KR20190120682A - 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 - Google Patents
에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질과 그 공동조절인자인 TIF 단백질을 아데닐레이트 사이클레이스와 접합시켜 형질전환된 박테리아 균주는 에스트로겐성 화합물 외의 노이즈 신호에 대한 민감도가 낮고 에스트로겐성 화합물에 대한 감지 성능이 우수하다. 또한, 본 발명의 박테리아 균주를 이용하여 에스트로겐성 화합물을 친환경적이고 간단하게 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법에 관한 것이다.
내분비 교란 화합물(Endocrine Disrupting Compounds, EDC)이란, 호르몬의 생리적 작용을 모방하거나, 차단하고 또 교란하는 것에 의해 인간과 야생생물에 대해 유해 효과를 나타내는 일군의 화합물들을 의미한다. 미국 내분비학회는 내분비 교란물질이 남성 및 여성 생식, 가슴 발육 및 암, 전립선암, 신경내분비, 갑상선 활성, 대사, 비만 및 심혈관계 내분비에 영향을 줄 수 있다는 사실을 보고한 바 있으며, EDC가 공중 건강에 대해서 심각한 우려를 자아낼 수 있음을 경고하고 있다.
호르몬은 표적 세포의 수용체(receptor)와 상호작용하여 성장, 발달, 거동 및 생식 등과 같은 다양한 반응 및 정상적인 생물학적 기능을 유발하는 기능을 수행한다. 그러나, 전술한 EDC와 같이 호르몬의 활성에 대해서 간섭을 초래하는 물질은 왜소 성장, 단기 기억 손상, 난관 임신, 낮은 정자 수치, 생식장애 및 면역계 손상을 비롯한 다양한 가역적 또는 비가역적 생물학적 손상을 초래할 수 있다.
일반적으로, EDC는 3개의 주요 그룹으로 분류될 수 있으며, 안드로겐형(천연 테스토스테론을 모방하거나 차단하는 화합물), 갑상선형(갑상선에 대한 직접적 또는 간접 영향을 미치는 화합물) 및 에스트로겐형(천연 에스트로겐을 모방하거나 또는 차단하는 화합물)로 분류될 수 있다. 특히, 그 중에서도 에스트로겐 화합물(EC)은 성인 남녀뿐 아니라 소아의 성 발달 및 장애, 암 발병 등과 밀접한 관련을 갖고 있다고 알려져 있으며, 일상 생활에서 사용되는 수천 가지의 제품에서 발견되기 때문에 그 심각도가 매우 위중하다.
에스트로겐을 포함하는 내분비 교란 화합물은 환경에서 아주 낮은 농도로 존재하는 것으로 널리 보고되어 있으나, 지방 용해도가 비교적 높아서 먹이 사슬에서 높은 위치에 있는 생물 및 동물의 지방에 축적되며, 비교적 낮은 농도에서도 현저한 생리적 반응을 초래하게 된다. 또한, 살충제, 제초제, 살진균제, 가소제, 플라스틱, 수지 및 세제와 같은 공업용 화학제에서도 발견된다.
현재까지 에스트로겐 및 에스트로겐 유사 화합물을 검출하는 분석 방법으로는 고상 추출법(SPE), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피/중량 분광광도계(LC/MS) 또는 가스 크로마토그래피/중량 분광광도계(GC/MS) 등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 방법들은 이용하는 장치가 고가일 뿐 아니라, 분석과정이 복잡하기 때문에 분석 비용과 시간이 많이 필요하다는 단점이 있다.
한편, 본 발명자는 RNA 중합효소 αNTD 와 λCI 단백질을 이용한 박테리아 단백질 잡종법을 기반으로 하는 감지 센서를 발명하였으나(한국공개특허 제10-2017-0112017호), 상기 감지 센서는 노이즈 신호에 의해 발현되는 리포터 유전자인 lacZ 유전자가 에스트로겐이나 환경호르몬으로 처리되지 않아도 X-gal에 의해 발색되기 때문에, 노이즈 신호가 높아 플레이트 위에서 실시하는 스크리닝 방법에 이용되기에 적합하지 않다.
