.0 %로 나타났다 (도 5의 B 및 C). 동일한 조건에서, A3, I2.1 및 I9.2 세포의 BAK 활성화 비율은 각각 44.3 %, 15.8 % 및 16.3 %로 나타났다 (도 5의 D). FADD-결핍 I2.1 세포와 caspas-8-결핍 I9.2 세포는 외인성 에폽토시스를 일으키지 못하는 세포들로 알려져 있으므로, 이러한 연구결과는 I2.1 및 I9.2 세포에 있어서 BS-181처리에 의해 유도되는 내인성 BAK-의존적 에폽토시스가 BS-181의 처리에 유도되는 외인성 에폽토시스와는 관련없이 독립적으로도 일어날 수 있음을 시사한다.
또한, 15 μM BS-181을 처리한 A3, I2.1 및 I9.2 세포에 있어서의 TRAIL의 세포표면 발현을 조사하기 위해 면역형광법으로 염색한 후 Flow cytometry로 분석한 결과, A3 세포 표면에서는 TRAIL의 발현수준이 현저히 증가하였으나, I2.1 및 I9.2 세포표면에서의 TRAIL 발현은 별로 증가하지 않았다 (도 5의 E). 한편, 웨스턴 블롯팅으로 15 μM BS-181의 처리에 의해 유도되는 에폽토시스 경로를 조사한 결과, A3 세포의 경우는 15 μM BS-181 처리에 의해 caspase-8 활성화 및 BID 절단을 일으켰지만, I2.1 및 I9.2 세포의 경우는 이러한 에폽토시스 반응이 일어나지 않았다 (도 5의 F). 또한, caspase-9/caspase-3 활성화 및 PARP 절단 반응들 또한 A3 세포에서 보다 I2.1 및 I9.2 세포에서 현저하게 낮은 수준으로 관찰되었다. BS-181 처리에 의한 DR5의 발현수준 증가의 경우도 I2.1 및 I9.2 세포에 비해 A3 세포에서 더 현저하게 나타났는데, 이러한 결과는 TRAIL 및 DR5의 발현수준이 외인성 에폽토시스 경로의 신호전달에 의해 양성적인 조절을 받는다고 보고한 선행 연구결과들과도 일치한다 [35].
결과적으로, 현재의 연구결과들은 Jurkat T 세포에 있어서 BS-181 (15μM)의 처리는 외인성 에폽토시스의 유도와는 별개로 BAK-의존적 미토콘드리아성 에폽토시스를 유도할 수도 있지만, BS-181의 세포독성은 TRAIL/DR5-상향조절에 의한 외인성 에폽토시스에 의해 대부분이 야기됨을 보여준다.
Jurkat T 세포에 대한 BS-181의 세포독성에 관련된 외인성 에폽토시스의 중요성을 더 조사하고자, A3, I2.1 및 I9. 2 세포에서 BS-181 세포독성에 미치는 외인성 rTRAIL (1.0-4.0 ng/ml)의 첨가효과를 조사하였다. MTT 분석결과, BS-181의 세포독성에 미치는 rTRAIL의 시너지 효과는 A3 세포에서만 나타나고, I2.1 및 I9.2 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 6의 A, B 및 C). 이는 rTRAIL에 의해 증대될 수 있는 외인성 TRAIL/DR-매개 에폽토시스가 Jurkat T 세포에서 BS-181의 세포독성에 관련된 매우 중요한 기전임을 보여준다.
BS-181과 rTRAIL의 복합처리에 의한 시너지 효과기전을 구명하기 위해, A3 세포에서 BS-181 처리에 의해 유발되는 외인성 에폽토시스에 미치는 rTRAIL의 영향을 조사하였다. 도 7의 A에 나타난 바와 같이, A3 세포를 10 μM BS-181 및 10 μM BS-181 + 1.0 ng/ml rTRAIL로 15 시간 동안 처리하였을 경우에 세포생존율은 각각 73 %와 54 %로 감소되는 것으로 나타났으며, 1.0 ng/ml rTRAIL로만 처리하였을 경우에는 91 %로 나타났다. 이때, sub-G1 세포의 비율은 각각 12.1 %, 40.5 % 및 18.9 %이었으며, Δψm 상실은 각각 10.7 %, 46.7 % 및 24.2 %로 나타났고, BAK 활성화 비율은 각각 11.7 %, 38.4 % 및 13.9 %로 나타났다 (도 7의 B, C 및 D).
