KR20190112768A - 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

아밀로이드-β 결합 펩티드의 뇌-침투 조성물이 개시되어 있다. 상기 조성물은, 예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 뇌 내로 관통이동할 수 있는, Fc 단편을 통해 연결된 혈액-뇌 장벽 횡단 항체와 아밀로이드-β 표적화 펩티드를 포함하는 이작용성 분자, 및 이를 포함하는 조성물로서 알츠하이머병의 치료에 유용할 수 있다. 이 조성물을 알츠하이머병을 치료하는 데 사용하는 방법이 개시되어 있다.

Description

혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도
본 발명은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 관통이동하는 화합물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 도메인 또는 이의 단편, 및 베타-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 화합물, 이의 융합 단백질 및 조성물, 및 알츠하이머병의 치료에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
신경퇴행성 질병, 예컨대 알츠하이머병 및 파킨슨병은, 현재, 이들 불능 상태에 대한 효과적인 치료가 없기 때문에 고령화 사회에 점점 더 부담이 되고 있다. 알츠하이머병(AD)은 65세 연령을 넘는 인구의 대략 15%가 이환된 비가역적 신경퇴행성 장애이고, 노령 인구에서의 진행성 지적 인지 장애의 주된 원인이다(문헌[Hardy et al, 2014]).
AD에서는, 콜린성 뉴런의 심각한 손실이 있으며, 이와 함께 결과적으로, 기억 처리 및 저장에 관여하는 중요 신경전달물질인 아세틸콜린(ACh)의 수준에 있어서의 감소가 있다. 게다가, 신경전달물질 글루타메이트에 의해 유도되는 흥분독성이 또한 AD의 발병기전에 관여되어 있다. 따라서, 콜린성 증강 및/또는 글루타메이트 독성의 억제가 AD에서 인지를 개선할 수 있다. 실제로, AD 치료에 대해 유일하게 FDA 승인된 약물은 ACh의 손실을 방지하기 위한 아세틸콜린 에스테라제(AChE) 억제제(예를 들어, 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민) 및 특정 글루타메이트 수용체의 억제제(예를 들어, 메만틴)이다(문헌[Mangialasche et al, 2010]; 문헌[Ji and Ha, 2010]; 문헌[Savonenko et al, 2012]). 그러나, 이들 대증 약물의 유익한 효과는 제한적이고 순간적이어서, 인지 기능에 있어서 일시적인 개선을 제공하고 이 질병의 진행을 중단시키지 못한다. 항산화제, 항염증 약물(NSAID), 콜레스테롤-저하 약물 및 에스트로겐 요법을 포함한 기타 다른 치료가 고려되고 있지만, 이들 치료 중 어느 것도, 특히 AD 환자에서 기억 및 인지 기능을 개선하는 데 있어서 어떠한 장기간의 유익한 효과도 갖지 않는 것으로 보인다(문헌[Magialasche et al, 2010]; 문헌[Ji and Ha, 2010]).
알츠하이머병의 주요 특징은 뇌에서의 응집체 및 플라크(plaque) 형태로의 39 내지 43개의 아미노산 펩티드 β아밀로이드(Aβ)의 축적이다. 유전자적, 병리학적 및 생화학적 연구에 기초한 상당한 증거는 Aβ, 특히 이의 올리고머 응집체가 AD 병리의 발생에서 중추적인 역할을 함을 나타낸다(문헌[Hardy et al, 2014]; 문헌[DeLaGarza, 2003]; 문헌[Selkoe and Hardy, 2016]). 아밀로이드 가설에 따르면, 뇌에서의 Aβ의 생성 및 제거에 있어서의 만성 불균형은 나이가 듦에 따라 이의 축적 및 응집을 초래한다. 이들 Aβ 응집체는, 시냅스 손실 및 뉴런 기능의 손실로 이어져서, 기억 및 기타 다른 인지 기능의 진행성 손실로 이어지는 사건들의 캐스케이드를 개시하는 것으로 여겨진다(문헌[Hardy et al, 2014]; 문헌[DeLaGarza, 2003]; 문헌[Selkoe and Hardy, 2016]; 문헌[Sengupta et al, 2016]).
전구체 단백질 APP로부터의 Aβ의 생성은 프로테아제 β및 γ 세크레타제에 의한 APP의 순차적인 단백질분해에 의해 달성된다(문헌[Barageb and Sonawane, 2015]). 이들 효소의 억제제는 Aβ 생성을 감소시키는 것으로 밝혀져 있으며, AD를 치료하기 위한 잠재적인 약물로서 개발 중이다(문헌[Hardy et al, 2014]; 문헌[Mangialasche et al, 2010]; 문헌[Selkoe and Hardy, 2016]; 문헌[Ji and Ha, 2010]). 유사하게, Aβ를 봉쇄하고/하거나 Aβ 제거를 촉진하는 작용제가 또한 개발 중이다. 이들 중에서 주목할 만한 것은 AD 백신에 의한 면역요법의 개발이다. 능동적 면역화(Aβ 펩티드) 및 수동적 면역화(Aβ 항체) 둘 모두는 AD의 유전자도입 동물 모델에서 그리고 AD 환자를 수반하는 임상 시험에서 아밀로이드 침착을 예방하는 데뿐만 아니라 이미 형성된 아밀로이드 플라크를 제거하는 데 효과적인 것으로 밝혀져 있다(문헌[Mangialasche et al, 2010]; 문헌[Ji and Ha, 2010]; 문헌[Morrone et al, 2015]; 문헌[Lannfelt et al, 2014]; 문헌[Selkoe and Hardy, 2016]; 문헌[Goure et al, 2014]).
