KR20190137944A - 응집 방법 - Google Patents
응집 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20190137944A KR20190137944A KR1020197035609A KR20197035609A KR20190137944A KR 20190137944 A KR20190137944 A KR 20190137944A KR 1020197035609 A KR1020197035609 A KR 1020197035609A KR 20197035609 A KR20197035609 A KR 20197035609A KR 20190137944 A KR20190137944 A KR 20190137944A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell culture
- cell
- pdadmac
- added
- peg
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 title description 3
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 title description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 48
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 42
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 156
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 70
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 59
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 42
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 42
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 27
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims description 19
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 claims description 7
- NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N [(1r,2s,4r,5r)-3-hydroxy-4-(4-methylphenyl)sulfonyloxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl] 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)O[C@H]1C(O)[C@@H](OS(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)[C@@H]2OC[C@H]1O2 NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 50
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 37
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 16
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 11
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- -1 N-substituted pyrrolidine structure Chemical group 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 3
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 102100038647 Fibroleukin Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101001031613 Homo sapiens Fibroleukin Proteins 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000010961 commercial manufacture process Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 108010054404 Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 1
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 1
- 108010008629 CA-125 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000007269 CA-125 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000007499 CD27 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000004634 CD30 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010017987 CD30 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091008038 CHOP Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102000013602 Cardiac Myosins Human genes 0.000 description 1
- 108010051609 Cardiac Myosins Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100021246 DDIT3 upstream open reading frame protein Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 1
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026879 Interleukin-2 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000003959 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100027159 Membrane primary amine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710132836 Membrane primary amine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010038036 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000010498 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 102100034201 Sclerostin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102100039024 Sphingosine kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960001838 canakinumab Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 229960000578 gemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010043603 integrin alpha4beta7 Proteins 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 229950000518 labetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 229950001869 mapatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950008001 matuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005108 mepolizumab Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000002950 monocyclic group Chemical class 0.000 description 1
- 229960003816 muromonab-cd3 Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 108091006084 receptor activators Proteins 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017572 squamous cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000005486 sulfidation Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 1
- 229950009002 zanolimumab Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
Abstract
본 발명은 포유류 세포 배양액으로부터 재조합 단백질들의 수확 방법에 관한 것이다. 이 방법은 양이온성 중합체들, 비이온성 중합체들 및 비이온성 계면활성제들을 이용한다.
Description
본 출원은 2011. 12. 15.자로 출원된 U.S. 가출원 번호 61/576,303을 우선권으로 주장하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 포유류 세포 배양 배지로부터 재조합 단백질들의 수확 방법에 관한 것이다. 이 방법은 양이온성 중합체들, 비이온성 중합체들 및 비이온성 계면활성제들을 이용한다.
치료 단백질들의 임상적 제조는 고가의 대규모적인 실시이다. 더 많은 양의 치료 재조합 단백질들에 대한 수요는 세포 배양 처리에서 산물 역가를 극적으로 증가시킨 진보들을 유도하였다. 고역가 세포 배양 공정들은 전형적으로 더 긴 배양 기간들에 걸쳐 고생활성 세포 밀도들을 유지함으로써 생성된다. 대응하는 생물질 고형분들(생활성 및 비생활성 세포들) 및 마이크론 미만의 세포성 파편 입자들의 증가도 관찰된다. 더 높은 고형분들 및 마이크론 미만의 세포성 파편 입자들의 부담은 포유류 세포 배양 수확 공정들을 어렵게 하여 생산능의 실질적인 손실 없이 파편들을 제거하는데 있어서 수확 공정을 덜 효과적으로 만들 수 있다.
양이온성 중합체 응집제들은 휴대용 수 정제, 폐수 처리, 석유, 채광 및 제지 산업들, 화장품들에서의 용도들, 및 의학적 용도들 범위의 여러 응용분야들을 위해 사용되며, 또한 포유류 세포들 및 효소들을 캡슐화하고 미생물 세포 배양물들을 응집하기 위해 사용되어 왔다. 그러나 상업적 규모의 포유류 세포 수확 공정에서의 사용을 위해서는 긴 응집 침강 시간이 문제가 되어, 수확 공정을 시간 소모적이고 표준 수확 관행들에 비해 덜 효율적으로 만들 수 있다.
포유류 세포 배양 수확 방법들, 특히 상업적 규모의 방법들을 개선하기 위한 지속적인 요구가 있다. 더 빠른 회수 시간들 및/또는 더 많은 회수를 허용하는 임의의 개선들은 단백질 치료제들의 제조에 연관된 비용들을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 세포 배양 수확의 신속하고 효율적인 방법을 제공함으로써 이러한 수요를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 양이온성 중합체 및 비이온성 중합체를 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드 및 PEG 3,000을 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드, PEG 3,000 및 Triton X-100을 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 양이온성 중합체 및 비이온성 중합체를 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 일차 침강을 위해 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 일차 청정화된 상청액을 회수하는 단계, 일차 침강 응집제를 세척하는 단계, 이차 침강을 위해 세척된 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 이차 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 양이온성 중합체 및 비이온성 중합체를 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 일차 침강을 위해 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 일차 청정화된 상청액을 회수하는 단계, 일차 청정화된 상청액 중 산물 회수가 80% 미만인 경우 일차 침강 응집제를 세척하는 단계, 이차 침강을 위해 세척된 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 이차 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드 및 PEG 3,000을 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 일차 침강을 위해 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 일차 청정화된 상청액을 회수하는 단계, 일차 침강 응집제를 세척하는 단계, 이차 침강을 위해 세척된 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 이차 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 용적이 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포들을 배양하는 단계, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드, PEG 3,000 및 Triton X-100을 상기 세포 배양 배지에 첨가하여 응집을 개시하는 단계, 응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계, 일차 침강을 위해 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 일차 청정화된 상청액을 회수하는 단계, 일차 침강 응집제를 세척하는 단계, 이차 침강을 위해 세척된 응집제가 침강하도록 방치하는 단계, 이차 청정화된 상청액을 회수하는 것을 포함하는 포유류 세포 배양의 수확 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 양이온성 중합체는 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드이다.
또 다른 구현예에서, 비이온성 중합체는 폴리 에틸렌 글리콜 및 덱스트란으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 비이온성 중합체는 PEG 3,000 및 PEG 6,000으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 제공되는 포유류 세포 배양의 수확 방법들은 비이온성 계면활성제를 세포 배양 배지로 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 관련 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 Triton X-100이다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 중합체 및 비이온성 중합체는 동시에 첨가된다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 중합체, 비이온성 중합체 및 비이온성 계면활성제는 동시에 첨가된다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 중합체가 먼저 첨가되고 적어도 30초 동안 혼합된 뒤 비이온성 중합체가 첨가된다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 중합체가 먼저 첨가되고 적어도 30초 동안 혼합된 뒤 비이온성 중합체 및 비이온성 계면활성제가 첨가된다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 중합체는 디알릴디메틸암모늄 클로라이드, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드, 폴리에틸렌이민, 폴리아크릴아미드 또는 키토산의 중합체이다.
또 다른 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 Sapoin 또는 Triton X-100이다.
또 다른 구현예에서, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드는 약 20 내지 약 90pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가된다.
또 다른 구현예에서, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드는 약 25pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가되며, 여기서 포유류 세포들은 이배체 세포주에서 유래된다.
또 다른 구현예에서, 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드는 43pg/총 세포 밀도 내지 57pg/총 세포 밀도로 첨가되며, 여기서 포유류 세포들은 사배체 세포주에서 유래된다.
또 다른 구현예에서, PEG 3,000의 농도는 약 3% 내지 약 4.5%이다.
또 다른 구현예에서, PEG 6,000의 농도는 약 2.5% 내지 약 3.5%이다.
또 다른 구현예에서, Triton X100의 농도는 0.05%(w/v)이다.
또 다른 구현예에서, 포유류 세포 배양 배지는 36℃ 내지 20℃이다.
또 다른 구현예에서, 포유류 세포 배양 배지는 20℃ 이상이다.
또 다른 구현예에서, 일차 침강으로부터의 응집제는 9% 수크로오스 용액 중에 세척된다.
도 1은 PDADMAC의 구조를 나타낸다.
도 2a는 다양한 분자량들에서 PDADMAC에 의해 달성되는 침강 시간들의 차이를 나타낸다. 각 분자량에서 PDADMAC의 농도는 57pg/총 세포 밀도였다. 검은 다이아몬드/단속선은 PDADMAC 분자량 100,000 - 200,000을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 PDADMAC 분자량 200,000 - 300,000을 나타낸다. 검은 삼각형 및 연속선은 PDADMAC 분자량 400,000 - 500,000을 나타낸다.
도 2b는 다양한 분자량들에서 PDADMAC를 이용한 세포 배양 배지의 응집 시 달성되는 상청액 청정도를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽까지 막대들은 PDADMAC 분자량 < 100,000; 100,000 - 200,000; 200,000 - 350,000; 및 400,000 - 500,000을 나타낸다.
도 3a는 15-20㎛ 세포들의 응집에 대한 고분자량 PDADMAC 농도의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드 단속선은 11pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 18pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 25pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 원과 단속선은 39pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다.
도 3b는 21-24㎛ 세포들의 응집에 대한 고분자량 PDADMAC 농도의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 29pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 43pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 57pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 원과 연속선은 71pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 점선은 86pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다.