이에, 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질과 그 공동조절인자인 TIF 단백질을 아데닐레이트 사이클레이스와 접합시킴으로써, 기존의 RNA 중합효소 αNTD 와 λCI 단백질을 이용한 박테리아 단백질 잡종법을 기반으로 하는 감지 센서에 비하여 노이즈에 대한 민감성이 현저히 낮아 적은 시료양으로도 에스트로겐성 화합물을 즉시 검출할 수 있는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 T18 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα LBD 및 상기 T25 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 T25 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα LBD 및 상기 T18 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 박테리아 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주, 고초균(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 에스트로겐성 화합물은 노레틸노드렐, 5α-안드로스탄, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르, 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산, 아우린, 페놀프탈레인 및 페놀 레드로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로, 상기 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제조하는 단계, 상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계, 및 상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 다르면, 상기 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 인체로부터 유래된 에스트로겐 수용체 단백질과 그 공동조절인자인 TIF 단백질을 아데닐레이트 사이클레이스와 접합시켜 형질전환된 박테리아 균주는 에스트로겐성 화합물 외의 노이즈 신호에 대한 민감도가 낮고 에스트로겐성 화합물에 대한 감지 성능이 우수하다. 또한, 본 발명의 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 이용함으로써, 에스트로겐성 화합물을 친환경적이고 간단하게 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 하나의 양태에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서가 에스트로겐성 화합물의 존재에 따라 리포터 유전자를 발현시키는 것을 개략적으로 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서가 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)와 TIF2 단백질 사이의 리간드 의존성 특이적 결합에 의해 에스트로겐성 화합물을 감지한다는 것을 비교 실험한 결과이다.
도 3은 종래의 λCI 단백질과 αNTD 단백질을 기반으로 하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서와 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서의 노이즈 신호에 대한 민감도를 비교 실험한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서를 실제 시료에 이용하여 에스트로겐성 화합물의 감지 성능과 노이즈 민감도를 실험한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 센서의 에스트라디올(E2)에 대한 감지 성능을 베타 갈락토시다아제 실험을 통해 확인한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 센서의 비스페놀 A(BPA)에 대한 감지 성능을 베타 갈락토시다아제 실험을 통해 확인한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서가 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)와 TIF2 단백질 사이의 리간드 의존성 특이적 결합에 의해 에스트로겐성 화합물을 감지한다는 것을 비교 실험한 결과이다.
도 3은 종래의 λCI 단백질과 αNTD 단백질을 기반으로 하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서와 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서의 노이즈 신호에 대한 민감도를 비교 실험한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 검출 센서를 실제 시료에 이용하여 에스트로겐성 화합물의 감지 성능과 노이즈 민감도를 실험한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 센서의 에스트라디올(E2)에 대한 감지 성능을 베타 갈락토시다아제 실험을 통해 확인한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물 센서의 비스페놀 A(BPA)에 대한 감지 성능을 베타 갈락토시다아제 실험을 통해 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제공한다.
본 발명에서 "아데닐레이트 사이클레이스(Adenylate cyclase)"는 아데닐산고리화효소라고도 하며, ATPAMP＋PPi 반응을 촉매하는 세포막결합형 효소이다. 이 효소활성은 여러 가지 세포외 신호로 제어되고, 생성된 cAMP는 세포내 제2전령으로 작용한다. 원핵, 진핵세포를 막론하고 일반적으로 생물에 널리 존재하며, 특히 동물조직에서는 원형질막 결합성 효소로 알려져 있다.
본 발명에서는 다음과 같이 리포터 유전자가 발현되는 원리를 이용하고자 하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD) 및 그 공동조절인자인 TIF2의 결합 부위 단백질은 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위 또는 T18 부위에 각각 결합되어 있다. 리간드가 존재하지 않을 때, hERα LBD와 TIF2 단백질 사이에서 상호작용이 일어나지 않고 T18과 T25에 의한 아데닐레이트 사이클레이스 효소 효과도 나타나지 않게 된다. 하지만 리간드가 존재하게 되면, hERα LBD와 TIF2 단백질 사이에서 상호작용이 일어나게 되고, 이들과 결합된 T18과 T25가 충분히 가까워져 아데닐레이트 사이클레이스 효소의 능력을 갖게 된다. 그로 인하여 ATP가 cAMP로 바뀔 수 있게 되고, cAMP가 CAP 단백질과 결합하여 리포터 유전자인 lacZ 유전자를 발현시킬 수 있다. 즉, 분석 대상이 되는 시료 중에 에스트로겐성 화합물들이 존재하는 경우, 해당 에스트로겐성 화합물이 상기 hERα LBD에 결합하게 되고, 이러한 결합에 의해서 상기 hERα LBD와 TIF2 단백질 사이에 상호작용이 발생되며, 다시 이러한 상호작용에 의해서 리포터 유전자의 발현이 이루어지게 되는 것이다. 또한, 발현된 상기 리포터 유전자는 발색 시약에 의한 발색 반응을 야기하게 되고, 이러한 발색 반응 정도를 정량함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물의 농도를 정확하게 정량하는 것이 가능해진다.
