KR20110077671A - 밀겨 추출물을 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비만세포의 탈과립을 억제하는 활성을 가지고 수동 피부 과민증 동물실험에 있어서도 항알러지 활성을 보이는 밀겨 추출물을 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물에 관한 것이다.

비만세포, 탈과립, 밀겨, 알러지성 질환

Description

밀겨 추출물을 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물{Composition for Improving Allergy Disease Using Wheat Bran}

본 발명은 밀겨 추출물을 이용한 알러지성 질환의 개선제 조성물에 관한 것이다.

알러지(allergy)란 일반적으로 이물질인 알러지원(allergen)에 의해 면역학적 기전을 통해 야기되는 반응으로 신체에 해로운 손상을 유발하는 현상을 말한다.

알러지 반응은 비만세포를 매개로 일어나는데, 비만세포는 피부, 호흡기, 위장관의 점막, 임파관 주위, 혈관 주위, 뇌 등 전신의 장기에 널리 분포하며, 알러지 반응의 원인 세포로서 알려져 있다.

알러지 반응은 집먼지진드기, 꽃가루, 동물 비듬, 곰팡이, 난알부민, 우유단백질, 땅콩 등의 알러지원에 대항하기 위하여 생성된 IgE가 비만세포에 작용함으로써 야기된다(Wills-Karp M., et al., Science, 282, pp 2258-61, 1998; Grunig G., et al., Science, 282, pp 2261-2263, 1998).

이를 구체적으로 살펴보면, 알러지원이 생체에 침입하면 알러지원은 먼저 항원제시세포에 의해 인지되며, 이 항원제시세포는 IL-4 존재하에서 알러지원 제시를 통해 Th0를 Th2 세포로 분화시켰다. 이렇게 분화된 Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-13와 같은 사이토카인을 분비하는데, IL-4, IL-5 등이 B세포에 작용하여 IgE의 생성을 유도한다.

이렇게 생성된 IgE는 비만세포의 고친화도 IgE 수용체인 FcεRⅠ에 결합하는데, 이후 동일한 알러지원에 재차 노출되면 알러지원이 비만세포의 FcεRⅠ와 결합된 IgE에 결합하여 이들 수용체들의 교차결합을 일으키고, 이것이 신호로서 작용하여 일련의 신호전달 반응이 진행되게 된다.

이 신호전달 반응을 통해서 활성화된 비만세포는 히스타민(histamine), 프로테오글리칸, 프로테아제, 루코트리엔(Leukotrien), 프로스타클라딘(Prostaglandin), 사이토카인 등을 탈과립에 의하여 분비하거나 새로 합성하여 분비함으로써 혈관 확장이나 투과성의 항진, 신경종말의 자극, 점액 분비의 항진, 평활근의 수축 등 일련의 알러지 반응을 매개한다.

항히스타민제, 류코트리엔 길항제, 항-IgE 항체, IgE의 합성과 분비를 저해하는 물질(예컨대 미국 특허 제6,369,091호가 개시하는 디아실벤지미다졸 동족체 등) 등이 알러지성 증상을 개선할 수 있다는 사실이 상기 기작을 뒷받침한다.

이처럼 알러지 반응이 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화에 의해 야기되므로, 비만세포의 활성화를 억제하는 물질은 알러지성 질환의 치료제로 활용될 수 있다(J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 48(4), 315-321 (2005)).

본 발명은 밀겨 추출물이 비만세포의 활성화를 억제함을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 알러지성 질환의 개선제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 밀겨 추출물을 IgE 및 항원(DNP-BSA)으로 활성화시킨 비만세포주 RBL-2H3(rat basophilic leukemia)에 처리한 결과, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 생성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 상기 비만세포주인 RBL-2H3는 그 표면에 IgE 항체의 수용체(FcεRI)를 갖고 있어 IgE와 항원으로 활성화되면 탈과립 등에 의하여 히스타민 등의 알러지 반응의 매개물질을 분비하는 것으로 알려져 있는 세포이며, 베타-헥소사미니다아제는 탈과립의 지표 물질로 알려져 있는 물질이다(J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 48(4), 315-321 (2005)).