도 4a는 높은 락테이트 수준들을 생산하는 세포 배양물들에 대한 고분자량 PDADMAC 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 연속선은 락테이트가 첨가되지 않음을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 3g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 6g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다. 검은 원과 단속선은 9g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다.
도 4b는 패킹된 세포 용적(PCV)로 측정되는 높은 세포 밀도를 갖는 세포 배양물들에 대한 고분자량 PDADMAC 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 44% PCV를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 33% PCV를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 22% PCV를 나타낸다. 검은 원과 연속선은 11% PCV를 나타낸다.
도 5는 높은 락테이트 수준들을 갖는 세포 배양 공정을 위한 고분자량 PDADMAC 응집에 대한 다양한 희석제들의 영향을 나타낸다. 검은 삼각형과 점선 및 단속선은 수크로오스를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 희석제들이 없는 세포 배양 배지를 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 베타인을 나타낸다. 검은 원과 단속선은 PEG 1,000을 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 PEG 6,000을 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 덱스트란 70 및 베타인을 나타낸다.
도 6은 PCV 43.2%의 세포 배양물들에 대한 PDADMAC/PEG 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 PDADMAC만을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 수크로오스를 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 PDADMAC/PEG를 나타낸다.
도 7은 PDADMAC 및 PEG의 첨가 순서의 영향을 나타낸다. PDADMAC 및 PEG 볼루스 첨가(1 단계 방법)를 검은 삼각형과 단속선으로 나타낸다. PDADMAC 첨가 후 PEG 첨가(2 단계 방법)를 검은 사각형과 단속선으로 나타낸다. PDADMAC 단독을 검은 다이아몬드와 연속선으로 나타낸다.
도 8은 Triton X-100 첨가의 영향을 나타낸다. PDADMAC/PEG 첨가를 검은 사각형과 연속선으로 나타낸다. PDADMAC/PEG/Trition X-100 첨가를 검은 삼각형과 단속선으로 나타낸다.
도 2a는 다양한 분자량들에서 PDADMAC에 의해 달성되는 침강 시간들의 차이를 나타낸다. 각 분자량에서 PDADMAC의 농도는 57pg/총 세포 밀도였다. 검은 다이아몬드/단속선은 PDADMAC 분자량 100,000 - 200,000을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 PDADMAC 분자량 200,000 - 300,000을 나타낸다. 검은 삼각형 및 연속선은 PDADMAC 분자량 400,000 - 500,000을 나타낸다.
도 2b는 다양한 분자량들에서 PDADMAC를 이용한 세포 배양 배지의 응집 시 달성되는 상청액 청정도를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽까지 막대들은 PDADMAC 분자량 < 100,000; 100,000 - 200,000; 200,000 - 350,000; 및 400,000 - 500,000을 나타낸다.
도 3a는 15-20㎛ 세포들의 응집에 대한 고분자량 PDADMAC 농도의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드 단속선은 11pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 18pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 25pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 원과 단속선은 39pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다.
도 3b는 21-24㎛ 세포들의 응집에 대한 고분자량 PDADMAC 농도의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 29pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 43pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 57pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 원과 연속선은 71pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다. 검은 사각형과 점선은 86pg/총 세포 밀도의 PDADMAC를 나타낸다.
도 4a는 높은 락테이트 수준들을 생산하는 세포 배양물들에 대한 고분자량 PDADMAC 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 연속선은 락테이트가 첨가되지 않음을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 3g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 6g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다. 검은 원과 단속선은 9g/L로 첨가된 락테이트를 나타낸다.
도 4b는 패킹된 세포 용적(PCV)로 측정되는 높은 세포 밀도를 갖는 세포 배양물들에 대한 고분자량 PDADMAC 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 44% PCV를 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 33% PCV를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 22% PCV를 나타낸다. 검은 원과 연속선은 11% PCV를 나타낸다.
도 5는 높은 락테이트 수준들을 갖는 세포 배양 공정을 위한 고분자량 PDADMAC 응집에 대한 다양한 희석제들의 영향을 나타낸다. 검은 삼각형과 점선 및 단속선은 수크로오스를 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 희석제들이 없는 세포 배양 배지를 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 베타인을 나타낸다. 검은 원과 단속선은 PEG 1,000을 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 PEG 6,000을 나타낸다. 검은 삼각형과 단속선은 덱스트란 70 및 베타인을 나타낸다.
도 6은 PCV 43.2%의 세포 배양물들에 대한 PDADMAC/PEG 응집의 영향을 나타낸다. 검은 다이아몬드와 단속선은 PDADMAC만을 나타낸다. 검은 사각형과 단속선은 수크로오스를 나타낸다. 검은 삼각형과 연속선은 PDADMAC/PEG를 나타낸다.
도 7은 PDADMAC 및 PEG의 첨가 순서의 영향을 나타낸다. PDADMAC 및 PEG 볼루스 첨가(1 단계 방법)를 검은 삼각형과 단속선으로 나타낸다. PDADMAC 첨가 후 PEG 첨가(2 단계 방법)를 검은 사각형과 단속선으로 나타낸다. PDADMAC 단독을 검은 다이아몬드와 연속선으로 나타낸다.
도 8은 Triton X-100 첨가의 영향을 나타낸다. PDADMAC/PEG 첨가를 검은 사각형과 연속선으로 나타낸다. PDADMAC/PEG/Trition X-100 첨가를 검은 삼각형과 단속선으로 나타낸다.
본 발명은 높은 세포 물질 세포 배양 공정들의 회수 작동을 최대화하기 위한 단순한 수확 응집 기법을 제공한다. 세포 배양 배지의 응집에서 비이온성 중합체들과 조합된 양이온성 중합체들을 이용하는 포유류 세포 배양의 수확 방법이 제공된다. 또한 비이온성 중합체들 및 비이온성 계면활성제들 모두와 조합된 양이온성 중합체들의 사용이 제공된다.
본 발명은 포유류 세포 배양 배지를 응집시키기 위해 양이온성 중합체와 조합된 비이온성 중합체 또는 비이온성 중합체 및 비이온성 계면활성제의 사용이 모두 세포 배양 공정 밀도(44% 패킹된 세포 용적까지) 또는 락테이트 수준들(10g/L)과 무관하게 응집제 침강 시간을 24시간 이상에서 1시간 미만까지, 일부 경우들에서는 15분까지 감소시켰다는 발견에 근거한다. 비이온성 중합체들의 사용은 또한 원하는 재조합 산물과 함께 정제되는 높은 수준의 응집물들 및 숙주 세포 단백질의 제거를 일으켰다. 이러한 단순환 수확 방법은 세포 배양 공정들, 특히 상업적 수준의 높은 세포 물질 세포 배양 공정들의 회수 작동을 최대화하였다.
응집은 현탁액 중 입자들이 더 큰 크기의 응집물들 또는 클러스터들을 형성하는 공정이다. 응집 시, 입자들은 응집 제제 또는 응집제의 첨가에 의해 부빙의 형태로 현탁액으로부터 나온다. 응집제들은 음이온성 또는 양이온성 중합체들일 수 있다. 천연 응집제들, 예컨대 알기네이트들 또는 키토산; 광물성 응집제들, 예컨대 콜로이드성 점토들 및 활성 실리카; 및 합성 응집제들, 예컨대 폴리아크릴아미드들 및 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드가 존재한다. 합성 응집제들은 특정 분자량들(사슬 길이에 근거하여) 및 분자 분포를 갖도록 제조될 수 있다.
양이온성 중합체들은 음으로 하전된 입자들, 예컨대 유기 물질들과 상호작용한다. 세포 배양 배지에서, 양이온성 중합체들은 음으로 하전된 입자들, 예컨대 생활성 및 비생활성 세포들, 세포 대사물질들 및 세포성 파편, 예컨대 핵산들, 단백질들 및 리포좀들과 상호작용한다. 세포 배양 배지에서 발견되는 음으로 하전된 화합물들과 양이온성 중합체들의 응집은 음으로 하전된 입자들의 가교를 통한 이온성 상호작용을 통해; 응집을 일으키는 양이온성 중합체의 패치 결합을 통해; 또는 용액에서 빠져 나오는 중화된 입자를 생성하는 큰 음으로 하전된 입자들의 전하 중화를 통해 일어난다. 음으로 하전된 입자들의 양이온성 중합체 가교에 의해 형성되는 부빙들은 더 큰 부빙들을 생성하며, 더 많은 수준의 더 느리게 침강하는 더 작은 입자들을 생성하는 부빙 손상을 일으키는 전단 감수성을 증가시켰다. 패치 또는 전하 중화로, 높은 전하 밀도들을 갖는 양이온성 중합체들은 현탁액 중 입자들에서 음이온성 패치들과 상호작용하며, 용액에서 침강되어 나오는 더 큰 입자들을 형성하거나 입자 상 전하를 중화시킨다. 이러한 방식으로 형성된 부빙들은 더 작은 부빙 입자 용적을 가지며 전단으로 인한 손상에 덜 취약하다. 예를 들어, 세포 배양 배지로의 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드(PDADMAC)의 첨가는 음으로 하전된 세포들 및 세포성 파편을 정전기적 패치 기전을 통해 더 큰 입자들로 응집시킨다(Ramsden 등(1998), Biotechnology technologies, 12(8):599-603). PDADMAC는 또한 음으로 하전된 마이크론 미만의 입자들을 응집시켜 전형적으로 원심분리된 수확 공급물 스트림에 비해 크게 더 높은 수확 필터 보유를 갖는 공급물 스트림을 생성한다. 이온성 상호작용을 통한 응집은 염 농도의 증가 또는 pH의 변경에 의해 손상될 수 있다.
