TW201341030A - 絮凝方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於用於自哺乳動物細胞培養液收穫重組蛋白質之方法。該方法利用陽離子聚合物、非離子聚合物及非離子表面活性劑。
Description
本發明係關於用於自哺乳動物細胞培養液收穫重組蛋白質之方法。該方法利用陽離子聚合物、非離子聚合物及非離子表面活性劑。
臨床製造治療性蛋白成本昂貴，需要付出極大努力。對於更大量治療性重組蛋白質之需求已驅動細胞培養處理之發展，此已顯著增加產品效價。高效價細胞培養製程通常係藉由在較長培養持續時間內維持高活細胞密度來產生。亦觀察到生質固體(活細胞及死細胞)及次微米細胞碎片粒子之相應增加。固體及次微米細胞碎片粒子之較高負擔可對哺乳動物細胞培養物收穫製程造成麻煩，從而使收穫製程在不顯著損失產能之情況下移除碎片之效率降低。
陽離子聚合物絮凝劑係用於許多應用中，包括飲用水純化、廢水處理、石油、採礦及造紙工業中之應用、化妝品及醫學應用，且亦已用於囊封哺乳動物細胞及酶且用於使微生物細胞培養物絮凝。然而，對於在商業規模之哺乳動物細胞收穫製程中之應用而言，過長絮凝沉降時間可能有問題，會使收穫製程耗時且不如標準收穫實踐有效。
相關技藝仍需要改良哺乳動物細胞培養物收穫方法，尤其商業規模方法。任何允許更短回收時間及/或更高回收率之改良皆可降低與製造蛋白質治療劑相關之成本。本發明藉由提供快速且有效之細胞培養物收穫方法來滿足此需
要。
本發明提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨及PEG 3,000添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3,000及Triton X-100添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至細胞培養基中以起始絮
凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，若初次澄清上清液中之產物回收率低於80%則洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨及PEG 3,000添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
本發明亦提供哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3,000及Triton X-100添加至細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合細胞培養基，
讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
在一實施例中，陽離子聚合物係聚二烯丙基二甲基氯化銨。
在另一實施例中，非離子聚合物係選自聚乙二醇及葡聚糖。
在另一實施例中，非離子聚合物係選自PEG 3,000及PEG 6,000。
在另一實施例中，以上所提供之哺乳動物細胞培養物收穫方法進一步包括將非離子表面活性劑添加至細胞培養基。在相關實施例中，非離子表面活性劑係Triton X-100。
在另一實施例中，同時添加陽離子聚合物及非離子聚合物。
在另一實施例中，同時添加陽離子聚合物、非離子聚合物及非離子表面活性劑。
在另一實施例中，首先添加陽離子聚合物且混合至少30秒，然後添加非離子聚合物。
在另一實施例中，首先添加陽離子聚合物且混合至少30秒，然後添加非離子聚合物及非離子表面活性劑。
在另一實施例中，陽離子聚合物係二烯丙基二甲基氯化銨之聚合物、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺或幾丁聚糖。
在另一實施例中，非離子表面活性劑係皂苷或Triton X100。
在另一實施例中，添加濃度為20 pg/總細胞密度或約20 pg/總細胞密度至90 pg/總細胞密度或約90 pg/總細胞密度之聚二烯丙基二甲基氯化銨。
在另一實施例中，添加濃度為25 pg/總細胞密度或約25 pg/總細胞密度之聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中哺乳動物細胞源於二倍體細胞系。
在另一實施例中，添加介於43 pg/總細胞密度與57 pg/總細胞密度之間之聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中哺乳動物細胞源於四倍體細胞系。
在另一實施例中，PEG 3,000之濃度係3%或約3%至4.5%或約4.5%。
在另一實施例中，PEG 6,000之濃度係2.5%或約2.5%至3.5%或約3.5%。
在另一實施例中，Triton X100之濃度係0.05%(w/v)。
在另一實施例中，哺乳動物細胞培養液係介於36℃與20℃之間。
在另一實施例中，哺乳動物細胞培養液係20℃或高於20℃。
在另一實施例中，在9%蔗糖溶液中洗滌來自初次沉降之絮凝劑。
本發明提供意欲使高細胞質量細胞培養製程之回收操作
最佳化之簡單收穫絮凝技術。本發明提供在細胞培養液之絮凝中利用陽離子聚合物與非離子聚合物之組合之哺乳動物細胞培養物收穫方法。本發明亦提供陽離子聚合物與非離子聚合物及非離子表面活性劑二者之組合之用途。
本發明係基於以下發現：使用非離子聚合物或非離子聚合物及非離子表面活性劑與陽離子聚合物之組合來使哺乳動物細胞培養液絮凝將絮凝劑沉降時間自24小時或更久縮短至不到1小時(在一些情形下15分鐘)，此與細胞培養製程密度(高達44%細胞容積比)或乳酸鹽含量(10 g/L)無關。使用非離子聚合物亦可移除高級聚集體及與期望重組產物共純化之宿主細胞蛋白質。此簡單收穫方法使細胞培養製程、尤其商業級高細胞質量細胞培養製程之回收操作最佳化。
絮凝係懸浮液中之粒子形成較大尺寸聚集體或叢集之過程。在絮凝中，粒子藉由添加絮凝試劑或絮凝劑以絮凝物之形式離開懸浮液。絮凝劑可係陰離子聚合物或陽離子聚合物。存在天然絮凝劑，例如海藻酸鹽或幾丁聚糖；礦物質絮凝劑，例如膠質黏土及活性二氧化矽；及合成絮凝劑，例如聚丙烯醯胺及聚二烯丙基二甲基氯化銨。合成絮凝劑可經製造以具有特定分子量(基於鏈長)及分子分佈。
陽離子聚合物與帶負電荷粒子(例如有機物質)相互作用。在細胞培養液中，陽離子聚合物與帶負電荷粒子(例如活細胞及死細胞、細胞代謝產物及細胞碎片(例如核酸、蛋白質及脂質體))相互作用。用陽離子聚合物使細胞
培養液中所發現之帶負電荷化合物絮凝係經由以下發生：經由帶負電荷粒子之橋接進行之離子相互作用；引起絮凝之陽離子聚合物之補綴結合；或引起中和粒子自溶液沉降之帶負電荷大粒子之電荷中和。藉由帶負電荷粒子之陽離子聚合物橋接形成之絮凝物產生較大絮凝物且剪切敏感性增加，此導致絮凝物分裂而產生較高含量之沉降較緩慢之較小粒子。使用補綴或電荷中和時，具有高電荷密度之陽離子聚合物在懸浮液中與粒子上之陰離子補綴相互作用，且中和粒子上之電荷或形成自溶液沉降析出之較大粒子。以此方式形成之絮凝物具有較小絮凝物粒子體積且較不易於因剪切而分裂。例如，將聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)添加至細胞培養液經由靜電補綴機制使帶負電荷細胞及細胞碎片絮凝成較大粒子(Ramsden等人(1998),Biotechnology Techniques,12(8)：599-603)。PDADMAC亦使帶負電荷次微米粒子絮凝以產生與典型離心收穫給料流相比具有顯著更高之收穫濾器系列通量之給料流。增加鹽濃度或改變pH可破壞經由離子相互作用之絮凝。
