JP2009128178A - 身体活動レベルの検出方法及び検出用キット - Google Patents

Abstract

【課題】被験者の身体活動レベルを反映するバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを指標として被験者の身体活動レベルを検出するための一連の技術を提供する。
【解決手段】被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ（オステオネクチン、ＢＭ−４０）濃度を指標として、前記被験者の身体活動レベルを検出する身体活動レベルの検出方法が提供される。体液の例として血液が挙げられる。ＳＰＡＲＣに対する抗体を含む、当該方法に用いるためのキットも提供される。
【選択図】図１

Description

本発明は身体活動レベルの検出方法及び検出用キットに関し、さらに詳細には、体液におけるバイオマーカーを指標として被験者の身体活動レベルを検出する身体活動レベルを検出方法、及び当該方法に用いるための身体活動レベル検出用キットに関する。

近年の健康志向の増大に伴い、運動に対する重要性が高まっている。習慣的な運動（身体活動）が疾病予防や健康維持に有用であることは経験的に明らかである。

運動にはネガティブな面とポジティブな面が存在する。ネガティブな面としては、過度の運動による疲労やオーバーワークが挙げられる。このような状態のときには、運動を控える方が健康のために好ましい。一方、ポジティブな面としては、適度な運動による身体機能の向上が挙げられる。例えば、適度な運動を習慣的に行うことは骨格筋の質と量を維持・向上させ、代謝能や筋力を高めることができる。その結果、生活習慣病の予防や改善、さらに、高齢者の骨折・転倒・寝たきりの予防等に効果を発揮する。結局、ネガティブな面が現れない範囲内において、できるだけ多くの運動を行うことが健康維持等にとって理想的であるといえる。そのためには、被験者ごとに、適切とされる身体活動レベルや前記したネガティブな面が現れない範囲（上限）を正確に把握することが好ましい。それにより、個々の被験者に対して個別の運動処方を行うことが可能となる。

「身体活動レベル」は、身体活動の内容と時間を総合的に考慮して活動の程度を分類したものであり、運動処方を行う際の１つの指標となる。しかし、一般に身体活動レベルについては運動内容を基にした画一的な分類、すなわち「低（I）」「普通（II）」「高（III）」の３段階しか設定されておらず、個々の被験者について個別に身体活動レベルを把握する技術は見出されていない。身体活動レベルを反映するバイオマーカーがあれば、当該バイオマーカーを指標として個々の被験者について個別に身体活動レベルを把握することが可能と考えられるが、そのようなバイオマーカーは知られていない。

骨や骨格筋に関連する蛋白質として、ＳＰＡＲＣ（secreted protein acidic and rich in cysteine）が知られている。ＳＰＡＲＣ（「オステオネクチン」、「ＢＭ−４０」とも呼ばれている。）は骨の非コラーゲン性蛋白質の約１／４を占める酸性リン酸化糖蛋白質である。ＳＰＡＲＣの臨床的意義についてはあまり知られていないが、例えば、ＳＰＡＲＣの存在を指標として悪性腫瘍（特許文献１，２）や糖尿病（特許文献３）の病態を評価する技術が知られている。これらの技術はいずれも組織レベルの遺伝子発現量を指標とするものである。一方、体液中に存在するＳＰＡＲＣの臨床的意義については定かなく、身体活動レベルとの関連性も知られていない。

特開２００４−２４７９０１号公報 特開２００４−２４７９０２号公報 特開２００４−２９６３４６号公報

本発明の目的は、被験者の身体活動レベルを反映するバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを指標として被験者の身体活動レベルを検出するための一連の技術を提供することにある。

本発明者らは上記した課題を解決するために、身体活動レベルを反映する体液中のバイオマーカーを探索した。その結果、体液中のＳＰＡＲＣ濃度が日常の運動履歴によく応答し、身体活動レベルを反映することを見出した。そして、体液中のＳＰＡＲＣ濃度を指標として被験者の身体活動レベルを検出する系を構築し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下のとおりである。

請求項１に記載の発明は、被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ濃度を指標として、前記被験者の身体活動レベルを検出することを特徴とする身体活動レベルの検出方法である。

