KR20200007777A - 대상체의 흡연 상태를 구별하기 위한 진단 테스트 - Google Patents

Abstract

대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치가 본원에서 개시되어 있고, 상기 장치는 생물학적 시료에서 2개 또는 3개의 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 특이적으로 검출하기 위해 고체상에 증착된 복수의 상이한 특이적 결합 분자를 포함하고 있으며, 상기 바이오마커는 (i) 코티닌 및 총 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄올 (NNAL); (ii) 코티닌 및 N-아세틸-S-[2-카르복시에틸]-L-시스테인 (CEMA); 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA으로 구성되어 있다.

Description

대상체의 흡연 상태를 구별하기 위한 진단 테스트

본 발명은 일반적으로 생물 진단 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상체의 흡연 상태를 결정하거나 구별하기 위한 방법, 장치, 시스템 및 키트에 관한 것이다.

담배가 연소되기보다는 가열되는 다수의 에어로졸 발생 물품이 본 기술 분야에서 제안되었다. 가열식 흡연 물품에서, 담배와 같은, 기재를 가열하여 에어로졸이 발생된다. 많은 연구에 따르면 열분해 및 연소 온도 아래까지 담배를 가열하면 궐련 연기에서 발견되는 일부 독성물을 줄이거나 제거할 가능성이 있음을 알 수 있다. 일반적으로 300°C보다 낮은 온도에서, 담배를 태우는 것 대신 가열하는 것은 니코틴을 방출하기에 충분하지만, 상당한 열분해를 일으키기에 충분히 높지는 않다. 이러한 온도에서, 에어로졸 조성물은 궐련 연기에서 발견되는 것보다 더 단순해진다. 궐련 연기 내의 많은 유해하고 잠재적으로 유해한 성분들(HPHC)은 담배의 연소로 인해 형성된다. 따라서, 온도를 낮추고 태우는 대신에 담배를 가열하는 것은 HPHC를 실질적으로 감소시키거나 제거할 수 있다. 공지된 가열식 에어로졸 발생 물품은, 예를 들어 전기 가열식 에어로졸 발생 물품 및 가연성 연료 요소 또는 열원으로부터 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 재료로의 열 전달에 의해서 에어로졸이 발생되는 에어로졸 발생 물품을 포함한다. 흡연하는 동안, 휘발성 화합물은 연료 요소로부터의 열 전달에 의해서 에어로졸 형성 기재로부터 방출되어 에어로졸 발생 물품을 통해 흡인된 공기에 연행된다. 방출된 화합물은 냉각되면서 응축되어, 소비자에 의해 흡입되는 에어로졸을 형성한다. 담배 재료, 담배 추출물 또는 다른 니코틴 공급원으로부터 연소 없이, 그리고 일부 경우에는, 예를 들어 화학 반응을 통한 가열 없이 니코틴 함유 에어로졸이 발생되는 에어로졸 발생 물품 또한 알려져 있다.

담배가 연소되기보다는 가열되는 이러한 무연 대체물(예를 들어, 가열되지만 태우지 않는 제품)은 종래의 궐련에 대해 흡연자에게 대안을 제공하며, 이는 여전히 니코틴을 전달하면서 담배로부터 방출된 유해한 화학물질을 감소시킬 수도 있다.

본 기술분야에서는, 대상체의 흡연 상태를 구별하거나 결정하기 위한 신속하고, 비용 효율적이며, 사용하기 쉬운 진단 테스트가 필요하다. 예를 들면, 본 기술분야에서는 통상의 궐련의 현재 흡연자를, 무연 대체물로 전환했거나 담배를 끊은 사람들과 구별하거나 결정할 필요가 있다. 이러한 테스트는 다양한 응용 분야를 가질 것이다. 예를 들어, 테스트는 그들의 흡연 상태에 기초하여 대상체를 식별하고 스크리닝하기 위한 임상 시험에서 사용될 수 있다. 추가적인 예로서, 테스트는, 무연 대체물로서 전환하고 전환을 준수하는지 모니터링하기 위한 순응준수 테스트로서 보장 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 이들 및 다른 요구를 다루고자 한다.

대상체의 흡연 상태를 구별하거나 결정하기 위해 적어도 두 개의 대사산물이 검출되는 방법, 장치, 시스템 및 키트가 본원에 개시되어 있다. 대사산물은 담배 연기 노출 바이오마커로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 종래의 궐련의 현재 흡연자는 무연 대체물(예를 들어, 가열되지만 태우지 않는(heat-not-burn) 제품)로 전환했거나 담배를 끊은 대상체와 구별될 수 있다. 또 다른 예로서, 무연 대체물 흡연자는 담배를 끊은 대상체와 구별할 수 있다. 약 2일의 흡연 절제(smoking abstinence) 후 소변, 타액 또는 혈액에서 더 이상 검출 가능하지 않지만, 무연 대체물로 전환한 이들에게서 여전히 존재할 코티닌(cotinine) 이외에, 하나 이상의 다른 담배 연기 노출 바이오마커가 소변에서 검출될 수 있다. 이러한 대사산물의 한 가지는 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄올 (4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol, NNAL)이며, 이것은 보통 17시간으로 추정되는 반감기를 갖는 소변에서 측정되는, 니코틴-유래 니트로사민 케톤 (nicotine-derived nitrosamine ketone, NNK) (4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone), 담배 특이 니트로사민으로도 공지됨)의 대사산물이다. 또 다른 대사산물은 아크릴로니트릴(가연성 담배 제품으로부터의 휘발성 화합물)의 대사산물인, 2-시아노에틸메르캅투산(2-cyanoethylmercapturic acid, CEMA)이다. 소정의 구현예들에서, 코티닌 및 총 NNAL 만 측정된다. 즉, 코티닌 및 총 NNAL는 담배 연기 노출 바이오마커로서 배타적으로 측정된다. 총 NNAL은 NNAL 및 NNAL-Gluc를 의미한다. 소정의 구현예들에서, 코티닌 및 CEMA 만 측정된다. 즉, 코티닌 및 CEMA는 담배 연기 노출 바이오마커로서 배타적으로 측정된다. 소정의 구현예들에서, 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 만 (배타적으로) 측정된다. 즉, 총 NNAL 및 CEMA는 담배 연기 노출 바이오마커로서 배타적으로 측정된다. 따라서, 담배 연기 노출 바이오마커로서 검출될 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로만 구성되어 있다. 즉, 담배 연기 노출 바이오마커로서 검출될 대사산물은 배타적으로 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA이다. 이들 대사산물은 개체의 흡연 상태에 대한 표지이며, 무연 제품으로 전환시 시간에 따라 소변으로부터 사라지지만, 니코틴 대사산물은 존재하는 상태로 유지된다. 한 구현예에서, 진단 테스트는 24시간 소변과 같이, 소변을 이용한다. 적합하게는, 진단 테스트는 코티닌; 및 총 NNAL 및/또는 CEMA을 위한 2개 또는 3개의 판독을 제공한다. 적합하게는, 진단 테스트는 코티닌; 및 총 NNAL 및/또는 CEMA을 위한 2개 또는 3개의 판독; 및 소변에 임의의 담배 대사산물을 가지고 있지 않은 대상체에 대해 테스트가 작동한다는 것을 입증하기 위한 양성 대조군을 위한, 3개 또는 4개의 판독을 제공한다. 양성 대조군은, 예를 들어, 크레아티닌 또는 알부민 또는 소변 특이적 단백질 - 예컨대 탐-호스폴 단백질(Tamm-Horsfall protein, THP)일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 테스트될 시료의, 무결성, 특히 미-변질을 측정하기 위한 대조군과 같은, 다른 형태의 대조군이 추가되거나 포함될 수 있다.

일 측면에서, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치가 기재되어 있으며, 여기서 상기 장치는 생물학적 시료에서 2개 또는 3개의 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기 위해 고체상(solid phase) 상에 증착된 복수의 상이한 특이적 결합 분자를 포함하고 있고, 상기 담배 연기 노출 바이오마커는: (i) 코티닌 및 총 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄올 (NNAL); 또는 (ii) 코티닌 및 N-아세틸-S-[2-카르복시에틸]-L-시스테인 (CEMA); 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA으로 구성되어 있다.

적절하게는, 상기 장치는 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치, 바람직하게는, 경쟁 면역분석을 수행하도록 구성되어 있는 딥스틱(dipstick)이다.

적절하게는, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치는 다음을 포함하고 있다: (i) 시료 패드; (ii) 접합체 패드; 및 (iii) 적어도 하나의 검출 구역.

적합하게, 접합체 패드는 각각 다음을 개별적으로 결합할 수 있는 표지된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA, 적합하게, 여기서 상기 표지된 특이적 결합제의 각각은 항체 또는 그의 단편, 앱타머(aptamer), 광앱타머, 아피머(affimer), 단백질, 펩티드, 펩티드모방체(peptidomimetic) 또는 소분자이다.

적절하게는, (a) 접합체 패드는 각각 대사산물을 개별적으로 결합할 수 있고: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA, 및 표지된 특이적 결합제 대사산물 접합체를 형성할 수 있는, 상부에 증착된 표지된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있으며; 그리고 (b) 검출 구역은 각각 대사산물에 개별적으로 결합할 수 있는 고정화된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다.

적절하게는, (a) 접합체 패드는 상부에 증착된 표지된 대사산물(들)을 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있으며, 상기 표지된 대사산물(들)은: (i) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체; 또는 (ii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체; 또는 (iii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체로 구성되어 있으며; 그리고 (b) 검출 구역은 각각 다음을 개별적으로 결합할 수 있는 고정화된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다: (i) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL 및 CEMA.

적절하게는, 특이적 결합제 분자는 유색 입자, 적절하게는 금 나노입자로 표지되어 있고, 선택적으로, 특이적 결합제 분자들 각각에 대한 표지는 동일하거나 상이하다.

적절하게는, 임계값은 다음과 같다: (i) 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상 및 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상 또는 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상; 또는 (ii) 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상 및 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상 및 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상.

적절하게는, 상기 장치는 다음을 검출하기에 적합하다: (i) 약 200 내지 800ng/ml의 양의 24시간 소변 코티닌; 또는 (ii) 24시간 소변 내 약 10 내지 125 pg/ml의 양의 24시간 소변 NNAL; 또는 (iii) 약 5 내지 80ng/ml의 양의 24시간 소변 CEMA; 또는 (iv) (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개의 조합.

적절하게는, (i) 장치의 테스트 라인(들) 상의 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았으며 비-흡연 대상체에 대한 표시임을 나타내며; (ii) 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었음을 나타내며 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았으며 가열된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시임을 나타내며; (iii) 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었으며 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시임을 나타낸다.

또 다른 측면에서, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치가 개시되어 있고, 상기 장치는: (a) 본원에서 설명하는 장치를 수용하기에 적합한 수용기; (b) 장치의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기에 적합한 이미징 장치; 및 (c) 적어도 하나의 디지털 이미지를 처리하기에 적합한 프로세서를 포함하고 있다.

다른 측면에서, (a) 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상의 양에 대한 참조 값 또는 기준선 값을 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있으며, 상기 참조 값 또는 기준선 값은 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 대사산물의 공지된 양을 나타내는 것인, 컴퓨터 데이터 저장소; 및 (b) 상기 데이터 저장소에 접근하고 대상체로부터의 시료 내의 대사산물의 양에 대한 정보와 조합하여 상기 데이터 저장소로부터의 정보를 사용하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하도록 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 포함하고 있는 시스템이 개시되어 있다.

다른 측면에서, 본원에 설명하는 장치 및 선택적으로 키트를 작동시키기 위한 지침서 세트 및 선택적으로 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 지침서 세트를 포함하고 있는 키트가 개시되어 있다.

다른 측면에서, 본원에서 설명하는 장치의 사용을 포함하고 있는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법이 개시되어 있다.

다른 측면에서, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법이 개시되어 있고, 상기 방법은: (a) 시료 내의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 양을 검출하고, 여기서 상기 대사산물은 코티닌 및 NNAL 및 CEMA로 구성되어 있고, 상기 시료를 항-코티닌 및 항-NNAL 및 항-CEMA 특이적 결합제와 접촉시키고 결합을 검출하는 것을 포함하고 있는, 단계; 및 (b) 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하고 있고; 여기서, 상기 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 10.6 내지 41.5ng/ml이면 흡연 절제자에 대한 표시이고; 그리고 총 NNAL 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 37.7pg/ml 내지 115pg/ml이고 CEMA 양이 24시간 소변에서 약 31.1ng/ml와 90ng/ml이면 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시이고; 그리고 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 652.5 내지 1115ng/ml ng/ml 이상이면 가열된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시이다.

또한, 대상체의 흡연 상태 변화의 진행을 모니터링하는 방법이 또한 개시되어 있고, 상기 방법은: (i) 본 명세서에서 설명하는 방법을 대상체로부터의 적어도 2개의 생물학적 시료로 수행하고, 여기서 각각의 시료는 상이한 시점에서 취해진 것인, 단계; 및 (ii) 상이한 시점 각각에 대해 취해진 측정을 비교하는 단계를 포함하고 있고, 여기서 시간 경과에 따른 측정값의 변화는 대상체의 흡연 상태가 시간이 지남에 따라 변했다는 표시이다.

대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법이 또한 개시되어 있고, 상기 방법은: (i) 대상체로부터 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양의 값을 대표하는 데이터를 수신하되, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계; (ii) 컴퓨터 상의 데이터 저장소에 접근하되, 상기 데이터 저장소는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 진단인 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA의 양에 대한 참조 또는 기준선 값을 포함하고 있는, 단계; 및 (iii) (i) 단계에서 수신된 데이터를 (ii) 단계의 컴퓨터 상의 데이터 저장소 내의 참조 또는 기준선 값과 비교하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하고 있다.

또한, 대상체의 흡연 상태를 구별하거나 결정하는 방법이 개시되어 있고, 상기 방법은: (i) 대상체로부터 시료를 수득하거나 제공하는 단계; (ii) 상기 시료를 항-코티닌 및 항-총 NNAL 및/또는 항-CEMA 항체 또는 그의 단편과 접촉시키고, 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA와 상기 항체 사이의 결합을 검출하여, 상기 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 검출하는 단계로, 여기서 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로 구성되어 있는, 단계; 및 (iii) 상기 시료 내의 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA의 존재를 검출하는 것에 기초하여 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하고 있다.

추가 측면은 대상체의 흡연 상태를 결정하고 및 하나 이상의 치료제를 투여해서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: (i) 대상체로부터 시료를 수득하거나 제공하는 단계; (ii) 2개 또는 3개의 대사산물이 상기 시료 내에 존재하는지 여부를 검출하고, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로 구성되어 있는, 단계; (iii) 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계; 및 (iv) (iii)에서 수득된 결과에 따라, 하나 이상의 치료제의 유효량을 투여해서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 단계를 포함하고 있다.

추가 측면은 대상체에서 종래의 궐련의 흡연을 진단하고 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은: (i) 대상체로부터 시료를 수득하는 단계; (ii) 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상이 상기 시료 내에 존재하는지 검출하는 단계; 및 (iii) 흡연자로 진단된 대상체에서, 하나 이상의 치료제의 유효량을 투여해서 상기 대상체에서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 단계를 포함하고 있다.

본 방법들은 대상체로부터 얻어진 시료에 대해 특정한 시험관 내 또는 생체 외 처리 및 분석 단계들을 적용한다는 점에서 시험관 내 또는 생체 외 용도로서 적절히 자격을 갖추고 있을 수 있다.

상기 방법은 둘 이상의 연속하는 시점에서 대상체에게 수행될 수 있고, 상기 연속하는 시점에서 각각의 결과는 비교될 수 있고, 이에 따라 상기 연속적인 시점에서 코티닌, 총 NNAL 및/또는 CEMA 검출 간의 변화의 존재 또는 부재가 결정된다. 적용되었을 때, 상기 방법은 시간 경과에 따라 대상체에서 코티닌, 총 NNAL 및/또는 CEMA의 검출의 변화를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 기준선 또는 참조 값과 비교하여 대상체로부터의 시료 내 대사산물(들) 양의 편차는 대상체의 흡연 상태에 대한 표시일 수 있다.

소정의 구현예들에서, 예를 들어, 임상의 또는 회사가, 어떠한 조치를 취할지에 대한 결정이, 상기 검출을 고려하여 컴퓨터에 의해 수행된다. 소정의 구현예들에서, 컴퓨터는 결과 및/또는 취해야 할 조치를 보고하는 데 사용될 수 있다.

소정의 구현예들에서, 대상체의 시료에서 측정된 각각의 특이적 대사산물 레벨에 기인한 0과 1 사이의 개별 점수의 합에 기초하여, 알고리즘이 개발될 수 있다. 그런 다음, 상기 합이 소정의 임계값을 넘는 경우에 흡연 상태가 예측될 수도 있다. 일부 구현예에서, 각각의 개별 대사산물 점수의 중량은 알고리즘의 성능을 개선하도록 조정될 수 있다.

또한 다음을 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 키트가 제공되어 있고, 상기 키트는: (i) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기에 적합한 제1 장치로, 여기서 상기 담배 연기 노출 바이오마커는 코티닌으로 구성되어 있는, 제1 장치;(ii) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 검출하기에 적합한 제2 장치로, 여기서 상기 담배 연기 노출 바이오마커는 NNAL으로 구성되어 있는, 제2 장치; 및/또는(iii) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 검출하기에 적합한 제3 장치로, 여기서 상기 담배 연기 노출 바이오마커는 CEMA로 구성되어 있는, 제3 장치; 및 선택적으로, 상기 키트를 작동시키기 위한 지침서 세트 및 선택적으로 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 지침서 세트를 포함하고 있다.

몇몇 장점들

본 발명은, 대상체의 흡연 상태를 결정하거나, 판독하거나 구별하기 위한 신속하고, 비용 효율적이며, 사용하기 쉬운 진단 테스트를 제공하고 있다.

본 발명은 대상의 흡연 상태를 결정하기 위한 다른 테스트에 비해 개선된 차별적 능력을 가질 수 있다.

본 발명은 집단 내 소정의 유형의 대상체들의 흡연 상태를 결정하기 위해 개선된 차별적 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 차별적 능력은 소정의 인종 그룹에서 또는 소정의 연령 집단에서 더 클 수 있다.

유리하게는, 본 발명은 소변 총 NNAL, 소변 CEMA 및 소변 코티닌의 동시 검출을 허용할 수 있다. 특히, 본 발명은 대상체의 흡연 상태를 결정하거나 구별하기 위해 24시간 소변 내 약 10 내지 125pg/ml의 양의 소변 총 NNAL 및 약 5 내지 80ng/ml의 양의 24시간 소변 내 소변 CEMA 및 약 200 내지 800ng/ml의 양의 소변 코티닌의 동시 검출을 허용할 수 있다. 본 발명은 멘톨화 및 비멘톨화 흡연 제품을 사용하는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위해 개선된 차별적 능력을 가질 수 있다. 멘톨 궐련은 일반적으로 비멘톨화 궐련과 유사한 방식으로 구성되어 있으며, 제조 공정 동안 여러 단계 중 어느 하나에서 멘톨이 첨가된 것이다. 멘톨은 예를 들어, 증류시킨 옥수수 민트 오일로부터 유래하거나 또는 합성하여 생산될 수 있다. 멘톨 궐련은 통상적으로 적어도 0.3 중량%의 멘톨 함량을 갖는다. 저-타르 멘톨 궐련은 최대 2%의 멘톨 레벨을 가질 수 있다. 비멘톨화 궐련용 담배 블렌드와 비교하여, 멘톨 궐련은 벌리종 담배보다 더 많은 황색종, 및 더 적은 오리엔트종 담배를 갖는 경향이 있다.

