CN104245922B - 絮凝方法 - Google Patents
絮凝方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104245922B CN104245922B CN201280069842.1A CN201280069842A CN104245922B CN 104245922 B CN104245922 B CN 104245922B CN 201280069842 A CN201280069842 A CN 201280069842A CN 104245922 B CN104245922 B CN 104245922B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell culture
- cell
- pdadmac
- peg
- flocculation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 title claims description 63
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 title claims description 63
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 75
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 37
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 24
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 164
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 claims description 131
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 59
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 55
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 43
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 27
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 17
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 16
- 238000012789 harvest method Methods 0.000 claims description 13
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 11
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 11
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 11
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 10
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 claims description 7
- NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N [(1r,2s,4r,5r)-3-hydroxy-4-(4-methylphenyl)sulfonyloxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-2-yl] 4-methylbenzenesulfonate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)O[C@H]1C(O)[C@@H](OS(=O)(=O)C=2C=CC(C)=CC=2)[C@@H]2OC[C@H]1O2 NJSSICCENMLTKO-HRCBOCMUSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract description 20
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 48
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 41
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 37
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 23
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 8
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 8
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 8
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 8
- 229960000578 gemtuzumab Drugs 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- -1 N-substituted pyrrolidine structure Chemical group 0.000 description 3
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 3
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 3
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229960002224 eculizumab Drugs 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 2
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101001031613 Homo sapiens Fibroleukin Proteins 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 2
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 229960000446 abciximab Drugs 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 2
- 229960003270 belimumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 2
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 2
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 2
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 2
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 2
- 229960005267 tositumomab Drugs 0.000 description 2
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007505 ADAM17 Proteins 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- 108010054404 Adenylyl-sulfate kinase Proteins 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010059886 Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 102000005666 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 102100032412 Basigin Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710167766 C-type lectin domain family 11 member A Proteins 0.000 description 1
- 102100032528 C-type lectin domain family 11 member A Human genes 0.000 description 1
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000007499 CD27 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010046080 CD27 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000004634 CD30 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010017987 CD30 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091008038 CHOP Proteins 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 102000013602 Cardiac Myosins Human genes 0.000 description 1
- 108010051609 Cardiac Myosins Proteins 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010028773 Complement C5 Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100021246 DDIT3 upstream open reading frame protein Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 101800001224 Disintegrin Proteins 0.000 description 1
- 102100031111 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 17 Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100038647 Fibroleukin Human genes 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010092372 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016355 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000798441 Homo sapiens Basigin Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 102100026018 Interleukin-1 receptor antagonist protein Human genes 0.000 description 1