將陽離子聚合物(例如聚二烯丙基二甲基氯化銨)添加至含有或已含有表現重組蛋白質之細胞之哺乳動物細胞培養基使帶負電荷粒子(包含細胞(活細胞及死細胞)、細胞代謝產物及細胞碎片)絮凝。可藉由離心或藉由重力沉降移除該等絮凝的大粒子。使絮凝的細胞及細胞碎片沉降析出所需要之沉降速率或時間取決於細胞、細胞碎片及細胞代謝產物之密度。在分批細胞培養製程通常具有之低細胞密度
下，絮凝的材料通常在4小時至24小時範圍內之某一點(通常約20-24小時)沉降析出(不進一步沉降)。在使用產生高細胞密度之生質(>10%細胞容積比)、次微米細胞碎片及/或高乳酸鹽含量(>2-3 g/L)之細胞培養製程時，沉降速率顯著降低。產生高細胞密度或具有高乳酸鹽含量之細胞培養製程需要大量細胞培養液稀釋物以使絮凝物在24小時內沉降析出。儘管使用陽離子聚合物(例如PDADMAC)作為傳統收穫方法之替代很方便，但沉降時間延長在商業規模下可能不甚合意。
本發明提供，在非離子聚合物及非離子表面活性劑存在下，陽離子聚合物絮凝材料中之絮凝的粒徑及粒徑生長速率顯著增加。儘管高生質/細胞密度顯著延長僅使用PDADMAC之絮凝沉降時間，但當PDADMAC與非離子聚合物(例如聚乙二醇)及非離子表面活性劑(例如Triton X100)組合使用時，通常可見絮凝物重力沉降時間小於2小時。添加非離子聚合物及非離子表面活性劑耐受可分裂絮凝物及/或降低絮凝速率之剪切力。始終達成80%-90%或更高之收穫回收產率且宿主DNA顯著減少。添加非離子聚合物亦減少宿主細胞蛋白質及一些高分子量物質。
如本文所使用，「陽離子聚合物」係結合至帶負電荷懸浮粒子之帶正電荷聚合物。陽離子聚合物包含(但不限於)二烯丙基二甲基氯化銨(DADMAC)之聚合物。在較佳實施例中，DADMAC之聚合形成經N取代之吡咯啶結構PDADMAC(圖1)。陽離子聚合物亦包含聚乙烯亞胺
(PEI)、聚丙烯醯胺(PAA)及幾丁聚糖。
濃度為20 pg/總細胞密度或約20 pg/總細胞密度至90 pg/總細胞密度或約90 pg/總細胞密度之PDADMAC產生低上清液濁度及優良絮凝物沉降。「總細胞密度」係如使用Cedex細胞計數器及分析儀藉由台盼藍(Trypan Blue)排除法量測之活細胞加死細胞之和。在一實施例中，對於小細胞系(例如二倍體細胞系)而言，添加25 pg/總細胞密度或約25 pg/總細胞密度之PDADMAC。在另一實施例中，對於較大細胞系(例如四倍體細胞系)而言，添加43 pg/總細胞密度或約43 pg/總細胞密度至57 pg/總細胞密度或約57 pg/總細胞密度之PDADMAC。
分子量為200,000-500,000之PDADMAC藉由增加沈澱速率及上清液澄清度(與較低分子量形式相比)影響絮凝性能。在一實施例中，PDADMAC分子量係在400,000至500,000範圍內。在一實施例中，以22 pg/總細胞密度之最終濃度使用分子量在400,000-500,000範圍內之PDADMAC。在另一實施例中，以25 pg/總細胞密度之最終濃度使用分子量在400,000-500,000範圍內之PDADMAC。在另一實施例中，以45 pg/總細胞密度之最終濃度使用分子量在400,000-500,000範圍內之PDADMAC。
如本文所使用，「沉降速率」、「重力沉降速率」及「絮凝密實沉降速率」可互換使用。可藉由相關技藝已知及本文所闡述之方法測定沉降速率。例如，重力沉降係在1 g
下進行。沉降速率係藉由用絮凝物體積除以在0.5 L或1 L玻璃量筒中量測之總體積來測定。總體積係包含所有絮凝劑/沉降劑之細胞培養液之體積。
「沉降時間」係使絮凝物沉降所耗時間。沉降時間係在絮凝物沉降速率小於或等於1%/小時時達成。本文闡述在組合給予非離子聚合物或非離子聚合物與非離子表面活性劑之組合時之PDADMAC絮凝之沉降時間短至15分鐘。儘管高的生質/細胞密度會顯著延長僅使用PDADMAC時之絮凝沉降時間，但仍出現較短沉降時間。添加非離子聚合物或非離子表面活性劑時，可耐受會分裂絮凝物及/或降低絮凝速率之剪切力。
上清液澄清度與沉降速率無關，但取決於陽離子聚合物之給予量。其他因素(例如溫度、細胞培養液密度及黏度)對沉降速率或上清液澄清度幾乎沒有影響。具體而言，給予之PDADMAC隨細胞體積、細胞(活細胞及死細胞)之總密度及次微米細胞碎片粒子之濃度而變化。
如本文所使用，「非離子聚合物」係指增加分子之間之相互作用，從而促進沈澱之親水性聚合物。非離子聚合物包含(但不限於)聚乙二醇(PEG)、麥芽糊精、澱粉、甲基纖維素及葡聚糖。
當在添加陽離子聚合物絮凝劑的同時或之後將PEG或葡聚糖添加至哺乳動物細胞培養基時，沉降速率增加。產物回收率取決於非離子聚合物濃度、PEG分子量、添加非離子聚合物與PDADMAC之順序(同時添加或先添加
PDADMAC然後添加非離子聚合物)及細胞培養持續時間或細胞培養液中之碎片含量。
PEG 3,000可在3%(w/v)或約3%(w/v)至4.5%(w/v)或約4.5%(w/v)範圍內使用。PEG 6,000可在2.5%(w/v)或約2.5%(w/v)至3.5%(w/v)或約3.5%(w/v)範圍內使用。在一實施例中，PEG 3,000係以3%(w/v)之最終濃度使用。在另一實施例中，PEG 3,000係以15%(w/v)之最終濃度使用。在另一實施例中，PEG 3,000係以25%(w/v)之最終濃度使用。
如本文所使用，「非離子表面活性劑」係指兩親性有機化合物，意味著其同時含有疏水性基團及親水性基團，且包含(但不限於)皂苷及Triton X100。在一實施例中，Triton X-100係以0.05%(w/v)之最終濃度使用。
非離子聚合物可單獨添加或與非離子表面活性劑組合添加。以上兩者中之任一者皆可與陽離子聚合物同時添加或在添加陽離子聚合物之後添加。非離子聚合物及表面活性劑二者皆可以1分鐘或更短之添加時間快速添加。
一旦絮凝劑已沉降(初次沉降)，即可收穫澄清上清液。為增加重組產物回收率，可洗滌絮凝物或使其再懸浮以移除任何殘留重組產物。適宜洗滌稀釋劑包含蔗糖、PEG、細胞培養基及緩衝鹽水溶液。在一實施例中，洗滌稀釋劑係9%蔗糖。將絮凝物及洗滌稀釋劑混合不到1分鐘至60分鐘且沉降約1小時至24小時。一旦絮凝物已沉降(二次沉降)即收穫澄清二次上清液。可合併或單獨純化來自初次及二
次沉降之上清液。
澄清上清液可藉由以以下方式來收穫：藉由泵送或傾析移除上清液，然後經由含有矽藻土之深層濾器過濾，且然後經由0.2 μ截止膜濾器或僅0.2 μ截止濾器過濾。
陽離子聚合物清除率可藉由相關技藝已知方法監測，例如用於監測哺乳動物細胞毒性之分析；藉由DNA聚合酶或逆轉錄測定對DNA轉錄或RNA轉錄之抑制之分析；及測定mRNA之蛋白質翻譯之分析；及本文所闡述之方法。例如，可藉由在使用定量聚合酶鏈反應(QPCR)中對DNA擴增之抑制來監測來自重組蛋白質純化製程中間體之PDADMAC清除率。
可直接使用來自生物反應器之細胞培養液或可在絮凝之前將其冷卻。在較佳實施例中，細胞培養液之溫度範圍係自36℃或約36℃至20℃或約20℃。在另一實施例中，將細胞培養液冷卻至20℃或約20℃。