도 1: CEMA: 박스의 하단은 제1 사분위수(관찰값들 중 25%가 놓이는 값)이며, 상단은 제3 사분위수(관찰값들 중 75%가 놓이는 값)이며, 중간 막대는 관찰값들의 중간값이다. 수염들은 관찰된 최소값 및 관찰된 최대값 각각으로 연장되어 있다.
도 2: 총 NNAL: 박스의 하단은 제1 사분위수(관찰값들 중 25%가 놓이는 값)이며, 상단은 제3 사분위수(관찰값들 중 75%가 놓이는 값)이며, 중간 막대는 관찰값들의 중간값이다. 수염들은 관찰된 최소값 및 관찰된 최대값 각각으로 연장되어 있다.
도 3: 유리 코티닌: 박스의 하단은 제1 사분위수(관찰값들 중 25%가 놓이는 값)이며, 상단은 제3 사분위수(관찰값들 중 75%가 놓이는 값)이며, 중간 막대는 관찰값들의 중간값이다. 수염들은 관찰된 최소값 및 관찰된 최대값 각각으로 연장되어 있다.
도 4: 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 측방향 유동테스트 스트립을 함유한 딥스틱의 실시예. 이 예시적인 구현예에서, 3개의 상이한 딥스틱을 사용하여, 대상체의 3가지 상이한 흡연 상태를 결정한다. 한 구현예에서, 딥스틱은 10-125pg/ml 양의 24시간 소변 내 소변 총 NNAL 및 5-80ng/ml 양의 24시간 소변 내 소변 CEMA를 검출할 만큼 충분히 민감하다. 또 다른 구현예에서, 딥스틱은 10-125pg/ml 양의 24시간 소변 내 소변 총 NNAL 및 5-80ng/ml 양의 24시간 소변 내 소변 CEMA 및 200-800ng/ml 양의 소변 코티닌을 검출할 만큼 충분히 민감하다. 흡연 상태를 딥스틱을 사용하여 추론할 수 있다.
도 5: 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 측방향 유동테스트 스트립을 함유한 딥스틱의 실시예. 이 예시적인 구현예에서, 단일 딥스틱을 사용하여, 대상체의 3가지 상이한 흡연 상태를 결정한다. 단일 딥스틱은 장치에 담긴 측방향 유동 테스트 스트립의 대향 말단들에서 시료 패드 형태의 다공성 요소, 및 하나 이사의 흡수 패드 형태의 다공성 요소를 포함하고 있다. 이는 코티닌 콜로이드 금 접합체(CGC), 총 NNAL CGC 및 CEMA CGC를 포함하고 있는 시료 다공성 요소에 인접하여 하류에 (시료의 유동 방향으로) 접합체 패드 형태의 다공성 요소를 더 포함하고 있다. 필요에 따라, 다른 종류의 표지를 사용할 수 있다. 접합체 다공성 요소에 인접하여 하류에, 3개의 순차적으로 배열된 테스트 라인이 검출 구역에 포함되어 있다. 하나의 제1 테스트 라인(1)은 항-코티닌 단클론 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이 테스트 라인은 검출의 임계값이 약 200ng/ml 이상의 임계값 양에서 넘었음(예를 들어, 분석 포맷에 따라 사라지거나 나타남)을 나타내도록 구성될 수 있다. 다음의 제2 테스트 라인(2)은 항-총 NNAL 단클론 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이 테스트 라인은 검출의 임계값이 약 10pg/ml 이상의 임계값 양에서 넘었음(예를 들어, 분석 포맷에 따라 사라지거나 나타남)을 나타내도록 구성될 수 있다. 하나의 제3 테스트 라인(3)은 항-CEMA 단클론 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이 테스트 라인은 검출의 임계값이 약 5ng/ml 이상의 임계값 양에서 넘었음(예를 들어, 분석 포맷에 따라 사라지거나 나타남)을 나타내도록 구성될 수 있다. 필요에 따라, 대조군 라인도 포함될 수 있다. 필요에 따라, 다른 종류의 특이적 결합제를 사용할 수 있다.
도 6: 경쟁 포맷으로 도 5의 딥스틱을 사용하여 얻어질 수 있는 테스트 해석 결과의 실시예. 대상체의 흡연 상태와 관련될 수 있는 예시적인 해석 실시예는 다음과 같다: ‘음성’ 표지된 박스 = 코티닌 테스트 라인, NNAL 테스트 라인, CEMA 테스트 라인에서의 가시적 표시들은 검출의 임계값이 통과되지 않았으며 비-흡연 대상체에 대한 표시임을 나타내며; “코티닌 양성” 표지된 박스 = 코티닌의 가시적 표시 없음은 검출의 임계값이 통과되었음을 나타내며; NNAL 라인에서 가시적 표시 없음, CEMA 라인에서 가시적 표시 없음은 검출의 임계값이 통과되지 않았으며 가열된 담배(에어로졸)에만 노출된 대상체에 대한 표시임을 나타내며; ‘코티닌 및 총 NNAL 양성 및/또는 코티닌, 총 NNAL 및 CEMA 양성’ 표지된 박스 = 코티닌 및 총 NNAL에서 가시적 표시 없음은 검출의 임계값이 통과되었음을 나타내거나 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA에서 가시적 표시 없음은 검출의 임계값이 통과되었으며 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시임을 나타낸다.

정의

본 발명에 사용된 바와 같은 단락 앞머리들은 단지 편성을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적인 용어 및 과학적인 용어들은 당업자가 보편적으로 의미하는 것과 동일한 의미를 가진다. 상충하는 경우, 정의를 비롯한 본 문헌이 좌우할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되어 있으며, 그렇더라도 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적일 뿐, 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태들(“a”, “an”, 및 “the”)은 달리 그 내용을 명확하게 기술하지 않는 한, 단수와 복수의 지시 대상을 포함하고 있다.

용어 “및/또는”은 (a) 또는 (b) 또는 (a) 및 (b)를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "포함하는", "포함한다" 및 "구성되어 있는"은 "포함하고 있는", "포함하고 있다" 또는 "함유하는", "함유한다"와 동의어이며, 포괄적이거나 끝이 개방된 것이며, 추가적인, 인용되지 않은 부재, 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 용어 “구성되어 있는(consisting of)”은 추가 구성요소가 제외되고 인용된 요소만 가지며 더 이상 없다는 것을 의미한다.

종점에 의한 수치 범위의 언급은 인용된 종점뿐만 아니라 각각의 범위 내에 포함되는 모든 숫자와 분획을 포함하고 있다.

변수, 양, 일시적인 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용된 용어 "약"은 지정된 값과 그로부터의 변형, 특히 그러한 변형이 본 개시에서 수행하기에 적절한 한, 지정된 값과 그로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변형을 포함하는 것을 의미한다. 수정자 "약"이 지칭하는 값은 또한 그 자체로 구체적으로, 바람직하게 개시되는 것을 이해해야 한다.

부재들의 그룹의 하나 이상의 부재와 같은, “하나 이상의”라는 용어는, 그 자체로 명확하지만, 추가 예시에 의해, 특히 상기 부재 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 부재 중 임의의 2개 이상, 예를 들어, 상기 부재 중 임의의 ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 또는 ≥7개 등등 및 최대 상기 부재들 전부에 대한 참조를 포괄하는 것이다.

용어 "흡연자"는 지난 5년간 담배 제품을 흡연한 대상체를 나타낸다. 흡연자는 일반적으로 현재 흡연자가 될 것이다. 적절하게는, 흡연자는 그/그녀의 생애 적어도 100개의 담배 제품을 흡연하고, 현재 매일 또는 며칠 마다(매일 아님) 담배를 피울 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "비-흡연자"는 이전에는 흡연자였지만 지난 5년간 담배 제품을 피우지 않은 대상체를 의미한다. 비-흡연자는 흡연을 절제한(abstained) 것으로 간주될 것이다.

용어 "대사산물"은 당업계에 널리 공지되어 있고 대사에 의해 또는 대사 공정에 의해 생성된 임의의 물질을 광범위하게 나타낼 수 있다. 다른 방식으로 표현하면, 대사산물은 대사로부터 발생하는 최종 생성물이다. 상기 용어는 또한 대상체에서의 정성적 및/또는 정량적 평가가 단독으로 또는 다른 데이터와 조합하여, 스위칭 준수에 관한 대상체의 상태에 대하여 정보를 주는, 대사산물의 검출 가능한 부분을 포함하고 있다, 대사산물은 통상적으로 가연성 담배 제품으로부터 유래된 소분자이다. 대사산물의 모니터링은 특히 시간이 지남에 따라 대상체의 스위칭 준수의 진행이 시간이 지남에 따라 결정되도록 할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 통상적으로 인간을 가리키지만, 비인간 동물, 바람직하게는 항온 동물, 더욱 바람직하게는 태생 동물, 더욱 더 바람직하게는 포유류, 예를 들어, 비-인간 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포괄할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "시료" 또는 "생물학적 시료"는 대상체로부터 얻어진 임의의 생물학적 시편을 포함하고 있다. 시료는, 제한하지 않고, 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구(예, 말초 혈액 단핵 세포), 타액, 소변, 대변(즉,, faeces), 눈물, 땀, 피지, 유두 흡인액(nipple aspirate), 유관 세척액(ductal lavage), 종양 분비물, 활액(synovial fluid), 뇌척수액, 림프액, 미세바늘 흡인액(fine needle aspirate), 양수, 임의의 기타 체액, 손톱 깎은 물질, 세포 용해물, 세포 분비 산물, 염증 유체, 질 분비, 또는 예컨대 바람직하게는 태반 생검과 같은 생검을 포함할 수 있다. 바람직한 시료는 검출 가능한 양으로 본원에 교시된 임의의 하나 이상의 대사산물을 포함하고 있는 것을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 시료는 전혈 또는 예를 들어, 혈장, 혈청, 또는 세포 펠릿과 같은, 그의 분획 성분일 수 있다. 바람직하게는, 시료는 최소 침습 방법에 의해 쉽게 수득될 수 있어서, 대상체로부터 상기 시료를 검출, 제거 또는 단리시킬 수 있다. 시료는 또한 조직 시료 및 생검, 조직 균질물 등을 포함할 수 있다. 용어 “혈장”은 일반적으로 세포를 포함하지 않지만, 영양소, 당, 단백질, 미네랄, 효소 등을 함유하여, 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)가 정상적으로 현탁되는 혈액의 실질적으로 무색 수액을 의미한다. 가장 적합한 구현예에서, 시료는 수득하기 쉽고 비-침습성이므로 24시간 소변과 같은 소변이다. 24시간 소변 채취는 24시간 전체 기간에 걸쳐 피험자의 소변을 용기에 채취하여 수행된다.

대사산물과 같은 분자는, 상기 분자 또는 상기 분자 군의 존재 또는 부재 및/또는 수량이 바람직하게는 다른 분자를 실질적으로 배제하고, 시료에서 검출되거나 결정될 때, 시료에서 "측정된다". 예를 들어, 대사산물은 본원에 기술된 실험실 테스트에 의해 측정될 수 있다.

용어 "수량", "양" 및 "수준"은 당업계에서 동의어이고 일반적으로 잘 이해된다. 대사산물, 분자 또는 분석물과 관련하여, 용어들은 시료 내의 대사산물, 분자 또는 분석물의 절대 정량화를 지칭할 수 있거나, 특히 즉, 다른 값에 대해 상대적인, 예컨대 본원에 교시된 기준선 또는 참조 값에 대해 상대적인, 시료 내의 대사산물, 분자 또는 분석물의 상대 정량화를 지칭할 수 있거나, 대사산물, 분자 또는 분석물의 기준-선 표현을 나타내는 값들의 범위를 지칭할 수 있다. 이들 값 또는 범위는 단일 대상체로부터 또는 대상체 군으로부터 얻어질 수 있다. 시료 내의 대사산물, 분자 또는 분석물의 절대 양은 유리하게는 중량 또는 몰 양으로, 또는 보다 일반적으로 농도, 예를 들어 부피 당 중량 또는 부피 당 몰로 표현될 수 있다.

검출의 맥락에서 용어 “임계값”은 소정의 또는 정의된 양 또는 수량 또는 농도에 도달되거나 넘는 지점을 의미한다. 예를 들어, 면역분석 장치 상의 테스트 라인은 임계값 양 또는 수량 또는 농도에 도달되거나 넘을 때 가시적 변화를 생성하도록 구성될 수 있다.

용어 “소분자”는 일반적으로 약제에서 사용되는 유기 분자에 필적하는 크기를 갖는, 화합물, 바람직하게는 유기 화합물을 지칭한다. 이 용어는 생물학적 거대분자(예를 들어, 단백질, 핵산 등)을 배제한다. 바람직한 소형 유기 분자는 최대 약 5000 Da, 예를 들어, 최대 약 4000, 바람직하게는 최대 3000 Da, 더욱 바람직하게는 최대 2000 Da, 더욱 더 바람직하게는 최대 약 1000 Da, 예를 들어, 최대 약 900, 800, 700, 600 또는 최대 약 500 Da 크기 범위이다.

본원에서 사용된 용어 "단리된(isolated)"은 바람직하게는 또한 "정제된" 한정자(qualifier)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 대사산물을 참조하여 용어 "정제된"은 절대 순도를 필요로 하지 않는다. 대신에, 이러한 대사산물(들)이 다른 분자들에 비해 그들의 풍부함(편리하게 질량 또는 중량 또는 농도 면에서 표현됨)이 생물학적 시료에서 보다 큰 개별 환경에 있다는 것을 나타낸다. 개별 환경은 단일 매질, 예컨대 예를 들어 단일 용액, 겔, 침전물, 동결건조물, 등을 나타낸다. 정제된 대사산물은, 예를 들어 크로마토그래피, 예비 전기영동, 원심분리, 침전, 친화도 정제, 등에 의해 얻어질 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "특이적으로 결합한다"는, 제제(본원에서 "특이적 결합제"라고도 나타냄)가, 무작위적이거나 관련되지 않은, 다른 분자를 실질적으로 배제하고, 선택적으로 구조적으로 관련되는 다른 분자를 실질적으로 배제하고 하나 이상의 원하는 분자에 결합하는 것을 의미한다. 용어 "특이적으로 결합한다"는 제제가 그것이 의도한 타겟(들)에 배타적으로 결합하는 것을 반드시 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 결합 조건 하에서 이러한 의도된 타겟(들)에 대한 제제의 친화성이 비-타겟 분자에 대한 그의 친화성보다 적어도 약 2배 크고, 바람직하게는 적어도 약 5배 크고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10배 크고, 더욱 바람직하게는 적어도 약 25배 크고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 50배 크고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 100배 큰 경우 관심있는 타겟(들)에 제제가 특이적으로 결합한다고 말할 수 있다. 특이적 결합제의 예는 항체 또는 그의 단편, 앱타머, 아피머, 광앱타머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자이다. 바람직한 특이적 결합제는 항체 또는 그의 단편, 앱타머 또는 아피머이다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 일반적으로 임의의 면역 결합제를 의미한다. 용어는 무손상 단클론 항체, 다클론 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된, 다가(예를 들어, 2-가, 3-가 또는 그 이상-가) 및/또는 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중-특이적 또는 그 이상-특이적 항체) 및 원하는 생물학적 활성(특히, 관심있는 항원을 특이적으로 결합하는 능력)을 나타내는 한 항체 단편 뿐만 아니라, 이러한 단편들의 다가 및/또는 다중-특이적 복합물을 포괄한다. 용어 "항체"는 면역화를 포함하고 있는 방법들에 의해 생성된 항체를 포함할뿐만 아니라, 관심있는 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하도록 만들어진, 임의의 폴리펩티드, 예를 들어 재조합으로 발현된 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 이 용어는 그것이 시험관 내 또는 생체 내에서 생산되는지 여부와 관계없이 이러한 분자에 적용된다.

용어 “앱타머(aptamer)”는 펩티드 같은 타겟 분자에 특이적으로 결합할 수 있는, 단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고-DNA, 올리고-RNA 또는 올리고-DNA/RNA 또는 이의 임의의 유사체를 지칭한다. 유리하게는, 앱타머는 타겟에 대해 상당히 높은 특이성과 친화성을 보여줄 수 있다 (예를 들어, 1×10⁹ M^-1 순 K_A). 앱타머 생산은 특히 미국 특허 제5,270,163호; Ellington & Szostak 1990 (Nature 346: 818-822); Tuerk & Gold 1990 (Science 249: 505-510); 또는 “The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications”, by Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592에 기술되어 있다. 용어 "광앱타머(photoaptamer)"는 타겟 분자와 공유 결합하거나 가교결합할 수 있는 하나 이상의 광반응성 작용기를 함유하는 앱타머를 지칭한다.

“조사 기간”과 관련하여, 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 기준선 측정을 행한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 그런 다음, 조사 기간이 시작된다. 용어 “아피머(affimer)”는 항체와 유사한 특이성 및 친화성을 가지고 이의 타겟 분자를 결합하는 고도로 안정적인 단백질을 지칭한다. 이들은 단클론 항체의 인식 능력을 모방하도록 설계된 조작된(engineered) 비-항체 결합 단백질이다. 예를 들어, 이러한 조작된 단백질은 약 12-14 kDa일 수 있고, 식물의 시스타틴 A의 컨센서스 서열에 기초할 수 있다(Avacta, 캠브리지, 영국). 예를 들면 Tiede 등, eLife (2017) 6: e24903; WO2006/131749, WO2009/136182 및 WO2014/125290을 참조한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 단락 앞머리들은 단지 편성을 위한 것이며, 제한하려는 것이 아니다.

대사산물

본원에 기술된 담배 연기 노출 바이오마커로서 사용되는 대사산물에 대한 각각의 양 또는 측정값은 동시에, 별도로 또는 개별적으로 평가될 수 있다. 적절하게는, 본원에 기술된 대사산물은 사실상 동시에 또는 동시에 평가된다. 적절하게는, 본원에 기술된 대사산물은 시간 상 동일한 지점에 평가된다. 대사산물(들)의 양을 사용하여, 대상체가 종래의 궐련의 현재 흡연자인지를 확립할 수 있다. 대사산물(들)의 양을 사용하여, 대상체가 무연 대체물의 소비자인지를 확립할 수 있다. 대사산물(들)의 양을 사용하여, 대상체가 흡연을 절제했는지를 확립할 수 있다. 편리하게, 이는 단일 테스트에서 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 대사산물의 양을 사용하여, 유리하게는 무연 대체물로 전환한 사람들이나 흡연을 절제한 사람들로부터 종래의 궐련의 현재 흡연자를 구별하기 위한 대상체에 대한 스위칭 프로파일을 확립할 수 있다. 스위칭 준수 거동을 시간 경과에 따라 평가하여 스위칭 거동의 진행을 모니터링할 수 있다.

대사산물은 코티닌 및 총 NNAL, 또는 코티닌 및 CEMA, 또는 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA을 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있거나 이들로 필수적으로 구성되어 있을 수 있다. 적합하게는, 대사산물은 배타적으로 코티닌 및 총 NNAL, 또는 배타적으로 코티닌 및 CEMA, 또는 배타적으로 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA일 수 있다. 따라서, 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL로 구성되어 있거나, 또는 코티닌 및 CEMA로 구성되어 있거나, 또는 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 구성되어 있다. 소정의 구현예들에서, 이 대사산물들의 이성질체 형태 (예컨대 입체 이성질체 및/또는 기하 및/또는 광학 이성질체 및 이들의 혼합물), 화학적 유도체, 모방체, 변이체, 용매화물 및 염을 포함하려는 것이다.

담배 연기 노출 바이오마커로서 사용되는 대사산물을 검출하는 것 이외에, 시료의 보다 일반적인 특성들을 동시에, 별개로 및/또는 개별적으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 시료의 변질 또는 희석을 테스트하기 위해, 소정의 특징들이 검출될 수 있다. 예를 들어, 소변 시료의 경우, pH, 비중, 산화제, 아질산염, 글루타르알데히드 및 크레아티닌 수준 중 하나 이상과 같은 특징이 소변 시료에서 측정될 수 있다. 이러한 보다 일반적인 특징들은 예를 들어, 추가 측방향 유동테스트 스트립 등을 장치 내로 포함시켜서, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치를 사용하여 검출될 수 있다.

코티닌(cotinine)

니코틴은 피리딘 및 피롤리딘 고리로 구성되어 있는 삼차 아민이다. 이는 흡입된 양의 80-90%를 간 대사시키는 큰 첫번째 통과 효과(first pass effect)를 겪는다. 니코틴의 주요 대사산물은 코티닌이며; 니코틴-1'-N-산화물은 마이너 대사산물(흡연자가 흡수한 니코틴의 겨우 4-7%임)이다. 니코틴의 코티닌으로의 변환은 2 단계를 포함한다: 1) CYP2A6 활성화, 및 2) 세포질 알데히드 산화효소에 의한 산화. 코티닌은 또한 트랜스-3'-하이드록시코티닌으로 광범위하게 대사된다. 마우스에서 가장 풍부한 대사산물은 트랜스-3'-하이드록시코티닌이며, 40-60%를 차지하는 반면, 코티닌 자체는 니코틴 용량의 단지 약 15%을 차지한다. 또한, 그것은 흡연자의 소변에서 검출된 주요 니코틴 대사산물이다. 다양한 생물학적 유체 속의 코티닌 수준은 담배 사용자에서의 니코틴의 흡입을 예측하기 위해 널리 사용된다. 니코틴 섭취의 정량적 마커로서의 코티닌의 유용성은 니코틴의 코티닌으로의 변환율 및 코티닌의 제거율에 있어서 개별적인 가변성에 의해 제한된다.

니코틴의 총 제거율은 약 1200 mL 분-1이다. 코티닌의 대사가 훨씬 더 느리며, 총 제거율 평균은 45 mL 분-1이다. 트랜스-3’-하이드록시코티닌 총 제거율은 또한 느리며, 약 82 mL 분-1이다. 절제중인 성인 흡연자에서 니코틴의 정맥내 주입은 니코틴의 경우 2.3시간, 코티닌의 경우 17.5시간 및 트랜스-3’-하이드록시코티닌의 경우 6.6시간의 반감기를 보였다.