- 101710144554 Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000004559 Interleukin-13 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017511 Interleukin-13 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010092694 L-Selectin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 102100021747 Leukemia inhibitory factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000003959 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 108010054862 Member 10c Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100027159 Membrane primary amine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710132836 Membrane primary amine oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001676573 Minium Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010064527 OSM-LIF Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 102000003987 Oncostatin M Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010082522 Oncostatin M Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000008108 Osteoprotegerin Human genes 0.000 description 1
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010038036 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000010498 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 108050006698 Sclerostin Proteins 0.000 description 1
- 102100034201 Sclerostin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 102100039024 Sphingosine kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229950001863 bapineuzumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960001838 canakinumab Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000010961 commercial manufacture process Methods 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229960001251 denosumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000051284 human FGL2 Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002473 insulinotropic effect Effects 0.000 description 1
- 108010043603 integrin alpha4beta7 Proteins 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 231100001141 mammalian cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-M sodium lactate Chemical compound [Na+].CC(O)C([O-])=O NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于从哺乳动物细胞培养流体中收获重组蛋白的方法。所述方法利用阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
Description
本申请要求2011年12月15日提交的美国临时申请号61/576,303的权益，该美国临时申请以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及一种用于从哺乳动物细胞培养肉汤中收获重组蛋白的方法。所述方法利用阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
发明背景
临床制造治疗性蛋白质是一项成本高的大规模的尝试。对更大量的治疗性重组蛋白的需求已驱使在产生显著提高的产物滴度的细胞培养物处理方面取得了长足的进展。高滴度细胞培养过程典型地是通过在更长的培养持续时间内维持高的活细胞密度而产生的。同样还会观测到生物质固体(活细胞和非活细胞)以及亚微米细胞碎片颗粒相应增多。固体和亚微米细胞碎片颗粒的更高负荷可能对哺乳动物细胞培养物收获方法提出挑战，会使得收获方法在不使产物产量大幅损失的情况下去除碎片方面的有效性较低。
阳离子型聚合物絮凝剂被用于以下范围内的多种应用：饮用水纯化、废水处理、在石油、采矿以及造纸行业中使用、化妆品和医疗用途，并且还已经被用于封装哺乳动物细胞和酶以及用于使微生物细胞培养物絮凝。然而，对于在商业规模的哺乳动物细胞收获方法中使用来说，漫长的絮凝沉降时间可能成问题，会使得收获方法耗时并且与标准收获操作规程相比效率更低。
持续需要对哺乳动物细胞培养物收获方法，特别是商业规模的方法进行改进。任何使得回收时间更快和/或回收率更大的改进都可以使得与制造蛋白质治疗剂相关的成本降低。本发明通过提供一种快速并且高效的细胞培养物收获方法来满足这一需要。
发明概述
本发明提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3,000添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3,000以及Triton X-100(曲通X-100)添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降，以及回收澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将阳离子型聚合物和非离子型聚合物添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级澄清了的上清液，如果在初级澄清了的上清液中的产物回收率小于80％，则对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵和PEG 3,000添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
本发明还提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，将聚二烯丙基二甲基氯化铵、PEG 3,000以及Triton X-100添加至细胞培养基中以引发絮凝，在絮凝期间混合细胞培养基，使得絮凝体沉降以进行初级沉降，回收初级澄清了的上清液，对初级沉降的絮凝体进行洗涤，使得经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
在一个实施方案中，阳离子型聚合物是聚二烯丙基二甲基氯化铵。
在另一个实施方案中，非离子型聚合物选自聚乙二醇和葡聚糖。
在另一个实施方案中，非离子型聚合物选自PEG 3,000和PEG 6,000。
在另一个实施方案中，上文提供的哺乳动物细胞培养物收获方法进一步包括将非离子型表面活性剂添加至细胞培养基中。在一个相关的实施方案中，所述非离子型表面活性剂是Triton X-100。
在另一个实施方案中，同时添加阳离子型聚合物和非离子型聚合物。
在另一个实施方案中，同时添加阳离子型聚合物、非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂。
在另一个实施方案中，首先添加阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加非离子型聚合物。
在另一个实施方案中，首先添加阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加非离子型聚合物和非离子型表面活性剂。
在另一个实施方案中，阳离子型聚合物是二烯丙基二甲基氯化铵的聚合物、聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺或壳聚糖。
在另一个实施方案中，非离子型表面活性剂是Sapoin或Triton X100。
在另一个实施方案中，以等于或约20皮克/总细胞密度至等于或约90皮克/总细胞密度的浓度添加聚二烯丙基二甲基氯化铵。
在另一个实施方案中，以等于或约25皮克/总细胞密度的浓度添加聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于二倍体细胞系。
在另一个实施方案中，添加介于43皮克/总细胞密度与57皮克/总细胞密度之间的聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于四倍体细胞系。
在另一个实施方案中，PEG 3,000的浓度是等于或约3％至等于或约4.5％。
在另一个实施方案中，PEG 6,000的浓度是等于或约2.5％至等于或约3.5％。
在另一个实施方案中，Triton X100的浓度是0.05％(w/v)。
在另一个实施方案中，哺乳动物细胞培养肉汤在36℃与20℃之间。
在另一个实施方案中，哺乳动物细胞培养肉汤处于或高于20℃。
在另一个实施方案中，在9％蔗糖溶液中对来自初级沉降的絮凝体进行洗涤。
附图简述
图1提供了PDADMAC的结构。
图2A示出了由具有不同分子量的PDADMAC所实现的沉降时间的差异。具有每一种分子量的PDADMAC的浓度均是57皮克/总细胞密度。实心的菱形/虚线表示100,000-200,000的PDADMAC分子量。实心的正方形和虚线表示200,000-300,000的PDADMAC分子量。实心的三角形和实线表示400,000-500,000的PDADMAC分子量。
图2B示出了当使用具有不同的分子量的PDADMAC使细胞培养肉汤絮凝时所实现的上清液澄明度。从左至右，各柱形图表示以下的PDADMAC分子量：<100,000；100,000-200,000；200,000-350,000；以及400,000-500,000。
图3A示出了高分子量PDADMAC的浓度对15-20μm细胞的絮凝的影响。实心的菱形/虚线表示11皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和虚线表示18皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的三角形和实线表示25皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的圆形和虚线表示39皮克/总细胞密度的PDADMAC。
