KR20190122677A - Prmt5 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성인 암환자의 확인에 있어서의 바이오마커의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5(PRMT5) 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법에 관한 것으로, 이는 스플라이소솜 변경의 존재에 대하여 환자 유래의 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 포함하며, 여기서, 임의의 상기 변경의 존재는 상기 환자가 상기 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 임의의 상기 돌연변이 또는 변경의 부재 하에서보다 더 높음을 나타낸다.

Description

PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성인 암환자의 확인에 있어서의 바이오마커의 용도
단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 높은 환자를 확인하는 방법 및 상기 환자의 치료 방법이 본원에 제공된다.
Hsl7, Jbp1, Skb1, Capsuleen 또는 Dart5로도 기술되는 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제(PRMT5)는 아르기닌의 모노- 및 대칭적 디메틸화의 원인이 되는 주요 메틸트랜스퍼라아제 중 하나이다. PRMT5는 Sym Arg 디메틸트랜스퍼라아제 효소 패밀리에 속한다. 촉매 활성은 종양 면역원성 케모카인뿐만 아니라 종양 억제자의 폐 발암 인자 경로 활성화(스플라이싱 및 WNT 신호전달) 및 후성유전적 억제와 관련된다. 단백질의 수준 및 국소화는 더 많은 세포 메틸화, 기관지 상피 표현형의 상실 및 불량한 질환 진행과 연관된다.
히스톤 및 비-히스톤 단백질에서의 번역 후 아르기닌 메틸화는 게놈 구성(genome organization), 전사, 분화, 스플라이소솜(spliceosome) 기능, 신호 전달(signal transduction) 및 세포-주기 진행의 조절, 줄기 세포 및 T 세포 운명과 같은 다양한 생물학적 과정에 결정적이다. 후생동물 PRMT5는 Wdr77, 안드로겐 수용체 보조 활성 인자(coactivator) p44 및 Valois로도 명명된 메틸로좀 단백질(methylosome protein) 50(MEP50)과 기능성 복합체를 형성한다. 상승된 PRMT5-MEP50 단백질 수준 및 세포질 축적 둘 다는 암성 종양 형성(cancer tumorigenesis)에 관련되어 있으며, 최근에는 불량한 임상 결과와 상관되었다 .PRMT5-MEP50 복합체의 촉매 및 스캐폴드(scaffold) 기능 둘 다를 다루는 세포 구조(cellular rescue) 실험은, 포괄적 효소학 연구에 비해 단백질의 수준, 국소화 및 효소 기능 사이의 발암 연관성을 입증하였다 .이러한 상관성은 PRMT5가 암 및 기타 질환에 대한 필수적인 소분자 약물 표적이 되게 한다 .
PRMT5는 S-아데노실호모시스테인(S-adenosylhomocysteine; SAH) 및 히스톤과 비-히스톤 단백질 기질 상에 대칭적 디메틸화 아르기닌을 생성하기 위해 S-아데노실메티오닌(S-adenosylmethionine; SAM)을 이용하는 타입 II PRMT 하위패밀리(subfamily)의 구성원이다. PRMT5 활성의 조절은 많은 수의 상이한 결합 파트너, 번역 후 변형, miRNA 및 세포내(subcellular) 국소화를 통하여 일어난다. Arg3 상의 히스톤 H2A 및 H4와 Arg8 상의 히스톤 H3의 메틸화는 분화, 형질전환, 세포-주기 진행 및 종양 억제(suppression)와 관련된 유전자 전사체의 특이적 억제(repression)/활성화를 위한 염색질 구성(chromatin organization)을 조절한다 .더욱이, Arg3 상의 히스톤 H4의 PRMT5-매개된 메틸화는 장기간 유전자 사일런싱(silencing)을 위한 DNA 메틸화 및 히스톤의 커플링을 위하여 DNA-메틸트랜스퍼라아제 DNMT3A를 모집할 수 있다.
비-히스톤 메틸화는 PRMT5의 세포 국소화에 따라 세포질 또는 핵 중 어느 하나에서 일어날 수 있다. 핵 스플라이소솜의 조립에 요구되는 Sm 단백질 D1 및 D3의 메틸화는 PRMT5 함유 "메틸로솜"의 일부로서 세포질에서 일어난다 .PRMT5가 스플라이싱과 관련되어 있다는 추가의 증거는 마우스 신경 줄기 세포에서의 조건부(conditional) PRMT5 넉아웃(knockout)에 의해 제공되었다. PRMT5가 결여된 세포는 선택적인 인트론의 보유 및 약한 5' 공여 부위(donor site)를 갖는 엑손의 스키핑(skipping)을 나타냈다 .스플라이싱에서의 역할에 더하여, PRMT5는 핵심 시그널링 노듈(signalling nodule), 예컨대 p53,30 EGFR,26 CRAF,3 PI3K/AKT,64 및 NFkB의 직접적 메틸화에 의해 세포의 운명 및 항상성과 관련된 핵심 경로에 영향을 준다.
PRMT5는 주요 sym-Arg 메틸트랜스퍼라아제 중 하나이며 다수의 세포 과정과 관련되어 있기 때문에, 증가된 단백질 발현은 이의 종양발생에서 중요한 인자인 것으로 보인다. 흥미롭게도, 맨틀 세포 림프종(mantle cell lymphoma; MCL)에서의 PRMT5의 번역은 miRNA에 의해 조절되는 것으로 보인다. MCL 세포는 정상 B 림프구보다 더 적은 PRMT5의 mRNA 및 더 느린 전사 속도를 나타내지만, PRMT5 수준과 H3R8 및 H4R3의 메틸화는 유의하게 증가된다 .PRMT5의 3'UTR 영역에 결합하는 miRNA의 재발현은 PRMT5 단백질 수준을 감소시킨다 .두드러지게, PRMT5 안티센스 RNA는 고 mRNA 발현 수준보다는 오히려 특이적 번역 조절의 가설을 뒷받침하는 인간 PRMT5 유전자 내에서 발견되었다 .
PRMT5가 고도로 임상 관련 표적으로 간주되지만, 선택적 PRMT5 저해제는 아직 거의 공개되지 않았다. 최근에, 많은 MCL 이종이식 모델에서 항종양 활성을 갖는 신규한 나노몰 미만(sub-nanomolar)의 효력을 갖는 (potent) PRMT5 저해제(EPZ015666)가 PRMT5의 생물학적 특성(biology) 및 암에서의 역할의 추가의 확인에 적합한 첫 번째의 화학적 프로브인 것으로 설명되었다(문헌[Chan-Penebre E, Kuplast KG, Majer CR, et al. A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nat Chem Biol. Jun 2015;11(6):432-437]).
국제 공개 제2014100695A1호에는 PRMT5 활성의 저해에 유용한 화합물이 개시되어 있으며; PRMT5-매개된 장애의 치료를 위한 화합물의 사용 방법이 또한 기술되어 있다.
국제 공개 제2014100730A1호에는 디히드로- 또는 테트라히드로이소퀴놀린을 포함하는 PRMT5 저해제 및 이의 용도가 개시되어 있다.
문헌[Devkota, K. et al., ACS Med Chem Lett, 2014. 5: p. 293-297]에는 천연 생성물 시네푼긴(sinefungin)의 일련의 유사체의 합성 및 이러한 유사체가 EHMT1 및 EHMT2를 저해하는 능력이 기술되어 있다.
국제 공개 제2003070739호에는 A1 아데노신 수용체의 부분 및 완전 작용제, 그의 제조, 및 그의 치료적 용도가 개시되어 있다.
국제 공개 제2012082436호에는 히스톤 메틸트랜스퍼라아제의 조절제로서, 그리고 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 활성의 조절에 의해 영향을 받는 질환의 치료를 위한 화합물 및 조성물이 개시되어 있다.
국제 공개 제2014100719호에는 PRMT5 저해제 및 이의 용도가 개시되어 있다.
국제 공개 제03074083호에는 메틸티오아데노신 포스포릴라아제 결함 세포를 선택적으로 사멸시키는 병용 요법이 개시되어 있다. MTA의 유사체가 본원에 항독성제(anti-toxicity agent)로서 기술되어 있다.
문헌[Kung, P.-P. et al., Bioorg Med Chem Lett, 2005. 15: p. 2829-2833]에는 신규한 인간 5'-데옥시-5'-메틸티오아데노신 포스포릴라아제(MTAP) 기질의 설계, 합성, 및 생물학적 평가가 설명되어 있다.
국제 공개 제2012075500호에는 히스톤 메틸트랜스퍼라아제의 7-데아자퓨린 조절제가 개시되어 있다.
국제 공개 제2014035140호에는 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 활성을 조절하기 위한 화합물 및 조성물이 개시되어 있다.
국제 공개 제2015200680호에는 PRMT5 저해제 및 이의 용도가 설명되어 있다.
또한 국제 공개 제2017/032840호 및 국제 공개 제2017/153186호에 PRMT5 저해제 및 이의 용도가 설명되어 있으며, 상기 국제 공개들은 본원에 참고로 포함된다.
PRMT5는 다수의 기작을 통하여 폐암과 관련되었다. NSCLC에서의 상승된 PRMT5 및 MEP50 발현은 더 불량한 생존성과 고도로 상관된다. 폐 선암종에서의 이러한 상승된 발현에 대한 기계적 식견이 연구에 의해 밝혀졌으며, 여기서, PRMT5의 세포질 고발현은, 아마도 상피의 중간엽으로의 전환 및 히스톤 메틸화를 통하여 매개되는 나쁜 예후와 직접적으로 상관되었다. 게다가, PRMT5 과발현은 누드 마우스에서 종양의 형성을 야기한다. PRMT5의 세포 형질전환 능력의 뒤에 있는 기작은 불확실하지만, 이 효소는 세포사, 세포 주기 진행, 스플라이싱, 세포의 성장 및 증식에서 역할을 할 것으로 가정된다.
전임상 데이터는 PRMT5 저해가 폐암 집단의 하위세트의 폐암 세포사를 야기하는 한편 상이한 하위세트는 PRMT5 저해제에의 긴 노출에 의해 영향을 받지 않음을 입증한다. 따라서, NSCLC 또는 SCLC 환자 또는 PRMT5에 의해 매개되는 기타 질환에 걸린 환자에서 PRMT5 저해제를 이용한 치료의 약력학적 효과를 측정하기 위하여, 또는 특정한 환자의 PRMT5 매개 질환이 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 반응할 가능성이 높은지를 결정하기 위하여 약력학적(PD) 및/또는 예측 바이오마커가 명백히 필요하다. 이러한 바이오마커는 현 기술 상태에서 공지되어 있지 않다.