本発明は身体活動レベルを検出する方法に係り、被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ濃度を指標として、被験者の身体活動レベルを検出する。本発明では、体液における特定の物質（ＳＰＡＲＣ）をバイオマーカーとして採用し、当該バイオマーカーを指標として身体活動レベルを検出するので、個々の被験者についてその時々の身体活動レベルを個別に把握することができる。また、バイオマーカーの濃度を指標とするので、身体活動レベルを定量的に把握することも可能である。さらに、本発明では一般の臨床検査と同様に被験者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速に身体活動レベルを検出することができる。なお本発明において、被験者の身体活動レベルが高いほど体液中のＳＰＡＲＣ濃度は高値を示し、身体活動レベルが低いほど体液中のＳＰＡＲＣ濃度は低値を示す。

請求項２に記載の発明は、前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載の身体活動レベルの検出方法である。

本発明では検査材料として血液を採用するので、検査材料の採取が容易である。

ＳＰＡＲＣに対する抗体を用いて体液中のＳＰＡＲＣ濃度を測定する工程を含む構成が推奨される（請求項３）。

請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の身体活動レベルの検出方法に用いるためのキットであって、ＳＰＡＲＣに対する抗体を含むことを特徴とする身体活動レベル検出用キットである。

本発明は身体活動レベル検出用キットに係るものであり、ＳＰＡＲＣに対する抗体を含むことを特徴とする。本発明のキットによれば、被験者の体液中のＳＰＡＲＣ濃度を簡便に測定することができ、その結果、被験者における身体活動レベルを簡便に検出することができる。

本発明の身体活動レベルの検出方法によれば、特定のバイオマーカー（ＳＰＡＲＣ）を指標として身体活動レベルを検出するので、個々の被験者についてその時々の身体活動レベルを個別に把握することができる。また、被験者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速に身体活動レベルを検出することができる。

本発明の身体活動レベル検出用キットによれば、被験者における身体活動レベルを簡便に検出することができる。

本発明の身体活動レベルの検出方法は、被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ濃度を指標として、前記被験者の身体活動レベルを検出するものである。使用する体液としては特に限定はないが、好ましくは血液が用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿を検査材料（測定試料）とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。

ＳＰＡＲＣ濃度の測定方法としては、ＳＰＡＲＣ濃度を特異的に測定できる方法であれば特に限定はなく、蛋白質の定量法として一般に採用されている方法をそのまま適用することができる。好ましくは、抗体を用いてＳＰＡＲＣ濃度を測定する。抗体を用いる方法の例としては、各種の免疫測定法やウエスタンブロット法が挙げられる。

免疫測定法によれば、体液のような夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができ、好適である。免疫測定法の例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらの免疫測定法に用いるＳＰＡＲＣに対する抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。なお、ＳＰＡＲＣに対するモノクローナル抗体はすでに取得されており、ＥＩＡを採用したＳＰＡＲＣ測定キットが市販されている。

ウエスタンブロット法を採用する場合は、例えば、測定試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供してＳＰＡＲＣを分離した後、分離されたＳＰＡＲＣをニトロセルロース等の膜に転写する。そして、膜上に転写されたＳＰＡＲＣを検出する。ＳＰＡＲＣの検出は、例えば標識抗体を膜上のＳＰＡＲＣに対して直接的または間接的に結合させ、当該標識を検出することにより行うことができる。

抗体を用いずにＳＰＡＲＣ濃度を測定することもでき、例えば、電気泳動法、クロマトグラフィー、質量分析法を採用することができる。電気泳動法によってＳＰＡＲＣ濃度を測定する場合には、例えば、測定試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してＳＰＡＲＣを分離し、適宜の色素や蛍光試薬でゲルを染色し、ＳＰＡＲＣに相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではＳＰＡＲＣの分離が不十分な場合には、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。

クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合には、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、測定試料をＨＰＬＣに供してＳＰＡＲＣを分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のＳＰＡＲＣ濃度を測定することができる。

質量分析法を採用する場合は、質量分析計を用いてＳＰＡＲＣ由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもってＳＰＡＲＣ濃度を測定する。例えば、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization；ＭＡＬＤＩ）と飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer；ＴＯＦ）とを組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、体液中のＳＰＡＲＣ濃度を測定することができる。

本発明の身体活動レベルの検出方法は、被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ濃度を「指標」として身体活動レベルの検出を行う。「指標」の代表例は基準値との比較である。