특히 밀겨 추출물은 알러지 치료제의 개발에 자주 이용되는 수동 피부 과민증(Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA) 동물실험에 있어서도 농도 의존적으로 항알러지 활성을 나타내었다.

본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 완성된 것으로서, 밀겨 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 상기 "밀겨"은 밀(wheat)을 도정하는 과정에서 얻어지는 부 산물을 의미한다. 이러한 부산물은 통상 밀가루가 되는 배유를 제외하고 과피와 배아로 구성되게 된다.

또 본 명세서에서, 상기 "추출물"이란 추출 방법을 불문하고 추출 대상인 밀겨를 증류수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 추출하여 얻어진 조추출물과 그 조추출물을 상기 열거된 용매로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 추출 방법을 불문하므로, 추출 대상을 추출 용매에 침지시키는 단계를 통하여 추출되는 한, 추출 방법은 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사 등 임의의 방식이 모두 적용될 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 다른 극성의 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 소수성 레진이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 상기 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 사용될 수 있는 소수성 레진은 예컨대 Amberlite XAD-2™, 아래의 실시예에 사용된 Diaion HP-20™ 등 시판되는 것 중에서 적절히 선택될 수 있다. 상기 추출물의 의미에는 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

또 본 명세서에서, 상기 "알러지성 질환"은 비만세포의 탈과립 등 비만세포의 활성화에 의하여 야기되는 알러지 반응으로 인하여 초래되는 임상적 증상을 의미하는데, 이러한 임상적 증상에는 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 소양 (搔痒), 화분증, 천식, 기관지염, 두드러기, 혈관염, 비염, 위장증, 설사, 간질성 폐렴, 관절염, 안염, 결막염, 신경염, 중이염, 육아종증, 뇌척수염, 방광염, 후두염, 자반병(紫斑病), 음식물 알러지, 곤충 알러지, 약물 알러지, 금속 알러지, 아나필락시성 쇼크(anaphylactic shock) 등이 포함된다(Bierman CW, et al. (eds.) Allergy, asthma, and immunology from infancy to adulthood. page xvii, Saunders, Philadelphia, 1996).

또 본 명세서에서, 상기 "개선"이란 병리적 증상의 예방, 치료, 발병 억제, 또는 지연을 의미한다.

한편 본 발명의 조성물은 그 유효성분인 밀겨 추출물을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 치료를 의도하는 알러지성 질환의 개선 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 알러지성 질환의 개선, 치료, 또는 그러한 병리적 증상의 발병 억제/지연을 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 밀겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 개선제 조성물에 관한 것이다.

IgE 및 그것의 항원에 의하여 활성화된 비만세포는 탈과립에 의하여 알러지 반응을 일으키는 히스타민 등을 분비할 뿐만 아니라 TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, INF-γ 등의 사이토카인을 합성하고 분비한다. TNF-α, IL-1β, IL-6 등은 대표적인 염증성 사이토카인이다. 이 염증성 사이토카인은 세포 독성과 각종 염증 반응을 일으키는 NO를 생성하는 iNOS의 발현과 염증과 통증에 관여하는 COX-2의 발현을 유도한다. 또한 IL-3, IL-5, IL-13 등은 만성 알러지성 염증을 매개하는 호산구의 침윤과 활성화를 일으키는 것으로 알려져 있다(Erb KJ., Immunol. Today, 20, pp 317-322, 1999; Rothenberg ME., Eosinophilia., N. Engl. Med. , 338, pp 1592-1600, 1998).

아래의 실험예는 밀겨 추출물이 활성화된 비만세포의 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 뿐만 아니라 iNOS 발현과 COX-2의 발현을 억제함을 보여준다. 그리고 염증성 사이토카인의 전사인자인 NF-κB의 생성 억제 활성과 NF-κB의 활성화에 관여하는 MAPK(mitogen-activated protein kinase)(ERK, JNK 및 p-38)의 생성 억제 활성을 보여준다.

이러한 실험 결과는 밀겨 추출물이 염증성 질환의 개선제로서도 유용하게 사용될 수 있음을 보여주는 것이라 할 수 있다.