재조합 단백질들을 발현하는 세포들을 함유하거나 함유했던 포유류 세포 배양 배지들로의 양이온성 중합체, 예컨대 폴리 디알릴디메틸암모늄 클로라이드의 첨가는 세포들(생활성 및 비생활성), 세포 대사물질들 및 세포성 파편을 포함하는 음으로 하전된 입자들을 응집시킨다. 이러한 큰 응집 입자들은 원심분리에 의해 또는 중력 침강에 의해 제거될 수 있다. 응집된 세포들 및 세포 파편이 침강해 나오는데 필요한 침강 속도 또는 시간은 세포들, 세포 파편 및 세포 대사물질들의 밀도에 의존한다. 배치 세포 배양 공정에 전형적인 낮은 세포 밀도들에서, 응집된 물질은 전형적으로 4시간 내지 24시간, 통상적으로 20-24시간 근처에 걸쳐 일정 시점에 침강해 나온다(추가 침강 없음). 침강 속도들은 높은 생물질의 세포 밀도들(>10% 패킹된 세포 용적), 마이크론 미만의 세포성 파편, 및/또는 높은 락테이트 수준들(>2-3g/L)을 생성하는 세포 배양 공정들과 함께 크게 감소된다. 높은 세포 밀도들을 생성하거나 또는 상승된 락테이트 수준들을 갖는 세포 배양 공정들은 24시간 내에 부빙이 침강해 나오기 위해 상당량의 세포 배지 희석을 필요로 한다. 전통적인 수확 방법들에 대한 대안으로서 양이온성 중합체들, 예컨대 PDADMAC의 사용의 용이성에도 불구하고, 연장된 침강 시간들은 상업적 규모에서 덜 바람직할 수 있다.
본 발명은 양이온성 중합체 응집 재료에서 응집된 입자 크기 및 입자 크기 성장 속도가 비이온성 중합체들 및 비이온성 계면활성제들의 존재 하에 크게 증강됨을 제공한다. PDADMAC-단독 응집 침강 시간을 크게 증가시키는 높은 생물질/세포 밀도들에도 불구하고, PDADMAC가 비이온성 중합체들, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜들 및 비이온성 계면활성제들, 예컨대 Triton X100과 조합 사용되는 경우 일상적으로 2시간 미만의 부빙 중력 침강 시간이 확인되었다. 비이온성 중합체들 및 비이온성 계면활성제들의 첨가로 부빙들을 손상시키고/시키거나 응집 속도들을 감소시킬 수 있는 전단력들이 관용되었다. 80-90% 이상의 수확 회수 수율들이 크게 감소된 숙주 DNA와 함께 일관되게 달성되었다. 비이온성 중합체 첨가는 또한 숙주 세포 단백질들 및 일부 고분자량 종들을 감소시킨다.
본원에서 사용되는 "양이온성 중합체들"은 음으로 하전된 현탁 입자들에 결합하는 양으로 하전된 중합체들이다. 양이온성 중합체들에는 디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드(DADMAC)의 중합체들이 비제한적으로 포함된다. 바람직한 구현예에서, DADMAC의 중합은 N-치환 피롤리딘 구조 PDADMAC를 형성한다(도 1). 양이온성 중합체들에는 또한 폴리 에틸렌이민(PEI), 폴리 아크릴아미드(PAA) 및 키토산이 포함된다.
총 세포 밀도 당 약 20pg 내지 약 90pg PDADMAC의 농도들은 낮은 상청액 탁도 및 우수한 부빙 침강을 일으켰다. "총 세포 밀도"는 Cedex 세포 계수기 및 분석기를 이용하여 트립판 블루 배제로 측정되는 생활성 세포들 + 비생활성 세포들의 합이다. 작은 세포주들, 예컨대 이배체 세포주에 대한 하나의 구현예에서, PDADMAC는 약 25pg/총 세포 밀도로 첨가된다. 또 다른 구현예에서, PDADMAC는 더 큰 세포주들, 예컨대 사배체 세포주에 대해 약 43 내지 약 57pg/총 세포 밀도로 첨가된다.
200,000-500,000 분자량들의 PDADMAC는 더 낮은 분자량 형태들에 비해 침강 속도 및 상청액 청정도를 증가시켜 응집 성능에 영향을 미친다. 하나의 구현예에서, PDADMAC 분자량은 400,000 내지 500,000의 범위이다. 하나의 구현예에서, 분자량 범위가 400,000 - 500,000인 PDADMAC는 최종 농도 22pg/총 세포 밀도로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 분자량 범위가 400,000 - 500,000인 PDADMAC는 최종 농도 25pg/총 세포 밀도로 사용된다. 또 다른 구현예에서, 분자량 범위가 400,000 - 500,000인 PDADMAC는 최종 농도 45pg/총 세포 밀도로 사용된다.
본원에서 사용되는 "침강 속도", "중력 침강 속도" 및 "응집된 패킹 침강 속도"는 상호 교환적으로 사용된다. 침강 속도들은 당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 중력 침강은 1g에서 수행된다. 침강 속도들은 부빙 용적을 0.5L 또는 1L 눈금 실린더에서 측정되는 총 용적로 나누어서 결정된다. 총 용적은 포함된 모든 응집/침강 제제들을 포함하는 세포 배지의 용적이다.
"침강 시간"은 부빙이 침강하는데 걸리는 시간이다. 침강 시간은 부빙 침강 속도가 1%/시간 이하일 때 달성된다. 비이온성 계면활성제들과 조합된 비이온성 중합체 또는 비이온성 중합체들의 투여와의 조합에서 PDADMAC 응집에 대해 15분만큼 적은 침강 시간들이 본원에 기재된다. PDADMAC-단독 응집 침강 시간을 크게 증가시키는 높은 생물질/세포 밀도들에도 불구하고 신속한 침강 시간이 일어난다. 비이온성 중합체들 또는 비이온성 계면활성제들의 첨가로 부빙들을 손상시키고/시키거나 응집 속도들을 감소시키는 전단력들이 관용된다.
상청액 청정도는 침강 속도와 무관하지만, 양이온성 중합체 투여 수준에 의존한다. 온도, 세포 배양액 밀도 및 점도와 같은 다른 요인들은 침강 속도 또는 상청액 청정도에 거의 영향을 미치지 않았다. 특히 PDADMAC 투여는 세포 용적, 세포들(생활성 및 비생활성 세포들)의 총 밀도, 및 마이크론 미만의 세포성 파편 입자들 농도의 함수이다.
본원에서 사용되는 "비이온성 중합체"는 분자들 간의 상호작용들을 증가시켜 침전을 증강시키는 친수성 중합체들을 나타낸다. 비이온성 중합체들에는 폴리에틸렌 글리콜들(PEG) 말토덱스트란, 전분들, 메틸 셀룰로오스들, 및 덱스트란들이 비제한적으로 포함된다.
PEG 또는 덱스트란들이 포유류 세포 배양 배지들에 양이온성 중합체 응집제의 첨가와 동시에 또는 이에 이어서 첨가되는 경우 증가된 침강 속도들이 달성되었다. 산물 회수는 비이온성 중합체 농도, PEG 분자량, 비이온성 중합체 및 PDADMAC의 첨가 순서(동시에 또는 PDADMAC 먼저, 이어서 비이온성 중합체를) 및 세포 배양 기간 또는 세포 배양 배지 중의 파편 수준에 의존하였다.
PEG 3,000은 약 3 내지 약 4.5%(w/v) 범위에서 유용하다. PEG 6,000은 약 2.5% 내지 약 3.5%(w/v) 범위에서 유용하다. 하나의 구현예에서 PEG 3,000은 최종 농도 3%(w/v)에서 사용된다. 또 다른 구현예에서, PEG 3,000은 최종 농도 15%(w/v)에서 사용된다. 또 다른 구현예에서, PEG 3,000은 최종 농도 25%(w/v)에서 사용된다.
본원에서 사용되는 "비이온성 계면활성제"는 양쪽성인, 즉 소수성기들 및 친수성기들을 모두 함유하는 유기 화합물들을 나타내며, Sapoin 및 Triton X100이 비제한적으로 포함된다. 하나의 구현예에서, Triton X-100은 최종 농도 0.05%(w/v)에서 사용된다.
비이온성 중합체는 단독으로 또는 비이온성 계면활성제와의 조합으로 첨가될 수 있다. 둘 중 하나가 양이온성 중합체와 동시에 또는 양이온성 중합체의 첨가에 뒤이어 첨가될 수 있다. 비이온성 중합체 및 계면활성제는 모두 1분 이하의 첨가 시간에 빠르게 첨가될 수 있다.
응집제가 침강되면(일차 침강), 청정화된 상청액이 수확될 수 있다. 재조합 산물 회수를 증가시키기 위해, 부빙을 세척하거나 재현탁하여 임의의 잔여 재조합 산물을 제거할 수 있다. 적합한 세척 희석제들에는 수크로오스, PEG, 세포 배양 배지들 및 완충 식염수 용액이 포함된다. 하나의 구현예에서, 세척 희석제는 9% 수크로오스이다. 부빙 및 세척 희석제는 <1분 내지 60분 동안 혼합되고 ~1시간 내지 24시간 동안 침강하도록 방치된다. 부빙이 침강되면(이차 침강), 청정화된 이차 상청액이 수확된다. 일차 및 이차 침강으로부터의 상청액들은 조합되거나 별도로 정제될 수 있다.