코티닌은 약 20시간의 생체 내 반감기를 가지고 있으며, 담배 사용 후 며칠 동안 검출될 수 있다. 혈액, 타액 및 소변 속의 코티닌 수준은 담배 연기에 대한 노출 양에 비례한다. <10ng/mL의 코티닌 수준은 활발한 흡연이 없음을 나타내는 것이다. 10ng/mL 내지 100ng/mL의 값은 가벼운 흡연 또는 적당한 노출을 나타내는 것이다. 300ng/mL를 넘는 수준은 하루에 20개가 넘는 궐련을 소비하고 있는 무거운 흡연자 상태를 나타내는 것이다. 소변에서, 11ng/mL 내지 30ng/mL의 값은 가벼운 또는 적당한 흡연을 나타내는 것이며, 활발한 흡연자 내의 수준은 약 500ng/mL 이상이다. 타액에서, 1ng/mL 내지 30ng/mL의 값은 가벼운 또는 적당한 흡연을 나타내는 것이며 활발한 흡연자 내의 수준은 약 100ng/mL 이상이다. 코티닌을 검출하기 위한 방법은 비색법, 가스 크로마토그라피(GC) 및 가스 크로마토그라피-질량 분광분석(GC-MS), 고성능 액체 크로마토그라피, 및 방사선 면역 측정법(RIA)을 포함한다. 코티닌 등가 측정은 피리딘 유도체(구체적으로 니코틴 대사산물)의 결정을 위해 시안화물 및 발색단-발생 시약을 사용할 수도 있다. 코티닌을 검출하기 위한 다른 방법은 이중 특이적 항체를 포함하여, 다양한 포맷으로 변환될 수 있는, 항-코티닌 항체 또는 이의 단편을 사용하는 것을 포함한다. 항-코티닌 항체 또는 이의 단편은 본원에 기술된 바와 같이, 면역블롯, 효소 면역분석, 면역친화도 정제, 및 생체 내 방사선면역 촬영법 등을 포함하여, 다양한 포맷에 적용될 수 있다. 코티닌을 측정하기 위한 방법은, 예를 들어, BMB Rep. (2014) Mar; 47(3): 130-134; J Clin Diagn Res. (2016) Mar; 10(3): ZE04-ZE06 및 Ther Drug Monit . (2009) 2월; 31(1): 14-30에서 본 기술분야에 잘 문서화되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치 및 방법은 약 11ng/ml 내지 약 500ng/ml 범위로 소변에서, 적절하게는 5일 후 24시간 소변에서, 코티닌을 검출하도록 구성되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 459ng/ml 내지 약 1350ng/ml 또는 약 339-959ng/ml 또는 약 546-1160ng/ml 범위의 (유리) 코티닌을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 이 값들은 소변에서, 적절하게는 24시간 소변에서 결정된다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 200ng/ml 내지 약 800ng/ml 범위의 (유리) 코티닌을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 이 값들은 소변에서, 적절하게는 24시간 소변에서 결정된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 11ng/ml 내지 약 30ng/ml 범위의 (유리) 코티닌을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 이 값들은 소변에서, 적절하게는 24시간 소변에서 결정된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 결과를 시각적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 그 결과는 기계 또는 눈에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 결과는 눈에 의해 결정된다. 한 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는 24시간 소변에서 200ng/ml 이상인 코티닌의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 시각적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 다른 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는, 24시간 소변에서 300ng/ml 또는 400ng/ml 또는 500ng/ml 또는 600ng/ml 이하인 코티닌의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 시각적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다.

NNAL

NBAL은 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논(NNK)의 대사산물이다. 흡연자의 24시간 소변에서 배출된 총 NNAL(NNAL 및 NNAL-Gluc)의 기준선 수준은 일반적으로 1.1-2.9nmol/24h(즉, 230-607ng/24h)이다. NNAL도 NNN도, 다른 담배 제품, 니코틴 대체 제품을 사용하고 있지 않거나, 또는 이 경우 수준이 0.1nmol 범위인, 간접 흡연에 노출되지 않는 한, 원칙적으로 비흡연자의 소변에서 검출할 수 없다.

한 연구에서, 20 CPD 이상을 소비하는 흡연자들에게 5일 대기 기간 동안 정확히 20, 15, 5 또는 0 CPD를 흡연하도록 요구하였다. 그 결과 궐련의 수와 소변 NNAL 수준 사이에 용량-관계를 나타냈다(즉, 각각 624, 549, 422 및 311ng/24h).

10일과 최대 45일 사이로 추정되는, NNAL의 긴 반감기 때문에, 짧은 기간에 대한 금연/흡연 절제 연구에 있어서 NNAL 수준은 비-흡연자의 수준에 도달하지 않으며, 3 내지 8일 동안 지속되는 연구에서 약 3- 내지 4-배 감소한다. 최대 56일 동안 지속되는 금연 연구에서, 총 NNAL 수준은 연구의 종료 시점에 비-흡연자에 대해 기술된 수준에 도달하였으며(즉, 56일째에 0.13nmol/24h 대 기준선에서 2.70nmol/24h), 28일 및 42일 후에 이들 수준 위로 남아있는 것으로 보였다(즉, 각각 0.26과 0.2nmol/24h).

NNAL는 LC-MS/MS 또는 GC/MS 등을 포함하여, 본 기술분야에 공지된 임의의 종래의 방법들을 사용하여 검출될 수 있다. 또한, NNAL는 선택적으로 면역원성 담체에 결합된, NNAL에 구체적으로 결합하는, 항체 또는 이의 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 항체는 WO2009/010296에 기술되어 있다.

Haziza 등 (2017) Data in Brief 10, 283-293은 24시간 소변 내 총 NNAL 수준을 기술하고 있다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 (i) 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, (ii) 무연 대체물로 전환하거나, (iii) 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 조사 기간의 5일 후, 이어서 24시간 소변을 수집하여 그 안의 대사산물의 수준을 측정한다. 종래의 궐련 소비자에서, 기준선 총 NNAL은 84-131pg/mg 크레아티닌(105pg/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 85-133pg/mg 크레아티닌(107pg/mg 크레아티닌)로 증가한다. 기준선과 비교하여, 이는 -2.8%에서 10.5%로의 변화(3.9% 평균 증가)를 나타낸다.

무연 대체물 소비자에서, 기준선 총 NNAL은 95-129pg/mg 크레아티닌(111pg/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 42-58pg/mg 크레아티닌(49pg/mg 크레아티닌)으로 감소한다. 기준선과 비교하여, 이는 -57%에서 -51%로의 변화(-54% 평균 감소)를 나타낸다.

흡연 절제자에서, 기준선 총 NNAL은 94-150pg/mg 크레아티닌(119pg/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 31-54pg/mg 크레아티닌(41pg/mg 크레아티닌)으로 감소한다. 기준선과 비교하여, 이는 -67에서 -61%로의 감소(-63.9% 평균 감소)를 나타낸다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 10pg/ml 내지 약 125pg/ml 범위의 총 NNAL를 검출하도록 구성되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 30pg/mg 크레아티닌 내지 약 160pg/mg 크레아티닌 범위의 총 NNAL을 검출하도록 구성되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 85-133pg/mg 크레아티닌 또는 약 85-125pg/mg 크레아티닌 범위의 총 NNAL을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 107pg/mg 크레아티닌 양의 총 NNAL를 검출하도록 구성되어 있다. 이 양들은 종래의 궐련의 사용자에 대한 진단이다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 42-58pg/mg 크레아티닌 범위의 총 NNAL을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 49pg/mg 크레아티닌 양의 총 NNAL를 검출하도록 구성되어 있다. 이 양들은 무연 대체물 사용자에 대한 진단이다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 31-54pg/mg 크레아티닌 범위의 총 NNAL을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 41pg/mg 크레아티닌 양의 총 NNAL를 검출하도록 구성되어 있다. 이 양들은 흡연 억제자에 대한 진단이다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 33ng/ml 내지 약 132pg/ml 또는 약 33ng/ml 내지 약 125pg/ml 또는 약 2.5 내지 46pg/ml 또는 약 10 내지 46pg/ml 또는 약 37 내지 115ng/ml 또는 약 17 내지 41ng/ml 범위의 총 NNAL를 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 이 값들은 소변에서, 적절하게는 24시간 소변에서 결정된다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 결과를 시각적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 그 결과는 기계 또는 눈에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 결과는 눈에 의해 결정된다.

소정의 구현예들에서, 결과는 눈에 의해 결정된다. 한 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는 24시간 소변에서 10pg/ml 이상인 NNAL의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 가시적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 다른 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는 24시간 소변에서 10pg/ml 또는 20pg/ml 또는 30pg/ml 또는 40pg/ml 이하인 NNAL의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 가시적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다.

CEMA

CEMA는 아크롤레인 노출의 특이적 소변 바이오마커이다. 아크롤레인이 인간 신체로부터 제거되는 주요 경로는 간에서 글루타티온(GSH)과 접합된 다음 효소 절단과 N-아세틸화해서 신장에서 S-(3-옥소프로필)-N-아세틸 시스테인(OPMA)을 형성하는 것을 통하는 것이다. OPMA의 알데히드기의 환원으로 아크롤레인 노출의 주요 소변 대사산물인, 3HPMA를 형성하며, OPMA의 알데히드기의 산화로 N-아세틸-S-[2-카르복시에틸]-L-시스테인(CEMA)을 마이너 대사산물로 형성한다.

CEMA의 소변 배출은 비-흡연자에서보다는 흡연자에서 일관되게 더 높은 것으로 나타났다. 비-흡연자에서의 범위는 일반적으로 2ng/mL 미만이며 흡연자에서 20-205ng/mL를 초과하는 수준으로 증가한다. 연구에서, 흡연자는 187±181μg/L(평균 ± SD) 또는 184μg/L의 CEMA를 배설한 반면, 비-흡연자는 4.6 ± 35μg/L 또는 1.9μg/L만을 배설하였다.

20 CPD 이상을 소비하는 흡연자들에게 5일 대기 기간 동안 정확히 20, 15, 5 또는 0 CPD를 흡연하도록 요구하였으며 궐련의 수와 소변 CEMA 수준 사이에 용량-관계를 보였다(즉, 각각 218.0, 168.0, 93.2 및 38.3μg/24h). 5 내지 8일의 금연 연구에 의하면 약 7 내지 10배만큼 소변 내 CEMA의 수준을 상당히 낮게 나타냈다.

예컨대 전기분무 이온화 탠덤 질량 분광분석법과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피 같은 다양한 방법이 CEMA를 측정하기 위해 본 기술분야에 공지되어 있다. 소변에서 CEMA의 결정은 또한 Anal. Bioanal . Chem . (2009) 393:969-981 및 Anal Biochem. (2012) 430(1):75-82에 기술되어 있다. 또한, CEMA는 선택적으로 면역원성 담체에 결합된, CEMA에 구체적으로 결합하는, 항체 - 예컨대 단클론 항체 - 또는 이의 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, WO2009/010296에 기술된 방법을 채택할 수 있다.

Haziza 등 (2017) Data in Brief 10, 283-293은 24시간 소변 내 CEMA 수준을 기술하고 있다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 조사 기간의 5일 후, 이어서 24시간 소변을 수집하여 그 안의 대사산물의 수준을 측정한다.

종래의 궐련 소비자에서, 기준선 CEMA은 83-115ng/mg 크레아티닌(98ng/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 85-115ng/mg 크레아티닌(99.5ng/mg 크레아티닌)으로 증가한다. 기준선과 비교하여, 이는 -4%에서 12%로의 변화(4.2% 평균 증가)를 나타낸다.

무연 대체물 소비자에서, 기준선 CEMA은 85-112ng/mg 크레아티닌(98ng/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 11-15ng/mg 크레아티닌(13ng/mg 크레아티닌)으로 감소한다. 기준선과 비교하여, 이는 -87%에서 -85%로의 변화(-86% 평균 감소)를 나타낸다.

흡연 절제자에서, 기준선 CEMA은 89-119ng/mg 크레아티닌(103ng/mg 크레아티닌)이다. 5일째에, 이는 10-15ng/mg 크레아티닌(12ng/mg 크레아티닌)으로 감소한다. 기준선과 비교하여, 이는 -88에서 -85%로의 감소(-86% 평균 감소)를 나타낸다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 11ng/mg 크레아티닌 내지 약 120ng/mg 크레아티닌 범위의 CEMA를 검출하도록 구성되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 11ng/mg 크레아티닌 내지 약 80ng/mg 크레아티닌 범위의 CEMA을 검출하도록 구성되어 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 5ng/mg 크레아티닌 내지 약 80ng/mg 크레아티닌 범위의 CEMA를 검출하도록 구성되어 있다.

이 양들은 종래의 궐련의 사용자에 대한 진단이고, 판독은 조사 기간의 5일 후에 24시간 소변에서 행해진다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 11-15pg/mg 크레아티닌 범위의 CEMA을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 13ng/mg 크레아티닌 양의 CEMA를 검출하도록 구성되어 있다. 이 양들은 무연 대체물 사용자에 대한 진단이고, 판독은 조사 기간의 5일 후에 24시간 소변에서 행해진다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 10-15ng/mg 크레아티닌 범위의 CEMA을 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 12ng/mg 크레아티닌 양의 CEMA를 검출하도록 구성되어 있다. 이 양들은 흡연 억제자에 대한 진단이고, 판독은 조사 기간의 5일 후에 24시간 소변에서 행해진다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 약 32ng/ml 내지 약 98ng/ml 또는 약 7ng/ml 내지 약 17ng/ml 또는 약 31 내지 90ng/ml 또는 약 5 내지 12ng/ml 범위의 CEMA를 검출하도록 구성되어 있다. 적절하게는, 이 값들은 소변에서, 적절하게는 24시간 소변에서 결정된다.

적절하게는, 본 발명에 따른 장치, 방법 및 키트는 결과를 시각적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 그 결과는 기계 또는 눈에 의해 결정될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 결과는 눈에 의해 결정된다.

소정의 구현예들에서, 결과는 눈에 의해 결정된다. 한 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는 24시간 소변에서 10pg/ml 이상인 CEMA의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 가시적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다. 다른 구현예에서, 장치, 방법 및 키트는 24시간 소변에서 20pg/ml, 30pg/ml, 40pg/ml 또는 50pg/ml 이상인 CEMA의 임계값 수준을 넘을 때 결과를 가시적으로 디스플레이하도록 구성되어 있다.

대사산물 양

본원에 기술된 바와 같이, 대사산물의 양은, 예를 들어, 5일째에 표 1에 제시된 데이터를 사용하여 대상체의 흡연 상태를 판독하기 위해 측정될 수 있다.

예를 들어, 24시간 소변에서 총 NNAL의 양이 조사 기간의 5일째에 약 37-115pg/ml이며, 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의 5일째에 약 31-90ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 456-1300ng/ml이라면 대상체가 종래의 궐련의 소비자임을 나타낸다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 그들의 기호에 따라 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 조사 기간의 5일 후, 이어서 24시간 소변을 수집하여 그 안의 대사산물의 수준을 측정한다.

추가적인 예로서, 24시간 소변에서 총 NNAL의 양이 조사 기간의 5일째에 약 17-40pg/ml이며, 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의 5일째에 약 5-11ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 10-42ng/ml이라면 대상체가 무연 대체물의 소비자임을 나타낸다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 그들의 기호에 따라 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 조사 기간의 5일 후, 이어서 24시간 소변을 수집하여 그 안의 대사산물의 수준을 측정한다.

추가적인 예로서, 24시간 소변에서 총 NNAL의 양이 조사 기간의 5일째에 약 17-40pg/ml이며, 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의 5일째에 약 4-15ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 10-42ng/ml이라면 대상체가 흡연을 절제하였음을 나타낸다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 그들의 기호에 따라 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택한다. 조사 기간의 5일 후, 이어서 24시간 소변을 수집하여 그 안의 대사산물의 수준을 측정한다.

흡연 상태에 대한 진단인 상기 표시된 대사산물의 양을 고려하여, 이러한 진단 수준이 측정될 수 있도록 방법, 장치 및 키트가 구성되어 있다. 적절하게는, 상기 방법, 장치 및 키트는 이러한 진단 수준이 신속하고 사용하기 쉬운 포맷으로 측정될 수 있도록 구성되어 있다. 소정의 실시예들에서, 상기 방법, 장치 및 키트는24시간 소변에서 총 NNAL의 양이 조사 기간의 5일째에 약 37-115pg/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의5일째에 약 31-90ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 456-1300ng/ml인 경우에 이것이 대상체가 종래의 궐련의 소비자일 것이라고표시하도록 구성되어 있다.

소정의 실시예들에서, 상기 방법, 장치 및 키트는 24시간 소변에서 총 NNAL 양이 조사 기간의 5일째에 약 17-40pg/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의 5일째에 약 5-11ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 10-42ng/ml인 경우에 대상체가 무연 대체물의 소비자임을 표시하도록 구성되어 있다.

소정의 실시예들에서, 상기 방법, 장치 및 키트는 24시간 소변에서 총 NNAL 양이 조사 기간의 5일째에 약 17-40pg/ml이며 및/또는 24시간 소변에서 CEMA의 양이 조사 기간의 5일째에 약 4-15ng/ml이며 및/또는 24시간 소변에서의 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 약 10-42 ng/ml인 경우에 이것이 대상체가 흡연을 절제하였다는 것에 대한 진단일 것이라고 표시하도록 구성되어 있다.

하나의 예시적인 분석 포맷에서, 대상체가 종래의 궐련의 소비자라는 것에 대한 진단인 하나의 테스트와, 대상체가 무연 대체물의 소비자라는 것에 대한 진단인 하나의 테스트와, 대상체가 흡연을 절제하였다는 것에 대한 진단인 하나의 테스트에 대응하는 3개의 개별 테스트를 실행할 수 있다. 하나의 예시적인 테스트 포맷은, 테스트할 시료가 3개의 상이한 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치로 도전되는, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치-예컨대 딥스틱-이며, 각각은 3개의 상이한 흡연 상태 각각에 대한 진단이 되도록 구성되어 있다. 대안적으로, 3개의 모든 테스트는 하나의 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치 상으로 통합될 수 있다.

바람직한 구현예에서, CEMA 및 코티닌은 특이성 및 민감도가 적어도 75%를 가지고 2일 후 종래의 궐련 흡연자와 흡연 절제자의 분리를 보장할 수 있다.

2일째, 종래의 궐련 흡연자의 CEMA 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 32ng/ml 내지 약 98ng/ml이다.

2일째, 종래의 궐련 흡연자의 코티닌 수준은 약 459ng/ml 내지 약 1350ng/ml이다. 총 NNAL는 5일과 30일 사이에 동일한 수준의 구별을 제공한다. 5일과 30일 사이에, 종래의 궐련 흡연자의 총 NNAL 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 33pg/ml 내지 약 132pg/ml이다.

2일째, 흡연 절제자의 CEMA 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 7-17ng/ml이다.

2일째, 흡연 절제자의 코티닌 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 339 내지 959ng/ml이다.

5일과 30일 사이에, 흡연 절제자의 총 NNAL 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 2.5-46pg/ml이다.

무연 대체물의 소비자는 특이성 및 민감도가 적어도 75%를 가지고 5일 후 CEMA 및 총 NNAL에 기초하여 종래의 궐련 흡연자와 구별될 수 있다.

5일째, 종래의 궐련 흡연자의 CEMA 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 31ng/ml 내지 90ng/ml이다.

5일째, 종래의 궐련 흡연자의 총 NNAL 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 37ng/ml 내지 115ng/ml이다.

5일째, 무연 대체물 소비자의 CEMA 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 5 내지 12ng/ml이다.

5일째, 무연 대체물 소비자의 총 NNAL 수준은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 17-41ng/ml이다.

무연 대체물의 소비자는 (특이성 및 민감도가 적어도 75%인) 2일 후 유리 코티닌에 기초하여 흡연 절제자와 구별될 수 있다.

2일째, 무연 대체물 소비자의 유리 코티닌은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 546-1160ng/ml이다.

2일째, 흡연 절제자의 유리 코티닌은 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 약 128-313ng/ml이다.

한 구현예에서, 상기 코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 10.6 내지 41.5ng/ml이면 흡연 절제자에 대한 표시이고; 그리고총 NNAL 양이 24시간 소변에서 약 37.7pg/ml 내지 115pg/ml이고 CEMA 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 31.1ng/ml와 90ng/ml이면 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시이고; 및코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 652.5 내지 1115ng/ml ng/ml 이상이면 가열된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시이다.

이 값들은 표 1 및 도 1 내지 도 3에 제시된 데이터로부터 이해될 수 있다.

대사산물의 참조 값

참조 값을 사용해서 공지된 참조 값에 대해 대상체에서 검출된 하나 이상의 대사산물의 양을 비교하고 대상체의 흡연 상태에 대한 결정에 도달할 수 있다. 참조 값 위 또는 아래 또는 같은 값은 임계값을 넘었음을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들어, 기준선 값 위 또는 아래의 값은 임계값을 넘었음을 나타내는 것일 수 있다.

기준선 대비, 총 NNAL에서 -2.8%에서 10.5%로의 변화(3.9% 평균 증가)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 종래의 궐련 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 총 NNAL에서 -57%에서 -51%로의 변화(-54% 평균 감소)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 무연 대체물의 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 총 NNAL에서 -67%에서 -61%로의 변화(-63.9% 평균 감소)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 흡연 절제자에 대한 표시이다.

기준선 대비, CEMA에서 -4%에서 12%로의 변화(4.2% 평균 증가)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 종래의 궐련 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, CEMA에서 -87%에서 -85%로의 변화(-86% 평균 감소)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 무연 대체물의 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, CEMA에서 -88%에서 -85%로의 변화(-86% 평균 감소)는 24시간 소변에서 조사 기간 5일 후 흡연 절제자에 대한 표시이다.

참조 값은 본원에 교시된 바와 같은 방법 및 용도 이내에서(즉, 단계를 구성함) 또는 이외에서(즉, 단계를 구성하지 않음) 설정될 수 있다. 따라서, 본원에 교시된 방법 또는 용도 중 임의의 하나는 필수 참조 값을 설정하는 단계를 포함할 수 있다. 기준선 대비, 2일째에 1.5%에서 18%로의 CEMA 수준에 대한 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 궐련 흡연자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 16%에서 6%로의 유리 코티닌 수준에 대한 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 흡연자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 20%에서 6%로의 총 NNAL에 대한 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 궐련 흡연자에 대한 표시이다. 기준선 대비, 30일째에 29%에서 17.5%로의 총 NNAL에 대한 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 궐련 흡연자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 79%에서 80%로의 CEMA 수준 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 흡연 절제자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 74%에서 78%로의 코티닌 수준 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 흡연 절제자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 56%에서 67%로의 총 NNAL 감소는 흡연 절제자에 대한 표시이다. 기준선 대비, 30일째에 68%에서 72%로의 총 NNAL 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 흡연 절제자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 9.5%에서 20.6%로의 CEMA 수준 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 궐련 흡연자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 19%에서 5%로의 총 NNAL 수준 증가는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 종래의 궐련 흡연자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 83%에서 84%로의 CEMA 수준 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 무연 대체물 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 5일째에 55%에서 58%로의 총 NNAL 수준 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 무연 대체물 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 74%에서 77%로의 유리 코티닌 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 흡연 절제자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 0.3%에서 4%로의 유리 코티닌 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 무연 대체물 소비자에 대한 표시이다.

