KR20190123123A - 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제 - Google Patents

글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제 Download PDF

Info

Publication number
KR20190123123A
KR20190123123A KR1020180046890A KR20180046890A KR20190123123A KR 20190123123 A KR20190123123 A KR 20190123123A KR 1020180046890 A KR1020180046890 A KR 1020180046890A KR 20180046890 A KR20180046890 A KR 20180046890A KR 20190123123 A KR20190123123 A KR 20190123123A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
carbon atoms
formula
scheme
group
compound
Prior art date
Application number
KR1020180046890A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102062291B1 (ko
Inventor
손기영
김재화
윤선영
유창현
정진선
Original Assignee
주식회사 엔지켐생명과학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엔지켐생명과학 filed Critical 주식회사 엔지켐생명과학
Priority to KR1020180046890A priority Critical patent/KR102062291B1/ko
Priority to JP2020558931A priority patent/JP7105916B2/ja
Priority to EP19792728.8A priority patent/EP3778558A4/en
Priority to PCT/KR2019/004789 priority patent/WO2019208980A1/ko
Priority to CN201980027923.7A priority patent/CN112041297B/zh
Priority to US17/047,123 priority patent/US20210198183A1/en
Publication of KR20190123123A publication Critical patent/KR20190123123A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102062291B1 publication Critical patent/KR102062291B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/20—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a carbon atom of an acyclic unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and unsaturated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • A23L33/12—Fatty acids or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/133—Amines having hydroxy groups, e.g. sphingosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/231—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having one or two double bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/34—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • C07C233/35—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/38—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a carbon atom of an acyclic unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/20—Esters of monothiocarboxylic acids
    • C07C327/28—Esters of monothiocarboxylic acids having sulfur atoms of esterified thiocarboxyl groups bound to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/67—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of saturated acids
    • C07C69/708—Ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/02—Systems containing only non-condensed rings with a three-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/14—The ring being saturated

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

IL-4, IL-6등의 각종 염증사이토카인 또는 CXCL8의 과발현을 억제하고, HL-60 세포주의 이동을 감소하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제가 개시된다. 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 포함한다.
[화학식 2]
Figure pat00059

상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.
[화학식 3]
Figure pat00060

상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9(여기서, R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다.)이다.