단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5(PRMT5) 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 높은 환자를 확인하는 방법이 본원에 개시된다.
PRMT5 저해제는 PRMT5 효소에, 천연 기질 SAM(S-아데노실-L-메티오닌)과 경쟁적으로 결합하여 상기 효소를 저해할 수 있다.
따라서 PRMT5 저해제 또는 이의 제약 조성물은 혈액 질환, 대사 장애, 자가 면역 질환, 암, 염증성 질환, 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환, 췌장염, 다발성 장기 부전, 신장 질환, 혈소판 응집, 정자 운동성, 이식 거부, 이식편 거부, 폐 손상 등과 같은 질환의 치료 또는 예방, 특히 치료에 유용할 수 있을 것으로 예상된다.
특히 PRMT5 저해제 또는 이의 제약 조성물은 알러지, 천식, 조혈기계 암, 폐암, 전립선암, 흑색종, 대사 장애, 당뇨병, 비만, 혈액 질환, 겸상 적혈구성 빈혈 등과 같은 질환의 치료 또는 예방, 특히 치료에 유용할 수 있다.
PRMT5 또는 이의 제약 조성물은 증식성 질환(proliferative disorder), 예컨대 자가 면역 질환, 암, 양성 신생물, 또는 염증성 질환과 같은 질환의 치료 또는 예방, 특히 치료에 유용할 수 있다.
PRMT5 저해제 또는 이의 제약 조성물은 당뇨병, 비만을 포함하는 대사 장애; 암, 조혈기계 암, 폐암, 전립선암, 흑색종, 또는 췌장암을 포함하는 증식성 질환; 혈액 질환; 혈색소병증; 겸상 적혈구성 빈혈; β-지중해 빈혈, 염증성 질환, 및 자가 면역 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 설사, 위식도 역류 질환 등과 같은 질환의 치료 또는 예방, 특히 치료에 유용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, PRMT5의 저해는 하기 비제한적 목록의 암의 예방 또는 치료, 특히 치료에서 유용할 수 있다: 유방암, 폐암, 식도암, 방광암, 조혈기계 암, 림프종, 수모세포종, 직장 선암종, 결장 선암종, 위암, 췌장암, 간암, 선양 낭성 암종, 폐선암종, 두경부 편평 세포 암종, 뇌종양, 간세포 암종, 신세포 암종, 흑색종, 핍지교종(oligodendroglioma), 난소 명세포 암종, 및 난소 장액성 낭선종.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 대사 장애의 예는 당뇨병 또는 비만을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 혈액 질환의 예는 혈색소병증, 예컨대 겸상 적혈구병 또는 β-지중해 빈혈을 포함하지만, 이에 한정되지 아니다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 암의 예는 청신경종, 선암종, 부신암, 항문암, 혈관 육종(예를 들어, 림프관 육종, 림프관 내피성 육종, 혈관 육종), 충수암, 양성 단클론성 감마글로불린병증, 담관암(예를 들어, 담관암종), 방광암, 유방암(예를 들어, 유방의 선암종, 유방의 유두상 암종, 유암, 유방의 수질 암종), 뇌암(예를 들어, 수막종; 신경교종, 예를 들어, 성상세포종, 핍지교종; 수모세포종), 기관지암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암(예를 들어, 자궁경부 선암종), 척삭종, 융모막 암종, 두개인두종, 결장직장암(예를 들어, 결장암, 직장암, 결장직장 선암종), 상피 암종, 상의세포종, 내피 육종(예를 들어, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 다중 특발성 출혈성 육종), 자궁 내막 암(예를 들어, 자궁암, 자궁 육종), 식도암(예를 들어, 식도의 선암종, 바렛 선암종(Barrett's adenocarcinoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 눈의 암(예를 들어, 안구 흑색종, 망막 모세포종), 가족성 과다호산구증가증, 쓸개 암, 위암(예를 들어, 위 선암종), 위장관 간질 종양(GIST), 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 상피 세포 암종), 구강암(예를 들어, 구강 편평 세포 암종(OSCC), 인후암(예를 들어, 후두암, 인두암, 비인두암, 구인두암)), 조혈기계 암(예를 들어, 백혈병, 예컨대 급성 림프구성 백혈병(ALL)(예를 들어, B-세포 ALL, T-세포 ALL), 급성 골수성 백혈병(AML)(예를 들어, B-세포 AML, T-세포 AML), 만성 골수성 백혈병(CML)(예를 들어, B-세포 CML, T-세포 CML), 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)(예를 들어, B-세포 CLL, T-세포 CLL); 림프종, 예컨대 호지킨 림프종(HL)(예를 들어, B-세포 HL, T-세포 HL) 및 비호지킨 림프종(NHL)(예를 들어, B-세포 NHL, 예컨대 미만성 대세포 림프종(DLCL)(예를 들어, 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL)), 소포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병/소림프구성 림프종(CLL/SLL), 외투 세포 림프종(MCL), 변연부 B-세포 림프종(예를 들어, 점막-관련 림프 조직(MALT) 림프종, 결절성 변연부 B-세포 림프종, 비장 변연부 B-세포 림프종), 원발성 종격 B-세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 림프형질세포성 림프종(즉, "발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia"), 면역모세포성 대세포 림프종, 모양세포성 백혈병(HCL), 전구체 B-림프모세포성 림프종 및 원발성 중추신경계(CNS) 림프종; 및 T-세포 NHL, 예컨대 전구체 T-림프모세포성 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종(PTCL)(예를 들어, 피부 T-세포 림프종(CTCL)(예를 들어, 균상식육종, 세자리(Sezary) 증후군), 혈관 면역모세포성 T-세포 림프종, 결절외 천연 살생 T-세포 림프종, 장병증형 T-세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T-세포 림프종, 역형성 대세포 림프종); 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 백혈병/림프종의 혼합; 및 다발성 골수종(MM)), 중쇄 질환(예를 들어, 알파 쇄 질환, 감마 쇄 질환, mu쇄 질환), 혈관 모세포종, 염증성 근섬유모세포 종양, 면역세포성 아밀로이드증, 신장암(예를 들어, 신모세포종(빌름스 종양(Wilms' tumor)으로도 알려짐), 신세포 암종), 간암(예를 들어, 간세포암(HCC), 악성 간종양), 폐암(예를 들어, 기관지 암종, 비소세포 폐암(NSCLC), 편평세포 폐암(SLC), 폐의 선암종, 루이스 폐암종, 폐 신경내분비 종양: 전형적 유암종, 비정형 유암종, 소세포 폐암(SCLC), 및 대세포 신경내분비 암종), 평활근 육종(LMS), 비만 세포증(예를 들어, 전신 비만세포증), 골수이형성 증후군(MDS), 중피종, 골수 증식성 장애(MPD)(예를 들어, 진성적혈구증가증(PV), 특발성 혈소판 증가증(ET), 원인불명 골수화생(AMM)(골수섬유증(MF)으로도 알려짐), 만성 특발성 골수섬유증, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 호산구 증후군(HES)), 신경 모세포종, 신경 섬유종(예를 들어, 신경섬유종증(NF) 1형 또는 2형, 신경초종증(schwannomatosis)), 신경내분비암(예를 들어, 위장관 내분비종양 종양(GEP-NET), 카르시노이드 종양), 골육종, 난소암(예를 들어, 낭선암종, 난소 배아 암종, 난소 선암종), 유두 선암종, 췌장암(예를 들어, 췌장 선암종, 췌장 내 유두상 점액 종양(IPMN), 작은 섬 세포 종양), 음경암(예를 들어, 음경과 음낭의 파제트 병(Paget's disease)), 송과체종, 원시 신경 외배엽 종양(PNT), 전립선암(예를 들어, 전립선 선암종), 직장암, 횡문근 육종, 타액선 암, 피부암(예를 들어, 편평 세포 암종(SCC), 각화극세포종(KA), 흑색종, 기저 세포 암종(BCC)), 소장암(예를 들어, 충수암), 연조직 육종(예를 들어, 악성 섬유성 조직구종(MFH), 지방 육종, 악성 말초 신경 초 종양(MPNST), 연골 육종, 섬유 육종, 점액 육종), 피지선 암종, 땀샘 암종, 활막종, 고환암(예를 들어, 정상 피종, 고환 배아 암종), 갑상선암(예를 들어, 갑상선의 유두상 암종, 유두 갑상선 암종(PTC), 갑상선 수질 암), 요도암, 질암 및 외음부 암(예를 들어, 외음부의 파제트 병)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 신경퇴행성 질환의 예는 운동 신경 질환, 진행성 핵상 마비, 피질기저핵변성, 픽 병(Pick's disease), 알츠하이머 병, AIDS-관련 치매, 파킨슨 병, 근위축성 측삭 경화증, 망막색소변성증, 척수성 근위축, 및 소뇌 변성을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 심혈관계 질환의 예는 심장 비대, 재발협착증, 죽상동맥경화증, 및 사구체신염을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는 여드름과 관련된 염증, 빈혈(예를 들어, 재생불량성 빈혈, 용혈성 자가면역 빈혈), 비염, 천식, 동맥염(예를 들어, 다발동맥염, 측두동맥염, 결절성 동맥주위염, 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis)), 관절염(예를 들어, 결정체 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 통풍성 관절염, 반응성 관절염, 류마티스 관절염 및 라이터 관절염(Reiter's arthritis)), 상기도 질환, 강직성 척추염, 아밀로시스(amylosis), 근위축성 측삭 경화증, 자가 면역 질환, 알레르기 또는 알레르기 반응, 죽상동맥경화증, 기관지염, 활액낭염, 만성 전립선염, 결막염, 샤가스 병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 게실염, 피부근염, 당뇨병(예를 들어, I형 당뇨병, 2형 당뇨병), 피부 병태(예를 들어, 건선, 습진, 습진 과민 반응, 화상, 피부염, 소양증(가려움)), 자궁내막증, 길랭 바레 증후군(Guillain-Barresyndrome), 감염, 허혈성 심장 질환, 가와사키 병, 사구체신염, 치은염, 과민증, 두통(예를 들어, 편두통, 긴장성 두통), 장폐색(예를 들어, 수술후 장폐색 및 패혈증 동안의 장폐색), 특발성 혈소판 감소성 자반증, 간질성 방광염(방광 통증 증후군), 위장 질환(예를 들어, 소화성 궤양, 국한성 장염, 게실염, 위장 출혈, 호산구성 위장 질환(예를 들어, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 결장염), 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD, 또는 그의 동의어 GERD), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론 병, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 우회 결장염, 베체트 증후군, 불확정 결장염) 및 염증성 장 증후군(IBS)으로부터 선택됨), 루푸스, 반상경피증, 중증 근무력증, 심근허혈, 다발성 경화증, 신증후군, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 소화성 궤양, 다발성 근염, 원발성 담즙성 강경변, 뇌질환과 관련된 신경염증(예를 들어 , 파킨슨 병, 헌팅턴 병 및 알츠하이머 병), 전립선염, 두개 방사선 상해와 관련된 만성 염증, 골반 염증성 질환, 재관류 상해, 국한성 장염, 류마티스 열, 전신성 홍반성 루푸스, 피부경화증, 유육종증, 척추관절병, 쇼그렌 증후군, 갑상선염, 이식 거부 반응, 건염, 외상 또는 상해(예를 들어, 동상, 화학적 자극, 독소, 흉터, 화상, 물리적 상해), 혈관염, 백반 및 베게너 육아종증을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특히, 염증성 질환은 급성 염증성 질환(예를 들어, 감염으로 인한 염증)일 수 있다. 