KR20200014318A - 최적화된 인간 응고 인자 ix 유전자 발현 카세트 및 이의 사용 - Google Patents

최적화된 인간 응고 인자 ix 유전자 발현 카세트 및 이의 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상체의 간에서 폴리펩티드 및 기능성 핵산을 제조하기 위한 합성된 간-특이적인 프로모터 및 발현 작제물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인자 IX 단백질을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열, 이를 포함하는 벡터, 및 이들 조성물을 출혈 장애를 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

최적화된 인간 응고 인자 IX 유전자 발현 카세트 및 이의 사용
우선권의 진술
본 출원은 미국 가출원 일련 번호 제62/512,833호(2017년 5월 31일 제출)의 이익을 주장하며, 이의 전제 내용은 본원에 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 대상체의 간에서 폴리펩티드 및 기능성 핵산을 제조하기 위한 합성된 간-특이적인 프로모터 및 발현 작제물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인자 IX 단백질을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열, 이를 포함하는 벡터, 및 이들 조성물을 출혈 장애를 치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
인자 IX(FIX)는 인자 X의 인자 Xa로의 변환을 가속화시킴으로써, 응고 캐스캐이드에서 중요한 역할을 한다. FIX 활성의 결핍은 출혈 장애 B형 간염과 관련된다. B형 간염에 대한 최근의 치료는 혈장-유래 또는 재조합 FIX 단백질의 정맥내 주입이다. 이러한 치료가 출혈 사건을 조절하는데 효과적이기는 하지만, FIX의 짧은 반감기(8-12 시간) 때문에, 빈번한 주입을 위한 요건은 본질적으로 비용이 많이 들게 된다. 유전자 치료는 이러한 질병의 최종적인 치료를 위한 매력적인 전략으로서 등장하였다. 그러나 가장 유망한 바이러스 벡터 중 하나인 아데노-관련 바이러스(AAV)를 사용하여 FIX 유전자를 전달하는 데 있어서의 발전은, 불충분한 수준의 FIX 발현 때문에 어려움을 겪었다.
본 발명은 AAV 벡터에서 사용하기에 적합한 짧은 합성된 간-특이적인 프로모터 및 발현 작제물을 제공함으로써, 당업계의 단점을 극복한다. 본 발명은 추가로 연장된 시기 동안 과생리적 수준의 FIX를 제조할 수 있는 최적화된 FIX 암호화 서열, 및 이의 출혈 장애 치료에서의 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 200개 염기쌍 미만의 길이를 갖는 합성된 간-특이적인 프로모터의 개발에 부분적으로 기초한다. 프로모터는 특히 AAV 벡터를 사용하여 간-특이적인 방식으로 폴리펩티드 및 기능성 핵산을 제조하기 위해 사용될 수 있는데, 이는 엄격한 길이 제한, 및 짧지만 강한 프로모터의 이용가능성으로부터 이점을 갖는다.
본 발명은 추가로 연장된 시기 동안 과생리적 수준의 FIX를 제조할 수 있는 최적화된 FIX 암호화 서열의 개발에 부분적으로 기초한다.
일 측면에서, 본 발명은 합성된 간 특이적인 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기에서 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 인간에서의 발현에 코돈 최적화된 인간 인자 IX를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 세포, 및/또는 형질전환 동물에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 생산하는 단계를 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B형 간염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 B형 간염을 치료하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 단계를 포함한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하는 방법에서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B형 간염을 치료하는 방법에서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 방법에 있어서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 대상체에서 B형 간염을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은, 이하의 본 발명의 상세한 설명에서 더욱 상세히 제시되었다.
도 1은 LXP2.1 프로모터(서열번호 1)의 구조 및 서열을 도시한다. 추정되는 간 및 하우스-키핑 전사 인자 결합 부위는 밑줄로 강조하였다.
도 2는 최적화된 간-특이적인 인간 인자 IX(FIX) 유전자 발현 카세트의 구조를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 형질감염의 48시간 이후 Huh7 세포의 배지 중의 FIX 활성을 나타낸다. Huh7 간암 세포는 6-웰 플레이트에 분주하고, 2 ㎍의 FIX 유전자 발현 작제물로 형질감염하였다. 세포 배양 배지는 24시간 후 교환하였고, 무혈청 Opti-MEM 배지에서 형질감염된 지 48시간 이후에 수집하였다. FIX 활성은 표준 시료로서 정제된 정상적인 FIX 단백질을 사용한 APTT 시험으로 측정하였다. Wt FIX 유전자 발현 작제물은 코돈-최적화 없이 원래의 인간 FIX cDNA를 포함하나, R338L 돌연변이를 포함한다. Opti-FIX-1, 2, 3 유전자 발현 작제물은 모두 R338L 돌연변이를 포함하나, 실시예 1의 텍스트에 기재된 바와 같은 상이한 인간 코돈-최적화 알고리즘에 의한다.
도 4는 FIX 유전자 KO 마우스 모델에서 AAV8-LXP2.1-opti-FIX-1 벡터의 투여량 증가 이후의 응고 활성 검정 및 강건하고 장기적인 인자 IX 발현을 도시한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 첨부된 도면을 참고하여 이하에서 더욱 상세히 기재될 것이며, 본 발명의 바람직한 구현예가 도시된다. 그러나 본 발명은 상이한 형태들로 구현될 수 있고, 본원에 제시된 구현예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이들 구현예는 이러한 기재 내용이 철저하고 완전하며, 본 발명의 범주를 당업계의 숙련자들에게 완전히 전달하도록 제공된다.
내용이 달리 기재된 바 없는 경우, 특히 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특성들은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 의도된다. 나아가, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구현예에서, 본원에 제시된 임의의 특성 또는 특성들의 조합이 배제되거나 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시를 위하여, 상세한 설명에서 복합체가 구성 요소 A, B 및 C를 포함한다고 기술하는 경우, 특히 이는 A, B 또는 C 중 어느 것, 또는 이들의 조합이 생략되어, 단수형으로 또는 임의의 조합으로 생략되어 부인될 수 있다고 의도된다.
달리 정의된 바 없는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 관련 분야의 숙련자들에게 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 상세한 설명에 사용되는 기술은 단지 특정 구현예를 설명할 목적을 위한 것이고, 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
뉴클레오티드 서열은 본원에서 구체적으로 달리 기재된 바 없는 경우, 5'에서 3' 방향으로, 좌측에서 우측으로, 단일 가닥으로만 제시된다. 뉴클레오티드 및 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해, 또는 (아미노산에 대해서는) 1-글자 코드, 또는 3-글자 코드(둘 다 37 C.F.R. §1.822 및 확립된 관용법에 의함)에 의해 추천된 방식으로 본원에 제시된다.
달리 기재된 경우를 제외하고는, 당업계의 숙련자들에게 알려진 표준 방법은 유전자를 클로닝하고, 핵산을 증폭 및 탐지하는 등에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 당업계의 숙련자들에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2판. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubel 등 Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York)]를 참고하라.
정의
본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형 ["a," "an," 및 "the"]은 문맥에서 명확히 달리 기재된 바 없는 경우 복수형도 또한 포함하는 것으로 의도된다.
또한, 본원에 사용된 "및/또는(and/or)"은 관련된 열거 항목 중 하나 이상의 일부 및 모든 가능한 조합을 지칭하며, 뿐만 아니라 대안형("또는")에서 해석되는 경우 조합의 결여를 포함하는 것을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은 측정값, 예컨대 폴리펩티드의 양, 투여량, 시간, 온도, 효소 활성 또는 다른 생물학적 활성 등에 대해 지칭될 경우, 특정량의 ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 심지어 ±0.1%의 편차를 포괄하는 것으로 의도된다.
이행 어구 "이를 본질적으로 포함하는(consisting essentially of)"은, 청구항의 범주가 청구항에서 인용된 특정 물질 또는 단계들을 포함하고, 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것으로 해석될 것이다.
용어 "이를 본질적으로 포함하는" (및 문법적인 변형체)은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 적용될 때, 언급된 서열 및 언급된 서열의 5' 및/또는 3' 또는 N-말단 및/또는 C-말단 상의 총 10개 이하(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 둘 다로 이루어져서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능이 실질적으로 변형되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 총 10개 이하의 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산은 양 말단 모두에 첨가된 추가적인 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 수를 포함한다. 용어 "실질적으로 변형(materially altered)된"은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 적용되는 경우, 인용된 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준에 비해 적어도 약 50% 이상의 암호화된 폴리펩티드를 발현하는 능력이 증가 또는 감소되는 것을 지칭한다. 용어 "실질적으로 변형된"은, 본 발명의 폴리펩티드에 적용되는 경우, 인용된 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 활성에 비해 응고-자극 활성을 적어도 약 50% 이상 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "강화되다(enhance)" 또는 "증가되다(increase)" 또는 이의 문법적 변형체는, 특정 변수에서 적어도 약 1.25-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 12-배, 또는 심지어 15-배 증가된 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "저해하다(inhibit)" 또는 "감소되다(reduce)" 또는 이의 문법적 변형체는, 특정 수준 또는 활성에서 적어도 약 15%, 25%, 35%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소되거나 또는 경감되는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, 저해 또는 감소는 탐지가능한 활성이 거의 없거나 또는 본질적으로 없게 한다(최대로, 유의하지 않은 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만).
본원에 사용된 "유효(effective)""량은, 원하는 효과를 제공하는 양이다.
본원에 사용된 "치료 유효(therapeutically effective)"량은, 일부 개선 또는 이점을 대상체에 제공하는 양이다. 대안적으로 기재될 때, "치료 유효"량은 대상체에서 적어도 하나의 임상적 증상이 일부 경감, 완화 또는 감소될 수 있도록 제공될 양이다. 당업계의 숙련자는 대상체에 일부 이점이 제공되는 이상은, 치료 효과가 완전하거나 또는 치유적일 필요가 없다는 점을 이해할 것이다.
본원에 사용된 "예방 효과(prevention effective)"량은, 대상체에서 질병, 장애 및/또는 임상적 증상을 (본원에서 정의된 바와 같이) 예방하는데 충분한 양이다. 당업계의 숙련자는 대상체에 일부 이점이 제공되는 이상은, 예방의 수준이 완전할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법에 의해 출혈 장애를 치료하는 효능은, 당업계의 숙련자에게 잘 알려진 바와 같이, 대상체의 증상 및/또는 임상적 변수의 변화로 나타나는 임상적 개선을 탐지함으로써 결정될 수 있다.
용어 "치료하다(treat)", "치료하는(treating)", 또는 "치료(treatment)"는, 대상체의 질환의 중증도가 감소되거나, 또는 적어도 부분적으로 개선되거나 또는 변형되며, 적어도 하나의 임상적 증상에서 일부 경감, 완화 또는 감소가 달성된 것으로 의도한다.
용어 "예방하다(prevent)", "예방하는(preventing)", 및 "예방(prevention)" (및 이들의 문법적 변형체)은, 질병, 장애 및/또는 임상적 증상(들)의 발생 이전에 본 발명의 방법들을 실시하지 않고 발생될 것들에 비해, 발생 이후의 질병, 장애 및/또는 임상적 증상(들)의 정도 또는 중증도가 감소 또는 지연되는 것을 지칭한다. B형 간염에 대하여, "예방하는"은 예방적 치료 없이 발생한 출혈성 사건의 수 및/또는 중증도보다 더 낮은 수 및/또는 중증도가 발생한 것을 지칭한다.
본원에 사용된, "핵산(nucleic acid)",및 "뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)", 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 상호교환적으로 사용되며, RNA 및 DNA 모두를 포괄하는데, cDNA, 게놈 DNA, mRNA, 합성된(예를 들어, 화학적으로 합성된) DNA 또는 RNA, 및 RNA 및 DNA의 키메라를 포함한다. 용어 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열, 또는 핵산은 사슬의 길이에 관계없이 뉴클레오티드의 사슬을 지칭한다. 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥인 경우, 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 유도체(예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 변형된 염기-쌍 형성 능력을 갖거나 또는 뉴클레아제에 대한 저항성이 증가한 핵산을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로 본 발명의 핵산, 뉴클레오티드 서열, 또는 폴리뉴클레오티드의 보완체(complement)(전체 보완체 또는 부분 보완체일 수 있음)인 핵산을 제공한다.
"분리된 폴리뉴클레오티드(isolated polynucleotide)"는 이것이 유래한 생물의 자연 발생 게놈에서 이것이 바로 인접한 뉴클레오티드 서열(5' 말단에 하나 및 3' 말단에 하나)에 바로 인접하지 않는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)이다. 따라서, 일 구현예에서, 분리된 핵산은 암호화 서열에 바로 인접한 5' 비-암호화 서열(예를 들어, 프로모터)의 일부 또는 전부를 포함한다. 상기 용어는 따라서 예를 들어, 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA로 혼입되는 재조합 DNA, 또는 다른 서열과 무관하게 별개의 분자(예를 들어, PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 제조된 cDNA 또는 게놈 DNA 절편)로 존재하는 것을 포함한다. 이는 또한 추가적인 폴리펩티드 또는 펩티드 서열을 암호화하는 혼성화 핵산의 일부인 재조합 DNA를 포함한다. 유전자를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 이러한 유전자를 포함하는 염색체의 절편이 아니며, 오히려 유전자와 관련된 암호화 부위 및 조절 부위를 포함하나, 염색체 상에서 자연적으로 발견된 추가적인 유전자는 포함하지 않는다.
용어 "절편"은, 폴리뉴클레오티드에 적용될 때, 참고용 핵산 또는 뉴클레오티드 서열에 비해 감소된 길이의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 이는 참고용 핵산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 거의 동일한 (예를 들어, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 동일한) 인접한 뉴클레오티드들의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 및/또는 이로써 이루어진다. 본 발명에 의한 이러한 핵산 절편은, 적절한 경우, 더 큰 폴리뉴클레오티드에 포함되어 이의 구성체가 될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 절편은 본 발명에 따른 핵산 또는 뉴클레오티드 서열의 적어도 약 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 개, 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 및/또는 이로써 이루어질 수 있다.
용어 "분리된"은 세포성 물질, 바이러스 물질, 및/또는 (재조합 DNA 기술에 의해 생성된 경우) 배양 배지, 또는 화학적 전구체 또는 (화학적으로 합성된 경우) 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 핵산, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 게다가, "분리된 절편"은 절편으로서 자연적으로 발생하지는 않아서 자연적인 상태에서 발견되지 않을, 핵산, 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드의 절편이다. "분리된"은 제제가 기술적으로 순수한(균질한) 것을 의미하지는 않지만, 폴리펩티드 또는 핵산을 의도된 목적으로 사용될 수 있는 형태로 제공하기에 충분히 순수하다.
용어 "절편"은, 폴리펩티드에 적용될 때 참고용 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 비해 감소된 길이의 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이며, 이는 참고용 폴리펩티드 또는 아미노산 서열과 동일하거나 또는 거의 동일한(예를 들어, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 동일한) 인접한 아미노산들의 아미노산 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 및/또는 이로써 이루어진다. 본 발명에 의한 이러한 폴리펩티드 절편은 적절한 경우, 구성체인 더 큰 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 절편은 본 발명의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열의 적어도 약 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 개, 또는 그 이상의 인접한 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 및/또는 이로써 이루어질 수 있다.
"벡터(vector)"는 핵산을 클로닝하고 및/또는 세포로 전달하기 위한 임의의 핵산 분자이다. 벡터는 이에 또 다른 뉴클레오티드 서열이 부착되어 그 부착된 뉴클레오티드 서열의 복제를 허용할 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘(replicon)"은 생 체내에서 핵산 복제의 자가 단위로서 기능하는데, 즉, 이의 자체 조절 하에 복제할 수 있는 임의의 유전적 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 게놈)일 수 있다. 용어 "벡터"는 시험관 내에서, 생체외에서, 및/또는 생체내에서 핵산을 세포로 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스(예를 들어, 플라스미드) 핵산 분자를 모두 포함한다. 당업계에 알려진 다수의 벡터는 핵산을 조작하고, 반응 요소 및 프로모터를 유전자에 도입하는 등에 사용될 수 있다. 예를 들어, 반응 요소 및 프로모터에 해당하는 핵산 절편의 적합한 벡터로의 삽입은, 적절한 핵산 절편을 보완적인 점착 말단을 갖는 선택된 벡터에 라이게이션함으로써 달성할 수 있다. 대안적으로, 핵산 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있거나, 또는 어느 부위는 뉴클레오티드 서열(링커)을 핵산 말단에 라이게이션함으로써 제조될 수 있다. 이러한 벡터는 벡터를 포함하는 세포의 선별을 위해 제공하는 선별 마커를 암호화하는 서열을 포함하고, 및/또는 벡터의 핵산을 세포성 게놈에 혼입시키도록 조작될 수 있다. 이러한 마커는 마커에 의해 암호화되는 단백질을 포함하여 이를 발현시키는 숙주 세포의 식별 및/또는 선별을 가능하게 한다. "재조합(recombinant)" 벡터는 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열[즉, 전이유전자(transgene)], 예를 들어, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 지칭한다.
바이러스 벡터는 세포, 뿐만 아니라 살아있는 동물 대상체에서 넓은 범위의 다양한 유전자 전달 응용에 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스, 수두바이러스, 알파바이러스, 배큘로 바이러스, 천연두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 및 아데노바이러스 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적으로 충전된 지질(사이토펙틴), 핵산-단백질 복합체, 및 생체중합체(biopolymer)를 포함한다. 관심 대상의 핵산 이외에, 벡터는 또한 핵산 전달 결과(특이적인 조직으로의 전달, 발현의 지속 등)의 선별, 측정 및 모니터링에 유용한 하나 이상의 조절 부위, 및/또는 선별 마커를 포함할 수도 있다.
