KR20140001067A

KR20140001067A - 밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드를 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물

Info

Publication number: KR20140001067A
Application number: KR1020120110821A
Authority: KR
Inventors: 오좌섭; 안은경; 홍성수; 이재연; 박영진
Original assignee: 재단법인 경기과학기술진흥원
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-10-05
Publication date: 2014-01-06
Also published as: KR101431008B1

Abstract

본 발명은 밀겨 추출물로부터 분리한 타치오시드가 알러지 반응을 매개하는 비만세포의 탈과립 억제 활성을 지님과 함께, 알러지 염증 반응에 관여하는 사이토카인의 생성 억제 활성, 이들 사이토카인의 전사인자인 NF-κB의 생성 억제 활성 그리고 NF-κB의 활성화에 관여하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)(ERK, JNK 및 p-38)의 생성 억제 활성을 지닌다는 것에 기초하여, 상기 타치오시드를 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물을 개시한다.

Description

밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드를 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물{Composition for Improving Allergy Disease Using Tachioside Isolated from Wheat Bran}

본 발명은 밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드(tachioside)를 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물에 관한 것이다.

알러지(allergy)란 일반적으로 이물질인 알러지원(allergen)에 의해 면역학적 기전을 통해 야기되는 반응으로 신체에 해로운 손상을 유발하는 현상을 말한다.

비만세포(mast cell)는 알러지 반응을 매개하는 중요한 세포로, 피부, 호흡기, 위장관의 점막, 임파관 주위, 혈관 주위, 뇌 등 전신의 장기에 널리 분포하여 있으며, 세포질 내 풍부한 과립을 가지고 있다.

알러지 반응은 집 먼지, 진드기, 꽃가루, 동물 비듬, 곰팡이, 난 알부민, 우유 단백질, 땅콩 등의 알러지원에 대항하기 위하여 생성된 IgE가 비만세포에 작용함으로써 야기된다(Wills-Karp M., et al., Science, 282, pp 2258-61, 1998; Grunig G., et al., Science, 282, pp 2261-2263, 1998).

알러지원이 생체에 침입하면 알러지원은 먼저 항원제시세포에 의해 인지되며, 이 항원제시세포는 IL-4 존재하에서 알러지원 제시를 통해 Th0를 Th2 세포로 분화시킨다. 이렇게 분화된 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-13와 같은 사이토카인을 분비하는데, IL-4, IL-5 등이 B세포에 작용하여 IgE의 생성을 유도한다(Kato, Y. et al., J. Immuno. 1999, 162, 7470-7479; Toru, H. et al., J. Allergy. Clin. Immunol. 1998, 102, 491-502).

IgE는 비만세포의 고친화도 IgE 수용체인 FcεRⅠ에 결합하는데, 알러지원이 비만세포의 FcεRⅠ와 결합된 IgE에 결합하여 이들 수용체들의 교차결합을 일으키고, 이것이 신호로서 작용하여 일련의 신호전달 반응이 진행되게 된다(Marshall, J. S. Nat. Rev. Immunol. 2004, 4, 787-799).

이 신호전달 반응에 의해서 비만세포가 활성화되면 세포질 내 칼슘 농도가 상승하고 비만세포의 탈과립이 유도되어 과립 내에 존재하던 히스타민, 프로스타글란딘, 류코트리엔, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등의 사이토카인을 분비하게 되는데, 이들 히스타민 등의 다양한 화학매개물질이 혈관 확장이나 투과성의 항진, 신경종말의 자극, 점액 분비의 항진, 평활근의 수축 등 조기 알러지 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다(Meltzer, E. O. et al., Ann Allergy Asthma Immunnol. 2000, 84, 176-187).

비만세포는 이러한 조기 알러지 반응만이 아니라 후기 반응이나 만성 알러지 반응에도 깊이 관여하는데, 비만세포로부터 분비되는 TNF-α, IL-3, IL-5, IL-13 등은 만성 알러지성 염증을 매개하는 호산구와 T 림프구의 표적기관으로의 유입을 촉진시킨다(Erb KJ., Immunol. Today, 20, pp 317-322, 1999; Rothenberg ME., Eosinophilia., N. Engl. Med. , 338, pp 1592-1600, 1998).