특히, 염증성 질환은 만성 염증성 질환(예를 들어, 천식, 관절염 및 염증성 장 질환으로 인한 병태)일 수 있다. 또한 PRMT5 저해제는 비염증성 근육통 및 외상과 관련된 염증을 치료하는 데 유용할 수 있다. 또한 본 화합물은 암과 관련된 염증을 치료하는 데 유용할 수 있다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 예는 관절염(류마티스 관절염, 척추관절병, 통풍성 관절염, 퇴행성 관절 질환, 예컨대 골관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 강직성 척추염, 미분화 척추염, 베체트병, 용혈성 자가면역 빈혈, 근위축성 측삭 경화증, 아밀로시스, 다발성 경화증, 급성 어깨 통증, 건선성, 및 소아 관절염을 포함함), 천식, 죽상동맥경화증, 골다공증, 기관지염, 건염, 활액낭염, 피부 병태(예를 들어, 건선, 습진, 습진 과민 반응, 화상, 피부염, 소양증(가려움)), 야뇨증, 호산구성 질환, 위장 질환(예를 들어, 소화성 궤양, 국한성 장염, 게실염, 위장 출혈, 호산구성 위장 질환(예를 들어, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 결장염), 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD, 또는 그의 동의어 GERD), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들어, 크론병, 궤양성 결장염, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 우회 결장염, 베체트 증후군, 불확정 결장염) 및 염증성 장 증후군(IBS)으로부터 선택됨), 및 위운동 촉진제에 의해 완화되는 질환(예를 들어, 장폐색, 수술후 장폐색 및 패혈증 동안의 장폐색; 위식도 역류 질환(GORD, 또는 그의 동의어 GERD); 호산구성 식도염, 위마비, 예를 들어 당뇨병성 위마비; 음식물 불내증 및 식품 알러지 및 기타 기능성 장 질환, 예컨대 비궤양성 소화불량(NUD) 및 비심인성 흉통(NCCP, 늑연골염을 포함함))을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
특정 실시 형태에서, PRMT5 저해제는 체세포 재프로그래밍, 예를 들어 줄기 세포로의 체세포의 재프로그래밍에 유용할 수 있다. 특정 실시 형태에서, PRMT5 저해제는 생식 세포 발달에 유용할 수 있으며, 따라서 생식 기술 및 재생 의학 분야에 유용한 것으로 생각된다.
치료 또는 예방될 수 있는, 특히 치료될 수 있는 기타 질환은 심근경색과 관련된 허혈성 상해, 면역학적 질환, 뇌졸중, 부정맥, 독소-유도 또는 알코올 관련 간 질환, 아스피린-민감성 부비동염, 낭포성 섬유증, 암 통증, 및 혈액학적 질환, 예를 들어 만성 빈혈 및 재생불량성 빈혈을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
따라서 본 발명은 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5(PRMT5) 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법을 포함하며, 이는 하기 중 임의의 것의 존재에 대하여 환자 유래의 생물학적 샘플을 평가하는 단계를 포함한다:
· PIC3CA 활성화 돌연변이,
· 스플라이소솜 변경,
· 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는
· WNT 경로 변경
(여기서, 임의의 상기 돌연변이 또는 변경의 존재는 상기 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 상기 환자가 반응성일 가능성이 임의의 상기 돌연변이 또는 변경의 부재 하에서보다 더 높음을 나타냄).
바람직한 실시 형태에서, 스플라이소솜 변경은 U2AF1, RBM10 및 KIAA1429로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이를 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 유전자는 U2AF1이며, 돌연변이는 S34F이다. 또 다른 구체적인 실시 형태에서, 유전자는 RBM10이며, 돌연변이는 I696fs, I348N, G840fs로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시 형태에서, 유전자는 KIAA1429이며, 돌연변이는 L837V, F1260L, D251if, T1333M, V1548L, G397A 및 Q962E로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한 다른 스플라이소솜 변경은 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 환자가 반응성일 가능성이 더 높음을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, PIC3CA 활성화 돌연변이는 H1047R, PG106-R108del, T1025A 및 E542K로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나, 다른 활성화 돌연변이도 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 환자가 반응성일 가능성이 더 높음을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 사이클린 D1 경로 증폭은 Cyclin D1, CDK4 또는 CDK6 발현의 증폭이다. 그러나, 다른 사이클린 D1 경로 증폭도 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 환자가 반응성일 가능성이 더 높음을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, WNT 경로 변경은 자가분비 WNT 신호전달을 포함한다. 바람직하게는, WNT 경로 변경은 APC 또는 CTNNB1 유전자의 돌연변이를 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 유전자는 APC이며, 돌연변이는 R213Q, R2673G, I1177M 및 D2796G로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체적인 실시 형태에서, 유전자는 CTNNB1이며, 돌연변이는 Y670*, S45F, 및 T41A로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나, 다른 WNT 경로 변경도 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 환자가 반응성일 가능성이 더 높음을 나타낼 수 있다.
특정한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 또는 변경은 스플라이소솜 변경을 포함하며, 환자는 NSCLC를 갖는다.
또 다른 특정한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 또는 변경은 사이클린 D1 경로 증폭 또는 WNT 경로 변경을 포함하며, 환자는 NSCLC를 갖는다.
또 다른 특정한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 돌연변이 또는 변경은 PIC3CA 활성화 돌연변이를 포함하며, 환자는 SCLC를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서, PRMT5 저해제는 화합물 2 또는 화합물 80이다.
본 출원에는 민감성이 NSCLC에서 WNT 경로 상향조절 및 스플라이소솜 변경, 그리고 SCLC에서 PI3K-알파 활성화 돌연변이와 관련됨이 개시되어 있다. 사이클린 D1 경로 증폭은 NSCLC에서 PRMT5 저해제 반응과 연관된다.
생물학적 샘플에서 상기에 기술된 바와 같은 하나 이상의 돌연변이 또는 변경의 존재를 확인하기 위한 키트 및 프라이머가 본원에서 추가로 제공된다.
본 발명의 개시된 방법, 키트, 및 프라이머는 본 발명의 일부를 형성하는 첨부된 도면과 함께 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]을 참조하면 더 쉽게 이해될 수 있다. 본 발명의 개시된 방법, 키트 및 프라이머는 본원에 기술되고/되거나 예시된 특정한 방법, 키트 및 프라이머에 한정되지 않으며, 본원에서 사용되는 용어는 단지 예로서 특정 실시 형태를 설명하려는 목적을 위한 것으로서, 청구된 방법, 키트 및 프라이머를 한정하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
특정한 수치의 언급은, 그 문맥이 명확하게 달리 기술하지 않는 한, 적어도 그 특정 수치를 포함한다. 값들의 범위를 표현할 때, 또 다른 실시 형태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 하나의 특정 값까지를 포함한다. 또한, 범위로 기술된 값의 언급은 그 범위 내의 각각의 모든 값을 포함한다. 모든 범위는 포괄적이며 조합가능하다.
명확함을 위하여, 별개의 실시 형태의 맥락에서 본원에 설명된 본 발명의 개시된 방법들, 키트들 및 프라이머들의 특정한 특징들은 또한 단일 실시 형태로 조합되어 제공될 수 있음을 알아야 한다. 또한, 역으로, 간결함을 위하여 단일 실시 형태의 맥락에서 설명된 본 발명의 개시된 방법들, 키트들 및 프라이머들의 다양한 특징들이 개별적으로 또는 임의의 하위 조합으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 복수형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하는" 및 이와 유사한 용어들은 암 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소, 암 증상 및/또는 상기 증상의 근본 원인의 제거, 암 증상의 빈도 또는 가능성 및/또는 그의 근본 원인의 감소, 및 암에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 야기되는 손상의 개선 또는 교정을 지칭한다.
"생물학적 샘플"은 암성 세포가 수득될 수 있고 RNA가 단리될 수 있는 환자 유래의 임의의 샘플을 지칭한다. 적합한 생물학적 샘플은 혈액, 림프액, 골수, 고형 종양 샘플, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "증폭 전"은 증폭 단계를 위한 주형 cDNA의 양의 증가를 위하여 증폭 단계 전에 수행되는 PCR 절차를 지칭한다. 증폭 전 단계는 예를 들어 TaqMan® PreAmp Master Mix(Life Technologies/Applied Biosystems® 제품 번호 4391128)를 사용하여 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "증폭시키는", "증폭시키다" 및 이와 유사한 용어들은 핵산 샘플의 다수의 동일한 카피의 생성을 지칭한다. 핵산 샘플의 증폭에 적합한 기술은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 실시간 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 증폭 단계는 RT-PCR을 포함한다.