벡터는 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용, 또는 핵산 벡터 전달자에 의해 원하는 세포에 도입될 수 있다[(예를 들어, Wu 등, J. Biol . Chem . 267:963 (1992); Wu 등, J. Biol . Chem . 263:14621 (1988); 및 Hartmut 등, 캐나다 특허 출원 제2,012,311호(2017년 3월 15일자 제출)를 참고하라]. 다양한 구현예에서, 다른 분자, 예컨대 양이온성 올리고펩티드(예를 들어, WO95/21931), 핵산 결합 단백질 유래의 펩티드[예를 들어, WO96/25508), 및/또는 양이온성 중합체(예를 들어, WO95/21931)로부터 유래한 펩티드는 생체 내에서 핵산의 전달을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 또한 벡터를 생 체내에서 네이키드(naked) 핵산으로 도입하는 것도 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호를 참고하라). 수용체-매개 핵산 전달 접근법도 또한 사용될 수 있다[(Curiel 등, Hum. Gene Ther . 3:147 (1992); Wu 등, J. Biol . Chem. 262:4429 (1987)].
본원에 사용된, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되며, 달리 기재된 바 없는 경우 펩티드 및 단백질을 모두 포괄한다.
"융합 단백질(fusion protein)"은 자연에서는 함께 융합되어 발견되지 않는 2개 (또는 그 이상의) 상이한 폴리펩티드를 암호화하는 2개의 이종 뉴클레오티드 서열 또는 이의 절편이 정확한 번역 해독 프레임으로 함께 융합되는 경우 제조되는 폴리펩티드이다. 예시적인 융합 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드 (또는 이의 절편)의, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토스-결합 단백질, 또는 리포터 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, β-글루쿠로니다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제 등), 헤마글루티닌, c-myc, FLAG 에피토프 등의 전부 또는 일부로의 융합체를 포함한다.
본원에 사용된 "기능성((functional)" 폴리펩티드 또는 "기능성 절편(functional fragment)"은, 그 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성(예를 들어, 효소 활성, 단백질 결합, 리간드 또는 수용체 결합)을 실질적으로 보유하는 것이다. 특정 구현예에서, "기능성" 폴리펩티드 또는 "기능성 절편"은 변형되지 않은 펩티드가 갖는 모든 활성을 실질적으로 보유한다. 생물학적 활성을 "실질적으로 보유(substantially retains)"하는 것은, 폴리펩티드가 원래의 폴리펩티드의 생물학적 활성의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상을 보유하고, (심지어 원래의 폴리펩티드보다 더 높은 수준의 활성을 가질 수 있는) 것을 의미한다. "비-기능성(non-functional)" 폴리펩티드는 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 생물학적 활성을 거의 나타내지 않거나, 또는 본질적으로 탐지할 수 있을 정도로 나타내지 않는 것이다(예를 들어, 최대로, 단지 유의하지 않은 양, 예를 들어, 약 10% 또는 심지어 5% 미만). 생물학적 활성, 예컨대 단백질 결합 및 효소 활성은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 검정법을 사용하여 측정할 수 있다.
용어 폴리뉴클레오티드 암호화 서열을 "발현하는(express)" 또는 "발현(expression)"은, 서열이 전사되고, 선택적으로 번역되는 것을 의미한다. 통상적으로, 본 발명에 의하면, 본 발명의 암호화 서열의 발현에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 제조가 가능해질 것이다. 전체적인 발현된 폴리펩티드 또는 절편은 또한 정제 없이도 손상되지 않은 세포에서 기능할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "아데노-관련 바이러스"(adeno-associated virus, AAV)는, 제한 없이 AAV 타입 1, AAV 타입 2, AAV 타입 3(타입 3A 및 3B 포함), AAV 타입 4, AAV 타입 5, AAV 타입 6, AAV 타입 7, AAV 타입 8, AAV 타입 9, AAV 타입 10, AAV 타입 11, AAV12, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 및 양 AAV 및 현재 알려졌거나 또는 이후에 발견될 임의의 다른 AAV를 포함한다. 예를 들어, 문헌[BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, 챕터 69(4판, Lippincott-Raven 출판사)]를 참고하라. 다수의 추가적인 AAV 혈청 타입 및 분기군(clade)이 식별되었고[예를 들어, Gao 등, (2004) J. Virol . 78:6381-6388 및 표 1를 참고하라], 이들도 또한 용어 "AAV"에 포괄된다.
다양한 AAV 및 자가 파르보바이러스의 게놈 서열, 뿐만 아니라 ITR의 서열, Rep 단백질, 및 캡시드 하위 단위가 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공공적인 데이터베이스, 예컨대 GenBank® 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, GenBank® 수탁 번호 NC 002077, NC 001401, NC 001729, NC 001863, NC 001829, NC 001862, NC 000883, NC 001701, NC 001510, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC 001358, NC 001540, AF513851, AF513852, AY530579, AY631965, AY631966를 참고하라; 그 기재 내용은 본원에서 전체로서 참고된다. 또한, 예를 들어, 문헌[Srivistava 등, (1983) J. Virol . 45:555; Chiorini 등, (1998) J. Virol . 71:6823; Chiorini 등, (1999) J. Virol . 73:1309; Bantel-Schaal 등, (1999) J. Virol . 73:939; Xiao 등, (1999) J. Virol . 73:3994; Muramatsu 등, (1996) Virology 221:208; Shade 등, (1986) J. Virol . 58:921; Gao 등, (2002) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 99:11854]; 국제 특허 공보 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 미국 특허 제6,156,303호를 참고하라; 그 기재 내용은 본원에서 전체로서 참고된다. 또한, 표 1을 참고하라. AAV1, AAV2 및 AAV3 말단 반복부 서열의 초기 기재는 문헌[Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno- associated virus (AAV) DNA replication and integration," Ph.D. Dissertation, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA](본원에서 전체로서 포함됨)에 기재되었다.
"재조합 AAV 벡터 게놈(recombinant AAV vector genome)" 또는 "rAAV 게놈(rAAV genome)"은, 적어도 하나의 반전된 말단 반복부(예를 들어, 1, 2 또는 3개의 반전된 말단 반복부) 및 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 게놈(즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 시스 방식으로 145개의 염기 말단 반복부(들)[TR(들)]를 보유하여, 바이러스를 생성한다; 그러나, 부분적인 또는 완전한 합성된 서열을 포함하는 변형된 AAV TR 및 비-AAV TR도 또한 이러한 목적을 제공할 수 있다. 모든 다른 바이러스 서열은 불필요하며, 트랜스 방식으로 공급될 수도 있다[Muzyczka, (1992) Curr . Topics Microbiol. Immunol . 158:97]. rAAV 벡터는 선택적으로 2개의 TR(예를 들어, AAV TR)를 포함하는데, 이는 일반적으로 이종 뉴클레오티드 서열(들)의 5' 및 3' 말단에 있을 것이나, 인접할 필요는 없다. TR은 서로 동일 또는 상이할 수 있다. 벡터 게놈은 또한 이의 3' 또는 5' 말단에 단일 ITR을 포함할 수 있다.
용어 "말단 반복부(terminal repeat)" 또는 "TR"은 헤어핀 구조를 형성하고 반전된 말단 반복부로서 기능하는(즉, 원하는 기능들, 예컨대 복제, 바이러스 패키징, 통합(integration) 및/또는 프로바이러스 구제(provirus rescue) 등을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성된 서열을 포함한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV TR 서열, 예컨대 다른 파르보바이러스[예를 들어, 개 파르보바이러스(CPV), 마우스 파르보바이러스(MVM), 인간 파르보바이러스 B-19] 또는 SV40 복제의 기원으로 역할을 하는 SV40 헤어핀의 것들이, 절단(truncation), 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 변형될 수 있는 TR로서 사용될 수 있다. 추가로, TR은 Samulski 등에게 양도된 미국 특허 제5,478,745호에 기재된 바와 같은, 부분적으로 또는 완전히 합성된 예컨대 "이중-D 서열(double-D sequence)"일 수 있다.
"AAV 말단 반복부(AAV terminal repeat)" 또는 "AAV TR"은 혈청 타입 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 또는 현재 알려졌거나 또는 이후에 발견된 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 AAV로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 표 1을 참고하라). 말단 반복부가 원하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패키징, 통합, 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는 이상, AAV 말단 반복부는 원래의 말단 반복부 서열을 가질 필요가 없다[예를 들어, 원래의 AAV TR 서열은 삽입부, 결실, 절단 및/또는 미스센스(missense) 돌연변이에 의해 변형될 수 있다].
본 발명의 바이러스 벡터는, 국제 특허 공보 WO 00/28004 및 문헌[Chao 등, (2000) Mol . Therapy 2:619]에 기재된 바와 같이, 추가로 "표적화된(targeted)" 바이러스 벡터[예를 들어, 지정된 친화성(tropism)을 가짐]및/또는 "혼성화(hybrid)" 파르보바이러스(즉, 여기에서 바이러스 ITR 및 바이러스 캡시드는 상이한 파르보바이러스로부터 유래한다) 일 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 다른 변형을 포함할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "아미노산"은 임의의 자연 발생 아미노산, 이의 변형된 형태, 및 합성된 아미노산을 포괄한다.
자연 발생적인 좌선성(levorotatory)(L-) 아미노산은 표 2에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기(비제한적 예는 표 3에 나타나 있다)일 수 있거나, 또는 번역-후 변형(예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 포르밀화, 히드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형된 아미노산일 수 있다.
Figure pct00003
추가로, 비-자연 발생 아미노산은 문헌[Wang 등, (2006) Annu . Rev. Biophys. Biomol . Struct . 35:225-49]에 기재된 바와 같이, "비자연적(unnatural)" 아미노산일 수 있다. 이들 비자연적 아미노산은 관심 대상의 분자를 AAV 캡시드 단백질에 화학적으로 연결시키는데 유리하게 사용될 수 있다.
용어 "템플레이트(template)" 또는 "기질(substrate)"은 본원에서 파르보바이러스 바이러스 DNA를 제조하기 위해 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 벡터 제조의 목적을 위해, 템플레이트는 통상적으로 플라스미드, 네이키드 DNA 벡터, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, AAV, 배큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는 더 큰 뉴클레오티드 서열 또는 작제물 내부에 삽입될 수 있을 것이다(embedded). 대안적으로, 템플레이트는 패키징 세포의 염색체로 안정적으로 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 파르보바이러스 또는 AAV "Rep 암호화 서열(Rep coding sequences)"은 바이러스 복제 및 새로운 바이러스 입자의 제조를 매개하는 파르보바이러스 또는 AAV 비-구조적 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 가리킨다. 파르보바이러스 및 AAV 복제 유전자 및 단백질은 예를 들어, 문헌[Fields 등, Virology, volume 2, chapters 69 & 70(4판, Lippincott-Raven 출판사)]에 기재되어 있다.
"Rep 암호화 서열"은 파르보바이러스 또는 AAV Rep 단백질을 모두 암호화할 필요는 없다. 예를 들어, AAV에 대하여, Rep 암호화 서열은 4개의 AAV Rep 단백질 (Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40)을 모두 암호화할 필요는 없고, 실제로 AAV5는 단지 스플라이싱된 Rep68 및 Rep40 단백질만을 발현하는 것으로 여겨진다. 대표적인 구현예에서, Rep 암호화 서열은 적어도 바이러스 게놈 복제 및 새로운 비리온(virion)으로의 패키징에 필요한 이들 복제 단백질을 암호화한다. Rep 암호화 서열은 일반적으로 적어도 하나의 큰 Rep 단백질(즉, Rep78/68) 및 하나의 작은 Rep 단백질(즉, Rep52/40)을 암호화할 것이다. 특정 구현예에서, Rep 암호화 서열은 AAV Rep78 단백질 및 AAV Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, Rep 암호화 서열은 Rep68 및 Rep52 및/또는 Rep40 단백질을 암호화한다. 또 다른 추가적인 구현예에서, Rep 암호화 서열은 Rep68 및 Rep52 단백질, Rep68 및 Rep40 단백질, Rep78 및 Rep52 단백질, 또는 Rep78 및 Rep40 단백질을 암호화한다.
본원에 사용된 용어 "큰 Rep 단백질"은 Rep68 및/또는 Rep78을 지칭한다. 본 청구항의 큰 Rep 단백질은 야생형이거나, 또는 합성될 수 있다. 야생형의 큰 Rep 단백질은 혈청 타입 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 13, 또는 현재 알려져 있거나 또는 나중에 발견될 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 파르보바이러스 또는 AAV로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 표 1를 참고하라). 합성된 큰 Rep 단백질은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변형될 수 있다.
당업계의 숙련자들은 추가로 복제 단백질들이 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, MVM에 대하여, NS-1 및 NS-2 단백질(스플라이싱된 변이체)은 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 마찬가지로, AAV에 대해서는, p19 프로모터는 불활성화될 수 있고, 큰 Rep 단백질(들)은 하나의 폴리뉴클레오티드로부터 발현되고, 작은 Rep 단백질(들)은 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현된다. 그러나 통상적으로 복제 단백질을 단일 작제물로부터 발현시키는 것이 더 편리할 것이다. 일부 시스템에서, 바이러스 프로모터(예를 들어, AAV p19 프로모터)는 세포에서 인식되지 않을 수도 있으며, 따라서 별개의 발현 카세트로부터 크고 작은 Rep 단백질들을 발현시킬 필요가 있다. 다른 경우에, 큰 Rep 및 작은 Rep 단백질을 별도로, 즉, 별개의 전사 및/또는 번역 조절 요소의 조절 하에서 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 큰 Rep 단백질의 발현을, 큰 Rep 단백질 대 작은 Rep 단백질의 비율이 감소하도록 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 곤충 세포의 경우, 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep78/68)의 발현을 하향-조절하여 세포에 대한 독성을 피하는 것이 유리할 수 있다(예를 들어, Urabe 등, (2002) Human Gene Tharapy 13:1935를 참고하라).
본원에 사용된 파르보바이러스 또는 AAV "cap 암호화 서열"은, 기능성 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드를 형성하는(즉, DNA를 패키징하고 표적 세포를 감염시킬 수 있는) 구조적 단백질을 암호화한다. 통상적으로, cap 암호화 서열은 파르보바이러스 또는 AAV 캡시드 하위 단위 모두를 암호화할 것이나, 기능성 캡시드가 제조되는 이상은 캡시드 하위 단위는 전체보다는 적게 암호화될 수 있다. 통상적이지만, 필수적이지는 않지만, cap 암호화 서열은 단일 핵산 분자 상에 존재할 것이다.
용어 "rAAV 입자" 및 "rAAV 비리온"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "rAAV 입자" 또는 "rAAV 비리온"은 AAV 캡시드 내에 패키징된 rAAV 벡터 게놈을 포함한다.
AAV 캡시드 구조는 문헌[BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70(4판, Lippincott-Raven 출판사)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
용어 "약동학적 특성(pharmacokinetic properties)"은 통상의 관례적인 의미를 갖고, FIX 단백질의 흡수, 분포, 대사 및 분비를 지칭한다.
"생체이용성(bioavailability)"의 통상의 관례적인 의미는, 전신 순환에 도달한 생물학적으로 활성인 약물의 분획 또는 투여량이다. 본 발명의 구현예의 맥락에서, 용어 "생체이용성"은 통상의 관례적인 의미를 포함하나, 추가로, FIX 단백질이 생활성인 정도로 포함되는 넓은 의미를 갖는 것으로 받아들여진다. FIX의 경우, 예를 들어, "생체이용성"의 하나의 측정은 주입-후 순환에서 얻은 FIX 단백질의 응고 촉진 활성이다.
"번역후 변형(Posttranslational modification)"은 이들의 통상적이며 관례적인 의미를 갖고, 리더 서열의 제거, 글루탐산 잔기의 γ-카르복실화, 아스파르트산 잔기의 β-히드록실화, 아스파라긴 잔기의 N-연결된 글리코실화, 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 O-연결된 글리코실화, 티로신 잔기의 황산화, 세린 잔기의 인산화 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "생물학적 활성(biological activity)"은 예를 들어, 인간 혈장으로부터 유래되거나, 또는 재조합에 의해 제조된 기준 물질에 비교하여 결정된다. FIX에 대하여, 기준 물질은 BeNEFIX®(Pfizer) 또는 MONONINE®(CSL Behring)일 수 있다. 기준 물질의 생물학적 활성은 100%인 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 용어 "인자 IX 단백질" 또는 "FIX 단백질"은 야생형 FIX 단백질, 뿐만 아니라 자연 발생적인 또는 인간이 제조한 단백질을 포함한다. 본 발명의 FIX 단백질은 문헌에서 공지된 FIX의 돌연변이 형태(예를 들어, Padua 돌연변이)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 FIX 단백질은 현재 알려졌거나 또는 이후에 확인될 임의의 다른 자연 발생적인 인간 FIX 단백질, 또는 인간이 만든 인간 FIX 단백질, 및 당업계에 알려진 이의 유도체 및 활성 절편/활성 도메인을 추가로 포함한다.
다수의 포유류 종으로부터의 FIX의 아미노산 서열은, 서열 데이터베이스, 예컨대 GenBank로부터 이용가능하다. FIX 서열의 예는 이하의 표에 나와있다.
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본 발명의 FIX 단백질은 추가로 FIX의 약학적인 활성 형태를 포함하는데, 이는 신호 펩티드가 제거된 분자이며, 상기 단백질은 프로테아제의 작용에 의해 (또는 이를 핵산 수준에서 제거하여 단백질에서 탈락되도록 조작함으로써) 절단되어, 이황화 다리로 연결되는 2개의 비-인접한 폴리펩티드 사슬을 생성한다.
인간 FIX 단백질의 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 GenBank 수탁 번호 AAB59620.1에서 찾을 수 있다. 인간 FIX 단백질은 461개 아미노산 길이이며, 신호 펩티드(잔기 1-46), Gla 도메인(잔기 28-92), EGF 도메인(잔기 93-129), 및 트립신 도메인(잔기 226-454)로 구성된다.