图3B示出了高分子量PDADMAC的浓度对21-24μm细胞的絮凝的影响。实心的菱形/虚线表示29皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和虚线表示43皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的三角形和虚线表示57皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的圆形和实线表示71皮克/总细胞密度的PDADMAC。实心的正方形和点线表示86皮克/总细胞密度的PDADMAC。
图4A示出了高分子量PDADMAC絮凝作用对产生高乳酸盐水平的细胞培养物的影响。实心菱形和实线表示未添加乳酸盐。实心的正方形和虚线表示搀入有3g/L的乳酸盐。实心的三角形和虚线表示搀入有6g/L的乳酸盐。实心的圆形和虚线表示搀入有9g/L的乳酸盐。
图4B示出了高分子量PDADMAC絮凝作用对具有如通过细胞压积(PCV)所测量的高细胞密度的细胞培养物的影响。实心的菱形和虚线表示44％的PCV。实心的三角形和虚线表示33％的PCV。实心的正方形和虚线表示22％的PCV。实心的圆形和实线表示11％的PCV。
图5示出了各种稀释剂对于用于具有高乳酸盐水平的细胞培养过程的高分子量PDADMAC絮凝作用的影响。实心的三角形和虚线表示蔗糖。实心的正方形和虚线表示不含稀释剂的细胞培养基。实心的菱形和虚线表示甜菜碱。实心的圆形和虚线表示PEG 1,000。实心的三角形和实线表示PEG 6,000。实心的三角形和虚线表示葡聚糖70和甜菜碱。
图6示出了PDADMAC/PEG絮凝作用对具有43.2％的PCV的细胞培养物的影响。实心的菱形和虚线表示单独PDADMAC。实心的正方形和虚线表示蔗糖。实心的三角形和实线表示PDADMAC/PEG。
图7示出了PDADMAC和PEG的添加顺序的影响。一次性(bolus)添加PDADMAC和PEG(单步法)由实心三角形和虚线示出。先添加PDADMAC，继而添加PEG(两步法)由实心正方形和虚线示出。单独PDADMAC由实心的菱形和实线示出。
图8示出了添加Triton X-100的影响。添加PDADMAC/PEG由实心的正方形和实线示出。添加PDADMAC/PEG/Trition X-100由实心的三角形和虚线示出。
发明详述
本发明提供了一种简单的收获絮凝技术，所述技术旨在使得高细胞量的细胞培养过程的回收操作达到最大限度。提供了一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法在使细胞培养肉汤絮凝时将阳离子型聚合物与非离子型聚合物组合使用。还提供了将阳离子型聚合物与非离子型聚合物和非离子型表面活性剂这两者组合使用。
本发明是基于以下的发现：将非离子型聚合物或非离子型聚合物和非离子型表面活性剂与阳离子型聚合物组合用于使哺乳动物细胞培养肉汤絮凝会使得絮凝体沉降时间从24小时或更长时间缩短至不到1小时，在一些情况下，缩短至15分钟，而与细胞培养过程的密度(高达44％的细胞压积)或乳酸盐水平(10g/L)无关。使用非离子型聚合物还能够将与所需的重组产物共同纯化的高级聚集体和宿主细胞蛋白去除。这种简单的收获方法使得细胞培养过程，特别是高细胞量的细胞培养商业水平过程的回收操作达到最大限度。
絮凝是使悬浮液中的颗粒形成更大尺寸的聚集体或簇集体的过程。在絮凝中，通过添加絮凝剂(flocculation agent/flocculent)使颗粒以絮状物形式从悬浮液中离开。絮凝剂可以是阴离子型聚合物或阳离子型聚合物。存在天然絮凝剂，如藻酸盐或壳聚糖；矿物絮凝剂，如胶态粘土和活性二氧化硅；以及合成絮凝剂，如聚丙烯酰胺和聚二烯丙基二甲基氯化铵。合成絮凝剂可以被制造成具有特定的分子量(基于链长)和分子分布。
阳离子型聚合物与诸如有机物质之类的带负电荷的颗粒相互作用。在细胞培养肉汤中，阳离子型聚合物与诸如活细胞和非活细胞、细胞代谢物以及细胞碎片(如核酸、蛋白以及脂质体)之类的带负电荷的颗粒相互作用。使用阳离子型聚合物使细胞培养肉汤中存在的带负电荷的化合物絮凝是经由以下方式发生离子相互作用而进行的：带负电荷的颗粒的架桥；阳离子型聚合物的补缀结合(patch binding)，从而引起絮凝；或对较大的带负电荷的颗粒的电荷中和，从而使得所中和的颗粒从溶液中沉降出。通过阳离子型聚合物对带负电荷的颗粒的架桥作用所形成的絮状物产生更大的絮状物并且具有增加的剪切敏感性，从而引起絮状物破坏，进而产生更高水平的更缓慢沉降的更小颗粒。在补缀或电荷中和的情况下，具有高电荷密度的阳离子型聚合物与悬浮液中的颗粒上的阴离子补缀物相互作用，并且中和颗粒上的电荷或形成更大颗粒而从溶液中沉降出。以这种方式形成的絮状物具有更小的絮状物颗粒体积并且更不易于由于剪切而被破坏。举例来说，将聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)添加至细胞培养肉汤中会经由静电补缀机制使带负电荷的细胞和细胞碎片絮凝成更大的颗粒(Ramsden等(1998),Biotechnology Techniques,12(8):599-603)。PDADMAC还使带负电荷的亚微米颗粒絮凝以产生与典型的以离心方式收获的进料流相比具有显著更高的收获过滤器组通量的进料流。经由离子相互作用所实现的絮凝作用可以通过提高盐浓度或改变pH值而被破坏。
将诸如聚二烯丙基二甲基氯化铵之类的阳离子型聚合物添加至含有或已经含有表达重组蛋白的细胞的哺乳动物细胞培养基中会使得包括细胞(活细胞和非活细胞)、细胞代谢物以及细胞碎片在内的带负电荷的颗粒絮凝。可以通过离心或通过重力沉降将这些大的絮凝颗粒去除。絮凝的细胞和细胞碎片沉降出所需的沉降速率或时间取决于细胞、细胞碎片以及细胞代谢物的密度。在对于分批式细胞培养过程典型的低细胞密度下，絮凝的物质典型地在4小时至24小时，典型地约20-24小时内的某个时间点沉降出(无进一步沉降)。沉降速率在产生高生物质细胞密度(>10％的细胞压积)、亚微米细胞碎片和/或高乳酸盐水平(>2-3g/L)的细胞培养过程的情况下显著降低。产生高细胞密度或具有升高的乳酸盐水平的细胞培养过程需要显著量的细胞肉汤稀释以使得絮状物在24小时内沉降出。虽然使用诸如PDADMAC之类的阳离子型聚合物作为传统收获方法的替代方案是非常方便的，但是长时间的沉降时间可能对于商业规模来说不太合乎需要。
本发明提供了经过阳离子型聚合物絮凝的物质的絮凝颗粒尺寸以及颗粒尺寸的增长率在非离子型聚合物和非离子型表面活性剂的存在下会得到极大地提高。在将PDADMAC与非离子型聚合物(如聚乙二醇)和非离子型表面活性剂(如Triton X100)组合使用时，通常观测到少于2小时的絮状物重力沉降时间，尽管高生物质/细胞密度会显著地延长单独PDADMAC絮凝的沉降时间。在添加非离子型聚合物和非离子型表面活性剂的情况下能够耐受可能破坏絮状物和/或降低絮凝速率的剪切力。在使得宿主DNA显著减少的情况下始终如一地实现80％-90％或更大的收获物回收产率。添加非离子型聚合物还会减少宿主细胞蛋白质和一些高分子量物质。
如本文所用的“阳离子型聚合物”是与带负电荷的悬浮颗粒结合的带正电荷的聚合物。阳离子型聚合物包括但不限于二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)的聚合物。在一个优选的实施方案中，使DADMAC聚合形成N-取代的吡咯烷结构，即PDADMAC(图1)。阳离子型聚合物还包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯酰胺(PAA)以及壳聚糖。
等于或约20皮克至等于或约90皮克的PDADMAC/总细胞密度的浓度会产生低的上清液浊度和良好的絮状物沉降作用。“总细胞密度”是如通过台盼蓝拒染(Trypan Blueexclusion)，使用Cedex细胞计数器和分析器所测量的活细胞加上非活细胞的总数。在用于小细胞系(如二倍体细胞系)的一个实施方案中，添加等于或约25皮克/总细胞密度的PDADMAC。在另一个实施方案中，对于更大的细胞系，如四倍体细胞系，添加等于或约43皮克/总细胞密度至等于或约57皮克/总细胞密度的PDADMAC。
与更低分子量形式相比，分子量为200,000-500,000的PDADMAC通过提高沉降速率和上清液澄明度来影响絮凝性能。在一个实施方案中，PDADMAC的分子量在400,000至500,000的范围内。在一个实施方案中，以22皮克/总细胞密度的最终浓度使用具有在400,000-500,000范围内的分子量的PDADMAC。在另一个实施方案中，以25皮克/总细胞密度的最终浓度使用具有在400,000-500,000范围内的分子量的PDADMAC。在另一个实施方案中，以45皮克/总细胞密度的最终浓度使用具有在400,000-500,000范围内的分子量的PDADMAC。
如本文所用的“沉降速率”、“重力沉降速率”以及“絮凝并且压紧的沉降速率”可互换使用。沉降速率可以通过本领域已知的以及本文所述的方法来测定。举例来说，在1g下进行重力沉降。通过将絮状物体积除以在0.5L或1L玻璃量筒中所测量的总体积来确定沉降速率。总体积是包括所有絮凝剂/沉降剂在内的细胞肉汤体积。
“沉降时间”是絮状物沉降所要花费的时间。在絮状物的沉降速率小于或等于每小时1％时实现沉降时间。本文描述了在将PDADMAC絮凝与给予非离子型聚合物或非离子型聚合物连同非离子型表面活性剂组合的情况下沉降时间短达15分钟。沉降时间快速，尽管高生物质/细胞密度会显著地延长单独PDADMAC絮凝的沉降时间。在添加非离子型聚合物或非离子型表面活性剂的情况下能够耐受会破坏絮状物和/或降低絮凝速率的剪切力。
上清液澄明度与沉降速率无关，但是取决于阳离子型聚合物的给予水平。诸如温度、细胞培养流体密度以及粘度之类的其它因素对沉降速率或上清液澄明度的影响非常小。PDADMAC的给予量尤其是随细胞体积、总细胞(活细胞和非活细胞)密度以及亚微米细胞碎片颗粒的浓度而变的。
如本文所用的“非离子型聚合物”指的是增强分子之间的相互作用，从而增强沉淀作用的亲水性聚合物。非离子型聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、麦芽糖糊精、淀粉、甲基纤维素以及葡聚糖。
在添加阳离子型聚合物絮凝剂同时或之后将PEG或葡聚糖添加至哺乳动物细胞培养基中时会使得沉降速率有所提高。产物回收率取决于非离子型聚合物浓度、PEG分子量、非离子型聚合物和PDADMAC的添加顺序(同时添加或首先添加PDADMAC，继而添加非离子型聚合物)以及细胞培养持续时间或细胞培养肉汤中的碎片水平。
可使用在等于或约3％至等于或约4.5％(w/v)范围内的PEG 3,000。可使用在等于或约2.5％至等于或约3.5％(w/v)范围内的PEG 6,000。在一个实施方案中，以3％(w/v)的最终浓度使用PEG 3,000。在另一个实施方案中，以15％(w/v)的最终浓度使用PEG 3,000。在另一个实施方案中，以25％(w/v)的最终浓度使用PEG 3,000。
如本文所用的“非离子型表面活性剂”指的是具有两亲性的有机化合物，意指它们含有疏水性基团和亲水性基团，并且包括但不限于Sapoin和Triton X100。在一个实施方案中，以0.05％(w/v)的最终浓度使用Triton X-100。
可以单独添加或与非离子型表面活性剂组合添加非离子型聚合物。任一者均可以与阳离子型聚合物同时或在添加阳离子型聚合物之后添加。非离子型聚合物和非离子型表面活性剂两者均可以在1分钟或更短的添加时间内快速添加。
在絮凝体沉降(初级沉降)后，可以收获澄清了的上清液。为了提高重组产物回收率，可以将絮状物洗涤或重悬以便移去任何残留的重组产物。合适的洗涤稀释剂包括蔗糖、PEG、细胞培养基以及缓冲盐水溶液。在一个实施方案中，洗涤稀释剂是9％的蔗糖。将絮状物与洗涤稀释剂混合<1分钟至60分钟并且允许沉降约1小时至24小时。在絮状物沉降(二次沉降)后，可以收获二次澄清了的上清液。可以将来自初级沉降的上清液与来自二次沉降的上清液合并或单独地纯化。
可以通过抽吸或倾析取出上清液，继而经由容纳硅藻土的深度过滤器，继而0.2μ截留膜式过滤器过滤，或仅经由0.2μ截留过滤器过滤来收获澄清了的上清液。