"차세대 서열결정법" 또는 "NGS"는 개개의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나(예를 들어, 단일 분자 서열결정법으로) 또는 개개의 핵산 분자의 클론 확대 프록시들의 뉴클레오티드 서열을 고 처리량의 병행 방식으로 결정하는(예를 들어, 103, 104, 105가지 이상의 분자가 동시에 서열결정될 수 있음) 임의의 서열결정 방법을 지칭한다. 예시적인 차세대 서열결정 기술은 합성에 의한 서열결정, 라이게이션에 의한 서열결정, 및 혼성화에 의한 서열결정을 포함한다. 예시적인 차세대 서열결정 방법은 Massively Parallel Signature Sequencing(Lynx Therapeutics); 454 파이로-서열결정법(pyro-sequencing)(454 Life Sciences/Roche Diagnostics); 고상, 가역성 염료-종결자 서열결정법(Solexa/Illumina); SOLiD 기술(Applied Biosystems); Ion 반도체 서열결정법(Ion Torrent); 및 DNA 나노볼 서열결정법(nanoball sequencing)(Complete Genomics)을 포함한다. 특정 NGS 플랫폼의 설명은 다음의 것에서 발견될 수 있다: 문헌[Shendure, et al, "Next-generation DNA sequencing," Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145];
NGS 플랫폼
일부 실시 형태에서, 고 처리량, 대량 병행 서열결정법은 가역성 염료 종결자를 이용한 합성에 의한 서열결정을 이용한다. 다른 실시 형태에서, 서열결정은 라이게이션에 의한 서열결정을 통하여 수행된다. 또 다른 실시 형태에서, 서열결정은 단일 분자 서열결정이다. 차세대 서열결정 기술의 예는 파이로서열결정법, 가역성 염료-종결자 서열결정법, SOLiD 서열결정법, Ion 반도체 서열결정법, Helioscope 단일 분자 서열결정법 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
Ion Torrent™(Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 앰플리콘 서열결정 시스템은 DNA 복제에서 비변형 뉴클레오티드의 혼입 중에 수소 이온이 방출됨으로써 야기되는 pH 변화를 탐지하는 유동-기반 접근법을 이용한다. 이 시스템과 함께 사용하기 위하여, 서열결정 라이브러리는 처음에 서열결정 어댑터가 측면에 있는 DNA 단편을 생성함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, 이러한 단편은 에멀젼 PCR에 의해 입자 상에서 클론 증폭될 수 있다. 그 후, 증폭된 주형을 갖는 입자는 규소 반도체 서열결정 칩 내에 두어진다. 복제 중에, 상기 칩은 뉴클레오티드가 차례로 범람하며, 뉴클레오티드가 칩의 특정 마이크로웰 내의 DNA 분자를 상보한다면, 이것이 혼입될 것이다. 뉴클레오티드가 폴리머라아제에 의해 DNA 분자 내에 혼입될 경우 양성자가 자연스럽게 방출되어 pH의 검출가능한 국소적 변화로 이어진다. 그러면 용액의 pH는 그 웰 내에서 변화되어 이온 센서에 의해 검출된다. 단독중합체 반복체가 주형 서열에 존재할 경우, 다수의 뉴클레오티드가 단일 사이클에서 혼입될 것이다. 이것은 상응하는 개수의 방출 수소 및 비례적으로 더 높은 전자 신호를 초래한다.
454TM GS FLX™ 서열결정 시스템(Roche, 독일 소재)은 대규모 병행 파이로서열결정 시스템에서 광-기반 검출 방법을 이용한다. 파이로서열결정법은 DNA 중합을 이용하는데, 이는 한 번에 하나의 뉴클레오티드 종을 부가하고, 부착된 파이로포스페이트의 방출에 의한 발광을 통하여 주어진 위치에 부가된 뉴클레오티드의 개수를 탐지 및 정량화한다. 454™ 시스템과 함께 사용하기 위하여, 어댑터-라이게이션된 DNA 단편은 유중수 에멀젼 중 작은 DNA-포획 비드에 고정되고, PCR에 의해 증폭된다(에멀젼 PCR). 각각의 DNA-결합 비드는 피코타이터(picotiter) 플레이트 상의 웰 내로 두어지고, 서열결정 시약은 상기 플레이트의 웰을 가로질러 전달된다. 서열결정 실행 중에 4가지의 DNA 뉴클레오티드는 피코타이터 플레이트 디바이스를 가로질러 고정된 순서로 순차적으로 부가된다. 뉴클레오티드 유동 중에, 비드 각각에 결합된 DNA의 수 백만개의 카피가 병행적으로 서열결정된다. 주형 가닥에 상보성인 뉴클레오티드가 웰에 첨가되는 경우, 상기 뉴클레오티드는 기존의 DNA 가닥에 혼입되어 광 신호를 생성하고, 이는 상기 기기 내의 CCD 카메라에 의해 기록된다.
가역성 염료-종결자를 기반으로 한 서열결정 기술: DNA 분자는 먼저 슬라이드 상의 프라이머에 부착되고, 증폭되어서 국소적 클론 콜로니가 형성되게 한다. 4가지 유형의 가역성 종결자 염기(RT -염기)가 부가되고, 비-혼입 뉴클레오티드가 세척 제거된다. 파이로서열결정법과는 달리, DNA는 단지 한 번에 뉴클레오티드 하나씩 연장될 수 있다. 카메라는 형광 표지 뉴클레오티드의 영상을 촬영하며, 그 후 염료는 말단 3' 차단자와 함께 DNA로부터 화학적으로 제거되어 다음 사이클을 가능하게 한다.
Helicos의 단일-분자 서열결정법은 폴리A 테일 어댑터가 부가된 DNA 단편을 이용하는데, 상기 어댑터는 유동 세포 표면에 부착된다. 각각의 사이클에서, DNA 폴리머라아제 및 단일 형광 표지 뉴클레오티드 종이 첨가되어, 표면-고정 프라이머-주형 이중가닥의 주형-의존적 연장으로 이어진다. 판독은 Helioscope 서열결정기에 의해 수행된다. 전체 어레이(array)를 타일링하는 영상의 획득 후, 형광 표지체의 화학적 절단 및 방출은 연장 및 영상화의 후속 사이클을 가능하게 한다.
합성에 의한 서열결정법(SBS), 예컨대 "옛날식" 염료-종결 전기영동적 서열결정법은 염기 서열을 결정하기 위하여 DNA 폴리머라아제에 의해 뉴클레오티드를 혼입하는 것에 의존한다. 어댑터가 부착된 DNA 라이브러리는 단일 가닥으로 변성되며, 유동 세포에 그래프팅되고, 이어서 가교 증폭되어 유리 칩 상에 고밀도 스폿(spot) 어레이를 형성한다. 가역성 종결자 방법은 가역성 버전의 염료-종결자를 이용하여, 한 번에 뉴클레오티드 하나씩을 부가하고, 또 다른 뉴클레오티드의 중합을 허용하도록 차단기의 반복 제거에 의해 각각의 위치에서 형광을 검출한다. 뉴클레오티드 혼입의 신호는 사용된 모든 형광 표지된 뉴클레오티드, 포스페이트-구동 광 반응 및 수소 이온 감작에 따라 달라질 수 있다. SBS 플랫폼의 예는 Illumina GA 및 HiSeq 2000을 포함한다. MiSeq® 개인용 서열결정 시스템(Illumina, Inc.)도 가역성 종결자 화학을 이용한 합성에 의한 서열결정법을 이용한다.
합성에 의한 서열결정 방법과는 대조적으로, 라이게이션에 의한 서열결정 방법은 표적 서열을 결정하기 위하여 DNA 라이가아제를 이용한다. 이러한 서열결정 방법은 주형 DNA 가닥 상의 국소적 상보성을 통한 인접한 올리고뉴클레오티드들의 효소적 라이게이션에 의존한다. 이 기술은 서열결정 위치에 따라 표지된 고정된 길이의 모든 가능한 올리고뉴클레오티드들의 분할을 이용한다. 올리고뉴클레오티드들은 어닐링되고, 라이게이션되고, 매칭 서열들을 위한 DNA 라이가아제에 의한 우선적인 라이게이션은 (올리고를 따라 공지된 위치의 공지된 뉴클레오티드에 상응하는 형광 표지 프로브의 방출을 통하여) 그 위치에서의 디뉴클레오티드 코딩된 색공간 신호를 생성한다. 이러한 방법은 주로 Life Technologies의 SOLiD™ 서열결정기에 의해 사용된다. 서열결정 전에, DNA는 에멀젼 PCR에 의해 증폭된다. 각각이 동일 DNA 분자의 카피만을 포함하는 생성된 비드는 고체 편평 기재 상에 침적된다.
SMRT™ 서열결정법은 합성에 의한 서열결정이라는 접근법을 기반으로 한다. DNA는 포획 도구가 웰의 기저부에 위치하는 제로-모드 웨이브 가이드(zero-mode wave-guide; ZMW)-소형 웰-유사 용기에서 합성된다. 서열결정은 비변형 폴리머라아제(ZMW 기저부에 부착됨) 및 형광 표지 뉴클레오티드(용액에서 자유롭게 유동함)를 사용하여 수행된다. 웰은 웰의 기저부에 나타나는 형광만이 검출되도록 하는 방식으로 구성된다. 형광 표지체는 DNA 가닥 내로의 뉴클레오티드의 혼입시에 뉴클레오티드로부터 탈리되어 비변형 DNA 가닥을 남긴다.
돌연변이체를 증폭시키기 위한 프라이머
당업자라면 핵산의 증폭이, 상보성이고 증폭시키고자 하는 영역의 측면에 위치하는 핵산 가닥의 5' 및 3' 영역에 결합하는 프라이머들을 필요로 함을 알고 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"은 증폭 단계에서 사용되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 지칭한다.
당업자라면 공지된 방법을 이용하여, 상기에 기술된 바와 같은 특정 돌연변이의 증폭 및 검출에 적합한 프라이머를 확인할 수 있다.
게놈학 및 분석
기능적 게놈학 및 전사 분석은 표준 기술 및 프로토콜을 이용한 경로 및 유전자의 증폭의 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 개시된 방법에 사용하기 위한 PRMT5 저해제
본 발명의 개시된 방법에 사용하기에 적합한 PRMT5 저해제가 본원에서 제공된다. 일부 실시 형태에서, PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭이 샘플에 존재하는 경우, 환자는 PCT/EP2016/070097(본원에 참고로 포함됨)에 개시된 PRMT5 저해제(이의 임의의 호변이성질체 형태 또는 입체화학적 이성질체 형태, 및 이들의 N-산화물, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물(적합한 R 기가 또한 PCT/EP2016/070097에 개시되어 있음)을 포함함)로 치료될 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어, 환자는 화합물 2 또는 화합물 80(이의 임의의 호변이성질체 형태 또는 입체화학적 이성질체 형태, 및 이들의 N-산화물, 이들의 제약상 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물을 포함함)으로 치료될 수 있다. 일부 양태에서, 제약상 허용가능한 염은 HCl 염이다.
일부 실시 형태에서, PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭이 샘플에 존재하는 경우, 환자는 PRMT5 저해제로 치료될 수 있으며, 여기서, PRMT5 저해제는 항-PRMT5 항체이다.
염은 본원에 참고로 포함된 문헌[Pharmaceutical Salts:Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002]에 기술된 방법과 같은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물에서 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용된다. 본 발명의 개시된 방법에서 사용하기 위한 PRMT5 저해제는 염이 형성되는 산의 pKa에 따라 일염 또는 이염으로서 존재할 수 있다.