본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주는 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위 및 T25 부위를 코딩하는 유전자 중 어느 하나와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 상기 T18 부위 및 T25 부위 중 TIF2 단백질과 접합되지 않은 다른 하나를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;에 의해서 형질전환된(transformed) 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주이다.
하나의 구체적인 실시예로, 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주는 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;에 의해서 형질전환된(transformed) 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주이다.
다른 하나의 구체적인 실시예로, 본 발명에 따른 박테리아 균주는 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주이다.
본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주는 상기 플라스미드에 의해서 형질전환된 것이며, 상기 플라스미드는 리포터 유전자의 발현에 관여하는 단백질 세트들을 코딩한다.
본 발명에 있어서, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 이와 결합한 T18 또는 T25 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다. 마찬가지로, 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα LBD 및 이와 결합한 상기 T25 부위 또는 T18 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합될 수 있다. 이러한 FLAG 서열의 접합에 의해서, 발현된 단백질만을 특이 항체로서 인식하는 웨스턴 블롯팅 등의 방법을 사용하여 확인할 수 있게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 1의 염기서열일 수 있다. 서열번호 1에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, 아데닐레이트 사이클레이의 T18 부위를 코딩하는 유전자(pUT18C), 링커 아미노산 서열, TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.
상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 2의 염기서열일 수 있다. 서열번호 2에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, 아데닐레이트 사이클레이의 T25 부위를 코딩하는 유전자(pKT25), 링커 아미노산 서열, hERα LBD를 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 3의 염기서열일 수 있다. 서열번호 3에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, 아데닐레이트 사이클레이의 T25 부위를 코딩하는 유전자(pKT25), 링커 아미노산 서열, TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.
상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열은 서열번호 4의 염기서열일 수 있다. 서열번호 4에 도시된 서열은 5'에서 3' 방향으로, 아데닐레이트 사이클레이의 T18 부위를 코딩하는 유전자(pUT18C), 링커 아미노산 서열, hERα LBD를 코딩하는 유전자 및 FLAG 서열을 포함한다.
하기 실시예에서는 본 발명에 따른 염기서열을 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 세포로서, 하기 실시예에서는 대장균 균주를 예로 들어 설명하였으나, 대상 균주가 반드시 대장균으로만 한정되는 것은 아니며, 이외에도 고초균, 바실러스 리체니포르미스, 유산균 등과 같이 유전자 조작이 가능한 모든 박테리아 균주가 대상 균주로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 박테리아가 검출할 수 있는 대상 화합물들에는 인간 에스트로겐 호르몬을 비롯해서, 에스트로겐 수용체에 결합이 가능한 모든 종류의 호르몬 및 유사체에 대한 검출이 포함된다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다양한 스테로이드 계열 호르몬들 (Norethylnodrel,5α-Androstane 등), 알킬페놀 화합물 (Dodecylphenol,Octylphenol 등), 비스페놀 계열 화합물 (Bisphenol A, Bisphenol S, Bisphenol F 등), 방부제로 많이 사용되는 파라벤 계열 화합물 (2-Ethylhexyl 4-hydroxybenzoate, Heptyl 4-hydroxybenzoatea 등), 화장품 향 고정제 등으로 사용되는 벤조페논 계열 화합물 (4,4'-Dihydroxybenzophenone, 2,4-Dihydroxybenzophenone 등), 살충제에 들어가는 유기염소계 물질들 (Dihydroxymethoxychlor olefin, o,p'-DDT, Dihydroxymethoxychlor (HPTE), 2',3',4',5'-Tetrachloro-4-biphenylol 등), 산화방지제로 식품에도 첨가되는 Nordihydroguaiaretic acid, 산 염기 지시약으로 많이 사용되는 Aurin, Phenolphthalein, Phenol red 등의 화합물들을 본 발명에 의해서 검출해낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 플레이트 상에서 에스트로겐성 화합물을 검출하는 실험을 통해 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주가 노이즈에 민감하지 않으면서도, 에스트로겐성 화합물만을 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 3).