Description

글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제{Glycerol derivatives, method for preparing these and immunomodulating agent including the same as active ingredient}
본 발명은 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 IL-4, IL-6 등의 각종 염증사이토카인, CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제에 관한 것이다.
면역이란 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어하는 것으로, 면역 결핍이란, 면역계의 일부 구성요소에 결함이 생겨 발생하는 것이다. 그 결과, 많은 종류의 항원에 대하여 면역반응이 일어나지 않게 되는데. 이러한 면역 결핍은 크게 선천성 면역결핍(congenital or primary immunodeficiency)과 후천성 면역결핍(acquired or secondary immunodeficiency)으로 나누어진다. 선천성 면역결핍은 B 세포, T 세포 등 면역세포가 원래부터 존재하지 않는 것으로 유전자 치료나 항체주입, 골수 이식 등의 치료만이 가능한 치료법이다. 그에 반해, 후천성 면역결핍증은 면역 구성 요소 자체는 원래 존재하나 이들에 의해 나타나는 면역반응 과정에 이상이 생긴 것이므로 면역 구성요소의 기능을 증진시킴으로써 면역결핍상태를 개선할 수 있다. 또한, 근래 면역기능의 이상 증가로 발생하는 관절염, 아토피, 치매, 패혈증 등의 자가면역질환이 많이 발생하고 있으며, 이러한 경우, 면역억제제를 주로 사용하여 치료하고 있는 실정이지만, 면역력을 떨어뜨려 다른 문제를 야기하는 경우가 많다. 최근 면역기능의 작용기전이 알려지면서 전세계적으로 면역기능을 증진 또는 억제할 수 있는 면역조절 물질을 개발하려는 시도가 진행되고 있다. 이러한 시도는 면역조절물질을 통하여 비특 이적으로 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진 또는 억제 등 조절함으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증진시킴과 동시에 부작용을 최소화시키려는 것이다. 이와 같은 면역 조절 물질로서, 대한민국 특허공개 10-2006-0047447호에는 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물이 개시되어 있다. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물은 1-팔미도일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤로서, 통상 EC-18 또는 PLAG로 알려져 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 각종 면역기능의 저하에 의하는 질환, 예를 들면, 암, 패혈증, 관절염, 감염증, 치매, 노화, 당뇨, 피부병, 천식, 아토피, 스트레스, 신경쇠약, 만성피로증후군 등 자가면역작용에 의한 세포손상의 억제, 예방 및 치료에 효능을 가지는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 기존의 면역 조절 물질인 1-팔미도일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤과 유사한 면역 조절 기능을 가지는 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 IL-4, IL-6 등의 염증사이토카인 또는 염증세포의 이동에 연관된 키모카인 CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9(여기서, R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다.)이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역조절용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제는 IL-4, IL-6 등의 염증사이토카인 또는 염증세포의 이동에 연관된 키모카인 CXCL8의 과발현을 억제하여, 염증관련 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 화합물을 제조할 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 LPS로 유도된 IL-6 분비의 정도를 나타낸 도표.
도 3 및 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 IL-6로 유도된 STAT3 활성화 정도를 나타낸 도표.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 THP-1 세포에서의 CXCL8(IL-8) 발현 정도를 나타낸 도표.
도 6은 본 발명의 다른 실시예에 따른 트렌스웰(Transwell)을 이용한 HL-60 세포주의 이동 정도를 나타낸 도표.
도 7 및 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 IL-4로 유도된 STAT6 활성화 정도를 나타낸 도표.
도 9 및 도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 PKC activator로 유도된 IL-4 분비 정도를 나타낸 도표.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 신규한 글리세롤 유도체를 제공한다. 구체적으로는 하기 화학식 2로 표시되는 신규한 글리세롤 유도체와 하기 화학식 3으로 표시되는 백본(backbone)에 카보닐기가 도입된 신규한 글리세롤 유도체를 제공한다.
[화학식 2]
Figure pat00004
상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.
구체적으로, 상기 R4에서 지방산기는 사슬형 또는 가지형 및 포화 또는 불포화 지방산에서 히드록시기(-OH)가 제거된 아실기를 의미한다. 예를 들면, 아세틸(Acetyl), 팔미토일(Palmitoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 미리스토일(Myristoyl) 등 일 수 있다. 상기 R5에서 지방족 탄화수소기는 방향족을 제외한, 사슬형, 가지형 또는 고리형 및 포화 또는 불포화 탄화수소를 포함한다. 예를 들면, 에틸(ethyl), 프로필(Propyl), 부틸(Butyl), 펜타데실(Pentadexyl), 헵타데실-8,11-다이엔(heptadecyl-8,11-diene), 1-메틸프로필(1-Methylpropyl), t-부틸(tert-butyl), 사이클로프로필(cyclopropyl), 사이클로헥실(cyclohexyl) 등일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00005
상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9이며, 상기 R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다. 구체적으로, 상기 R6 및 R7은 각각 독립적으로 팔미토일(Palmitoyl), 리놀레오일(Linoleoyl)등 일 수 있으며, R9는 에틸기 등일 수 있다.
상기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체는 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면, 세리놀(serinol, 2-Amino-1,3-propanediol, C3H9NO2, 분자량: 91.11)을 출발물질로 사용하여 상기 화학식 2로 표시되는 글리세롤 유도체를 제조할 수 있다. 상기 출발물질로서, 세리놀을 이용한 합성법은 대표적으로 하기 반응식 1 내지 2에 따라 수행할 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00006
먼저, 상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 세리놀과 리놀레산(지방산)을 반응시켜, 상기 화학식 2로 표시되는 글리세롤 유도체를 얻을 수 있다.
[반응식 2]
Figure pat00007
상기 반응식 2에서 합성한 화합물에 아세틸 클로라이드를 반응시켜, 상기 화학식 2로 표시되는 글리세롤 유도체를 얻을 수 있다.
본 발명의 글리세롤 유도체는, 기존에 면역조절 및 항암제로서 다양한 급, 만성 염증 질환에서 효과를 나타내는 상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 유도체(EC-18)와 유사하게, 인체 감염시 초기 대응하는 대식세포들의 염증 사이토카인의 발현을 조절하여, 면역조절제로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 글리세롤 유도체는, 염증 사이토카인인 IL-6의 과발현을 억제하고, IL-6 발현 조절 인자인 STAT3 활성을 감소시킬 수 있으므로, 각종 급, 만성 염증 질환 및 면역질환 관련 질병의 개선, 예방 및 치료제로서 사용할 수 있다. 또한, 기존에 면역조절 및 항암제로서 다양한 급, 만성 염증 질환에서 효과를 나타내는 상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 유도체(EC-18)와 유사하게 인체 감염시 초기 대응하는 대식 세포들의 염증사이토카인의 발현을 조절하여, 면역조절제로서 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 글리세롤 유도체는, 각종 알러지 및 자가면역질환, 그리고 나아가 암의 미세환경에 영향을 미치는 T hepler 2 type (Th2)의 T 세포에서 발현하는 IL-4 발현을 조절하여 감소시키고 이들 사이토카인의 발현조절인자인 STAT6 활성을 감소시키는 효과가 있어 Th2 관련 만성질환 및 암 예방 및 치료제로서도 사용할 수 있다. 또한, 대식세포 셀라인 중 하나인 RAW 265.7 세포에서의 염증사이토카인인 IL-6 발현을 저해하는 효과와 IL-6 발현 조절 인자인 STAT3 활성을 감소시키는 효과가 있어 각종 염증질환 개선제로서, 독성이 없으면서 각종 급, 만성 염증 질환 및 면역질환 관련 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
기존의 글리세롤 유도체들과 유사하게 THP-1 세포에서 CXCL8의 발현을 조절하여 감소시키고, 결국 과도한 호중구이동을 경감하여 동물모델에서 기관지내 균 급성 감염 모델에서의 감염을 억제하는 효과가 있어, 과도한 호중구 이동에 따른 염증반응을 조절하는 면역조절제로서 초기 감염에 대응하는 치료제로서 독성이 없으면서 각종 급, 만성 염증 질환 및 면역질환 관련 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 트랜스웰(Transwell)을 이용하여, 미분화 호중구세포주인 HL-60 세포주의 이동이 감소되어, 전이억제 및 암 미세환경을 변화시켜 암 관련 질병의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 글리세롤 유도체의 투여로 인하여 예방 또는 치료될 수 있는 면역 관련 질환의 예로는 각종 박테리아 및 바이러스 감염질환, 급, 만성 염증 폐질환, 폐렴, 자가면역질환, 알러지 질환, 암 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서 용어, "예방"은 상기 유도체의 투여로 면역의 과발현을 억제하는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 유도체에 의해 면역 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 글리세롤 유도체는 다른 물질과의 혼합없이 단독으로 면역조절제로 사용되거나, 상기 글리세롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 형태로 면역조절제로 사용될 수 있다. 본 발명의 글리세롤 유도체가 약학적 조성물에 사용될 경우, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 글리세롤 유도체의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 100.0 중량%, 구체적으로는 0.001 내지 95.0 중량% 포함될 수 있다. 예를 들면, 조성물 중 글리세롤 유도체의 함량은 0.01 내지 50 중량%, 더욱 구체적으로는 1 내지 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 조성물 중 글리세롤 유도체의 함량은 50 내지 100 중량%, 더욱 구체적으로는 50 내지 95 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 유도체 또는 조성물은 면역 저하 예방, 면역 증진 또는 면역 질환의 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 1,2-디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 면역조절용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 글리세롤 유도체를 면역 과발현의 방지, 면역 기능의 증진, 면역 관련 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 포함시킬 수 있다. 여기서, 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 면역 관련 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04 g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03 g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 면역 과발현 또는 면역 관련 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역 조절 방법 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 상기 면역 과발현 또는 면역 관련 질환의 의심 개체는 면역 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물을 면역 관련 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 면역 관련 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1의 1,2-디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는 지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 글리세롤 유도체 합성(EC-A04_2)