산 부가염은 매우 다양한 유기산 및 무기산에 의해 형성될 수 있다. 산 부가염의 예는 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산(예를 들어, L-아스코르브산), L-아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 부탄산, (+) 캄포르산, 캄포르-술폰산, (+)-(1S)-캄포르-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디술폰산, 에탄술폰산, 2-하이드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, D-글루콘산, 글루쿠론산(예를 들어, D-글루쿠론산), 글루탐산(예를 들어, L-글루탐산), α-옥소글루타르산, 글리콜산, 히푸르산, 브롬화수소산, 염화수소산, 요오드화수소산, 이세티온산, 락트산(예를 들어, (+)-L-락트산, (±)-DL-락트산), 락토비온산, 말레산, 말산, (-)-L-말산, 말론산, (±)-DL-만델산, 메탄술폰산, 나프탈렌술폰산(예를 들어, 나프탈렌-2-술폰산), 나프탈렌-1,5-디술폰산, 1-하이드록시-2-나프트산, 니코틴산, 질산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 인산, 프로피온산, L-파이로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노-살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 황산, 탄닌산, (+)-L-타르타르산, 티오시안산, 톨루엔술폰산(예를 들어, p-톨루엔술폰산), 운데실렌산 및 발레르산과, 아실화된 아미노산 및 양이온 교환 수지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 산에 의해 형성되는 염을 포함한다.
하나의 특정한 염의 군은 아세트산, 염화수소산, 요오드화수소산, 인산, 질산, 황산, 시트르산, 락트산, 숙신산, 말레산, 말산, 이세티온산, 푸마르산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산(메실레이트), 에탄술폰산, 나프탈렌술폰산, 발레르산, 아세트산, 프로판산, 부탄산, 말론산, 글루쿠론산 및 락토비온산으로부터 형성되는 염으로 이루어진다. 또 다른 산 부가염의 군은 아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 아스파르트산, 시트르산, DL-락트산, 푸마르산, 글루콘산, 글루쿠론산, 히푸르산, 염화수소산, 글루탐산, DL-말산, 메탄술폰산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산 및 타르타르산으로부터 형성되는 염을 포함한다.
화합물이 음이온성이거나, 음이온성일 수 있는 작용기를 갖는다면(예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있음), 염은 적합한 양이온에 의해 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예는 Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2+ 및 Mg2+와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al3+와 같은 다른 양이온을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예는 암모늄 이온(즉, NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온(예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예로는 다음으로부터 유도되는 것이 있다: 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민과, 라이신 및 아르기닌과 같은 아미노산. 일반적인 4차 암모늄 이온의 예로는 N(CH3)4 +가 있다.
화합물이 아민 작용체를 포함하는 경우, 화합물은, 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 알킬화제와의 반응에 의해, 4차 암모늄 염을 형성할 수 있다. 이러한 4차 암모늄 화합물은 본 발명의 개시된 화합물의 범주 내에 있다. 아민 작용체를 포함하는 화합물은 또한 N-산화물을 형성할 수 있다. 본원에서 아민 작용체를 포함하는 화합물의 언급은 또한 N-산화물을 포함한다. 화합물이 몇 개의 아민 작용체를 포함할 경우, 하나 이상의 질소 원자가 N-산화물을 형성하도록 산화될 수 있다. N-산화물의 특정 예로는 질소-함유 복소환의 질소 원자 또는 3차 아민의 N-산화물이 있다. N-산화물은 과산화수소 또는 과산(예를 들어, 퍼옥시카르복실산)과 같은 산화제로 상응하는 아민을 처리하는 것에 의해 형성될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages.]을 참조한다. 더 구체적으로, N-산화물은 문헌[L. W. Deady (Syn. Comm. (1977), 7, 509-514)]의 절차에 의해 만들어질 수 있으며, 여기서, 아민 화합물을 예를 들어 디클로로메탄과 같은 불활성 용매에서 m-클로로퍼옥시벤조산(MCPBA)과 반응시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용매화물"은 화합물과 하나 이상의 용매 분자의 물리적 회합을 의미한다. 이 물리적 회합은, 수소 결합을 포함하여, 다양한 정도의 이온 결합 및 공유 결합을 포함한다. 특정 예에서 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 결정성 고체의 결정 격자 내로 혼입된 경우 단리될 수 있다. 용어 "용매화물"은 용액-상 및 단리가능한 용매화물 둘 다를 포함하고자 한다. 적합한 용매화물의 비제한적 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 또는 에탄올아민 등과 조합된 본 발명의 개시된 화합물을 포함한다. 본 화합물은 용액 상태로 있는 동안 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
용매화물은 제약 화학에서 잘 알려져 있다. 용매화물은 물질의 제조를 위한 공정(예를 들어, 이들의 정제와 관련하여), 물질의 보관(예를 들어, 이의 안정성) 및 물질의 처리의 용이성에서 중요할 수 있고 종종 화학적 합성의 단리 또는 정제 단계의 일부로서 형성된다. 당업자라면 수화물 또는 다른 용매화물이 주어진 화합물을 제조하기 위해 사용된 단리 조건 또는 정제 조건에 의해 형성되었는지를 오랫동안 사용된 표준 기술에 의해 결정할 수 있다. 이러한 기술의 예는 열중량 분석(TGA), 시차 주사 열량분석(DSC), X-선 결정학(예를 들어, 단결정 X-선 결정학 또는 X-선 분말 회절) 및 고체상 NMR(SS-NMR, 매직 각 스피닝 NMR 또는 MAS-NMR로도 알려짐)을 포함한다. 이러한 기술은 NMR, IR, HPLC 및 MS만큼 숙련된 화학자의 표준 분석 도구의 중요한 부분이다. 대안적으로, 당업자라면 특정 용매화물에 요구되는 용매의 양을 포함하는 결정화 조건을 사용하여 용매화물을 의도적으로 형성할 수 있다. 이후, 위에 기술된 표준 방법을 사용하여 용매화물이 형성되었는지를 확립할 수 있다. PRMT5 저해제의 임의의 복합체(예를 들어, 사이클로덱스트린과 같은 화합물과의 포접 복합체 또는 포접체, 또는 금속과의 복합체)가 또한 포함된다.
더욱이, 본 화합물은 하나 이상의 다형체(결정성) 또는 비정질 형태를 가질 수 있다.
본 화합물은 하나 이상의 동위원소 치환을 갖는 화합물을 포함하고, 특정 원소에 대한 언급은 이 원소의 모든 동위원소를 그 범주 내에 포함한다. 예를 들어, 수소에 대한 언급은 1H, 2H(D), 및 3H(T)를 그 범주 내에 포함한다. 이와 유사하게, 탄소 및 산소에 대한 언급은 각각 12C, 13C 및 14C, 그리고 16O 및 18O를 그 범주 내에 포함한다. 동위원소는 방사성 또는 비-방사성일 수 있다. 일 실시 형태에서, 화합물은 방사성 동위원소를 포함하지 않는다. 이러한 화합물은 치료적 용도에 바람직하다. 그러나, 또 다른 실시 형태에서 화합물은 하나 이상의 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 이러한 방사성 동위원소를 포함하는 화합물은 진단적 맥락에서 유용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 환자는 하나 이상의 U2AF1 돌연변이체가 샘플에 존재할 경우 PRMT5 저해제로 치료되며, 여기서, PRMT5 저해제는 화합물 2 또는 화합물 80, 또는 이들의 제약상 허용가능한 염 또는 이들의 용매화물이다.
환자에서의 암의 치료 방법
PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭의 존재에 대하여 환자 유래의 생물학적 샘플을 평가하는 단계; 및 PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭이 샘플에 존재하는 경우 환자를 PRMT5 저해제로 치료하는 단계를 포함하는 환자에서의 암의 치료 방법이 본원에 개시된다.
본 발명의 개시된 방법은 다음을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 암의 치료에 사용될 수 있다: 방광암, 전이성 방광암, 난소암, 두경부암, 식도암, 비-소세포 폐 선암종, 비-소세포 폐 편평 세포 암종, 전립선암, 폐암, 위암, 요로 상피 세포 암종, 소세포 폐암, 유방암, 내막암, 담관암종, 교모세포종, 신경교종, 결장암종, 육종, 편평세포 기원의 고형 종양, 및 다발성 골수종.
일부 실시 형태에서, 상기 평가 단계는 다음을 포함한다: RNA를 생물학적 샘플로부터 단리하는 것; cDNA를 상기 단리된 RNA로부터 합성하는 것; cDNA를 사전 증폭시키는 것; 및 PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이에 결합하여 이를 증폭시키는 프라이머쌍을 이용하여 상기 사전 증폭된 cDNA를 증폭시키는 것.
RNA를 생물학적 샘플로부터 단리하는 것은 당업자에게 공지된 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, RNA는 Qiagen으로부터의 AllPrep DNA/RNA FFPE Kit(제품 번호 80234)를 사용하여 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다.
cDNA를 단리된 RNA로부터 합성하는 것은 당업자에게 공지된 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 ABI로부터의 High Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit with RNase Inhibitor(제품 번호 4374966)를 사용하여 단리 RNA로부터 합성될 수 있다.
cDNA의 사전 증폭은 당업자에게 공지된 다수의 절차에 의해 수행될 수 있다. 증폭 절차는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일 실시 형태에서, cDNA는 TaqMan® PreAmp Master Mix(Life Technologies/Applied Biosystems® 제품 번호 4391128)를 사용하여 사전 증폭될 수 있다.
본 치료 방법에서 사용하기에 적합한 PRMT5 저해제는 본원에서 이전에 기술된 것을 포함한다.
a를 이용한 치료에 대하여 반응성인 암환자의 확인 방법으로는 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5(PRMT5)저해제가 있다
돌연변이체 또는 변경된 유전자의 존재를 확인하기 위한 키트
생물학적 샘플에서 PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭의 존재를 확인하기 위한 키트가 추가로 개시되며, 이는 서열들의 조합을 갖는 프라이머 쌍; 및 PIC3CA 활성화 돌연변이, 스플라이소솜 변경, 사이클린 D1 경로 증폭, 및/또는 WNT 경로 변경을 포함하는 하나 이상의 돌연변이 또는 증폭을 탐지하기 위한 분석을 수행하는 것에 대한 설명서를 포함한다.
[발명의 내용]과, 다음의 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해된다. 본 발명의 개시된 방법, 키트, 및 프라이머를 예시하기 위하여, 본 방법, 키트, 및 프라이머의 예시적인 실시 형태가 도면에 예시되어 있지만, 본 방법, 키트, 및 프라이머는 개시된 특정 실시 형태에 한정되지 않는다.
실시예에서 사용되는 PRMT5 저해제인 화합물 2 및 화합물 80은 PCT/EP2016/070097에도 예시되어 있다.