청정화된 상청액은 펌핑 또는 경사분리 후 규조토를 함유하는 뎁스 필터에 이어 0.2μ 컷 오프 멤브레인 필터 또는 단순히 0.2μ 컷 오프 필터를 통한 여과에 의해 상청액을 제거하여 수확될 수 있다.
양이온성 중합체 제거는 당분야에 공지된 방법들, 예컨대 포유류 세포 독성을 모니터링하기 위한 분석들; DNA 중합효소 또는 역전사에 의한 DNA 또는 RNA 전사의 저해를 결정하기 위한 분석들 및 mRNA의 단백질 번역을 결정하는 분석들에 의해; 그리고 본원에 기재된 방법들에 의해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 정제 공정 중간체들로부터의 PDADMAC 제거는 정량적 중합효소 연쇄 반응(QPCR)을 이용하여 DNA 증폭의 저해에 의해 모니터링될 수 있다.
세포 배양 배지는 생물반응기에서 직접 사용될 수 있거나 또는 응집 전에 냉각될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포 배양 배지에 대한 온도 범위는 약 36℃ 내지 약 20℃이다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양 배지는 약 20℃로 냉각된다.
본 발명은 포유류 세포 배양들로부터 재조합 단백질들의 수확 방법을 제공한다. 포유류 세포 배양에 의한 재조합 단백질들의 제조를 위한 상업적 공정들에서 이용되는 통상적 방법들에는 배치 배양, 공급-배치 및 관류 배양이 포함된다. 배치 배양은 세포들을 고정된 용적의 배양 배지들 중에 단시간 성장시킨 후 전체 수확하는 불연속적 방법이다. 수확은 통상 최대 세포 밀도(통상 5-10x106세포들/mL)에 도달하는 시점에 일어난다. 공급-배치 배양은 소비된 이들 배지들의 성분들을 보충하기 위해 볼루스 또는 연속 배지들의 공급들을 제공한다. 공급-배치 배양들은 주행을 통해 추가 영양소들을 받으므로, 이들은 배치 방법에 비해 더 높은 세포 밀도들(>10 내지 30x106세포들/ml) 및 증가된 산물 역가들을 달성할 가능성이 있다. 관류 방법들을 이용하면 통상적인 대규모의 상업적 세포 배양 전략들로 높은 세포 밀도들 60 - 90(+) x 106세포들/mL에 도달하려고 노력하며, 여기서 거의 50% 이상의 반응기 용적이 생물질이다. 관류 배양을 이용하면 >1 x 108세포들/mL의 매우 높은 세포 밀도들이 달성되고 더 높은 밀도들도 예상된다.
본원에서 사용되는 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 펩티드 결합들에 의해 서로 결합된 둘 이상의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 나타낸다. 펩티드들, 폴리펩티드들 및 단백질들은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황화, 글루탐산 잔기들의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화를 비제한적으로 포함하는 개질들을 포함한다. 폴리펩티드들은 단백질 기반 약물들을 포함하여 과학적 또는 상업적 관심의 대상이 될 수 있다. 폴리펩티드들에는 다른 것들 중에 항체들, 융합 단백질들 및 시토카인들이 포함된다. 펩티드들, 폴리펩티드들 및 단백질들은 세포 배양 방법들을 이용하여 재조합 동물 세포주들에 의해 생성되며, "재조합 펩티드", "재조합 폴리펩티드" 및 "재조합 단백질"로 불릴 수 있다. 발현되는 단백질(들)은 세포내에서 생성되거나 이것이 회수 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지 내로 분비될 수 있다.
본 발명의 방법들을 이용하여 수확될 수 있는 폴리펩티드들의 예들에는 하기 단백질들 중 하나의 전부 또는 일부와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열들을 포함하는 단백질들이 포함된다: 종양 괴사 인자(TNF), flt3 리간드(WO 94/28391), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 칼시토닌, IL-2, 안지오포이에틴-2(Maisonpierre 등(1997), Science 277(5322): 55-60), NF-카파 B의 수용체 활성화제에 대한 리간드(RANKL, WO 01/36637), 종양 괴사 인자(TNF)-관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL, WO 97/01633), 흉선 기질 유래 림포포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립구-대식구 집락 자극 인자(GM-CSF, 호주 특허 번호 588819), 비만 세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자(US 특허 번호 6,204,363), 표피 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 대핵세포 성장 및 발생 인자, RANTES, 인간 피브리노겐 유사 2 단백질(FGL2; NCBI 접근 번호 NM_00682; Rueegg and Pytela (1995), Gene 160:257-62), 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자들, 부갑상선 호르몬, α-인터페론들, γ-인터페론, 및 컨센서스 인터페론들을 포함하는 인터페론들(US 특허 번호들 4,695,623 및 4,897471), 신경 성장 인자, 뇌 유래 신경영양 인자, 시냅토태그민 유사 단백질들(SLP 1-5), 뉴로트로핀-3, 글루카곤, 인터류킨들, 집락 자극 인자들, 림포톡신-β, 백혈병 저해 인자 및 온코스타틴-M. 본 발명의 방법들에 따라 제조될 수 있는 단백질들의 설명들은, 예를 들어 [Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, all volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); 및 The Cytokine Handbook, Vols. 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003)]에서 찾아볼 수 있다.
추가적으로 본 발명의 방법들은 임의의 상기 언급된 단백질들에 대한 수용체의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질들, 이러한 수용체 또는 임의의 상기 언급된 단백질들의 길항제, 및/또는 이러한 수용체들 또는 길항제들에 실질적으로 유사한 단백질들을 수확하는데 유용할 것이다. 이들 수용체들 및 길항제들에는 하기가 포함된다: 두 형태들의 종양 괴사 인자 수용체(TNFR, p55 및 p75로 불림, US 특허 번호 5,395,760 및 US 특허 번호 5,610,279), 인터류킨-1(IL-1) 수용체들(I형 및 II형; EP 특허 번호 0460846, US 특허 번호 4,968,607, 및 US 특허 번호 5,767,064), IL-1 수용체 길항제들(US 특허 번호 6,337,072), IL-1 길항제들 또는 저해제들(US 특허 번호들 5,981,713, 6,096,728, 및 5,075,222), IL-2 수용체들, IL-4 수용체들(EP 특허 번호 0 367 566 및 US 특허 번호 5,856,296), IL-15 수용체들, IL-17 수용체들, IL-18 수용체들, Fc 수용체들, 과립구-대식구 집락 자극 인자 수용체, 과립구 집락 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 저해 인자에 대한 수용체들, NF-카파 B의 수용체 활성화제(RANK, WO 01/36637 및 US 특허 번호 6,271,349), 오스테오프로테게린(US 특허 번호 6,015,938), TRAIL에 대한 수용체들(TRAIL 수용체들 1, 2, 3, 및 4를 포함), 및 Fas 또는 아폽토시스-유도 수용체(AIR)와 같은 사멸 도메인들을 포함하는 수용체들.
본 발명을 이용해서 수확될 수 있는 다른 단백질들에는 분화 항원들의 아미노산 서열들의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질들(CD 단백질들로 불림) 또는 이들의 리간드들 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질들이 포함된다. 이러한 항원들은 Leukocyte Typing VI(Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani 등 eds., Kobe, Japan, 1996)에 개시된다. 유사한 CD 단백질들은 후속 워크샵들에서 개시된다. 이러한 항원들의 예들에는 CD22, CD27, CD30, CD39, CD40, 및 이에 대한 리간드들(CD27 리간드, CD30 리간드 등)이 포함된다. 일부 CD 항원들은 TNF 수용체 패밀리의 구성원들이며, 여기에는 41BB 및 OX40도 포함된다. 리간드들은 종종 41BB 리간드 및 OX40 리간드와 마찬가지로 TNF 패밀리의 구성원들이다.
효소적으로 활성을 갖는 단백질들 또는 이들의 리간드들이 본 발명을 이용하여 수확될 수 있다. 예들에는 하기 단백질들 중 하나의 전부 또는 일부를 포함하는 단백질들 또는 이들의 리간드들 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질이 포함된다: 디스인테그린 및 TNF-알파 전환 효소를 포함하는 메탈로프로티나아제 도메인 패밀리 구성원들, 다양한 키나아제들, 글루코세레브로시다아제, 수퍼옥시다아제 디스뮤타아제, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인자 VIII, 인자 IX, 아포리포단백질 E, 아포리포단백질 A-I, 글로빈들, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, 임의의 상기 언급된 효소들에 대한 리간드들 및 여러 다른 효소들과 이들의 리간드들.
"항체"라는 용어에는 임의 이소형 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린들 모두, 또는 달리 명시되지 않는 한, 이들의 인간, 인간화, 키메라, 다중-특이적, 모노클로날, 폴리클로날 및 올리고머들 또는 항원 결합 단편들을 포함하는 특이적 결합을 위해 온전한 항체와 경쟁하는 이들의 항원 결합 영역에 대한 참조가 포함된다. 또한, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디들, Fd, dAb, 맥시바디들, 단일쇄 항체 분자들, 상보성 결정 영역(CDR) 단편들, scFv, 디아바디들, 트리아바디들, 테트라바디들 및 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합을 부여하기 충분한 적어도 일부 면역글로불린을 함유하는 폴리펩티드들과 같은 항원 결합 단편 또는 영역을 갖는 단백질들이 포함된다. "항체"라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나 발현되거나 생성되거나 또는 단리되는 것들, 예컨대 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체들이 비제한적으로 포함된다.