본 발명의 다른 실시예에서는, 플레이트 상에서 에스트로겐성 화합물을 검출하는 비교실험을 통해 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주가 기존의 RNA 중합효소 αNTD 와 λCI 단백질을 이용한 박테리아 단백질 잡종법을 기반으로 하는 감지 센서 보다 에스트로겐성 화합물의 검출능이 우수하고 노이즈 민감도가 낮다는 것을 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, β-갈락토시다아제를 사용하여 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주의 에스트로겐성 화합물에 대한 검출능력을 실험하였고, 에스트라디올 및 비스페놀 A에 대한 검출능력이 매우 우수하다는 것을 확인하였다(실시예 5).
상기 실시예들의 결과로부터 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주는 에스트로겐성 화합물에 대한 검출능이 매우 우수하고 노이즈 민감도가 낮아, 에스트로겐성 화합물을 검출하는 센서에 유용하게 적용될 수 있음을 알 수 있다.
이에 본 발명은 또한 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출센서를 제공한다.
본 발명은 또한 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제조하는 단계; 상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계; 상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계를 포함하는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 검출방법은 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주를 제조하고, 이를 분석 대상이 되는 시료와 함께 배양한 다음, 배양된 박테리아 균주를 용균(lysis)시켜서, 박테리아에 의해서 발현된 리포터 단백질을 분석하는 것이다. 이때, 시료 중에 에스트로겐성 화합물이 존재하는 경우에만 리포터 유전자에 의한 리포터 단백질이 생산되고, 생산된 리포터 단백질을 정량적으로 분석함으로써 시료 중 에스트로겐성 화합물을 검출할 수 있게 된다.
즉, 본 발명에 따른 방법은 전술한 바와 같이 시료 중에 존재하는 에스트로겐성 화합물이 리간드로 작용하여 hERα LBD에 결합하는 경우에만 특정 단백질을 생산하는 특성을 이용하여 시료 중 에스트로겐성 화합물을 분석하게 된다.
본 발명은 발현되는 리포터 단백질의 종류에 따라서, 분석 방법이 달라질 수 있는 바, 예를 들어, 상기 리포터 단백질은 베타-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질일 수 있고, 상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 상기 발색 또는 형광 단백질은 UV-VIS 스펙트로포토미터 등의 장비를 사용하여 정량적으로 분석이 가능하다.
또한, 리포터 단백질로서, β-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는, 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해주는 경우, 첨가된 ONPG는 β-갈락토시다아제에 의해서 분해되고, 분해산물로서 강한 황색 발광을 내는 오르쏘니트로페놀 (orthonitrophenol)이 생산된다. 이때, 황색 발광 정도는 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도에 따라서 달라지므로, ONPG에 의한 발색 정도를 UV-VIS 스펙트로포토미터 등을 사용하여 측정하게 되면, 시료 중 존재하는 에스트로겐성 화합물의 농도를 정량적으로 분석하는 것이 가능하게 된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 플라스미드의 제작
인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 바인딩 도메인(hERα LBD (N304~T553 : 304번째 아미노산인 아스파라진부터 553번째 아미노산인 트레오닌까지))은 클로닝된 플라스미드인 pJL2397(pDG1730::PxylA::αNTD-hERα LBD-FLAG)를 주형으로 하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법을 사용하여 증폭하였다. PCR 시 사용된 프라이머는 BamHI과 EcoRI site가 각각 5’과 3’에 포함되어 있으며, 단백질 발현을 특이 항체로 확인할 수 있는 플래그 순서(FLAG sequence)와 종결기(terminator) 부분까지를 포함한 DNA부분이 증폭되었다.