[반응식 1a]
Figure pat00008
MC(메틸렌 클로라이드, Methylene chloride) 500ml에 출발물질로서, 2-아미노프로판-1,3-다이올(2-Amino propane-1,3-diol, 1.5eq.), TEA(트리에틸아민, Triethylamine, 6eq.), 리놀레산(Linoleic acid, 2g, 7.13mmole, 1eq.), HOBt(1-Hydroxybenzotriazole, 1.2eq.)과 EDCI(N-(3-Dimethylamino propyl)-N'-ethylcarbodiimide, 1.2eq.)을 넣고, 25℃에서 18시간 동안 교반한다. 용매를 농축하고 컬럼(MC:MeOH=100:1 → 10:1)으로 정제하여 목적화합물 1(L= 리놀레오일)을 얻었다.(MeOH=메탄올, 수율 90.46%)
[실시예 2] 글리세롤 유도체 합성(EC-A04_3)
[반응식 1b]
Figure pat00009
MC 10ml에 상기 실시예 1에서 합성한 화합물 1(EC-A04_2, 1g, 2.83mmole, 1eq.)을 넣고 녹인 후, 아세틸클로라이드(Acetyl chloride, 0.8eq.)를 0℃ 유지하면서 천천히 적가한다. 반응물을 25℃에서 18시간 교반한다. 용매를 농축하고 컬럼(MC:MeOH=10:1 → 1:1)으로 정제하여 목적화합물 2를 얻었다. (수율 74.25%)
[실시예 3] 글리세롤 유도체 합성(EC-A04)
[반응식 1c]
Figure pat00010
MC 100ml에 상기 실시예 2에서 합성한 화합물 2(EC-A04_3, 100mg, 252.8mmole, 1eq.), DCC(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide, 1.2eq.)와 DMAP(4-(Dimethylamino) pyridine, 0.2eq.)을 넣고 25℃에서 18시간 교반한다. 용매를 농축하고 컬럼(PE(Petroleum ether, 석유에테르):EA(Ethyl acetate, 에틸아세테이트)=30:1 → 10:1)으로 정제하여 목적화합물 3(P= 팔미토일, L= 리놀레오일) 을 얻었다. (수율 60.4%)
[실시예 4] 글리세롤 유도체 합성(EC-A06)
[반응식 2a]
Figure pat00011
MC 360ml에 출발물질로서, 3-아미노-1,2-프로판다이올(3-Amino-1,2-propane diol, 1.2eq.), R1-OH(1g, 3.9mmol, 1eq.), EDCI(N-(3-Dimethylamino propyl)-N'-dethylcarbodiimide, 1.2eq.), HOBt(1-Hydroxybenzotriazole, 1.2eq.)와 TEA(6eq.)을 넣고 20℃에서 16시간 교반하고, TLC(MC:MeOH=10:1) (TLC=Thin　Layer　Chromatography)로 반응을 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 용매를 농축하고, 컬럼(MC:MeOH=20:1 → 10:1)으로 정제하여 목적화합물 4(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율= 53.22%)
[반응식 2b]
Figure pat00012
THF(테트라히드로푸란, Tetrahydrofuran) 10ml에 상기 반응식 2a에서 얻은 화합물 4(720mg, 2.18mmole, 1eq.)를 넣고, TBDPSCl(tert-Butyldiphenylchlorosilane, 1.2eq.), 이미다졸(imidazole, 2eq.)을 넣고, 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.7)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼으로 정제하여 목적화합물 5(R1= 팔미토일, TBDPS=터트-부틸디페닐실릴)를 얻었다. (수율=76.73%)
[반응식 2c]
Figure pat00013
MC 1ml에 상기 반응식 2b에서 합성한 화합물 5(500mg, 880.41mmole, 1eq.), R2-OH(1.05eq.), DCC(1.05eq.)와 DMAP(0.1eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=3:1, Rf=0.35)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=3:1 → 1:1)으로 정제하여 목적화합물 6(R1= 팔미토일, R2=리놀레오일)을 얻었다. (수율=64.98%)
[반응식 2d]
Figure pat00014
THF 6ml에 상기 반응식 2c에서 합성한 화합물 6(500mg, 602.16mmole, 1eq.)과 TBAF(Tetrabutylammonium fluoride hydrate, 1.5eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=3:1, Rf=0.1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=3:1 → 1:1)으로 정제하여 목적화합물 7(R1=팔미토일, R2=리놀레오일)을 얻었다. (수율=90.34%)
[반응식 2e]
Figure pat00015
MC 1ml에 상기 반응식 2d에서 합성한 화합물 7(100mg, 168.93mmole, 1eq.)과 무수 아세트산(Acetic anhydride, 1.2eq.)과 TEA(2eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=3:1, Rf=0.35)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=3:1)으로 정제하여 목적화합물 8(EC_A06, R1=팔미토일, R2=리놀레오일, R3=아세틸)을 얻었다. (수율=19.47%)
[실시예 5 내지 21] 글리세롤 유도체 합성
상기 실시예 4와 실질적으로 동일한 방법으로, 하기 표 1에 나타낸 글리세롤 유도체 화합물을 합성하였으며, 최종 합성 단계의 수율과 함께 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 화합물 R1 group R2 group R3 group 수율(%)
5 EC-A06A Palmitoyl Acetyl Linoleoyl 22.17
6 EC-A11 Acetyl Linoleoyl Palmitoyl 46.33
7 EC-A73 Palmitoyl Linoleoyl 2-Methylbutyryl 37.3
8 EC-A73A Palmitoyl 2-Methylbutyryl Linoleoyl 29.8
9 EC-A74 Myristoyl Linoleoyl Acetyl 42.7
10 EC-A75 Palmitoyl Linoleoyl Propionyl 53.0
11 EC-A76 Palmitoyl Linoleoyl Butyryl 63.9
12 EC-A77 Palmitoyl Linoleoyl Cyclopropanecarbonyl 44.9
13 EC-A81 Palmitoyl Linoleoyl Cyclohexanecarbonyl 38.7
14 EC-A104 Myristoyl Acetyl Linoleoyl 50.1
15 EC-A105 Myristoyl Cyclopropanecarbonyl Linoleoyl 37.7
16 EC-A106 Myristoyl 2-Methylbutyryl Linoleoyl 48.9
17 EC-A107 Myristoyl Pivaloyl Linoleoyl 50.7
18 EC-A111 Palmitoyl Propionyl Linoleoyl 59.7
19 EC-A112 Palmitoyl Butyryl Linoleoyl 60.3
20 EC-A113 Palmitoyl Cyclopropanecarbonyl Linoleoyl 27.1
21 EC-A114 Palmitoyl Cyclohexanecarbonyl Linoleoyl 31.7
[실시예 22] 글리세롤 유도체 합성(EC-A44)
[반응식 3a]
Figure pat00016
MC 160ml에 출발물질로써, 2-[(터트-부톡시카보닐)아미노] -3-아미노프로피오닉산(Boc-Dap-OH, 2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]-3-aminopro pionic acid, 10g, 48.97mole, 1eq.)와 MeOH(16ml)을 넣고, (트리메틸실릴)디아조메탄(TMSCHN2, (Trimethylsilyl)diazomethane solution, 2.0 M in Hex. 또는 디에틸에테르(Diethyl ether), 1.07eq.)을 천천히 적가한 후, 20~25℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.5)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 여과하여 목적화합물 9를 얻었다.
[반응식 3b]
Figure pat00017
N2-퍼지(purge)하에서 MC 100ml에 상기 반응식 3a에서 얻은 화합물 9 (1.2eq.), R1-OH(9.5g, 37.05mmole, 1eq.), EDCI(1.2eq.), HOBt(1.2eq.)와 TEA(6eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=2:1, Rf=0.5)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=5:1 → 3:1)으로 정제하여 목적화합물 10(R1=팔미토일)을 얻었다. (수율=32%)
[반응식 3c]
Figure pat00018
THF 20ml에 상기 반응식 3c에서 합성한 화합물 10(2.1g, 4.6mmole, 1eq.)을 넣고, LiBH4(4eq.)을 0℃에서 투입한 후, 0~20℃에서 1시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=2:1, Rf=0.15)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 에틸아세테이트(EA)를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 농축하여 목적화합물 11(R1=팔미토일)을 얻었다. (수율=91.54%)
[반응식 3d]
Figure pat00019
MC 2ml에 상기 반응식 3c에서 합성한 화합물 11(200mg, 466.58mmole, 1eq.)을 넣고, 무수 아세트산(Acetic anhydride, 1.2eq.)을 0℃에서 과 TEA(2eq.)를 투입한 후, 0~20℃에서 16시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=2:1, Rf=0.4)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 MC를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 농축하여 목적화합물 12(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=86.06%)
[반응식 3e]
Figure pat00020
MC 2ml와 TFA 400mL의 혼합용매에 상기 반응식 3d에서 합성한 화합물 12(230mg, 488.65mmol, 1eq.)를 넣고, 20℃에서 15분간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.3)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 탄산수소나트륨(NaHCO3 soln.)으로 pH 7~8로 맞춘 후, 정제수와 MC를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 후, 농축하여 목적화합물 13을 얻었다.
[반응식 3f]
Figure pat00021
N2-퍼지(purge)하에서 MC 100mml에 상기 반응식 3e에서 합성한 화합물 13(181mg, 488.44mmol, 1eq.), 리놀레산(Linoleic acid, 1.2eq.), EDCI(1.2eq.), HOBt(1.2eq.)와 TEA(4eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간동안 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.7)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=1:1 → 3:1)으로 정제하여 목적화합물 14(EC-A44, R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=9.27%)
[실시예 23] 글리세롤 유도체 합성(EC-A45)
[반응식 4a]
Figure pat00022
MC 10ml에 상기 반응식 3c에서 합성한 화합물 11(500mg, 1.17mmol, 1eq.)과 TEA(1.1eq.)을 넣고, 0℃까지 냉각한 후, 메탄설포닐클로라이드(Methanesulfonyl chloride, 1.1eq.)를 천천히 적가한 후, 20℃에서 24시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=2:1, Rf=0.35)로 확인한다. 반응액에 정제수와 MC를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 후, 컬럼(PE:EA=1:1)으로 정제하고, 농축하여 목적화합물 15(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=32.05%)