항체들의 예들에는 상기 언급된 단백질들 및/또는 하기 항원들을 비제한적으로 포함하는 단백질들의 임의 하나 또는 조합을 인식하는 것들이 비제한적으로 포함된다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛들, FGL2, PDGF-β 및 이들의 유사체들(US 특허 번호들 5,272,064 및 5,149,792 참고), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, EGF 수용체(US 특허 번호 6,235,883 참고), VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극제(BlyS, 또한 BAFF, THANK, TALL-1, 및 zTNF4로도 알려져 있음; [Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25 참고], C5 보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, LCG(폐암과 연관되어 발현되는 유전자 산물임), HER-2, HER-3, 종양-연관 당단백질 TAG-72, SK-1 항원, 결장암 및/또는 췌장암을 갖는 환자들의 혈청들에서 상승된 수준들로 존재하는 종양-연관 에피토프들, 유방, 결장, 편평 세포, 전립선, 췌장, 폐 및/또는 신장 암 세포들 및/또는 흑색종, 신경교종, 또는 신경아세포종 세포들에서 발현되는 암-연관 에피토프들 또는 단백질들, 종양의 괴사 중심, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린들, TRAIL 수용체들 1, 2, 3, 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 세포내 부착 분자-3(ICAM-3), 류코인테그린 어드헤신, 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2(인자 VIIa-조직 인자의 저해제임), MHC I, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 종양 괴사 인자(TNF), CTLA-4(세포독성 T 림프구 연관 항원임), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클레로스틴, L-셀렉틴, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염 바이러스(HBV), 스트렙토코커스 뮤탄스 및 스타필로코커스 아우레우스. 본 발명의 방법들을 이용하여 제조될 수 있는 공지된 항체들의 구체예들에는 아달리무맙, 베바시주맙, 인플릭시맵, 앱식지맵, 알렘투주맙, 바피뉴주맙, 바실릭지맵, 벨리무맙, 브리아키누맵, 카나키누맵, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맵, 코나투무맙, 데노수맵, 에쿨리주맙, 젬투주맙, 오조가마이신, 골리무맙, 이브리투모맵 티욱세탄, 라베투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 무로모냅-CD3, 나탈리주맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맵, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨투모맵, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맵, 로벨리주맙, 토실리주맙, 토시투모맵, 트라스투주맙, 우스테키누맵, 베돌리조맙, 잘루투무맙, 및 자놀리무맙이 비제한적으로 포함된다.
본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 언급된 단백질들을 포함하는 재조합 융합 단백질들을 수확하기 위해서도 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 단백질들 중 하나 + 다량체화 도메인, 예컨대 류신 지퍼, 코일화 코일, 면역글로불린의 Fc 부분 또는 실질적으로 유사한 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질들이 본 발명의 방법들을 이용하여 제조될 수 있다. 예로, [WO94/10308; Lovejoy 등(1993), Science 259: 1288-1293; Harbury 등(1993), Science 262: 1401-05; Harbury 등(1994), Nature 371:80-83; Hakansson 등(1999), Structure 7:255-64]를 참고하라. 이러한 재조합 융합 단백질들 가운데, 수용체 부분이 항체의 Fc 부분에 융합된 단백질들, 예컨대 에타네르셉트(p75 TNFR:Fc), 및 벨라타셉트(CTLA4:Fc)가 구체적으로 포함된다.
본 발명의 목적들을 위해, 세포 배양 배지는 시험관 내 세포 배양에서 동물 세포들, 예컨대 포유류 세포들의 성장에 적합한 배지들이다. 세포 배양 배지들의 제형물들은 당분야에 널리 공지되어 있다. 통상적으로, 세포 배양 배지들은 완충액들, 염들, 탄수화물들, 아미노산들, 비타민들 및 미량 필수 원소들로 이루어진다. 세포 배양 배지는 혈청, 펩톤, 및/또는 단백질들을 함유할 수도 함유하지 않을 수도 있다. 무혈청 및 정의된 배양 배지들을 포함하는 다양한 조직 배양 배지들이 시판되며, 예를 들어 하기 세포 배양 배지들 중 임의 하나 또는 조합을 사용할 수 있다: 다른 것들 중에서 RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지 이글, F-12K 배지, Ham F12 배지, Iscove 변형 둘베코 배지, McCoy 5A 배지, Leibovitz L-15 배지, 및 무혈청 배지들, 예컨대 EX-CELL™ 300 시리즈(JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). 세포 배양 배지들에는 배양되는 세포들의 요건들 및/또는 원하는 세포 배양 파라미터들에 따라 아미노산들, 염들, 당들, 비타민들, 호르몬들, 성장 인자들, 완충액들, 항생제들, 지질들, 미량 원소들 등과 같은 성분들의 추가적이거나 증가된 농도들이 보강될 수 있다.
세포 배양 배지들은 무혈청, 무단백질, 및/또는 무펩톤일 수 있다. "무혈청"이란 동물 혈청들, 예컨대 태아 소 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. "무단백질"이란 외래 첨가된 단백질들, 예컨대 트랜스페린, 단백질 성장 인자들 IGF-1, 또는 인슐린이 없는 세포 배양 배지들에 적용된다. 무단백질 배지들은 펩톤들을 함유할 수도 함유하지 않을 수도 있다. "무펩톤"이란 외래 단백질 가수분해물, 예컨대 동물 및/또는 식물 단백질 가수분해물들을 함유하지 않는 세포 배양 배지들에 적용된다. 세포 배양 배지 등의 용어는 다른 것들 가운데 생활성 및 비생활성 포유류 세포들, 세포 대사물질들 및 세포성 파편, 예컨대 핵산들, 단백질들 및 리포좀들을 함유하는 세포 배양 배지들을 나타낸다.
세포 배양 또는 "배양"이란 다세포 개체 또는 조직 밖에서의 세포들의 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포들에 대해 적합한 배양 조건들은 당분야에 공지되어 있다. 예로, [Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)]를 참고하라. 포유류 세포들은 현탁액 중에서 또는 고체 기재에 부착된 채로 배양될 수 있다. 마이크로담체들을 포함하거나 포함하지 않고 배치, 공급 배치, 연속, 반연속, 또는 관류 모드로 작동되는 유동층 생물반응기들, 중공 섬유 생물반응기들, 롤러 병들, 진탕 플라스크들, 또는 교반 탱크 생물반응기들을 포유류 세포 배양에 이용할 수 있다.
포유류 세포들, 예컨대 CHO 세포들은 소규모 배양들, 예컨대 100ml에서부터 대규모 세포 배양들, 예컨대 단백질 치료제들의 임상적 및 상업적 제조를 위한 수천 및 수만 ml들의 배양 크기들을 갖는 시스템들까지에서 배양될 수 있다.
세포주들(또한 "숙주 세포들"로 나타냄)은 상업적 또는 과학적 관심 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 세포주들은 통상적으로 무제한의 시간 동안 배양 중에 유지될 수 있는 일차 배양에서 생기는 계통으로부터 유래된다. 세포주의 유전적 조작에는 숙주 세포가 원하는 재조합 폴리펩티드를 발현하도록 하기 위해 세포들의 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 이용한 형질감염, 형질변환 또는 형질이입 및/또는 다른 변경(예로 재조합 세포와 비재조합 세포의 융합 또는 유전자 활성화 및 상동성 재조합)이 관여된다. 관심 폴리펩티드를 발현하기 위한 세포들 및/또는 세포주들의 유전적 조작을 위한 방법들 및 벡터들은 당분야 숙련자에게 널리 공지되어 있다; 예를 들어, 다양한 기법들이 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등 eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 업데이트들); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69]에 예시된다.
배양 중 성장에 적합한 다양한 포유류 세포주들은 American Type Culture Collection(Manassas, Va.) 및 상업적 공급업체들로부터 이용할 수 있다. 업계에서 일반적으로 사용되는 포유류 세포주들의 예들에는 VERO, BHK, HeLa, CV1(Cos 포함), MDCK, 293, 3T3, 골수종 세포주들(예로, NSO, NS 1), PC12, WI38 세포들, 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들이 포함된다. CHO 세포들은 복잡한 재조합 단백질들, 예로 시토카인들, 응고 인자들 및 항체들(Brasel 등(1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman 등(1988), J. Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon 등(1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood 등(1990), J. Immunol. 145:3011-3016)의 제조를 위해 널리 사용된다. 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)-결핍 돌연변이체 세포주들(Urlaub 등(1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220), DXB11 및 DG-44는 효율적인 DHFR로 선택 가능하고 증폭 가능한 유전자 발현 시스템이 이들 세포들에서 고수준의 재조합 단백질 발현을 허용하므로 바람직한 CHO 숙주 세포주들이다(Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566). 추가적으로, 이들 세포들은 부착물 또는 현탁액 배양들로 조작하기 쉽고 상대적으로 우수한 유전적 안정성을 나타낸다. CHO 세포들 및 이들 중에서 재조합적으로 발현되는 단백질들은 널리 특징분석되었으며 규제 당국들에 의해 임상적 상업적 제조에서의 사용에 대해 승인받았다.