本発明の身体活動レベルの検出方法は、例えば、個々の被験者に対して個別の運動処方を行う際に利用できる。具体例を挙げると、ある被験者について体液中のＳＰＡＲＣ濃度を測定し、当該測定値を予め設定した基準値と比較する。基準値としては、適切な身体活動レベルに対応する値を採用する。そして、被験者の体液中ＳＰＡＲＣ濃度が当該基準値と同程度の値を示した場合には、当該被験者における身体活動量は適正であると判断し、当該被験者に対して現在行っている身体活動を継続して行うよう助言することができる。一方、被験者の体液中ＳＰＡＲＣ濃度が当該基準値よりも低い値を示した場合には、当該被験者における身体活動量が不足していると判断し、その不足を補うための具体的な身体活動計画を提案することができる。さらに、同一の被験者について継続的に検査を行って体液中ＳＰＡＲＣ濃度の変化をモニタリングすれば、より正確に身体活動レベルを把握することができ、有用である。

なお一般に、習慣的に運動を行うことによって筋力や糖・脂質代謝能が向上することが知られているので、体液中のＳＰＡＲＣを「筋力および糖・脂質代謝を反映するバイオマーカー」、あるいは「筋力および脂質代謝能の変動を反映するバイオマーカー」と捉えることもできる。そして、本発明における「身体活動レベルの検出」は「筋機能（筋力や代謝能）の検出」と換言することができる。

本発明は、運動療法（運動処方）を行った際の効果判定にも有用である。例えば、生活習慣病の予防のために運動教室等で運動療法を一定期間行った場合、一般に、その効果判定は形態計測（体組成など）や生理機能検査を中心に行われている。しかし、本発明を適用して体液中のＳＰＡＲＣ濃度を指標とすれば、運動療法を受けた後における被験者の身体活動レベルを把握すると共に筋機能（筋力や代謝能）を間接的に評価（推定）することができ、運動療法の効果判定が可能となる。

本発明の身体活動レベル検出用キットは、ＳＰＡＲＣに対する抗体を含むものである。すなわち、本発明のキットは免疫測定法やウエスタンブロット法のような、抗体を用いた方法によってＳＰＡＲＣ濃度を測定するために用いられる。ＳＰＡＲＣに対する抗体は、単独の試薬であってもよいし、固相に結合した状態であってもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。構成例１はサンドイッチＥＩＡ用、構成例２はウエスタンブロット用のものである。

〔キットの構成例１〕
（１）抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体固定化９６穴マイクロタイタープレート １枚
（２）酵素標識抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体（凍結乾燥品） 適量
（３）基質液 適量
（４）希釈用緩衝液 適量

〔キットの構成例２〕
（１）抗ＳＰＡＲＣモノクローナル抗体（凍結乾燥品） 適量
（２）酵素標識２次抗体（凍結乾燥品） 適量
（３）基質液 適量
（４）希釈用緩衝液 適量
（５）ニトロセルロース膜 適量

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

１．マウスの飼育
ＩＣＲマウス（雄、１０週齢）を安静群（４匹）と運動群（４匹）とに分け、６週間飼育した。運動群には、トレッドミル走運動を速度と時間を漸増させる方法（トレーニング初日：２０ｍ／分，１５分間→最終日：３２ｍ／分，６０分間）で週５回負荷を与えた。なお、この運動は健康によいと一般に認識されているものである。６週間飼育後、最終運動負荷の２４時間後に各マウスを解体して血液を採取した。各血液から血清を調製した。

２．ウエスタンブロットによる血中ＳＰＡＲＣ濃度の測定
３００μＬの各血清に２００μＬのLysis buffer（CelLytic-MT Lysis/Extraction Reagent；シグマ社）を加え、さらに４μｇのａｎｔｉ−ＳＰＡＲＣ抗体（サンタクルス社）を加え、４℃で６０分間攪拌した。５０μＬのプロテインＡ−アガロースビーズ（protein A-agarose beads；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を加え、さらに６０分間攪拌した。遠心分離（１２０００ｇ、２０秒）を行って上清を除去した。沈殿物を５００μＬのLysis bufferで３回、Tris buffer (５０ｍＭ、ｐＨ８．０）で１回洗浄した。洗浄は各buffer５００μＬを加えて軽く攪拌した後、遠心分離（１２０００ｇ、２０秒）にて上清を除去することにより行った。得られた沈殿物に３０μＬのsample bufferを加えて９５℃で３分間インキュベートした。遠心分離（１２０００ｇ、２０秒）を行い、上清を蛋白試料とした。