本發明提供自哺乳動物細胞培養物收穫重組蛋白質之方法。藉由哺乳動物細胞培養產生重組蛋白質之商業製程中使用之典型方法包含分批培養、補料分批培養及灌注培養。分批培養係使細胞在固定體積之培養基中生長較短時間段然後完全收穫之不連續方法。收穫通常在達成最大細胞密度(通常5-10×106細胞/mL)時進行。補料分批培養提供團塊(bolus)或連續培養基進料以補充彼等已消耗之培養基組份。由於補料分批培養物在整個運行中接收額外營養素，因此其與分批方法相比有可能達成更高細胞密度(大
於10至30×106細胞/ml)及增加的產物效價。灌注方法係典型大規模商業細胞培養策略，其致力於達到高細胞密度(60-90(+)×106細胞/mL)，其中幾乎50%至大於一半之反應器體積係生質。對於灌注培養而言，已達成大於1×108細胞/mL之極高細胞密度且預期可達成甚至更高之密度。
如本文所使用之「肽」、「多肽」及「蛋白質」通篇可互換使用，且係指包括2個或更多個藉由肽鍵彼此連接之胺基酸殘基之分子。肽、多肽及蛋白質亦包含修飾，包含(但不限於)糖基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧基化、羥基化及ADP-核糖基化。多肽在學術或商業上皆引人關注，包含基於蛋白之藥物。多肽尤其包含抗體、融合蛋白及細胞介素。肽、多肽及蛋白質係使用細胞培養方法藉由重組動物細胞系產生，且可稱為「重組肽」、「重組多肽」及「重組蛋白質」。所表現蛋白質可在細胞內產生或分泌至培養基中，可自該培養基回收及/或收集該(等)蛋白質。
可使用本發明之方法收穫之多肽之實例包含包括與下列蛋白質中之一者之全部或部分相同或實質上相似之胺基酸序列之蛋白質：腫瘤壞死因子(TNF)、flt3配體(WO 94/28391)、紅血球生成素、血小板生成素、降鈣素、IL-2、血管生成素-2(Maisonpierre等人，(1997),Science 277(5322)：55-60)、NF-κ B之受體激活劑之配體(RANKL,WO 01/36637)、腫瘤壞死因子(TNF)相關細胞凋亡誘導配體(TRAIL,WO 97/01633)、胸腺基質源淋巴細胞生成素、
顆粒球集落刺激因子、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，澳大利亞專利第588819號)、肥大細胞生長因子、幹細胞生長因子(美國專利第6,204,363號)、表皮生長因子、角質細胞生長因子、巨核細胞生長及發育因子、RANTES、人血纖維蛋白原樣2蛋白(FGL2；NCBI登記號NM_00682；Rüegg及Pytela(1995)，Gene 160：257-62)、生長激素、胰島素、促胰島素、胰島素樣生長因子、副甲狀腺激素、干擾素(包含α-干擾素、γ-干擾素及複合干擾素，美國專利第4,695,623號及第4,897,471號)、神經生長因子、腦源性神經營養因子、突觸結合蛋白樣蛋白(SLP 1-5)、神經滋養蛋白-3、升糖素、介白素、集落刺激因子、淋巴毒素-β、白血病抑制因子及製瘤素-M。可根據本發明方法產生之蛋白質之說明可參見(例如)：Human Cytokines：Handbook for Basic and Clinical Research，所有卷(Aggarwal及Gutterman編輯，Blackwell Sciences,Cambridge,MA,1998)；Growth Factors：A Practical Approach(McKay及Leigh編輯，Oxford University Press有限公司，New York,1993)；及The Cytokine Handbook，第1卷及第2卷(Thompson及Lotze編輯，Academic Press,San Diego,CA,2003)。
此外，本發明之方法將可用於收穫以下蛋白：包括任一上述蛋白質之受體之全部或部分胺基酸序列之蛋白質、該受體或任一上述蛋白質之拮抗劑，及/或與該等受體或拮抗劑實質上相似之蛋白質。該等受體及拮抗劑包含：兩種
形式之腫瘤壞死因子受體(TNFR，稱為p55及p75，美國專利第5,395,760號及美國專利第5,610,279號)、介白素-1(IL-1)受體(I型及II型；歐洲專利第0460846號、美國專利第4,968,607號及美國專利第5,767,064號)、IL-1受體拮抗劑(美國專利第6,337,072號)、IL-1拮抗劑或抑制劑(美國專利第5,981,713號、第6,096,728號及第5,075,222號)、IL-2受體、IL-4受體(歐洲專利第0 367 566號及美國專利第5,856,296號)、IL-15受體、IL-17受體、IL-18受體、Fc受體、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子受體、顆粒球集落刺激因子受體、製瘤素-M及白血病抑制因子之受體、NF-κ B之受體激活劑(RANK，WO 01/36637及美國專利第6,271,349號)、護骨素(美國專利第6,015,938號)、TRAIL受體(包含TRAIL受體1、2、3及4)及包括死亡結構域之受體(例如Fas或細胞凋亡誘導受體(AIR))。
可使用本發明收穫之其他蛋白質包含以下蛋白：包括分化抗原(稱為CD蛋白)或其配體之全部或部分胺基酸序列之蛋白質或與該等抗原或配體中之任一者實質上相似之蛋白質。該等抗原揭示於Leukocyte Typing VI(Proceedings of the VIth International Workshop and Conference,Kishimoto、Kikutani等人編輯，Kobe,Japan,1996)。相似CD蛋白揭示於後續工作中。該等抗原之實例包含CD22、CD27、CD30、CD39、CD40及其配體(CD27配體、CD30配體等)。若干CD抗原係TNF受體家族之成員，該家族亦包含41BB及OX40。該等配體通常係TNF家族之成員，如
41BB配體及OX40配體。
亦可使用本發明收穫酶活性蛋白或其配體。實例包含包括下列蛋白質或其配體中之一者之全部或部分之蛋白質或與該等蛋白質或配體中之一者實質上相似之蛋白質：去整合蛋白及金屬蛋白酶結構域家族成員(包含TNF-α轉化酶、各種激酶、葡萄糖腦苷脂酶、超氧化物歧化酶、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、因子VIII、因子IX、脂蛋白元E、脂蛋白元A-I、球蛋白、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶)、任一上述酶之配體及眾多種其他酶及其配體。
除非另有說明，否則術語「抗體」包含涉及任何同種型或子類之糖基化及非糖基化免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特異結合之抗原結合區域，包含人類、人類化、嵌合、多特異性、單株、多株及寡聚體或其抗原結合片段。亦包含具有抗原結合片段或區域之蛋白質，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、雙鏈抗體、Fd、dAb、馬克西抗體(maxibody)、單鏈抗體分子、互補決定區域(CDR)片段、scFv、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及至少含有免疫球蛋白中足以賦予靶多肽以特異性抗原結合之一部分之多肽。術語「抗體」包含(但不限於)彼等藉由重組方式製備、表現、產生或分離者，例如自經轉染以表現抗體之宿主細胞分離之抗體。