TIF2 바인딩 도메인(TIF2 BD (Q624~T869 : 624번째 아미노산인 글루타민산부터 869번째 아미노산인 트레오닌까지))은 클로닝된 플라스미드인 pJL2398 (pDG1730::PxylA::λCI-TIF2 BD-FLAG)를 주형으로 하여 마찬가지로 PCR방법을 사용하여 증폭하였다. PCR 시 사용된 프라이머는 BamHI과 EcoRI site가 각각 5’ 과 3’에 포함되어 있으며, 단백질 발현을 특이 항체로 확인할 수 있는 플래그 순서와 종결기 부분까지를 포함한 DNA부분이 증폭되었다.
증폭된 hERα LBD-FLAG 및 TIF2 BD-FLAG 유전자는 제한효소인 BamHI과 EcoRI 로 절단하였다. 이 후 BamHI과 EcoRI로 절단된 pUT18C 와 pKT25 부위에 리가제(ligase)를 이용하여 pUT18C::TIF2 BD-FLAG(서열번호 1)의 염기서열을 포함하는 플라스미드, pKT25::hERα LBD-FLAG(서열번호 2)의 염기서열을 포함하는 플라스미드, pKT25::TIF2 BD-FLAG(서열번호 3)의 염기서열을 포함하는 플라스미드 및 pUT18C::hERα LBD-FLAG(서열번호 4)의 염기서열을 포함하는 플라스미드를 클로닝하였다.
실시예 2. 대장균 형질전환
아데닐레이트 사이클레이스 유전자가 결실되어 있는 대장균 균주인 E. coli BTH101(Euromedex)의 수용 세포를 제작하였다. OD600(600nm 광에서의 광학밀도)~ 0.4까지 배양한 세포를 수득하였다. 이후 100 mM CaCl2를 약 4시간 동안 처리하고. 처리한 세포를 다시 수득한 다음, 처음 배양 시 배지 부피의 1/50에 해당하는 부피의 100 mM CaCl2로 세포들을 풀어준 뒤 사용하였다.
제조된 수용 세포 50μL에 클로닝된 pUT18C::TIF2 BD-FLAG 와 pKT25::hERα LBD-FLAG, 그리고 pUT18C::hERα LBD-FLAG와 pKT25::TIF2 BD-FLAG 각각을 1 μL(약 100 ng) 첨가한 후, 0 ℃에서 약 30분 동안 보관하였다. 이후 42℃의 열을 1분 40초 동안 가해준 뒤 바로 0℃에서 5분 동안 보관하였다. 이어서, LB 배지 1 mL을 넣고 1 시간 동안 37℃에서 배양한 후 선택 마커인 카나마이신(kanamycin)(pKT25 선택), 엠피실린(ampicillin)(pUT18C 선택)이 함유된 배지에 플레이팅 하였다.
실시예 3. 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주의 에스트로겐성 화합물 검출성능 측정
본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주가 에스트로겐성 화합물에 대해서만 특이적으로 반응하는지 여부를 확인하기 위하여 본 발명에 따른 서열번호와 일부 염기서열을 각각 달리한 플라스미드로 형질변환된 박테리아 균주를 제조하여 다음과 같이 On-plate 시험(spotting) 실험을 진행하였다.
100 μg/mL 엠피실린, 50 μg/mL 카나마이신, 1 mM IPTG 가 포함된 배지(- X-gal 배지)를 제작하였다. 100 μg/mL 앰피실린, 50 μg/mL 카나마이신, 1 mM IPTG, 200 μM X-gal이 포함된 배지(+ X-gal 배지)를 제작하였다. 그리고 100 μg/mL 앰피실린, 50 μg/mL 카나마이신, 1 mM IPTG, 200 μM X-gal, 10 μM 에스트라디올이 포함된 LB-agar 플레이트(1.5%)(+ X-gal + Estradiol 배지)를 제작하였다. OD600 ~ 1 까지 배양한 각 균주를 5 μL씩 상기 각각의 배지에 스포팅(spotting)한 다음, 약 30분 동안 건조시킨 후 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 리포터 유전자인 lacZ 유전자의 발현에 의해 파란색을 띄는 물질인 X-gal, 그리고 에스트로겐인 에스트라디올이 포함된 배지 위에 각 균주를 올려 놓고 색 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 아데닐레이트 사이클레이스 T18와 T25 부위에 각각 인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)와 TIF2 단백질이 클로닝된 박테리아 균주(pUT18C::TIF2 BD-FLAG와 pKT25::hERα LBD-FLAG, 또는 pUT18C::hERα LBD-FLAG와 pKT25::TIF2 BD-FLAG에 의해 각각 형질변환된 박테리아 균주)를 이용한 에스트로겐성 화합물 검출 센서만이 에스트로겐성 화합물인 에스트라디올(Estradiol)이 존재할 때에만 특이적으로 상호작용하여 lacZ 유전자가 발현되고, 푸른색을 나타냄을 확인하였다.