기준선 대비, 2일째에 74%에서 78%로의 유리 코티닌 감소는 적절하게는 소변에서, 더욱 적절하게는 24 시간 소변에서, 흡연 절제자에 대한 표시이다.

이 값들은 표 1 및 도 1 내지 도 3에 제시된 데이터에 기초하여 계산된다.

크레아티닌에 대한 정규화

일부 구현예에서, 예컨대 정량적 결과가 요구되는 경우와 정상적인 신장 기능을 위한 대조군을 제공하기 위해, 본 발명의 방법은 크레아티닌 측정치를 포함할 수 있고, 대사산물(예컨대 NNAL 및 CEMA)의 값은 뇨 크레아티닌에 대해 정규화된다. 이러한 정규화는 반-정량적 또는 정성적 테스트에는 필요하지 않다. 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치(예, 딥스틱)는 일반적으로 반-정량적 또는 정성적 결과를 보고하고 있으며 이어서 크레아티닌에 대한 정규화가 본 개시의 이러한 구현예들에 요구되는 것은 아니다. 더욱이, 정량적 결과가 요구되는 경우에도, 크레아티닌 대조군의 사용은 항상 중요하거나 필수적인 것은 아닌데, 소변 시료 내의 크레아티닌에 대한 참조 값이 유도되었기 때문이다(예를 들어, Occupational Medicine (2011), 61권, 5호, 349-353 페이지).

대사산물 검출

대사산물(들)의 양 또는 수량 또는 수준은, 당 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기술될 수 있는 바와 같은, 임의의 적절한 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제를 사용할 수 있다. 결합제는 특히 항체 또는 그의 단편, 앱타머, 아피머, 광앱타머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자일 수 있다. 예를 들어, 면역분석 기술 또는 질량 분광분석법 또는 크로마토그래피 방법, 또는 상기 방법들의 조합을 사용할 수 있다.

소정의 구현예들에서, 임의의 하나 이상의 대사산물의 존재 및/또는 수량은 면역분석 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 다양한 종류의 면역분석 기술이 당업계에 공지되어 있다. 하나의 포맷으로, 대사산물(들)은 표지된 검출 시약에 접합될 수 있고 특이적 결합제에 특이적으로 결합하도록 경쟁할 수 있다. 시료 내의 대사산물(들)의 존재 또는 부재는 각각 가시적(또는 측정가능한) 신호의 부재 또는 존재에 의해 측정된다. 다른 포맷으로, 표지된 검출 시약은 복합체를 형성하는 대사산물(들)에 결합하고, 복합체는 특이적 결합제를 통해 고체 지지체에 고정된다. 액체 시료 내의 대사산물(들)의 존재 또는 부재는 가시적(또는 측정가능한) 신호의 존재 또는 부재에 의해 측정된다. 다양한 장치가 당 기술분야에 주지되어 있고, 본원에서 더 설명되고 있다. 이러한 장치는 단일 및 가정용으로 일반적으로 적합하며, 이는 사용하기 용이하고 빠르며, 육안으로 결과가 시각화될 수 있기 때문이다.

일부 환경에서, 대사산물(들)의 존재 및/또는 양을 결정하는 데 더욱 복잡한 장치가 요구될 수 있는데, 예를 들어, 육안으로 해석할 수 없거나 불확실성을 생성하는 경우이다. 이러한 장치는 면역 크로마토그래피 장치를 수용하기에 적합한 수용기, 장치의 드러난 구역의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기에 적합한 이미징 장치, 적어도 하나의 디지털 이미지를 처리하기에 적합한 프로세서, 및 정성적 및/또는 정량적 평가의 결과를 보고하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 장치는 WO2016/075405에 개시되어 있으며, 여기서 면역 크로마토그래피 장치 상에 증착된 액체 시료에 함유될 가능성이 있는 적어도 하나의 대사산물의 정량적 및/또는 정량적 평가를 위한 시스템이 다 개시되어 있다. 평가 시스템은 서로 구조적으로 분리될 수 있는 판독 장치 및 분석 장치를 포함하고 있다. 판독 장치는 면역 크로마토그래피 장치를 수용하기에 적합한 수용기, 및 그의 디스플레이 구역의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기 위한 이미징 장치를 포함하고 있다. 분석 장치는 적어도 하나의 디지털 이미지를 처리하기에 적합하고, 액체 시료에 함유될 수 있는 적어도 하나의 대사산물의 정성적 및/또는 정량적 평가에 적합한, 프로세서를 더 포함할 수 있다. 분석 장치는 평가 결과를 출력하기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 평가 시스템은, 판독 장치로부터 원격 분석 장치로 획득된 적어도 하나의 디지털 이미지를, 예를 들어 통신 네트워크를 통해 송신하기에 적합한 장치를 더 포함할 수 있다. 판독 장치는 휴대용 장치일 수 있다. 이미징 장치는 광학(또는 사진) 센서, 아날로그-대-디지털 변환기, 및 변환기로부터 나오는 데이터로부터 디지털 이미지를 생성하기에 적합한 프로세서 및 컴퓨터 프로그램을 포함하고 있는, 처리 모듈을 포함할 수 있다. 광학 센서는 전자기 방사선을 아날로그 전기 신호로 변환하기 위한 감광형 전자 구성요소일 수 있다. 얻어지는 신호는 아날로그-디지털 변환기에 의해 디지털화될 수 있고, 이어서 처리 모듈에 의해 처리되어 면역 크로마토그래피 장치의 노출 구역에 대응하는 디지털 이미지를 획득할 수 있다. 적어도 하나의 디지털 이미지를 송신하기에 적합한 장치는 판독 장치로부터 적어도 하나의 디지털 이미지를 송신할 수 있는 유선 또는 무선 수단을 포함할 수 있다. 판독 장치에 의해 획득된 디지털 이미지는, 전용 컴퓨터 서버와 같은 원격 분석 장치에 송신될 수 있다. 동작시, 판독 장치는 그 사이에서 데이터 교환을 허용하기 위해 전송 장치와 쌍을 이룰 수 있다. 분석될 시료는 면역 크로마토그래피 장치 상에 증착되고 충분한 기간 동안 배양될 수 있다. 이어서, 판독 장치는 송신 장치에 전송하기 위해 면역 크로마토그래피 장치로부터 디지털 이미지를 획득할 수 있다. 그런 다음, 디지털 이미지는 송신 장치에 의해 분석 장치에 송신될 수 있다. 분석 장치에 의해 수신되는 각각의 디지털 이미지는 분석을 위해 처리될 수 있다.

비제한적인 실시예들에서, 면역분석 기술은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 형광 면역분석, 화학발광 면역분석, DRI 면역분석, 정량적 면역검정, 측방향 유동 면역분석, 미세유체 면역분석 및 응집 면역분석 기술을 사용하며, 바람직하게는 ELISA를 사용한다. 한 구현예에서, 측방향 유동 면역분석을 사용하는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 경쟁적 포맷 측방향 유동 면역분석을 사용하는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 교시된 임의의 하나 이상의 대사산물의 존재 및/또는 양은 경쟁적 결합 분석을 사용하고/하거나 유도체화 및/또는 착색제-함유 제제를 사용하여, 항체- 또는 크로마토그래피-기반인 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 본원에 교시된 임의의 하나 이상의 대사산물의 존재 및/또는 양은, 각각의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제를 사용하여, 바람직하지만 비제한적인 예들로, 앱타머, 항체 또는 이의 단편, 아피머, 광앱타머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자, 바람직하게는 앱타머, 아피머 또는 항체, 보다 바람직하게는 항체 또는 이의 단편 또는 아피머를 사용하여, 측정될 수 있다.

결합제

적합하게는, 특이적 결합제는 이러한 결합의 친화도 상수(K_A) K_A≥ 1×10⁶ M^-1, 더욱 바람직하게 K_A≥ 1×10⁷ M^-1, 더욱 적절하게는 K_A≥ 1×10⁸ M^-1, 더욱 더 적절하게는 K_A≥ 1×10⁹ M^-1, 더욱 더 적절하게는 K_A≥ 1×10¹⁰ M^-1 또는 K_A≥ 1×10¹¹ M^{- 1}를 가지고 그의 의도된 타겟(들)에 결합할 수 있고, 여기서 K_A = [SBA_T]/[SBA][T], SBA는 특이적 결합제를 나타내고, T는 의도된 타겟을 나타낸다. K_A의 결정은 예를 들어, 평형 투석과 Scatchard 플롯 분석을 사용하여, 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

항체

항체는 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 계열, 및 바람직하게는 IgG 계열 항체일 수 있다. 항체는 다클론 항체, 예를 들어, 그로부터 정제된 (예를 들어, 친화도-정제된) 항혈청 또는 면역글로불린일 수 있다. 항체는 단클론 항체 또는 단클론 항체의 혼합물일 수 있다. 단클론 항체는 더 큰 선택성과 재현성을 가지고 특정 항원 또는 항원 내에서 특정 에피토프를 표적화할 수 있다. 예로서, 제한되지는 않고, 단클론 항체는 Kohler 등 1975 (Nature 256: 495)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에서와 같음) 제조될 수 있다. 단클론 항체는 또한 예를 들어, Clackson 등 1991 (Nature 352: 624-628) 및 Marks 등 1991 (J Mol Biol 222: 581-597)에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

항체는 항체 단편일 수 있다. "항체 단편"은 항원 결합 또는 이의 가변 영역을 포함하고 있는, 온전한 항체의 일부분을 포함하고 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 scFv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편(들)으로부터 형성된 다가 및/또는 다중특이적 항체, 예, 이중체, 삼중체 및 다중체를 포함한다. 상기 명칭 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 등은 그 분야에서 확립된 의미를 갖도록 의도되었다.

용어 항체는 임의의 동물 종, 바람직하게는 척추동물 종, 바람직하게는 예, 조류 및 포유류로부터 유래한 하나 이상의 부분으로부터 기원하거나 이를 포함하고 있는 항체를 포함한다. 제한 없이, 항체는 닭, 칠면조, 거위, 오리, 기니 닭, 메추라기 또는 꿩일 수 있다. 또한, 제한 없이, 항체는 인간, 쥐(예를 들어, 마우스, 랫트 등), 당나귀, 토끼, 염소, 양, 기니 피그, 낙타(예를 들어, 쌍봉 낙타(Camelus bactrianus) 및 단봉 낙타(Camelus dromaderius)), 라마 (예, 알파카(Lama paccos), 백색 라마(Lama glama) 또는 비쿠냐(Lama vicugna)) 또는 말을 포함한다.

숙련자라면, 항체가 하나 이상의 아미노산 결실, 추가 및/또는 치환(예를 들어, 보존적 치환)을 포함할 수 있고, 이러한 변경들이 각각의 항원의 결합을 보존하는 것을 전제로 하는 것을 이해할 것이다. 항체는 또한 그의 구성 아미노산 잔기의 하나 이상의 본연의 또는 인위적 변형(예를 들어, 당질화 등)을 포함할 수 있다.

다클론 및 단클론 항체 및 이의 단편을 생산하는 방법은 본 기술분야에 주지되어 있으며, 재조합 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법에서와 같다 (예를 들어, Harlow and Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; “Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach”, by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921 참조).

결합 분자는 다른 작용제로 검출할 수 있는 태그로 표지될 수 있다 (예, 프로브 결합 파트너). 이러한 태그는, 예를 들어 비오틴, 스트렙타비딘, his-tag, myc tag, 말토오스, 말토오스 결합 단백질 또는 결합 파트너를 갖는 당 기술분야에 공지된 임의의 다른 종류의 태그일 수 있다. 프로브:결합 파트너 배열에서 이용될 수 있는 연관의 예는, 임의의 것일 수 있으며, 예를 들어, 비오틴:스트렙타비딘, his-tag/금속 이온 (예, Ni²⁺), 말토오스/말토오스 결합 단백질을 포함한다.

결합 분자 또는 결합 분자 접합체는 검출제에 연관되거나 부착되어서 검출을 용이하게 할 수 있다. 실험실 검출제의 예로는 발광 표지; 염료와 같은 비색 표지; 형광 표지; 또는 전기활성제와 같은(예, 페로시아나이드) 같은 화학적 표지; 효소; 방사능 표지; 또는 고주파 표지가 있지만, 이에 한정되지 않는다. 보다 일반적으로, 검출제는 입자이다. 본 발명의 실시에 유용한 입자의 예로는 콜로이드성 금 입자; 콜로이드성 황 입자; 콜로이드성 셀레늄 입자; 콜로이드성 황산 바륨 입자; 콜로이드성 황산철 입자; 금속 요오드화물 입자; 은 할라이드 입자; 실리카 입자; 콜로이드성 금속(수성) 산화물 입자; 콜로이드성 금속 황화물 입자; 콜로이드성 납 셀렌화물 입자; 콜로이드성 카드뮴 셀렌화물 입자; 콜로이드성 금속 인산염 입자; 콜로이드성 금속 페라이트 입자; 유기 또는 무기 층으로 코팅된 전술한 콜로이드성 입자 중 임의의 것; 단백질 또는 펩티드 분자; 리포좀; 또는 유기 중합체 라텍스 입자, 예컨대 폴리스티렌 라텍스 비드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 입자는 콜로이드성 금 입자이다. 콜로이드성 금은 임의의 종래의 수단, 예컨대 G. Frens, 1973 Nature Physical Science, 241:20 (1973)에 개략된 방법들에 의해 제조될 수도 있다. 대안적인 방법은 미국 특허 번호 5,578,577, 5,141,850; 4,775,636; 4,853,335; 4,859,612; 5,079,172; 5,202,267; 5,514,602; 5,616,467; 5,681,775에 기술되어 있을 수 있다.

항- CEMA 항체

본원에서 논의된 바와 같이, CEMA는 항체(예컨대 단클론 항체) 또는 이의 단편을 사용하여 검출될 수 있고, 이는 선택적으로 면역원성 담체에 결합된, CEMA에 결합한다. 예를 들어, 본원에 또는 WO2009/010296에 기술된 방법들을 채택할 수 있다. 추가 측면은 면역원성 담체에 결합된 CEMA를 포함하고 있는 접합체에 관한 것이다. 또한, CEMA를 면역원성 담체에 결합시켜서 수득가능한 접합체가 개시되어 있다. 면역원성 담체는, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 중합체일 수 있다. 접합체 제조 방법이 또한 개시되어 있으며, 상기 방법은: (a) 면역원성 담체를 활성화시키는 단계; 및 (b) 단계 a)에서 얻은 활성화된 면역원성 담체를 CEMA에 결합시키는 단계를 포함하고 있다. 본 발명의 또 다른 측면은 CEMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CEMA 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 본원에 기술된 접합체로 비인간 동물을 면역화하는 단계를 포함하고 있는, 이러한 항체 또는 이의 단편을 생산하기 위한 방법이 또한 개시되어 있다. 또한, 상기 접합체를 포함하고 있는 약제학적 조성물이 개시되어 있으며 시료를 항-CEMA 항체 또는 이의 단편을 거치게 하고 상기 항체 또는 이의 단편의 CEMA에 대한 결합을 검출하는 단계를 포함하고 있는 시료 내 CEMA를 검출하는 방법에서와 같다. 결합은 시료 내 CEMA의 존재를 나타낸다. 또한, 대상체의 시료를 본원에 기술된 접합체를 거치게 하고 항체 또는 이의 단편에 대한 접합체의 결합을 검출하는 단계를 포함하고 있는 CEMA에 특이적인 항체 또는 이의 단편의 검출을 위한 방법이 기재되어 있다.

항-CEMA 항체를 기르기 위한 한 가지 방법은 하이브리도마의 사용을 포함한다. 무-병원균 BALB/c 마우스를 완전한 프로인트(Freund) 보강제(Sigma)를 사용하여 CEMA 접합체로 프라이밍할 수 있다. 마우스는 콜레라 독소(Sigma)의 존재 하에 동일한 용량의 항원으로 14, 16, 28, 30, 42 및 44일째에 위 삽관에 의해 추가투여될 수 있다. 혈청은 0, 14, 28, 42, 55 및 84일째에 채취될 수 있고, 항-CEMA 항체 역가는 직접 ELISA로 측정될 수 있다. 하이브리도마 융합 3일 전에, 최고 CEMA 특이적 항체 역가를 갖는 마우스에 대한 불완전 Freund 보강제(Sigma)를 사용하여 최종 추가투여를 수행할 수 있다. 하이브리도마는 ClonaCell™-HY 완전 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 생산될 수 있다. 간단히 말해, 면역화된 마우스 비장으로부터, 비장세포를 세척하고 모체 골수종 세포를 갖는 PEG 함유 배지에서 배양한다. 24시간 팽창 후, 세포를 메틸셀룰로오스-계 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티민) 선택성 배지와 혼성화를 위해 혼합시킨다. 혼합물을 접시에 플레이팅하고 37°C에서 인큐베이팅하여, 융합된 세포들이 14일 동안 성장하게 한다. 이어서, 하이브리도마 콜로니를 골라내고 생장 배지를 갖는 96 웰 플레이트에 옮길 수 있다. 37°C에서 4일 성장 후, 각각의 상청액을 직접 ELISA에 의해 특이적 [NNK-C2]-항체의 존재에 대해 테스트할 수 있다. 양성 클론들은 mAb 생산을 위한 단백질 없는 영양 보충제인, HyClone HyQ PF-Mab (Perbio Sciences)로 보충된 RPMI-1640 배지에 더 적합하였다.

검출

임의의 현존하거나, 이용 가능하거나 종래의 분리, 검출 및 정량화 방법이 시료 내의 대사산물(본원에 교시된 임의의 하나 이상의 대사산물을 포함하여, 시료에서 소위 측정될 관심있는 임의의 분자 또는 분석물을 이하 집합해서 대사산물로서 지칭될 수 있다)의 존재 또는 부재(예, 존재 대 부재라는 판독; 또는 검출 가능한 양 대 검출 불가능한 양) 및/또는 수량(예, 예를 들어, 절대 또는 상대 농도와 같은, 절대 또는 상대 양이라는 판독)을 결정하거나 검출하거나 측정하기 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 이러한 방법은 생화학적 분석 방법, 면역분석 방법, 경쟁 결합 분석, 샌드위치 결합 분석, 질량 분광분석 방법, 또는 크로마토그래피 방법, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

경쟁 결합 분석 및 면역분석

경쟁적 결합 분석 및 면역분석은 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법들은 시료 내에서 관심있는 하나 이상의 대사산물을 검출하기 위한 것으로 공지되어 있으며, 여기서 관심있는 대사산물에 대한 분석의 특이성은 특이적 결합제, 일반적으로 항체 및 관심있는 대사산물 사이의 특이적 결합에 의해 부여된다. 정량적 분석은 혈장 또는 혈청과 같은 생물학적 매트릭스에서 특이적 모이어티의 양을 측정하기 위해 사용된다. 면역분석 기술은 제한 없이, 직접 ELISA (효소-결합 면역흡착 분석), 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁 ELISA, 멀티플렉스 ELISA, 방사성 면역분석 (RIA) 기술, 및 당 기술분야에 공지된 기타 유사한 기술을 포함한다. 이러한 면역분석 방법의 원리는 당 기술분야에 공지되어 있다, 예, John R. Crowther, "The ELISA Guidebook", 1st ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282.

추가적인 설명을 위해, 그리고 제한적인 것은 아니지만, 직접 ELISA는 표지된 일차 항체 또는 이의 단편을 사용하여 마이크로웰 플레이트와 같은 고체 지지체에 고정되는 시료 내의 타겟 항원에 결합하여 이를 정량화한다. 간접 ELISA는 타겟 항원에 결합하는 비-표지된 일차 항체 및 항원-결합된 일차 항체를 인식하고 정량화할 수 있게 하는 이차 표지된 항체를 사용한다. 샌드위치 ELISA에서, 타겟 항원은 항원 내의 하나의 항원성 부위에 결합하는 고정화된 '포획(capture)' 항체를 사용하여 시료로부터 포획되고, 비-결합 대사산물의 제거에 후속하여, 이렇게 포획된 항원은 상기 항원 내의 다른 항원 부위에 결합하는 '검출' 항체를 사용하여 검출되며, 여기서 검출 항체는 상기와 같이 직접 표지되거나 간접적으로 검출 가능할 수 있다. 경쟁 ELISA는 일차 항체 또는 타겟 항원일 수 있는 표지된 ‘경쟁자’를 사용한다. 일 실시예에서, 비-표지된 고정화된 일차 항체가 시료와 함께 인큐베이션되고, 이 반응은 평형 상태에 도달하게 되고 나서 표지된 표적 항원이 첨가된다. 후자는 이의 결합 부위가 시료로부터 비-표지된 타겟 항원에 의해 아직 점유되지 않은 어디든지 일차 항체에 결합할 것이다. 따라서, 결합된 표지된 항원의 검출된 양은 시료 내의 비-표지된 항원의 양과 역으로 상관된다. 멀티플렉스 ELISA는 일반적으로 복수의 어레이 주소(예를 들어, 추가 가이드를 위해 Nielsen & Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20 및 Ling 등 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98 참조)에서 단일 구획 (예, 마이크로플레이트 웰) 내에서 2개 이상의 대사산물을 동시에 검출하게 할 수 있다. 이해되는 바와 같이, ELISA 기술의 라벨링은 일반적으로 효소 (예컨대, 서양고추냉이 과산화효소) 접합에 의하며, 종결점은 통상적으로 비색, 화학발광 또는 형광, 자기, 압전 전계, 초전기 및 기타이다.