본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알러지 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분 비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알러지성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알러지성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알러지성 및 비-알러지성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염(아토피성 피부염 포함), 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

본 발명의 염증성 질환의 개선제 조성물에 있어서, 밀겨 추출물의 의미, 유효량 등과 관련하여서는 상기 본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물과 관련하여 설명한 바가 그대로 유효하다.

본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물과 염증성 질환의 개선제 조성물(이하 "본 발명의 조성물")은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 밀겨 추출물을 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 경구용 제형(정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등), 비경구형 제형(멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액), 국소형 제형(용액, 크림, 연고, 겔, 로션, 패치) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등) 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산, 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 정제화제, 안정화제, 항산화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 들 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물이 수성 현탁제로 제조될 경우에 적합한 부형제로서는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산 제 등을 들 수 있다. 주사액으로 제조되는 경우 적합한 부형제로서는 링거액, 등장 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있고, 경우에 따라서는 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합 성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 알러지성 질환의 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따르면 염증성 질환의 개선제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 알러지성 질환의 개선제 조성물과 염증성 질환의 개선제 조성물은 약품이나 기능성 식품으로 제품화될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 밀겨 추출물의 제조

밀겨(Red-dog) 200g을 2ℓ물에 넣고 6시간 열수 추출하였다. 열수 추출물을 여과시키고 그 여과액을 Diaion HP-20 레진이 충진된 칼럼에 넣고 100% 에탄올과 물을 이동상으로 하여 100% 에탄올을 통과한 샘플을 Red-dog A라 하였고, 물을 통과한 샘플을 Red-dog B라 명명하여 실험에 사용하였다.

< 실험예 > 항알러지 활성 및 항염증 활성 실험

< 실험예 1> 비만세포주의 탈과립 억제 활성 실험 - β- Hexosaminidase assay

Rat basophlic leukemia 셀 라인인 RBL-2H3 세포주를 15% FBS, 100unit/ml의 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하는 MEM 배지와 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2X10⁵/well의 세포수로 24시간 배양하였다.

상등액을 제거 후 25 ng/ml anti-DNP IgE 가 포함된 MEM 배지를 넣고 4시간 배양하였다. 배양 후 PIPES buffer (25mM PIPES, 119mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl₂, 0.4mM MgCl₂, 40mM NaOH, 5.6mM glucose, 0.1% BSA)로 세척하고 10분 동안 전 배양하였다. 전 배양 후 실시예의 시료를 25, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 20분간 처리 후 50ng/ml DNP-BSA 20분간 반응시켰다. 4℃에서 반응을 종결시킨 후 상등액을 25 ㎕씩 96 웰 플레이트에 넣고, 1mM P-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드를 25 ㎕ 넣은 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 0.1M citrate buffer를 넣고 반응을 종결시킨 후 405 nm 파장대에서 ELISA 리더로 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen(100 ㎍/ml)을 사용하였다.

결과를 <도 1>에 나타내었는데, 실시예의 시료는 모두 농도 의존적으로 탈과립을 억제함을 알 수 있으며, 동일한 처리 농도에서 양성대조군인 ketotifen과 유사한 활성을 보였다.

< 실험예 2> 알러지 동물 모델을 이용한 항알러지 활성 실험 - 수동 피부 과 민증( PCA ) 실험

수동적인 피부 알러지 반응은 anti-DNP IgE (0.5 ㎍/site)를 ICR mouse 피내 주입하여 피부를 감작시킨 후 48시간 후 실시예의 시료(Red-dog A)를 경구 투여하고 대조군인 ketotifen (100 mg/kg)은 복강 투여하였다. 1시간 후 4% Evans blue와 DNP-BSA를 1:1로 섞은 용액을 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 1시간 후 실험동물을 촬영하여 <도 2>에 나타내었다. <도 2>를 참조하여 보면 육안으로도 실시예의 시료의 투여 용량에 따라 알러지를 일으키는 물질과 반응하는 색소의 양이 감소함을 알 수 있다.