또한, 도 7의 E에서 나타난 바와 같이, BS-181 처리에 의해 유도되는 caspase-8 활성화와 BID 절단은 caspase-9/capase-3 활성화와 마찬가지로 rTRAIL과의 복합처리에 의해 유의적으로 증가되었다. 더구나, BS-181 처리에 의해 유도되는 BAK-매개성 미토콘드리아 손상 경로의 상위신호로 작용하는 DR5 발현수준의 상향조절이 rTRAIL과의 복합처리에 의해 더욱 증진되었다.
이러한 결과는, Jurkat A3 세포에 있어서 BS-181의 세포독성에 미치는 rTRAIL의 시너지 효과가, 외인성 TRAIL/DR5-매개 에폽토시스 신호전달 및 이에 따른 BAK-의존적 미토콘드리아 손상-매개 에폽토시스 유도를 증진시킴으로써 야기됨을 입증한다.
2.5. 악성 종양세포 및 정상 인간 T 세포에 있어서 BS-181 세포독성에 대한 rTRAIL의 시너지 효과의 비교
BS-181의 세포독성효과가 악성종양세포와 정상세포에 대해 차이를 나타내는지를 조사하고, 악성종양세포에 대한 BS-181의 선택적 세포독성이 rTRAIL과의 복합처리에 의해 증진될 수 있는지를 밝히기 위해, 악성종양세포 (Jurkat A3, U937 및 HeLa) 및 정상 인간 말초혈액 T 세포 (자극 받지 않았거나 혹은 PHA-자극된 인간 말초 T 세포)에 대한 BS-181의 세포독성을 rTRAIL의 부재 및 존재 하에서 각각 MTT 방법으로 조사하였다.
Jurkat A3, U937 및 HeLa 세포에 대한 BS-181의 IC50 값은 각각 14.5, 16.4 및 17.3 μM로 나타났으나, 자극되지 않았거나 혹은 PHA-자극된 인간 말초혈액 T 세포에 대한 BS-181의 IC50 값은 각각 43.9 및 18.9 μM로 나타났다 (표 1). 이러한 BS-181 세포독성에 대한 rTRAIL (1~4 ng/ml)의 시너지 효과를 악성 및 정상 T 세포간에 비교하였을 때, BS-181 세포독성에 대한 rTRAIL의 시너지 효과는 Jurkat A3, U937 및 HeLa에서 두드러지게 나타났고, 특히 4 ng/ml 농도의 rTRAIL의 복합처리 시에는 Jurkat A3, U937 및 HeLa에 대한 BS-181의 IC50 값을 각각 3.2, 11.4 및 13.0 μM로 낮추는 것으로 나타났다 (도 8의 A, B 및 C). 이러한 조건 하에서, PHA-자극된 인간 말초혈액 T 세포의 경우는 BS-181의 세포독성에 대한 rTRAIL (1~4 ng/ml)의 시너지효과가 전혀 나타나지 않았다 (도 8의 D).
[표 1] 정상인 유래의 말초혈액 T 세포, PHA-자극된 말초혈액 T 세포의 IL-2-의존성 증식 및 종양세포의 증식에 미치는 BS-181의 억제 효과
이상의 연구 결과는 rTRAIL과의 조합에 의해 상승되는 BS-181의 세포독성이 T-ALL 세포주인 Jurkat T 세포에서 가장 높게 나타남을 보여준다. 결론적으로, 이러한 결과는 CDK7 저해제 BS-181의 항암활성이 주로 외인성 TRAIL/DR5-의존성 에폽토시스에 의해 유도됨을 보여주며, 아울러 BS-181 및 rTRAIL의 조합이 T-ALL의 화학요법으로 유망할 수 있음을 시사한다.
Claims (8)
- 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 백혈병 (leukemia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
(Ⅰ) - 제 1항에 있어서, 상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 백혈병 (leukemia)의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품:
(Ⅰ) - 제 3항에 있어서, 상기 백혈병은 급성 T 림프구성 백혈병 (T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)인 것을 특징으로 하는 건강 기능 식품.
- 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 (extrinsic apoptosis) 유도용 시약 조성물:
(Ⅰ) - 제 5항에 있어서, 상기 세포는 T 세포 (T-cell)인 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 인 비트로 (in vitro) 상에서, 세포에 하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 것을 포함하는 세포의 외인성 에폽토시스 (extrinsic apoptosis) 유도 방법:
(Ⅰ) - 제 7항에 있어서, 상기 세포는 T 세포 (T-cell)인 것을 특징으로 하는 유도 방법.
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