抗體之實例包含(但不限於)彼等識別包含(但不限於)上述蛋白質及/或下列抗原之蛋白質中之任一者或組合者：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、
CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受體、IL-4受體、IL-6受體、IL-13受體、IL-18受體亞單位、FGL2、PDGF-β及其類似物(參見美國專利第5,272,064號及第5,149,792號)、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受體(參見美國專利第6,235,883號)、VEGF受體、肝細胞生長因子、護骨素配體、γ干擾素、B淋巴細胞刺激因子(BlyS，亦稱為BAFF、THANK、TALL-1及zTNF4；參見Do及Chen-Kiang(2002)、Cytokine Growth Factor Rev.13(1)：19-25)、C5補體、IgE、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG(其係與肺癌相關的基因表現產物)、HER-2、HER-3、腫瘤相關糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、以高含量存在於患有結腸癌及/或胰腺癌之患者之血清中之腫瘤相關表位、在乳癌、結腸癌、鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌及/或腎癌癌細胞上及/或在黑色素瘤、神經膠質瘤或神經胚細胞瘤細胞上表現之癌相關表位或蛋白質、腫瘤壞死核心、整合素α4β7、整合素VLA-4、B2整合素、TRAIL受體1、2、3及4、RANK、RANK配體、TNF-α、黏附分子VAP-1、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、細胞間黏附分子-3(ICAM-3)、白血球整合素黏附素、血小板糖蛋白gp IIb/IIIa、心肌肌凝蛋白重鏈、副甲狀腺激素、rNAPc2(其係因子VIIa-組織因子抑制劑)、MHC I、癌胚抗原(CEA)、α-胎蛋白(AFP)、腫瘤壞死因子
(TNF)、CTLA-4(其係細胞毒素T淋巴細胞相關抗原)、Fc-γ-1受體、HLA-DR 10 β、HLA-DR抗原、硬骨素(sclerostin)、L-選擇素、呼吸道融合性病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、變種鏈球菌(Streptococcus mutans)及金黃色葡萄球菌(Staphlycoccus aureus)。可使用本發明之方法產生之已知抗體之具體實例包含(但不限於)阿達木單抗(adalimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、阿昔單抗(abciximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、佈雷奴單抗(briakinumab)、卡那奴單抗(canakinumab)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、西妥昔單抗(cetuximab)、可那木單抗(conatumumab)、地諾單抗(denosumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin)、戈利木單抗(golimumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、那他珠單抗(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕妥莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗
(rituximab)、羅維珠單抗(rovelizumab)、托珠單抗(tocilizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、優特克單抗(ustekinumab)、維多珠單抗(vedolizomab)、紮蘆木單抗(zalutumumab)及紮木單抗(zanolimumab)。
亦可使用本發明收穫包括(例如)任一上述蛋白質之重組融合蛋白。可使用本發明之方法產生(例如)包括上述蛋白質中之一者加多聚化結構域(例如，白胺酸拉鏈、捲曲螺旋、免疫球蛋白之Fc部分)之重組融合蛋白或實質上相似之蛋白質。例如，參見WO 94/10308；Lovejoy等人(1993)，Science 259：1288-1293；Harbury等人(1993),Science 262：1401-05；Harbury等人(1994),Nature 371：80-83；Håkansson等人(1999),Structure 7：255-64。特定而言，在該等重組融合蛋白中尤其包含受體之一部分融合至抗體之Fc部分之蛋白質，例如依那西普(etanercept)(p75 TNFR：Fc)及貝拉西普(belatacept)(CTLA4：Fc)。
出於本發明之目的，細胞培養基係適於在活體外細胞培養中使動物細胞(例如哺乳動物細胞)生長之培養基。相關技藝已熟知細胞培養基配方。通常，細胞培養基包括緩衝液、鹽、碳水化合物、胺基酸、維生素及微量必需元素。細胞培養基可含有或可不含血清、蛋白腖及/或蛋白質。多種組織培養基(包含無血清培養基及確定成份培養基)可自市面購得，例如，尤其可使用下列培養基中之任一者或組合：RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、達爾伯克
改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM))、最低必需伊格爾培養基(Minimum Essential Medium Eagle)、F-12K培養基、Ham's F12培養基、伊斯考夫改良達爾伯克培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、McCoy's 5A培養基、Leibovitz's L-15培養基及無血清培養基(例如EX-CELLTM 300系列，JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)。細胞培養基可補充有額外組份或濃度增加之組份，例如胺基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長因子、緩衝液、抗生素、脂質、微量元素及諸如此類，端視欲培養之細胞之要求及/或期望細胞培養參數而定。
細胞培養基可不含血清，不含蛋白質及/或不含蛋白腖。「無血清」適用於不含動物血清(例如胎牛血清)之細胞培養基。「無蛋白」適用於不含外源添加蛋白(例如運鐵蛋白、蛋白生長因子IGF-1或胰島素)之細胞培養基。無蛋白質培養基可含有或可不含蛋白腖。「無蛋白腖」適用於不含外源蛋白質水解產物(例如動物及/或植物蛋白水解產物)之細胞培養基。細胞培養液或類似術語係指尤其含有活及死哺乳動物細胞、細胞代謝產物及細胞碎片(例如核酸、蛋白質及脂質體)之細胞培養基。