[반응식 4b]
Figure pat00023
DMF(디메틸포름아미드, Dimethylformamide) 6ml에 상기 반응식 4a에서 합성한 화합물 15(300mg, 592.02mmol, 1eq.)와 아지드화 나트륨(Sodium azide, 2.4eq.)을 넣고, 50℃에서 24시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=2:1, Rf=0.35)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 탄산수소나트륨(NaHCO3 soln.)으로 pH 9이상을 맞춘 후, EA를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 컬럼(PE:EA= 1:1) 정제하고, 농축하여 목적화합물 16(R1=팔미토일)을 얻었다.
[반응식 4c]
Figure pat00024
N2-퍼지(purge)하에서 MeOH 10ml에 상기 반응식 4b에서 합성한 화합물 16(300mg, 661.29mmol, 1eq.)과 Pd/C(300mg)을 넣고, H2로 여러 번 탈기(degassing) 한 후, 20℃에서 H2 20psi를 유지하면서, 16시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.25)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응의 확인은 LC-MS(EW2692-141-P1A)로 확인했다. 반응이 완결되면 여과하여 제거하고, 농축하여 목적화합물 17(R1=팔미토일)을 얻었다.
[반응식 4d]
Figure pat00025
MC 3ml에 상기 반응식 4c에서 합성한 화합물 11(3000mg, 701.49mmole, 1eq.)을 넣고, 무수 아세트산(Acetic anhydride, 1.2eq.)을 0℃에서 TEA(1.4eq.)를 투입한 후, 20℃에서 16시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=20:1, Rf=0.3)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 MC를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 후, 농축하여 컬럼(MC:MeOH=20:1)으로 정제하고, 농축하여 목적화합물 18(R1=팔미토일)을 얻었다.
[반응식 4e]
Figure pat00026
MC 2ml와 트리플루오로아세트산(TFA) 200mL의 혼합용매에 상기 반응식 4d에서 합성한 화합물 18(50mg, 106.45mmol, 1eq.)을 넣고, 20℃에서 10분간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.3)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 탄산수소나트륨(NaHCO3 soln.)으로 pH 7~8로 맞춘후, 정제수와 MC를 투입하여 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(Brine soln.)으로 역수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 농축하여 목적화합물을 얻었다.
[반응식 4f]
Figure pat00027
N2-퍼지(purge)하에서 MC 1ml에 상기 반응식 4e에서 합성한 화합물 19(40mg, 108.23mmol, 1eq.), 리놀레산(Linoleic acid, 1.2eq.), EDCI(1.2eq.), HOBt(1.2eq.)와 TEA(6eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간동안 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.5)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼 (MC:MeOH=15:1)으로 정제하여 목적화합물 20(EC_A45, R1=팔미토일)을 얻었다. (수율=14.16%)
[실시예 24] 글리세롤 유도체 합성(EC-A07)
[반응식 5a]
Figure pat00028
N2-퍼지(purge)하에서 아세톤(Acetone) 40ml에 출발물질로써, 1-티오글리세롤(1-Thioglycerol, 2g, 18.49mmol, 1eq.), 피리디늄 파라-톨루엔설포네이트(pyridinium p-toluenesulfonate, 0.1eq.), 황산마그네슘(MgSO4, 1.5eq.)을 넣고, 25℃에서 48시간동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=5:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 여과하여 농축하고, 컬럼(PE:EA=100:1 → 50:1)으로 정제하여 목적화합물 21을 얻었다. (수율=14.16%)
[반응식 5b]
Figure pat00029
MC 1ml에 상기 반응식 5a에서 합성한 화합물 21(963.39mg, 6.5mmole, 1eq.), R1-OH(1.2eq.), DCC(1.4eq.)와 DMAP(0.2eq.)을 넣고, 20~25℃에서 18시간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=20:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=100:1 → 20:1)으로 정제하여 목적화합물 22(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=75.6%)
[반응식 5c]
Figure pat00030
정제수 100ml에 상기 반응식 5b에서 합성한 화합물 22(963.39mg, 6.5mmole, 1eq.), 아세트산(Acetic acid, 400ml)을 넣고, 100℃에서 10분간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=20:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 석유 에테르(Petroleum ether) 10ml로 재결정하여 목적화합물 23(R1=팔미토일)을 얻었다. (수율=90.13%)
[반응식 5d]
Figure pat00031
MC 6ml에 상기 반응식 5c에서 합성한 화합물 23(300mg, 865.63mmole, 1eq.), 터트-부틸디메틸실릴클로라이드(TBSCl, tert-Butyldimethylsilyl chloride, 1eq.)와 이미다졸(Imidazole, 4eq.)을 넣고, 25℃에서 2시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=5:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=5:1)으로 정제하여 목적화합물 24(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=52.39%)
[반응식 5e]
Figure pat00032
MC 3ml에 상기 반응식 5d에서 합성한 화합물 24(219.1mg, 475.44mmole, 1eq.), 리놀레산(Linoleic acid, 1.2eq.), DCC(1.2eq.)와 DMAP(0.2eq.)을 넣고, 20~25℃에서 18시간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=20:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=10:1)으로 정제하여 목적화합물 25(R1=팔미토일)를 얻었다. (수율=44.2%)
[반응식 5f]
Figure pat00033
MC 2ml에 상기 반응식 5e에서 합성한 화합물 25(50mg, 69.13mmole, 1eq.), 무수 아세트산(Acetic anhydride, 3eq.), 테트라-노르말-부틸암모늄브로마이드 (Tetra-n-butylammonium bromide, 2eq.)와 트리메틸브로모실란(Trimethyl bormosilane, 1.5eq.)을 넣고, 50℃에서 18시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=10:1)으로 정제하여 목적화합물 26(EC_A07, R1=팔미토일)을 얻었다. (수율=52.77%)
[실시예 25] 글리세롤 유도체 합성(EC-A12)
[반응식 6a]
Figure pat00034
N2-퍼지(purge)하에서 1.5ml의 석유에테르(PE, petroleum ether)에 출발물질로써, 글리시딜 클로라이드(Glycidyl chloride, 832.68mg, 9.0mmol, 1.8eq.), 팔미트산(Palmitic acid, 1eq), 수산화나트륨 (NaOH, 1.8eq.) 및 촉매로서 테트라노르말부틸암모늄브로마이드(n-Bu4NBr, 0.05 eq.)을 넣고, 50℃로 승온하고 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 30ml의 PE로 묽힌 후, 여과하였다. 유기층을 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하고, 여과한 후 농축한 다음, 플래시 칼럼(flash column, PE:EA(에틸아세테이트)=50:1)으로 정제하여 목적 화합물 43을 얻었다(P=팔미토일, 수율=63.65%).
[반응식 6b]
Figure pat00035
MC 2ml에 상기 반응식 6a에서 합성한 화합물 43(200mg, 640.02mmole, 1eq.)과 칼륨티오아세테이트(KSAc, 0.25eq.)를 녹인 용액에 티오아세트산(AcSH, 2.5eq.)을 넣고 15℃에서 65시간 동안 강교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=5:1)로 확인한다. 반응이 완결되면 농축하고, 컬럼(PE:EA=3:1)으로 정제하여 목적화합물 44를 얻었다.(P=팔미토일, 수율=44.23%)
[반응식 6c]
Figure pat00036
MC 600ml에 상기 반응식 6b에서 합성한 화합물 44(40mg, 102.93mmole, 1eq.), 리놀레산(Linoleic acid, 1.5eq.), DCC(1.05eq.), DMAP(0.1eq.)을 넣고 15℃에서 14시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1)로 확인한다. 반응이 완결되면 여과한 후, MC와 정제수로 추출하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 수분을 제거하고, 유기층을 농축한다. 컬럼(PE:EA=3:1)으로 정제하여 목적화합물 45를 얻었다.(EC-A12, P=팔미토일, L=리놀레오일, 수율=20.82%)
[실시예 26] 글리세롤 유도체 합성(EC-A05)
[반응식 7a]
Figure pat00037
무수(Anhydrous) MC 10ml에 리놀레산(Linoleic acid, 588.9mg, 2.1mmole, 1eq.)을 넣고 교반한다. 옥살릴클로라이드(Oxalyl chloride, Cl-CO-CO-Cl, 2eq.)을 MC 1.1ml에 녹여서, 반응 혼합물에 넣고 교반한다. MC 20ml에 DMF(0.1eq.)를 섞은 용액을 반응 혼합물에 넣고 20℃에서 1시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=5:1, Rf=0.3)로 확인한다. 반응이 완결되면, 반응물을 농축하여 얻은 조생성물인 리놀레익 클로라이드를 627.67mg을 다음 단계에 바로 사용한다. 0~10℃에서 THF 5ml에 위에서 합성한 리놀레익 클로라이드(Linoleic chloride)를 넣고 교반한다. 0~10℃를 유지하면서 THF 15ml에 출발물질인 2-머캅토-1,3-프로판디올(2-Mercapto-1,3-propanediol, 454.27mg, 4.2mmole, 2eq.)과 TEA(2eq.)를 섞은 용액을 위의 혼합물에 적가한 후, 동온도에서 1시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=20:1, Rf=0.2)로 확인한다. 반응이 완결되면 반응물을 Hex(헥산) 20ml로 희석하여 여과하고, 농축한다. 클로로포름(chloroform) 10ml에 녹인 후, 정제수로 수세하고, 유기층을 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 다음, 농축하여 컬럼(PE:EA=1:1)으로 정제하여 목적화합물 27을 얻었다. (L=리놀레오일, 수율= 59.05%)
[반응식 7b]
Figure pat00038
MC 9ml에 상기 반응식 7a에서 합성한 화합물 27(300mg, 809.52mmol, 1eq.), TEA(0.1eq.)을 넣고, 아세틸 클로라이드(Acetyl chloride, 0.8eq.)을 -10~0℃에서 천천히 적가한다. 반응물을 -10~0℃에서 15분 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=3:1, Rf=0.5)로 확인한다. SM이 50% 정도 남으면 반응을 종결한다. 정제수와 MC를 0℃에서 투입한 후, 3회 추출한다. 유기층을 브라인 용액(brine soln.)으로 역수세하고, 유기층을 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 다음, 농축하여 컬럼(PE:EA=3:1)으로 정제하여 목적화합물 28을 얻었다. (수율= 18.86%)
[반응식 7c]
Figure pat00039
MC 600ml에 상기 반응식 7b에서 합성한 화합물 28(60mg, 145.41mmole, 1eq.), 팔미트산(Palmitic acid, 1.05eq.), DCC(1.05eq.)와 DMAP(0.1eq.)을 넣고, 20~25℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1, Rf=0.5)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하고, 컬럼(PE:EA=10:1)으로 정제하여 목적화합물 29를 얻었다. (EC_A05, P=팔미토일, L=리놀레오일, 수율=24.1%)