한편 Rat 유래의 RBL-2H3 세포는 막의 표면에 수십만 개의 IgE 수용체를 지니고 있으며, IgE로 감작된 후에 항체에 반응하여 히스타민 등을 유리하므로, 항알러지 효능 검색에 많이 이용되는 모델 세포주이다.

본 발명에서도 RBL-2H3 세포를 이용하여 밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드의 항알러지 활성을 확인하였다.

본 발명의 목적은 알러지성 질환의 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 밀겨(Wheat Bran) 추출물로부터 분리한 타치오시드(tachioside; methoxy-hydroquinone-4-β-D-glucopyranoside)를 IgE 및 항원(DNP-BSA)으로 활성화시킨 비만세포주 RBL-2H3(rat basophilic leukemia)에 처리한 결과, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 생성이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다. 비만세포의 과립 중에는 히스타민 외에 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)도 같이 저장되어 있어 비만세포가 탈과립을 일으키면 베타-헥소사미니다제가 히스타민과 함께 방출되므로, 베타-헥소사미니다아제는 탈과립의 지표물질로 알려져 있는 물질이다(J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 48(4), 315-321, 2005; J. Immunol., 123, 1445-1450, 1970).

나아가 본 발명자들은 상기 타치오시드가 TNF-α, IL-4, IL-6, IL-10 등의 알러지 염증 반응에 관여하는 사이토카인의 생성을 억제함을 확인하였으며, 이들 사이토카인의 전사인자인 NF-κB의 생성 억제 활성과 NF-κB의 활성화에 관여하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)(ERK, JNK 및 p-38)의 생성 억제 활성 등을 확인하였다.

상기 밀겨 추출물에서 분리된 타치오시드는 사탕수수, 당밀(sugarcane molasses), 청사조(Berchemia racemosa), 대나무 줄기(bamboo culm) 등으로부터 분리된 바 있는 물질이며(J. Agr. Food Chem. 31: 545-548, 1983; Phytochemistry 26: 2811-2814 (1987); Food Sci. Biotechnol. 17(6):1376 ~ 1378, 2008), 그 화합물의 화학구조식 및 IUPAC 명칭은 아래의 [화학식 1]에서 확인할 수 있다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은 타치오시드를 유효성분으로 하는 알러지성 질환의 개선제 조성물로 파악할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, 상기 "알러지성 질환"은 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화에 의하여 야기되는 알러지 반응으로 인하여 초래되는 임상적 증상을 의미하는데, 이러한 임상적 증상에는 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 소양(搔痒), 화분증, 천식, 기관지염, 두드러기, 혈관염, 비염, 위장증, 설사, 간질성 폐렴, 관절염, 안염, 결막염, 신경염, 중이염, 육아종증, 뇌척수염, 방광염, 후두염, 자반병(紫斑病), 음식물 알러지, 곤충 알러지, 약물 알러지, 금속 알러지, 아나필락시성 쇼크(anaphylactic shock) 등이 포함된다(Bierman CW, et al.(eds.) Allergy, asthma, and immunology from infancy to adulthood. page xvii, Saunders, Philadelphia, 1996).

또 본 명세서에서, 상기 "개선"이란 병리적 증상의 예방, 치료, 발병 억제, 또는 지연을 의미한다.

한편 본 발명의 조성물은 그 유효성분인 상기 [화학식 1] 의 화합물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 알러지성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 알러지성 질환의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서 화장품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로서 파악될 경우, 그 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 50 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 화장품의 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 알러지성 질환의 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물은 약품, 기능성 식품, 화장품 등으로 제품화될 수 있다.