본 출원에서 사용되는 용어는 당분야 내에서 표준이지만, 특허청구범위들의 의미에 대한 명확성 및 확실성을 확실히 하기 위해 특정 용어들의 정의들이 본원에 제공된다. 단위들, 접두어들 및 기호들은 이들의 SI 승인 형태로 표시될 수 있다. 본원에서 언급되는 수치 범위들은 범위를 정의하는 숫자들을 포함하며, 정의된 범위 내의 각 정수를 지지하는 것이다. 달리 주지되지 않는 한, "a" 또는 "an"이라는 용어들은 "적어도 하나"의 의미로 간주되어야 한다. 본원에서 사용되는 섹션 제목들은 단지 구성적 목적들을 위한 것이며 기재된 요지를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본원에 기재되는 방법들 및 기법들은 일반적으로 당분야에 널리 공지된 종래 방법들에 따라 그리고 달리 나타내지 않는 한 본 명세서에 걸쳐 언급되고 논의는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌들에 기재된 바와 같이 수행된다. 예로, [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]를 참고하라. 특허들, 특허 출원들, 논문들, 서적들, 및 조약들을 포함하여 본 출원에서 언급되는 모든 문헌들, 또는 문헌들의 일부들은 본원에 명시적으로 참고문헌으로 도입된다.
본 발명은 본 발명의 개별 측면들의 단일 예시들로 의도되는 본원에 기재된 특정 구현예들에 의해 범위가 제한되는 것이 아니며, 기능적으로 균등한 방법들 및 성분들이 본 발명의 범위 내이다. 실제로 본 발명의 다양한 개질들은 본원에 나타내고 기재된 것에 부가하여 상기 설명 및 동반 도면들로부터 당분야 숙련자에게 자명해질 것이다. 이러한 개질들은 첨부되는 특허청구범위들의 범위 내에 속하는 것이다.
실시예들
실시예 1
본 실험은 포유류 세포 배양 배지의 응집 및 이들의 침강 시간들을 비교하기 위한 디알릴디메틸암모늄 클로라이드(PDADMAC)의 상이한 분자량의 제조물들을 비교한다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 15일 동안 공급 배치 배양에서 2,000L 생물반응기들 중에 성장시켰다. 평가 전에 세포 배양 배지를 10℃로 냉각하였다. 일련의 스핀 플라스크들을 각 플라스크 내에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. PDADMAC를 20%(w/v) 액체(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 공급하고 정제수로 10%(w/v)로 희석하여 이들 실험들 모두에서 사용되는 작업 스톡 용액을 제조하였다. 분자량들 100,000 - 200,000; 200,000 - 350,000; 및 400,000 - 500,000의 PDADMAC를 각각의 플라스크로 총 세포 밀도 당 29 내지 86pg PDADMAC의 최종 농도로 첨가하였다. PDADMAC 용액들을 약 1분 동안 연속 첨가하고, 10℃에서 70-80rpm에서 교반하면서 15분 동안 인큐베이션하였다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다. 상기 재료를 침강 시간 결정에 이용하였다.
두 번째 공급 배치 배양을 15일 동안 1,000L 일회용 반응기 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지를 ~36℃에서 유지하였다. 일련의 스핀 플라스크들을 각 플라스크 내에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. 분자량들 < 100,000, 100,000 - 200,000; 200,000 - 350,000; 및 400,000 - 500,000의 PDADMAC를 각각의 플라스크로 총 세포 밀도 당 25 내지 76pg PDADMAC의 최종 농도로 첨가하였다. PDADMAC 용액들을 약 1분 동안 연속 첨가하고, ~36℃에서 70-80rpm에서 교반하면서 15분 동안 인큐베이션하였다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다. 상기 재료를 탁도 결정에 이용하였다.
총 세포 밀도는 생활성 세포들의 총 수를 Cedex 세포 계수기 및 분석기(Roche Innovatis AG, Indianapolis, IN)를 이용한 트립판 블루 배제로 측정되는 총 비생활성 세포들에 추가하여 결정하였다. 이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 90분 동안 15분 간격으로 측정하고 상대 응집 용적을 침강된 부빙 용적/총 용적로 계산하였다.
상청액을 경사분리 후 0.2μ 필터에 의해 침강된 응집 세포 물질로부터 제거하였다. 탁도를 2100P 탁도측정기(Hach, Loveland, CO)를 이용하여 측정하였다.
도들 2a 및 2b는 평균 분자량 200,000 초과 500,000 미만의 PDADMAC으로의 응집이 평균 분자량 200,000 미만의 PDADMAC에 비해 최적 침강 시간 및 청정도를 야기함을 나타낸다.
실시예 2
상기 실험은 작은 세포주, 예컨대 이배체 세포, 및 큰 세포주, 예컨대 사배체 세포주로부터 재조합 항체를 발현하는 포유류 세포 배양 배지를 응집하는데 필요한 PDADMAC의 양을 비교한다.
이배체 및 사배체 세포주들을 상술된 바와 같이 성장시켰다. 일련의 스핀 플라스크들을 각각의 이배체 및 사배체 배양들로부터 각각의 플라스크 내에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. 상기 실험 및 모든 하기 실험들에서 달리 주지되지 않는 한, 평균 분자량 400,000 내지 500,000의 PDADMAC를 사용한다. PDADMAC를 표 2에 나타낸 바와 같은 최종 농도로 각 플라스크에 첨가하였다. 총 세포 밀도를 상술된 바와 같이 결정하였다.
[표 2]
이배체 및 사배체 배양들을 위한 PDADMAC의 최종 농도들
PDADMAC 용액들을 연속 첨가하고 상술된 바와 같이 교반하였다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들 내로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 90분 내지 120분 동안 15분 간격으로 측정하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도 3a는 총 세포 당 25pg 농도의 PDADMAC를 이용한 응집이 가장 빠른 침강 시간을 가졌음을 나타낸다.
도 3b는 총 세포 당 57pg 농도의 PDADMAC를 이용한 응집이 가장 빠른 침강 시간을 가졌음을 나타낸다.
실시예 3
상기 실험은 높은 락테이트 수준들을 생성하고/하거나 높은 세포 밀도들을 갖는 세포 배양들에 대한 PDADMAC 응집의 영향을 살펴본다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 14일 동안 1,000L 일회용 생물반응기 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지는 상온이었다. 4개의 스핀 플라스크들을 각 플라스크 내에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. PDADMAC를 첨가하기 전에, 3g/L, 6g/L 또는 9g/L의 Na DL-락테이트를 60%(w/w)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)로 첨가하거나, 또는 대조군으로 락테이트를 첨가하지 않았다. 이어서 PDADMAC를 각각의 플라스크로 25pg/총 세포 밀도(상술된 바와 같은 PDADMAC 스톡 용액)의 최종 농도로 첨가하였다. 총 세포 밀도를 상술된 바와 같이 결정하였다.
PDADMAC를 상온에서 연속 첨가하고, 상술된 바와 같이 교반하였다. 이어서 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 1500분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
CHO 세포 배양들의 두 번째 배치를 20일 동안 관류 배양으로 1,000L 일회용 생물반응기들 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지를 상온으로 냉각하였다. PDADMAC 첨가 전에 세포 배지를 세포 배양 배지로 25%, 50% 및 75%로 희석하였다. 패킹된 세포 용적이 44%인 세포 배지는 PDADMAC 첨가 전에 희석하지 않았다. PDADMAC의 최종 농도는 25 내지 26pg/총 세포 밀도였다. PDADMAC 첨가 속도는 상술된 바와 같이 상온에서 교반 및 침강하며 ~1분이었다.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 1400분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도들 4a 및 4b는 높은 락테이트 수준들(>2-3g/L)을 갖고/갖거나 높은 생물질의 세포 밀도들(>10% 패킹 세포 용적)을 생성하는 세포 배양 공정들로 침강 속도들이 크게 감소됨을 나타낸다.
실시예 4
상기 실험은 PDADMAC와 조합 사용되는 상이한 희석제들의 침강 시간들을 비교한다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 18일 동안 관류 배양에서 1,000L 일회용 생물반응기 중에 성장시켰다. 16일째의 세포 배지를 36℃에서 평가를 위해 옮기고 응집 2.5시간 전에 상온으로 냉각하였다. 첨가 및 침강은 상온에서 수행하였다. PDADMAC 첨가 전에, 세포 배지를 다양한 희석제들로 67%로 희석하였다. 락테이트 수준은 5g/L이었다. PDADMAC 첨가 속도 ~1분, 인큐베이션 기간은 75-85rpm에서 15분이었다. PDADMAC 스톡 용액은 원액 20(w/v)과 정제수를 포함하여 10%(w/v)였다. PDADMAC의 최종 농도는 25pg/총 세포 밀도였다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
일련의 희석제들을 제조하였다; 농도들을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
다양한 희석제들의 최종 농도들
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 1600분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, PDADMAC 및 PEG 6,000의 조합이 가장 빠른 침강 시간을 갖는다. PDADMAC와 PEG 6,000, PEG 1,000 또는 덱스트란 70/베타인의 조합은 PDADMAC 단독에 비해 개선된 침강 속도들을 가졌다. 비이온성 중합체들의 첨가는 부빙 침강 속도를 크게 증가시켰다. 또한 PDADMAC와 PEG 또는 덱스트란의 조합은 배양에서 락테이트 수준들과는 무관하게 PDADMAC 단독에 비해 침강 시간을 감소시켰다.