이하, 용어 "rt", "r.t." 또는 "RT"는 실온을 의미하며; "Me"는 메틸을 의미하며; "MeOH"는 메탄올을 의미하며; "Et"는 에틸을 의미하며; "EtOH"는 에탄올을 의미하며; "NaH"는 수소화나트륨을 의미하며; "DEAD"는 디에틸 아조디카르복실레이트를 의미하며; "HMPT"는 헥사메틸포스포러스 트리아미드를 의미하며; "Boc2O"는 tert-부톡시카르보닐 언히드라이드를 의미하며; "ButONO"는 tert-부틸 니트라이트를 의미하며; "TosOH"는 4-메틸벤젠술폰산을 의미하며; "TosCl"은 4-메틸벤젠술포닐 클로라이드(또한 p-톨루엔술포닐 클로라이드)를 의미하며; "CMBP"는 시아노메틸렌트리부틸 포스포란을 의미하며; "DBAD"는 디-tert-부틸 아조디카르복실레이트를 의미하며; "LAH"는 수소화리튬알루미늄을 의미하며; "NaBH(AcO)3" 또는 "NaBH(OAc)3"은 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 의미하며; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 의미하며; "TEA" 또는 "Et3N"은 트리에틸아민을 의미하며; "DCM"은 디클로로메탄을 의미하며; "q.s."는 충분량을 의미하며; "Int."는 중간체를 의미하며; "MeCN" 또는 "ACN"은 아세토니트릴을 의미하며; "DMF"는 N,N-디메틸 포름아미드를 의미하며; "DMA"는 N,N-디메틸아세트아미드를 의미하며; "DMF-DMA"는 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈을 의미하며; "Pd(dppf)Cl2"는 [1,1′-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)을 의미하며; "THF"는 테트라히드로푸란을 의미하며; "C34H28FeP2.Cl2Pd"는 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센] 디클로로팔라듐(ii)을 의미하며; "i-PrOH" 또는 "iPrOH"는 2-프로판올을 의미하며; "LC"는 액체 크로마토그래피를 의미하며; "LCMS"는 액체 크로마토그래피/질량 분광법을 의미하며; "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며; "int."는 중간체를 의미하며; "분취용 HPLC"는 분취용 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며; "m-CPBA"는 메타-클로로퍼옥시벤조산을 의미하며; "TFA"는 트리플루오로아세트산을 의미하며; "m.p."는 융점을 의미하며; "RP"는 역상을 의미하며; "min"은 분을 의미하며; "h"는 시간을 의미하며; "PE"는 석유 에테르를 의미하며; "v/v"는 부피/부피를 의미하며; "Celite®"는 규조토를 의미하며; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 의미하며; "SFC"는 초임계 유체 크로마토그래피를 의미하며; "DIPE"는 디이소프로필 에테르를 의미하며; "dppf" 또는 "DPPF"는 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센을 의미하며; "DIPEA" 또는 "DIEA"는 N,N-디이소프로필에틸아민을 의미하며; "PPh3"은 트리페닐포스핀을 의미하며; "Et2O"는 디에틸 에테르를 의미하며; "Pd/C"는 탄소 상의 팔라듐을 의미하며; "Pt/C"는 탄소 상의 백금을 의미하며; "Pd(OH)2/C"는 탄소 상의 수산화팔라듐을 의미하며; "CPME"는 사이클로펜틸 메틸 에테르를 의미하며; "Pd2(dba)3은 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐을 의미하며; "DIAD"는 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 의미하며; "TMSCF3"은 트리메틸(트리플루오로메틸)실란을 의미하며; "TBAF"는 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 의미하며; "psi"는 파운드-힘/제곱 인치를 의미하며; "Et4NCl"은 테트라에틸암모늄 클로라이드를 의미하며; "eq."는 당량을 의미하며; "Pd(OAc)2"는 아세트산팔라듐(II)을 의미하며; "AcOH"는 아세트산을 의미하며; "DMAP"는 4-(디메틸아미노)피리딘을 의미하며; "t-BuOK", "tBuOK" 또는 "KOtBu"는 포타슘 tert-부톡시드를 의미하며; "데스-마틴 퍼요오디난(Dess-Martin periodinane)"은 1,1,1-트리아세톡시-1,1-디히드로-1,2-벤즈요오독솔-3(1H)-온을 의미하며; "TBDMSCl"은 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드를 의미하며; "PPh3-중합체" 또는 "PPh3-pol"은 결합된 트리페닐포스핀 중합체를 의미하며; "Ph3PCH3Br"은 메틸트리페닐포스포늄 브로마이드를 의미하며; "Bn"은 벤질을 의미하며; "Bz"는 벤조일을 의미하며; "p-TSA"는 4-메틸벤젠술폰산을 의미하며; "BF3.Et2O"는 삼플루오르화붕소-에틸 에테르 복합체를 의미하며; "9-BBN"은9-보라바이사이클로[3.3.1]노난을 의미하며; "Pd-118"은 디클로로[1,1′-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센]팔라듐(II)을 의미하며; "TLC"는 박막 크로마토그래피를 의미하며; "분취용-TLC"는 분취용 TLC를 의미하며; "p-MeC6H4SO3H.H2O"는 파라 톨루엔술폰산 수화물을 의미하며; "PMB"는 파라 메톡시벤질을 의미하며; "KOAc"는 아세트산칼륨을 의미하며; "PTSA"는 파라 톨루엔술폰산을 의미하며; "MTBE"는 메틸 tert. 부틸 에테르를 의미하며; Rh(acac)(eth)2"는 아세틸아세토나토비스(에틸렌)로듐(I)을 의미하며; "(S)-MonoPhos"는 (S)-N,N-디메틸디나프토[2,1-D:1',2'-F][1,3,2]디옥사포스페핀-4-아민을 의미하며; "Tf2O"는 트리플산 무수물을 의미하며; "MeI"는 메틸요오다이드를 의미하며; "Me2NH"는 디메틸아민을 의미하며; "Me2NH.HCl"은 디메틸아민 염산을 의미하며; "Me4NCl"은 테트라메틸암모늄 클로라이드를 의미하며; "MeONa"는 소듐 메톡시드를 의미하며; "Ts"는 토실을 의미하며; "MsCl"은 메실클로라이드를 의미하며; "DIBAH"는 디이소부틸알루미늄 히드라이드를 의미하며; "TBDMS"는 tert부틸 디메틸실릴을 의미하며; "Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2"은 [1,1′-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II), 디클로로메탄과의 복합체를 의미하며; "PPA"는 폴리인산을 의미하며; "NH2Bn"은 벤질아민을 의미하며; "Pd(PPh3) 2Cl2"는 디클로로비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II)을 의미한다.
다음 반응 단계에서 조 물질로서 또는 부분 정제 중간체로서 사용된 중간체에 있어서, 개산된 mol 양(일부의 경우
Figure pct00001
로 표시됨)이 하기에 기술된 반응 프로토콜에서 표시되거나, 또는 대안적으로 이론적인 mol 양이 표시된다.
중간체 1의 제조
Figure pct00002
N2 하에 25℃에서 아세톤(330 mL) 중 6-클로로-7-데아자퓨린베타-d-리보사이드(25.0 g, 87.5 mmol)의 혼합물에 2,2-디메톡시프로판(18.2 g, 175 mmol) 및 4-메틸벤젠술폰산(TosOH)(1.51 g, 8.75 mmol)을 한꺼번에 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 25℃까지 냉각시켰다. 반응물을 포화 NaHCO3(100 mL)을 서서히 첨가하여 켄칭하고, 그 후 에틸 아세테이트(125 mL x 5)로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 염수(120 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(구배 용출: 1:0으로부터 2:1까지의 DCM/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 조 중간체 1(38.0 g)을 연한 황색 검으로서 수득하였다.
중간체 59의 제조
Figure pct00003
디이소프로필 아조디카르복실레이트(0.221 mL, 1.125 mmol)를 실온에서 THF(8 ml) 중 중간체 1(0.27 g, 0.80 mmol), 3-브로모퀴놀린-7-올(0.18 g, 0.80 mmol) 및 트리페닐포스핀 수지(0.375 g, 3 mmol/g, 1.125 mmol)의 교반 현탁물에 적가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 Dicalite® 패드로 여과하였다. 잔사를 메탄올로 세척하였다. 여과액의 용매를 증발시켰다. 잔사를 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
중간체 105의 제조
Figure pct00004
조 중간체 59(q.s., 이론적으로 0.83 mmol)를 MeOH 중 7 M NH3(20 mL, 7 M, 140 mmol)에 용해시켰다. 생성된 용액을 교반시키고, 마이크로웨이브 조사를 이용하여 130℃에서 2시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시켰다. 잔사를 디클로로메탄에 용해시키고, 용출제로서 디클로로메탄 및 메탄올을 이용하여, 100% DCM(20 컬럼 부피에 있어서)으로부터 출발하여 20% MeOH 및 80% DCM(20 컬럼 부피를 초과함)까지의 구배로, 그레이스 레벨레리스(Grace Reveleris) X2 정제 시스템에서 SiO2 컬럼(타입: 그레이스 레벨레리스 SRC, 12 g, Si 40)에서 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시켜 조 중간체 105(175 mg)를 생성하고, 이를 다음 반응 단계에서 그대로 사용하였다.
화합물 2의 제조
Figure pct00005
실온에서 디옥산 중 4 M HCl(0.7 mL, 2.9 mmol)을 MeOH(10 mL) 중 중간체 105(175.1 mg, 조 물질, 대략 0.29 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 MeOH 중 NH3의 7 N 용액 1.5 mL의 첨가에 의해 켄칭하였다. 용매를 증발시켰다. 잔사를 DCM에 용해시켰다. 침전물을 여과 제거하였다. 용출제로서 DCM 및 MeOH를 사용하여, 100% DCM에서 출발하여 40% MeOH 및 60% DCM으로 끝나는 구배로, 아르멘 스폿 II 얼티밋(Armen Spot II Ultimate) 정제 시스템에서, SiO2 컬럼, 타입: 그레이스 레벨레리스 SRC, 12 g, Si 40에서 여과액을 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시켜 24.5 mg의 화합물 2를 생성하였다.