阳离子型聚合物清除率可以通过本领域已知的方法，如用于监测哺乳动物细胞毒性的测定法；用于测定对通过DNA聚合酶或逆转录进行的DNA或RNA转录的抑制作用的测定法；以及测定mRNA的蛋白质翻译的测定法；以及本文所述的方法来监测。举例来说，重组蛋白纯化过程中间体的PDADMAC清除率可以通过在使用定量聚合酶链式反应(QPCR)中对DNA扩增的抑制作用来监测。
可以直接使用来自生物反应器的细胞培养肉汤或可以在絮凝之前将它冷却。在一个优选的实施方案中，细胞培养肉汤的温度范围是等于或约36℃至等于或约20℃。在另一个实施方案中，将细胞培养肉汤冷却至20℃或冷却至约20℃。
本发明提供了一种从哺乳动物细胞培养物中收获重组蛋白的方法。用于通过哺乳动物细胞培养物产生重组蛋白的商业过程中所使用的典型方法包括分批式培养法、分批补料培养法以及灌注培养法。分批式培养法是一种不连续的方法，其中将细胞在固定体积的培养基中培养较短的一段时间，然后完全收获。典型地在达到最高细胞密度(典型地是5-10×106个细胞/毫升)时进行收获。分批补料培养法提供了一次性或连续的培养基进料以便补充已经被消耗的那些培养基组分。由于分批补料培养物在整个操作期间接受额外的营养素，所以在与分批法相比时，它们有可能达到更高的细胞密度(>10至30×106个细胞/毫升)以及增加的产物滴度。在灌注法的情况下，典型的大规模商业细胞培养策略力图达到高细胞密度，即60-90(+)×106个细胞/毫升，其中反应器容积的差不多五十到超过一半是生物质。在灌注培养的情况下，已经达到了>1×108个细胞/毫升的极限细胞密度并且预期达到甚至更高的密度。
如本文所用的“肽”、“多肽”以及“蛋白质”在全篇中可互换使用并且指的是包含两个或更多个彼此通过肽键连接的氨基酸残基的分子。肽、多肽以及蛋白质还包括修饰在内，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化以及ADP-核糖基化。多肽可以具有科学或商业价值，包括基于蛋白质的药物在内。多肽尤其包括抗体、融合蛋白以及细胞因子。肽、多肽以及蛋白质是使用细胞培养方法通过重组动物细胞系产生的并且可以被称为“重组肽”、“重组多肽”以及“重组蛋白”。一种或多种所表达的蛋白质可以在细胞内产生或被分泌到培养基中，可以从所述培养基中回收和/或收集所述蛋白质。
可以使用本发明的方法收获的多肽的实例包括包含与以下蛋白质中的一种的全部或一部分相同或基本上相似的氨基酸序列的蛋白质：肿瘤坏死因子(TNF)、flt3配体(WO94/28391)、促红细胞生成素、促血小板生成素、降钙素、IL-2、血管生成素-2(Maisonpierre等(1997),Science 277(5322):55-60)、NF-κB的受体活化因子的配体(RANKL，WO 01/36637)、肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL，WO 97/01633)、胸腺基质源性淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，澳大利亚专利No.588819)、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子(美国专利No.6,204,363)、表皮生长因子、角化细胞生长因子、巨核细胞生长和发育因子、RANTES、人纤维蛋白原样2蛋白(FGL2；NCBI登录号NM_00682；Rüegg和Pytela(1995),Gene 160:257-62)、生长激素、胰岛素、胰岛素调理素(insulinotropin)、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、包括α-干扰素、γ-干扰素以及复合干扰素(美国专利No.4,695,623和4,897471)在内的干扰素、神经生长因子、脑源性神经营养因子、突触结合蛋白样蛋白(SLP 1-5)、神经营养素-3、胰高血糖素、白细胞介素、集落刺激因子、淋巴细胞毒素-β、白血病抑制因子以及制瘤素-M。对于可以根据本发明的方法产生的蛋白质的描述可以见于例如Human Cytokines:Handbook for Basic and Clinical Research,所有卷(Aggarwal和Gutterman编著,Blackwell Sciences,Cambridge,MA,1998)；Growth Factors:A Practical Approach(McKay和Leigh编著,Oxford University Press Inc.,New York,1993)；以及The Cytokine Handbook,第1和2 卷(Thompson和Lotze编著,Academic Press,San Diego,CA,2003)中。
另外，本发明的方法可用于收获包含任何上述蛋白质的受体、所述受体或任何上述蛋白质的拮抗剂和/或与这些受体或拮抗剂基本上相似的蛋白质的氨基酸序列的全部或一部分的蛋白质。这些受体和拮抗剂包括：两种形式的肿瘤坏死因子受体(TNFR，被称为p55和p75，美国专利No.5,395,760和美国专利No.5,610,279)、白细胞介素-1(IL-1)受体(I型和II型；欧洲专利No.0460846、美国专利No.4,968,607、以及美国专利No.5,767,064)、IL-1受体拮抗剂(美国专利No.6,337,072)、IL-1拮抗剂或抑制剂(美国专利No.5,981,713、6,096,728以及5,075,222)、IL-2受体、IL-4受体(欧洲专利No.0367566以及美国专利No.5,856,296)、IL-15受体、IL-17受体、IL-18受体、Fc受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M受体和白血病抑制因子受体、NF-κB的受体活化因子(RANK，WO 01/36637和美国专利No.6,271,349)、骨保护素(美国专利No.6,015,938)、TRAIL受体(包括TRAIL受体1、2、3以及4)、以及包含死亡结构域的受体，如Fas或细胞凋亡诱导受体(AIR)。
可以使用本发明收获的其它蛋白质包括包含分化抗原(被称为CD蛋白)或它们的配体或与这些物质中的任一种基本上相似的蛋白质的氨基酸序列的全部或一部分的蛋白质。这些抗原公开在Leukocyte Typing VI(Proceedings of the Vlth InternationalWorkshop and Conference,Kishimoto,Kikutani等编著,Kobe,Japan,1996)中。类似的CD蛋白在后续的研讨会中公开。这些抗原的实例包括CD22、CD27、CD30、CD39、CD40以及其配体(CD27配体、CD30配体等)。多种CD抗原是TNF受体家族的成员，所述TNF受体家族还包括41BB和OX40。所述配体通常是TNF家族的成员，41BB配体和OX40配体同样如此。
具有酶活性的蛋白质或它们的配体也可以使用本发明来收获。实例包括包含以下蛋白质或它们的配体或与这些物质中的一种基本上相似的蛋白质中的一种的全部或一部分的蛋白质：去整合素和金属蛋白酶结构域家族成员(包括TNF-α转化酶)、各种激酶、葡糖脑苷脂酶、超氧化物歧化酶、组织纤溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I、球蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、任何上述酶的配体，以及许多其它酶和它们的配体。
除非另外说明，否则术语“抗体”包括提及任何同种型或子类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区，包括人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体以及其低聚物或抗原结合片段。还包括具有抗原结合片段或抗原结合区的蛋白质，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、双功能抗体、Fd、dAb、巨抗体(maxibody)、单链抗体分子、互补决定区(CDR)片段、scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体以及含有免疫球蛋白中足以赋予目标多肽以特异性抗原结合作用的至少一部分的多肽。术语“抗体”包括但不限于通过重组手段制备、表达、产生或分离的那些抗体，如从经过转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。
抗体的实例包括但不限于识别包括但不限于上述蛋白质和/或以下抗原的蛋白质中的任一种或组合的那些抗体：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体亚单位、FGL2、PDGF-β及其类似物(参见美国专利No.5,272,064和5,149,792)、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受体(参见美国专利No.6,235,883)、VEGF受体、肝细胞生长因子、骨保护素配体、干扰素γ、B淋巴细胞刺激因子(BlyS，也被称为BAFF、THANK、TALL-1以及zTNF4；参见Do和Chen-Kiang(2002),Cytokine Growth Factor Rev.13(1):19-25)、C5补体、IgE、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG(其是所表达的与肺癌有关的基因产物)、HER-2、HER-3、肿瘤相关糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、在患有结肠癌和/或胰腺癌的患者血清中以升高的水平存在的肿瘤相关表位、乳腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌和/或肾癌细胞上和/或黑色素瘤、神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞、肿瘤的坏死核心上表达的癌症相关表位或蛋白质、整合素α4β7、整合素VLA-4、B2整合素、TRAIL受体1、2、3以及4、RANK、RANK配体、TNF-α、粘附分子VAP-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、细胞间粘附分子-3(ICAM-3)、白细胞整合素、粘附素、血小板糖蛋白gp IIb/IIIa、心脏肌球蛋白重链、甲状旁腺激素、rNAPc2(其是因子VIIa-组织因子的抑制剂)、MHC I、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤坏死因子(TNF)、CTLA-4(其是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)、Fc-γ-1受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、硬化蛋白、L-选择素、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、变形链球菌(Streptococcus mutans)以及金黄色葡萄球菌(Staphlycoccus aureus)。可以使用本发明的方法产生的已知抗体的具体实例包括但不限于阿达木单抗(adalimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿昔单抗(abciximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利单抗(belimumab)、布雷奴单抗(briakinumab)、卡那单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、可那木单抗(conatumumab)、地诺单抗(denosumab)、伊库珠单抗(eculizumab)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、培图莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizomab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)以及扎木单抗(zanolimumab)。