도 1은 밀겨 추출물로부터 타치오시드를 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 타치오시드가 농도 의존적으로 사이토카인의 생성을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 3은 타치오시드가 사이토카인의 전사인자인 NF-κB의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 4는 타치오시드가 농도 의존적으로 NF-κB의 활성화에 관여하는 MAPK(ERK, JNK 및 p-38) 및 p-AKT의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 밀겨 추출물로부터의 유효물질의 분리 및 동정

<실시예 1> 밀겨 추출물로부터의 유효물질의 분리

밀(Triticum aestivum L.)의 도정 부산물인 밀겨 3.4kg에 에탄올을 가하고 24시간 2회 냉침 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 감압농축기를 이용하여 농축시켜 고형상의 에탄올 추출물을 얻었으며, 그 추출물을 증류수에 현탁시킨 후 n-헥산으로 용매 분획하여 물층에 대해서 CH₂Cl₂로 다시 용매 분획하였다. 또 다시 물층에 대해서 부탄올로 용매 분획하고, 이들 분획물 중에서 항비만 활성이 높은 부탄올층(G36W)을 감압상태에서 증발시켜 부탄올 추출물을 얻었고, 추출물에 대하여 물-메탄올 이동상(물, 20, 40, 60, 80, 100% 메탄올)으로 Diaion HP-20 컬럼크로마토그래피를 실시하여 6개의 소분획으로 나누었다(G36W-18-1~6). 분획 G36W-18-2에 대하여 실리카겔 크로마토그래피(10×25)를 이동상 CHCl₃:MeOH:H₂O(20:4:1,10:3:1,6:3:1.6:4:1)로 시행하여 화합물 1을 분리하였다.

상기 화합물 1의 분리 과정의 모식도를 [도 1]에 나타내었다.

<실시예 2> 화합물 1의 동정

상기 분리한 화합물 1에 대해 물리화학적 및 분광학적 분석을 실시하였다.

Colourless needles; [α]_D ²⁵-35.5°(c 0.15, CH₃OH); UV (MeOH) λ_max (log ε) 206 (4.25), 227 (sh, 3.84), 285 (3.58) nm;IR (KBr) v_max 3429, 1610, 1514, 1370, 1278, 1070, 1041, 993 cm^-1; ESIMS (positive mode) m/z 325.35 [M + Na]⁺, 627.35 [2M + Na]⁺; (negative mode) m/z 301.79 [M - H]^-, 603.20 [2M - H]^-;

¹H-NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz) δ 6.69 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-3), 6.66 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.46 (1H, dd, J = 8.8, 2.8 Hz, H-5), 4.67 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1', 3.73 (3H, s, 3-OCH₃), 3.71 (1H, dd, J = 11.6, 4.8 Hz, H-6'), 3.44 (1H, dd, J = 11.6, 6.0 Hz, H-6'), 3.10 - 3.45 (4H, m, H-2',3',4',5');

¹³C-NMR (DMSO-d ₆ , 100 MHz) δ 151.2 (C-4), 148.2 (C-2), 141.7 (C-1), 115.6 (C-6), 108.3 (C-5), 102.8 (C-3), 102.1 (C-1'), 77.5 (C-3'), 77.2 (C-5'), 73.7 (C-2'), 70.4 (C-4'), 61.3 (C-6'), 55.9 (OCH₃).

화합물 1은 무색의 침상결정 (colourless needles)의 형태로서 ESI-MS (m/z 325.35 [M + Na]⁺, 301.79 [M - H]^-)로부터 분자량은 302 amu로 확인하였고, 분자식 C₁₃H₁₈O₈임을 알 수 있었으며, 불포화도는 5로 나타났다. ¹H-NMR에서 1,2,4-trisubstituted aromatic proton [δ_H 6.69 (1H, d, J = 2.8 Hz), 6.66 (1H, d, J = 8.8 Hz), 6.46 (1H, dd, J = 8.8, 2.8 Hz)]이 관찰되었으며 하나의 methoxy 기에 기인하는 signal [δ_H 3.73 (3H, s)]과 glucose의 anomeric proton이 δ_H 4.67 (1H, d, J = 7.6 Hz)에서 확인되었다. ¹³C-NMR에서는 총 13개의 carbon signal을 확인하였으며, 6개의 벤젠고리에 기인하는 signal 외에 6 개의 당에 기인하는 signal [δ_C 102.1 (C-1'), 77.5 (C-3'), 77.2 (C-5'), 73.7 (C-2'), 70.4 (C-4'), 61.3 (C-6') ]과 methoxy기의 signal을 δ_C 55.9에서 확인하였다. 이상의 분광학적