반면 pUT18C-zip와 pKT25-zip에 의해 형질변환된 박테리아 균주는 에스트라디올이 존재하지 않아도 푸른색을 나타내었다. 이는 본 발명에 따른 박테리아 균주와 달리 pUT18C-zip와 pKT25-zip에 의해 형질변환된 박테리아 균주는 에스트로겐성 화합물이 존재하지 않아도 lacZ 유전자가 발현시키기 때문이며, 이로써 상기 균주는 노이즈(X-gal)에 민감함을 알 수 있다. 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주와 pUT18C-zip와 pKT25-zip에 의해 형질변환된 박테리아 균주를 제외한 다른 염기서열에 의해 형질 변환된 박테리아 균주에서는 육안으로 관찰되는 반응은 나타나지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이즈 기반의 박테리아 균주는 노이즈에 민감하지 않으면서도, 에스트로겐성 화합물만을 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4. 본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 검출센서의 노이즈 민감도 및 에스트로겐성 화합물 검출성능 측정
실시예 4-1. 기존 센서와의 비교실험
On-plate 디스크 확산(disk diffusion)법을 이용하여 기존의 RNA 중합효소 αNTD 와 λCI 단백질을 이용한 단백질 잡종법 기반 센서(대조군: E. coli FW102 OL2-62 pBRαNTD::hERα LBD-FLAG pACλCI::TIF2 BD-FLAG 균주)와 본 발명에 따른 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 검출센서의 노이즈에 대한 민감도를 비교하여 실험하였다.
100 μg/mL 엠피실린, 50 μg/mL 카나마이신, 1 mM IPTG(FW102 스트레인은 20 μM)가 포함된 bottom agar plate(1.5%, 15 mL)를 준비하였다(- X-gal 디스크).
100 μg/mL 엠피실린, 50 μg/mL 카나마이신, 1 mM IPTG(FW102 스트레인은 20 μM), 200 μM X-gal이 포함된 bottom agar plate (1.5%, 15 mL)를 준비하였다(+ X-gal 디스크).
상기와 같이 준비된 각각의 bottom agar plate에 하룻밤 동안 배양한 E. coli FW102 OL2-62 pBRαNTD::hERα LBD-FLAG pACλCI::TIF2 BD-FLAG 균주(대조군)와 E. coli BTH101 pUT18C::hERα LBD -FLAG pKT25::TIF2 BD-FLAG 균주를 bottom agar와 동일한 조성의 top agar (0.8%, 8 mL)에 OD600 0.1이 되도록 접종한 후 bottom agar 위에 붓고, 30분동안 건조하였다.
이 후 종이 디스크(paper disk)를 플레이트 위에 올린 후 디스크 위에 에탄올, 1 mM 에스트라디올, 1 mM 비스페놀 A, 1 mM 비스페놀 S, 1 mM 비스페놀 F, 그리고 1 mM 노닐페놀을 각각 10 μL 처리하였다. 모든 플레이트는 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, + X-gal 디스크에서 기존 센서 균주인 대조군의 경우 노이즈 신호에 민감하기 때문에 플레이트 전체가 푸른색을 띠는 것으로 나타났다. 반면, 본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 센서는 에스트라디올, 비스페놀enol A, bispheol S, 비스페놀 F를 처리했을 때, 처리 부분에서만 특이적으로 파란색이 나타남을 관찰할 수 있었다.
실시예 4-2. 실제 시료를 이용한 에스트로겐성 화합물의 검출능력 측정
본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 센서가 실제 시료로부터 에스트로겐성 화합물을 검출할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 실시하였다.