용어 "반감기(half-life)"는 통상의 관례적인 의미, 뿐만 아니라 FIX 에 대한 과학 문헌에 나타나는 통상의 관례적인 의미를 포함하는 넓은 용어이다. 특히, 이러한 정의에는, 주입시 측정된 초기값으로부터 초기값의 절반으로 감소될 때까지의 주입-후 시간을 정의하는, FIX와 관련된 변수의 측정이 포함된다. 일부 구현예에서, FIX의 반감기는 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 면역검정법에서 FIX에 대한 항체를 사용하여 혈액 및/또는 혈액 성분에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 반감기는 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같이, 표준 응고 검정법을 포함하는 기능성 검정법을 사용하여 FIX 활성에서의 감소로 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "회복(recovery)"은 임의의 허용가능한 방법에 의해 측정된 FIX의 양을 포함하는데, 이는 FIX의 투입, 주입, 전달 또는 아니면 투여 이후 FIX의 수준을 측정할 목적으로 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈액 산물 샘플)을 채취하는 최초의 실행 시간에 수여체 동물 또는 인간 대상체(예를 들어, 순환계)에서 탐지된, FIX 항원 수준 또는 FIX 프로테아제 또는 응고 활성 수준을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 최근의 방법들에서는, FIX 회복을 측정하기 위한 최초의 생물학적 샘플링 시간은 통상 FIX의 투입, 주입, 또는 전달/투여 후 첫번째 15분 이내에 해당되지만, 과학적 및/또는 임상적 기술이 개선됨에 따라 더 빠른 샘플링 시간을 기대하는 것이 합리적이다. 본질적으로, FIX에 대한 회복값은 본원에서 수여체 동물 또는 환자로의 투입, 주입 또는 다른 전달 이후 최초의 가능한 시점에 수여체(예를 들어, 순환계)에서 측정할 수 있는, 투입, 주입, 또는 그렇지 않으면 전달된/투여된 FIX의 최대 분획을 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "형질전환된(transformed)" 세포는, 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 핵산 분자(재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된 FIX 단백질 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않음)로 형질전환되거나(transformed), 형질도입되거나(transduced), 및/또는 형질감염된(transfected) 세포이다.
본원에 사용된, 용어 "출혈 장애(bleeding disorder)"는 출혈에서 명백한 세포성, 생리적, 또는 분자 기원의 선천적인, 후천적인 또는 유도된 임의의 결함을 반영한다. 예로는 응고 인자 결핍(예를 들어, 혈우병 A 및 B, 또는 응고 인자 XI, VII, VIII, 또는 IX의 결핍), 응고 인자 저해제, 혈소판 기능 결여(defective platelet function), 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 빌러브란트씨 병(von Willebrand's disease), 또는 수술 또는 외상에 의해 유발된 출혈이 있다.
과다한 출혈은 또한 정상적으로 기능하는 혈액 응고 캐스캐이드를 갖는 대상체(응고 인자 결핍 또는 어느 응고 인자에 대한 저해제 없음)에서도 발생할 수 있으며, 혈소판 기능 결여, 혈소판 감소증 또는 빌러브란트씨 병에 의해 유발될 수 있다. 이러한 경우에, 출혈은 혈우병에 의해 유발되는 이들 출혈과 연관될 수 있는데, 이는 혈우병에서와 마찬가지로 지혈 시스템이 부족하거나, 또는 비정상적인 필수 응고 "화합물"(예컨대 혈소판 또는 빌러브란트씨 인자 단백질)을 가져서, 주요한 출혈을 유발하기 때문이다. 수술 또는 외상과 관련된 넓은 조직 손상을 경험한 대상체에서, 정상적인 지혈 메커니즘은 즉각적인 지혈의 요구에 의해 제압될 수 있고, 이들은 정상적인 지혈 메커니즘에도 불구하고 출혈을 발생시킬 수 있다. 만족스러운 지혈을 달성하는 것은, 또한 출혈이 장기 예컨대 뇌, 내이 부위 및 눈에서 발생하는 경우, 수술 지혈의 제한된 가능성과 관련된 문제이다. 동일한 문제는 다양한 장기(간, 폐, 종양 조직, 위장관)로부터 생검을 채취하는 과정, 뿐만 아니라 복강경 수술에서도 발생할 수 있다. 수술 기술(봉합사, 클립 등)에 의해 지혈을 제공하기 어려운 것이 이들 모든 상황에서 공통적이며, 이는 또한 출혈이 확산되는 경우(출혈성 위염 및 다량의 자궁 출혈)이기도 하다. 급성의 대량 출혈도 또한 지혈 결여가 소정의 치료에 의해 유발되는 항응고제 치료에서 대상체에게 발생할 수 있다. 이러한 대상체는 항응고제 효과가 신속히 대응되어야 하는 경우 수술적 개재가 필요할 수 있다. 치골후 근치적 전립선 절제술(Radical retropubic prostatectomy)은 국소적인 전립선암을 갖는 대상체에게 공통적으로 실시되는 수술이다. 수술은 상당한 때로는 다량의 혈액 손실에 의해 흔히 복잡하다. 전립선 절제 동안의 상당한 혈액 손실은, 수술 지혈에 용이하게 접근할 수 없는 다양하고 촘촘한 혈관 부위를 갖는 복합적인 해부학적 상황과 주로 관련되는데, 이는 넓은 면적으로부터 확산된 출혈을 발생시킬 수 있다. 또한, 뇌내 출혈(intracerebral hemorrhage)는 뇌졸중의 최소의 치료가능 형태이고, 뇌내 출혈 이후의 첫 번째 몇 시간 내에 발생하는 높은 사망률 및 혈종(hematoma) 성장과 관련된다. 불만족스러운 지혈의 경우 문제를 발생시킬 수 있는 또 다른 상황은, 정상적인 지혈 메커니즘을 갖는 대상체에 항응고 치료를 부여하여 혈전색전성(thromboembolic) 질병을 예방하는 경우이다. 이러한 치료는 헤파린, 다른 형태의 프로테오글리칸(proteoglycans), 와파린(warfarin) 또는 다른 형태의 비타민 K-길항제, 뿐만 아니라 아스피린 및 다른 혈소판 응집 저해제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 출혈은 혈우병과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 후천적인 저해제에 의한 혈우병과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 혈소판 감소증과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 빌러브란트씨 병과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 심각한 조직 손상과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 심각한 외상과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 수술과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 복강경 수술과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 출혈성 위염(hemorrhagic gastritis)과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 다량의 자궁 출혈이다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 기계적 지혈의 제한적 가능성을 갖는 장기에서 발생한다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 뇌, 내이 부위 또는 눈에서 발생한다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 생검을 채취하는 과정과 관련된다. 또 다른 구현예에서, 출혈은 항응고제 치료와 관련된다.
본 발명의 "대상체(subject)"는 출혈 제어가 필요하거나/하고 출혈 제어가 요망되는 출혈 장애 또는 출혈 질환[예컨대 혈우병 B 및 (예를 들어, FIX에 대한 자가항체 또는 혈액 악성 종양에 기인한) 후천성 FIX 결핍]을 갖거나 또는 이에 취약한 임의의 동물을 포함하고, 이는 FIX를 대상체에 투여함으로써 치료, 완화 또는 예방될 수 있다. 이러한 대상체는 일반적으로 포유류 대상체(예를 들어, 실험 동물, 예컨대 래트, 마우스, 기니피그, 토끼, 영장류 등), 농장 또는 상업적인 동물(예를 들어, 소, 말, 염소, 당나귀, 양 등), 또는 가축 동물(예를 들어, 고양이, 개, 족제비 등)이다. 특정 구현예에서, 대상체는 영장류 대상체, 비-인간 영장류 대상체(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 원숭이, 고릴라 등) 또는 인간이다. 본 발명의 대상체는 제어가 필요하거나/하고 제어가 요구되는 출혈 장애 또는 출혈 질환의 위험이 있는 것으로 알려지거나 또는 여겨지는 대상체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 대상체는 또한 제어가 필요하거나 또는 제어가 요구되는 출혈 장애 또는 출혈 질환의 위험이 이전에 알려졌거나 또는 이에 취약한 대상체를 포함할 수 있다. 추가적인 선택 사항으로, 대상체는 실험 동물 및/또는 질병의 동물 모델일 수 있다.
대상체는 신생아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는, 임의의 연령의 남성 및/또는 여성을 포함한다. 인간 대상체에 대하여, 대표적인 구현예에서, 대상체는 영아(예를 들어, 약 12 개월, 10 개월, 9 개월, 8 개월, 7 개월, 6 개월 미만, 또는 더 어림), 유아(예를 들어, 적어도 약 12, 18 또는 24 개월 및/또는 약 36, 30 또는 24 개월 미만), 또는 소아(예를 들어, 적어도 약 1, 2, 3, 4 또는 5 세의 연령, 및/또는 약 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 또는 4 세 미만의 연령)일 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 대상체는 약 0 내지 3, 4, 5, 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 약 3 내지 6, 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 약 6 내지 9, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 약 9 내지 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 약 12 내지 18, 24, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 약 18 내지 24, 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령, 또는 약 24 내지 30, 36, 48 또는 60 개월의 연령인 인간 대상체이다.
프로모터 및 발현 카세트
본 발명의 일 측면은 합성된 간 특이적인 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기에서 상기 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 프로모터는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 간 특이적인 발현에 이상적인 짧고(200 염기쌍 미만) 강한 간-특이적인 프로모터인데, 이는 AAV 벡터의 짧은 길이 및 제한된 용량으로 인해 AAV 벡터에 사용하기에 특히 적합하다. 프로모터는 보존된 기본 프로모터 요소 및 전사 개시 부위를 포함하도록 고안되었다. 기본 프로모터는 이의 5' 말단에서 간-특이적인 발현을 위한 다수의 간-특이적인 전사 인자 결합 부위와 연결된다(도 1). 프로모터는 인간 간암 세포주 Huh7에서 루시퍼라제 리포터 유전자 및 형질감염 실험을 사용하여 초기에 시험관 내에서 확인되고, 이후 마우스에서 생체내에서 확증된 바와 같이, 높은 활성을 나타내었다.
프로모터는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 암호화한다. 특정 구현예에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 응고 인자, 예를 들어, FVIX를 암호화한다. 일부 구현예에서, FIX를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 인간에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 특정 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 서열 번호 14-16 중 하나와 적어도 90% 동일한, 예를 들어, 서열 번호 14-16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써이루어진다. 일부 구현예에서, FIX를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려진 돌연변이 또는 서열 변형을 포함하는 FIX 서열을 암호화한다. 일 예에서, 인자 IX 암호화 서열은 R338L 돌연변이를 생성하는 미스센스 돌연변이(Padua 돌연변이) 또는 그 부위(인간 인자 IX에 대해 넘버링함)의 다른 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 사이에 합성된 5'-비번역 부위(5'-UTR)를 추가로 포함한다. 합성된 5'-UTR은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 5'-UTR은 합성된 인트론을 포함한다. 합성된 인트론은 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 5'-UTR 및 합성된 인트론은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터, 합성된 5'-UTR 및 합성된 인트론은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 프로모터 또는 임의의 프로모터에 연결된 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 합성된 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열이며, 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 합성된 인트론은 함께 서열 번호 6, 7, 또는 8 중 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열 번호 6, 7, 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 어느 것도 폴리아데닐화 부위, 예를 들어, 양방향 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 부위는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열에 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 인자 IX를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 서열 번호 14-16 중 하나와 적어도 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열 번호 14-16의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화된 서열은 합성된 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성된 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다. 특정 구현예에서, 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 합성된 인트론은 함께 서열 번호 6, 7, 또는 8 중 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열 번호 6, 7, 또는 8의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이를 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다.
특정 구현예에서, 본 발명의 어느 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트, 예를 들어 프로모터, 5'UTR, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 합성된 인트론, 및/또는 폴리아데닐화 부위를 임의의 조합 및 순서로 압착하는 발현 카세트의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 서열 번호 10, 11, 또는 12 중 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열, 예를 들어, 서열 번호 10, 11, 또는 12의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 포함하거나, 또는 이로써 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면은 벡터, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다. 벡터는 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 타입의 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 타입 1, AAV 타입 2, AAV 타입 3(타입 3A 및 3B 포함), AAV 타입 4, AAV 타입 5, AAV 타입 6, AAV 타입 7, AAV 타입 8, AAV 타입 9, AAV 타입 10, AAV 타입 11, AAV 타입 12, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 및 양 AAV, 및 현재 알려졌거나 또는 이후 발견될 임의의 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 알려진 AAV 혈청 타입로부터의 AAV 벡터이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 AAV8 또는 AAV9이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 분리된 세포, 형질전환된 세포, 재조합 세포, 시험관 내 또는 생체외 세포 등)에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현예는 벡터(예를 들어, 발현 카세트)를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는 분리되거나, 및/또는 형질전환 동물 내에 존재할 수 있다. 세포의 형질전환은 이하에서 추가로 기재된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 포함하는 형질전환된 비-인간 동물에 관한 것이다. 형질전환 동물은 이하에서 추가로 기재된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 세포는 약학적 조성물 중에 포함될 수 있다. 일부 구현예는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 세포를 포함하는 키트, 및/또는 예를 들어 본 발명의 방법을 수행하기 위해 상기 키트를 사용하기 위한 시약 및/또는 지침에 관한 것이다.
본 발명의 방법
본 발명의 추가적인 측면은 예를 들어, 간-특이적인 방식으로 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하기 위한 프로모터, 최적화된 서열, 및 본 발명의 발현 카세트의 사용에 관한 것이다. 따라서, 일 측면은 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하는 단계를 포함한다. 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드의 발현이 폴리펩티드 또는 기능성 핵산의 제조를 위해 발생하는 조건 하에서 전달된다. 이러한 조건은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 이하에서 추가로 기재된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 프로모터, 최적화된 서열, 및 발현 카세트를 사용하여 대상체에서 B형 혈우병 또는 후천성 인자 IX 결핍을 치료하는 방법에 관한 것인데, 대상체에게 본 발명의 치료 유효량의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 B형 혈우병 또는 후천성 인자 IX 결핍을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 FIX 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
본 발명의 추가적 측면은 본 발명의 프로모터, 최적화된 서열, 및 발현 카세트를 사용하여 대상체에서 FIX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 본 발명의 유효량의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 FIX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 단계를 포함한다. 이러한 측면에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 FIX 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 대상체의 간에서 FIX를 제조하는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 본 발명의 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체의 간에서 FIX를 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적 측면은 대상체에서 FIX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 대상체에게 본 발명의 유효량의 FIX 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 FIX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 출혈 장애는 FIX로 치료될 수 있는 임의의 장애, 예컨대 B형 혈우병 및 후천적인 FIX 결핍을 포함한다. 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 대상체(예를 들어, 이것이 필요한 대상체)에게 투여 또는 전달하기 위한 이러한 치료 프로토콜 및 투여 요법은, 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 다른 핵산 벡터)의 투여량은, FIX 단백질의 치료적인 혈장 농도가 달성되는 양일 수 있다. FIX 단백질의 치료적인 농도는 건강한 개체의 정상적인 수준[이는 평균 100%, 따라서, 1 mL의 정상적인 인간 혈장 중의 1 국제 단위(IU)의 FIX 상에서 측정된다]의 1% 초과로 고려된다. 당업계의 숙련자는 소정의 대상체 및 소정의 조건을 위한 최적 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
의도적인 개제와 관련된 치료를 위해, 본 발명의 FIX 단백질은 통상적으로 개재술을 실시하기 전 약 24 시간 이내에, 그 이후 7 일 이상 동안만큼 투여될 것이다. 응고제로서의 투여는 본원에 기재된 다양한 경로에 의할 수 있다.
약학적 조성물은 주로 예방적 및/또는 치료적인 처리를 위한 비경구 투여용으로 의도된다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 비경구적으로, 즉, 정맥내, 피하, 또는 근육내에 투여되거나, 또는 이는 연속적 또는 박동성(pulsatile) 주입으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 경구, 피하, 정맥내, 뇌내, 비강내, 경피, 복강내, 근육내, 폐내, 질내, 직장, 안구내, 또는 임의의 다른 수용가능한 방식을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 방식의 투여를 위해 제형화될 수 있다.
비경구 투여용 조성물은 (예를 들어, 이에 용해된) 약제학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체와 함께, 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 포함한다. 다양한 수성 담체는, 예컨대 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 세포는, 또한 안정성 및 저장을 지속시키는 조성물, 예컨대 메티오닌 및 수크로스와 함께 제형화될 수 있다. 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는, 또한 부상의 부위(들)로 전달 또는 표적화하기 위한 리포좀 제제로 제형화될 수도 있다. 리포좀 제제는 전반적으로 예를 들어, 미국 특허 제4,837,028호, 제4,501,728호, 및 제4,975,282호에 기재되어 있다. 조성물은 종래의 잘 알려진 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 생성되는 수성 용액은 사용을 위해 포장되거나, 무균 조건 하에서 여과되고 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 이전에 멸균된 수성 용액과 합쳐진다. 조성물은 대략적인 생리적 조건으로 요구되는 경우, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 등을 함유할 수 있다. 조성물은 또한 방부제, 동위원소화제(isotonifier), 비-이온성 계면활성제 또는 세제, 항산화제 및/또는 다른 여러가지 첨가제를 함유할 수 있다.
이들 제형 중의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 농도는 즉, 약 0.5 중량% 미만, 통상 적어도 약 1 중량% 또는 그 이상 내지 약 15 또는 20 중량%만큼 많이 넓게 변화될 수 있고, 선택된 특정 투여 모드에 따라 주로 유체 부피, 점성 등에 의해 선택될 것이다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 21판, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (2005)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 벡터, 또는 세포를 포함하는 조성물은, 예방적인 및/또는 치료적인 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적인 응용에서, 조성물은 상기에 기재한 바와 같이 질병을 이미 겪고 있는 대상체에게, 질병 및 이의 합병증을 치유, 경감 또는 부분적으로 그 진행을 막는데 충분한 양으로 투여된다. 이것들을 달성하기에 적합한 양은 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"으로 정의된다. 이러한 목적을 위해 효과적인 양은 질병 또는 부상의 중증도, 뿐만 아니라 대상체의 체중 및 전반적인 상태에 따라 달라질 것이라는 것을 당업계의 숙련자들은 이해할 것이다.