데이터와 불포화도로부터 화합물 1은 methoxyhydroquinone에 glucose가 결합되어 있는 화합물로 추정하였고, 물리화학적 성상과 문헌(Food Sci . Biotechnol ., 17(6), 1376-1378, Tachioside, an antioxidative phenolic glycoside from bamboo Species)을 비교 검토하여 [화학식 1]의 tachioside(methoxy-hydroquinone-4-β-D-glucopyranoside)로 결정하였다.

< 실험예 > 항알러지 활성 실험

<실험예 1> 탈과립 억제 활성 실험 - β- Hexosaminidase assay

Rat basophlic leukemia 셀 라인인 RBL-2H3 세포주를 15% FBS, 100 unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지와 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24 well plate에 2×10⁵/well로 분주한 후 24시간 배양하였다.

상등액을 제거 후 25 ng/ml anti-DNP IgE가 포함된 MEM 배지를 넣고 4시간 배양 후 PIPES buffer 500㎕로 두 번 세척하고 4mM MgCl₂, 5.6mM glucose, 0.1% BSA를 포함시킨 PIPES buffer를 180㎕ 넣고 10분 동안 배양하였다. 전 배양 후 시료를 농도별로 20분간 처리 후 50ng/ml DNP-BSA 20분간 반응시켰다. ice 에서 10분 방치하여 반응을 종결시킨 후 상등액을 25㎕ 씩 96 웰 플레이트에 넣고, 1 mM P-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드를 25㎕ 넣은 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. stop solution(0.1M NaHCO₃, 0.1M Na₂CO₃)을 넣고 반응을 종결시킨 후 405nm 파장대에서 ELISA 리더로 흡광도를 측정하였다.

결과를 [표 1]에 나타내었다.

탈과립 억제 활성(%)

처리 농도(㎍/㎖)	탈과립 억제 활성(%)
25	41.2±1.1
50	69.4±0.7
100	75.8±0.7
* Data are presented as a mean±SD from three separate experiments.

상기 분리된 화합물 1의 50%의 탈과립 억제 활성에 해당하는 농도인 IC₅₀ 값은 32.7㎍/㎖(108.5uM)로 나타났으며, 양성대조군으로서 사용한 케토티펜(Ketotifen)(삼아제약, 한국)의 IC₅₀ 값은 26.1㎍/㎖(61.3uM)로 나타났다.

<실험예 2> 사이토카인의 생성 억제 활성 실험 - RT - PCR

BL-2H3 세포를 1×10⁶/well로 6 well plate에 배양 후 IgE를 넣고 4시간 반응시켰다. 그 이후 농도별로 시료를 처리하고 DNP-BSA를 첨가하여 각각 37℃에서 20분씩 반응시켰다. PBS로 2번 세척 후 Trizol(Invitrogen)을 넣어서 세포를 용해시킨 후 chloroform(Sigma)를 넣고 13,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액과 isopropanol을 섞은 후 반응시켜 RNA를 침전시킨 후 에탄올로 1회 세척하여 RNA를 분리하였다.

추출한 RNA를 이용하여 정량 후 역전사 효소인 SuperscriptⅢ(Invitrogen)를 사용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 1분 30초를 35 cycle 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 유전자의 발현 억제 효과를 agarose gel 상에서 비교하였다. 사용한 primer는 아래의 [표 2]와 같고, 대조군 유전자는 GAPDH를 사용하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen을 사용하였다.