[실시예 27] 글리세롤 유도체 합성(EC-A60)
[반응식 8a]
Figure pat00040
아세토니트릴(ACN, Acetonitrile) 140ml에 에탄아민(Ethanamine, 1.99g, 44.2mmole, 1eq.), TEA(5eq.)을 넣고, 출발물질인 아크릴로일클로라이드(Acryloyl chloride, 2.5eq.)을 0℃에서 천천히 적가한 후, 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=1:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 상기 반응액을 EA로 희석한 후, 순차적으로 1N-HCl, NaHCO3로 수세한 후, 브라인 용액(brine soln.)으로 한 번 더 수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 농축한다. 컬럼(PE:EA=20:1 → 3:1)으로 정제하여 목적화합물 30을 얻었다. (수율= 58.43%)
[반응식 8b]
Figure pat00041
아세톤(Acetone) 54ml와 정제수 36ml에 과망간산칼륨(KMNO4, 1.1eq.)을 녹인 후, -50℃로 냉각한다. 여기에 상기 반응식 8a에서 합성한 화합물 30(2.5g, 25.22mmole, 1eq.)을 천천히 적가한다. 동온도에서 10분간 교반한 후, 20℃까지 30분에 걸쳐 서서히 승온한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응물을 여과하고 농축하여 목적화합물 31을 얻었다.
[반응식 8c]
Figure pat00042
N,N-디메틸포름아미드(DMF, N,N-Dimethylformamide) 12ml에 상기 반응식 8b에서 합성한 화합물 31(2.2g, 16.52mmole, 1eq.), 터트부틸디메틸실릴클로라이드 (TBSCl, tert-Butyldimethylsilyl chloride, 1.2eq.)와 이미다졸(Imidazole, 2eq.)을 넣고, 20℃에서 3시간 교반한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1, Rf=0.65)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 EA를 넣고, 3회 추출한 후, 브라인 용액(brine soln.)으로 한 번 더 수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 후, 농축한다. 컬럼(PE:EA=20:1 → 2:1)으로 정제하여 목적화합물 32를 얻었다. (수율=28.14%)
[반응식 8d]
Figure pat00043
MC 8ml에 상기 반응식 8c에서 합성한 화합물 32(750mg, 3.03mmole, 1.05eq.), R1-OH(R1=탄소수 2내지 18의 카르보닐그룹, 1eq.), DCC(1eq.), DMAP(0.1eq.)을 넣고 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=3:1, Rf=0.75)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=50:1 → 5:1)으로 정제하여 목적화합물 33을 얻었다. (R1=리놀레오일, 수율= 58.45%)
[반응식 8e]
Figure pat00044
N2-퍼지(purge)하에서 MC 2ml에 상기 반응식 8d에서 합성한 화합물 33(850mg, 1.67mmole, 1eq.), 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(Triethylamine trihydrofluoride. 2eq.), 트리클로로무수아세트산(Trichloroacetic anhydride, 9eq.)을 25~30℃ 투입한다. 반응물을 80℃에서 2.5시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1, Rf=0.43)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=50:1 → 5:1)으로 정제하여 목적화합물 34를 얻었다. (R1= 리놀레오일, 수율= 81.4%)
[반응식 8f]
Figure pat00045
MeOH 10ml에 피리딘(Pyridine) 1ml, 상기 반응식 8e에서 합성한 화합물 34(800mg, 1.48mmol, 1eq.)을 넣고, 25℃에서 1시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=50:1, Rf=0.22)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=50:1 → 2:1)으로 정제하여 목적화합물 35를 얻었다. (R1= 리놀레오일, 수율= 56.37%)
[반응식 8g]
Figure pat00046
MC 4ml에 상기 반응식 8f에서 합성한 화합물 35(320mg, 808.96mmole, 1.2eq.), R2-OH(R2=탄소수 2 내지 18의 카르보닐그룹, 1eq.), DCC(1.2eq.), DMAP(0.2eq.)을 넣고 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=5:1, Rf=0.58)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=50:1 → 5:1)으로 정제하여 목적화합물 36을 얻었다. (EC-A60, R1=리놀레오일, R2=팔미토일, 수율 77.89%)
[실시예 28] 글리세롤 유도체 합성(EC-60A)
상기 실시예 27과 실질적으로 동일한 방법으로, 글리세롤 유도체 화합물을 합성하였으며, 본 목적화합물(EC-60A)의 구조는 상기 화합물 36에서 R1은 팔미토일, R2는 리놀레오일인 것이며, 최종 합성 단계의 수율은 62.14%이다.
[실시예 29] 글리세롤 유도체 합성(EC-A59)
[반응식 9a]
Figure pat00047
아세톤(Acetone) 45ml와 정제수 30ml에 과망간산칼륨(KMNO4, 1.1eq.)을 녹인 후, -50℃로 냉각한다. 여기에 출발물질인, 에틸 아크릴레이트(Ethyl acrylate, 2g, 19.976mmole, 1eq.)를 천천히 적가한다. 동온도에서 10분간 교반한 후, 20℃까지 30분에 걸쳐 서서히 승온한다. 반응은 TLC(MC:MeOH=10:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응물을 여과한 후, 정제수, 브라인 용액(brine soln.)과 EA로 3회 추출한 후, 황산마그네슘(MgSO4)으로 탈수하여 여과하고, 농축하여 목적화합물 37을 얻었다. (수율= 39%)
[반응식 9b]
Figure pat00048
MC 20ml에 상기 반응식 9a에서 합성한 화합물 37(1.05g, 7.83mmole, 1eq.), 터트부틸디메틸실릴클로라이드(TBSCl, tert-Butyldimethylsilyl chloride, 1.2eq.)와 이미다졸(Imidazole, 2eq.)을 넣고, 20℃에서 3시간 교반한다. 반응은 TLC(Hex:EA=1:1 or 9:1, Rf=0.4)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액에 정제수와 MC를 넣고, 3회 추출한 후, 브라인 용액(brine soln.)으로 한번 더 수세하고, 황산나트륨(Na2SO4)으로 탈수하여 여과한 후, 농축한다. 컬럼(Hex:EA=13:1)으로 정제하여 목적화합물 38을 얻었다. (수율= 72%)
[반응식 9c]
Figure pat00049
MC 6.5ml에 상기 반응식 9b에서 합성한 화합물 38(640mg, 2.58mmole, 1.05eq.), R1-OH(R1=탄소수 2 내지 18의 카르보닐그룹, 1eq.), DCC(1.05eq.), DMAP(0.1eq.)을 넣고 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(Hex:EA=13:1)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=200:1 → 100:1)으로 정제하여 목적화합물 39를 얻었다. (R1=리놀레오일, 수율=68.52%)
[반응식 9d]
Figure pat00050
N2-퍼지(purge)하에서 MC 5ml에 상기 반응식 9c에서 합성한 화합물 39(800mg, 1.57mmole, 1eq.), 트리에틸아민트리하이드로플루오라이드(Triethylamine trihydrofluoride, 2eq.), 트리클로로무수아세트산(Trichloroacetic anhydride, 9eq.)을 25~30℃ 투입한다. 반응물을 80℃에서 2.5시간 동안 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=20:1, Rf=0.43)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축하여 목적화합물 40(620mg, 조생성물(crude))을 얻었다. (R1=리놀레오일)
[반응식 9e]
Figure pat00051
MeOH 20ml에 피리딘(Pyridine) 2ml, 상기 반응식 9d에서 합성한 화합물 40(2g, 3.69mmol, 조생성물(crude))을 넣고, 25℃에서 1시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1, Rf=0.42)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한다. EA와 정제수를 투입하여 3회 추출하고, 황산나트륨(Na2SO4)로 탈수하여 여과한 후, 농축한다. 컬럼(PE:EA=100:1 → 20:1)으로 정제하여 목적화합물 41을 얻었다. (R1=리놀레오일, 수율=38.27%)
[반응식 9f]
Figure pat00052
MC 2ml에 상기 반응식 9e에서 합성한 화합물 41(200mg, 504.34mmole, 1.2eq.), R2-OH(R2=탄소수 2내지 18의 카르보닐그룹, 1eq.), DCC(1.21eq.), DMAP(0.2eq.)을 넣고 20℃에서 16시간 교반한다. 반응은 TLC(PE:EA=10:1, Rf=0.68)로 확인한다. SM은 완전히 소모된다. 반응액을 농축한 후, 컬럼(PE:EA=200:1 → 20:1)으로 정제하여 목적화합물 42를 얻었다. (EC-A59, R1=리놀레오일, R2=팔미토일, 수율=86.19%)
[실시예 30] 글리세롤 유도체 합성(EC-59A)
상기 실시예 29와 실질적으로 동일한 방법으로, 글리세롤 유도체 화합물을 합성하였으며, 본 목적화합물(EC-59A)의 구조는 상기 화합물 42에서 R1은 팔미토일, R2는 리놀레오일인 것이며, 최종 합성 단계의 수율은 80.94%이다.
[실험예 1] LPS로 유도된 IL-6 분비 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, 마우스 macrophage 계열의 세포인 RAW264.7 세포를 1×105cells/㎖ 농도로 배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 RAW264.7 세포를 5×104cells/㎖로 48 well plate에 접종하여 15시간 안정화 시킨 후, 하기 표 2와 표 3에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 배양액을 처리하였다. 1시간 후, 세포 자극원으로 Lipopolysaccaride(LPS)를 1㎍/㎖을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액 0.5 ㎖을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 IL-6 수준을 Mouse IL-6 ELISA set (BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-6 capture 항체(antibody)를 인산 완충 용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 microwell에 코팅(Coating)한 후 4 ℃에서 밤샘(overnight) 보관하였다. 각 well을 3회 워싱(washing) 완충 용액으로 세척한 후에 2% Bovine Serum Albumin(BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 이후 3회 워싱 완충용액으로 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 sample을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 워싱 완충 용액으로 3회 세척하고 희석한 Detection antibody를 각 웰(well)에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 워싱 완충 용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 발현감소율의 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) IL-6 concentration (㎍/㎕, 평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 0.045 ± 0.001
2 DMSO 1 % 0.045 ± 0.004
3 LPS 1 0.262 ± 0.008
4 EC-18 100 0.194 ± 0.011
5 EC_A04 100 0.141 ± 0.016
6 EC_A04_2 100 0.048 ± 0.003
7 EC_A04_3 100 0.043 ± 0.000
8 EC_A05 100 0.164 ± 0.012
9 EC_A06 100 0.168 ± 0.004
10 EC_A06A 100 0.180 ± 0.011
11 EC_A11 100 0.257 ± 0.029
12 EC_A12 100 0.245 ± 0.003
13 EC_A44 100 0.197 ± 0.031
14 EC_A59 100 0.174 ± 0.033
15 EC_A59A 100 0.168 ± 0.044
16 EC_A60 100 0.187 ± 0.000
17 EC_A60A 100 0.178 ± 0.001
18 EC_A73 100 0.183 ± 0.000