예방적 적용에서, 본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 함유하는 조성물은 대상체 자체의 응고 용량을 강화시키기 위해 질병 상태 또는 부상에 취약하거나 이의 위험이 있는 대상체에 투여된다. 이러한 양은 "예방적으로 효과적인 투여량(prophylactically effective dose)"으로 정의된다. 예방적 적용에서, 정확한 양은 일단 다시 대상체의 건강 상태 및 체중에 따라 달라진다.
조성물의 단일 또는 다수의 투여는 치료 의사가 선택하는 투여량 수준 및 패턴으로 실시될 수 있다. 매일 유지 수준을 요하는 보행하는 대상체에 대해서는, FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 예를 들어, 휴대용 펌프 시스템을 사용하여 연속 주입에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포는 또한 지연된 또는 연장된 방출 제형으로 제형화될 수 있다. 지연된 또는 연장된 방출 조성물을 제형화하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 이는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 함유하는 고체 소수성 입자의 반-투과성 매트릭스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 FIX 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 국소적 전달, 예를 들어, 국소 적용은 예를 들어, (혈관이식편 또는 스텐트에 혼입된) 스프레이, 관류, 이중 풍선 카테터, 스텐트, 풍선 카테터를 코팅하는데 사용된 하이드로겔, 또는 다른 잘 확립된 방법에 의해 실시될 수 있다. 어떠한 사건에서도, 약학적 조성물은 대상체를 효과적으로 치료하기에 충분한 FIX 단백질의 양을 제공해야 한다.
일부 구현예에서, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, FIX 단백질)는 AAV 벡터를 사용하여 대상체에 전달된다. 따라서, 본 발명은 또한 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 바이러스 입자(즉, 비리온)를 제공하는데, 여기에서 바이러스 입자는 벡터 게놈, 선택적으로 AAV 벡터 게놈을 패키징한다(즉, 캡슐화한다).
특정 구현예에서, 비리온은 예를 들어, 세포에 전달하기 위한 이종의 관심 대상 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터이다. 따라서, 본 발명은 시험관 내에서, 생체외에서, 및 생체내에서 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달하는데 유용하다. 대표적인 구현예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드를 동물(예를 들어, 포유류) 세포에, 예를 들어, 본 발명의 간-특이적인 프로모터를 사용하는 경우 간 세포에 전달하거나 또는 이송시키는데 유리하게 이용될 수 있다.
임의의 이종 뉴클레오티드 서열(들)은 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 전달될 수 있다. 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 치료적인(예를 들어, 의학적 또는 수의학적 용도) 및/또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩티드를 포함한다.
치료적인 폴리펩티드는 낭포성 섬유증 막 조절 단백질(cystic fibrosis transmembrane regulator protein, CFTR), 디스트로핀(디스트로핀 미니-유전자 또는 마이크로-유전자의 단백질 산물 포함[예를 들어, Vincent 등, (1993) Nature Genetics 5:130; 미국 특허 공보 제2003017131호; Wang 등, (2000) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 97:13714-9 [미니-디스트로핀]; Harper 등, (2002) Nature Med . 8:253-61 [마이크로-디스트로핀]을 참고하라]; 미니-아그린, 라미닌-α2, 사르코글리칸 (α, β, γ 또는 δ), 푸쿠틴(Fukutin)-관련 단백질, 미오스타틴 프로-펩티드, 폴리스타틴(follistatin), 우성 음성 미오스타틴, 혈관생성 인자(예를 들어, VEGF, 안지오포이에틴-1 또는 2), 항-어팝토시스 인자(예를 들어, 헴-옥시게나제-1, TGF-β, 사전-어팝토시스 신호의 저해제, 예컨대 카스파제, 프로테아제, 키나제, 사멸 수용체[예를 들어, CD-095], 시토크롬 C 방출의 조절자, 미토콘드리아 기공 개방 및 팽창의 저해제); 액티빈 타입 II 수용성 수용체, 항-염증성 폴리펩티드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이, 사르코스판(sarcospan), 우트로핀(utrophin), 미니-우트로핀, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 절편, 세포 주기 조절자, Rho 키나제 조절자, 예컨대 변형된 박테리아 C3 엑소효소인 세트린(Cethrin)[BioAxone Therapeutics, Inc., Saint-Lauren, Quebec, Canada로부터 이용가능함], BCL-xL, BCL2, XIAP, FLICEc-s, 우성-음성 카스파제-8, 우성 음성 카스파제-9, SPI-6(예를 들어, 미국 특허 출원 제20070026076호 참고), 전사 인자 PGC-α1, Pinch 유전자, ILK 유전자 및 티모신 β4 유전자), 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라제, 티로신 히드록실라제, 세포내 및/또는 세포외 수퍼록사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 렙틴, LDL 수용체, 네프릴리신(neprilysin), 지질단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, α1-항트립신, 메틸 시토신 결합 단백질 2, 아데노신 데아미나제, 히포잔틴(hypoxanthine) 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 스핑고미엘리나제(sphingomyelinase), 리소좀 헥소사미니다제 A, 분지-쇄 케토산 데드로게나제, RP65 단백질, 사이토카인(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-1 내지 -14, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림포톡신 등), 펩티드 성장 인자, 신경영양 인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, IGF-1 및 IGF-2를 포함하는 인슐린-유사 성장 인자, GLP-1, 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자-3 및 -4, 뇌-유래의 신경영양 인자, 교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자-α 및 -β 등), 골 형태 발생 단백질(RANKL 및 VEGF 포함), 리소좀 단백질, 글루타메이트 수용체, 림포카인, 수용성 CD4, Fc 수용체, T 세포 수용체, ApoE, ApoC, 단백질 포스파타제의 저해제 1(I-1), 포스폴람반(phospholamban), serca2a, 리소좀산 α-글루코시다제, α-갈락토시다제 A, Barkct, β2-아드레날린성 수용체, β2-아드레날린성 수용체 키나제(BARK), 포스포이노시티드-3 키나제(PI3 키나제), 칼사르신, 수용체(예를 들어, 종양 괴사 성장 인자-α 수용성 수용체), 항-염증성 인자, 예컨대 IRAP, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, ECF-SOD, 칼리크레인(kallikrein), 티모신(thymosin)-β4, 저산소증-유도성 전사 인자[HIF], 혈관생성 인자, S100A1, 파르발부민(parvalbumin), 아데닐릴 사이클라제 타입 6, G-단백질 결합된 수용체 키나제 타입 2 녹다운에 영향을 미치는 분자, 예컨대 절단된 항시적 활성 βARKct; 포스폴라반 저해성 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스폴라반 S16E, 단일클론 항체(단쇄 단일클론 항체 포함) 또는 자살 유전자 산물(예를 들어, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 및 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α), 및 이것이 필요한 대상체에서 치료 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드를 암호화하는 이종 뉴클레오티드 서열은 리포터 폴리펩티드를 암호화하는 것들(예를 들어, 효소)을 포함한다. 당업계에 알려진 리포터 폴리펩티드는, 형광 단백질(예를 들어, EGFP, GFP, RFP, BFP, YFP, 또는 dsRED2), 탐지가능한 산물, 예컨대 루시퍼라제[예를 들어, 가우시아(Gaussia ), 바다 팬지(Renilla ), 또는 반딧불이( Photinus ) 유래], β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 알칼라인 포스파타제, 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 생성하는 효소, 또는 직접 탐지될 수 있는 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 실제로, 임의의 단백질은 예를 들어 단백질에 특이적인 항체를 사용함으로써 직접 탐지될 수 있다. 진핵 세포의 양성 또는 음성 선별에 적합한 추가적인 마커 (및 관련 항생제)는 문헌[Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning, 3판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., and Ausubel 등 (1992), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons](주기적 업데이트 포함)에 기재되어 있다.
대안적으로, 이종 핵산은 기능성 RNA, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제5,877,022호에 기재됨), 스플라이세오좀(spliceosome)-매개 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA[Puttaraju 등, (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 제6,013,487호; 미국 특허 제6,083,702호를 참고하라], 유전자 사일런싱(gene silencing)을 매개하는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 간섭 RNA(RNAi)[Sharp 등, (2000) Science 287:2431 참고], 마이크로RNA, 또는 다른 비-번역된 "기능성" RNA, 예컨대 "가이드" RNA[Gorman 등, (1998) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 95:4929; 미국 특허 제5,869,248호(Yuan 등에 양도됨)] 등을 암호화할 수 있다. 예시적인 비번역 RNA는 (예를 들어, 종양을 치료하고, 및/또는 화학치료제에 의한 손상을 방지하기 위해 심장에 투여하기 위한) 다제약물 내성(MDR) 유전자 산물에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, 미오스타틴(뒤센 또는 벡커 근이영양증)에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, (종양을 치료하기 위한) VEGF, 또는 본원에 구체적으로 기재된 종양 면역원을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 면역원에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, 돌연변이된 디스트로핀(뒤센 또는 벡커 근이영양증)을 표적화하는 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, (B형 간염 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한) 간염 B 표면 항원 유전자에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, (HIV를 예방 및/또는 치료하기 위한) HIV tat 및/또는 rev 유전자에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA, 및/또는 (병원체로부터 대상체를 보호하기 위한) 병원체로부터의 임의의 다른 면역원 또는 (질병을 예방 또는 치료하기 위한) 결함있는 유전자 산물에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA를 포함한다. 상기 기재된 표적 또는 임의의 다른 표적에 대한 RNAi 또는 안티센스 RNA는 또한 연구 시약으로 이용될 수 있다.
당업계에 알려진 바와 같이, 안티-센스 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 및 저해성 RNA(예를 들어, 마이크로RNA 및 RNAi, 예컨대 siRNA 또는 shRNA) 서열은, 디스트로핀 유전자의 결핍으로부터 발생하는 근이영양증을 갖는 환자에서 "엑손 스키핑(exon skipping)"을 유도하는데 사용될 수 있다. 따라서, 이종 핵산은 적절한 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산 또는 저해성 RNA를 암호화할 수 있다. 당업계의 숙련자는 엑손 스키핑에 대한 특정 접근법이 디스트로핀 유전자의 근본적인 결핍의 특성에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이며, 다수의 이러한 전략이 당업계에 알려져 있다. 예시적인 안티센스 핵산 및 저해성 RNA 서열은 디스트로핀 엑손들(예를 들어, 엑손 19 또는 23) 중 하나 이상의 상류 분기점 및/또는 하류 공여체 스플라이스 부위 및/또는 내부 스플라이싱 인핸서 서열을 표적화한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 이종 핵산은 디스트로핀 유전자의 엑손 19 또는 23의 상류 분기점 및 하류 스플라이싱 공여체 부위로 지향하는 안티센스 핵산 또는 저해성 RNA를 암호화한다. 이러한 서열은 변형된 U7 snRNA 및 안티센스 핵산 또는 저해성 RNA를 전달하는 AAV 벡터로 혼입될 수 있다[예를 들어, Goyenvalle 등, (2004) Science 306:1796-1799를 참고하라]. 또 다른 전략으로서, 변형된 U1 snRNA는 디스트로핀 엑손(예를 들어, 엑손 19 또는 23)의 상류 및 하류 스플라이싱 부위에 보완적인 siRNA, 마이크로RNA 또는 안티센스 RNA와 함께, AAV 벡터로 혼입될 수 있다(예를 들어, Denti 등, (2006) Proc . Nat. Acad. Sci .USA 103:3758-3763을 참고하라). 추가로, 안티센스 핵산 및 저해성 RNA는 엑손 19, 43, 45 또는 53 내부의 스플라이싱 인핸서 서열을 표적화할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,653,467호; 미국 특허 제6,727,355호; 및 미국 특허 제6,653,466호를 참고하라).
리보자임은 부위-특이적인 경향으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 특이적인 촉매 도메인을 갖는다(Kim 등, (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:8788; Gerlach 등, (1987) Nature 328:802; Forster and Symons, (1987) Cell 49:211). 예를 들어, 다수의 리보자임은 올리고뉴클레오티드 기질 내의 몇몇 포스포에스테르 중 단 하나만을 흔히 절단하는 고도의 특이성으로 포스포에스테르 전달 반응을 가속화시킨다[Michel and Westhof, (1990) J. Mol . Biol . 216:585; Reinhold-Hurek and Shub, (1992) Nature 357:173]. 이러한 특이성은 화학 반응 이전에 특이적인 염기-쌍형성 상호작용을 통해, 기질이 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 결합하는 요건에 기인한다.
리보자임 촉매화는 주로 핵산과 관련된 서열-특이적인 절단/라이게이션 반응의 일부로서 관찰되었다(Joyce, (1989) Nature 338:217). 예를 들어, 미국 특허 제5,354,855호는 특정 리보자임이 알려진 리보뉴클레아제의 경우보다 서열 특이성이 더 크고 DNA 제한 효소의 서열 특이성에 접근하는 엔도뉴클레아제로서 작용할 수 있다고 보고한다. 따라서, 핵산 발현의 서열-특이적인 리보자임-매개 저해는 특히 치료적인 적용에 적합할 수 있다[Scanlon 등, (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10591; Sarver 등, (1990) Science 247:1222; Sioud 등, (1992) J. Mol . Biol . 223:831].
마이크로RNA(mir)는 mRNA의 안정성을 조절함으로써, 다수의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 자연적인 세포성 RNA 분자이다. 특정 마이크로RNA의 과다-발현 또는 감소는 기능 이상을 치료하는데 사용될 수 있으며, 다수의 질병 상태 및 질병의 동물 모델에서 효과적인 것으로 나타났다[예를 들어, Couzin, (2008) Science 319:1782-4를 참고하라]. 키메라 AAV는 유전적 및 후천적인 질병의 치료를 위해 마이크로RNA를 세포, 조직 및 대상체에 전달하거나, 또는 기능을 강화시키고, 특정 조직의 성장을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208은 심장 및 골격근 질병을 치료하는데 사용될 수 있다[예를 들어, Chen 등, (2006) Genet. 38:228-33; van Rooij 등, (2008) Trends Genet. 24:159-66을 참고하라]. 마이크로RNA는 또한 유전자 전달 이후 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다 (Brown 등, (2007) Blood 110:4144-52).
본원에 사용된 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)"("안티센스 RNA" 포함)는, 특정된 DNA 또는 RNA 서열에 보완적이어서, 이에 특이적으로 혼성화하는 핵산을 지칭한다. 동일한 것을 암호화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,023,243호(Tullis에 양도됨); 미국 특허 제5,149,797호 (Pederson 등에 양도됨)를 참고하라.
당업계의 숙련자는 서열 유사성의 정도가 안티센스 뉴클레오티드 서열이 이의 표적(상기에서 정의된 바와 같음)에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 이상, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 충분히 보완적일 필요가 없고, 단백질 산물의 제조를 (예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시킨다는 것을 이해할 것이다.
혼성화의 특이성을 결정하기 위하여, 이러한 올리고뉴클레오티드의 표적 서열로의 혼성화는 감소된 엄격성, 배지 엄격성 또는 심지어 엄격한 환경의 조건하에서 수행될 수 있다. 감소된, 배지 및 엄격한 혼성화 조건을 달성하기 위한 적합한 조건이 본원에 기재된다.
대안적으로 기재하면, 특정 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 보완체와 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖고, 단백질 산물(상기에서 정의된 바와 같음)의 제조를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 안티센스 서열은 표적 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 미스매치를 포함한다.
핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하는 방법은 본원의 다른 부분에 더욱 상세히 기재되어 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는, 이것이 의도된 표적에 특이적으로 혼성화하여, 단백질 산물(상기에서 정의된 바와 같음)의 제조를 감소시키는 이상 중요하지 않고, 통상의 과정에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 8, 10 또는 12 또는 15 개의 뉴클레오티드 길이, 및/또는 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100 또는 150 개 미만의 뉴클레오티드 길이이다.
RNA 간섭(RNAi)은 단백질 산물(예를 들어, shRNA 또는 siRNA)의 제조를 감소시키는 또 다른 유용한 접근법이다. RNAi는 전사후 유전자 사일런싱의 메커니즘으로, 여기에서 관심 대상의 표적 서열에 해당하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)가 세포 또는 생체에 도입된 결과, 해당하는 mRNA의 분해를 초래한다. RNAi가 유전자 사일런싱을 달성하는 메커니즘은 문헌[Sharp 등, (2001) Genes Dev 15: 485-490; 및 Hammond 등, (2001) Nature Rev. Gen. 2:110-119)]에서 검토되었다. RNAi 효과는 유전자 발현이 얻어지기 전에 다수의 세포 분열 동안 지속되었다. 따라서, RNAi는 RNA 수준에서 표적화된 녹아웃 또는 "녹다운(knockdown)"을 제조하는 강력한 방법이다. RNAi는 인간 배아 신장 및 HeLa 세포를 포함하는 인간 세포에서 성공적으로 입증되었다[예를 들어, Elbashir 등, Nature (2001) 411:494-8을 참고하라].
포유류 세포에서 RNAi를 사용하려는 초기의 시도는 dsRNA 분자에 대한 반응에서 PKR와 관련된 항바이러스 방어 메커니즘을 발생시킨다[예를 들어, Gil 등, (2000) Apoptosis 5:107을 참고하라]. 이후, 약 21개 뉴클레오티드의 짧은 합성된 dsRNA["짧은 간섭 RNAs"(siRNA)라고 알려짐]가 항바이러스 반응을 유발하지 않고 포유류 세포에서 사일런싱을 매개할 수 있다는 것이 입증되었다[예를 들어, Elbashir 등, Nature (2001) 411:494-8; Caplen 등, (2001) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 98:9742를 참고하라].
RNAi 분자(siRNA 분자 포함)는 짧은 헤어핀 RNA일 수 있는데[shRNA; Paddison 등, (2002), Proc . Nat. Acad . Sci . USA 99:1443-1448을 참고하라], 이는 세포에서 RNase III 유사 효소 다이서(Dicer)의 작용에 의해 20-25 량체 siRNA 분자로 가공되는 것으로 여겨진다. shRNA는 일반적으로 2개의 반전된 반복 서열이 짧은 스패이서 서열에 의해 분리되어 루프를 이루는 스템-루프 구조를 갖는다. 3 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이의 범위인 루프를 갖는 shRNA에 대한 보고가 있었다. 루프의 서열은 일반적으로 중요하지 않다. 예시적인 루프 서열은 이하의 모티프: AUG, CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU, CCACACC 및 UUCAAGAGA를 포함한다.