細胞培養或「培養」意為細胞在多細胞生物體或組織外之生長及繁殖。相關技藝已知哺乳動物細胞之適宜培養條件。例如，參見Animal cell culture：A Practical Approach,D.Rickwood編輯，Oxford University Press,New York
(1992)。哺乳動物細胞可懸浮培養或附著至固體基質培養。使用或不使用微載體且以分批、補料分批、連續、半連續或灌注模式操作之流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶、搖瓶或攪拌罐生物反應器皆可用於哺乳動物細胞培養。
可在小規模培養物(例如100 ml)至大規模培養物(例如培養尺寸為數千及數萬毫升之系統)中培養諸如CHO細胞等哺乳動物細胞以供臨床及商業製造蛋白質治療劑。
細胞系(亦稱為「宿主細胞」)經遺傳改造以表現在商業或學術上受關注之多肽。細胞系通常源自可在培養中維持無限時間之原代培養物產生之譜系。對細胞系進行遺傳改造涉及用重組多核苷酸分子對細胞進行轉染、轉化或轉導，及/或以其他方式改變(例如，藉由同源重組及基因激活或重組細胞與非重組細胞之融合)以使得宿主細胞表現期望重組多肽。對細胞及/或細胞系進行遺傳改造以表現受關注多肽之方法及載體已為彼等熟習此項技術者所熟知；例如，各種技術闡釋於以下文獻中：Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編輯，(Wiley & Sons，New York,1988，且每季更新)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press,1989)；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990，第15-69頁。
有許多種適於在培養物中生長之哺乳動物細胞系可自美國典型菌種保存中心(American Type Culture Collection，
Manassas,Va.)及商業供應商處購得。通常用於工業中之哺乳動物細胞系之實例包含VERO、BHK、HeLa、CV1(包含Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞系(例如NSO、NS1)、PC12、WI38細胞及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞廣泛用於產生複雜重組蛋白質，例如細胞介素、凝血因子及抗體(Brasel等人(1996),Blood 88：2004-2012；Kaufman等人(1988),J.Biol Chem 263：6352-6362；McKinnon等人(1991),J Mol Endocrinol 6：231-239；Wood等人(1990)J.Immunol.145：3011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷突變體細胞系(Urlaub等人(1980),Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220)、DXB11及DG-44係期望的CHO宿主細胞系，此乃因有效的DHFR可選擇及可擴增基因表現系統可以在該等細胞中大量表現重組蛋白質(Kaufman R.J.(1990),Meth Enzymol 185：537-566)。此外，該等細胞易於作為黏附或懸浮培養物操作且呈現相當良好之遺傳穩定性。已對CHO細胞及在其中以重組方式表現的蛋白質進行了多方面之特徵分析，且管理機構已批准將其用於臨床商業製造。
儘管本申請案中所使用之術語係相關技藝標準術語，但本文仍提供某些術語之定義以確保申請專利範圍之含義清晰且明確。單位、字首及符號可呈其SI可接受之形式表示。本文所列舉之數值範圍包含界定範圍之數字且包含並支持所界定範圍內之每一整數。除非另有說明，否則術語「一」(「a」或「an」)應理解為意指「至少一」。本文所
使用之各章節標題僅出於組織目的，而不應將其理解為限制所闡述之標的物。除非另外指明，否則本文所闡述之方法及技術通常係根據相關技藝熟知之習用方法且如本說明書通篇所引用及論述之多個一般及更具體參考文獻中所闡述來實施。例如，參見Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)，及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。本申請案中所引用之所有文件或文件之部分(包含(但不限於)專利、專利申請案、文章、書籍及論文)皆以引用方式明確併入本文中。
本發明並不受限於本文所闡述之具體實施例之範疇，該等實施例僅意欲闡釋本發明之個別態樣，且功能上等效之方法及組份係在本發明之範疇內。實際上，除本文所顯示並闡述之修改外，彼等熟習此項技術者將可根據上述描述及附圖明瞭本發明之各種修改。該等修改意欲涵蓋於隨附申請專利範圍之範疇內。
此實驗比較用於使哺乳動物細胞培養液絮凝之二烯丙基二甲基氯化銨(PDADMAC)之不同分子量的製劑且比較其
沉降時間。
使表現重組單株抗體之CHO細胞在2,000 L生物反應器中在補料分批培養中生長15天。測試之前將細胞培養液冷卻至10℃。設置一系列旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L細胞培養液。以20%(w/v)液體供應PDADMAC(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)且藉由用純化水稀釋至10%(w/v)來製備所有該等實驗中所使用之工作原液。將分子量為100,000-200,000、200,000-350,000及400,000-500,000之PDADMAC添加至每一燒瓶至最終濃度介於29 pg PDADMAC/總細胞密度與86 pg PDADMAC/總細胞密度之間。連續添加PDADMAC溶液約1分鐘且培育15分鐘，同時在10℃下以70-80 rpm攪拌。讓絮凝物在環境溫度下沉降。使用此材料來測定沉降時間。
使二次補料分批培養物在1,000 L可棄式反應器中生長15天。將細胞培養液維持在約36℃。設置一系列旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L細胞培養液。將分子量為<100,000、100,000-200,000、200,000-350,000及400,000-500,000之PDADMAC添加至每一燒瓶至最終濃度介於25 pg PDADMAC/總細胞密度與76 pg PDADMAC/總細胞密度之間。連續添加PDADMAC溶液約1分鐘且培育15分鐘，同時在約36℃下以70-80 rpm攪拌。讓絮凝物在環境溫度下沉降。使用此材料來測定濁度。
藉由將如使用Cedex細胞計數器及分析儀(Roche Innovatis AG,Indianapolis,IN)藉由台盼藍排除法量測之活
細胞總數與死細胞總數相加來確定總細胞密度。然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經90分鐘以15分鐘之間隔進行讀取且按照沉降的絮凝物體積/總體積計算相對絮凝體積。