各蛋白試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（１試料につき１レーン、各群４レーンずつ）。分離された蛋白質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。このニトロセルロース膜を３％ＢＳＡ−ＰＢＳに浸し、４℃で６０分間インキュベートした（ブロッキング）。ブロッキング後のニトロセルロース膜をＰＢＳＴで５分間×３回洗浄した後、１次抗体液（ａｎｔｉ-ＳＰＡＲＣ抗体（サンタクルス社）を３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで４００倍希釈したもの）に浸し、４℃で６０分間インキュベートした。このニトロセルロース膜をＰＢＳＴで５分間×３回洗浄した後、２次抗体液（抗マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで３０００倍希釈したもの）に浸し、４℃で６０分間インキュベートした。ニトロセルロース膜をＰＢＳＴで５分間×３回洗浄した後、West pico（ピアス社）を５分間反応させ、ニトロセルロース膜上のＳＰＡＲＣに相当するバンドを発光させた（図１の矢印）。各バンドの発光強度をScion image（NIH, Research Service Branch）にて測定し、安静群と運動群に分けてグラフ化した（図２）。その結果、運動群の方が安静群に比べて有意に高い発光強度を示し（Ｐ＜０．０５）、血中ＳＰＡＲＣ濃度が高かった。これにより、血中のＳＰＡＲＣが身体活動レベルを反映することがわかった。

健康な３０代男性であって日常的に運動習慣がある者（週３回の６０分間レジスタンストレーニング、週５回の３０分間の自転車こぎ）１名と、同様の男性で日常的に運動習慣がない者１名を被験者として選択した。なお、この運動は健康によいと一般に認識されているものである。血液採取の前日２２時から血液採取時の当日午前１１時までの間、水以外の飲食は行わないようにした。また、血液採取当日および前日は運動を行わないようにした。各被験者から採取した血液を遠心分離して血清を調製した。実施例１と同様にしてウエスタンブロットを行って、ニトロセルロース膜上のＳＰＡＲＣ相当部分を発光させ（図３）、発光強度を運動習慣がある者とない者に分けてグラフ化した（図４）。その結果、運動習慣のある者の方が、運動習慣のない者に比べて有意に高い発光強度を示し、血中ＳＰＡＲＣ濃度が高かった。これにより、血中のＳＰＡＲＣが身体活動レベルを反映することがわかった。

健康な３０代男性１名において、運動習慣のあった時期となかった時期とで血中ＳＰＡＲＣ濃度を比較した。週３回、６０分間のレジスタンストレーニングを３ヶ月間行った時期を「運動習慣のある時期」、その後、レジスタンストレーニングを行わなかった４週間（採血前４週間）を「運動習慣のない時期」とした。血液採取の前日２２時から血液採取時の当日午前１１時までの間、水以外の飲食は行わないようにした。また、血液採取当日および前日は運動を行わないようにした。被験者から採取した血液を遠心分離して血清を調製した。実施例１と同様にしてウエスタンブロットを行って、ニトロセルロース膜上のＳＰＡＲＣ相当部分を発光させ（図５）、発光強度を運動習慣があった時期となかった時期に分けてグラフ化した（図６）。その結果、運動習慣があった時期の方が、運動習慣がなかった時期に比べて有意に高い発光強度を示し、血中ＳＰＡＲＣ濃度が高かった。これにより、血中のＳＰＡＲＣを指標として、被験者の身体活動レベルを経時的にモニタリングできることがわかった。

実施例１のウエスタンブロットの結果を表す写真である。 実施例１の発光強度の測定結果を表すグラフである。 実施例２のウエスタンブロットの結果を表す写真である。 実施例２の発光強度の測定結果を表すグラフである。 実施例３のウエスタンブロットの結果を表す写真である。 実施例３の発光強度の測定結果を表すグラフである。

Claims (4)

1. 被験者から採取した体液におけるＳＰＡＲＣ濃度を指標として、前記被験者の身体活動レベルを検出することを特徴とする身体活動レベルの検出方法。
2. 前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１に記載の身体活動レベルの検出方法。
3. ＳＰＡＲＣに対する抗体を用いて体液中のＳＰＡＲＣ濃度を測定する工程を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の身体活動レベルの検出方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の身体活動レベルの検出方法に用いるためのキットであって、ＳＰＡＲＣに対する抗体を含むことを特徴とする身体活動レベル検出用キット。