방사성 면역분석

방사성 면역분석(RIA)을 사용하여 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출할 수 있다. 이것은 경쟁 기반 기술이며, 방사능-표지된 (예를 들어, 125I- 또는 131I-표지된) 타겟 항원의 공지된 양을 상기 항원에 대한 항체 또는 이의 단편과 혼합한 다음, 시료로부터 비-표지된 또는 ‘콜드’ 항원을 첨가하고, 변위된 표지된 항원의 양을 측정하는 것을 포함한다(예컨대, 가이드를 위해 "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", by Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 참조).

미세유체 시스템

미세유체 시스템은 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이들은 미세전자기계 시스템(MEMS) 기술에 의해 제작되며 일반적으로 “랩 온-어-칩(lab-on-a-chip)”(LOC), “바이오칩(biochip)” 또는 “마이크로-통합-분석(micro-total-analysis) 시스템”으로 지칭된다. 이들은 종종 대규모 대응 부분들의 소형화된 버전으로 표현된다. 이들 소형화 시스템은 전통적으로 실험실에서 수행되는 전체 프로토콜을 수행할 수 있다. 시료 전처리, 시료/시약 수송, 혼합, 반응, 분리, 검출 및 제품 수집은 모두 단일 LOC 시스템에서 자동으로 수행될 수 있다. 마이크로펌프, 마이크로밸브, 마이크로필터, 미세반응기 및 미세분리기와 같은, 기능성 미세유체 장치는 미세제작될 수 있고 심지어 특이성 분석을 수행하도록 통합될 수 있다. 이러한 개발된 LOC 시스템의 장점은, 적은 시료/시약 소비, 오염 위험 감소, 향상된 감도, 적은 단위 비용, 낮은 전력 소비, 및 높은 신뢰성 및 기능성을 포함한다. 더욱 중요한 것은, 소형 형태로부터 생기는 휴대성이 현장(point-of-care; POC) 응용 분야에 대한 핵심 요인이라는 점이다.

응집 면역분석

응집 면역분석은 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이들은 항원-DNA 접합체에 대한 항체 또는 이의 단편의 결합 및 응집(군집)을 이용하여, DNA 가닥의 연결 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(quantitative polymerase chain reaction; qPCR)을 포함하고 있는 방법에 의한 후속 정량화를 가능하게 한다. 응집-PCR(ADAP)은 이러한 항체 결합을 검출하기 위한 초감도 용액-상 방법이다. 다른 면역-PCR(IPCR) 검출 방법과 마찬가지로, ADAP는 항체-항원 인식의 특이성 및 PCR의 감도를 조합한다. ADAP는 5-6의 크기 순에 걸쳐 있는 동적 범위를 가지고 2μl의 시료 중의 젭토(zepto) 몰 내지 아토(atto) 몰의 항체를 검출한다. 예를 들어, ADAP는 FDA 승인된 방사성 면역분석에 비해 1000배 증가된 감도를 가지고 인간 환자 혈장의 항-티로글로불린 자가항체를 검출할 수 있게 한다. ADAP는 또한 하나의 실험에서 다수의 항체를 동시에 검출할 수 있게 한다.

DRI 기술

DRI 기술은 본원에 기재된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다. DRI 기술의 예는 Thermo Scientific™에서 제공되며 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH) 효소로 표지된 약물 또는 약물 대사산물 및 고정된 양의 특이적 항체 결합 부위를 위해 시료로부터의 유리 약물 사이의 경쟁에 기초한다. 시료로부터 유리 약물이 없는 경우, 특이적 항체는 G6PDH로 표지된 약물에 결합한다. 결과적으로, 효소 활성이 억제된다. 약물이 시료 내에 존재한다면, 그것은 제한된 수의 항체 결합 부위에 대한 효소-약물 접합체와 경쟁하여, 더 많은 활성 효소를 유발한다. 이 현상은 소변에서 약물 농도 및 효소 활성 사이에 직접적인 관계를 생성한다. 효소 G6PDH 활성은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)를 NADH로 변환하는 그것의 능력을 측정하여 340nm에서 분광광도계로 결정된다.

면역크로마토그래피

면역크로마토그래피는 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있고 본 개시의 바람직한 검출 방법이다. 이는 측방향 유동 면역크로마토그래피로분석으로도 공지되어 있다. 면역크로마토그래피는 특수 및 고가의 장비를 필요로 하지 않고, 소변과 같은 시료 내 분석물의 존재(또는 부재)를 검출하기 위한 간단한 장치 내로 통합될 수 있다. 면역크로마토그래피는 또한 아래에서 논의된 바와 같이, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치 내로 통합될 수 있다.

면역크로마토그래피의 일반적인 원리는 측방향 유동 테스트 스트립의 다양한 구역을 통해 외부 힘의 조력 없이 모세관 작용에 의해 이동하는 검출할 대사산물(들)을 함유하고 있는 액체 시료에 기초한다. 측방향 유동 테스트 스트립은 대사산물(들)과 상호작용할 수 있는 분자가 부착될 수 있는, 중합체 스트립일 수 있다. 전형적인 측방향 유동 테스트 스트립은 안정성 및 취급성을 위해 뒷받침 카드 위에 장착되어 있는 중첩 멤브레인으로 구성되어 있다. 이러한 측방향 유동 테스트 스트립은 시료로 습윤될 때, 대사산물(들)의 존재 시에 가시적 변화를 제공하고 그리고/또는 상기 시료 내의 대사산물(들)의 농도를 표시하는 하나 이상의 다공성 요소를 포함할 수 있다. 시료는 흡착성 시료 패드 상에, 스트립의 한쪽 끝에 적용되고, 측방향 유동 테스트 스트립을 통해 이동한다. 인접한 다공성 요소는, 일반적으로 검출되고 있는 대사산물(들)에 특이적이며 표지되어 있는 특이적 결합제를 함유하고 있는, 접합체 패드이다. 이들은 함께 표지된 특이적 결합제-대사산물 접합체를 형성할 수 있다. 표지를 특이적 결합제에 연관시키거나 부착하기 위한 방법은 당 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, EP007654에 기재되어 있다. 접합체는 검출 구역이라 불리는 다음의 인접한 다공성 요소 내로 스트립을 따라 이동한다. 이는, 접합체에 존재하는 대사산물(들)과 결합하도록 구성되어 있는, 특이적 결합제와 같은 특이적 생물학적 성분이 상부에 고정된, 니트로셀룰로오스와 같은 다공성 멤브레인이다. 적절하게는, 이는 검출 구역의 하나 이상의 테스트 라인에서 발생한다. 대사산물(들)의 인식은 검출 구역에서 테스트 라인(들)에서의 반응을 생성한다. 테스트 라인으로 표현되는, 결과는 눈에 의해 또는 전용 판독기를 사용하여 평가될 수 있다. 액체는 스트립 재료의 모세관 힘으로 인해 측방향 유동 테스트 스트립을 가로질러 흐르고, 이러한 이동을 유지하기 위해, 흡수 패드라 불리는, 검출 구역에 인접하는 추가 다공성 요소가 선택적으로 존재한다. 이는 과량의 시약을 빨아들이고(wick) 액체의 역류를 방지하기 위해 스트립의 말단에 위치하고 있다. 동일한 조건 하에서 동시에 다수의 대사산물을 테스트하기 위해, 특이적 결합제를 함유하고 있는 추가 테스트 라인들이 어레이 포맷으로 고정될 수 있다. 이러한 구성은 대사산물 이상이 검출되는 본 발명에서 특히 유용하다.

더욱 상세하게, 측방향 유동 테스트 스트립은 일반적으로 (i) 시료 패드; (ii) 접합체 패드; (iii) 검출 구역; 및 (iv) 선택적인 흡수 패드를 포함하고 있다. 시료 패드 및 선택적인 흡수 패드는 측방향 유동 테스트 스트립의 대향 말단들에 위치하고 있다. 통상적으로, 접합체 패드는 시료 패드에 인접하고, 검출 구역은 접합체 패드에 인접하고, 선택적인 흡수 패드는 검출 구역에 인접하고 있다.

측방향 유동 테스트 스트립의 제1 요소는 본원에서 시료 패드로 지칭되는 시료에 대한 다공성 요소이다. 이는 스폰지로서 작용하고, 시료 유체의 잉여분을 보유한다. 그것은 통상적으로 셀룰로오스 또는 유리 섬유 또는 이들의 조합으로 구성되어 있다. 그 기능은 시료를 측방향 유동 테스트 스트립의 다른 구성요소들로 이송하는 것이다. 시료 패드는 부드럽고 연속적이며 균질한 방식으로 시료를 이송할 수 있어야 한다. 시료 패드는 필요에 따라 완충액 및 계면활성제와 같은, 용액으로 함침될 수 있다. 일단 침지되면, 유체는 측방향 유동 테스트 스트립의 제2 요소로 이동한다.

측방향 유동 테스트 스트립의 제2 요소는 접합체를 위한 다공성 요소이며 본원에서 접합체 패드로서 지칭된다. 이것은 대사산물(또는 소정의 분석 포맷에서는, 대사산물 유사체)과 각각이 개별적으로 결합할 수 있는 표지된 특이적 결합제(들)이 존재하는 곳이다. 유리 섬유, 셀룰로오스 및 폴리에스테르는 접합체 패드를 제조하는데 사용되는 재료의 일반적인 예이다. 매트릭스, 예를 들어, 염-당 매트릭스 내에서 건조된 포맷으로, 접합체 패드에 표지된 특이적 결합제가 존재할 수 있다.표지된 특이적 결합제는 표지된 항체 또는 이의 단편 또는 앱타머 또는 아피머 또는 기타 등등일 수 있다. 적어도 2개의 상이한 특이적 결합제(예를 들어, 3개의 특이적 결합제)가 일반적으로 본원에 기술된 대사산물의 각각을 검출하는데 사용될 것이다. 그것의 양을 필요에 따라 조정해서 각각의 대사산물에 대한 분석의 감도를 미세 조정할 수 있다. 통상적으로, 사용되는 각각의 특이적 결합제의 양은 상이할 것이다. 특이적 결합제는 필요에 따라 동일하거나 상이한 표지로 표지될 수 있다. 시료 유체는 특이적 결합제(들)를 가용화시키고 하나의 조합된 수송 작용으로, 접합체 패드를 통해 흐르면서 시료와 특이적 결합제(들)가 혼합하여 표지된 특이적 결합제-대사산물 접합체를 형성하게 된다.

한 구현예에서, 접합체 패드는 하기와 각각이 개별적으로 결합할 수 있는 표지된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA, 적합하게, 여기서 상기 표지된 특이적 결합제의 각각은 항체 또는 이의 단편, 앱타머, 광앱타머, 아피머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자이다.

측방향 유동 테스트 스트립은 다른 분자(들)가 고정되어 있는, 하나 이상의 검출 구역, 예컨대 테스트 라인을 가질 것이다. 일반적으로, 검출 구역은 니트로셀룰로오스 멤브레인일 것이다. 통상적으로, 표지된 특이적 결합제-대사산물 접합체를 포획할 수 있거나 결합에 대해 경쟁할 수 있는 특이적 결합제를 각각 포함하고 있는 적어도 두 개의 테스트 라인이 존재할 것이다. 선택적인 대조군 라인도 포함될 수 있다. 검출 구역의 정확한 구성은, 후술하는 바와 같이, 분석의 포맷, 예컨대 분석의 샌드위치 또는 경쟁 포맷에 따라 달라질 것이다.

일 측면에서, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치가 개시되어 있으며, 여기서 상기 장치는 생물학적 시료에서, 2개 또는 3개의 담배 연기 노출 바이오마커 존재를 검출하기 위해 고체 상 위에 증착된 복수의 상이한 특이적 결합 분자를 포함하고 있으며, 상기 담배 연기 노출 바이오마커는 하기로 구성되어 있다: (i) 코티닌 및 총 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄올 (NNAL); 또는 (ii) 코티닌 및 N-아세틸-S-[2-카르복시에틸]-L-시스테인 (CEMA); 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA. 상기 장치는 샌드위치 포맷 또는 경쟁 포맷으로 사용하도록 구성될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 경쟁 포맷의 사용이 바람직하다.

샌드위치 포맷 분석에서는, 시료가 이동함에 따라, 먼저 접합체 패드와 접하게 된다. 대사산물(들)이 시료 내에 존재하는 경우, 접합체 패드 내의 특이적 결합제(들)는 대사산물(들)에 결합하여, 이동하고 검출 구역에 도달하는 표지된 특이적 결합제-대사산물 접합체를 형성하게 된다. 검출 구역은 또한 대사산물(들)에 특이적 결합제(들)를 함유한다. 시료가 검출 구역에 도달하면 표지된 특이적 결합제-대사산물 접합체가 대사산물에 대한 특이적 결합제에 의해, 하지만 상이한 부위 또는 상기 부위에 대한 에피토프 또는 접합체 패드로부터의 특이적 결합제가 결합되어 있는 에피토프에서 포획될 수 있다. 대사산물은 복합체를 형성하는 항체들 사이에 개재된다. 이로 인해 가시적 변화, 보통 라인 출현을 야기하여, 테스트가 임계값을 넘어섰다고 판독될 수 있게 한다. 샌드위치 분석의 대부분은 대사산물(들)이 존재하는지 여부와 상관없이 출현하게 되는 대조군 라인을 또한 갖는다. 과량의 표지된 항체는 필요할 경우 이차 항체에 의해 포획될 수 있다.

상기 샌드위치 포맷에서 사용하도록 구성되어 있는 장치에 대한 한 구현예에서, (a) 상기 접합체 패드는 각각이 하기 대사산물을 개별적으로 결합할 수 있고: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA, 그리고 표지된 특이적 결합제 대사산물 접합체를 형성할 수 있는 상부에 증착된 표지된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있으며; 및 (b) 상기 검출 구역은 각각 대사산물에 개별적으로 결합할 수 있는 고정화된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다.

하나의 예시적인 포맷에서, 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘지 않았음을 표시하며 비-흡연 대상체를 표시하는 것이고; 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘었음을 표시하고 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘지 않았음을 표시하며 가열된 담배에 노출된 대상체를 표시하는 것이고; 및 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘었음을 표시하고 연소된 담배에 노출된 대상체를 표시하는 것이다. 장치는, 테스트 라인(들)이 예를 들어, 5일째 결과를 사용하여, 표 1에 제시된 데이터를 사용하여 이들 결과를 표시하도록 구성되어 있도록 구성될 수 있다.

경쟁 포맷에서, 시료가 장치 내에서 이동함에 따라, 표지된 접합체, 즉 표지된 대사산물(들)을 함유하거나 대사산물(들)의 표지된 유사체를 함유하고 있는 접합체 패드를 먼저 접하게 된다. 통상적으로, 표지는 항체 또는 이의 단편과 같은, 특이적 결합제의 사용을 통해 대사산물(들) 또는 이의 유사체에 연관되거나 부착된다. 표지된 접합체는 시료에 함유된 대사산물(들), 및 표지된 대사산물(들) 또는 이의 유사체의 혼합물을 형성하기 위해 시료의 존재 시에 가용해진다.

검출 구역에서, 대사산물(들)에 대한 다른 특이적 결합제들이 테스트 라인을 형성하여 고정된다. 이동중인 시료 유체가 검출 구역으로 흐르면, 고정화된 특이적 결합제에 결합하기 위해 시료 대사산물(들)과 표지된 접합체 사이에서 경쟁이 일어난다. 검출 구역에서의 고정화된 특이적 결합제는, 표지된 특이적 결합제가 결합된 부위에 대해 대사산물 상의 상이한 부위에 결합한다.

경쟁 포맷에서 사용하도록 구성되어 있는 장치의 한 구현예에서: (a) 상기 접합체 패드는 상부에 증착된 표지된 대사산물(들)을 포함하고 있거나 이로 구성되어 있으며, 상기 표지된 대사산물(들)은: (i) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체; 또는 (ii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체; 또는 (iii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체로 구성되어 있으며; 및 (b) 상기 검출 구역은 각각이 하기와 개별적으로 결합할 수 있는 고정화된 특이적 결합제를 포함하고 있거나 이로 구성되어 있다: (i) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL 및 CEMA.

경쟁 포맷의 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았음을 표시하며 비-흡연 대상체를 표시하는 것이고; (ii) 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었음을 표시하며 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았음을 표시하며 가열된 담배에 노출된 대상체를 표시하는 것이고; 및 (iii) 상기 장치의 테스트 라인(들) 상에서 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었음을 표시하며 연소된 담배에 노출된 대상체를 표시하는 것이다. 장치는, 테스트 라인(들)이 예를 들어, 5일째 결과를 사용하여, 표 1에 제시된 데이터를 사용하여 이들 결과를 표시하도록 구성되어 있도록 구성될 수 있다. 이 경쟁 포맷은 2개의 특이적 결합제를 동시에 결합할 수 없는 저분자량 화합물과 일반적으로 맞다. 테스트 라인에서 신호의 부재는 대사산물의 존재의 표시이고, 신호의 출현은 음성 결과를 나타낸다. 소정의 구현예들에서, 경쟁 포맷은 본 발명에서 사용하기에 바람직하다.

멀티플렉스 포맷은 단일 스트립으로 하나보다 많은 대사산물을 검출할 수도 있다. 멀티플렉스 검출 포맷은, 다양한 방식으로 예를 들어, 측방향 유동 테스트 스트립의 길이 또는 검출 구역의 길이를 증가시켜서, 구축될 수 있다. 멀티플렉스 포맷은 샌드위치 또는 경쟁 포맷과 함께 사용될 수 있다. 소정의 구현예들에서, 멀티플렉스 경쟁 포맷이 바람직하다.

접합체 패드 및 검출 구역을 통과한 후, 유체는 최종 다공성 요소로 들어갈 수 있으며, 이는 본원에서 흡수 패드로서 지칭된다. 이는 폐기물 용기로서 기능하며 선택적인 특징부다.

측방향 유동 테스트 스트립의 다양한 부분은 지지체로서 기능하는 뒷받침 카드에 걸쳐서 고정되거나 장착되어 있고, 스트립을 취급하는 것을 더욱 용이하게 한다.

시료 내의 대사산물(들)의 수준이 소정의 미리 결정된 임계값 수준 또는 참조 값 또는 기준선 값보다 높으면, 신호가 형성되는 정성적 또는 반-정량적 결과를 얻기 위해, 미리 결정된 양의 고정된 특이적 결합제(들)가 검출 구역에 존재할 수 있다. 이는 미리 결정된 임계값 수준 또는 값에 대응하는, 시료에 존재하는 대사산물(들)의 소정의 양을 포획을 가능하게 할 수 있다. 그런 다음, 결합된 대사산물(들)의 잔량은(존재하는 경우), 그 후에 시료 내의 대사산물(들)의 수준이 미리 결정된 임계값 수준 또는 값보다 높으면 검출 가능한 신호만을 생성하는, 선택적인 추가 검출 구역으로 추가로 이동하도록 허용될 수 있다.

분석 포맷에 따라, 색 또는 신호의 강도는 참조 색 또는 신호 차트와 비교될 수 있다. 대안적으로, 색 또는 신호의 양 또는 강도는, 예를 들어 흡광 센서 또는 발광 계량기를 포함하고 있는 전자 장치로 측정될 수 있어서, 신호 강도 또는 형성된 색상 흡수의 수치 값을 생성한다. 이 구현예는 일정 기간에 걸쳐 대상체에서 상기 대사산물(들)의 수준을 모니터링하기 위해 특히 관련성을 가질 수 있다.

추가 구현예에서, 검출 구역에서의 색 또는 신호의 강도는, 신호의 강도가 소정의 임계 신호보다 위 또는 아래인 경우를 표시하고, 테스트가 양성인 것을 표시하는 참조 색 또는 신호 차트와 비교될 수 있다. 대안적으로, 위에서 논의된 바와 같이, 색 또는 신호의 양 또는 강도는 전자 장치로 측정될 수 있으며, 그 결과 신호 강도 또는 형성된 색상 흡수의 수치 값이 생성되며, 이는 이어서 음성 결과 또는 양성 결과의 형태로 대상체에 표시될 수도 있다.

면역 크로마토그래피를 수행하는 데 있어서 통상적인 단계는 다음과 같다: (a) 표지된 특이적 결합제의 준비 및 대사산물(들)에 대한 표지된 특이적 결합제의 포획; (b) 상기 표지된 특이적 결합제를 측방향 유동 테스트 스트립의 접합체 패드 상으로 증착하고, 상기 측방향 유동 테스트 스트립의 검출 구역 상으로 특이적 결합제를 고정하는 단계; (iii) 구성요소들을 상기 측방향 유동 테스트 스트립 상으로 조립하는 단계; (iv) 선택적인 완충액과 함께, 테스트될 시료를 시료 패드에 첨가하는 단계; (v) 시료가 측방향 유동 테스트 스트립을 통해 흐르도록 기다리는 단계 및; (vi) 검출 구역에서 결과를 판독하는 단계.

측방향 유동 테스트 스트립은 총 NNAL 또는 CEMA, 및 코티닌을 검출하도록 구성될 수 있고, 총 NNAL 및 CEMA 및 코티닌을 검출하도록 구성될 수 있다. 측방향 유동 테스트 스트립은, (예를 들어, 크레아틴, 알부민, 뇨 특이적 단백질, 예컨대 Tamm-Horsfall 단백질(THP)을, 마커(들)로서 사용하여) 자신의 소변에서 임의의 담배 대사산물을 갖지 않는 대상체에 대해 테스트가 작동한다는 것을 입증하기 위한 양성 대조군을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 다른 구현예에서, 측방향 유동 테스트 스트립은 총 NNAL 또는 CEMA, 및 코티닌 및 양성 대조군을 검출하도록 구성되어 있으며, 총 NNAL 및 CEMA 및 코티닌 및 양성 대조군을 검출하도록 구성될 수 있다.