상기 실시예 4-1.에서 제조한 - X-gal 디스크 및 + X-gal 디스크에 종이 시료인 영수증, 영수증(blue ink), 친환경 영수증(BPA-free), 친환경 영수증(Phenol-free), 일회용 종이컵, 그리고 A4 용지를 모두 가로 세로 0.5 cm로 잘라 top agar에 올렸다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 센서로 측정한 결과 실제 시료인 영수증과 친환경 영수증(BPA-free)에서 푸른색의 색변화를 육안으로 확인할 수 있었으며, 본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 화합물 검출센서는 실제 시료를 센서에 올려놓는 것만으로도 환경호르몬인 에스트로겐성 물질을 쉽게 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. β-갈락토시다아제 분석
본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 화합물 검출 센서의 에스트라디올, 비스페놀 A, 노닐페놀의 감지 능력 확인하였다.
E. coli BTH101 pUT18C::hERα LBD -FLAG와 pKT25::TIF2 BD-FLAG 균주를 접종 후, 1mM IPTG를 첨가하여 OD600 ~ 0.4까지 증식기 지점까지 배양하였다. 이후, 각 농도에 해당하는 에스트라디올, 비스페놀 A, 그리고 노닐페놀 및 EDCs를 세포 800 μL에 넣고 45분 동안 추가로 배양하였다. 다음으로, 세포를 수거하여 Z-완충용액 (Na2HPO4 60 mM, NaH2PO4 40 mM, KCl 10 mM, MgSO47H2O 1 mM, 디티오쓰레이톨 400 μM) 800 μL으로 풀어준 뒤, OD600 (세포 함량)을 측정하였다. 이후, 초음파처리를 통해서 세포를 용균시킨 다음, 4 mg/mL ONPG를 160 μL 처리하여 시료의 색상이 황색으로 변하는 시간을 확인하였다. 샘플이 황색으로 변화하면, 1M Na2CO3 400 μL로 반응을 중지시켰다. 이어서, OD550 (세포 잔류물)과 OD420(황색 정도)을 측정한 다음, lacZ 유전자의 발현을 밀러 단위(miller unit) 공식 (1000 * (((OD420 - (1.75 * OD550))/(t * v * OD600))에 대입하여 활성 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 박테리아 균주를 이용한 에스트로겐성 화합물 검출 센서는 에스트라디올을 1 μM 수준으로, 비스페놀 A는 1 mM 수준에서 감지할 수 있음을 확인하였다.
상기 실시예들로부터 본 발명에 따른 박테리아 균주 및 이를 이용한 에스트로겐성 화합물 검출 센서는 에스트로겐성 화합물을 용이하게 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 기존 검출 시스템의 단점이었던 높은 노이즈 신호를 개선함으로써 센서의 신호를 직접 눈으로 확인할 수 있는 장치에 효과적으로 적용할 수 있다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY
<120> Adenylate cyclase-based bacterial strain for the detection of
estrogenic compounds and a method for detecting estrogenic
compounds using the same
<130> PD18-034-P1
<150> KR 1020180043810
<151> 2018-04-16
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<170> KoPatentIn 3.0
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gccagatgct cacgcgcggg caactgaagg aatacattgg ccagcagcgc ggcgagggct 540
atgtcttcta cgagaaccgt gcatacggcg tggcggggaa aagcctgttc gacgatgggc 600
tgggagccgc gcccggcgtg ccgagcggac gttcgaagtt ctcgccggat gtactggaaa 660
cggtgccggc gtcacccgga ttgcggcggc cgtcgctggg cgcagtggaa cgccactgca 720
ggtcgactct agaggatcca aacagcctgg ccttgtccct gacggccgac cagatggtca 780
gtgccttgtt ggatgctgag ccccccatac tctattccga gtatgatcct accagaccct 840
tcagtgaagc ttcgatgatg ggcttactga ccaacctggc agacagggag ctggttcaca 900
tgatcaactg ggcgaagagg gtgccaggct ttgtggattt gaccctccat gatcaggtcc 960
accttctaga atgtgcctgg ctagagatcc tgatgattgg tctcgtctgg cgctccatgg 1020
agcacccagg gaagctactg tttgctccta acttgctctt ggacaggaac cagggaaaat 1080
gtgtagaggg catggtggag atcttcgaca tgctgctggc tacatcatct cggttccgca 1140
tgatgaatct gcagggagag gagtttgtgt gcctcaaatc tattattttg cttaattctg 1200
gagtgtacac atttctgtcc agcaccctga agtctctgga agagaaggac catatccacc 1260
gagtcctgga caagatcaca gacactttga tccacctgat ggccaaggca ggcctgaccc 1320
tgcagcagca gcaccagcgg ctggcccagc tcctcctcat cctctcccac atcaggcaca 1380
tgagtaacaa aggcatggag catctgtaca gcatgaagtg caagaacgtg gtgcccctct 1440
atgacctgct gctggagatg ctggacgccc accgcctaca tgcgcccact cggccggatt 1500
ataaagatga tgatgataaa taataatcta gtgcagcccg cctaatgagc gggctttttt 1560
ccatgcaagc gaattcatcg atataactaa gtaatatggt gcactctcag tacaatctgc 1620
tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga 1680
cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc 1740
atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata 1800
cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 1860
tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 1920
tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 1980
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 2040
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 2100
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 2160
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 2220
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 2280
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 2340
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 2400
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 2460
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 2520
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 2580