本发明还可以用于收获包含例如任何上述蛋白质的重组融合蛋白。举例来说，包含上述蛋白质中的一种加上多聚化结构域，如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、免疫球蛋白的Fc部分或基本上类似的蛋白质的重组融合蛋白可以使用本发明的方法产生。参见例如WO94/10308；Lovejoy等(1993),Science 259:1288-1293；Harbury等(1993),Science 262:1401-05；Harbury等(1994),Nature 371:80-83；
等(1999),Structure 7:255-64。在这些重组融合蛋白中特别包括的是受体的一部分与抗体的Fc部分融合的蛋白质，如依那西普(etanercept)(p75TNFR:Fc)和贝拉西普(belatacept)(CTLA4:Fc)。
为了实现本发明的目的，细胞培养基是在体外细胞培养中适于动物细胞，如哺乳动物细胞生长的培养基。细胞培养基制剂是本领域熟知的。典型地，细胞培养基包含缓冲剂、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素以及痕量的必需元素。细胞培养基可以含有或可以不含血清、蛋白胨和/或蛋白质。包括无血清培养基和成分明确培养基在内的各种组织培养基是可商购获得的，例如尤其可以使用以下细胞培养基中的任一种或组合：RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、杜氏改良伊格氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、伊格氏最低必需培养基(Minimum Essential Medium Eagle)、F-12K培养基、汉姆氏F12培养基(Ham's F12 Medium)、伊斯科夫改良杜氏培养基(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)、麦考伊氏5A培养基(McCoy's 5A Medium)、莱氏L-15培养基(Leibovitz's L-15 Medium)，以及无血清培养基，如EX-CELLTM 300系列(JRHBiosciences,Lenexa,Kansas)。细胞培养基可以补充有另外的组分或增加浓度的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、痕量元素等，这取决于所要培养的细胞的需要和/或所需的细胞培养参数。
细胞培养基可以是无血清、无蛋白质和/或无蛋白胨的。“无血清”适用于不含动物血清，如胎牛血清的细胞培养基。“无蛋白质”适用于不含外源添加的蛋白质，如转铁蛋白、蛋白质生长因子IGF-1或胰岛素的细胞培养基。无蛋白质培养基可以含有或可以不含蛋白胨。“无蛋白胨”适用于不含外源性蛋白质水解产物，如动物和/或植物蛋白水解产物的细胞培养基。细胞培养肉汤或类似术语指的是尤其含有活哺乳动物细胞和非活哺乳动物细胞、细胞代谢物以及细胞碎片(如核酸、蛋白质以及脂质体)的细胞培养基。
细胞培养或“培养”的意思是使细胞在多细胞生物体或组织外部生长和繁殖。适用于哺乳动物细胞的培养条件是本领域已知的。参见例如Animal cell culture:APractical Approach,D.Rickwood编著,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳动物细胞可以悬浮培养或在贴壁于固体基质上时进行培养。具有或不具有微载体并且以分批、分批补料、连续、半连续或灌注模式操作的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌釜式生物反应器可供哺乳动物细胞培养使用。
可以在小规模培养，例如像100ml至大规模细胞培养，如具有成千和上万毫升的培养尺寸的系统中培养哺乳动物细胞(如CHO细胞)，以便在临床和商业上制造蛋白质治疗剂。
对细胞系(也被称为“宿主细胞”)进行遗传工程化以使其表达具有商业或科学价值的多肽。细胞系典型地源自于由原代培养物所产生的谱系，所述原代培养物可以在培养中维持无限的时间。对细胞系进行遗传工程化包括使用重组多核苷酸分子对细胞进行转染、转化或转导，和/或以另外的方式发生改变(例如通过使重组细胞与非重组细胞进行同源重组和基因活化或融合)以便产生表达所需重组多肽的宿主细胞。用于对细胞和/或细胞系进行遗传工程化以使其表达所关注的多肽的方法和载体是为本领域技术人员所熟知的；例如，各种技术说明于Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等编著(Wiley&Sons,New York,1988以及每季更新的内容)；Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press,1989)；Kaufman,R.J.,Large ScaleMammalian Cell Culture,1990,第15-69页。
适于在培养中生长的多种多样的哺乳动物细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,Va.)和商业供应商。常用于工业中的哺乳动物细胞系的实例包括VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NSO、NS1)、PC12、WI38细胞以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞被广泛用于产生复杂的重组蛋白，例如细胞因子、凝血因子以及抗体(Brasel等(1996),Blood 88:2004-2012；Kaufman等(1988),J.Biol Chem 263:6352-6362；McKinnon等(1991),J Mol Endocrinol6:231-239；Wood等(1990),J.Immunol.145:3011-3016)。二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型突变细胞系(Urlaub等(1980),Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220)、DXB11以及DG-44是合乎需要的CHO宿主细胞系，这是因为高效的DHFR选择和可扩增基因表达系统允许在这些细胞中进行高水平的重组蛋白表达(Kaufman R.J.(1990),Meth Enzymol 185:537-566)。另外，这些细胞作为贴壁或悬浮培养物是易于操作的并且展现出相对良好的遗传稳定性。CHO细胞和在它们当中重组表达的蛋白质已被广泛地表征并且已由监管机构批准用于临床商业制造。
虽然本申请中所用的术语在本领域内是标准的，但是本文提供了某些术语的定义以确保权利要求书的含义的清晰性和明确性。单位、前缀以及符号可以它们为SI所接受的形式表示。本文所陈述的数值范围包括限定该范围的数字，并且包括并支持所限定的范围内的每一个整数。除非另外指出，否则术语“一个(种)(a)”或“一个(种)(an)”应被视为意指“至少一个(种)”。本文所用的章节标题仅用于组织目的而不应被视为限制所述的主题。除非另外指明，否则本文所述的方法和技术一般根据常规方法进行，所述常规方法是本领域熟知的并且如在整个本说明书中所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；以及Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；以及Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。本申请中所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍以及论文)特此以引用的方式明确并入。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案仅旨在对本发明的单个方面进行说明，并且功能上等同的方法和组分处于本发明的范围内。实际上，根据上述描述和附图，除了本文所示和所描述的那些改动之外，对本发明的各种改动对于本领域技术人员来说也将变得显而易见。这些改动旨在属于所附权利要求书的范围内。
实施例
实施例1
该实验对二烯丙基二甲基氯化铵(PDADMAC)的不同分子量制备物进行比较，使用这些制备物使哺乳动物细胞培养肉汤絮凝并且比较它们的沉降时间。
以分批补料培养法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在2,000L的生物反应器中培养15天。在测试之前将细胞培养肉汤冷却至10℃。设置一系列旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。PDADMAC以20％(w/v)液体的形式提供(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)，并且通过用纯水稀释至10％(w/v)来制备所有这些实验中所用的操作储备溶液。将分子量为100,000-200,000、200,000-350,000以及400,000-500,000的PDADMAC添加至每一个烧瓶中达到介于29皮克至86皮克的PDADMAC/总细胞密度之间的最终浓度。将PDADMAC溶液连续添加约1分钟并且在以70rpm-80rpm搅拌下在10℃下孵育15分钟。使絮状物在环境温度下沉降。将这一物质用于沉降时间测定。
在1,000L一次性反应器中培养第二批分批补料培养物，持续15天。将细胞培养肉汤维持在约36℃下。设置一系列旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。将分子量为<100,000、100,000-200,000、200,000-350,000以及400,000-500,000的PDADMAC添加至每一个烧瓶中达到介于25皮克至76皮克的PDADMAC/总细胞密度之间的最终浓度。将PDADMAC溶液连续添加约1分钟并且在以70rpm-80rpm搅拌下在约36℃下孵育15分钟。使絮状物在环境温度下沉降。将这一物质用于浊度测定。
通过将如使用Cedex细胞计数器和分析器(Roche Innovatis AG,Indianapolis,IN)由台盼蓝拒染所测量的活细胞总数与非活细胞总数相加来确定总细胞密度。然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以15分钟的时间间隔获得读数，持续90分钟并且将相对絮凝体积计算为沉降了的絮状物体积/总体积。
通过倾析，继而通过0.2μ过滤器将上清液从沉降并且絮凝了的细胞物质中取出。使用2100P浊度计(Hach,Loveland,CO)测量浊度。
图2A和2B示出了与平均分子量小于200,000的PDADMAC相比，使用具有大于200,000但是小于500,000的平均分子量的PDADMAC进行絮凝会产生最佳的沉降时间和澄明度。
实施例2
该实验比较使由小细胞系(如二倍体细胞系)与大细胞系(如四倍体细胞系)表达重组抗体的哺乳动物细胞培养肉汤絮凝所需的PDADMAC的量。
如上文所述培养二倍体细胞系和四倍体细胞系。设置一系列旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L来自二倍体培养物和四倍体培养物中的每一种的细胞培养肉汤。在该实验和以下所有实验中，除非另外指出，否则使用具有400,000至500,000的平均分子量的PDADMAC。将PDADMAC添加至每一个烧瓶中达到如表2中所示的最终浓度。如上文所述测定总细胞密度。表2：用于二倍体培养物和四倍体培养物的PDADMAC的最终浓度