19 EC_A73A 100 0.130 ± 0.006
20 EC_A74 100 0.187 ± 0.006
21 EC_A75 100 0.170 ± 0.071
22 EC_A76 100 0.167 ± 0.019
23 EC_A77 100 0.171 ± 0.032
시료 농도(㎍/㎖) IL-6 concentration ( pg /㎕, 평균 ± 편차)
2 DMSO 1 % 0.588 ± 0.003
3 LPS 1 1.526 ± 0.077
4 EC-18 100 1.159 ± 0.036
5 EC_A104 100 1.293 ± 0.000
6 EC_A105 100 1.163 ± 0.074
7 EC_A106 100 1.139 ± 0.010
8 EC_A107 100 1.462 ± 0.180
9 EC_A111 100 1.562 ± 0.127
10 EC_A112 100 1.312 ± 0.170
11 EC_A113 100 1.417 ± 0.159
12 EC_A114 100 1.394 ± 0.072
도 1 및 도 2는 LPS로 유도된 IL-6 분비의 정도를 나타낸 상기 표 2와 표 3의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 2, 표 3, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, RAW264.7 세포에 염증유발인자인 LPS를 처리하면 음성대조군에 비해 약 6-10배 정도 염증사이토카인인 IL-6 분비가 증가되는데, 이미 염증사이토카인의 발현을 저해하는 물질인 EC-18 (1-팔미토일-2-리놀레오일-3-아세틸글리세롤, PLAG) 화합물이가 첨가되면 LPS 처리군보다도 약 30% 정도가 발현이 감소하였고 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 경우 EC-18(PLAG)와 유사하거나 혹은 더 많이 IL-6 발현을 저해하는 유도체로는 A04, A04-2, A04-3, A05, A06, A06A, A44, A59, A59A, A60, A60A, A73, A73A, A74, A75, A76, A77, A105, A106이 있으며 적게는 30%, 많게는 50%까지 RAW264.7 세포에서 IL-6 사이토카인 분비가 감소됨을 확인하였다. 특히, A04-2와A04-3 화합물은 LPS를 처리하지 않은 음성대조군의 IL-6 발현 정도를 나타내며 LPS의 활성을 완전히 저해하였다.
[실험예 2] IL-6로 유도된 STAT3 활성화 감소
STAT3 활성능 확인하는 방법으로 두가지 실험으로 진행하였다. 첫번째는 HEK-BlueTM IL-6 세포를 이용하여 STAT3 유도 SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) 발현으로 활성정도를 확인하는 방법이고, 두번째는 STAT3와 결합하는 sis-Inducible Element를 포함하는 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] 벡터를 RAW264.7 세포에 주입하여 STAT3 활성정도를 확인하는 방법이다. 하기 표 4는 첫번째 방법을 이용하여 본 발명의 유도체 화합물의 STAT3활성 저해능을 확인하였다.
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, HEK-BlueTM IL-6 세포를 1×105cells/㎖ 농도로 배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 HEK-BlueTM IL-6 세포를 1×105cells/well로 접종하여 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 배양액에 처리하고 난 후, STAT3 활성을 위하여 IL-6 (5ng/ml)을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양 상층액을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 SEAP 발현 수준을 Quanti blue reagent와 상층액을 1:10비율로 섞어 약 30분간 37 °C에서 방치한 후 Spectrophotometer를 이용해 650nm 파장에서 SEAP 농도를 확인하였고 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) STAT3 activity_ SEAP expression ( % ) (평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 100
2 IL-6 5 ng/ml 228.8 ± 17.0
3 EC_18 100 173.0 ± 7.9
4 EC_A04 100 177.2 ± 18.4
5 EC_A04_2 100 85.4 ±9.4
6 EC_A04_3 100 85.9 ±6.4
7 EC_A05 100 201.6 ±34.6
8 EC_A06 100 164.8 ± 16.3
9 EC_A11 100 167.4 ± 9.8
10 EC_A12 100 174.9 ± 12.1
11 EC_A44 100 236.5 ± 55.9
도 3은 IL-6로 유도된 STAT3 활성화 정도를 나타낸 상기 표 4의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 4와 도 3에 나타난 바와 같이, HEK-BlueTM IL-6 세포에 IL-6 사이토카인을 처리하면 음성대조군에 비해 STAT3 활성이 약 2.3배가 증가되는데, EC-18(PLAG) 처리군은 LPS 처리군에 비해 약 25% 정도 STAT3 활성이 감소되었다. 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 경우, 대개 EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 STAT3활성을 감소시키는 유도체로는 A04, A06, A11 A12가 있으며 대부분이 약 25 % 정도 STAT3 활성을 감소시킴을 확인하였다. A04-2와 A04-3의 경우는 IL-6를 처리하지 않은 음성대조군 만큼이나 LPS에 의한 STAT3 활성을 저해함을 확인하였다.
[실험예 3] IL-6로 유도된 STAT3 활성화 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, RAW264.7 세포를 1×105cells/㎖ 농도로 배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 RAW264.7 세포를 1×105cells/well로 48 well plate에 접종하여 18시간 안정화시켰다. 이후 sis-Inducible Element를 포함하는 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] 벡터를 Attractene과 함께 섞어 실온에서 15분간 복합체 형성을 유도시킨다. 이 복합체를 세포에 처리한 후 18시간 추가 배양을 하였다. 추가 배양 이후 각 well에 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 배양액에 처리하고 난 후, STAT3 활성을 위하여 LPS (1㎍/ml)을 18시간 동안 추가로 배양하였다. 18시간 후에 각 well 당 배양 상층액을 제거하고 남아있는 세포를 Cell lysis buffer로 lysis 시킨 후 cell lysate를 회수한다. 회수한 cell lysate 10㎕에 luciferase reagent 90㎕를 섞어 Luminometer를 사용하여 형광정도를 확인하였고 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) STAT3 activity_ Luciferase activity (평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 100.00 ± 0.00
2 DMSO 1 % 73.26 ± 4.54
3 LPS 1 857.47 ± 12.13
4 EC-18 100 393.64 ± 46.12
5 EC_A59 100 392.97 ± 40.30
6 EC_A59A 100 410.32 ± 5.35
7 EC_A60 100 572.19 ± 40.59
8 EC_A60A 100 717.94 ± 25.68
9 EC_A73 100 451.22 ± 166.71
10 EC_A73A 100 649.59 ± 274.69
11 EC_A74 100 484.95 ± 29.86
12 EC_A75 100 727.51 ± 117.37
13 EC_A76 100 786.72 ± 202.75
14 EC_A77 100 500.37 ± 63.45
15 EC_A104 100 402.47 ± 55.50
16 EC_A105 100 458.80 ± 20.98
17 EC_A106 100 485.49 ± 6.45
18 EC_A107 100 541.13 ± 98.80
19 EC_A111 100 339.58 ± 20.40
20 EC_A112 100 470.22 ± 13.74
21 EC_A113 100 421.60 ± 29.72
22 EC_A114 100 382.48 ± 54.41
도 4는 IL-6로 유도된 STAT3 활성화 정도를 나타낸 상기 표 5의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 5와 도 4에 나타난 바와 같이, RAW264.7 세포에 LPS를 처리하면 음성대조군에 비해 STAT3 활성이 약 8.5배가 증가되는데, EC-18 (PLAG) 처리군은 약 50%까지 활성이 감소되었고, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 경우, EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 STAT3활성을 감소시키는 유도체로는 A59, A59A, A104, A111, A113, A114가 있음을 확인하였다.
[실험예 4] THP-1 세포에서의 CXCL8 (IL-8) 발현 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI(Hyclone, Thermo Scientific)배지에, 인간 macrophage 계열의 세포인 THP-1 세포를 1×105 cells/㎖ 의 농도로 배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 THP-1세포를 1×106 cells/㎖로 12 well plate에 접종하여 30분간 안정화 시킨 후, 하기 표 6에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 상기배양액을 처리한다. 1시간 후, 세포 자극원으로 Gemcitabine (2㎍/㎖)을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양상층액 1.5㎖을 회수하여 원심분리기(3000rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수한다. 회수된 상층액에서 CXCL8(IL-8) 수준을 human IL-8 ELISA set(BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-8 capture 항체(antibody)를 인산완충용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 microwell에 코팅(Coating) 한 후 4 ℃에서 overnight 하여 보관하였다. 각 well을 3회 워싱(washing) 완충 용액으로 세척한 후에 2% Bovine Serum Albumin(BSA)으로 1시간 동안 실온에서 blocking 하였다. 이후 3회 워싱 완충 용액으로 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 sample을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후 워싱 완충 용액으로 3회 세척하고 희석한 Detection antibody를 각 well 에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 워싱 완충 용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 발현 증가율의 결과는 하기 표 6과 같았다.
시료 농도(㎍/㎖) CXCL8 [IL-8] concentration ( pg /㎕, 평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 7.9 ± 0.0
2 Gemcitabine 2 104.6 ± 1.5
3 EC_18 100 79.6 ± 6.0
4 EC_A04 100 124.2 ± 0.5
5 EC_A04_2 100 141.6 ± 0.0
6 EC_A04_3 100 68.5 ± 0.2
7 EC_A05 100 84.6 ± 0.0
8 EC_A06 100 96.8 ± 8.3
9 EC_A06A 100 228.7 ± 1.0
10 EC_A44 100 228.7 ± 1.0
11 EC_A45 100 82.0 ± 2.0
12 EC_A59 100 79.6 ± 2.3
13 EC_A59A 100 116.6 ± 2.8
14 EC_A73A 100 100.9 ± 3.6
15 EC_A74 100 114.4 ± 3.9
16 EC_A75 100 110.9 ± 8.9
17 EC_A76 100 225.9 ± 7.0
18 EC_A104 100 113.6 ± 5.4
19 EC_A105 100 112.3 ± 1.8
20 EC_A106 100 115.7 ± 4.3
21 EC_A107 100 107.6 ± 3.4
22 EC_A111 100 92.0 ± 7.2
23 EC_A112 100 106.5 ± 8.2
24 EC_A113 100 113.1 ± 11.1
25 EC_A114 100 120.2 ± 4.3
도 5는 THP-1 세포에서의 CXCL8 (IL-8) 발현 정도를 나타낸 상기 표 6의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 6과 도 5에서 나타난 바와 같이, THP-1 세포에 항암제 일종인 Gemcitabine을 처리하면 음성대조군에 비해 약 13배 정도 호중구 세포 모집인자인 CXCL8(IL-8) 케모카인의 분비를 증가시키는데, EC-18(PLAG) 처리하면 약 20% 정도 CXCL8 발현을 감소시켰으며 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 처리가 첨가되면 EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 CXCL8(IL-8) 케모카인의 분비를 감소시키는 유도체로는 A04-3, A05, A44, A45가 있으며 A04-3의 경우 약 35% 정도까지 감소시킴을 확인하였다.