RNAi는 추가로 어느 한 쪽에 2개의 루프 부위를 가져 센스와 안티센스 부위 사이의 dsRNA 형성시 "덤벨" 형태의 구조를 형성하는, 센스 및 안티센스 부위를 포함하는 원형 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 시험관 내에서 또는 생체내에 서 가공되어, dsRNA 일부, 예를 들어, siRNA를 방출시킬 수 있다.
국제 특허 공보 WO 01/77350은 진핵 세포에서 이종 서열의 센스 및 안티센스 전사체 모두를 생성하기 위해, 양-방향 전사용 벡터를 기재하고 있다. 이러한 기술은 본 발명에 의한 사용을 위한 RNAi를 제조하는데 이용될 수 있다.
문헌[Shinagawa 등, (2003) Genes Dev . 17:1340]은 CMV 프로모터(pol II 프로모터)로부터 긴 dsRNA를 발현시키는 방법에 대해 보고하였는데, 이 방법은 또한 조직 특이적인 pol II 프로모터에도 적용될 수 있다. 마찬가지로, 문헌[Xia 등, (2002) Nature Biotech. 20:1006]의 접근법은 폴리(A) 꼬리를 회피하며, 조직-특이적인 프로모터와 연결하여 사용될 수 있다.
RNAi의 생성 방법은 화학적 합성, 시험관 내 전사, 다이서에 의한 긴 dsRNA의 (시험관 내 또는 생체내) 소화, 전달 벡터로부터의 생체내 발현, 및 PCR-유래의 RNAi 발현 카세트로부터의 생체내 발현을 포함한다[예를 들어, Ambion, Inc., Austin TX로부터의 TechNotes 10(3) "5 Ways to Produce siRNAs"를 참고하라; www.ambion.com에서 이용가능함].
siRNA 분자를 고안하기 위한 가이드라인은 이용 가능하다(예를 들어, Ambion, Inc., Austin TX로부터의 문헌을 참고하라; www.ambion.com에서 이용 가능함). 특정 구현예에서, siRNA 서열은 약 30-50% G/C 함량을 갖는다. 추가로, 4개 초과의 T 또는 A 잔기의 긴 스트레치는 일반적으로 RNA 중합효소 III를 이용하여 RNA를 전사하는 경우 회피된다. 온라인 siRNA 표적 찾기는 예를 들어, Ambion, Inc.(www.ambion.com)로부터, Whitehead Institute of Biomedical Research(www.jura.wi.mit.edu)를 통해, 또는 Dharmacon Research, Inc.(www.dharmacon.com)로부터 이용가능하다.
RNAi 분자의 안티센스 부위는 표적 서열에 완전히 보완적일 수 있으나, 이것이 표적 서열(상기에 정의된 바와 같음)에 특이적으로 혼성화하여, 단백질 산물의 제조를 (예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시키는 이상은 필요가 없다. 일부 구현예에서, 이러한 올리고뉴클레오티의 표적 서열로의 혼성화는 상기에 정의된 바와 같이 감소된 엄격성, 배지 엄격성 또는 심지어 엄격한 환경의 조건 하에서 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, RNAi의 안티센스 부위는 표적 서열의 보완체에 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖고, 단백질 산물의 제조를 (예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상) 감소시킨다. 일부 구현예에서, 안티센스 부위는 표적 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 미스매치를 포함한다. 미스매치는 일반적으로 중앙 부분보다는 dsRNA의 말단에서 더 양호하게 용인된다.
특정 구현예에서, RNAi는 2개의 별개의 센스 및 안티센스 분자 사이의 분자간 복합체화에 의해 형성된다. RNAi는 2개의 별도의 가닥들 사이의 분자간 염기쌍 형성에 의해 형성된 ds 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, RNAi는 통상적으로 반전된 반복부로서, 센스 및 안티센스 부위를 모두 포함하는 단일 핵산 분자 내의 분자내 염기쌍 형성에 의해 형성된 ds 부위(예를 들어, shRNA 또는 다른 스템 루프 구조, 또는 원형 RNAi 분자)를 포함한다. RNAi는 추가로 센스와 안티센스 부위의 사이에 스패이서 부위를 포함할 수 있다.
일반적으로, RNAi 분자는 매우 선택적이다. 원하는 경우, 당업계의 숙련자는 다른 알려진 서열과 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 RNAi 서열을 식별하기 위해 관련 데이터베이스를 조사함으로써, 예를 들어, BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST에서 이용 가능함)를 사용함으로써, 표적이 아닌 핵산의 발현을 간섭하는 경향이 있는 후보 RNAi를 용이하게 제거할 수 있다.
RNAi의 제조를 위한 키트는 예를 들어, New England Biolabs, Inc.사 및 Ambion, Inc.로부터 상업적으로 이용 가능하다.
재조합 바이러스 벡터는 또한 숙주 염색체 상의 좌위와 동일성을 공유하고 이에 재조합하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 숙주 세포에서 유전적 결함을 고치는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 예를 들어, 백신용으로 면역원성 폴리펩티드를 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다. 이종 핵산은 당업계에 알려진 관심 대상의 임의의 면역원을 암호화할 수 있는데, 이는 인간 면역결핍 바이러스 유래의 면역원, 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 면역원은 바이러스 캡시드 내에 존재하거나(예를 들어, 이에 혼입됨), 또는 (예를 들어, 공유적 변형에 의해) 바이러스 캡시드에 묶일 수 있다.
파르보바이러스의 백신으로의 사용은 당업계에 알려져 있다[예를 들어, Miyamura 등, (1994) Proc . Nat. Acad . Sci . USA 91:8507; 미국 특허 제5,916,563호(Young 등에 양도됨), 제5,905,040호(Mazzara 등에 양도됨), 미국 특허 제5,882,652호, 미국 특허 제5,863,541호(Samulski 등에 양도됨)를 참고하라; 이의 기재 내용이 전체로서 본원에 참고로 포함된다]. 항원은 바이러스 캡시드에 제시될 수 있다. 대안적으로, 항원은 재조합 벡터 게놈에 도입된 이종 핵산으로부터 발현될 수 있다.
면역원성 폴리펩티드, 또는 면역원은, 대상체를 질병에 대해 보호하기에 적합한 임의의 폴리펩티드일 수 있는데, 이는 미생물, 박테리아, 원생동물, 기생충, 진균 및 바이러스 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 면역원은 오르토믹소바이러스 면역원[예를 들어, 인플루엔자 바이러스 면역원, 예컨대 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질 유전자, 또는 말 인플루엔자 바이러스 면역원], 또는 렌티바이러스 면역원[예를 들어, 말 감염성 빈혈 바이러스 면역원, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 면역원, 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 면역원, 예컨대 HIV 또는 SIV 엔벨로프 GP160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질, 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물]일 수 있다. 면역원은 또한 아레나바이러스 면역원(예를 들어, 라사열(Lassa fever) 바이러스 면역원, 예컨대 라사열 바이러스 핵캡시드 단백질 유전자 및 라사열 엔벨로프 당단백질 유전자), 수두 바이러스 면역원(예를 들어, 우두, 예컨대 우두 L1 또는 L8 유전자), 플레비바이러스 면역원(예를 들어, 황열 바이러스 면역원 또는 일본 뇌염 바이러스 면역원), 필로바이러스 면역원(예를 들어, 에볼라 바이러스 면역원, 또는 마르부르크 바이러스 면역원, 예컨대 NP 및 GP 유전자), 분야바이러스 면역원(예를 들어, RVFV, CCHF, 및 SFS 바이러스), 또는 코로나바이러스 면역원(예를 들어, 감염성 인간 코로나바이러스 면역원, 예컨대 인간 코로나바이러스 엔벨로프 당단백질 유전자, 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스 면역원, 또는 조류 감염성 기관지염 바이러스 면역원, 또는 중증 급성 호흡 증후군(SARS) 면역원, 예컨대 S[S1 또는 S2], M, E, 또는 N 단백질 또는 이의 면역원성 절편)일 수 있다. 면역원은 추가로 소아마비 면역원, 헤르페스 면역원(예를 들어, CMV, EBV, HSV 면역원) 유행성 이하선염 면역원, 홍역 면역원, 풍진 면역원, 디프테리아 독소 또는 다른 디프테리아 면역원, 백일해 항원, 간염(예를 들어, A형 간염, B형 간염, 또는 C형 간염) 면역원, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 백신 면역원일 수 있다.
대안적으로, 면역원은 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 선택적으로, 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면 상에 발현된다. 예시적인 암 및 종양 세포 항원은 문헌[S.A. Rosenberg, (1999) Immunity 10:281)]에 기재되어 있다. 예시적인 암 및 종양 항원은 BRCA1 유전자 산물, BRCA2 유전자 산물, gp100, 티로시나제, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌(catenin), MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, PRAME, p15, MART-1[Coulie 등, (1991) J. Exp . Med. 180:35]을 포함하는 흑색종 종양 항원[Kawakami 등, (1994) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 91:3515; Kawakami 등, (1994) J. Exp . Med., 180:347; Kawakami 등, (1994) Cancer Res. 54:3124], gp100[Wick 등, (1988) J. Cutan . Pathol. 4:201] 및 MAGE 항원(MAGE-1, MAGE-2 및 MAGE-3)[Van der Bruggen 등, (1991) Science, 254:1643], CEA, TRP-1; TRP-2; P-15 및 티로시나제[Brichard 등, (1993) J. Exp . Med. 178:489]; HER-2/neu 유전자 산물(미국 특허 제4,968,603호); CA 125; HE4; LK26; FB5(엔도시알린, endosialin); TAG 72; AFP; CA19-9; NSE; DU-PAN-2; CA50; Span-1; CA72-4; HCG; STN(시알릴 Tn 항원); c-erbB-2 단백질; PSA; L-CanAg; 에스트로겐 수용체; 유지방 글로불린; p53 종양 억제자 단백질[Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623]; 뮤신 항원(국제 특허 공보 WO 90/05142); 텔로머라제; 핵 매트릭스 단백질; 전립선산 포스파타제; 파필로마 바이러스 항원; 및 이하의 흑색종, 선암종, 흉선종, 육종, 폐암, 간암, 결장직장암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 신장암, 위암, 식도암, 두경부암 및 다른 것들과 관련된 항원[예를 들어, Rosenberg, (1996) Annu . Rev. Med. 47:481-91를 참고하라]을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 이종 뉴클레오티드 서열은 세포에서 바람직하게 생성된 임의의 폴리펩티드를 시험관 내에서, 생체외에서, 또는 생체내에서 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 배양된 세포 및 이로부터 분리된 발현 단백질 산물로 도입될 수 있다.
당업계의 숙련자는 관심 대상의 이종 폴리뉴클레오티드(들)이 적절한 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 이종 핵산은 발현 조절 요소, 예컨대 전사/번역 조절 신호, 복제 기원, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 프로모터, 인핸서 등과 작동가능하게 연결될 수 있다.
당업계의 숙련자는 추가로 원하는 수준 및 조직-특이적인 발현에 따라 다양한 프로모터/인핸서 요소가 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 원하는 발현 패턴에 따라서 구성성 또는 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 고유성 또는 외인성일 수 있고, 자연적 또는 합성된 서열일 수 있다. 외인성인 경우, 전사 개시 부위가 도입되는 야생형 숙주에서는 전사 개시 부위가 발견되지 않은 것으로 의도된다.
프로모터/인핸서 요소는 치료될 표적 세포 또는 대상체에 고유한 것, 및/또는 이종 핵산 서열에 고유한 것일 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 이것이 관심 대상의 표적 세포(들)에서 기능을 발휘하도록 선택된 것이다. 대표적인 구현예에서, 프로모터/인핸서 요소는 포유류 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 구성성 또는 유도성일 수 있다.
유도성 발현 조절 요소는 일반적으로 이종 핵산 서열(들)의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 적용에 사용된다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직-특이적인 또는 조직-선호의 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 근육 특이적인 또는 선호의(심근, 골격근 및/또는 민무늬근 포함), 신경 조직 특이적인 또는 선호의(뇌-특이적인 경우 포함), 눈(망막-특이적인 및 각막-특이적인 경우 포함), 간 특이적인 또는 선호의, 골수 특이적인 또는 선호의, 췌장 특이적인 또는 선호의, 비장 특이적인 또는 선호의, 및 폐 특이적인 또는 선호의 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 다른 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르몬-유도성 및 금속-유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손(ecdysone)-유도성 프로모터, 라파마이신(rapamycin)-유도성 프로모터, 및 메탈로티오네인(metallothionine) 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
표적 세포에서 이종 핵산 서열(들)이 전사된 후 번역되는 구현예에서, 특이적인 개시 신호는 일반적으로 삽입된 단백질 암호화 서열의 효과적인 번역을 위해 이용된다. 이들 외인성 번역 조절 서열은, ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함할 수 있는데, 자연적 및 합성된 모두의 다양한 기원의 것일 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명의 바이러스 벡터의 제조 방법을 제공한다. 대표적인 구현예에서, 본 발명은 재조합 바이러스 벡터의 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은 세포에, (a) (i) 관심 대상의 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) AAV 템플레이트를 바이러스 입자로 캡슐화하기에 충분한 패키징 신호 서열(예를 들어, 하나 이상의(예를 들어, 2개) 말단 반복부, 예컨대 AAV 말단 반복부)을 포함하는 템플레이트, 및 (b) 템플레이트를 복제 및 바이러스 입자로 캡슐화하기에 충분한 AAV 서열(예를 들어, AAV rep 및 AAV cap 서열)을 시험관 내에서 제공하는 단계를 포함한다. 템플레이트 및 AAV 복제 및 캡시드 서열은, 캡시드 내에 패키징되는 템플레이트를 포함하는 재조합 바이러스 입자가 세포에서 제조되는 조건 하에 제공된다. 상기 방법은 추가로 세포로부터 바이러스 입자를 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 배지로부터 및/또는 세포를 용해함으로써 수집될 수 있다.
하나의 예시적인 구현에에서, 본 발명은 AAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 제조 방법을 제공하는데, 상기 방법은 세포에 시험관 내에서 AAV 캡시드를 암호화하는 핵산, AAV rep 암호화 서열, 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터 게놈, 및 생산적인 AAV 감염을 생성하기 위한 헬퍼 기능을 제공하는 단계; 및 AAV 캡시드를 포함하는 AAV 입자의 조립을 허용하여 AAV 벡터 게놈을 캡슐화하는 단계를 포함한다.
세포는 통상적으로 AAV 바이러스 복제를 허용하는 세포이다. 당업계에 알려진 어느 적합한 세포, 예컨대 포유류 세포가 이용될 수 있다. 또한, 복제-결핍성 헬퍼 바이러스로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-보완(trans-complementing) 패키징 세포주, 예를 들어, 293 세포 또는 다른 E1a 트랜스-보완 세포가 적합하다.
AAV 복제 및 캡시드 서열은 당업계에 알려진 어느 방법에 의해 제공될 수 있다. 최근의 프로토콜은 통상적으로 단일 플라스미드 상에서 AAV rep/cap 유전자를 발현시킨다. AAV 복제 및 패키징 서열은 함께 제공될 필요가 없으나, 그렇게 하는 것이 편리할 수 있다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 혼성화 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터(예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 부위로 삽입됨)에 의해 제공될 수 있다. EBV 벡터는 또한 AAV cap 및 rep 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 하나의 장점은 EBV 벡터가 에피좀이고, 연속적인 세포 분열을 통해 높은 카피수를 여전히 유지할 것이라는(즉, EBV 기반 핵 에피좀으로 지칭된 염색체-외부 요소로서 세포에 안정적으로 통합된다)는 점이다.
추가적인 대안으로서, rep/cap 서열은 세포 내부에 안정적으로 포함된다(에피좀이거나 또는 통합될 수 있다).
통상적으로, AAV rep/cap 서열은 AAV 패키징 서열(예를 들어, AAV ITR)에 측접되지 않아서, 이들 서열의 구제 및/또는 패키징을 방지할 것이다.
템플레이트(예를 들어, rAAV 벡터 게놈)는 당업계에 알려진 어느 방법을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 템플레이트는 비-바이러스(예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 특정 구현예에서, 템플레이트는 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 결실된 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 부위에 삽입됨)에 의해 공급된다. 또 다른 예로서, 문헌[Palombo 등, (1998) J. Virol . 72:5025]은, AAV ITR에 측접하는 리포터 유전자를 갖는 배큘로바이러스 벡터를 기재한다. EBV 벡터는 또한 rep/cap 유전자에 대해 상기 기재된 바와 같이 템플레이트를 전달하는데 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 템플레이트는 복제성 rAAV 바이러스에 의해 공급된다. 또 다른 구현예에서, AAV 프로바이러스는 세포의 염색체로 안정적으로 통합된다.
최대 바이러스 역가를 얻기 위해, 생산적인 AAV 감염에 필수적인 헬퍼 바이러스 기능(예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)이 일반적으로 세포에 제공된다. AAV 복제에 필요한 헬퍼 바이러스 서열이 당업계에 알려져 있다. 통상적으로, 이들 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공된다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열은 문헌[Ferrari 등, (1997) Nature Med . 3:1295, 및 미국 특허 제6,040,183호 및 제6,093,570호]에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 효과적인 AAV 제조에 요구되는 모든 헬퍼 유전자를 갖는 비-감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서, 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다.
추가로, 헬퍼 바이러스 기능은 염색체 내에 통합되거나 또는 안정적인 염색체외 요소로서 유지된 헬퍼 유전자를 갖는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온으로 패키징될 수 없고, 예를 들어, AAV ITR에 의해 측접되지 않는다.