측방향 유동 테스트 스트립은 장치로서 직접 사용될 수 있거나, 필요에 따라 하우징 내로 통합될 수 있다. 따라서, 측방향 유동 테스트 스트립을 포함하고 있는 장치가 또한 개시되어 있다.

대부분의 면역 크로마토그래피 테스트는 순수하게 정성적으로 작동한다. 그러나, 검출 구역의 강도를 측정하여 시료 내의 대사산물의 양을 결정하는 것이 가능하다. 측방향 유동 판독기로 공지된 손에 드는 진단 장치는 몇몇 회사에 의해 사용되어 완전한 정량적 분석 결과를 제공한다. CMOS (상보성 금속 산화물 반도체) 또는 CCD(전하 결합 소자) 검출 기술과 함께 조명을 위해 고유한 파장의 빛을 이용하여, 실제 테스트 라인에 신호가 풍부한 이미지가 생성될 수 있다. 특정 테스트 유형 및 배지를 위해 특별히 설계된 화상 처리 알고리즘을 사용하여, 이어서 테스트 라인 강도는 분석물 농도와 상관될 수 있다. 이러한 하나의 손에 드는 측방향 유동 장치 플랫폼은 Detekt Biomedical LLC에 의해 제조된 것이다. 대안적인 비광학 기술도 정량분석 결과를 보고할 수 있다. 하나의 이러한 예는 자기 면역분석(MIA)이다. 시료 유체의 모세관 펌핑의 변화를 감소시키는 것은, 정성적 결과부터 정량적 결과로 이동하기 위한 또 다른 접근법이다.

본원에 기술된 항체 및 이의 단편은, 검출 구역에서의 특이적 결합제로서 일반적으로 사용되며, 여기서 이들이 면역화학적 상호작용을 통해 대사산물에 특이적으로 결합한다. 앱타머 또는 아피머는 때때로 제조 용이성, 간단한 표지, 향상된 안정성, 향상된 재현성 및 향상된 다능성으로 인해 항체 보다 바람직하다.

특이적 결합제는 표지되어 있고, 광범위한 이러한 표지는 당 기술분야에 주지되어 있다. 그들은 금 나노입자, 셀레늄 나노입자, 양자 도트, 유색 라텍스 비드, 자성 입자, 탄소 나노입자, 은 나노입자, 상향 변환 형광체, 유기 형광체, 섬유 염료, 리포좀 및 효소를 포함할 수 있다. 콜로이드성 금 나노입자는 가장 흔히 사용되는 표지 중 하나이다. 콜로이드성 금은 불활성이고 거의 완벽한 구형 입자를 생성한다. 이러한 입자들은 생체분자에 대해 매우 높은 친화도를 가지며 쉽게 관능화될 수 있다. 금 나노입자의 광학 특성은 전형적으로 민감도를 향상시킨다. 금 나노입자의 광학 신호는, 필요시 은, 금 나노입자 및 효소의 증착에 의해 증폭될 수 있다. 금 나노입자 사용 시, 정성 또는 반-정량 분석은 검출 구역의 시각적 검사에 의해 수행될 수 있다. 시각적 검사의 주요 장점은 신속한 정성적 답변이 얻어질 수 있어 장치의 사용을 단순화하고 즉각적인 결정을 가능하게 하는 것이다. 정량화를 위해, 광학 스트립 판독기를 사용할 수 있다.

실용적인 면역 크로마토그래피에 관한 추가적인 정보는, Wiley Online Library에서 2008년 3월 15일에 공개한 P. J. Davies 등의 핸드북 "Lateral flow immunochromatography assays"에서 찾을 수 있다.

휴대용 측방향 유동 면역분석 장치

다른 구현예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 대사산물 중 하나 이상을 검출하기 위한 - 딥스틱과 같은 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치를 제공한다. 상기 장치는 면역 크로마토그래피의 원리를 사용할 수 있고 상기 논의된 바와 같이 측방향 유동 테스트 스트립을 포함하고 있거나 이로 구성될 수 있다.

이제 본 발명의 일 측면에 따른 샌드위치 포맷 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치에 사용하기 위한 측방향 유동 테스트 스트립이 설명되고 있다. 측방향 유동 테스트 스트립은 (i) 시료 패드; (ii) 접합체 패드; (iii) 검출 구역; 및 (iv) 선택적인 흡수 패드를 포함하고 있다. 시료 패드 및 선택적인 흡수 패드는 측방향 유동 테스트 스트립의 대향 말단들에 위치하고 있다. 통상적으로, 접합체 패드는 시료 패드에 인접하고, 검출 구역은 접합체 패드에 인접하고, 선택적인 흡수 패드는 검출 구역에 인접하고 있다.

측방향 유동 테스트 스트립의 제1 요소는 시료 패드이다. 소변과 같은 시료로 침지되면 유체가 접합체 패드로 이동한다. 이것은 대사산물과 각각이 개별적으로 결합할 수 있는 표지된 특이적 결합제(들)이 존재하는 곳이다. 따라서, 예를 들어, 각각이 (i) 코티닌 및 총 NNAL; (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA에 개별적으로 결합할 수 있는 표지된 특이적 결합제(들), 예컨대 항체 또는 이의 단편, 아피머 또는 앱타머가 존재할 것이다. 그것의 양을 필요에 따라 조정해서 각각의 대사산물에 대한 분석의 감도를 미세 조정할 수 있다. 통상적으로, 사용되는 각각의 특이적 결합제의 양은 상이할 것이다.

검출 구역은 (i) 코티닌 및 총 NNAL 표지된 항체 복합체; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA 표지된 항체 복합체; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA 표지된 항체 복합체를 개별적으로 포획할 수 있는 특이적 결합제를 각각 포함하고 있는 적어도 두 개의 테스트 라인을 포함할 것이다. 검출 구역의 정확한 구성은, 상술한 바와 같이, 분석의 포맷, 예컨대 분석의 샌드위치 또는 경쟁 포맷에 따라 달라질 것이다. 한 구현예에서, 검출 구역에서의 임계값은: (i) 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상이고 임계값은 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상이거나 임계값은 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상이고, 검출 임계값을 넘을 때 검출 가능한 신호가 발생되고; 또는 (ii) 임계값은 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상이고 임계값은 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상이고 임계값은 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상이고, 검출 임계값을 넘을 때 검출 가능한 신호가 발생된다.

휴대용 측방향 유동 면역 분석 장치는 통상적으로 상기 장치가 시료 내로 침지하는 것을 허용하고 측방향 유동테스트 스트립에 필요한 요소만 습윤되도록 허용하기 위해, 액체 밀착 또는 불침투성 하우징과 같은, 하우징 내에 함유된 측방향 유동 테스트 스트립을 포함할 것이다. 장치는 일반적으로 세장형 형상을 가질 것이고, 그 치수는 장치의 실제 용도에 따라 다양할 수 있다; 예시적인 치수는 길이가 6 내지 8cm, 폭이 3 내지 6mm이다.

휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 하나의 추가 예는 WO2007/023372에 설명되어 있으며, 이는 액체 시료에서 대사산물을 결정하기 위한 장치를 개시하고 있으며, 이 장치는, a) 시료 패드; b) 모세관 확산 수단에서 습윤 상태에서 모세관 확산에 의해 자유롭게 이동하는, 가시적 및/또는 측정 가능한 마커에 접합된 대사산물-특이적 검출 시약을 포함하고 있는 상류 방출 구역; 및 c) 상기 모세관 확산 방향으로 연속적으로, 한편에서는 대사산물-특이적 결합제(들)을, 다른 한편에서는 대사산물(들) 또는 고정화되는 대사산물(들)의 유사체를 포함하고 있는, 적어도 2개의 하류 접합체 패드가 구체화되어 있는, 모세관 확산 수단을 포함하고 있다. 시약(들)은 시료 내의 대사산물(들)을 샌드위치 포맷으로 결정할 수 있게 한다.

본원에서 사용하기 위해 고려되는 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 다른 예는 또한 WO2007/023372에 설명되어 있으며, 이는 액체 시료에서 대사산물을 결정하기 위한 장치를 개시하고 있으며, 이 장치는, a) 시료 패드; b) 모세관 확산 수단에서 습윤 상태에서 모세관 확산에 의해 자유롭게 이동하는, 가시적 및/또는 측정 가능한 마커에 접합된 대사산물-특이적 검출 시약을 포함하고 있는 상류 방출 구역; 및 c) 상기 모세관 확산 방향으로 연속적으로, 한편에서는 대사산물-특이적 결합제(들)을, 다른 한편에서는 대사산물(들) 또는 고정화되는 대사산물(들)의 유사체를 포함하고 있는, 적어도 2개의 하류 접합체 패드가 구체화되어 있는, 모세관 확산 수단을 포함하고 있다. 검출 시약(들) 및 대사산물(들), 또는 대사산물 유사체(들)는 경쟁 포맷으로 시료에서 관심있는 대사산물(들)을 결정할 수 있게 한다. 검출 시약(들)은, 접합체 패드의 상류에 형성되는 검출 구역에서 과량이 증착될 수 있다.

본원에서 사용하기 위해 고려되는 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 다른 예는, 예를 들어, EP1657550에 기술된 바와 같이, 2개 이상의 (예를 들어, 여러개의) 대사산물을 동시에 결정하기 위해 구성되어 있는 것이다. 장치는, a) 시료 패드; b) 모세관 확산 수단에서 습윤 상태에서 모세관 확산에 의해 자유롭게 이동하는, 가시적 및/또는 측정 가능한 마커에 접합된, 각각이 대사산물 중 하나에 특이적인, 검출 시약의 혼합물을 포함하고 있는 상류 접합체 패드; 및 c) 상기 이동 방향에 따라 연속적으로 분포되어 있으며, 대사산물 중 하나에 특이적인 특이적 결합제를 각각 포함하고 있는 하류 접합체 패드가 구체화되어 있는, 모세관 확산 수단을 포함하고 있다.

본원에서 사용하기 위해 고려되는 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 다른 예는 US2015/168397에 기재되어 있다. 액체 시료에 함유될 수 있는 적어도 하나 (또는 둘 이상의) 대사산물의 존재 및/또는 양을 결정하기 위한 장치가 개시되어 있으며, 상기 장치는 액체 시료가 모세관 이동 방향과 방식에 따라 측방향으로 이동하도록 의도되어 있는 모세관 확산 수단을 포함하고 있다. 모세관 확산 수단은 시료를 증착하기 위한 시료 패드, 모세관 확산 수단 내에서의 액체 시료의 이동의 결과로서 이동할 수 있는 적어도 하나(또는 2개 이상의) 검출 시약을 포함하고 있는 상류 접합체 패드, 및 모세관 확산 수단에 고정되는 적어도 하나의 (또는 2개 이상의) 특이적 결합제를 각각 포함할 수 있는 적어도 2개의 접합체 패드를 포함하고 있다. 장치는 모세관 확산 수단 상에 형성되어 있고 적어도 하나의 접합체 패드의 하류에 위치되어 있는 적어도 하나의 하류 검출 구역을 더 포함할 수 있다. 하류 검출 구역은 모세관 확산 수단에서의 액체 시료의 이동의 결과로서 이동할 수 있는 적어도 하나(2개 이상의) 검출 시약을 포함할 수 있다. 이어서, 검출 시약 및/또는 특이적 결합제는 대사산물(들)에 특이적으로 결합할 수 있고/있거나 서로에 특이적으로 결합해서 복합체를 형성할 수 있어 상보적인 포획 구역(들)에서 액체 시료 중의 대사산물(들)의 결정을 허용한다.

본 출원의 도 4로 돌아가서, 대상체의 흡연 상태를 결정 또는 구별하기 위한 딥스틱 형태의 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 다른 실시예가 기재되어 있다. 상이한 흡연 상태 결과들이 보이고 있다. 한 구현예에서, 딥스틱은 10-125pg/ml 양의 24시간 소변 내 소변 총 NNAL와 5-80ng/ml 양의 24시간 소변 내 소변 CEMA를 검출하기에 충분히 민감하다. 또 다른 구현예에서, 딥스틱은 10-125pg/ml 양의 24시간 소변 내 소변 총 NNAL 및 5-80ng/ml 양의 24시간 소변 내 소변 CEMA 및 약 200-800ng/ml 양의 소변 코티닌을 검출할 만큼 충분히 민감하다. 흡연 상태를 딥스틱을 사용하여 추론할 수 있다.

도 5는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 딥스틱 형태의 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치의 다른 실시예를 도시하고 있다. 이 실시예에서, 딥스틱을 사용하여 대상체의 3가지 가능한 상이한 흡연 상태를 구별한다. 딥스틱은, 상기 장치에 포함된 측방향 유동 테스트 스트립의 대향 말단들에 시료 패드와 선택적인 흡수 패드를 포함하고 있다. 그것은 3개의 상이한 특이적 결합제, 예컨대 코티닌 콜로이드성 금 표지된 특이적 결합제, 총 NNAL 콜로이드성 금 표지된 특이적 결합제 및 CEMA 표지된 특이적 결합제를 함유하고 있는 시료 패드에 인접하여 접합체 패드를 더 포함하고 있다. 3개의 상이한 특이적 결합제 각각은 그들의 원하는 농도에서 존재할 수 있다. 각각의 대사산물의 경우, 특이적 결합제의 농도를 각각 조정해서 그 대사산물에 대한 분석의 민감도를 미세 조정할 수 있으며 (예를 들어, 검출 임계값 변화), 이는 숙련자에게 통상적인 실험이다.

접합체 패드에 인접하여, 3개의 순차적으로 배치된 테스트 라인을 포함하고 있는 검출 구역이 존재한다. 선택적인 대조군 테스트 라인이 포함될 수 있다. 딥스틱은 경쟁 포맷에서 사용하도록 구성되어 있다. 하나의 테스트 라인은 코티닌, 예컨대 항-코티닌 단클론 항체 또는 이의 단편을 검출하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 테스트 라인은 약 200ng/ml 이상의 임계량에서 사라지도록 구성될 수 있다. 하나의 테스트 라인은 총 NNAL, 예컨대 항-총 NNAL 단클론 항체 또는 이의 단편을 검출하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 테스트 라인은 약 10pg/ml 이상의 임계량에서 사라지도록 구성될 수 있다. 하나의 테스트 라인은 CEMA, 예컨대 항-CEMA 단클론 항체 또는 이의 단편을 검출하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 테스트 라인은 약 5ng/ml 이상의 임계량에서 사라지도록 구성될 수 있다. 딥스틱의 종류를 사용하여 얻을 수 있는 테스트 해석 결과들의 예시를 도 6에서 볼 수 있다.

한 구현예에서, 상기 장치는, 담배 연기 노출 바이오마커의 정성적 결정을 위한 경쟁 포맷 테스트 장치이다. 이러한 실시예는 도 5에서 볼 수 있다. 상기 장치는 액체 밀착 또는 불침투성 하우징에 수용된 측방향 유동 테스트 스트립을 포함해서, 상기 장치의 시료 내로 침지를 가능하게 한다. 하우징은 플라스틱을 포함하고 있거나 플라스틱으로 구성될 수 있다. 시료는 소변과 같은 액체 시료일 수 있다. 측방향 유동 테스트 스트립은, 강성을 스트립에 부여하기 위해 플라스틱 또는 PVC 지지체 같은 지지체 상에 함께 조립되어 있는 상이한 중첩된 다공성 요소로 제조된 것일 수 있다. 스트립은 세장형 형상을 가질 수 있으며, 그 치수는 장치의 실제 사용에 따라 다양할 수 있다; 예시적인 치수는 길이가 6 내지 8cm, 폭이 3 내지 6mm이다. 시료 패드는 셀룰로오스 종이 물질과 같은 다양한 흡수성 재료로 제조된 것일 수 있다. 접합체 패드는 유리 섬유와 같은 다양한 재료로 제조된 것일 수 있다. 상기 측방향 유동 테스트 스트립의 일부를 형성하고 있는 기타 패드들은 니트로셀룰로오스로 제조된 것일 수 있다. 필요한 경우, 패드들을 조립하기 전에, 이들 중 하나 이상을 화학적 및/또는 생화학적으로 처리하거나, 또는 변형해서, 시료 투과성 및/또는 시료 모세관 이동을 얻을 수 있다. 전달 또는 유동은 전체 측방향 유동 테스트 스트립 전체에서 그리고 그를 따라 발생할 수 있다. 필요한 경우, 예를 들어, 특히 검출 구역의 테스트 라인(들)에서, 요구되는 면역화학적 상호 작용(들)을 스트립과 획득하기 위해, 시약(들)을 패드 상으로 가져오기 전 또는 후에 유사한 처리가 수행될 수 있다. 예시적인 검출제는 콜로이드성 금과 같은 유색 입자이다. 이러한 입자들은 상이한 크기(통상적으로 약 40 내지 약 100nm)로, 그리고 상이한 색상으로 이용 가능하다. 코티닌, 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상, 또는 둘 이상 또는 셋 이상을 갖는 유색 입자(예를 들어, 콜로이드성 금)를 갖는 상이한 접합체는, 액체 상에서 함께 혼합되고, 증착되고, 접합체 패드 상에서 건조될 수 있다. 3개의 특이적 항-코티닌, 항-총 NNAL, 및 항-CEMA 특이적 결합제 - 예컨대 단클론 항체 -는 검출 구역에서 3개의 상이한 가로방향 테스트 라인에서 또는 그를 따라 측방향 유동 테스트 스트립의 니트로셀룰로오스 막 상에 증착되고 고정될 수 있다. 적절한 특이적 시약이 또한 테스트 장치 상에 증착되어 검출 구역에서 스트립의 하류 말단에서 대조군 라인을 형성할 수 있다. 항-THP 또는 항-크레아티닌 특이적 결합제 - 예컨대 단클론 항체 - 또는 이의 단편 매칭된 쌍을 측방향 유동 테스트 스트립 상에서 사용하여, 검출 구역의 스트립의 하류 말단에서도, 뇨 양성 대조군 라인을 얻을 수 있다.

또한, 딥스틱 상에 배치된 적어도 2개의 상이한 접합체 패드 및 각각의 접합체 패드 상에 증착된, 상이한 특이적 결합제 모이어티를 갖는 딥스틱과 같은, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치를 포함하고 있는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 키트가 또한 개시되어 있고, 각각의 특이적 결합제는 본원에 설명된 대사산물 중 상이한 하나를 포획할 수 있다. 선택적으로, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 지침서 세트가 키트 내에 포함될 수 있다.

또한, 장치 상에 배치된 적어도 2개의 상이한 접합체 패드 및 각각의 접합체 패드 상에 증착된, 상이한 특이적 결합제를 포함하고 있는 딥스틱과 같은, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치가 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위해 또한 개시되어 있고, 각각의 특이적 결합제는 본원에 설명된 대사산물 중 상이한 하나를 개별적으로 포획할 수 있다.

대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 키트 또는 장치의 용도 또한 개시되어 있다.

가정, 임상 또는 실험실 사용을 위한 휴대용 장치

또한, 예를 들어, 가정에서 또는 임상 또는 실험실 환경에서 사용하기 위한 장치와 같은, 휴대용 장치, 및 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위해 이 장치를 포함하고 있는 키트가 본원에 개시되어 있다.

따라서, 관련된 측면은 대상체로부터의 시료 내의 본원에 교시된 대사산물의 존재 및/또는 양을 측정할 수 있는 휴대용 테스트 장치를 제공하고 있으며, 상기 장치는 하기를 포함하고 있다: (i) 대상체로부터 시료를 얻기 위한 수단, (ii) 상기 시료 내의 대사산물의 양을 측정하기 위한 수단, 및 (iii) 시료 내의 대사산물의 양을 시각화하기 위한 수단.

한 구현예에서, 상기 시각화 수단은 대상체 내의 대사산물의 양이 소정의 참조 또는 기준선 값으로부터 벗어나는지(예를 들어, 그 아래 또는 위) 여부를 표시할 수 있다. 따라서, 휴대용 테스트 장치는 또한 상기 참조 또는 기준선 값 또는 이를 확립하기 위한 수단을 적절하게 포함할 수 있다.

시료 내의 분자 또는 분석물의 상대적인 양은, 상기 다른 값에 비해, 예컨대 참조 값에 비해 증가 또는 감소로서, 배수-증가 또는 배수-감소로서 표현될 수 있다. 제1 및 제2 변수 (예, 제1 및 제2 수량) 사이의 상대적인 비교를 수행하는 것은 먼저 상기 제1 및 제2 변수의 절대 값을 결정할 필요가 없을 수도 있다. 예를 들어, 측정 방법은 상기 제1 및 제2 변수를 위한 정량화 가능한 판독값(예를 들어, 예, 신호 강도)을 생성할 수 있고, 여기서 상기 판독값은 상기 변수들의 값의 함수이고, 여기서 상기 판독값을 직접 비교해서 상기 판독값을 각각의 변수들의 절대 값으로 우선 실제로 변환할 필요 없이, 상기 제1 변수 대 상기 제2 변수에 대한 상대 값을 생성할 수 있다.

대사산물 중 임의의 것이 집합적으로 측정될 수 있어서, 측정된 수량은 집합적으로 측정된 종의 합계에 상응한다. 다른 실시예에서, 임의의 대사산물은 각각 개별적으로 측정될 수 있다.