藉由傾析後經0.2 μ濾器過濾而自沉降的絮凝細胞團移除上清液。使用2100P濁度計(Hach,Loveland,CO)量測濁度。
圖2A及2B顯示，與使用平均分子量小於200,000之PDADMAC相比，使用平均分子量大於200,000但小於500,000之PDADMAC之絮凝產生最佳沉降時間及澄清度。
此實驗比較使表現來自小細胞系(例如二倍體細胞)及大細胞系(例如四倍體細胞系)之重組抗體之哺乳動物細胞培養液絮凝所需PDADMAC之量。
二倍體及四倍體細胞系係如上所述生長。設置一系列旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L來自二倍體及四倍體培養物中之每一者之細胞培養液。在此實驗及所有以下實驗中，除非另有說明，否則使用平均分子量為400,000至500,000之PDADMAC。將PDADMAC添加至每一燒瓶至表2中所顯示之最終濃度。如上所述測定總細胞密度。
連續添加PDADMAC溶液且如上所述攪拌。讓絮凝物在環境溫度下沉降。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經90至120分鐘以15分鐘間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
圖3A顯示用濃度為25 pg/總細胞之PDADMAC之絮凝具有最短沉降時間。
圖3B顯示用濃度為57 pg/總細胞之PDADMAC之絮凝具有最短沉降時間。
此實驗關注PDADMAC絮凝對產生高乳酸鹽含量及/或具有高細胞密度之細胞培養物之影響。
使表現重組單株抗體之CHO細胞在1,000 L可棄式生物反應器中生長14天。細胞培養液係處在環境溫度下。設置四個旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L細胞培養液。在添加
PDADMAC之前，每一燒瓶摻有3 g/L、6 g/L或9 g/L 60%(w/w)之DL-乳酸Na(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)作為對照或無乳酸鹽。然後將PDADMAC添加至每一燒瓶至最終濃度為25 pg/總細胞密度(PDADMAC原液如上所述)。如上所述測定總細胞密度。
在環境溫度下連續添加PDADMAC且如上所述攪拌。然後讓絮凝物在環境溫度下沉降。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經1500分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
使第二批CHO細胞培養物在1,000 L可棄式生物反應器中在灌注培養中生長20天。將細胞培養液冷卻至環境溫度。在添加PDADMAC之前，用細胞培養基將細胞培養液稀釋成25%、50%及75%。細胞容積比為44%之細胞培養液在添加PDADMAC之前不稀釋。PDADMAC之最終濃度為25 pg/總細胞密度至26 pg/總細胞密度。PDADMAC添加速率係約1分鐘，同時如上所述在環境溫度下攪拌且沉降。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經1400分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
圖4A及4B顯示，具有高乳酸鹽含量(>2-3 g/L)及/或產生高細胞密度之生質(>10%細胞容積比)之細胞培養製程之沉降速率顯著降低。
此實驗比較與PDADMAC組合使用之不同稀釋劑之沉降時間。
表現重組單株抗體之CHO細胞在1,000 L可棄式生物反應器中在灌注培養中生長18天。遞送第16天之細胞培養液以供在36℃下測試且在絮凝之前將其冷卻至環境溫度達2.5小時。在環境下實施添加及沉降。在添加PDADMAC之前，用不同稀釋劑將細胞培養液稀釋至67%。乳酸鹽含量係5 g/L。PDADMAC添加速率係約1分鐘，且在75-85 rpm下培育15分鐘時間。PDADMAC原液係10%(w/v)，其係用純化水自20(w/v)之原始原液得來。PDADMAC之最終濃度係25 pg/總細胞密度。讓絮凝物在環境溫度下沉降。
製備一系列稀釋劑；濃度顯示於表3中。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密
實沉降速率。經1600分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
如圖5所顯示，PDADMAC與PEG 6,000之組合具有最短沉降時間。與單獨之PDADMAC相比，PDADMAC與PEG 6,000、PEG 1,000或葡聚糖70/甜菜鹼之組合具有經改良之沉降速率。添加非離子聚合物可顯著增加絮凝物沉降速率。與單獨之PDADMAC相比，PDADMAC與PEG或葡聚糖之組合亦減少沉降時間，此與培養物中之乳酸鹽含量無關。
此實驗關注PDADMAC與PEG 3,000之組合對具有高細胞密度之細胞培養物之沉降時間之影響。
使表現重組單株抗體之CHO細胞在80 L生物反應器中在灌注培養中生長20天。測試之前將細胞培養液冷卻至環境溫度。在添加PDADMAC之前，用36%(w/v)蔗糖或25%(w/v)PEG 3,000(皆存於純化水中)將細胞培養液稀釋至10%。最終細胞培養液蔗糖濃度係3.6%(w/v)且最終PEG 3,000濃度係2.5%(w/v)。PDADMAC添加速率係約1分鐘，且在75-85 rpm下培育15分鐘時間。PDADMAC原液係10%(w/v)，其係用純化水自20(w/v)之原始原液得來。PDADMAC之最終濃度係22 pg/總細胞密度(對於PEG 3,000)及25 pg/總細胞密度(對於蔗糖及對照或未經稀釋之細胞培養液)。對照或未經稀釋之細胞培養液PCV係48%。經稀釋之細胞培養液PCV=(對照PCV×稀釋因數)=43.2%。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經240分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
如圖6中所顯示，PDADMAC與PEG 3,000之組合比單獨之PDADMAC沉降更快。如實例3中所見，單獨之PDADMAC之沉降速率顯著降低，且細胞密度有所增加。PEG 3,000與PDADMAC之組合相對於單獨之PDADMAC縮短絮凝劑沉降時間，此與細胞培養製程密度(在此情形下細胞容積比為43%)無關。
此實驗關注添加PEG與PDADMAC之時機對沉降時間之影響。
使表現重組單株抗體之CHO細胞在80 L生物反應器中在19天之灌注細胞培養製程中生長。將細胞培養液冷卻至21℃。設置3個旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L細胞培養液。將濃度為45 pg/總細胞密度(分子量為400,000-500,000)之PDADMAC添加至一個燒瓶中。將45 pg/總細胞密度之PDADMAC及15%(w/v)之PEG 3,000以濃注添加方式添加至另一燒瓶中(1步式方法)。將濃度為45 pg/總細胞密度之PDADMAC添加至第三燒瓶中且在添加PDADMAC後添加最終濃度為15%(w/v)之PEG 3,000(2步式方法)。PDADMAC添加速率係約1分鐘。PDADMAC/PEG添加速率係約5分鐘。所有添加皆係在環境溫度下進行。在75-85 rpm下將所有燒瓶培育15分鐘。讓絮凝物在環境溫度下沉