당업계의 숙련자는 AAV 복제 및 캡시드 서열 및 헬퍼 바이러스 서열 (예를 들어, 아데노바이러스 서열)을 단일 헬퍼 작제물 상에 제공하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 헬퍼 작제물은 비-바이러스 또는 바이러스 작제물일 수 있지만, 선택적으로 AAV rep/cap 유전자를 포함하는 혼성화 아데노바이러스 또는 혼성화 헤르페스바이러스이다.
하나의 특정 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이러한 벡터는 추가로 rAAV 템플레이트를 포함한다. AAV rep/cap 서열 및/또는 rAAV 템플레이트는 아데노바이러스의 결실된 부위(예를 들어, E1a 또는 E3 부위)로 삽입될 수 있다.
추가적인 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. rAAV 템플레이트는 플라스미드 템플레이트로서 제공된다.
또 다른 예시적인 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, rAAV 템플레이트는 프로바이러스로서 세포에 통합된다. 대안적으로, rAAV 템플레이트는 염색체외 요소로서 세포 내에 유지되는 EBV 벡터로 제공된다[예를 들어, "EBV 기반의 핵 에피좀"으로서, 문헌[Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67를 참고하라].
추가적인 예시 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열 은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. rAAV 템플레이트는 별개의 복제성 바이러스 벡터로서 제공된다. 예를 들어, rAAV 템플레이트는 rAAV 입자 또는 제2 재조합 아데노바이러스 입자로서 제공될 수 있다.
상기 방법에 의하면, 혼성화 아데노바이러스 벡터는 통상적으로 아데노바이러스 복제 및 패키징을 위해 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스 서열(즉, 아데노바이러스 말단 반복부 및 PAC 서열)을 포함한다. AAV rep/cap 서열 및 (존재하는 경우) rAAV 템플레이트는 아데노바이러스 골격에 내장되며, 5' 및 3' 시스 서열에 의해 측접되어, 이들 서열은 아데노바이러스 캡시드로 패키징될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 대표적인 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 AAV rep/cap 서열은 AAV 패키징 서열(예를 들어, AAV ITR)에 의해 측접되어, 이들 서열은 AAV 비리온으로 패키징되지 않는다.
헤르페스바이러스는 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV rep 단백질(들)을 암호화하는 혼성화 헤르페스바이러스는 유리하게도 더욱 견고한 AAV 벡터 제조 계획을 용이하게 할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 혼성화 헤르페스 단순 바이러스 타입 I(HSV-1) 벡터는 기재되어 있다(Conway 등, (1999) Gene Therapy 6:986 및 WO 00/17377, 이의 기재 내용은 본원에서 참고로 포함된다).
추가적인 대안으로서, 본 발명의 바이러스 벡터는 문헌[Urabe 등, (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43]에 기재된 바와 같이, rep/cap 유전자 및 rAAV 템플레이트를 전달하기 위해 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 제조될 수 있다. AAV를 제조하는 다른 방법은 안정적으로 형질전환된 패키징 세포를 사용한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,658,785호를 참고하라).
오염된 헬퍼 바이러스를 포함하지 않는 AAV 벡터 스톡은, 당업계에 알려진 어느 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, AAV 및 헬퍼 바이러스는 크기에 기초하여 용이하게 차별화될 수 있다. AAV는 또한 헤파린 기질에 대한 친화도를 기초로 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다(Zolotukhin 등, (1999) Gene Therapy 6:973). 대표적인 구현예에서, 결실된 복제-결핍성 헬퍼 바이러스가 사용되어, 임의의 오염된 헬퍼 바이러스가 컴피턴트를 복제하지 않는다. 추가적인 대안으로서, 단지 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 AAV 바이러스의 패키징을 매개하는데 이용될 수 있기 때문에, 후기 유전자 발현이 결여된 아데노바이러스 헬퍼가 이용될 수 있다. 후기 유전자 발현이 결핍된 아데노바이러스 돌연변이가 당업계에 알려져 있다(예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이).
본 발명의 패키징 방법은 바이러스 입자의 높은 역가 스톡을 제조하는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 스톡은 적어도 약 105 형질도입 단위 (tu)/ml, 적어도 약 106 tu/ml, 적어도 약 107 tu/ml, 적어도 약 108 tu/ml, 적어도 약 109 tu/ml, 또는 적어도 약 1010 tu/ml의 역가를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명의 바이러스 벡터, 및 선택적으로, 다른 의약 제제, 약제, 안정화제, 완충제, 담체, 어쥬번트, 희석제 등을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 주사용으로, 담체는 통상적으로 액체일 수 있다. 다른 방법의 투여를 위해, 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여를 위해, 담체는 호흡 가능할 것이며, 바람직하게는 고체 또는 액체 미립자 형태일 것이다.
"약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 독성이 없거나 아니면 바람직하지 않은 점이 없는 물질을 의도하는데, 즉, 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않고 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 시험관 내에서 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 방법이다. 바이러스 벡터는 특정 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 배수로 세포에 도입될 수 있다. 투여될 바이러스 벡터 또는 캡시드의 역가는 표적 세포 타입과 수, 및 특정 바이러스 벡터 또는 캡시드에 따라 다를 수 있으며, 과도한 실험이 없이도 당업계의 숙련자들이 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 약 103 감염 단위, 더욱 바람직하게는 적어도 약 105 감염 단위가 세포로 도입된다.
바이러스 벡터가 도입될 수 있는 세포(들)은, 신경 세포(말초 및 중추 신경계의 세포, 특히, 뇌 세포, 예컨대 뉴런, 희돌기교세포, 교세포 세포, 성상세포 포함), 폐 세포, 눈의 세포(망막 세포, 망막 색소 상피 및 각막 세포 포함), 상피 세포(예를 들어, 내장 및 호흡 상피 세포), 골격근 세포(근아세포, 근관 및 근섬유 포함), 횡격막 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포(도세포 포함), 간 세포, 위장관의 세포(민무늬근 세포, 상피 세포 포함), 심장 세포 (심근 세포 포함), 뼈 세포(예를 들어, 골수 줄기세포), 조혈 줄기세포, 비장 세포, 각질형성세포, 섬유아세포, 내피 세포, 전립선 세포, 관절 세포[예를 들어, 연골, 반월판(meniscus), 활막(synovium) 및 골수 포함], 생식 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 타입일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가적인 대안으로서, 세포는 줄기세포(예를 들어, 신경 줄기세포, 간 줄기세포)일 수 있다. 또 다른 추가적인 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포(암 및 종양은 상기 기재됨)일 수 있다. 게다가, 세포는 상기에 기재된 임의의 종의 기원으로부터 유래될 수 있다.
바이러스 벡터는 변형된 세포를 대상체에 투여할 목적으로 시험관 내에서 세포에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 대상체로부터 채취되고, 바이러스 벡터가 이에 도입된 후, 세포를 대상체로 다시 넣는다. 치료를 위해 생체외에서 세포를 대상체로부터 채취한 후 다시 대상체로 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 참고). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터는 또 다른 대상체 유래의 세포, 배양된 세포, 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 세포에 도입되고, 상기 세포는 이것이 필요한 대상체에 투여된다.
생체외에서 유전자 치료에 적합한 세포는 상기에 기재한 바와 같다. 대상체에 투여될 세포의 투여량은 대상체의 연령, 질환 및 종, 세포의 타입, 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 모드 등에 따라 달라질 것이다. 통상적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 중의 투여당 적어도 약 102 내지 약 108 또는 약 103 내지 약 106 개 세포가 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포는 약학적인 담체와 함께 유효량으로 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포는 전달된 폴리펩티드(예를 들어, 전이유전자로서 또는 캡시드에서 발현됨)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 투여될 수 있다. 통상적으로, 유효량의 폴리펩티드를 발현하는 다량의 세포는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여된다. 선택적으로, 투여량은 보호 면역 반응(상기에서 정의된 바와 같음)을 발생시키기에 충분하다. 부여된 보호의 정도는 면역원성 폴리펩티드를 투여하는 이점이 이의 임의의 단점을 넘어서는 이상, 완전하거나 또는 영구적일 필요가 없다.
본 발명의 추가적인 측면은 본 발명의 바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 방법이다. 특정 구현예에서, 방법은 관심 대상의 폴리뉴클레오티드를 동물 대상체에 전달하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본 발명에 의한 유효량의 바이러스 벡터를 동물 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 인간 대상체 또는 동물로 투여하는 것은 당업계에 알려진 임의의 수단에 의할 수 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 유효 투여량으로 전달된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 추가로 (예를 들어, 백신으로서) 대상체에서 면역 반응을 유도하도록 투여될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 백신은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 유효량의 바이러스를 포함한다. 선택적으로, 투여량은 보호 면역 반응(상기에서 정의된 바와 같음)을 발생시키기에 충분하다. 부여된 보호의 정도는 면역원성 폴리펩티드를 투여하는 이점이 이의 임의의 단점을 넘어서는 이상, 완전하거나 또는 영구적일 필요가 없다. 대상체 및 면역원은 상기 기재한 바와 같다.
대상체에 투여될 바이러스 벡터의 투여량은 투여의 모드, 치료될 질병 또는 질환, 개별 대상체의 조건, 특정바이러스 벡터, 및 전달될 핵산에 따라 달라질 것이고, 통상의 방식으로 결정될 수 있다. 치료적인 효과를 달성하기 위한 예시적인 투여량은 적어도 약 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018 형질도입 단위 또는 그 이상, 바람직하게는 약 107 또는 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 형질도입 단위, 더욱더 바람직하게는 약 1012 내지 1014 형질도입 단위의 바이러스 역가이다.
특정 구현예에서, 1회 초과의 투여(예를 들어, 2, 3, 4 회 또는 그 이상 투여)는 다양한 간격, 예를 들어, 일, 주, 개월, 년 등의 시기 동안 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하도록 이용될 수 있다.
예시적인 투여 모드는 경구, 직장, 점막 경유, 국소, 비강내, (예를 들어, 에어로졸을 통한) 흡입, 볼내(예를 들어, 설하), 질내, 척추강내, 안구내, 경피, 자궁내 (또는 난소내), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 근육내 [골격, 횡격막 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함], 피내, 흉강내, 뇌내, 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부 및 점막 표면 모두에, 기도 표면, 및 경피 투여 포함), 림프-내 등, 뿐만 아니라 (예를 들어, 간, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌에 대한) 직접 조직 또는 장기로의 주입을 포함한다. 투여는 또한 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 그 근처의) 종양에 대한 것일 수 있다. 임의의 소정의 경우 가장 적합한 경로는 치료될 질환의 특성 및 중증도, 및 사용되는 특정 벡터의 특성에 따라 달라질 것이다.
임의의 이들 조직으로의 전달은 또한 바이러스 벡터를 포함하는 데포(depot)를 전달함으로써 달성될 수 있는데, 이는 조직으로 이식될 수 있고, 또는 조직은 바이러스 벡터를 포함하는 필름 또는 다른 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이러한 이식가능한 메트릭스 또는 기질의 예는, 미국 특허 제7,201,898호에 기재되어 있다.
본 발명은 조직 또는 장기의 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 핵산을 조직 또는 기관에 전달하는데 사용될 수 있는데, 이는 혈액 중에 정상적으로 순환하는 단백질 산물(예를 들어, 효소) 또는 비-번역된 RNA(예를 들어, RNAi, 마이크로RNA, 안티센스 RNA)의 제조를 위한, 또는 장애(예를 들어, 대사 장애, 예컨대 당뇨병(예를 들어, 인슐린), 혈우병(예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII), 또는 리소좀 저장 장애(예컨대 고셔병[글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase)], 폼페병[리소좀산 α-글루코시다제] 또는 파브리병 [α-갈락토시다제 A]) 또는 글리코겐 저장 장애(예컨대 폼페병[리소좀산 α-글루코시다제])를 치료하기 위해 다른 조직에 전신 전달되기 위한 플랫폼으로 사용된다. 대사 장애를 치료하기 위한 다른 적합한 단백질은 상기 기재된 바와 같다
주사제는 종래의 형태로, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주입 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼 중 하나로서 제조될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 전신 방식보다는 국소로 데포 또는 지연-방출형 제형 중에 바이러스 벡터를 투여할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터는 건조되어 수술로 이식가능한 매트릭스, 예컨대 골접합 대체물, 봉합사, 스턴트 등으로 전달될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호에 기재된 바와 같음).
경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 별개의 단위, 예컨대 캡슐, 카세제, 로젠지, 또는 정제로 존재할 수 있는데, 각각은 사전 결정된 양의 본 발명의 조성물을; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로 함유한다. 경구 전달은 본 발명의 바이러스 벡터를 동물의 내장 중의 소화 효소에 의한 분해를 견딜 수 있는 담체와 복합체화함으로써 수행될 수 있다. 이러한 담체의 예는 당업계에 알려진 바와 같이 플라스틱 캡슐 또는 정제를 포함한다. 이러한 제제는 약학적인 임의의 적합한 방법에 의해 제조되는데, 이는 조성물과 적합한 담체를 연결시키는 단계를 포함한다(상기에서 주지한 바와 같이 하나 이상의 보조적인 성분을 함유할 수 있다). 일반적으로, 본 발명의 구현예에 따른 약학적 조성물은 조성물을 액체 또는 잘게 분할된 고체 담체, 또는 둘 다와 균일하고 충실히 혼합한 후, 필요한 경우, 생성되는 혼합물을 형성함으로서 제조된다. 예를 들어, 정제는 조성물, 및 선택적으로 하나 이상의 보조적인 성분을 함유하는 분말 또는 과립을 압축 또는 성형함으로써 제조될 수 있다. 압축된 정제는 적합한 기계에서, 조성물을 자유-유동 형태, 예컨대 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 및/또는 표면 활성/분산제(들)와 혼합된 분말 또는 과립으로 압축함으로써 제조된다. 성형된 정제는 적합한 기계에서, 불활성 액체 결합제로 습윤된 분말화 화합물을 성형함으로써 제조된다.
볼내(설하) 투여에 적합한 약학적 조성물은 착향된 기재, 통상 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중에 본 발명의 조성물을 포함하는 로젠지; 및 불활성 기재, 예컨대 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 중에 조성물을 포함하는 사탕형 알약(pastilles)을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 본 발명의 조성물의 멸균된 수성 및 비-수성 주입 용액을 포함할 수 있는데, 이는 선택적으로 의도된 수용체의 혈액과 등장성을 갖는다. 이들 제제는 항-산화제, 완충제, 세균발육저지제(bacteriostat) 및 용질을 포함할 수 있는데, 이는 조성물이 의도된 수용체의 혈액과 등장성이 되도록 한다. 수성 및 비-수성의 멸균 현탁액, 용액 및 에멀젼은 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 채소유, 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 식염수 및 완충화된 매체를 포함하는, 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산화된 링거액, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것들) 등을 포함한다. 방부제 및 다른 첨가제는, 또한 예를 들어, 항미생물제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 다른 첨가제로 존재할 수 있다.
조성물은 단위/투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있고, 사용 직전의 주입을 위해-멸균된 액체 담체, 예를 들어, 염수 또는 물의 첨가만을 요구하는 동결-건조된(동결 건조) 조건에서 저장될 수 있다.
임시의 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 멸균된 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 용기 내의 단위 투여형의 주사가능한 안정되고 멸균된 본 발명의 조성물이 제공될 수 있다. 조성물은 동결 건조 형태로 제공될 수 있고, 이는 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체에 의해 재구성되어, 대상체로 주입하기에 적합한 액체 조성물을 형성할 수 있다. 단위 투여형은 약 1 ㎍ 내지 약 10 그램의 본 발명의 조성물일 수 있다. 조성물이 실질적으로 물-불용성인 경우, 생리적으로 허용가능한 충분한 양의 유화제는, 수성 담체 중에서 조성물을 유화하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 이러한 하나의 유용한 유화제는 포스파티딜 콜린이다.
직장 투여에 적합한 약학적 조성물은 단위 투여량 좌제로서 제시될 수 있다. 이들은 조성물을 하나 이상의 종래의 고체 담체, 예컨대 예를 들어, 코코아 버터와 혼합한 후, 생성되는 혼합물을 형성하여 제조될 수 있다.
피부로의 국소 적용에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸, 또는 오일의 형태를 취할 수 있다. 사용될 수 있는 담체는 바셀린(petroleum jelly), 라놀린(lanoline), 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 경피 인핸서, 및 이들 중 2개 이상의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 국소 전달은 본 발명의 약학적 조성물을 피부로 침투할 수 있는 지방 친화성 시약(예를 들어, DMSO)과 혼합함으로써 수행될 수 있다.
경피 투여에 적합한 약학적 조성물은 연장된 기간의 시간 동안 대상체의 상피와 밀접하게 접하여 유지될 수 있도록 구성된 별개의 패치 형태일 수 있다. 경피 투여에 적합한 조성물은 또한 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Pharm . Res. 3:318 (1986)를 참고하라), 통상적으로 본 발명의 조성물의 선택적으로 완충화된 수성 용액의 형태를 취할 수 있다. 적합한 제형은 시트레이트 또는 bis/tris 버퍼 (pH 6) 또는 에탄올/물을 포함할 수 있고, 0.1 내지 0.2M 활성 성분을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 바이러스 벡터는 대상체의 폐에 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 바이러스 벡터로 구성된 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액를 투여함으로써 투여될 수 있고, 이를 대상체가 흡입한다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 바이러스 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업계의 숙련자에게 알려진 바와 같이, 임의의 적합한 수단에 의해, 예컨대 압력-유도 에어로졸 네뷸라이저 또는 초음파 네뷸라이저로 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,501,729호를 참고하라. 바이러스 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약학 분야에서 알려진 기술에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 생성기로 제조될 수 있다.
본 발명의 인자 IX 단백질의 제조
많은 발현 벡터가 유전자 조작된 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 발현 벡터는 유리하게 선택되는 고도로 발현되는 세포에 다양한 조건 하에서 형질감염된 세포를 증폭한 이후 다량의 재조합 단백질을 발현하도록 고안된다. 일부 발현 벡터는 선택 압력 하의 증폭의 필요성이 없이, 다량의 재조합 단백질을 발현하도록 고안되었다. 본 발명은 당업계에서 표준인 방법에 의한 유전자 조작된 세포의 제조를 포함하며, 이는 임의의 특이적인 발현 벡터 또는 발현 시스템에 따라 달라지지 않는다.