실시예 5
상기 실험은 높은 세포 밀도들을 갖는 세포 배양들을 위한 침강 시간들에 대한 PDADMAC 및 PEG 3,000의 조합의 영향을 살펴본다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 20일 동안 관류 배양에서 80L 생물반응기 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지를 평가 전에 상온으로 냉각하였다. PDADMAC 첨가 전에, 세포 배지를 36%(w/v) 수크로오스 또는 25%(w/v) PEG 3,000(둘 다 정제수 중)을 이용하여 10%로 희석하였다. 최종 세포 배지 수크로오스 농도는 3.6%(w/v)였고 최종 PEG 3,000 농도는 2.5%(w/v)였다. PDADMAC 첨가 속도는 ~ 1분이고 인큐베이션 기간은 75-85rpm에서 15분이었다. PDADMAC 스톡 용액은 원액 20(w/v)과 정제수를 포함하여 10%(w/v)였다. PDADMAC의 최종 농도는 PEG 3,000에 대해 22pg/총 세포 밀도였고 수크로오스 및 대조군 또는 희석되지 않은 세포 배지에 대해 25pg/총 세포 밀도였다. 대조군 또는 희석되지 않은 세포 배지 PCV는 48%였다. 희석된 세포 배지 PCV = (대조군 PCV X 희석 인자) = 43.2%.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 240분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, PDADMAC 및 PEG 3,000의 조합은 PDADMAC 단독에 비해 더 빠른 침강을 일으켰다. 실시예 3에 나타낸 바와 같이, PDADMAC 단독에 대한 침강 속도는 세포 밀도의 증가에 따라 크게 감소하였다. PEG 3,000과 PDADMAC의 조합은 세포 배양 공정 밀도와는 무관하게(이 경우, 43% 패킹 세포 용적) PDADMAC 단독에 비해 응집제 침강 시간을 감소시켰다.
실시예 6
상기 실험은 침강 시간들에 대한 PDADMAC와 PEG 첨가 시점의 영향을 살펴본다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 19일 동안 관류 세포 배양 공정에서 80L 생물반응기 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지를 21℃로 냉각하였다. 3개의 스핀 플라스크들을 각 플라스크에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. 하나의 플라스크에 PDADMAC를 45pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가하였다(분자량 400,000-500,000). 또 다른 플라스크에 PDADMAC 45pg/총 세포 밀도 및 PEG 3,000, 15%(w/v)를 볼루스 첨가로 첨가하였다(1-단계 방법). 세 번째 플라스크에 PDADMAC를 45pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가한 뒤 PDADMAC 첨가 후 PEG 3,000을 최종 농도 15%(w/v)로 첨가하였다(2-단계 방법). PDADMAC 첨가 속도는 ~1분이었다. PDADMAC/PEG 첨가 속도는 ~5분이었다. 모든 첨가들은 상온이었다. 모든 플라스크들을 75-85rpm에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 240분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 동시에 또는 순차적으로 첨가된 PDADMAC 및 PEG 3,000의 조합은 PDADMAC 단독에 비해 응집제 침강 시간을 감소시켰다.
다음으로 대규모 배양을 제조하였다. 재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 19일 동안 관류 배양으로 80L 생물반응기 중에 성장시켰다. 세포 배양 배지를 21℃로 냉각하였다. 45pg/총 세포 밀도 농도의 PDADMAC 및 15%(w/v) 최종 농도의 PEG 3,000을 상온에서 동시에 첨가하였고, 첨가 속도는 21분이었고, 100rpm에서 5분의 인큐베이션이 뒤따랐다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
응집제가 침강된 후(일차 침강), 액체를 생물반응기로부터 펌핑한 뒤 규조토를 함유하는 뎁스 필터, 이어서 0.2μ 컷 오프 멤브레인 필터를 통한 여과에 의해 청정화된 상청액을 수확하였다.
부빙을 동일 용적의 9% 수크로오스 용액 중에 세척하여 임의의 잔여 재조합 단백질을 제거하고 16시간 동안 침강하도록 방치하였다. 부빙이 침강한 뒤(이차 침강), 상술된 바와 같이 청정화된 이차 상청액을 수확하였다.
상기 응집들(소규모 및 대규모)로부터의 청정화된 수확 세포 배양 상청액들을 단백질 A 크로마토그래피, 이어서 산물 품질 결정을 이용하여 정제하였다. 산물 품질 결정 전에 단백질 A 용출액을 중화하지 않았다. 측정된 단백질 A 용출액의 산물 품질 특성들은 SEC에 의해 결정되는 분자 변이체들, ELISA에 의해 결정되는 숙주 세포 단백질들이었다.
이어서 단백질 A 정제 재료를 pH 7.5에서 CEX 컬럼에 걸쳐 통과시켰다.
[표 4]
산물 품질은 두 규모들에 대해 대조군 및 일차 응집물 수확 간에 유사하다. PDADMAC/PEG 일차 수확은 단백질 A 풀에서 낮은 HMW 수준들에 의해 반영되듯이 더 높은 수준의 응집물을 제거하는 경향이 있다. PDADMAC/PEG 수확에 있어서 숙주 세포 단백질 수준의 감소가 관찰되었다. 수크로오스를 이용한 재현탁은 일차 PDADMAC/PEG 수확에 비해 약간 더 높은 수준들의 CHOP 및 HMW를 생성하였고, 이들 불순물들의 재용해인 것으로 여겨진다.
실시예 7
상기 실험은 PDADMAC 및 PEG와 함께 계면활성제의 첨가에 의한 침강 시간에 대한 영향을 살펴본다.
재조합 모노클로날 항체를 발현하는 CHO 세포들을 15일 동안 관류 세포 배양에서 80L 생물반응기 중에 성장시켰다. 14일째에 세포 배지를 평가를 위해 30℃로 냉각하였다. 2개의 스핀 플라스크들을 각 플라스크에 1L의 세포 배양 배지를 포함하여 설치하였다. 하나의 플라스크에 PDADMAC 및 PEG 3,000을 동시에 첨가하였고, PDADMAC는 25pg/총 세포 밀도의 농도로(분자량 400,000-500,000) 및 PEG 3,000은 3%(w/v)의 최종 농도로 첨가하였다. 다른 플라스크에는 상기 농도들의 PDADMAC 및 PEG에 부가하여 0.05%(v/v)의 최종 농도로 Triton X-100을 첨가하였다(Triton X-100 스톡 용액은 20%(v/v) 원액(Sigma Aldrich, St. Louis, Mo.)으로부터 10%(v/v)였다). 세 성분들을 동시에 첨가하였다. 첨가 속도는 ~1분이었고, 75-85rpm에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 모든 플라스크들을 이전 실시예들에 기재된 대로 회전시켰다. 부빙이 상온에서 침강하도록 방치하였다.
이어서 응집된 용액들을 1L 유리 눈금 실린더들로 옮겨서 응집된 패킹 침강 속도를 결정하였다. 240분 동안 다양한 간격들에서 측정들을 하고 상대 응집 용적을 상술된 바와 같이 계산하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, PDADMAC 및 PEG 3,000과 더불어 Triton X-100의 첨가는 PDADMAC 및 PEG 3,000 단독에 비해 응집제 침강 시간을 감소시켰다.