降。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經240分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
如圖7中所顯示，同時或依序添加PDADMAC與PEG 3,000之組合相對於單獨之PDADMAC縮短絮凝劑沉降時間。
隨後準備大規模培養。使表現重組單株抗體之CHO細胞在80 L生物反應器中在灌注培養中生長19天。將細胞培養液冷卻至21℃。在環境溫度下同時添加濃度為45 pg/總細胞密度之PDADMAC及最終濃度為15%(w/v)之PEG 3,000，添加速率係21分鐘，然後在100 rpm下培育5分鐘。讓絮凝物在環境溫度下沉降。
一旦絮凝劑已沉降(初次沉降)，即藉由自生物反應器泵送培養液然後依次經由含有矽藻土之深層濾器及0.2 μ截止膜濾器過濾來收穫澄清上清液。
在等體積9%蔗糖溶液中洗滌絮凝物以移除任何殘留重組蛋白質且讓其沉降16小時。一旦絮凝物已沉降(二次沉降)，即如上所述收穫二次澄清上清液。
使用蛋白A層析純化來自以上絮凝(小規模及大規模)之所收穫澄清細胞培養物上清液，然後測定產物品質。在測定產物品質之前不中和蛋白A洗脫液。所量測之蛋白A洗脫液產物品質屬性係如藉由SEC量測之分子變體、如藉由ELISA測定之宿主細胞蛋白質。
然後使經蛋白A純化之材料在pH 7.5下通過CEX管柱。
對於兩種規模而言，對照與初次絮凝物收穫物之間之產物品質相似。PDADMAC/PEG初次收穫物往往移除在蛋白A彙集物中由低HMW含量反映之高級聚集體。觀察到PDADMAC/PEG收穫物之宿主細胞蛋白質含量有所降低。用蔗糖再懸浮使CHOP及HMW含量比初次PDADMAC/PEG收穫物略高，且人們認為此係該等雜質之再增溶所致。
此實驗關注將表面活性劑與PDADMAC及PEG一起添加對沉降時間之影響。
使表現重組單株抗體之CHO細胞在80 L生物反應器中在灌注細胞培養中生長15天。將第14天之細胞培養液冷卻至
30℃以供測試。設置2個旋轉燒瓶且每一燒瓶中含有1 L細胞培養液。將PDADMAC及PEG 3,000同時添加至一個燒瓶中，添加濃度為25 pg/總細胞密度(分子量為400,000-500,000)之PDADMAC及最終濃度為3%(w/v)之PEG 3,000。將以上濃度之PDADMAC及PEG以及最終濃度為0.05%(v/v)之Triton X-100添加至另一燒瓶中。(Triton X-100原液係10%(v/v)，其係來自20%(v/v)之原始原液，Sigma Aldrich,St.Louis,Mo.)。同時添加3種組份。添加速率係約1分鐘，且在75-85 prm下培育15分鐘。如前述實例中所述旋轉所有燒瓶。讓絮凝物在環境溫度下沉降。
然後將絮凝的溶液轉移至1 L玻璃量筒中以測定絮凝密實沉降速率。經240分鐘以不同間隔進行讀取且如上所述計算相對絮凝體積。
如圖8中所顯示，將Triton X-100與PDADMAC及PEG 3,000一起添加相對於單獨之PDADMAC及PEG 3,000縮短絮凝劑沉降時間。
圖1提供PDADMAC之結構。
圖2A顯示藉由不同分子量之PDADMAC達成之沉降時間之差異。每一分子量之PDADMAC之濃度係57 pg/總細胞密度。閉合菱形/虛線表示PDADMAC分子量為100,000-200,000。閉合方形與虛線表示PDADMAC分子量為200,000-300,000。閉合三角形及實線表示PDADMAC分子量為400,000-500,000。
圖2B顯示在用不同分子量之PDADMAC使細胞培養液絮凝時所達成之上清液澄清度。自左至右，柱條表示PDADMAC分子量小於100,000；100,000-200,000；200,000-350,000；及400,000-500,000。
圖3A顯示高分子量PDADMAC濃度對15-20 μm細胞之絮凝之影響。閉合菱形虛線表示11 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合方形與虛線表示18 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合三角形與實線表示25 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合圓形與虛線表示39 pg/總細胞密度之PDADMAC。
圖3B顯示高分子量PDADMAC濃度對21-24 μm細胞之絮凝之影響。閉合菱形與點虛線表示29 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合方形與虛線表示43 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合三角形與虛線表示57 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合圓形與實線表示71 pg/總細胞密度之PDADMAC。閉合方形與點線表示86 pg/總細胞密度之PDADMAC。
圖4A顯示對產生高乳酸鹽含量之細胞培養物之高分子量PDADMAC絮凝之影響。實心菱形與實線表示不添加乳酸鹽。實心方形與虛線表示摻有3 g/L之乳酸鹽。實心三角形與虛線表示摻有6 g/L之乳酸鹽。實心圓形與虛線表示摻有9 g/L之乳酸鹽。
圖4B顯示對如藉由細胞容積比(PCV)所量測具有高細胞密度之細胞培養物之高分子量PDADMAC絮凝之影響。實
心菱形與虛線表示44% PCV。實心三角形與虛線表示33% PCV。實心方形與虛線表示22% PCV。實心圓形與實線表示11% PCV。
圖5顯示不同稀釋劑對具有高乳酸鹽含量之細胞培養製程之高分子量PDADMAC絮凝之影響。實心三角形與點虛線表示蔗糖。實心方形與虛線表示不含稀釋劑之細胞培養基。實心菱形與虛線表示甜菜鹼。實心圓形與虛線表示PEG 1,000。實心三角形與實線表示PEG 6,000。實心三角形與虛線表示葡聚糖70及甜菜鹼。
圖6顯示PDADMAC/PEG絮凝對PCV為43.2%之細胞培養物之影響。實心菱形與虛線表示單獨之PDADMAC。實心方形與虛線表示蔗糖。實心三角形與實線表示PDADMAC/PEG。
圖7顯示PDADMAC及PEG之添加順序之影響。PDADMAC及PEG濃注添加(1步式方法)係藉由實心三角形與虛線來顯示。添加PDADMAC之後添加PEG(2步式方法)係藉由實心方形與虛線來顯示。單獨之PDADMAC係藉由實心菱形與實線來顯示。
圖8顯示添加Triton X-100之影響。PDADMAC/PEG添加係藉由實心方形與實線來顯示。PDADMAC/PEG/Trition X-100添加係藉由實心三角形與虛線來顯示。
Claims (33)
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至該細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
- 如請求項1之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該陽離子聚合物係聚二烯丙基二甲基氯化銨。