다량의 FIX 단백질을 제조하도록 유전자 조작된 세포를 생성하기 위해서는, 세포는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, cDNA)를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질감염된다. 일부 구현예에서, FIX 단백질은 FIX 단백질의 적절한 번역-후 변형이 소정의 세포 시스템에서 발생하도록 유도하는 선택된 공동-형질감염된 효소를 갖도록 발현된다.
세포는 다양한 공급원으로부터 선택될 수 있으나, 그렇지 않으면 FIX 단백질을 암호화하는 핵산 분자(예를 들어, cDNA)를 포함하는 발현 벡터로 형질감염될 수 있는 세포이다.
본 발명의 실행은 달리 기재된 바 없는 경우, 당업계의 기술 내에 속하는 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, 등, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2판 (1989); DNA Cloning, Vols. I 및 II (D. N Glover, ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), 특히 Vols. 154 및 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos, eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Mayer and Walker, eds. (Academic Press, London, 1987); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 2판. 1987 (Springer-Verlag, N.Y.); 및 Handbook of Experimental Immunology Vols I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. 1986)]를 참고하라, 본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 전체로서 본원에 참고로 포함된다.
유전자 조작 기술
클로닝된 유전자, 재조합 DNA, 벡터, 형질전환된 세포, 유전자 조작에 의한 단백질 및 단백질 절편의 제조는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,761,371호(Bell 등에 양도됨)의 컬럼 6, 라인 3 내지 컬럼 9, 라인 65; 미국 특허 제4,877,729호(Clark 등에 양도됨)의 컬럼 4, 라인 38 내지 컬럼 7, 라인 6; 미국 특허 제4,912,038호(Schilling에 양도됨)의 컬럼 3, 라인 26 내지 컬럼 14, 라인 12; 및 미국 특허 제4,879,224호(Wallner에 양도됨)의 컬럼 6, 라인 8 내지 컬럼 8, 라인 59를 참고하라.
벡터는 복제가능한 DNA 작제물이다. 벡터는 FIX 단백질을 암호화하는 핵산을 증폭시키거나, 및/또는 FIX 단백질을 암호화하는 핵산을 발현시키는데 사용된다. 발현 벡터는 복제가능한 핵산 작제물인데, 여기에서 FIX 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결되어, 적합한 숙주 세포에서 FIX 단백질을 생성한다. 이러한 조절 서열에 대한 필요성은, 선별된 숙주 세포 및 선택된 형질전환 방법에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 조절 서열은 전사 프로모터, 전사를 조절하기 위한 선택적인 작동자(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
벡터는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스), 파지, 및 통합가능한 DNA 절편(즉, 재조합에 의해 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있는 절편)을 포함한다. 벡터는 복제되어 (예를 들어, 일시적인 발현을 통해) 숙주 세포 게놈과는 독립적으로 기능할 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 자체로 통합될 수 있다(예를 들어, 안정된 통합). 발현 벡터는 발현될 핵산 분자에 작동하능하게 연결되어, 숙주 세포 및/또는 생체 내에서 작동가능한 프로모터 및 RNA 결합 부위를 포함할 수 있다.
DNA 부위 또는 뉴클레오티드 서열은 이들이 서로 기능적으로 관련된 경우 작동가능하게 연결되거나 또는 작동가능하게 연관된다. 예를 들어, 프로모터는 이들이 서열의 전사를 조절하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 이들이 서열의 번역을 허용하도록 위치되는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다.
적합한 숙주 세포는 원핵, 효모 또는 고등 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포 및 곤충 세포를 포함한다. 다세포 생물 유래의 세포는 재조합 FIX 단백질 합성에 특히 적합한 숙주이고, 포유류 세포가 특히 바람직하다. 세포 배양물에서의 이러한 세포 의 전파는 통상의 과정이 된다(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. 유용한 숙주 세포주들의 예는 VERO 및 HeLa 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, 및 WI138, HEK 293, BHK, COS-7, CV, 및 MDCK 세포주이다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터는 통상 (필요한 경우) 복제 기원, FIX 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로부터 상류에 위치하여, 이에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위(인트론-포함 게놈 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 미국 특허 제5,888,809호(이는 전체로서 본원에 참고로 포함된다)의 발현 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 수행될 수 있다.
척추동물 세포를 형질전환하는데 사용되는 발현 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열은 종종 바이러스 공급원에 의해 제공된다. 비제한적인 예는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 및 및 유인원 바이러스 40(SV40)로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,599,308호를 참고하라.
복제 기원은 벡터가 외인성 기원을 포함하도록 제조함으로써 제공되거나, 예컨대 SV 40 또는 다른 바이러스(예를 들어, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV, 또는 BPV) 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 또는 숙주 세포 염색체 복제 메커니즘에 의해 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체로 통합되는 경우, 후자는 종종 충분하다.
바이러스 복제 기원을 포함하는 벡터를 사용하기보다는, 선별 마커 및 FIX 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 의한 동시형질전환의 방법에 의해 포유류 세포를 형질전환시킬 수 있다. 적합한 선별 마커의 비제한적인 예는 디히드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase, DHFR) 또는 티미딘 키나제이다. 이러한 방법들은 미국 특허 제4,399,216호(이는 전체로서 본원에 참고로 포함된다)에 추가로 기재된다.
재조합 척추동물 세포 배양물에서 FIX 단백질의 합성을 위한 구성에 적합한 다른 방법은, 문헌[Gething 등 Nature 293:620 (1981); Mantei 등 Nature 281:40; 및 Levinson 등], EPO 특허출원 117,060A 및 117,058A에 기재된 것들을 포함하며, 상기 각각의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다.
미국 특허 제4,745,051호 및 제4,879,236호(Smith 등으로 양도됨)에 기재된 바와 같이, 숙주 세포, 예컨대 곤충 세포[예를 들어, 배양된 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ) 세포] 및 발현 벡터, 예컨대 배큘로바이러스 발현 벡터[예를 들어, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica ) MNPV, 트리코프루시아니(Trichoplusia ni ) MNPV, 라치플루시아 오우(Rachiplusia ou ) MNPV, 또는 갤러리아 오우(Galleria ou ) MNPV로부터 유래된 벡터]를 본 발명을 수행하는데 이용할 수 있다. 일반적으로, 배큘로바이러스 발현 벡터는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터의 전자 조절 하에 폴리헤드린 전사 개시 신호로부터 ATG 개시 부위에 이르는 위치에서 폴리헤드린 유전자에 삽입되는, 발현될 뉴클레오티드 서열을 포함하는 배큘로바이러스 게놈을 포함한다.
원핵 숙주 세포는 그램 음성 또는 그램 양성 생물, 예를 들어 각각 대장균(Escherichia col , E. coli) 또는 바실러스(bacilli)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 본원에 기재된 포유류 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 예시적인 박테리아 숙주 세포는 E. coli W3110(ATCC 27,325), E. coli B, E. coli X1776(ATCC 31,537) 및 E. coli 294(ATCC 31,446)이다. 넓은 범위의 다수의 적합한 원핵 및 미생물 벡터가 이용가능하다. E. Col는 통상적으로 pBR322를 사용하여 형질전환된다. 재조합 미생물 발현 벡터에 가장 통상적으로 사용되는 프로모터는, 베타락타마제(페니실리나제) 및 락토스 프로모터 시스템[Chang 등 Nature 275:615 (1978); and Goeddel 등 Nature 281:544 (1979)], 트립토판(trp) 프로모터 시스템 (Goeddel 등 Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) 및 EPO 출원 공개 제36,776호) 및 tac 프로모터(De Boer 등 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:21 (1983)]을 포함한다. 프로모터 및 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵 숙주 발현의 경우)가 FIX 단백질을 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결되고, 즉 이들은 DNA로부터 FIX 메신저 RNA의 전사를 촉진하도록 위치한다.
진핵 미생물, 예컨대 효모 배양물도 또한 단백질-암호화 벡터로 형질전환될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,745,057호를 참고하라). 다수의 다른 종들이 상업적으로 이용가능하기는 하지만, 저급 진핵 숙주 미생물들 중에서 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 통상적으로 사용된다. 효모 벡터는 2 마이크론 효모 플라스미드 또는 자가 복제 서열(ARS) 유래의 복제 기원, 프로모터, FIX 단백질을 암호화하는 핵산, 폴리아데닐화 및 전사 조절을 위한 서열, 및 선별 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 플라스미드는 YRp7[Stinchcomb 등 Nature 282:39 (1979); Kingsman 등 Gene 7:141 (1979); Tschemper 등 유전자 10:157 (1980)]이다. 효모 벡터에서 적합한 프로모터 서열은, 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제[Hitzeman 등 J. Biol . Chem. 255:2073 (1980)] 또는 다른 해당 효소[Hess 등 J. Adv . Enzyme Reg. 7:149 (1968); 및 Holland 등 Biochemistry 17:4900 (1978)]를 위한 프로모터를 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위한 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 문헌[R. Hitzeman 등, EPO 공보 제73,657호]에 기재되어 있다.
본 발명의 클로닝된 암호화 서열은 마우스, 래트, 개, 주머니쥐, 토끼, 고양이, 돼지, 말, 양, 소, 기니피그, 주머니쥐, 오리너구리, 및 인간을 포함하는 기원의 임의의 종을 포함하는 기원의 FIX를 암호화할 수 있으나, 바람직하게는 인간 기원의 FIX 단백질을 암호화한다.
본원에 기재된 단백질을 암호화하는 핵산과 혼성화할 수 있는 FIX를 암호화하는 핵산도 또한 포괄된다. 이러한 서열의 혼성화는 감소된 엄격성 또는 심지어 엄격한 환경(예를 들어, 60℃ 또는 심지어 70℃에서 0.3M NaCl, 0.03M 구연산나트륨, 0.1% SDS의 세척 엄격성으로 나타나는 엄격한 환경)의 조건 하에서, 표준 제자리 혼성화 검정법으로 본원에 기재된 FIX 단백질을 암호화하는 핵산에 대해 실시될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2판, 1989) Cold Spring Harbor Laboratory)]를 참고하라.
본 발명에 의해 제조되는 FIX 단백질은 알려진 방법에 의해 형질전환 동물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,344,596호를 참고하라, 이는 전체로서 본원에 참고로 포함된다. 간략히, 형질전환 동물은 농장 동물(예를 들어, 돼지, 염소, 양, 소, 말, 토끼 등), 설치류(예컨대 마우스, 래트 및 기니피그), 및 가정의 애완 동물(예를 들어, 고양이 및 개)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가축 동물, 예컨대 돼지, 양, 염소, 및 소가 일부 구현예에서 특히 바람직하다.
본 발명의 형질전환 동물은 본 발명의 인간 FIX 단백질을 암호화하는 적절한 폴리뉴클레오티드를 단일 세포 배아에, 성숙한 동물의 생식 계열 세포의 DNA에 안정적으로 통합되어, 정상적인 멘델 경향으로 유전되는 방식으로 도입함으로써 제조된다. 본 발명의 형질전환 동물은 체액 및/또는 조직에서 FIX 단백질을 제조하는 표현형을 가질 것이다. FIX 단백질은 이들 체액 및/또는 조직으로부터 채취되어, 예를 들어 치료적 사용을 위해 가공될 것이다[예를 들어, Clark 등 "Expression of human anti-hemophilic factor IX in the milk of transgenic sheep" Bio/Technology 7:487-492 (1989); Van Cott 등 "Haemophilic factors produced by transgenic livestock: abundance can enable alternative therapies worldwide" Haemophilia 10(4):70-77 (2004)]를 참고하라, 이들의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다).
DNA 분자는 미세주입, 인산칼슘 매개 침전, 리포좀 융합, 또는 전능성 또는 다능성 줄기세포의 레트로바이러스 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 수단에 의해 배아에 도입될 수 있다. 형질전환된 세포는 이후 배아로 도입되고 이에 혼입되어, 형질전환 동물을 형성할 수 있다. 형질전환 동물의 제조 방법은 예를 들어, 문헌[Transgenic Animal Generation and Use by L. M. Houdebine, Harwood Academic Press, 1997]에 기재되어 있다. 형질전환 동물은 또한 예를 들어 문헌[Campbell 등, Nature 380:64-66 (1996) 및 Wilmut 등, Nature 385:810-813 (1997)]에 기재된 바와 같이, 배아 또는 성체 세포주를 사용하여 핵 전달 또는 클로닝의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 추가로, DNA의 세포질 주입을 이용하는 기술은 미국 특허 제5,523,222호에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
FIX-제조의 형질전환 동물은 FIX-암호화 서열을 포함하는 키메라 작제물을 도입함으로써 얻을 수 있다. 형질전환 동물을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Hogan 등, MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort 등, Bio/Technology 9:88 (1991); Palmiter 등, Cell 41:343 (1985), Kraemer 등, GENETIC MANIPULATION OF THE EARLY MAMMALIAN EMBRYO, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer 등, Nature 315:680 (1985); Wagner 등, 미국 특허 제5,175,385호; Krimpenfort 등, 미국 특허 제5,175,384호, Janne 등, Ann. Med. 24:273 (1992), Brem 등, Chim . Oggi . 11:21 (1993), Clark 등, 미국 특허 제5,476,995호]를 참고하라(이들 모두는 전체로서 본원에 참고로 포함된다).
일부 구현예에서, 프로모터가 생리학적 조건 하에서 모유가 합성되는 다른 조직에서보다 유방 조직에서 더욱 활성인 점에서, 유방 조직에서 "활성"인 시스-작용 조절 부위가 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 짧고 긴 유청 산성 단백질 (WAP), 짧고 긴 α, β 및 κ 카제인, α-락트알부민 및 β-락토글로불린("BLG") 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 발현된 단백질이 다른 체액, 특히 혈액 및 소변으로 분비되도록 유도하는 신호 서열도, 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 서열의 예는 FIX, 단백질 C, 및 조직-타입 플라스미노겐 활성자의 신호 펩티드를 포함하는 분비된 응고 인자의 신호 펩티드를 포함한다.
상기 논의된 프로모터 이외에, 전사를 조절하는 유용한 서열들 중에는, 인핸서, 스플라이스 신호, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 부위, 완충 서열, RNA 가공 서열, 및 전이유전자의 발현을 조절하는 다른 서열이 있다.
바람직하게는, 발현 시스템 또는 작제물은 원하는 재조합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 비번역 부위 하류를 포함한다. 이러한 부위는 전이유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 3' 비번역 부위들 중에서도, 폴리 A 신호를 제공하는 서열이 이에 대해 유용하다.
적합한 이형 3'-비번역 서열은 예를 들어, SV40 작은 t 항원, 카제인 3' 비번역 부위, 또는 이러한 분야에 잘 알려진 다른 3' 비번역 서열로부터 유도될 수 있다. 리보솜 결합 부위는 또한 FIX의 발현 효율을 증가시키는데 중요하다. 마찬가지로, FIX의 번역-후 변형을 조절하는 서열이 본 발명에서 유용하다.
본 발명을 설명할 때 이하의 실시예에서 더욱 상세히 설명될 것이며, 이는 본원에서 예시의 목적으로 포함되며, 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
유전자 발현 카세트의 제조
인간 인자 IX 유전자 발현 효율 및 지속성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 목표를 달성하기 위해 다수의 노력을 하였다: 1) 다수의 디자이너 프로모터를 합성함으로써 간 특이성 및 강한 활성을 얻고; 2) 프로모터 이후 작은 인트론을 사용함으로써 전이유전자 mRNA 가공의 효율성을 증가시키고; 그리고 유전자의 단백질 암호화 부위 내에 제2의 작은 인트론의 새로운(de novo) 삽입; 3) 감소된 2차 구조 등을 위해 5' 비번역 서열을 최적화함으로써 전이유전자 산물 단백질 합성의 번역 효율을 증가시키고; 4) 인간 코돈 사용을 최적화하고, CpG 모티프를 감소시키고, 긴 G 및 C 트랙을 감소시키고; 5) 효과적인 폴리A 합성 및 AAV의 3' 반전된 말단 반복부(ITR)로부터 잔여 안티-센스 프로모터 활성의 차단을 위해 양-방향 폴리아데닐화 서열을 사용하였다.
본 발명자들은 보존된 기본 프로모터 요소 및 전사 개시 부위를 포함하는 다수의 인공 프로모터를 고안하고 전체적으로 합성하였다. 기본 프로모터는 이의 5' 말단이 간-특이적인 발현을 위한 다수의 간-특이적인 전사 인자 결합 부위에 연결된다. LXP2.1라고 지칭된 프로모터(도 1)(서열번호 1)는 이의 작은 크기(188 bp), 및 인간 간암 세포주 Huh7에서 루시퍼라제(luciferase) 리포터 유전자 및 형질감염 실험을 사용하여 초기에 시험관 내에서 스크리닝된 높은 활성 때문에 선택되었다(표 4). 본 발명자들은 AAV8 바이러스 입자 내에 가우시아 루시퍼라제 발현 카세트를 패키징하고 마우스 꼬리 정맥에 주사한 후, 보편적이고 강한 CMV 프로모터로 LXP2.1 프로모터를 생체내에서 추가로 평가하였다. 루시퍼라제 발현은 5×1010 벡터 게놈(v.g.)/마우스를 IV 주입한 지 2주 후에, 마우스로부터 채취한 혈청을 사용하여 검정되었다(표 5). LXP2.1 프로모터는 CMV 프로모터의 약 4 배만큼 강력하였다.