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 2640
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 2700
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 2760
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 2820
tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 2880
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accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 3000
aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 3060
ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 3120
gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 3180
ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 3240
ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 3300
ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 3360
gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 3420
cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 3480
cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 3540
cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 3600
aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 3660
ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 3720
gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 3780
gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atg 3833
Claims (18)
- TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및
인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;
에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 T18 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항에 있어서,
상기 hERα LBD 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα LBD 및 상기 T25 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항에 있어서,
상기 hERα LBD 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드; 및
인간 에스트로겐 수용체 알파의 리간드 결합 부위(hERα LBD)를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드;
에 의해서 형질전환된(transformed), 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제6항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 TIF2 단백질 및 상기 T25 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제6항에 있어서,
상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자의 3' 말단에는 상기 hERα LBD 단백질 및 상기 T18 부위의 발현을 확인하기 위한 FLAG 서열이 접합된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제6항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T25 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 염기서열을 포함하는 플라스미드는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제6항에 있어서,
상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자가 아데닐레이트 사이클레이스의 T18 부위를 코딩하는 유전자와 접합된 플라스미드는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항 또는 제6항에 있어서,
상기 TIF2 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 hERα LBD를 코딩하는 유전자는, 인간 게놈 DNA로부터 mRNA를 전사하고, 상기 mRNA에 대한 스플라이싱 과정을 통해서 인트론이 제거된 mRNA를 제조한 다음, 상기 인트론이 제거된 mRNA에 대한 역전사 과정을 통해서 합성된 cDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭된 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항 또는 제6항에 있어서,
상기 박테리아 균주는 대장균(Escherichia coli) 균주, 고초균(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 유산균으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 균주인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항 또는 제6항에 있어서,
상기 에스트로겐성 화합물은 노레틸노드렐, 5α-안드로스탄, 도데실페놀, 옥틸페놀, 비스페놀 A, 비스페놀 S, 비스페놀 F, 2-에틸헥실-4-히드록시벤조에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논, 2,4-디히드록시벤조페논, 디히드록시메톡시클로르올레핀, o,p'-DDT, 디히드록시메톡시클로르, 2',3',4',5'-테트라클로로-4-비페닐올, 노르디히드로구아이 아레틱산, 아우린, 페놀프탈레인 및 페놀 레드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주. - 제1항 또는 제6항에 따른 에스트로겐성 화합물의 검출능을 갖는 아데닐레이트 사이클레이스 기반의 박테리아 균주를 제조하는 단계;
상기 박테리아 균주에 에스트로겐성 화합물을 함유한 시료를 첨가하고 배양하는 단계; 및
상기 배양된 박테리아 균주를 용균한 다음, 리포터 단백질의 발현 정도를 분석하는 단계;
를 포함하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법. - 제14항에 있어서,
상기 리포터 단백질은 β-갈락토시다아제, 형광 발광 단백질 또는 항생제 내성 부여 단백질인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법. - 제15항에 있어서,
상기 형광 발광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 루시퍼라아제인 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법. - 제14항에 있어서,
상기 리포터 단백질의 발현 정도는 UV-VIS 스펙트로포토미터에 의해서 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법. - 제15항에 있어서,
상기 베타-갈락토시다아제의 발현 정도는 상기 용균 이후에, 발색 시약으로서 O-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)를 첨가해 주고, 발현 정도를 분석함으로써 수행하는 것을 특징으로 하는 에스트로겐성 화합물의 검출방법.
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