프라이머

rTNF-α	F: 5' CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C 3'
	R: 5' CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T 3'
rIL-4	F: 5' ACC TTG CTT CAC CCT GTT C 3'
	R: 5' TTG TGA GCG TGG ACT CAT TC 3'
rIL-10	F: 5' TAG AAG TGA TGC CCC AGG 3'
	R: 5' TCA TCC TCC ACC TGC TCC ACT GC 3'
rIL-13	F: 5' ACA GCT CCC TGG TTC TCT CA 3'
	R: 5' CCC CCA TTC ACT ACA CAT CA 3'
rCOX-2	F: 5' TGT ATG CTA CCA TCT GGC TTC GG 3'
	R: 5' GTT TGG AAC AGT CGC TCG TCA TC 3'
GAPDH	F-GAGTCAACGGATTTGGTCGT
	R-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG

결과를 [도 2]에 나타내었다. [도 2]를 참조하여 보면 상기 분리된 화합물 1은 대체로 농도 의존적으로 사이토카인의 생성을 억제함을 알 수 있다.

<실험예 3> 사이토카인 생성의 작용 기전 조사

<실험예 3-1> NF -κB 발현 억제 활성 실험 - luciferase assay

HEK 293T 세포를 5×10⁴/well로 24 well plate에 배양 후 pGL3-basic luciferase expression 벡터(Promega)에 NF-κB 유전자를 삽입하여 얻은 재조합 벡터와 control reporter로서 Renilla luciferase의 cDNA를 가지는 pRL-SV-40 플라스미드(Promega)를 HEK 293T cell에 lipofectamine(Invitrogen)을 사용하여 co-transfection 하였다. 24시간 후 시료를 처리한 후 세포를 lysis시켜 발광효소의 활성화를 luciferase assay system(Promega)으로 측정하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen을 사용하였다.

결과를 [도 3]에 나타내었다. 상기 분리된 화합물 1은 양성 대조군 이상으로 NF-κB의 발현을 억제함을 보여주고 있다.

<실험예 3-2> MAPK 및 p- AKT 생성 억제 활성 실험 - western blot

상기 <실험예 1>과 같이 IgE와 그것의 항원인 DNP-BSA로 활성화되고 시료가 농도별로 처리된 RBL-2H3 세포를 PBS로 세척 후 lysis buffer(50mM Tris-HCl, pH 8.0 with 150mM sodium chloride, 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl s㎕fate)에 용해시켰다. 13,000rpm으로 20분간 원심 분리하여 단백질을 추출하여 정량한 후 100℃에서 5분간 단백질을 변성시켰다. 정량된 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl s㎕fate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 전기 영동 후 polyvinylidene difluoride membrane으로 이동시켰다. membrane은 0.1% Tween 20과 5% 탈지 건조된 우유를 포함하고 있는 phosphate buffered saline으로 blocking 하였다. membrane의 단백질은 1차 항체(1:1000)(Cell signaling) 와 horseradish peroxidase와 복합된 2차 항체(1:10000)(SantaCruz)에 반응시킨 후 ECL western detection 시약(Thermo scientific)으로 MAPK(ERK, JNK 및 p38) 및 p-AKT의 발현 정도를 β-actin의 발현 정도와 비교하여 평가하였다.

결과를 [도 4]에 나타내었는데, 상기 분리된 화합물 1은 대체로 농도 의존적으로 MAPK 및 p-AKT의 발현을 억제함을 알 수 있으며, 처리 농도(300uM)가 같을 경우 양성대조군(Ketotifen) 이상의 활성을 보임을 알 수 있다.

Claims

타치오시드(tachioside)를 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환의 개선제 조성물.
제1항에 있어서,
상기 알러지성 질환은 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 소양(搔痒), 화분증, 천식, 기관지염, 두드러기, 혈관염, 비염, 위장증, 설사, 간질성 폐렴, 관절염, 안염, 결막염, 신경염, 중이염, 육아종증, 뇌척수염, 방광염, 후두염, 자반병(紫斑病), 음식물 알러지, 곤충 알러지, 약물 알러지, 금속 알러지 및 아나필락시성 쇼크로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.