如上文所述将PDADMAC溶液连续地添加并且搅拌。使絮状物在环境温度下沉降。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以15分钟的时间间隔获得读数，持续90分钟至120分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
图3A示出了使用25皮克/总细胞的浓度的PDADMAC进行絮凝具有最快的沉降时间。
图3B示出了使用57皮克/总细胞的浓度的PDADMAC进行絮凝具有最快的沉降时间。
实施例3
该实验考察PDADMAC絮凝作用对产生高乳酸盐水平和/或具有高细胞密度的细胞培养物的影响。
将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在1,000L一次性生物反应器中培养14天。细胞培养肉汤处于环境温度下。设置四个旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。在添加PDADMAC之前，在每一个烧瓶中搀入3g/L、6g/L或9g/L的60％(w/w)DL-乳酸钠(SigmaAldrich,St.Louis,MO)，或不搀入乳酸盐作为对照组。然后将PDADMAC添加至每一个烧瓶中达到25皮克/总细胞密度的最终浓度(如上文所述的PDADMAC储液)。如上文所述测定总细胞密度。
如上文所述将PDADMAC在环境温度下连续地添加并且搅拌。然后使絮状物在环境温度下沉降。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续1500分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
以灌注培养法将第二批CHO细胞培养物在1,000L一次性生物反应器中培养20天。将细胞肉汤冷却至环境温度。在添加PDADMAC之前，使用细胞培养基将细胞肉汤稀释25％、50％以及75％。在添加PDADMAC之前不稀释细胞压积为44％的细胞肉汤。PDADMAC的最终浓度是25至26皮克/总细胞密度。PDADMAC的添加速率是约1分钟，在搅拌下进行添加并且如上文所述在环境温度下沉降。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续1400分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
图4A和4B示出了沉降速率在具有高乳酸盐水平(>2-3g/L)和/或产生高生物质细胞密度(>10％的细胞压积)的细胞培养过程的情况下显著降低。
实施例4
该实验比较了在将不同的稀释剂与PDADMAC组合使用时的沉降时间。
以灌注培养法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在1,000L一次性生物反应器中培养18天。在36℃下将来自第16天的细胞肉汤递送供测试使用并且在絮凝之前冷却至环境温度，持续2.5小时。在环境温度下进行添加和沉降。在添加PDADMAC之前，使用不同的稀释剂将细胞肉汤稀释至67％。乳酸盐水平是5g/L。PDADMAC的添加速率是约1分钟，在75rpm-85rpm下孵育15分钟的时间段。PDADMAC储备溶液是10％(w/v)，是从20(w/v)的原始储备溶液制备而来(使用纯水)。PDADMAC的最终浓度是25皮克/总细胞密度。使絮状物在环境温度下沉降。
制备一系列稀释剂；浓度示于表3中。
表3：不同稀释剂的最终浓度
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续1600分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
如图5中所示，PDADMAC与PEG 6,000的组合具有最快的沉降时间。与单独的PDADMAC相比，PDADMAC与PEG 6,000、PEG 1,000或葡聚糖70/甜菜碱的组合具有提高了的沉降速率。添加非离子型聚合物会显著地提高絮状物的沉降速率。与单独的PDADMAC相比，PDADMAC与PEG或葡聚糖的组合也使沉降时间缩短，而与培养物中的乳酸盐水平无关。
实施例5
该实验考察PDADMAC与PEG 3,000的组合对具有高细胞密度的细胞培养物的沉降时间的影响。
以灌注培养法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在80L的生物反应器中培养20天。在测试之前将细胞培养肉汤冷却至环境温度。在添加PDADMAC之前，使用36％(w/v)的蔗糖或25％(w/v)的PEG 3,000(这两者均是纯水溶液)将细胞肉汤稀释至10％。最终细胞肉汤蔗糖浓度是3.6％(w/v)，并且最终PEG 3,000浓度是2.5％(w/v)。PDADMAC的添加速率是约1分钟，在75rpm-85rpm下孵育15分钟的时间段。PDADMAC储备溶液是10％(w/v)，是从20(w/v)的原始储备溶液制备而来(使用纯水)。对于PEG 3,000来说，PDADMAC的最终浓度是22皮克/总细胞密度，并且对于蔗糖和对照组或未稀释的细胞肉汤来说，PDADMAC的最终浓度是25皮克/总细胞密度。对照组或未稀释细胞肉汤的PCV是48％。稀释过的细胞肉汤的PCV＝(对照组PCV X稀释因数)＝43.2％。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续240分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
如图6中所示，与单独的PDADMAC相比，PDADMAC与PEG 3,000的组合引起更快速的沉降。如在实施例3中所看到，单独PDADMAC的沉降速率随细胞密度增加而显著降低。与单独的PDADMAC相比，PEG 3,000与PDADMAC的组合使絮凝体沉降时间缩短，而与细胞培养过程的密度无关(在此情况下，是43％的细胞压积)。
实施例6
该实验考察添加PEG与PDADMAC的时序对沉降时间的影响。
以灌注培养方法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在80L的生物反应器中培养19天。将细胞培养肉汤冷却至21℃。设置三个旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。向一个烧瓶中添加45皮克/总细胞密度的浓度的PDADMAC(分子量：400,000-500,000)。向另一个烧瓶中以一次性添加法(单步法)添加45皮克/总细胞密度的PDADMAC和15％(w/v)的PEG 3,000。向第三个烧瓶中，首先以45皮克/总细胞密度的浓度添加PDADMAC，并且在添加PDADMAC之后，添加PEG 3,000达到15％(w/v)的最终浓度(两步法)。PDADMAC的添加速率是约1分钟。PDADMAC/PEG的添加速率是约5分钟。所有添加均在环境温度下进行。在75rpm-85rpm下将所有烧瓶孵育15分钟。使絮状物在环境温度下沉降。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续240分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
如图7中所示，与单独的PDADMAC相比，同时添加或依次添加的PDADMAC与PEG 3,000的组合使絮凝体沉降时间缩短。
随后制备大规模的培养物。以灌注培养法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在80L的生物反应器中培养19天。将细胞培养肉汤冷却至21℃。在环境温度下同时添加45皮克/总细胞密度的浓度的PDADMAC与15％(w/v)的最终浓度的PEG 3,000，添加速率是21分钟，继而在100rpm下孵育5分钟。使絮状物在环境温度下沉降。
在絮凝体已沉降(初级沉降)后，通过从生物反应器中抽吸流体，继而经由容纳硅藻土的深度过滤器过滤，继而经由0.2μ截留膜式过滤器过滤来收获澄清了的上清液。
将絮状物在等体积的9％蔗糖溶液中洗涤以移去任何残留的重组蛋白并且允许沉降16小时。在絮状物沉降(二次沉降)后，如上文所述收获二次澄清了的上清液。
使用蛋白质A色谱法对来自上述絮凝(小规模和大规模)的所收获的澄清了的细胞培养上清液进行纯化，继而进行产物质量测定。在进行产物质量测定之前，不对蛋白质A洗脱物进行中和。所测量的蛋白质A洗脱物的产物质量属性是如通过SEC所测量的分子变体、如通过ELISA所测定的宿主细胞蛋白。
然后使经过蛋白质A纯化的物质穿过CEX柱(pH 7.5)。
表4
对于两种规模来说，对照组与初级絮凝收获之间的产物质量是相似的。PDADMAC/PEG初级收获倾向于去除高级聚集体，这反映在蛋白质A池中HMW的水平较低。观测到PDADMAC/PEG收获物中的宿主细胞蛋白质水平降低。与初级PDADMAC/PEG收获相比，使用蔗糖进行重悬会使得CHOP和HMW的水平略微更高并且据信是这些杂质被重新溶解。
实施例7
该实验考察连同PDADMAC和PEG一起添加表面活性剂对沉降时间的影响。
以灌注细胞培养法将表达重组单克隆抗体的CHO细胞在80L的生物反应器中培养15天。将来自第14天的细胞肉汤冷却至30℃以用于测试。设置两个旋转烧瓶，其中每一个烧瓶中存在1L的细胞培养肉汤。向一个烧瓶中同时添加PDADMAC和PEG 3,000，以25皮克/总细胞密度的浓度添加PDADMAC(分子量：400,000-500,000)，并且添加PEG 3,000达到3％(w/v)的最终浓度。向另一个烧瓶中，除了添加上述浓度的PDADMAC和PEG之外，还添加Triton X-100达到0.05％(v/v)的最终浓度。(Triton X-100储备溶液是10％(v/v)，由20％(v/v)的原始储备溶液制得，Sigma Aldrich,St.Louis,Mo.)同时添加这三种组分。添加速率是约1分钟，在75-85rpm下孵育15分钟。如之前的实施例中所述将所有烧瓶旋转。使絮状物在环境温度下沉降。
然后将絮凝了的溶液转移到1L玻璃量筒中以测定絮凝并且压紧的沉降速率。以不同的时间间隔获得读数，持续240分钟并且如上文所述计算相对絮凝体积。
如图8中所示，与单独的PDADMAC和PEG 3,000相比，连同PDADMAC和PEG 3,000一起添加Triton X-100会使絮凝体沉降时间缩短。
Claims (18)
1.一种哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法包括
将表达重组蛋白的哺乳动物细胞在细胞培养基中培养预定的时间或直到达到所需的细胞密度和/或细胞压积为止，
将阳离子型聚合物和非离子型聚合物以及非离子型表面活性剂添加至所述细胞培养基中，从而引发絮凝，所述阳离子型聚合物选自二烯丙基二甲基氯化铵的聚合物和聚二烯丙基二甲基氯化铵的聚合物，所述非离子型聚合物选自聚乙二醇和葡聚糖，
在絮凝期间混合所述细胞培养基，
使絮凝体沉降以进行初级沉降，以及
回收初级澄清了的上清液。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型聚合物选自PEG 3,000和PEG 6,000。
3.根据权利要求2所述的方法，其中PEG 3,000的浓度是3%至4.5%。
4.根据权利要求2所述的方法，其中PEG 6,000的浓度是2.5%至3.5%。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型表面活性剂是Sapoin或TritonX100。
6.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，其中所述非离子型表面活性剂是Triton X-100。
7.根据权利要求6所述的方法，其中Triton X100的浓度是0.05%（w/v）。
8.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞培养物收获方法，所述方法进一步包括
对所述初级沉降的絮凝体进行洗涤，
使经过洗涤的絮凝体沉降以进行二次沉降，以及