[실험예 5] Transwell을 이용한 HL -60 세포주의 이동 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI(Hyclone, Thermo Scientific)배지에, 인간 macrophage 계열의 세포인 THP-1 세포를 1×105 cells/㎖ 의 농도로 계대배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. Transmigration assay 시 하부 well에 처리할 THP-1 세포 배양액을 준비하기 위하여, 우선 배양하던 THP-1세포를 1×106 cells/㎖ 로 12 well plate에 접종하여 30분간 안정화 시킨 후, 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 상기배양액에 처리한다. 1시간 후, 세포 자극원으로 Gemcitabine (2㎍/㎖)을 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 24시간 후에 각 well 당 배양상층액 1.5㎖을 회수하여 원심분리기(3000rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수한다. 회수한 상층액을 Cultrex 96 well Laminin Cell Invasion assay에서 제공하는 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 본 실험인 Transmigration assay를 수행하기 하루 전날 상부의 Invasion Chamber에 1 × Lamin I 용액을 처리하여 코팅하였다. 24시간후 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI1640 배지에 배양한 HL-60 세포를 5 × 104 cells/chamber로 분주하고 하부의 chamber 에는 미리 준비한 THP-1 배양 상층액을 150㎕씩 넣어 주었다. 24시간 동안 배양한 후, 상부 Chamber를 제거하고 하부 chamber를 원심분리기로 세포를 chamber 바닥에 부착하고 상층액은 제거하였다. Cell dissociation/Calcein-AM 용액을 넣어서 1시간 반응시킨 후, 형광 spectrometer를 이용하여 나온 값을 세포수로 환산하여 계산하였고 HL-60 세포의 이동 감소 결과는 하기 표 7과 같다.
시료 농도(㎍/㎖) Transwell을 통하여 이동한 HL -60 세포수 (Cell Number)
1 음성대조군 0 2582.6
2 Gemcitabine 2 5022.9
3 EC_18 100 2697.2
4 EC_A04 100 11116.7
5 EC_A04_2 100 4346.3
6 EC_A04_3 100 11646.2
7 EC_A05 100 17283.8
9 EC_A06A 100 11719.5
10 EC_A44 100 9320.6
11 EC_A45 100 16343.3
12 EC_A59 100 15130.2
13 EC_A59A 100 4714.8
14 EC_A73A 100 2527.7
15 EC_A75 100 3140.9
16 EC_A76 100 5338.4
17 EC_A104 100 6901.7
18 EC_A111 100 4899.9
도 6은 Transwell을 이용한 HL-60 세포주의 이동 정도를 나타낸 상기 표 7의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 7과 도 6에서 나타난 바와 같이, THP-1 세포에 항암제 일종인 Gemcitabine을 처리하면 음성대조군에 비해 약 2배 정도 호중구 세포이동이 증가하였고, EC-18(PLAG)를 처리하면 음성대조군과 유사하게 HL-60 세포의 이동이 감소하였다. 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 처리가 첨가되면 EC-18(PLAG)와 유사하게 세포이동을 감소시키는 유도체로는 A73와 A75가 있음을 확인하였다.
[실험예 6] IL-4로 유도된 STAT6 활성화 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, A549 세포를 1×105cells/㎖ 농도로 계대배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 A549 세포를 1×105cells/well로 48 well plate에 접종하여 18시간 안정화시켰다. 이후 STAT6 결합 promoter 부분을 포함하는 pGL4-STAT6 reporter 벡터를 Attractene과 함께 섞어 실온에서 15분간 복합체 형성을 유도시킨다. 이 복합체를 세포에 처리한 후 24시간 추가 배양을 하였다. 추가 배양 이후 각 well에 하기 표 8과 표 9에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 1시간 배양액에 처리하고 난 후, STAT6 활성을 위하여 IL-4(2ng/ml 또는 10ng/ml)을 20시간 동안 추가로 배양하였다. 20시간 후에 각 well 당 배양 상층액을 제거하고 남아있는 세포를 세포 용해 완충액(Cell lysis buffer)으로 용해(lysis) 시킨 후 세포 용해물(cell lysate)을 회수한다. 회수한 세포 용해물(cell lysate) 10㎕에 루시페라아제 시약(luciferase reagent) 90㎕를 섞어 루미노미터(Luminometer)를 사용하여 형광 정도를 확인하였고, 그 결과는 하기 표 8 및 표 9에 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) STAT6 activity_ Luciferase activity (평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 8.5 ± 1.2
2 IL-4 2 982.0 ± 38.7
3 EC_18 100 462.5 ± 161.7
4 EC-A04 100 1026 ± 275.9
5 EC-A04-2 100 175.5 ± 28.2
6 EC-A04_3 100 123.2 ± 11.5
7 EC-A05 100 739.5 ± 197.6
8 EC-A06 100 570.7 ± 52.9
9 EC-A11 100 953 ± 98.9
10 EC-A12 100 549.5 ± 96.5
11 EC-A44 100 974.2 ± 37.4
시료 농도(㎍/㎖) STAT6 activity_ Luciferase activity (평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 12.5 ± 0.7
2 IL-4 10 2134.5 ± 17.6
3 EC_18 100 1281.5 ± 26.1
4 EC_A59 100 1129 ± 5.6
5 EC_A59A 100 2127.5 ± 4.9
6 EC_A60 100 2534.5 ± 40.3
7 EC_60A 100 1034.5 ± 12.0
8 EC_A73 100 1176 ± 1.4
9 EC_A73A 100 625.5 ± 7.7
10 EC_A74 100 2450 ± 16.9
11 EC_A75 100 2308 ± 4.2
12 EC_A76 100 1438 ± 7.0
13 EC_A77 100 1819 ± 2.8
14 EC_06A 100 1552.5 ± 9.1
도 7 및 도 8은 IL-4로 유도된 STAT6 활성화 정도를 나타낸 상기 표 8 및 표 9의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 8과 9 및 도 7과 8에 나타난 바와 같이, A549 세포에 IL-4를 처리하면 음성대조군에 비해 STAT6 활성이 IL-4 처리량에 따라 약 120배에서 2000배까지 증가되는데, EC-18 (PLAG) 처리하면 약 50%까지 STAT6 활성을 감소시켰다. 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 경우, EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 유의하게 STAT6 활성을 감소시키는 유도체로는 A04-2, A04-3, A06, A12, A59, A60A, A73, A73A, A76이 있으며, 대부분 EC-18 처리군 결과와 유사한 정도로 STAT6 활성이 감소함을 확인하였다. 그 중에서, A04-2, A04-3, A73A의 경우는 EC-18 처리군보다 월등히 STAT6 활성을 최대 약 80%까지 감소시킴을 확인하였다.
[실험예 7] PKC activator로 유도된 IL-4 분비 감소
소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 DMEM(Hyclone, Thermo Scientific) 배지에, 마우스 림프종(lymphoma) 계열의 세포인 EL-4 세포를 1×105cells/㎖ 농도로 계대배양하여 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37 ℃로 세포를 유지하고 배양하였다. 배양하던 EL-4 세포를 5×104cells/㎖로 48 well plate에 접종하여 30분간 안정화 시킨 후, 하기 표 10과 표 11에 나타낸 바와 같은 종류의 글리세롤 유도체 화합물로 2시간 배양액을 처리하였다. 2시간 후, 세포 자극원으로 PKC activator(p10, PMA 일종) 0.5㎍/㎖을 처리하고 18시간 동안 추가로 배양하였다. 18시간 후에 각 well 당 배양 상층액 0.5㎖을 회수하여 원심분리기(3000 rpm, 5분간)를 이용하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에서 IL-4 수준을 Mouse IL-4 ELISA set(BD Biosciences)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 측정하였다. ELISA 시행 전날 IL-4 포획 항체(capture antibody)를 인산 완충 용액(phosphate buffered saline)에 희석하여 microwell에 코팅(Coating) 한 후 4 ℃에서 밤샘(overnight) 보관하였다. 각 well을 3회 워싱(washing) 완충 용액으로 세척한 후에 2% Bovine Serum Albumin(BSA)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 이후 3회 워싱 완충용액으로 세척한 다음, 각 well에 100㎕씩 샘플(sample)을 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후, 워싱 완충 용액으로 3회 세척하고 희석한 검출 항체(Detection antibody)를 각 웰(well)에 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 실온 방치한 후, 2차 HRP conjugated 항체를 30분간 실온에서 반응시킨 후, 워싱 완충용액으로 3회 세척하고 각 Well 당 50㎕ Stop 용액을 처리한 후 ELISA microplate leader 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 발현감소율의 결과를 하기 표 10 및 표 11에 나타내었다.
시료 농도(㎍/㎖) IL-4 concentration ( pg /㎕, 평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 1.5 ± 1.2
2 PKC activator 1 910.6 ± 25.7
3 EC-18 100 662.4 ± 42.4
4 EC_A59 100 1027.4 ± 22.4
5 EC_A59A 100 955.1 ± 26.9
6 EC_A60 100 899.2 ± 61.0
7 EC_60A 100 774.7 ± 187.0
8 EC_A73 100 1424.7 ± 210.2
9 EC_A73A 100 792 ± 220.4
10 EC_A74 100 627 ± 3.8
11 EC_A75 100 728.8 ± 23.1
12 EC_A76 100 933.3 ± 140.1
13 EC_A77 100 721.0 ± 89.3
14 EC_A06A 100 778.8 ± 86.1
15 EC_A06 100 912.9 ± 10.9
시료 농도(㎍/㎖) IL-4 concentration ( pg /㎕, 평균 ± 편차)
1 음성대조군 0 0.6 ± 0.0
2 PKC activator 1 462.5 ± 57.1
3 EC-18 100 189.8 ±38.5
4 EC_A104 100 183.2 ± 56.4
5 EC_A105 100 154.7 ± 6.6
6 EC_A106 100 166.9 ± 15.7
7 EC_A107 100 175.0 ± 17.3
8 EC_A111 100 165.6 ± 20.1
9 EC_A112 100 171.6 ± 18.1
10 EC_A113 100 198.5 ± 26.0
11 EC_A114 100 277.8 ± 61.2
도 9 및 도 10은 PKC activator로 유도된 IL-4 분비 정도를 나타낸 상기 표 10 및 표 11의 값을 도표로 나타낸 것이다. 상기 표 10, 표 11, 도 9 및 도 10에서 나타난 바와 같이, 마우스 EL-4 세포에 PKC activator를 처리하면 음성대조군에 비해 급격하게 IL-4 사이토카인의 분비를 증가시키는데, EC-18(PLAG) 처리하면 약 20%에서 60% 정도까지 IL-4 발현을 감소시켰으며, 본 발명의 글리세롤 유도체 화합물의 처리가 첨가되면 EC-18(PLAG)와 유사한 정도로 IL-4 케모카인의 분비를 감소시키는 유도체로는 A74, A75, A77, A104, A105, A106, A107, A111, A112, A113이 있으며 약 20%에서 60%까지 감소시킴을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체.
    [화학식 2]
    Figure pat00053