중간체 10의 제조
Figure pct00006
단계 a)
Figure pct00007
25℃에서 N2 하에 프로판-2-올/ H2O(208 mL, 7:1) 중 4,6-디클로로-5-(2,2-디에톡시에틸)피리미딘(14.0 g, 52.8 mmol) 및(1R,2S,3R,5R)-3-아미노-5-(히드록시메틸)시클로펜탄-1,2-디올 히드로클로라이드(10.7 g, 58.1 mmol)의 혼합물에, Et3N(13.4 g, 132 mmol)를 한꺼번에 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 23시간 동안 교반하였다. 혼합물을 50℃까지 냉각하고 4 M HCl(24 mL, 106 mmol)을 서서히 첨가하였다. 그 후, 잔사를 50℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 25℃까지 냉각하고 NaHCO3(14 g, 100 mmol)을 서서히 첨가하였다. 에틸 아세테이트(230 mL)를 첨가한 후에, 반-포화된 NaHCO3 용액(충분량)을 첨가하였다. 유기상을 분리하고 수상을 에틸 아세테이트(230 mL x 2)로 추출하였다. 합한 유기 상을 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 중간체 9를 황색 고체(17.4 g, 2단계에서 정량적 수율)로 수득하였다. 조 생성물을 추가 정제 없이 다음 반응 단계에서 그대로 직접 사용하였다.
단계 b)
Figure pct00008
아세톤(250 mL) 중 중간체 9(17.4 g, 약 52.7 mmol)의 혼합물에 2,2-디메톡시프로판(11.0 g, 105 mmol) 및 TsOH.H2O(908 mg, 5.27 mmol)를 한꺼번에 25℃에서 N2 하에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 25℃까지 냉각하고 용액을 진공에서 농축시키고, 포화 NaHCO3(100 mL)으로 서서히 켄칭하고, 그 후 에틸 아세테이트(100 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 염수(100 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과하고 진공에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔에서 플래시 크로마토그래피(구배 용출: 1/0으로부터 2/1까지의 DCM/에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 중간체 10을 연한 황색 검(15.5 g, 89% 수율)으로 수득하였다.
중간체 33의 제조
Figure pct00009
DCM(40 mL) 중 중간체 1(2.00 g, 이론적으로 6.18 mmol)의 혼합물에 데스-마틴 퍼요오디난(5.24 g, 12.36 mmol)을 0℃에서 N2 하에 한꺼번에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 포화 NaHCO3(20 mL) 중 Na2S2O3(4 g)을 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 수성 상을 DCM(20 mL x 3)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 염수(20 mL x 2)로 세척하고, 무수 MgSO4 로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켜, 중간체 33(1.80 g, 조 물질)을 연한 황색 검으로서 수득하였다. 조 생성물을 추가 정제 없이 다음 반응 단계에 직접 사용하였다.
적절한 출발 물질을 사용하여, 중간체 33의 제조에 사용한 것과 유사한 반응 프로토콜에 의해 하기 중간체를 제조하였다(표 7).
[표 7]
Figure pct00010
중간체 38의 제조
방법 1
Figure pct00011
THF(500 mL) 중 메틸트리페닐포스포늄 브로마이드(4.87 g, 13.62 mmol)의 혼합물에 t-BuOK(11.4 mL, THF 중 1 M, 1.27 g, 11.35 mmol)를 0℃에서 N2 하에 적가하였다. 현탁물이 밝은 황색으로 변하였고 이를 0℃에서 0.5시간 동안 교반하고, 그 후 0.5시간 동안 25℃까지 가온하였다. 혼합물을 -40℃까지 냉각하였다. THF(130.0 mL) 중 중간체 35(1.46 g, 이론적으로 4.54 mmol)의 용액을 적가하고 그 후 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 2시간 동안 25℃까지 가온하였다. 상기 혼합물에 포화 NH4Cl(300 ml)을 첨가하고, 이를 10분 동안 교반시켰다. 층들을 분리하고, 수성 상을 DCM(300 mL x 2)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 포화 염수(500 mL)로 세척하고, 무수 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(ISCO®; 80 g 세파플래시(SepaFlash)® 실리카 플래시 컬럼, 구배 용출: 0%로부터 15%까지의 에틸 아세테이트 / 석유 에테르)에 의해 정제하였다. 원하는 분획을 수집하고 용매를 증발시켰다. 중간체 38을 황백색 고체(530 mg, 36% 수율)로 얻었다.
방법 2:
중간체 38
Figure pct00012
THF(100 mL) 중 중간체 35(10.0 g, 이론적으로 31.1 mmol)의 용액을 N2 하에 30분의 기간에 걸쳐 THF 중 비스(요오도진시오)메탄 용액(180 mL, 0.31 M, 55.9 mmol, 문헌[Tetrahedron 2002, 58, 8255-8262]에 기술된 절차에 따라 제조됨)에 적가하고, 완전한 전환(대략 2시간)까지 교반을 계속하였다. 포화 NH4Cl 수용액을 서서히 첨가하여 반응 혼합물을 켄칭하였고, 그 동안 염 형성이 관찰되었다. 추출(EtOAc, 2 x 200 mL) 전에, 암모니아 수용액(25%)을 첨가하여 염을 다시 용해시켰다. 합한 유기 상을 아황산수소나트륨 수용액 및 염수로 세척하고, 무수 MgSO4 로 건조시키고,여과하고 진공에서 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 크로마토그래피(용출제: 디클로로메탄/EtOAc 95/5)에 의해 정제하여 중간체 38을 황백색 고체(6.9 g, 66%)로 제공하였다.
중간체 174의 제조
Figure pct00013
3-브로모-7-요오도-퀴놀린(5.99 g, 17.7 mmol)을 디클로로메탄(60 mL)에 용해시키고, 그 후 m-CPBA(4.57 g, 26.5 mmol)을 일부씩 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4일 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 포화 Na2S2O3 수용액(40 mL) 및 포화 NaHCO3 수용액(6 내지 7까지의 PH)에 의해 켄칭하고, 그 후 디클로로메탄(50 mL x3)으로 추출하였다. 유기 상을 H2O(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 감압 하에 증발시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼(용출제: 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1에서 1/1까지)에 의해 정제하여 요망되는 생성물인 중간체 174(1.9 g, 14.1%의 수율)를 황색 고체로서 수득하였다.
중간체 175 의 제조
Figure pct00014
클로로포름(60 mL) 중 중간체 174(2.9 g, 8.29 mmol)의 용액에 포스포릴 트리클로라이드(8.3 g, 54.1 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 80℃에서 12시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 감압 하에 증발시켜 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제하였다(용출제: 석유 에테르/에틸 아세테이트 = 10/1에서 1/1까지). 요망되는 분획을 수집하고, 농축시켜 생성물 중간체 175(1.3 g, 41.5%의 수율)를 백색 고체로서 제공하였다.
중간체 176 의 제조
Figure pct00015
4-메톡시벤질아민(1.34 g, 9.78 mmol)을 에탄올(10 ml) 중 중간체 175(0.8 g, 약 1.95 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 밀봉 튜브에서 100℃에서 12시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 진공 하에 증발시켜 조 생성물을 얻었다. 이것을 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제하였다(구배 용출제: 0/1으로부터 1/10까지의 에틸 아세테이트/석유 에테르). 요망되는 분획을 수집하고, 농축시켜 생성물중간체 176(600 mg, 51.6%의 수율)을 오일로서 제공하였다.
중간체 177의 제조
Figure pct00016
9-BBN(1.3 ml, 0.69 mmol, THF 중 0.5 M) 중 중간체 38(44 mg, 0.138 mmol)의 혼합물을 N2 하에 1시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 그 후 H2O(1 mL) 중 K3PO4(87 mg, 0.413 mmol ), 이어서 THF(5 ml), 중간체 176(122.727 mg, 약 0.206 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(4.48 mg, 0.007 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트(40 ml)에 용해시키고, 물(6 ml), 염수(6 ml)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 조 중간체 177 분획 1(120 mg, 71.5%의 수율)을 제공하였다.
9-BBN(7.31 ml, 3.65 mmol, THF 중 0.5 M) 중 중간체 38(233.7 mg, 0.73 mmol)의 혼합물을 N2 하에 1시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 그 후 H2O(1 mL) 중 K3PO4(87 mg, 0.413 mmol ), 이어서 THF(5 ml), 중간체 176(478 mg, 약 0.80 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(23.8 mg, 0.037 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트(40 ml)에 용해시키고, 물(6 ml), 염수(6 ml)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 조 중간체 177 분획 2(600 mg, 63.1%의 수율)를 얻었다.
두 분획을 합하고, 크로마토그래피 컬럼에 의해 정제하였다(구배 용출제: 1/10으로부터 1/1까지의 에틸 아세테이트/석유 에테르). 요망되는 분획을 수집하고, 농축시켜 중간체 177(300 mg, 61.0%의 수율)을 고체로서 제공하였다.
중간체 178의 제조
Figure pct00017
디옥산(10 ml) 중 중간체 177(300 mg, 약 0.446 mmol) 및 NH3.H2O(10 ml)의 혼합물을 밀봉 튜브에서 120℃에서 14시간 동안 교반시켰다. 이 반응물을 진공 하에 증발시켜 중간체 178(250 mg, 87.1%의 수율)을 오일로서 얻었다.
중간체 179의 제조
Figure pct00018
TFA(5 ml) 중 중간체 178(250 mg, 약 0.388 mmol)의 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 진공 하에 증발시켜 중간체 179(350 mg, 63.4%의 수율)를 오일로서 얻었다.
화합물 80의 제조
Figure pct00019
메탄올(3 mL) 중 중간체 179(350 mg) 및 K2CO3(102 mg, 0.74 mmol)의 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 진공 하에 증발시켜 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 분취용 HPLC에 의해 정제하였다(컬럼: 워터스 엑스브리지 프렙(Waters Xbridge Prep) OBD C18 150x30 mm, 5 μm, 조건: 구배: 물(0.05% 수산화암모니아(v/v))-ACN). 요망되는 분획을 수집하고, 용매를 증발시켜 화합물 80(113.3 mg, 94.9%의 수율)을 백색 고체로서 제공하였다.
분석 파트
NMR
다수의 화합물에 있어서, 1H NMR 스펙트럼은 360 MHz에서 작동하는 브루커(Bruker) DPX-360, 600 MHz에서 작동하는 브루커 아반스(Avance) 600, 400 MHz에서 작동하는 브루커 아반스 400, 또는 400 MHz에서 작동하는 바리안(Varian) 400MR 분광계에서 기록되었다. 용매로서 클로로포름-d(중수소화 클로로포름, CDCl3), 메탄올-d4 또는 DMSO-d6(중수소화 DMSO, 디메틸-d6 술폭시드)을 사용하였다. 화학적 이동(δ)은 테트라메틸실란(TMS)에 대하여 백만부당 부(ppm)로 기록하며, 이를 내부 표준으로 사용하였다.