< 실험예 3> 사이토카인의 생성 억제 활성 실험 - RT PCR

RBL-2H3 세포를 1X10⁶/well로 6 well plate에 배양 후 25 ng/ml IgE를 넣은 후 4시간 반응시켰다. 그 이후 실시예의 시료 처리 후 50ng/ml DNP-BSA를 첨가하여 각각 37℃에서 20분씩 반응시켰다. PBS로 2번 세척 후 Trizol(Invitrogen)과 chloroform(Sigma)를 넣고 반응시켜 RNA를 분리하였다. 추출한 RNA를 이용하여 정량한 후 역전사 효소인 SuperscriptⅢ (Invitrogen)를 사용하여 역전사 연쇄중합반응에 의해 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 1분 30초를 35 cycle 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 유전자의 발현 억제 효과를 agarose gel 상에서 비교하였다. 사용한 primer는 아래의 [표 2]와 같고 대조군 유전자는 GAPDH를 사용하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen(100 ㎍/ml)을 사용하였다.

[표 2]

프라이머

rTNF-α	F: 5' CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA C 3'(서열번호 1)
	R: 5' CCG GAC TCC GTG ATG TCT AAG TAC T 3'(서열번호 2)
rIL-1b	F: 5' CAC CTC TCA AGC AGA GCA CAG 3'(서열번호 3)
	R: 5' GGG TTC CAT GGT GAA GTC AAC 3'(서열번호 4)
rIL-4	F: 5' ACC TTG CTT CAC CCT GTT C 3'(서열번호 5)
	R: 5' TTG TGA GCG TGG ACT CAT TC 3'(서열번호 6)
rIL-5	F: 5' TGA GCA CAG TGG TGA AAG AGA C 3'(서열번호 7)
	R: 5' AAT CCA GGA AAT GCC TGG TC 3'(서열번호 8)
rIL-6	F: 5' GCC CTT CAG GAA CAG CTA TGA 3'(서열번호 9)
	R: 5' TGT CAA CAA CAT CAG TCC CAA GA 3'(서열번호 10)
rIL-10	F: 5' TAG AAG TGA TGC CCC AGG 3'(서열번호 11)
	R: 5' TCA TCC TCC ACC TGC TCC ACT GC 3'(서열번호 12)
rIL-11	F: 5' TTG GTA CTT GGA GCG G 3'(서열번호 13)
	R: 5' CAC TGT GAA TAG ACT TCG T 3'(서열번호 14)
rIL-13	F: 5' ACA GCT CCC TGG TTC TCT CA 3'(서열번호 15)
	R: 5' CCC CCA TTC ACT ACA CAT CA 3'(서열번호 16)
rIFN-γ	F: 5' AGG ACG GTA ACA CGA AA 3'(서열번호 17)
	R: 5' CTG TGG TTG TTC ACC TC 3'(서열번호 18)
rCOX-2	F: 5' TGT ATG CTA CCA TCT GGC TTC GG 3'(서열번호 19)
	R: 5' GTT TGG AAC AGT CGC TCG TCA TC 3'(서열번호 20)
rNOS	F: 5' CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG 3'(서열번호 21)
	R: 5' CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT 3'(서열번호 22)
GAPDH	F-GAGTCAACGGATTTGGTCGT(서열번호 23)
	R-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG(서열번호 24)

결과를 <도 3>에 나타내었다. <도 3>를 참조하여 보면 실시예의 시료는 농도 의존적으로 사이토카인의 생성을 억제함을 알 수 있으며, 처리 농도가 같을 경우 양성대조군(PC)과 유사한 정도의 활성을 보이고 있다.

< 실험예 4> 사이토카인 생성의 작용 기전 조사

<실험예 4-1> NF -κB 발현 억제 활성 실험 - luciferase assay

HEK 293T 세포를 5X10⁴/well로 24 well plate에 배양 후 pGL3-basic luciferase expression 벡터(Promega)에 NF-κB 유전자를 삽입하여 얻은 재조합 벡터와 control reporter로서 Renilla luciferase의 cDNA를 가지는 pRL-SV-40 프라스미드(Promega)를 HEK 293T cell에 lipofectamine(Invitrogen)을 사용하여 co-transfection 하였다. 24시간 후 실시예의 시료를 처리한 후 세포를 lysis시켜 발광효소의 활성화를 luciferase assay system (Promega)으로 측정하였다. 양성 대조군으로는 ketotifen(100 ㎍/ml)을 사용하였다.