回收所述二次澄清了的上清液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在9%蔗糖溶液中对来自所述初级沉降的所述絮凝体进行洗涤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中同时添加所述阳离子型聚合物和所述非离子型聚合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中首先添加所述阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加所述非离子型聚合物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中同时添加所述阳离子型聚合物、所述非离子型聚合物以及一种非离子型表面活性剂。
13.根据权利要求1所述的方法，其中首先添加所述阳离子型聚合物并且混合至少30秒，继而添加所述非离子型聚合物和一种非离子型表面活性剂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中以20皮克/总细胞密度至90皮克/总细胞密度的浓度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化铵。
15.根据权利要求1所述的方法，其中以25皮克/总细胞密度的浓度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于二倍体细胞系。
16.根据权利要求1所述的方法，其中添加介于43皮克/总细胞密度与57皮克/总细胞密度之间的所述聚二烯丙基二甲基氯化铵，其中所述哺乳动物细胞来源于四倍体细胞系。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养基在36℃与20℃之间。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养基处于20℃或高于20℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110381379.5A CN113150060A (zh) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 絮凝方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161576303P | 2011-12-15 | 2011-12-15 | |
| US61/576303 | 2011-12-15 | ||
| PCT/US2012/069916 WO2013090820A1 (en) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | Flocculation method |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110381379.5A Division CN113150060A (zh) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 絮凝方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104245922A CN104245922A (zh) | 2014-12-24 |
| CN104245922B true CN104245922B (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=47559662
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201280069842.1A Active CN104245922B (zh) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 絮凝方法 |
| CN202110381379.5A Pending CN113150060A (zh) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 絮凝方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110381379.5A Pending CN113150060A (zh) | 2011-12-15 | 2012-12-14 | 絮凝方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9371554B2 (zh) |
| EP (1) | EP2791319B1 (zh) |
| JP (4) | JP2015504659A (zh) |
| KR (5) | KR20210095723A (zh) |
| CN (2) | CN104245922B (zh) |
| AR (1) | AR089231A1 (zh) |
| AU (4) | AU2012351926A1 (zh) |
| BR (1) | BR112014014116A2 (zh) |
| CA (1) | CA2859197C (zh) |
| CL (1) | CL2014001564A1 (zh) |
| EA (1) | EA201491144A1 (zh) |
| HK (1) | HK1199057A1 (zh) |
| IL (2) | IL233028B (zh) |
| MX (1) | MX353959B (zh) |
| SG (1) | SG11201403258VA (zh) |
| TW (1) | TWI576144B (zh) |
| WO (1) | WO2013090820A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201404351B (zh) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AR089231A1 (es) * | 2011-12-15 | 2014-08-06 | Amgen Inc | Metodo de floculacion |
| TW202246486A (zh) * | 2014-06-09 | 2022-12-01 | 美商健臻公司 | 種子罐培養法(seed train processes)及其用途 |
| FI20165282A (fi) * | 2016-04-01 | 2017-10-02 | Kemira Oyj | Menetelmä ja järjestelmä koaguloinnin ja/tai flokkuloinnin optimoimiseksi veden käsittelyprosessissa |
| CN109311937A (zh) * | 2016-06-15 | 2019-02-05 | 新加坡科技研究局 | 增强用于纯化蛋白质的色谱法的性能的方法 |
| SG11202101113YA (en) * | 2018-08-30 | 2021-04-29 | Glaxosmithkline Ip Dev Ltd | Methods of detecting nucleic acid |
| HUP1900112A1 (hu) | 2019-04-04 | 2020-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával |
| US11219843B2 (en) * | 2019-07-08 | 2022-01-11 | Nik Paya Karen Pharmed | Extraction of animal-derived pulmonary surfactants |
| CN111068367A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-28 | 青岛宝和信生物科技有限公司 | 植物/中药提取液及水处理连续自动化絮凝及分离工艺 |
| GB2590721A (en) | 2019-12-31 | 2021-07-07 | Inst Jozef Stefan | Controlled aggregation of cells |
| EP4217366A1 (en) | 2020-09-22 | 2023-08-02 | Basf Se | Method for recovering a protein from a fermentation broth comprising a high degree of lysed cells |
| WO2024059235A2 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Amgen Inc. | A method for harvesting products from perfusion cultures |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001012778A2 (en) * | 1999-08-14 | 2001-02-22 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Flocculation of cell material |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| AU588819B2 (en) | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| US4968607A (en) | 1987-11-25 | 1990-11-06 | Immunex Corporation | Interleukin-1 receptors |
| US5075222A (en) | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| WO1990005183A1 (en) | 1988-10-31 | 1990-05-17 | Immunex Corporation | Interleukin-4 receptors |
| US5395760A (en) | 1989-09-05 | 1995-03-07 | Immunex Corporation | DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors |
| DE59010908D1 (de) | 1989-09-12 | 2000-08-10 | Hoffmann La Roche | TNF-bindende Proteine |
| US6204363B1 (en) | 1989-10-16 | 2001-03-20 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| US5149792A (en) | 1989-12-19 | 1992-09-22 | Amgen Inc. | Platelet-derived growth factor B chain analogs |
| US5272064A (en) | 1989-12-19 | 1993-12-21 | Amgen Inc. | DNA molecules encoding platelet-derived growth factor B chain analogs and method for expression thereof |
| US5350683A (en) | 1990-06-05 | 1994-09-27 | Immunex Corporation | DNA encoding type II interleukin-1 receptors |
| AU651596B2 (en) | 1990-06-05 | 1994-07-28 | Immunex Corporation | Type II interleukin-1 receptors |
| JP3589665B2 (ja) | 1992-10-23 | 2004-11-17 | イミュネックス・コーポレーション | 可溶性オリゴマー蛋白質の調製法 |