질량 분광 기술

이 기술은 또한 본원에 기술된 대사산물 중 하나 이상을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 분자의 질량에 대한 정확한 정보를 얻을 수 있는 임의의 질량 분광(MS) 기술이 본원에서 유용하다. 적절한 MS 및 MS/MS 기술과 시스템은 그 자체로 주지되어 있으며 (예를 들어, LC/MS: A Practical User's Guide by Marvin C. McMaster ISBN: 9780471655312; Methods in Molecular Biology, vol. 146: “Mass Spectrometry of Proteins and Peptides”, by Chapman, ed., Humana Press 2000, ISBN 089603609x; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79; 또는 Methods in Enzymology, vol. 402: “Biological Mass Spectrometry”, by Burlingame, ed., Academic Press 2005, ISBN 9780121828073 참조) 본원에서 사용될 수 있다. 화학 또는 생물학 종의 분석에 적합한 MS 배열, 기기 및 시스템은 제한 없이, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 시간비행형(matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight; MALDI-TOF) MS; MALDI-TOF 이온원후 붕괴(post-source-decay; PSD); MALDI-TOF/TOF; 표면 증강 레이저 탈착/이온화 시간비행형 질량 분광분석법(SELDI-TOF) MS; 전기분무 이온화 질량 분광분석법(ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n (n은 0보다 큰 정수임); ESI 3D 또는 선형(2D) 이온 트랩 MS; ESI 삼중 사중극자 MS; ESI 사중극자 직교 TOF(Q-TOF); ESI 푸리에 변환 MS 시스템; 실리콘 상 탈착/이온화(DIOS); 이차 이온 질량 분광분석법(SIMS); 대기압 화학 이온화 질량 분광분석법(APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI-(MS)n; 대기압 광이온화 질량 분광분석법(APPI-MS); APPI-MS/MS; 및 APPI- (MS)n을 포함할 수 있다. 질량 분광분석법에 의한 화학 종의 검출 및 정량화는, 다른 것들 중에서 Roepstorff & Fohlman (Biomed. Mass Spectrom. (1984) 11, 601)이 기술한 바와 같은, 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring; MRM)을 포함할 수 있다. MS 분석 방법은 상류의 화학 종 분리 또는 분별 방법과, 예를 들어, 크로마토그래피 및 본원에 기술된 다른 방법과 유리하게 조합될 수 있다.

크로마토그래피

크로마토그래피 또한 본원에 기술된 대사산물을 포함하고 있는 화학 종을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "크로마토그래피"는 당 기술분야에 이렇게 지칭되고 광범위하게 이용가능한, 화학 물질 분리 방법을 포괄한다. 바람직한 접근법에서, 크로마토그래피는, 액체 또는 기체의 이동 스트림("이동상")에 의해 운반되는 화학 물질의 혼합물이 고정형 액체 또는 고체 상("정지상") 주위로 또는 그 위로 흐르면서, 상기 이동상 및 상기 정지상 사이에서, 대사산물의 차등 분포의 결과로서 성분들로 분리되는 공정을 지칭한다. 정지상은 일반적으로 미세하게 분할된 고체, 필터 물질의 시트, 또는 고체 표면 상의 액체의 박막 등일 수 있다.

본원에서 사용되는 크로마토그래피는 바람직하게는 컬럼 (즉, 여기서 정지상은 컬럼 내에 증착되거나 포장됨), 바람직하게는 액체 크로마토그래피, 및 보다 바람직하게는 HPLC일 수 있다. 크로마토그래피의 특이사항들이 당 기술분야에 주지되어 있지만, 추가 지침을 위해, 예, Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X, 및 "Practical HPLC Methodology and Applications", Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993을 참조한다. 예시적인 형태의 크로마토그래피에는 제한 없이, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 정상 상 HPLC(NP-HPLC), 역상 HPLC(RP-HPLC), 이온 교환 크로마토그래피(IEC), 예컨대 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 겔 여과 크로마토그래피(HILIC) 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함한 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 크로마토포커싱, 면역 친화도, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 같은 친화도 크로마토그래피 등이 포함된다.

키트

본 개시는 본원에서 교시된 바와 같은 대사산물의 검출을 위한 키트를 추가로 제공하고 있으며, 대상체로부터의 시료에서 본원에 교시된 하나 이상의 대사산물(들)의 수준을 검출하기 위한 수단을 포함하고 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 키트 또는 키트들은, 이상적으로, 가정용 또는 일반적인 실무 환경에서 사용하도록 설계된 것이다.

또한 키트, 특히 대상체에서 본원에 교시된 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 키트가 개시되어 있으며, 상기 키트는 (i) 특히 대상체로부터의 시료에서, 본원에서 교시된 대사산물을 측정하기 위한 수단, 및 (ii) 상기 대사산물 또는 대사산물들에 대한 참조 값 및 상기 참조 값을 확립하기 위한 수단을 포함하고 있고, 여기서 상기 참조 값은 상기 대사산물들의 검출을 나타낸다.

가정용 테스트 키트는, 내과 실무진에 연락할 수 있어서, 이후에 적절한 조치가 취해질 수 있는, 판독값을 대상체에게 제공할 수 있다. 비제한적인 예는 고체 상, 예를 들어, 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치 - 예컨대 딥스틱에 부착된 요구 대사산물(들)을 위한 특이적 결합 분자를 포함하고 있는 시스템이다. 하나의 비제한적인 예는 측방향 유동테스트-스트립 및 표지된 특이적 결합제(예를 들어, 샌드위치 포맷으로)를 사용하는 것이며 이 조합은 어떠한 멤브레인 세척도 필요로 하지 않는다. 측방향 유동테스트 스트립은, 예를 들어, 제1 항-hCG 항체가 지지체 상에 존재하고, 가시화를 허용하는 고정화된 제2 항-hCG 항체 상으로의 소변의 흐름에 의해 hCG와 복합체로 운반되는 임신 테스트 키트 분야에서 주지되어 있다. 이러한 가정용 테스트 장치, 시스템 또는 키트의 다른 비제한적인 예는, 예를 들어 다음의 미국 특허들: 6,107,045, 6,974,706, 5,108,889, 6,027,944, 6,482,156, 6,511,814, 5,824,268, 5,726,010, 6,001,658 또는 미국 특허 출원: 2008/0090305 또는 2003/0109067에서 발견될 수 있다.

키트 내에서 대사산물의 존재 및/또는 양을 측정하기 위한 수단은 상기 대사산물(들)에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 특이적 결합제는 특히 항체 또는 이의 단편, 앱타머, 아피머, 광앱타머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자일 수 있다. 본 발명의 키트들은 본원에 교시된 하나 이상의 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 앱타머, 아피머, 또는 항체 또는 이의 단편, 보다 바람직하게는 하나 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 결합제는 유리하게는 고체 상 또는 지지체에 증착되거나 고정될 수 있다. 키트는 면역분석 기술 또는 질량 분광분석 분석 기술 또는 크로마토그래피 기술, 또는 상기 기술들의 조합을 사용할 수 있다. 적합하게는, 키트는, 면역분석 기술을 이용하되, 바람직하지만 비제한적인 예들로, 효소-결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 형광 면역분석, 화학발광 면역분석, DRI 면역분석, 정량적 면역검정, 측방향 유동 면역분석, 미세유체 면역분석 및 응집 면역 분석 기술, 바람직하게는 ELISA을 사용한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 본원에 교시된 임의의 하나 이상의 대사산물의 존재 및/또는 양은 경쟁 포맷 또는 샌드위치 포맷 결합 분석을 사용하고/하거나 유도체화 및/또는 착색제-함유 제제를 사용하는, 항체-기반 또는 크로마토그래피-기반 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 따라서, 마커(들)의 양을 측정하기 위한 수단은 면역분석, 예컨대 항체(들) 또는 이의 단편 또는 앱타머 또는 아피머를 별도로 또는 조합하여(예: ELISA 또는 RIA 분석) 사용하는 면역분석일 수 있다.

따라서, 키트, 특히 대상체에서 본원에 교시된 대사산물의 검출을 위한 키트가 개시되어 있으며, 상기 키트는 (i) 특히 대상체로부터의 시료에서, 본원에 기술된 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 특이적 결합제, (ii) 바람직하게는, 상기 대사산물의 공지된 양 또는 농도 (예, 대조군, 표준 및/또는 보정제로 사용하기 위함), (iii) 선택적으로 그리고 바람직하게는 상기 대사산물 또는 대사산물들에 대한 참조 값 또는 상기 참조 값을 확립하기 위한 수단을 포함하고 있고, 여기서 상기 참조 값은 상기 대사산물들의 검출을 나타낸다. (i) 및/또는 (ii) 하에서 상기 구성요소들은 본원에 기재된 바와 같이 적절하게 표지될 수 있다.

또한, 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 키트가 개시되어 있고, 하기를 포함하고 있거나 이들로 구성되어 있다: (i) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기에 적합하고, 여기서 상기 바이오마커는 코티닌으로 구성되어 있는, 제1 장치;(ii) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기에 적합하고, 여기서 상기 바이오마커는 NNAL으로 구성되어 있는, 제2 장치; 및/또는(iii) 생물학적 시료에서 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기에 적합하고, 여기서 상기 바이오마커는 CEMA로 구성되어 있는, 제3 장치; 및 선택적으로, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 지침서 세트. 각각의 장치는 일반적으로 고체상에 부착되어 있는 코티닌 또는 총 NNAL 또는 CEMA에 특이적 결합 분자를 포함하고 있으며, 적합하게는, 여기서 상기 장치는 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치 - 예컨대 딥스틱이다. 일반적으로, 상기 제1 장치의 특이적 결합 분자는 약 200-800ng/ml 양으로 소변 코티닌을 검출하기에 적합하다. 일반적으로, 상기 제2 장치의 특이적 결합 분자는 10-125pg/ml 양으로 24 시간-소변에서 소변 총 NNAL을 검출하기에 적합하다. 일반적으로, 상기 제3 장치의 특이적 결합 분자는 5-80ng/ml 양으로 24시간 소변에서 소변 CEMA를 검출하기에 적합하다. 대사산물 양은 면역분석, 적합하게는, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 형광 면역분석, 화학발광 면역분석, DRI 면역분석, 정량적 면역검정, 측방향 유동 면역분석, 미세유체 면역분석, 응집 면역분석 기술, ELISA, 또는 항체- 또는 크로마토그래피, 적합하게는 경쟁 결합 분석 또는 유도체화 및/또는 착색제-함유 제제를 사용하는 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 특이적 결합 분자는 항체 또는 이의 단편, 앱타머, 광앱타머, 단백질, 펩티드, 펩티드모방체 또는 소분자 또는 이들 중 두 개 이상의 조합으로 구성되어 있는 군으로부터 선택될 수 있다. 각각의 장치는 면역 크로마토그래피 장치, 적합하게 측방향 유동 면역 크로마토그래피장치일 수 있다. 또한 본원에 교시된 대사산물의 검출을 위해 본원에 기술된 바와 같은 키트의 용도가 개시되어 있다.

또한, 본원에서 교시된 대사산물에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합제, 바람직하게는 공지된 양 또는 농도의 상기 결합제를 포함하고 있는 결합제 어레이 또는 마이크로어레이가 개시되어 있다. 이러한 결합제는 본원에서 상세히 설명될 수 있다.

표지

일부 구현예에서, 본원에 개시된 시약은 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 용어 “표지”는 검출가능하고 바람직하게는 정량가능한 판독값 또는 특성을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 대사산물 또는 특이적 결합제와 같은 관심있는 개체 중 일부에 부착되거나 또는 그것으로 만들어질 수 있는 임의의 원자, 분자, 모이어티 또는 생체분자를 지칭한다. 표지는 질량 분광분석법, 분광, 광학, 비색, 자기, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 적절히 검출될 수 있다. 표지는 제한 없이 염료; 방사성표지, 예컨대 32P, 33P, 35S, 125I, 131I; 전자 밀집 시약; 효소(예를 들어, 면역분석에 널리 사용되는 바와 같은 서양고추냉이 인산분해효소 또는 알칼리성 인산분해효소); 비오틴-스트렙타비딘과 같은 결합 모이어티; 디곡시게닌(digoxigenin) 같은 합텐; 발광, 인광 또는 형광 모이어티; 질량 태그; 단독으로 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 의해 방출 스펙트럼을 억제 또는 이동시킬 수 있는 모이어티와 조합한 형광 염료를 포함하고 있다. 다른 종류의 표지, 예를 들면 유색 입자, 예를 들어 금 나노입자가 또한 본원에 기재되어 있다.

예를 들어, 표지는 질량 변경 표지일 수 있다. 바람직하게는, 질량 변경 표지는 상응하는 비-표지된 대사산물에 대한 대사산물의 하나 이상의 화학적 모이어티에서 별개의 안정적인 동위원소의 존재를 포함할 수 있다. 질량 표지된 모이어티는 질량 분광분석 적용예에서 양성 대조군, 표준 및 보정자로 특히 유용하다. 특히, 하나 이상의 별개의 동위원소를 포함하고 있는 분자는 화학적으로 유사하며, 동일한 방식으로 크로마토그래피 및 전기영동적으로 별도이며, 또한 동일한 방식으로 이온화 및 단편화된다. 그러나, 적절한 질량 분석기에서, 이러한 분자는 구별가능한 m/z 비율을 표시할 것이고 따라서 차별될 수 있다. 구별가능한 안정적인 동위원소의 쌍의 예는 H 및 D, ¹²C 및 ¹³C, ¹⁴N 및 ¹⁵N 또는 ¹⁶O 및 ¹⁸O를 포함한다.

또한, 선택적으로 검출가능한 표지를 상기 대사산물의 정성적 또는 정량적 검출 분석(측정 방법)에서, 그리고 특히 대상체에서 본원에 교시된 대사산물의 검출을 위한 방법에서, (양성) 대조군, 표준 및 보정자로서, 포함하고 있는, 본원에 교시된 바와 같은 대사산물의 용도가 고려되고 있다. 대사산물은 임의의 형태로, 특히 액체 또는 얼린 상태로 용액 중에서, 침전물로서, 또는 고체 상, 예컨대 고체 크로마토그래피 매트릭스 또는 유리 또는 플라스틱 또는 다른 적합한 표면 상에서 공유 또는 비공유 고정된 형태로(예, 어레이 또는 마이크로어레이의 일부로서) 공급될 수 있다.

편차

제2 값으로부터의 제1 값의 "편차"는 일반적으로 임의의 방향 (예, 증가: 제1 값 > 제2 값; 또는 감소: 제1 값 < 제2 값) 및 임의의 변경 정도를 포괄할 수 있다. 예를 들어, 편차는, 비교가 이루어지고 있는 제2 값에 대하여, 제한 없이, 적어도 약 10%(약 0.9배 이하)만큼, 또는 적어도 약 20%(약 0.8배 이하)만큼, 또는 적어도 약 30%(약 0.7배 이하)만큼, 또는 적어도 약 40%(약 0.6배 이하)만큼, 또는 적어도 약 50%(약 0.5배 이하)만큼, 또는 적어도 약 60%(약 0.4배 이하)만큼, 또는 적어도 약 70%(약 0.3배 이하)만큼, 또는 적어도 약 80%(약 0.2배 이하)만큼, 또는 적어도 약 90%(약 0.1배 이하)만큼 제1 값의 감소를 포함할 수 있다.

예를 들어, 편차는, 비교가 이루어지고 있는 제2 값에 대하여, 제한 없이, 적어도 약 10%(약 1.1배 이상), 또는 적어도 약 20%(약 1.2배 이상)만큼, 또는 적어도 약 30%(약 1.3배 이상)만큼, 또는 적어도 약 40%(약 1.4배 이상)만큼, 또는 적어도 약 50%(약 1.5배 이상)만큼, 또는 적어도 약 60%(약 1.6배 이상)만큼, 또는 적어도 약 70%(약 1.7배 이상)만큼, 또는 적어도 약 80%(약 1.8배 이상)만큼, 또는 적어도 약 90%(약 1.9배 이상)만큼, 또는 적어도 약 100%(약 2배 이상)만큼, 또는 적어도 약 150%(약 2.5배 이상)만큼, 또는 적어도 약 200%(약 3배 이상)만큼, 또는 적어도 약 500%(약 6배 이상)만큼, 또는 적어도 약 700%(약 8배 이상)만큼 제1 값의 증가를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 편차는 통계학적으로 유의한 관측된 변경을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 편차는 주어진 집단에서 참조 값의 오차 한계를 벗어난 관측된 변경을 지칭할 수 있다 (예를 들어, 표준 편차 또는 표준 오차, 또는 그의 미리 결정된 배수로 표현됨, 예, ±1xSD 또는 ±2xSD, 또는 ±1xSE 또는 ±2xSE). 편차는 주어진 집단에서 값으로 정의된 참조 범위를 벗어난 값을 지칭할 수 있다 (예를 들어, 상기 집단에서 값의 ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥75% 또는 ≥80% 또는 ≥85% 또는 ≥90% 또는 ≥95% 또는 심지어 ≥100%).

관측된 변경이 주어진 임계값 또는 컷-오프를 초과하면 편차가 결론날 수 있다. 이러한 임계값 또는 컷-오프는, 검출방법에 대해 선택된 감도 및/또는 특이성, 예를 들어, 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 감도 및/또는 특이성을 제공하기 위해 당 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 선택될 수 있다.

추가적 방법

시료에서의 대사산물(들)의 존재 및/또는 농도는 그 위에 고정된 상기 대사산물(들)에 대한 결합 분자를 갖는 칩을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 생물발광 공명 에너지 전달(BRET), 형광 ?칭, 형광 편광 측정 또는 당 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 측정될 수 있다. 기술된 결합 분석법 중 임의의 것을 사용하여 시료 내의 임의의 대사산물(들)의 존재 및/또는 농도를 결정할 수 있다. 이렇게 하기 위해, 대사산물(들)을 위한 결합 분자는 시료와 반응하고, 대사산물(들)의 농도는 사용 중인 결합 분석에 적절한 것으로 측정된다. 분석을 검증하고 보정하기 위해, 다양한 농도의 표준 대사산물(들) 및/또는 결합 분자를 사용하여 대조군 반응을 수행할 수 있다. 고체 상 분석이 사용되는 경우, 인큐베이션 후에, 미결합 대사산물을 제거하기 위해 세척 단계를 수행한다. 결합된 대사산물을 주어진 표지에 적절한 것으로 측정된다 (예, 섬광 계수, 형광, 항체-염료 등). 정성적 결과를 원하는 경우, 대조군과 다른 농도는 필요하지 않을 수 있다. 물론, 상기 대사산물(들)과 결합 분자의 역할이 서로 바뀔 수도 있으며; 숙련자라면 결합 분자가 다양한 농도의 시료로, 시료에 적용되도록 방법을 적응시킬 수도 있다.

본 발명에서 대사산물을 측정하기 위해, 선택적으로 상술한 분석 방법 중 임의의 것과 함께, 추가의 화학 종 분리, 동정 또는 정량화 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 제한 없이, 화학 추출 분획, 모세관 등전점 집적(CIEF), 모세관 등속이동(CITP), 모세관 전기크로마토그래피(CEC) 등을 포함한, 등전점 집적(IEF), 1차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2D-PAGE), 모세관 겔 전기영동(CGE), 모세관 구역 전기영동(CZE), 미셀 동전기 크로마토그래피(MEKC), 자유 유동 전기영동(FFE) 등을 포함한다.

입체 및 기하 이성질체

본원에 개시된 대사산물은 입체 이성질체 및/또는 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 이들은 하나 이상의 비대칭 및/또는 기하학적 중심을 보유할 수 있고, 따라서 2개 이상의 입체 이성질체 및/또는 기하학적 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 개별 입체 이성질체 및 그의 기하 이성질체, 및 이들의 혼합물의 용도를 고려하고 있다.

종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 방법

테스트된 대상체가 종래의 궐련의 소비자인 것으로 추정되는 경우, 대상체는 이 테스트 결과에 기초하여 종래의 궐련의 흡연을 감소시키기 위해 하나 이상의 요법을 투여받을 수 있다.

종래의 궐련의 흡연을 감소시키도록 흡연자를 돕기 위한 많은 요법들이 개발되었으며, 한 가지 우세한 것은 니코틴 대체 요법이다. 니코틴 대체 요법은 적절한 전달 시스템을 통해 니코틴을 투여하는 것을 포함한다. 현재 시판중인 니코틴 대체 제품은 (1) 니코틴 경피 패치, 예컨대 NicoDerm® CQ® (GlaxoSmithKline ), Habitrol® (Novartis Consumer Health), 및 Nicotrol ® (Pharmacia Consumer Healthcare); (2) 니코틴 검, 예컨대 Nicorette® (GlaxoSmithKline); (3) 니코틴 비강 스프레이, 예컨대 Nicotrol NS® (Pharmacia Consumer Healthcare); 및 (4) 니코틴 흡입기(Nicotrol® 니코틴 흡입 시스템(Pharmacia Consumer Healthcare)을 포함한다. 항우울제 또한 금연 요법으로 개발되거나 제안되었다. 이러한 항우울제 중 하나는 부프로피온(bupropion)이다. 흡연 절제 치료를 위해 제안된 다른 항우울제는, 독세핀(doxepin), 이미프라민(imipramine)을 포함한다. 예를 들어, 이소발레르아미드(isovaleramide), 디아제팜(diazepam), 메프로바메이트(meprobamate), 메토프로롤(metoprolol), 온단세트론(ondansetron), 및 옥스프레노롤(oxprenolol)을 포함하고 있는, 흡연 절제 요법으로서 항불안제가 탐색되거나 제안되었다. 흡연 절제 요법으로서 탐색된 제제의 또 다른 부류는 니코틴 수용체 길항제이며, 그 예는 메카밀아민(mecamylamine), 헥사메토늄(hexamethonium), 디하이드로-베타-에리트로이딘 및 d-튜보큐라린(d-tubocurarine)을 포함한다. 또 다른 류의 제제는 오피오이드 길항제, 예컨대 날트렉손(naltrexone) (17-(시클로프로필메틸)-4,5-에폭시-3,14-디하이드록시모 힌난-6-온으로도 공지됨), 날록손(naloxone) (4,5-에폭시-3,14-디히드록시-17-(2-프로페닐)모르피난-6-온으로도 공지됨), 및 날메펜(nalmefene) (5알파-17-(시클로프로필메틸)-4,5-에폭시-6-메틸렌모르피난-3,14-디올로도 공지됨)이다.