결과를 <도 4>에 나타내었다. 실시예의 시료는 모두 농도 의존적으로 NF-κB의 발현을 억제함을 보여주고 있다.

<실험예 4-2> MAPK 생성 억제 활성 실험 - western blot

IgE와 그것의 항원으로 활성되고 실시예의 시료가 처리된 상기 <실험예 3>의 RBL-2H3 세포를 PBS로 세척 후 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 8.0 with 150mM sodium chloride, 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl s㎕fate)에 용해시켰다. 13000rpm으로 20분간 원심 분리하여 단백질을 추출하여 정량하였다. 정량된 단백질을 SDS-PAGE (sodium dodecyl s㎕fate polyacrylamide gel electrophoresis) 를 이용하여 전기 영동 후 polyvinylidene difluoride membrane으로 이동시켰다. membrane은 0.1% Tween 20과 5% 탈지 건조된 우유를 포함하고 있 는 phosphate buffered saline으로 blocking 하였다. membrane은 0.1% Tween 20과 5% 탈지 건조된 우유를 포함하고 있는 phosphate buffered saline으로 blocking 하였다. membrane의 단백질은 1차 항체 (1:1000)(Cell signaling) 와 horseradish peroxidase와 복합된 2차 항체 (1:10000)(SantaCruz)에 반응시킨 후 ECL western detection 시약(Thermo scientific)으로 MAPK(ERK, JNK 및 p38)의 발현 정도를 β-actin의 발현 정도와 비교하여 평가하였다.

결과를 <도 5>에 나타내었는데, 실시예의 시료는 모두 농도 의존적으로 MAPK의 발현을 억제함을 알 수 있다.

도 1은 밀겨 추출물의 비만세포의 탈과립 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 2는 밀겨 추출물의 동물실험에서의 항알러지 활성을 보여주는 결과이다.

도 3은 밀겨 추출물의 비만세포에서의 사이토카인 생성 억제 활성을 보여주는 결과이다.

도 4는 밀겨 추출물이 사이토카인의 전사 인자인 NF-κB의 발현을 억제함을 보여주는 결과이다.

도 5는 밀겨 추출물이 NF-κB의 활성화를 조절하는 MAPK 발현 억제 활성을 보여주는 결과이다.

Claims (10)

1. 밀겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 밀겨 추출물은 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 하나인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물

   (Ⅰ) 밀겨를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 추출하여 얻어진 추출물,

   (Ⅱ) 상기 (Ⅰ) 추출물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매 중 2 가지 이상의 용매를 이용하여 분획하여 얻어진 추출물, 및

   (Ⅲ) 밀겨를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 추출하여 얻어진 추출물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 알러지성 질환은 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 소양(搔痒), 화분증, 천식, 기관지염, 두드러기, 혈관염, 비염, 위장증, 설사, 간질성 폐렴, 관절염, 안염, 결막염, 신경염, 중이염, 육아종증, 뇌척수염, 방광염, 후두염, 자반 병(紫斑病), 음식물 알러지, 곤충 알러지, 약물 알러지, 금속 알러지 및 아나필락시성 쇼크로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 알러지성 질환 개선제 조성물.
6. 밀겨 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 개선제 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 밀겨 추출물은 아래의 (Ⅰ) 내지 (Ⅲ) 중 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선제 조성물

   (Ⅰ) 밀겨를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 추출하여 얻어진 추출물,

   (Ⅱ) 상기 (Ⅰ) 추출물을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매 중 2 가지 이상의 용매를 이용하여 분획하여 얻어진 추출물, 및

   (Ⅲ) 밀겨를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매에 침지시켜 추출하여 얻어진 추출물.
8. 제6항에 있어서,

   상기 염증성 질환은 천식, 알러지성 및 비-알러지성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환제 조성물.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선제 조성물.
10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 개선제 조성물.

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