Claims (19)
- 재조합 단백질을 발현하는 포유류 세포를, 소정 시간 동안 또는 원하는 세포 밀도 및/또는 패킹된 세포 부피가 달성될 때까지 세포 배양 배지 중에서 배양하는 단계,
세포 배양 배지에 디알릴디메틸암모늄 클로라이드의 중합체, 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드의 중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 중합체 및 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비이온성 중합체를 첨가하여 응집을 개시하는 단계,
응집 동안 상기 세포 배양 배지를 혼합하는 단계,
응집제가 일차 침강을 위해 침강하도록 방치하는 단계, 및
일차 청정화된 상청액을 회수하는 단계
를 포함하는, 포유류 세포 배양물의 수확 방법. - 제1항에 있어서, 상기 비이온성 중합체가 PEG 3,000 및 PEG 6,000으로부터 선택되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 PEG 3,000의 농도가 3% 내지 4.5%인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 PEG 6,000의 농도가 2.5% 내지 3.5%인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 세포 배양 배지에 비이온성 계면활성제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 사포인(Sapoin) 또는 트리톤 엑스100(Triton X100)인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 트리톤 엑스100인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 트리톤 엑스100의 농도가 0.05%(w/v)인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서,
일차 침강 응집제를 세척하는 단계,
세척된 응집제가 이차 침강을 위해 침강하도록 방치하는 단계, 및
이차 청정화 상청액을 회수하는 단계
를 추가로 포함하는, 포유류 세포 배양물의 수확 방법. - 제9항에 있어서, 상기 일차 침강으로부터의 응집제가 9% 수크로오스 용액 중에 세척되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양이온성 중합체 및 비이온성 중합체가 동시에 첨가되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 양이온성 중합체가 먼저 첨가되고 적어도 30초 동안 혼합된 뒤 비이온성 중합체가 첨가되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 양이온성 중합체, 비이온성 중합체 및 비이온성 계면활성제가 동시에 첨가되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 양이온성 중합체가 먼저 첨가되고 적어도 30초 동안 혼합된 뒤 비이온성 중합체 및 비이온성 계면활성제가 첨가되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드가 20 내지 90 pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드가 25 pg/총 세포 밀도의 농도로 첨가되며, 여기서 포유류 세포는 이배체 세포주에서 유래되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드가 43 pg/총 세포 밀도 내지 57 pg/총 세포 밀도로 첨가되며, 여기서 포유류 세포는 사배체 세포주에서 유래되는 것인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포 배양 배지가 36℃ 내지 20℃인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포 배양 배지가 20℃ 이상인, 포유류 세포 배양물의 수확 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020217023322A KR20210095723A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161576303P | 2011-12-15 | 2011-12-15 | |
| US61/576,303 | 2011-12-15 | ||
| PCT/US2012/069916 WO2013090820A1 (en) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | Flocculation method |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020147019193A Division KR20140103320A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217023322A Division KR20210095723A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190137944A true KR20190137944A (ko) | 2019-12-11 |
Family
ID=47559662
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217023322A KR20210095723A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020237042787A KR20230172040A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020197035609A KR20190137944A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020147019193A KR20140103320A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020227019427A KR20220084192A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217023322A KR20210095723A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020237042787A KR20230172040A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020147019193A KR20140103320A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
| KR1020227019427A KR20220084192A (ko) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 응집 방법 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9371554B2 (ko) |
| EP (1) | EP2791319B1 (ko) |
| JP (4) | JP2015504659A (ko) |
| KR (5) | KR20210095723A (ko) |
| CN (2) | CN104245922B (ko) |
| AR (1) | AR089231A1 (ko) |
| AU (4) | AU2012351926A1 (ko) |
| BR (1) | BR112014014116A2 (ko) |
| CA (1) | CA2859197C (ko) |
| CL (1) | CL2014001564A1 (ko) |
| EA (1) | EA201491144A1 (ko) |
| HK (1) | HK1199057A1 (ko) |
| IL (2) | IL233028B (ko) |
| MX (1) | MX353959B (ko) |
| SG (1) | SG11201403258VA (ko) |
| TW (1) | TWI576144B (ko) |
| WO (1) | WO2013090820A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA201404351B (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR089231A1 (es) * | 2011-12-15 | 2014-08-06 | Amgen Inc | Metodo de floculacion |
| TW202246486A (zh) * | 2014-06-09 | 2022-12-01 | 美商健臻公司 | 種子罐培養法(seed train processes)及其用途 |
| FI20165282A (fi) * | 2016-04-01 | 2017-10-02 | Kemira Oyj | Menetelmä ja järjestelmä koaguloinnin ja/tai flokkuloinnin optimoimiseksi veden käsittelyprosessissa |
| CN109311937A (zh) * | 2016-06-15 | 2019-02-05 | 新加坡科技研究局 | 增强用于纯化蛋白质的色谱法的性能的方法 |
| SG11202101113YA (en) * | 2018-08-30 | 2021-04-29 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Methods of detecting nucleic acid |
| HUP1900112A1 (hu) | 2019-04-04 | 2020-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával |
| US11219843B2 (en) * | 2019-07-08 | 2022-01-11 | Nik Paya Karen Pharmed | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants |
| CN111068367A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-28 | 青岛宝和信生物科技有限公司 | 植物/中药提取液及水处理连续自动化絮凝及分离工艺 |
| GB2590721A (en) | 2019-12-31 | 2021-07-07 | Inst Jozef Stefan | Controlled aggregation of cells |
| EP4217366A1 (en) | 2020-09-22 | 2023-08-02 | Basf Se | Method for recovering a protein from a fermentation broth comprising a high degree of lysed cells |
| WO2024059235A2 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Amgen Inc. | A method for harvesting products from perfusion cultures |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| AU588819B2 (en) | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| US4968607A (en) | 1987-11-25 | 1990-11-06 | Immunex Corporation | Interleukin-1 receptors |
| US5075222A (en) | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| WO1990005183A1 (en) | 1988-10-31 | 1990-05-17 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
| US5395760A (en) | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
| DE59010908D1 (de) | 1989-09-12 | 2000-08-10 | Hoffmann La Roche | TNF-bindende Proteine |
| US6204363B1 (en) | 1989-10-16 | 2001-03-20 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| US5149792A (en) | 1989-12-19 | 1992-09-22 | Amgen Inc. | Platelet-derived growth factor B chain analogs |
| US5272064A (en) | 1989-12-19 | 1993-12-21 | Amgen Inc. | DNA molecules encoding platelet-derived growth factor B chain analogs and method for expression thereof |
| US5350683A (en) | 1990-06-05 | 1994-09-27 | Immunex Corporation | DNA encoding type II interleukin-1 receptors |
| AU651596B2 (en) | 1990-06-05 | 1994-07-28 | Immunex Corporation | Type II interleukin-1 receptors |
| JP3589665B2 (ja) | 1992-10-23 | 2004-11-17 | イミュネックス・コーポレーション | 可溶性オリゴマー蛋白質の調製法 |
| US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
| US5552316A (en) * | 1993-06-04 | 1996-09-03 | Environmental Marketing Services, Ltd. | Clarifying E. coli fermentation broths with a combination of anionic and cationic flocculants |
| US5981713A (en) | 1994-10-13 | 1999-11-09 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Antibodies to intereleukin-1 antagonists |
| US5763223A (en) | 1995-06-29 | 1998-06-09 | Immunex Corporation | DNA encoding a cytokine that induces apoptosis |
| US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| US6096728A (en) | 1996-02-09 | 2000-08-01 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
| US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
| US6337072B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-01-08 | Hyseq, Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof |
| GB9919187D0 (en) * | 1999-08-14 | 1999-10-20 | Ciba Spec Chem Water Treat Ltd | Flocculation of cell material |
| WO2001036637A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Immunex Corporation | Receptor activator of nf-kappa b |
| EP1403274A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-03-31 | Meristem Therapeutics | Process for the purification of recombinant proteins from complex media and purified proteins obtained thereby |
| WO2007035283A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Wyeth | Protein floculation using salts |
| EP2121753A2 (en) | 2007-02-14 | 2009-11-25 | Amgen, Inc | Method of isolating antibodies by precipitation |
| EP1985305A1 (en) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
| WO2009101968A1 (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Gene Techno Science Co., Ltd. | 抗ａｄａｍ－１５抗体及びその利用 |
| AU2010205007A1 (en) | 2009-01-13 | 2011-07-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Precipitation of biomolecules with negatively charged polymers |
| AR089231A1 (es) | 2011-12-15 | 2014-08-06 | Amgen Inc | Metodo de floculacion |
-
2012
- 2012-12-13 AR ARP120104705A patent/AR089231A1/es unknown
- 2012-12-14 AU AU2012351926A patent/AU2012351926A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-14 CN CN201280069842.1A patent/CN104245922B/zh active Active
- 2012-12-14 CN CN202110381379.5A patent/CN113150060A/zh active Pending
- 2012-12-14 MX MX2014007128A patent/MX353959B/es active IP Right Grant
- 2012-12-14 KR KR1020217023322A patent/KR20210095723A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 EP EP12815893.8A patent/EP2791319B1/en active Active
- 2012-12-14 EA EA201491144A patent/EA201491144A1/ru unknown
- 2012-12-14 KR KR1020237042787A patent/KR20230172040A/ko active Application Filing
- 2012-12-14 KR KR1020197035609A patent/KR20190137944A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-12-14 BR BR112014014116A patent/BR112014014116A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 JP JP2014547521A patent/JP2015504659A/ja active Pending
- 2012-12-14 CA CA2859197A patent/CA2859197C/en active Active
- 2012-12-14 US US14/365,496 patent/US9371554B2/en active Active
- 2012-12-14 KR KR1020147019193A patent/KR20140103320A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 WO PCT/US2012/069916 patent/WO2013090820A1/en active Application Filing
- 2012-12-14 SG SG11201403258VA patent/SG11201403258VA/en unknown
- 2012-12-14 TW TW101147676A patent/TWI576144B/zh active
- 2012-12-14 KR KR1020227019427A patent/KR20220084192A/ko active Application Filing
-
2014
- 2014-06-09 IL IL233028A patent/IL233028B/en active IP Right Grant
- 2014-06-12 ZA ZA2014/04351A patent/ZA201404351B/en unknown
- 2014-06-13 CL CL2014001564A patent/CL2014001564A1/es unknown
- 2014-12-09 HK HK14112366.5A patent/HK1199057A1/xx unknown
-
2016
- 2016-06-20 US US15/187,460 patent/US20160297850A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-06-22 AU AU2018204547A patent/AU2018204547B2/en active Active
- 2018-10-12 JP JP2018193329A patent/JP6998853B2/ja active Active
- 2018-12-12 IL IL263674A patent/IL263674A/en unknown
-
2020
- 2020-11-09 AU AU2020267147A patent/AU2020267147B2/en active Active
-
2021
- 2021-09-24 JP JP2021155652A patent/JP7274547B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-28 JP JP2023074144A patent/JP2023099117A/ja active Pending
- 2023-08-23 AU AU2023219874A patent/AU2023219874A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020267147B2 (en) | Flocculation method | |
| US20230117598A1 (en) | Mammalian cell culture | |
| KR102391259B1 (ko) | 포유류 세포 배양물을 회수하는 방법 | |
| US9133493B2 (en) | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production | |
| US11319568B2 (en) | Methods for increasing mannose content of recombinant proteins | |
| EP3710139A1 (en) | Methods for producing protein products | |
| EA046418B1 (ru) | Способ флокуляции |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X601 | Decision of rejection after re-examination |