화합물 80: 1H NMR (600 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.50 - 1.56 (m, 1 H) 1.68 - 1.75 (m, 1 H) 1.85 - 1.92 (m, 1 H) 1.96 (ddt, J=13.0, 9.0, 6.5, 6.5 Hz, 1 H) 2.25 (dt, J=12.7, 7.9 Hz, 1 H) 2.69 - 2.80 (m, 2 H) 3.76 (br t, J=4.7 Hz, 1 H) 4.21 (dd, J=7.6, 6.0 Hz, 1 H) 4.57 (br s, 1 H) 4.72 (br s, 1 H) 4.80 (dt, J=10.5, 7.9 Hz, 1 H) 6.50 (br s, 2 H) 6.59 (d, J=3.5 Hz, 1 H) 7.07 (br s, 2 H) 7.12 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1 H) 7.29 (d, J=3.6 Hz, 1 H) 7.34 (s, 1 H) 7.58 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.07 (s, 1 H) 8.31 (s, 1 H).
실험 절차 시험관 내 분석(분석 1a 및 1b)
시약.
PRMT5-MEP50 효소를 Charles River(Argenta)로부터 구매하였다. 효소 복합체를 2가지 바큘로바이러스(baculovirus)로 동시에 감염시킨 곤충 세포(Sf9)에서 생성하였다. 하나의 바이러스는 N-말단에 Flag-태그를 갖는 전장 인간 PRMT5를 발현하며, 두 번째 바이러스는 N-말단에 His6-TEV 절단부를 갖는 전장 MEP50을 발현한다. 단백질을 3xFLAG 펩티드로 용출되는 항-Flag(M2) 비드, 이어서 0.5M 이미다졸로 용출되는 His-셀렉트(Select)를 사용하여 친화성 정제하였다. 그 후, 용출된 단백질을 20% 글리세롤 및 3 mM 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 트리스-완충 염수(TBS)(pH 8.0)에 대하여 투석시켰다.
이. 콜라이(E. coli)에서 발현시킨 전장 비태그 인간 재조합 히스톤 H2A(잔기 1 내지 130, 젠뱅크(Genbank) 등록 번호 NM_021052, MW = 14.1 kDa)를 Reaction Biology Corporation(카탈로그 번호 HMT-11-146)으로부터 구매하였다. 트리스 염기(Sigma 카탈로그 번호 T-1503), NaCl(Sigma 카탈로그 번호 RGF-3270), MgCl2(Sigma 카탈로그 번호 M0250), DTT(Invitrogen 카탈로그 번호 15508-013) 및 포름산(Riedel deHaen, 카탈로그 번호 33015)을 포함하여, 반응 완충액을 제조하거나 반응을 중단시키는 데 사용되는 시약을 구매하였다.
고 처리량 질량 분광계 분석
PRMT5는 공동 기질(co-substrate)인 S-아데노실-L-메티오닌(AdoMet, SAM)을 이용하여 단백질 내에서의 아르기닌 잔기의 구아니딘 기 상의 말단 질소 원자들의 순차적인 메틸화를 촉매하여 모노-메틸(MMA), 대칭형 디메틸 아르기닌(sDMA) 및 S-아데노실-L-호모시스테인(AdoHcy, SAH)을 형성한다. 고 처리량 질량 분광법(Sciex 4000 시리즈 QTrap® 트리플-쿼드(triple-quad) MS/MS와 커플링된 Agilent Rapidfire 300 시스템)을 사용하여 생성물인 SAH의 형성을 추적함으로써 효소 활성을 결정하였다. 반응 완충액은 20 mM 트리스-HCl, pH 8.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 및 1 mM DTT였다. 반응 활성을 1% 포름산(최종 농도)을 사용하여 중단시켰다.
저해 연구. 디메틸 술폭시드(DMSO)에서 1:2로 연속 희석함으로써 각각의 화합물에 대하여 제조한 11개의 지점의 투약 시리즈를 이용하여 IC50 연구를 수행하였으며, 이때 지점 12는 DMSO 대조군이었다. 먼저 화합물을 플레이트에 스포팅하고(spotted), 이어서 2 μM SAM 및 0.6 μM H2A(히스톤 H2A) 용액 혼합물을 첨가하였다. 동일 부피의 효소 용액을 첨가하여 효소 반응을 개시하였다. 반응물의 최종 농도는 1 μM SAM, 0.3 μM H2A 및 10 nM 효소(분석법 1a) 또는 1.25 nM 효소(분석법 1b)이다. 상기 반응물을 30℃에서 60분 동안(10 nM 효소를 사용할 때) 및 120분 동안(1.25 nM 효소를 사용할 때) 인큐베이션하였다. 후속적으로, 포름산을 1%의 최종 농도까지 첨가함으로써 상기 반응물을 켄칭하였다. 화합물의 존재 하에서의 SAH 형성의 저해를 저해제 농도의 함수로서 비개시 반응에 대한 대조구의 백분율로서 계산하였다. 데이터를 다음과 같이 피팅하였다:
Y = 최저 + (최고- 최저)/(1+10^((log IC50 -X)*h))
여기서, IC50 은 50% 저해율에서의 저해제 농도(X와 동일한 단위)이며, h는 힐 기울기(Hill slope)이다. Y는 저해율(%)이며, X는 화합물 농도의 로그이다. 최저 및 최고는 Y와 동일한 단위의 평탄역이다.
하기 표 1에서 pIC50 값은 평균 값이다(Co. No.는 화합물 번호를 의미한다).
Figure pct00020
실시예 1: SCLC에서 PIK3CA 활성화 돌연변이는 PRMT5 저해제 민감성과 연관된다.
화합물 2의 세포 민감성 프로파일을 광범위 폐암 세포주 패널의 SCLC 하위 분류에서 평가하였다. 두드러지게, 가장 민감한 세포주 중 일부는 PIK3Cα 유전자에 있어서 상이한 기능 획득 돌연변이들을 가지며, 이는 표 2에 언급되어 있다. 관리 기준(시스플라틴)에 대한, 또는 심지어 가장 최근의 PARP 저해제 세대와 같은 표적화 약제에 대한 종양 반응으로서의 PI3Kα 경로의 활성화(기능 획득 돌연변이 또는 경로 자극)는 SCLC 환자의 치료 후 낮은 전체 생존율과 관련될 수 있는 저항성의 과정에서의 결정적인 역할을 시사한다.
Figure pct00021
실시예 2: NSCLC에서 스플라이소솜 변경은 PRMT5 저해제-민감성과 연관된다
암-특이적 스플라이싱 이벤트는 악성 종양을 개시하고 또한 질환 진행의 원인이 되는 것으로 공지되어 있다. 지금까지, 스플라이싱에 관련된 두 단백질, U2AF1 및 RBM10은 NSCLC에서 잘못 조절된 것으로 설명되었다.
잘 특성화된 스플라이싱 인자인 U2AF1은 NSCLC 환자 중 3~8%에서 기능 획득 핫-스팟(hot-spot) 돌연변이(S34F)를 갖는다. 최근에, 스플라이소솜의 조립에 또한 결정적인 RNA 결합 단백질 RBM10은 주로 흡연 이력이 있는 NSCLC 환자(대략 8%)에서 기능 손실 돌연변이에 의해 불활성화되는 종양 억제자로 분류되었다.
스플라이소솜 조립에 결정적인 Sm 단백질은 PRMT5의 직접적 기질로 설명되었으며, 따라서 PRMT5 기능은 스플라이소솜 활성의 조절과 관련되었다.
U2AF1에서의 S34F 기능 획득 돌연변이는 발암성인 것으로 확인되었기 때문에, S34F 돌연변이를 갖는 모든 구매가능한 NSCLC 세포주의 작은 패널을 조립하여 U2AF1-S34F 및 PRMT5 저해 사이의 잠재적인 합성적 치명적 관계를 분석하였다.
이러한 핫-스팟 돌연변이를 갖는 모든 NSCLC 세포(3개 중 3개)는 PRMT5 저해제 화합물 2에 대하여 증식 민감성이며, 표 3을 참조한다.
Figure pct00022
실시예 3: NSCLC에서 사이클린 D1 경로 증폭은 PRMT5 저해제-민감성과 연관된다
G1 사이클린 패밀리의 증폭 및/또는 증가된 발현이 NSCLC를 비롯한 다수의 암에서 보고되었다. 사이클린 D1, CDK4 및 CDK6을 포함하는 세포 주기의 조절자의 발현과 PRMT5 사이의 연관성이 관찰되었으며, 이는 PRMT5가 G1기에 대하여 조절적 영향을 줄 수 있음을 시사하는 것이다. 화합물 2-처리 폐암 세포주 패널의 분석은 사이클린 D1/CDK4/CDK6 증폭(들)과 PRMT5i-민감성 사이의 유의한 연관성을 보여주었으며, 이는 사이클린 경로 이상이 환자 선발을 위한 마커로서 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 표 4는 이러한 사이클린 D1/CDK4/CDK6 증폭(들)을 갖는 NSCLC 세포주가 화합물 2를 이용한 처리에 민감함을 나타낸다.
Figure pct00023
실시예 4: WNT 경로 변경은 PRMT5 저해제-민감성과 연관된다
β-카테닌 및 APC를 포함하는 핵심 Wnt 신호전달 유전자의 돌연변이를 갖는 세포주는 표 5에 나타낸 바와 같이 PRMT5i 처리에 대하여 민감성을 나타낸다.
Figure pct00024
실시예
당업자라면 많은 변화 및 변경이 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대하여 이루어질 수 있으며 이러한 변화 및 변경은 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음을 알 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 실제 사상 및 범주 내에 있는 모든 그러한 등가의 변동을 포함하는 것으로 의도된다.
본 문서에서 인용되거나 기술된 각각의 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.

Claims (7)

  1. 단백질 아르기닌 N-메틸트랜스퍼라아제 5(PRMT5) 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 있는 환자를 확인하는 방법으로서,
    스플라이소솜 변경의 존재에 대하여 환자 유래의 생물학적 샘플을 평가하는 단계
    (여기서, 임의의 상기 변경의 존재는 상기 환자가 상기 PRMT5 저해제를 이용한 치료에 대하여 반응성일 가능성이 임의의 상기 변경의 부재 하에서보다 더 높음을 나타냄)를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 스플라이소솜 변경은 U2AF1, RBM10 및 KIAA1429로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 유전자는 U2AF1이며, 돌연변이는 S34F인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 유전자는 RBM10이며, 돌연변이는 I696fs, I348N, G840fs로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 유전자는 KIAA1429이며, 돌연변이는 L837V, F1260L, D251if, T1333M, V1548L, G397A 및 Q962E로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 스플라이소솜 변경을 포함하며, 환자는 NSCLC를 갖는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PRMT5 저해제는 화합물 2 또는 화합물 80인 방법.
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