- 如請求項1之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子聚合物係選自聚乙二醇及葡聚糖。
- 如請求項1之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子聚合物係選自PEG 3,000及PEG 6,000。
- 如請求項1之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其進一步包括將非離子表面活性劑添加至該細胞培養基。
- 如請求項5之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子表面活性劑係Triton X-100。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨及PEG 3,000添加至該細胞培養基中以起始絮凝， 在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3,000及Triton X-100添加至該細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑沉降，及回收澄清上清液。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至該細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培 養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將陽離子聚合物及非離子聚合物添加至該細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，若該初次澄清上清液中之產物回收率小於80%時，則洗滌該初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
- 如請求項9或10之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該陽離子聚合物係聚二烯丙基二甲基氯化銨。
- 如請求項9或10之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子聚合物係選自聚乙二醇及葡聚糖。
- 如請求項9或10之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子聚合物係選自PEG 3,000及PEG 6,000。
- 如請求項9或10之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其進一步包括將非離子表面活性劑添加至該細胞培養基。
- 如請求項14之哺乳動物細胞培養物收穫方法，其中該非離子表面活性劑係Triton X-100。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨及PEG 3,000添加至該細 胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
- 一種哺乳動物細胞培養物收穫方法，其包括：在細胞培養基中將表現重組蛋白質之哺乳動物細胞培養預定時間或直至達成期望細胞密度及/或細胞容積比，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3,000及Triton X-100添加至該細胞培養基中以起始絮凝，在絮凝期間混合該細胞培養基，讓絮凝劑在初次沉降中沉降，回收初次澄清上清液，洗滌初次沉降絮凝劑，讓經洗滌絮凝劑在二次沉降中沉降，及回收二次澄清上清液。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中同時添加該陽離子聚合物及該非離子聚合物。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中首先添加該陽離子聚合物且混合至少30秒，然後添加該非離子聚合物。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中同時添加該陽離子聚合物、該非離子聚合物及非離子表面活性劑。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中首先添加該陽離子聚合物且混合至少30秒，然後添加該非離子聚合物及非離子表面活性劑。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該陽離子聚合物係二烯丙基二甲基氯化銨之聚合物、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞胺、聚丙烯醯胺或幾丁聚糖。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該非離子聚合物係聚乙二醇或葡聚糖。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該非離子表面活性劑係皂苷或Triton X100。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該聚二烯丙基二甲基氯化銨之添加濃度為20 pg/總細胞密度或約20 pg/總細胞密度至90 pg/總細胞密度或約90 pg/總細胞密度。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該聚二烯丙基二甲基氯化銨之添加濃度為25 pg/總細胞密度或約25 pg/總細胞密度，其中該等哺乳動物細胞源於二倍體細胞系。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中添加介於43 pg/總細胞密度至57 pg/總細胞密度之間之該聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中該等哺乳動物細胞源於四倍體細胞系。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中PEG 3,000之濃度係3%或約3%至4.5%或約4.5%。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中PEG 6,000之濃度係2.5%或約2.5%至3.5%或約3.5%。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中Triton X100之濃度 係0.05%(w/v)。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞培養液係介於36℃與20℃之間。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞培養液係20℃或高於20℃。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在9%蔗糖溶液中洗滌來自該初次沉降之該絮凝劑。
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