| US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
| US5552316A (en) * | 1993-06-04 | 1996-09-03 | Environmental Marketing Services, Ltd. | Clarifying E. coli fermentation broths with a combination of anionic and cationic flocculants |
| US5981713A (en) | 1994-10-13 | 1999-11-09 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Antibodies to intereleukin-1 antagonists |
| US5763223A (en) | 1995-06-29 | 1998-06-09 | Immunex Corporation | DNA encoding a cytokine that induces apoptosis |
| US6613544B1 (en) | 1995-12-22 | 2003-09-02 | Amgen Inc. | Osteoprotegerin |
| US6096728A (en) | 1996-02-09 | 2000-08-01 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
| US6271349B1 (en) | 1996-12-23 | 2001-08-07 | Immunex Corporation | Receptor activator of NF-κB |
| US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
| US6337072B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-01-08 | Hyseq, Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof |
| WO2001036637A1 (en) | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Immunex Corporation | Receptor activator of nf-kappa b |
| EP1403274A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-03-31 | Meristem Therapeutics | Process for the purification of recombinant proteins from complex media and purified proteins obtained thereby |
| WO2007035283A1 (en) * | 2005-09-15 | 2007-03-29 | Wyeth | Protein floculation using salts |
| EP2121753A2 (en) | 2007-02-14 | 2009-11-25 | Amgen, Inc | Method of isolating antibodies by precipitation |
| EP1985305A1 (en) * | 2007-04-24 | 2008-10-29 | Vivalis | Duck embryonic derived stem cell lines for the production of viral vaccines |
| WO2009101968A1 (ja) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Gene Techno Science Co., Ltd. | 抗ａｄａｍ－１５抗体及びその利用 |
| AU2010205007A1 (en) | 2009-01-13 | 2011-07-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Precipitation of biomolecules with negatively charged polymers |
| AR089231A1 (es) | 2011-12-15 | 2014-08-06 | Amgen Inc | Metodo de floculacion |
-
2012
- 2012-12-13 AR ARP120104705A patent/AR089231A1/es unknown
- 2012-12-14 AU AU2012351926A patent/AU2012351926A1/en not_active Abandoned
- 2012-12-14 CN CN201280069842.1A patent/CN104245922B/zh active Active
- 2012-12-14 CN CN202110381379.5A patent/CN113150060A/zh active Pending
- 2012-12-14 MX MX2014007128A patent/MX353959B/es active IP Right Grant
- 2012-12-14 KR KR1020217023322A patent/KR20210095723A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 EP EP12815893.8A patent/EP2791319B1/en active Active
- 2012-12-14 EA EA201491144A patent/EA201491144A1/ru unknown
- 2012-12-14 KR KR1020237042787A patent/KR20230172040A/ko active Application Filing
- 2012-12-14 KR KR1020197035609A patent/KR20190137944A/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-12-14 BR BR112014014116A patent/BR112014014116A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 JP JP2014547521A patent/JP2015504659A/ja active Pending
- 2012-12-14 CA CA2859197A patent/CA2859197C/en active Active
- 2012-12-14 US US14/365,496 patent/US9371554B2/en active Active
- 2012-12-14 KR KR1020147019193A patent/KR20140103320A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-12-14 WO PCT/US2012/069916 patent/WO2013090820A1/en active Application Filing
- 2012-12-14 SG SG11201403258VA patent/SG11201403258VA/en unknown
- 2012-12-14 TW TW101147676A patent/TWI576144B/zh active
- 2012-12-14 KR KR1020227019427A patent/KR20220084192A/ko active Application Filing
-
2014
- 2014-06-09 IL IL233028A patent/IL233028B/en active IP Right Grant
- 2014-06-12 ZA ZA2014/04351A patent/ZA201404351B/en unknown
- 2014-06-13 CL CL2014001564A patent/CL2014001564A1/es unknown
- 2014-12-09 HK HK14112366.5A patent/HK1199057A1/zh unknown
-
2016
- 2016-06-20 US US15/187,460 patent/US20160297850A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-06-22 AU AU2018204547A patent/AU2018204547B2/en active Active
- 2018-10-12 JP JP2018193329A patent/JP6998853B2/ja active Active
- 2018-12-12 IL IL263674A patent/IL263674A/en unknown
-
2020
- 2020-11-09 AU AU2020267147A patent/AU2020267147B2/en active Active
-
2021
- 2021-09-24 JP JP2021155652A patent/JP7274547B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-28 JP JP2023074144A patent/JP2023099117A/ja active Pending
- 2023-08-23 AU AU2023219874A patent/AU2023219874A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001012778A2 (en) * | 1999-08-14 | 2001-02-22 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Flocculation of cell material |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 壳聚糖及其衍生物工程领域中的应用研究;郎刚华等;《海洋科学》;20011231;第25卷(第7期);25-28 * |
| 常用化学絮凝剂的环境效应与生态毒性研究进展;李威等;《生态学杂志》;20071231;第26卷(第6期);943-947 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7274547B2 (ja) | 凝集方法 | |
| US20230117598A1 (en) | Mammalian cell culture | |
| US9133493B2 (en) | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production | |
| US11319568B2 (en) | Methods for increasing mannose content of recombinant proteins | |
| US20100221823A1 (en) | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production | |
| US20200323958A1 (en) | Methods for producing protein products | |
| EA046418B1 (ru) | Способ флокуляции |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: California, USA Patentee after: American Amgen Address before: California, USA Patentee before: AMGEN Inc. |