Figure pct00005
Figure pct00006
인자 IX 유전자 발현을 생체 내에서 강화시키기 위해, 본 발명자들은 목표를 달성하기 위한 2가지 접근법을 취하였다. 먼저, 본 발명자들은 더욱 효과적인 코돈의 사용을 최적화하려는 목적으로, 인간 코돈-최적화 프로그램인 GeneArt(Invitrogen)을 사용하여, 인간 인자 유전자의 암호화 서열을 전체적으로 합성하였다. 추가로, 본 발명자들은 합성된 인자 IX 유전자 내의 모든 CpG 서열을 감소시키거나, 또는 제거하기 위한 시도를 하였다. 유전자 내의 CpG 아일랜드 또는 모티프가 선천성 면역 반응[예를 들어, 톨-유사 수용체 9, TLR9, 매개 면역 반응(Bauer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(16):9237 (2001)]을 유발하고, 또한 유전자 사일런싱을 잠재적으로 유발할 수 있다는 관련 문서가 있다. 인자 IX 유전자-1(서열번호 6) 및 인자 IX 유전자-2(서열번호 7)에서, CpG 모티프는 완전히 제거되었다. 그러나, 인자 IX 유전자-3(서열번호 8)에서는, 단지 TCG 및 CGT 서열만 제거되었다. 인간 세포에서, 보존된 CpG 모티프인 GTCGTT가 TLR9 반응을 유발하는 가장 강력한 모티프라는 것이 보고된 바 있다. TCG 및 CGT 모티프의 제거는 GTCGTT 요소를 효과적으로 무용화시킨다.
인트론이 사전-mRNA 가공을 용이하게 하고 유전자 발현을 강화시킴으로서 이들의 기능을 발휘한다는 관련 문서가 많다. 인간 인자 IX 유전자의 원래의 인트론은 크기가 비교적 커서, 본 발명의 유전자 발현 카세트에 적합하지 않다. 인자 IX 유전자 발현을 더욱 증가시키려는 시도로, 본 발명자들은 작은 인간 인트론(서열번호 4 및 5)을 합성하였다. 제1 인트론은 AAG과 G 사이의 인공 5' 비번역 부위(5' UTR)(서열번호 4)에 삽입되었다. 제2 인트론(서열번호 5)은 공통적인 엑손/인트론 접합 부위인 뉴클레오티드 CAG와 G 사이의 유전자의 5' 암호화 부위로 삽입되었다. 인공 인트론(서열번호 5) 삽입부를 갖는 상기 3개의 유전자의 전체 DNA 서열은 각각 서열번호 6, 7 및 8에 제시되었다. 비록 인자 IX 유전자의 암호화 서열 내의 인공 인트론 1 및/또는 5' UTR 내의 인트론 2의 삽입부는 평가하지 않았지만, 본 발명자들은 유사한 결과를 얻을 수 있을 것으로 예상한다.
실시예 2
유전자 발현 카세트의 시험관 내 발현
디자이너 인간 인자 IX 유전자 발현 카세트가 세포 내에서 작용하는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 상기 언급된 발현 카세트를 Huh7 세포주에 형질감염시켰다. Huh7은 간세포에서 활성을 나타내는 프로모터를 평가하는데 종종 사용된다. Huh7 세포가 어떠한 내재성 응고 인자 IX도 생성하지 않기 때문에, 비-형질감염된 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 이러한 실험의 목적은, 본 발명의 신규한 인자 IX 작제물이 인간 세포에서 세포 배양 배지로 세포외 분비되는 기능성 인자 단백질을 생성할 수 있는지 여부를 알아보는 것이다. 형질감염의 24 시간 이후에, 세포 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하고, 또 다른 24 시간 동안 배양을 계속하였다. 이후에, 세포 배양 배지를 수집하여, 통상 시험관 내에서 사용되는 응고 활성 시험인 APTT 시험을 실시하였다. 본 발명자들의 결과는 본 발명의 작제물 모두가 고수준의 인자 IX 단백질을 발현 및 분비한다고 나타내었다(도 3). 본 발명의 유전자 발현 카세트의 기능을 확인함으로써, 본 발명자들은 임상적으로 관련된 동물 모델인 B형 혈우병 마우스에서 생체내 유전자 발현 실험을 실시하게 되었다.
실시예 3
유전자 발현 카세트의 생체내 발현
시험관 내에서 세포 배양물 형질감염 실험이 인공 인트론-2(서열번호 4)을 갖는 코돈 최적화된 인간 인자 IX 유전자-1을 포함하는 유전자 발현 카세트가 더욱 강력하다는 것을 암시하였기에, 본 발명자들은 AAV 반전된 말단 반복부(ITR)가 측접된 이러한 작제물을 선택하여, 이를 마우스 간에서 고수준의 발현을 위해 AAV8 혈청 타입 벡터, 강건한 간-지향성 AAV 벡터로 패키징하였다. 코돈 최적화된 인간 인자 IX 유전자-1이 AAV 벡터의 다른 혈청 타입에서 작용하는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 이를 조작된 캡시드(AAVXL14)를 갖는 신규한 AAV 벡터에 패키징시켰다. 벡터를 이중 CsCl 밀도 초원심분리로 정제하고, 염수에 대해 투석하고, DNA 닷 블롯, 및 PAGE 겔 분리 이후 AAV 캡시드 단백질 은 염색에 의해 적정하였다. 동시에, 이전에 보고된 인간 인자 IX 유전자 발현 카세트[Wu 등, Mol . Ther . 16(2):280 (2008)](본원에서 F9-ZWu라고 지칭함)은, 양성 대조군으로서 AAV8 벡터에 패키징되었다. 그 카세트는 간-특이적인 TTR 프로모터 및 상이한 코돈-최적화된 인간 인자 IX 유전자를 포함하나, 동일한 아미노산 R338L 돌연변이[Padua 돌연변이; Simioni 등, N. Engl. J. Med 361(17):1671 (2009)]를 갖는다.
인자 IX 발현 카세트가 생체내에서 얼마나 효율적으로 작용하는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 6주령의 수컷 인자 IX 유전자 녹아웃 마우스(B형 혈우병 동물모델에 통상 사용됨)를 사용하도록 선택하였다. 상기 언급된 벡터는 인자 IX KO 마우스에서 4개의 상이한 투여량인 1×1010 vg/kg(벡터 게놈/킬로그램 체중), 4×1010 vg/kg, 1×1011 vg/kg 및 4×1011 vg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사되었다(표 4). 비처리된 연령- 및 성별-일치하는 인자 IX KO 마우스는 음성 대조군으로 사용되었다. 혈장은 표준 프로토콜을 사용하여 안와 정맥(retroorbital vein)을 통해 2주마다 수집되었다. 혈장 샘플은 추가적인 시험을 위해 -80℃에서 동결되었다. 인간 인자 IX 유전자 발현을 정량적으로 평가하기 위하여, 인자 IX 활성에 대한 표준 곡선으로서, 중증 B형 혈우병 환자의 혈장에 연속적으로 희석된 정제된 재조합 인간 인자 IX를 사용하여, 혈장 샘플에 통상의 APTT 시험을 실시하였다.
본 발명자들의 결과는 모든 AAV 벡터가 KO 마우스에서 인간 인자 IX를 발현한다고 나타내었다(표 6). 그러나 본 발명자의 FIX 유전자-1 발현 카세트는 이전에 보고된 양성-대조군 벡터 F9-ZWu보다 유의하게 더 효율적이었다[Wu 등, Mol . Ther . 16(2):280 (2008)]. 예를 들어, 1×1011vg/kg 및 4×1011vg/kg의 벡터 투여량에서는, 본 발명의 벡터는 양성 대조군 벡터만큼 높은 대략 25 및 34 배인 발현 수준을 달성하였다. 1×1010vg/kg 체중만큼 낮은 벡터 투여량에서, 본 발명의 벡터는 정상적인 생리학적 수준의 인간 인자 활성의 대략 140%를 달성할 수 있었다. 추가로, 인간 인자 유전자 발현은 시험된 모든 투여량에서 생체내 실험의 지속 기간인 최대 20 주 동안 안정되었다(도 4 및 표 7). 따라서 본 발명자들의 결과는, 유전자 발현이 강건할 뿐만 아니라 또한 장기간 지속된다는 것을 입증하였다. FIX KO 마우스에서 FIX-1 유전자 산물의 지속적인 고수준의 발현은 어떠한 분명한 부작용도 유발하지 않았다.
Figure pct00007
인자 IX 활성은 벡터 주입(n = 7)의 2주 후에 측정되었다.
인자 IX 활성은 정상적인 인간 혈장 수준의 백분율로 나타내었다.
Figure pct00008
인자 IX 활성은 정상적인 인간 혈장 수준의 백분율로 나타내었다.
당업계의 숙련자들은 다수의 다양한 변형들이 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고도 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 형태는 단지 예시이며, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니라고 명백히 이해될 것이다.
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 특허 공보, GenBank® 데이터베이스 수탁 번호에 의해 식별된 서열 및 다른 참고 문헌은 참고 사항이 존재하는 문장 및/또는 단락에 관련된 교시에 대하여 전체로서 참고로 본원에 포함된다.
상기한 것들은 본 발명의 예시이며, 이에 대한 제한으로 이해되지 않을 것이다. 본 발명은 이하 청구항, 및 이에 포함될 청구항의 균등물에 의해 정의된다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of North Carolina at Chapel Hill Xiao, Xiao Li, Juan <120> Optimized Human Clotting Factor IX Gene Expression Cassettes and Their Use <130> 5470-817WO <150> 62/512,833 <151> 2017-05-31 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter LXP2.1 <220> <221> promoter <222> (1)..(188) <400> 1 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttactct ggttaataat ctcaggagta caaacattcc agatccaggt taatttttaa 120 aaaaagagtg ctctagtttt gcaatacagg acatgctata aaaagcgaag cgcgcggtgg 180 gcggggtt 188 <210> 2 <211> 359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter and 5'UTR and intron-1 <220> <221> promoter <222> (1)..(188) <220> <221> 5'UTR <222> (189)..(263) <220> <221> Intron <222> (264)..(351) <220> <221> 5'UTR <222> (352)..(359) <400> 2 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttactct ggttaataat ctcaggagta caaacattcc agatccaggt taatttttaa 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aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 1980 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2040 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat ctggggaggc tgctggtgaa tattaaccaa 2100 ggtcacccca gttatcggag gagcaaacag gggctaagtc cacacgcgt 2149 <210> 11 <211> 2149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor FIX expression cassette-2 <220> <221> promoter <222> (7)..(194) <220> <221> 5'UTR <222> (195)..(269) <220> <221> Intron <222> (270)..(357) <220> <221> 5'UTR <222> (358)..(365) <220> <221> Intron <222> (537)..(618) <400> 11 cttaagaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg cagcatttac 60 tctctctgtt tactctggtt aataatctca ggagtacaaa cattccagat ccaggttaat 120 ttttaaaaaa agagtgctct agttttgcaa tacaggacat gctataaaaa gcgaagcgcg 180 cggtgggcgg ggttgaagct aacaaagacc acgacgatat cacggtcgtg gtctcaaaga 240 acaacaaaca acaaagtccg actgagaagg tgagtggcgg gccctgagct ggggggcggg 300 ggtgttggct ctggaggctg ggtctgagcg taattttgca cccccgcgtc cctgcaggag 360 ccaccatgca gagggtcaac atgattatgg ctgagagccc tggcctgatc accatctgtc 420 tgctgggcta cctgctgtct gcagagtgca cagtgtttct ggaccatgag aatgccaaca 480 agatcctgaa caggcccaag aggtacaact ctggcaagct ggaagagttt gtgcaggtga 540 gtatctcagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct ctgatcccag ggctcactgt 600 gggtctctct gttcacaggg caacctggaa agggaatgca tggaagagaa gtgcagcttt 660 gaagaggcca gggaagtgtt tgagaacaca gagagaacca cagagttctg gaagcagtat 720 gtggatgggg accagtgtga aagcaacccc tgcctgaatg gtggcagctg caaggatgac 780 atcaacagct atgagtgctg gtgccccttt ggctttgagg gcaagaactg tgaactggat 840 gtgacctgca acatcaagaa tggcagatgt gaacagttct gcaagaactc tgctgacaac 900 aaggttgtgt gctcctgcac agagggctac agactggctg agaaccagaa aagctgtgaa 960 cctgctgtgc cctttccatg tggcagagtg tctgtgtccc agaccagcaa gctgaccaga 1020 gctgaggctg tgttccctga tgtggactat gtgaactcca cagaggctga gacaatcctg 1080 gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aatgacttca caagagttgt tggaggggaa 1140 gatgccaagc ctggacagtt cccttggcaa gtggtgctga atggcaaagt ggatgccttc 1200 tgtggtggct ccattgtgaa tgagaagtgg attgtgacag ctgcccactg tgtggaaaca 1260 ggggtcaaga tcacagtggt ggctggggag cacaacattg aggaaacaga gcacacagag 1320 caaaagagga atgtcatcag gatcatccct caccacaact acaatgctgc catcaacaag 1380 tacaaccatg acattgccct gcttgagctg gatgagcccc tggtcctgaa ctcctatgtg 1440 acccctatct gcattgctga caaagagtac accaacatct ttctgaagtt tggctctggc 1500 tatgtgtctg gctggggtag agtgttccac aagggaagat ctgccctggt gctgcagtac 1560 ctgagagtgc ccctggtgga tagagccaca tgtctgctga gcaccaagtt caccatctac 1620 aacaacatgt tctgtgctgg gttccatgaa ggtggcagag actcctgcca gggagatagt 1680 ggtggccctc atgtgacaga ggtggaaggc accagctttc tgacaggcat catcagctgg 1740 ggagaagagt gtgccatgaa gggcaaatat ggcatctaca ccaaggtgtc cagatatgtc 1800 aactggatca aagaaaagac caagctcacc tgataagcta gctctagatc ataatcagcc 1860 ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc 1920 tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt 1980 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2040 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 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ggaagagttt gtgcaggtga 540 gtatctcagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct ctgatcccag ggctcactgt 600 gggtctctct gttcacaggg caacctggaa agggaatgca tggaagagaa gtgcagcttt 660 gaagaggccc gggaagtgtt tgagaacaca gagcggacca cagagttctg gaagcagtat 720 gtggatgggg accagtgtga aagcaacccc tgtctgaatg gcggcagctg caaggatgac 780 atcaacagct atgagtgctg gtgccccttt ggctttgagg gcaagaactg tgaactggat 840 gtgacctgca acatcaagaa tggccgctgt gaacagttct gcaagaacag cgctgacaac 900 aaggttgtgt gctcctgcac agagggctac agactggctg agaaccagaa aagctgtgaa 960 cccgctgtgc cctttccatg cggcagagtg tctgtgtccc agaccagcaa gctgaccaga 1020 gctgaggctg tgttccctga tgtggactat gtgaacagca cagaggctga gacaatcctg 1080 gacaacatca cccagagcac ccagtccttc aatgacttca ccagagttgt tggcggagag 1140 gatgccaagc ctggacagtt cccttggcaa gtggtgctga atggcaaagt ggatgccttc 1200 tgcggcggca gcattgtgaa tgagaagtgg attgtgaccg ccgctcactg tgtggaaacc 1260 ggggtcaaga ttacagtggt ggccggggag cacaacattg aggaaacaga gcacacagag 1320 caaaagcgga atgtcatccg gatcatccct caccacaact acaatgccgc 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ccggatcatc 900 cctcaccaca actacaatgc cgccatcaac aagtacaacc atgacattgc cctgcttgag 960 ctggatgagc ccctggtcct gaactcctat gtgaccccta tctgcattgc tgacaaagag 1020 tacaccaaca tctttctgaa gtttggcagc ggctatgtgt ccggctgggg aagagtgttc 1080 cacaagggaa gatctgccct ggtgctgcag tacctgagag tgcccctggt ggatagagcc 1140 acatgtctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccat 1200 gaaggcggca gagatagctg tcagggagat tctggcggcc ctcatgtgac agaggtggaa 1260 ggcaccagct ttctgaccgg catcatcagc tggggagaag agtgtgccat gaagggcaaa 1320 tatggcatct acaccaaggt gtcccgctat gtcaactgga tcaaagaaaa gaccaagctc 1380 acctgataa 1389

Claims (44)

  1. 합성된 간-특이적인 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 관심 대상의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 응고 인자를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 인자 IX를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 인간에서 발현을 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 인자 IX를 암호화하는 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 R338L 돌연변이(인간 인자 IX에 대한 넘버링)를 발생시키는 미스센스 돌연변이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터와 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드 사이에 합성된 5'-비번역 부위를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 합성된 5'-비번역 부위는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 합성된 5'-비번역 부위는 합성된 인트론을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 합성된 인트론은 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 합성된 5'-비번역 부위 및 합성된 인트론은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 프로모터, 상기 합성된 5'-비번역 부위 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상의 폴리뉴클레오티드는 합성된 인트론을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 합성된 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 부위에 작동가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 부위는 양방향 폴리아데닐화 부위인, 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 부위는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  25. 인간에서 발현을 위해 코돈 최적화된 인간 인자 IX를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  27. 제25항에 있어서, 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 본질적으로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  28. 제25항에 있어서, 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  29. 제25항에 있어서, 합성된 인트론을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 합성된 인트론은 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  31. 제29항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  32. 제29항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  33. 제29항에 있어서, 상기 코돈-최적화된 인자 IX 암호화 서열 및 상기 합성된 인트론은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 대해 적어도 약 90% 동일한 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인, 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV8 또는 AAV9 벡터인, 벡터.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및/또는 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 형질전환 세포.
  39. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포를 포함하는, 형질전환된 비-인간 동물.
  40. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포를 포함하는, 조성물.
  41. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  42. 대상체의 간에서 폴리펩티드 또는 기능성 핵산을 제조하는 방법으로서, 대상체에 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포를 전달함으로써, 상기 폴리펩티드 또는 상기 기능성 핵산을 대상체의 간에서 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 대상체에서 B형 간염 또는 후천성 인자 IX 결핍을 치료하는 방법으로서, 대상체에 치료 유효량의 제5항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 B형 간염을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 방법으로서, 대상체에 유효량의 제5항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 벡터, 및/또는 제38항의 형질전환된 세포를 전달함으로써, 대상체에서 인자 IX 폴리펩티드의 생체이용성을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
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