보험

본 발명은, 대상체의 흡연 상태에 기초하여 보험에 대한 적합성을 결정하거나 보험료를 계산하는 것에 적용예를 찾을 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 대상체의 흡연 상태에 기초하여 보험의 적합성을 결정하거나 또는 보험료를 계산하는 방법이 제공되고 있으며, 하기 단계를 포함하고 있다: (i) 시료 중의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 상기 대상체로부터의 생물학적 시료에서 측정하되, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계: (ii) 상기 (i) 단계의 측정에 기초하여 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계; 및 (iii) (ii) 단계의 대상체의 흡연 상태 결정에 기초하여 대상체의 보험의 적합성을 결정하거나 대상체의 흡연 상태에 기초하여 보험료를 계산하는 단계.

임상 시험

본 발명은 임상 시험에서의 적용예를 찾을 수 있다. 예시로서, 대상체가 특정 흡연 상태를 갖도록 임상 시험에 대한 준수가 요구하는 경우, 본 발명은 이러한 흡연 상태를 모니터링하거나 확인하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 대상체가 임상 시험을 준수하는지 결정하기 위한 방법이 제공되고 있으며, 하기 단계를 포함하고 있다: (i) 시료 중의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 상기 대상체로부터의 생물학적 시료에서 측정하되, 상기 대사산물은 코티닌및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계: (ii) 상기 (i) 단계의 측정에 기초하여 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계; 및 (iii) (ii) 단계의 대상체의 흡연 상태 결정에 기초하여 대상체가 임상 시험을 준수하는지 결정하는 단계.

대상체가 임상 시험의 요건을 준수하지 않은 것으로 결정되면 대상체는 임상 시험에서 제거될 수 있다.

대상체가 임상 시험의 요건을 준수하지 않은 것으로 결정되면 해당 대상체로부터 기인하는 데이터를 임상 시험에서 제거할 수 있다.

관련된 측면에서, 대상체가 임상 시험의 흡연 상태를 준수하지 않은 것으로 결정될 수 있고, 이 경우 비-준수 대상체는 시험에서 제거될 수 있거나, 비-준수 대상체로부터의 데이터는 임상 시험에서 제거될 수 있다.

연산

또한 시스템이 본원에 기재되어 있으며, 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상의 양의 참조 값을 포함하고 있거나 그것으로 구성되어 있는 컴퓨터 데이터 저장소로, 상기 참조 값은 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 대사산물의 공지된 양을 나타내는, 상기 컴퓨터 데이터 저장소; 및 상기 데이터 저장소에 접근하고 대상체로부터의 시료 내의 대사산물의 양에 대한 정보와 조합되어 상기 데이터 저장소로부터의 정보를 사용하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하도록 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 포함하고 있다. 시스템의 사용 및 흡연 상태를 결정하기 위한 시스템의 사용을 포함하고 있는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법이 또한 개시되어 있다. 기술과 장치는 프로그래밍된 연산 시스템을 포함하고 있는, 임의의 적절한 하드웨어에 구현될 수 있다. 본 발명은 다수의 범용 또는 특수 목적 연산 시스템 환경 또는 구성으로 작동한다. 사용하기에 적합할 수 있는 주지의 연산 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 개인용 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 휴대용 또는 랩톱 장치, 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서 기반 시스템, 셋톱 박스, 프로그래밍가능 소비자 전자 장치, 네트워크 PC, 미니컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터, 분산 연산 환경 또는 상기 시스템 또는 장치 중 임의의 것을 포함하고 있는 클라우드 기반 연산 환경을 포함할 수 있다. 연산 환경은 프로그램 모듈과 같은 컴퓨터 실행가능 명령어를 실행할 수 있다. 일반적으로, 프로그램 모듈은 특정 작업을 수행하거나 구체적인 추상적 데이터 유형을 구현하는 루틴, 프로그램, 객체, 컴포넌트, 데이터 구조 등을 포함하고 있다. 본 개시는, 또한, 통신 네트워크를 통해 링크되는 원격 처리 장치에 의해 수행되는 분산 연산 환경에서 실시될 수도 있다. 분산 연산 환경에서, 프로그램 모듈은 메모리 저장 장치를 포함하고 있는 로컬 및 원격 컴퓨터 저장 매체 모두에 위치할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 시스템의 구성요소는 처리 유닛, 시스템 메모리, 및 시스템 메모리를 포함하고 있는 다양한 시스템 구성요소를 처리 유닛에 결합시키는 시스템 버스를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 시스템 버스는 메모리 버스 또는 메모리 컨트롤러, 주변 버스, 및 다양한 버스 아키텍처 중 임의의 것을 사용하는 로컬 버스를 포함하고 있는 여러 유형의 버스 구조체일 수 있다. 예시로서, 제한 없이, 이러한 아키텍처는, 산업 표준 아키텍처(ISA) 버스, 마이크로 채널 아키텍처(MCA) 버스, 향상된 ISA(EISA) 버스, 비디오 전자기기 표준 협회(VESA) 로컬 버스, 및 Mezzanine 버스로도 공지된 주변기기 구성요소 상호연결(PCI) 버스를 포함하고 있다. 컴퓨터는, 통상적으로, 당 기술분야에 주지되어 있는, 다양한 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하고 있다.

필요에 따라, 테스트는, 선택적으로 실시간으로, 테스트 결과의 자동 통신을 허용하는 모바일 리더와 연관될 수 있다.

본 발명의 추가 측면들이 하기 번호가 매겨진 단락들에 제시되어 있다:

1. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법으로, (i) 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 상기 대상체로부터의 생물학적 시료에서 측정하되, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계: 및 (ii) 상기 (i) 단계의 측정에 기초하여 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

2. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법으로, (i) 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 상기 대상체로부터의 생물학적 시료에서 측정하되, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계; (ii) (i) 단계에서 측정된 대사산물의 양을 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA의 공지된 양을 나타내는 참조 또는 기준선 값과 비교하는 단계; (iii) 상기 참조 또는 기준선 값으로부터의 (i) 단계에서 측정된 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA 양의 편차 또는 편차 없음을 발견하는 단계; 및 (iv) 상기 편차 또는 편차 없음의 발견이 상기 대상체의 흡연 상태를 나타내는 단계를 포함하는, 방법.

3. 흡연 상태에서의 대상체 변화의 진행을 모니터링하는 방법으로, (i) 상기 대상체로부터의 적어도 2개의 생물학적 시료 상에서 단락 1 또는 단락 2에 따른 방법을 수행하는 단계로, 여기서 각각의 시료는 상이한 시점에서 취해지는, 단계; 및 (ii) 상기 상이한 시점 각각에 대해 취해진 측정을 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 시간 경과에 따른 측정의 변화는 상기 대상체의 흡연 상태가 시간이 지남에 따라 변했다는 표시인 것인, 방법.

4. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법으로, (i) 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양의 값을 대표하는 데이터를 수신하되, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상으로 구성되어 있는, 단계; (ii) 컴퓨터 상의 데이터 저장소에 접근하되, 상기 데이터 저장소는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 진단인 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA의 양에 대한 참조 또는 기준선 값을 포함하는, 단계; 및 (iii) (i) 단계에서 수신된 데이터를 (ii) 단계의 컴퓨터 상의 데이터 저장소 내의 참조 또는 기준선 값과 비교하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

5. 대상체의 흡연 상태를 구별하는 방법으로, 상기 방법은 (i) 대상체로부터 시료를 수득하거나 제공하는 단계; (ii) 상기 시료를 항-코티닌 및 항-총 NNAL 및/또는 항-CEMA 항체와 접촉시키고, 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA와 항체 사이의 결합을 검출하여, 상기 시료 내의 2개 또는 3개의 대사산물의 양을 검출하는 단계로, 여기서 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로 구성되어 있는, 단계; 및 (iii) 상기 시료 내의 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA의 존재를 검출하는 것에 기초하여 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.

6. 대상체의 흡연 상태를 결정하고 하나 이상의 치료제를 투여해서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 방법으로, 상기 방법은 (i) 대상체로부터 시료를 수득하거나 제공하는 단계; (ii) 2개 또는 3개의 대사산물이 상기 시료 내에 존재하는지 여부를 검출하고, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로 구성되어 있는, 단계; (iii) 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계; 및 (iv) (iii)에서 수득된 결과에 따라, 하나 이상의 치료제의 유효량을 투여해서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.

7. 대상체에서 종래의 궐련의 흡연을 진단 및 감소시키는 방법으로, 상기 방법은 (i) 대상체로부터 시료를 수득하는 단계; (ii) 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상이 상기 시료 내에 존재하는지 검출하는 단계; 및 (iii) 흡연자로 진단된 대상체에서, 하나 이상의 치료제의 유효량을 투여해서 상기 대상체에서 종래의 궐련의 흡연을 감소시키는 단계를 포함하고 있는, 방법.

8. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변, 적합하게, 24 시간 소변인 것인, 방법.

9. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 있어서, 상기 대사산물의 양은 생성되는 신호의 양에 기초하여 측정되는 것인, 방법.

10. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 있어서, 상기 대사산물의 양은 면역분석, 적합하게는, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 형광 면역분석, 화학발광 면역분석, DRI 면역분석, 정량적 면역검정, 측방향 유동 면역분석, 미세유체 면역분석, 응집 면역분석 기술, ELISA, 또는 항체- 또는 크로마토그래피, 적합하게는 경쟁 결합 분석 또는 유도체화 및/또는 착색제-함유 제제를 사용하는 분석을 사용하여 측정되는 것인, 방법.

11. 선행하는 단락들 중 어느 하나에 있어서, 상기 대사산물의 양은 24시간 소변에서 조사 기간의 2일 및/또는 5일 후에 측정되고, 여기서 상기 대사산물의 양은 상기 대사산물의 각각에 대한 기준선에 비교되는 것인, 방법.

12. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치로, 상기 장치는 생물학적 시료에서 2개 또는 3개의 대사산물의 존재를 검출하기에 적합하며, 상기 대사산물은 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA로 구성되어 있는 것인, 장치.

13. 단락 12에 있어서, 고체상에 부착되어 있는 코티닌 및 총 NNAL 및/또는 CEMA에 대한 특이적 결합 분자를 포함하며, 적합하게, 여기서 상기 장치는 측방향 유동 스트립 또는 딥스틱 장치인 것인, 장치.

14. (i) 코티닌 및 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상의 양의 참조 값을 포함하거나 그것으로 구성되어 있는 컴퓨터 데이터 저장소로, 상기 참조 값은 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 대사산물의 공지된 양을 나타내는, 상기 컴퓨터 데이터 저장소; 및 (ii) 상기 데이터 저장소에 접근하고 대상체로부터의 시료 내의 대사산물의 양에 대한 정보와 조합되어 상기 데이터 저장소로부터의 정보를 사용하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하도록 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 포함하는, 시스템.

본 발명은 본 발명을 더 상세히 설명하기 위하여 제공되는 하기 실시예에서 추가적으로 설명되고 있다. 본 발명을 수행하기 위하여 현재 고려되는 바람직한 형태를 제시하고 있는, 이 실시예는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하도록 의도된 것이다.

실시예

이 실시예는 통상의 궐련(CC)에서 선택된 연기 성분에 대한 노출 감소를 입증하기 위한 무작위배정된, 대조, 공개 표지, 3-아암 평행군, 다기관 연구이다. 이 연구에는 가열되지만 연소되지 않는(무연 대체물(SW)) 제품으로 전환하거나, 흡연 절제(SA)를 관찰하는 건강한 흡연자들이 포함되었으며, 은폐된 상태로 5일 동안 계속해서 CC를 사용하고 활동 환경에서 85일까지 장시간 지속된 것과 비교되었다. 이것은 무제한 흡연 연구였다. 기준선 측정은 대상체가 2일 동안 그들이 선택한 종래의 궐련 브랜드를 피울 수 있게 하여 실시한다. 이 2일 기간 후, 이어서 대상체는 종래의 궐련을 계속 흡연하거나, 무연 대체물로 전환하거나, 흡연을 절제하는 것을 선택하게 된다. 그런 다음, 조사 기간이 시작된다. 각각의 대사산물을 측정하기 위한 방법은 Haziza 등 (2017) Data in Brief 10, 283-293에 기재되어 있다.

순응 기간 동안, 제품/요법 할당(각각, SW 및 CC 아암에 있어서 무연 대체물 및 CC의 배타적 사용, 및 SA 아암에 있어서 완전한 흡연 절제)을, 대상체가 요청시 각각의 담배 스틱/CC의 엄격한 공급에 의해 보장하였다. 활동 기간 동안 SW 아암에 무작위배정된 대상체에게 HNB 제품을 배타적으로 사용하도록 지시하고, SA 아암에 무작위배정된 대상체에게 흡연을 절제하도록 지시했다.

총 NNAL(pg/ml), CEMA(ng/ml) 및 유리 코티닌(ng/ml)을 소변에서 측정하며 사분위 범위(IQR = [제1 사분위수; 제3 사분위수]]가 하기 표에 기록되어 있다. 또한, 데이터는 아래 도면들에서 박스구성으로 표현된다. 박스의 하단은 제1 사분위수(관찰값들 중 25%가 놓이는 값)이며, 상단은 제3 사분위수(관찰값들 중 75%가 놓이는 값)이며, 중간 막대는 관찰값들의 중간값이다. 수염들은 관찰된 최소값 및 관찰된 최대값 각각으로 연장되어 있다.

도 1 내지 도 3과 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, CEMA 및 코티닌은 2일 후 CC 및 SA 대상체의 분리를 달성할 수 있고, 적어도 75%의 특이성 및 민감도를 갖는 반면, 총 NNAL는 5일과 30일 사이에 동일한 수준의 구별을 제공하고 있다. SW 아암의 대상체는 5일 이후 CEMA 및 총 NNAL에 기초하여 CC 아암과 구별할 수 있으며, 특이성 및 민감도가 적어도 75%이다. 마지막으로, SW 아암의 대상체는 2일 후 유리 코티닌에 기초하여 SA 아암 내 대상체와 구별할 수 있다(특이성 및 민감도가 적어도 75%임).

본원에 인용된 또는 설명된 간행물은 본 출원의 출원일에 앞서 개시된 관련 정보를 제공한다. 본원에서 언급된 것은, 발명자가 이와 같은 개시보다 선행하도록 명명하지 않는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다. 상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 인용된다. 본 발명의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구범위에 기술된 발명은 이와 같은 특정 구현예에 부당하게 한정되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 것을 포함하는, 본원 발명을 실시하기 위하여 기술된 모드들의 다양한 변형들이 이하의 청구범위에 포함된다.

표 1

샘플링 시점에 대한 각각의 아암 중의 CEMA, 코티닌 및 총 NNAL에 대한 사분위 범위(IQR = [제1 사분위수; 제3 사분위수])

Claims (15)

1. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치로서, 상기 장치는 생물학적 시료에서 2개 또는 3개의 담배 연기 노출 바이오마커의 존재를 검출하기 위해 고체상(solid phase) 상에 증착된 복수의 상이한 특이적 결합 분자를 포함하고 있고, 상기 담배 연기 노출 바이오마커는:
   (i) 코티닌 및 총 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부탄올 (NNAL); 또는
   (ii) 코티닌 및 N-아세틸-S-[2-카르복시에틸]-L-시스테인 (CEMA); 또는
   (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA;
   으로 구성되어 있는, 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 장치는 경쟁 면역분석을 수행하도록 구성된 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치, 바람직하게는 딥스틱(dipstick)인, 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 휴대용 측방향 유동 면역분석 장치는 (i) 시료 패드; (ii) 접합체 패드; 및 (iii) 적어도 하나의 검출 구역을 포함하는, 장치.
4. 제3항에 있어서, 상기 접합체 패드는 표지된 특이적 결합제들을 포함하거나 이들로 구성되어 있으며, 상기 표지된 특이적 결합제들 각각은: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA;를 개별적으로 결합할 수 있고, 적절하게는, 상기 표지된 특이적 결합제들 각각은 항체 또는 그의 단편, 앱타머(aptamer), 광앱타머, 아피머(affimer), 단백질, 펩티드, 펩티드모방체(peptidomimetic) 또는 소분자인, 장치.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서:
   (a) 상기 접합체 패드는 상부에 증착된 표지된 특이적 결합제들을 포함하거나 이들로 구성되어 있고, 상기 표지된 특이적 결합제들 각각은 대사산물인: (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA;을 개별적으로 결합할 수 있고, 표지된 특이적 결합제 대사산물 접합체를 형성할 수 있고; 그리고
   (b) 상기 검출 구역은, 각각이 상기 대사산물에 개별적으로 결합할 수 있는 고정화된 특이적 결합제들을 포함하거나 이들로 구성되어 있는, 장치.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서:
   (a) 상기 접합체 패드는 상부에 증착된 표지된 대사산물(들)을 포함하거나 이들로 구성되어 있으며, 상기 표지된 대사산물(들)은: (i) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체; 또는 (ii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체; 또는 (iii) 표지된 코티닌 또는 이의 유사체 및 표지된 NNAL 또는 이의 유사체 및 표지된 CEMA 또는 이의 유사체로 구성되어 있으며; 그리고
   (b) 상기 검출 구역은 고정화된 특이적 결합제들을 포함하거나 이들로 구성되어 있으며, 상기 고정화된 특이적 결합제들 각각은: (i) 상기 표지된 코티닌 또는 상기 이의 유사체 및 상기 표지된 NNAL 또는 상기 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 상기 표지된 코티닌 또는 상기 이의 유사체 및 상기 표지된 CEMA 또는 상기 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 상기 표지된 코티닌 또는 상기 이의 유사체 및 상기 표지된 NNAL 또는 상기 이의 유사체 및 상기 표지된 CEMA 또는 상기 이의 유사체 및 시료에 존재할 수 있는 코티닌 및 NNAL 및 CEMA;를 개별적으로 결합할 수 있는, 장치.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 특이적 결합 분자는 유색 입자, 적절하게는 금 나노입자로 표지되어 있고, 선택적으로, 상기 특이적 결합제 분자 각각에 대한 표지는 동일하거나 상이한, 장치.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 임계값은 (i) 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상 및 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상 또는 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상; 또는 (ii) 24시간 소변 코티닌의 경우 약 200ng/ml 이상 및 24시간 소변 내 총 NNAL의 경우 약 10pg/ml 이상 및 24시간 소변 CEMA의 경우 약 5ng/ml 이상인, 장치.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는: (i) 약 200 내지 800ng/ml의 양의 24시간 소변 코티닌; 또는 (ii) 24시간 소변 내 약 10 내지 125 pg/ml의 양의 24시간 소변 총 NNAL; 또는 (iii) 약 5 내지 80ng/ml의 양의 24시간 소변 CEMA; 또는 (iv) (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개의 조합;을 검출하기에 적합한, 장치.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 장치의 테스트 라인(들) 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았으며 비-흡연 대상체에 대한 표시임을 표시하며;
    (ii) 상기 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었음을 표시하며 상기 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시는 검출 임계값을 넘지 않았으며 가열된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시임을 표시하며;
    (iii) 상기 장치의 테스트 라인 상의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 가시적 표시 없음은 검출 임계값을 넘었으며 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시임을 표시하는, 장치.
11. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 장치로서,
    (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 장치를 수용하기에 적합한 수용기;
    (b) 상기 장치의 적어도 하나의 디지털 이미지를 획득하기에 적합한 이미징 장치; 및
    (c) 상기 적어도 하나의 디지털 이미지를 처리하기에 적합한 프로세서;
    를 포함하는, 장치.
12. (a) 총 NNAL 및 CEMA 중 하나 이상 및 코티닌의 양의 참조 또는 기준선 값을 포함하거나 이들로 구성되어 있는 컴퓨터 데이터 저장소로서, 상기 참조 또는 기준선 값은 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 대사산물의 공지된 양을 나타내는, 상기 컴퓨터 데이터 저장소; 및
    (b) 상기 데이터 저장소에 접근하고 대상체로부터의 시료 내의 대사산물의 양에 대한 정보와 조합되어 상기 데이터 저장소로부터의 정보를 사용하여, 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하도록 프로그래밍된 컴퓨터 시스템;
    을 포함하는 시스템.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 장치 및 선택적으로, 키트를 작동시키기 위한 지침서 세트 및 선택적으로 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 지침서 세트를 포함하는 키트.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 장치의 사용을 포함하는 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법.
15. 대상체의 흡연 상태를 결정하기 위한 방법으로, 상기 방법은
    (a) 시료 내의 (i) 코티닌 및 NNAL; 또는 (ii) 코티닌 및 CEMA; 또는 (iii) 코티닌 및 NNAL 및 CEMA의 양을 검출하는 단계로서, 상기 대사산물은 코티닌 및 NNAL 및 CEMA로 구성되어 있고, 상기 시료를 항-코티닌 및 항-NNAL 및 항-CEMA 특이적 결합제와 접촉시키고 결합을 검출하는 것을 포함하는 단계; 및
    (b) 상기 대상체의 흡연 상태를 결정하는 단계를 포함하고;
    코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 10.6 내지 41.5ng/ml이면 흡연 절제자에 대한 표시이고; 그리고
    총 NNAL 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 37.7pg/ml 내지 115pg/ml이고 CEMA 양이 24시간 소변에서 약 31.1ng/ml와 90ng/ml이면 연소된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시이고; 그리고
    코티닌의 양이 조사 기간의 5일째에 24시간 소변에서 약 652.5 내지 1115ng/ml 또는 그 이상이면 가열된 담배에 노출된 대상체에 대한 표시인, 방법.

Images