    상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.

    [화학식 3]
    Figure pat00054

    상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9(여기서, R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다.)이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R4는 아세틸(Acetyl), 팔미토일(Palmitoyl), 리놀레오일(Linoleoyl) 또는 미리스토일(Myristoyl)이며, R5는 메칠(Methyl), 에틸(ethyl), 프로필(Propyl), 부틸(Butyl), 펜타데실(Pentadexyl), 헵타데실-8,11-다이엔(heptadecyl-8,11-diene), 1-메틸프로필(1,1-Methylpropyl), t-부틸(tert-butyl), 사이클로프로필(cyclopropyl), 사이클로헥실(cyclohexyl)인 것인, 글리세롤 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 R6 및 R7은 각각 독립적으로 팔미토일(Palmitoyl) 또는 리놀레오일(Linoleoyl)이며, R9는 에틸(ethyl)인 것인, 글리세롤 유도체.
  4. 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역조절제.
    [화학식 2]
    Figure pat00055

    상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.
    [화학식 3]
    Figure pat00056

    상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9(여기서, R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다.)이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 글리세롤 유도체는 IL-4, IL-6, CXCL8(IL-8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염증 사이토카인의 과발현을 억제하는 것인, 면역조절제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 글리세롤 유도체는 박테리아 또는 바이러스 감염 질환, 급, 만성 염증 폐질환, 폐렴, 자가면역질환, 알러지 질환 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역 질환을 예방 또는 치료하는 것인, 면역조절제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 글리세롤 유도체의 함량은 0.0001 내지 100.0 중량%인 것인 면역조절제.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 면역조절제를 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절 방법.
  9. 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 글리세롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역조절용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 2]
    Figure pat00057

    상기 화학식 2에서, R1, R2 및 R3는 적어도 하나는 -NHR4 또는 -SR4(여기서, R4는 탄소수 2 내지 18의 사슬형 지방산기이다.)이며, 나머지는 -OC(=O)R5(여기서, R5은 탄소수 1 내지 17의 사슬형 또는 가지형 지방족 탄화수소기 또는 탄소수 3 내지 6의 고리형 지방족 탄화수소기이다.) 또는 -OH 이다.

    [화학식 3]
    Figure pat00058

    상기 화학식 3에서, R6 및 R7은 각각 독립적으로 탄소수 2 내지 18의 지방산기이고, R8은 -OR9 또는-NHR9(여기서, R9는 탄소수 1 내지 3의 알킬기이다.)이다.
KR1020180046890A 2018-04-23 2018-04-23 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제 KR102062291B1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180046890A KR102062291B1 (ko) 2018-04-23 2018-04-23 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제
JP2020558931A JP7105916B2 (ja) 2018-04-23 2019-04-19 グリセロール誘導体、これの製造方法及びこれを有効成分として含有する免疫調節剤
EP19792728.8A EP3778558A4 (en) 2018-04-23 2019-04-19 GLYCEROL DERIVATIVE, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND IMMUNE MODULATOR CONTAINING THIS AS AN ACTIVE INGREDIENT
PCT/KR2019/004789 WO2019208980A1 (ko) 2018-04-23 2019-04-19 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제
CN201980027923.7A CN112041297B (zh) 2018-04-23 2019-04-19 甘油衍生物、其制备方法以及包含其作为有效成分的免疫调节剂
US17/047,123 US20210198183A1 (en) 2018-04-23 2019-04-19 Glycerol derivative, preparation method therefor, and immunomodulator comprising same as effective ingredient

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180046890A KR102062291B1 (ko) 2018-04-23 2018-04-23 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190123123A true KR20190123123A (ko) 2019-10-31
KR102062291B1 KR102062291B1 (ko) 2020-01-03

Family

ID=68293615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180046890A KR102062291B1 (ko) 2018-04-23 2018-04-23 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210198183A1 (ko)
EP (1) EP3778558A4 (ko)
JP (1) JP7105916B2 (ko)
KR (1) KR102062291B1 (ko)
CN (1) CN112041297B (ko)
WO (1) WO2019208980A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050208015A1 (en) * 2002-09-26 2005-09-22 Tecno Network Shikoku Co., Ltd Glycerol derivative
KR100885679B1 (ko) * 2004-04-24 2009-02-25 주식회사 엔지켐 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물을 유효성분으로함유하는 건강식품
KR101621863B1 (ko) * 2013-08-19 2016-06-01 한국생명공학연구원 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2820893C2 (de) * 1978-05-12 1986-02-20 A. Nattermann & Cie GmbH, 5000 Köln Strukturanaloga von natürlichen Phospholipiden und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen
DE2820892A1 (de) * 1978-05-12 1979-11-22 Nattermann A & Cie Neue strukturanaloga von glyveriden und verfahren zu deren herstellung
US5059442A (en) * 1989-09-19 1991-10-22 Nabisco Brands, Inc. Primary amide esters as low calorie fat mimetics
EP1534068A4 (en) 2002-08-08 2006-08-23 Univ Georgia Res Found COMPOSITIONS AND METHODS FOR NEURONAL DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
NZ552205A (en) 2006-12-20 2009-10-30 Ind Res Ltd Phosphatidylinositol mannosides and analogues thereof
ES2704439T3 (es) 2007-03-20 2019-03-18 Scf Pharma Inc Composiciones que comprenden monoglicéridos de ácidos grasos poliinsaturados o derivados de los mismos y usos de los mismos
IL187247A0 (en) * 2007-11-08 2008-12-29 Hadasit Med Res Service Novel synthetic analogs of sphingolipids
KR20110088991A (ko) * 2010-01-29 2011-08-04 부산대학교 산학협력단 신규 카나비노이드 유도체 및 이의 의학적 용도
WO2016086136A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Catabasis Pharmaceuticals, Inc. Fatty acid cysteamine conjugates of cftr modulators and their use in treating medical disorders
AU2016332266B2 (en) * 2015-09-30 2020-05-07 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050208015A1 (en) * 2002-09-26 2005-09-22 Tecno Network Shikoku Co., Ltd Glycerol derivative
KR100885679B1 (ko) * 2004-04-24 2009-02-25 주식회사 엔지켐 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물을 유효성분으로함유하는 건강식품
KR101621863B1 (ko) * 2013-08-19 2016-06-01 한국생명공학연구원 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STN 검색 자료* *
논문 J. Molecular Catalysis B Enzymatic(2008)* *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3778558A1 (en) 2021-02-17
CN112041297A (zh) 2020-12-04
KR102062291B1 (ko) 2020-01-03
JP2021519807A (ja) 2021-08-12
US20210198183A1 (en) 2021-07-01
JP7105916B2 (ja) 2022-07-25
EP3778558A4 (en) 2022-08-10
WO2019208980A1 (ko) 2019-10-31
CN112041297B (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101621851B1 (ko) 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액암 또는 암전이 억제용 조성물
EP3750867B1 (en) 1,2-diacylglycerol compound, preparation method therefor, and immunomodulator containing same as active ingredient
KR101710474B1 (ko) 갈아마이드 유도체 및 이의 용도
TW202304497A (zh) 新穎多酚化合物
KR102016078B1 (ko) 심장 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR102062291B1 (ko) 글리세롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 면역조절제
KR20000075824A (ko) 화합물
KR101927209B1 (ko) 멜라토닌 유도체를 포함하는 염증성 질환, 알러지 질환 또는 암 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2022254868A1 (ja) 新規イソフラボン化合物
KR20140001067A (ko) 밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드를 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물
KR20200029772A (ko) 베르베논 유도체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물
KR20120056243A (ko) 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물
JP6368270B2 (ja) モニエロサイドａ及びその誘導体、又はそれを有効成分として含有する医薬用組成物、健康食品又は化粧品
JP7050174B2 (ja) ジアシルグリセロールラクトン化合物、その製造方法及びこれを有効成分として含有する免疫増進剤
JP7334927B2 (ja) 抗がん剤
JP2018070518A (ja) フェルラ酸誘導体含有組成物及びその製造方法
KR101839356B1 (ko) 프리마퀸을 포함하는, 암 줄기세포 성장 억제용 조성물
KR101323157B1 (ko) 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산을 함유하는 암 전이 억제용 약학 조성물
KR20200053272A (ko) 신규 페룰산 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right