아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백질분해 절단을 예방하고 그럼으로써 뇌 Aβ 생성을 감소시키거나 억제하는 β 및 γ 세크레타제의 억제제가 개발 중이다(예를 들어, 타렌플루르빌, 세마가세스타트, 베루베세스타트). 그러나, Aβ 부하를 감소시는 데 있어서의 이들의 치료적 효능은 아직 알려져 있지 않으며, 이들 약물 중 다수가 전임상 또는 임상 시험에서 실패하였다(문헌[Savonenko et al, 2012]; 문헌[Musiek and Holtzman, 2015]). 더욱이, 이들 효소는 또한 기타 다른 효소 및 신호전달 분자, 예컨대 뉴런 발달과 연관된 Notch의 처리에 관여하기 때문에(문헌[Savonenko et al, 2012]; 문헌[Musiek and Holtzman, 2015]), 이들 억제제는 심각한 비특이적 부작용을 가질 수 있다.
면역요법 접근법, 예컨대 능동적 면역화(Aβ백신, AN1792) 및 수동적 면역화(예를 들어, 바피뉴주맙, 솔라네주맙, 크레네주맙, 아두카누맙 등)는 유전자도입 동물에서 Aβ침착을 감소시키는 데 그리고 기억 결손의 부분 제거에 매우 효과적인 것으로 밝혀져 있다(문헌[Monsonego and Weiner, 2003]; 문헌[Bard et al, 2000]; 문헌[Sevigny J et al., 2016]). 능동적 면역화 및 수동적 면역화 둘 모두를 사용하는 몇몇 임상 시험은 중간 정도의 인지 개선과 함께 뇌 Aβ 침착의 감소를 나타내었다. 그러나, 임상 시험은 AD 환자에서 심각한 염증 반응(수막뇌염 제시), 혈관성 부종, 및 미세출혈로 인해 폐기되어야 했다. 이러한 제한사항에도 불구하고, 면역요법 접근법은 Aβ를 효과적으로 봉쇄하고 그의 침착 및 독성을 예방하는 작용제가 AD의 진행을 정지시키는 데 있어서, 그리고 심지어는 그의 발생을 예방하는 데 있어서 효과적인 약물로서 잠재적으로 역할을 할 수 있음을 나타낸다(문헌[Rafii and Aisen, 2015], 문헌[Selkoe and Hardy, 2016]).
뇌에서 기원하는 AD 및 기타 다른 질병의 치료뿐만 아니라 조기 진단은, 대다수의 적합한 치료적 분자 및 진단제가 조밀하고 고도로 제한적인 혈액-뇌 장벽(BBB)을 관통할 수 없기 때문에 과제로 남아 있다(문헌[Abbott, 2013]). BBB는, 혈관을 둘러싸고, 밀착 연접(tight junction)을 통해 서로 연결된 뇌 내피 세포(BEC)에 의해 형성되는 물리적 방어벽을 구성한다(문헌[Abbott, 2013]). BEC 사이에 형성된 밀착 연접은 BBB의 완전성에 본질적이며, 500 달톤(Da) 초과의 분자의 세포주위(paracellular) 수송을 방지한다. 뇌 내피 세포는 매우 느린 음세포작용 속도를 나타내기 때문에(문헌[Abbott, 2013]), 더 큰 분자의 세포관통(transcellular) 수송은 고도로 특이적인 수용체 매개 트랜스사이토시스(RMT) 경로, 및 수동적인 전하-기반 흡착 매개 트랜스사이토시스로 제한된다(문헌[Abbott, 2013]; 문헌[Pardridge, 2002]). 추가적으로, 고밀도의 유출 펌프, 예컨대 P-당단백질 또는 다중-약물 저항성 단백질-1(MDR-1)은 뇌로부터의 원치 않는 물질의 제거에 기여한다(문헌[Abbott, 2013]).
이러한 모든 특징들은 병원체 및 독소로부터 뇌를 보호하지만, 이들은 마찬가지로 대부분의 치료제의 진입을 방해한다. 실제로, 수송체 분자에 특이적으로 '운송되지', 즉 커플링되지 않는 한, 소분자 치료제 중 5% 미만이, 약리학적으로 관련된 농도(즉, 중추 신경계(CNS) 표적에 교합(engage)하고 약리학적/치료적 반응을 유발하는 데 충분한 농도)로 BBB를 횡단할 수 있으며, 사실상 더 큰 치료제는 어느 것도 그렇게 할 수 없다. BBB를 가로질러 분자를 수송하기에 효과적인 '운반체'의 결여로 인해, 신경퇴행성 질병에 대한 다수의 약물은, 그들이 충분한 양으로 뇌에 전달될 수 없기 때문에 추가의 개발로부터 '보류되거나' 제거되어 왔다.
AD 병리의 분자 기전에 대한 이해에 있어서의 상당한 진보에도 불구하고, 이 질병의 진행을 예방하거나 이를 치유할 수 있는 현재 이용 가능한 효과적인 약물 또는 치료는 없다. 더욱이, 고용량 및 고선택성 BBB 운반체의 결여는 뇌 종양 및 신경퇴행성 질병을 비롯한 뇌에서 기원하는 질병에 대한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시킨다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 또는 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 베타-아밀로이드(β-아밀로이드)에 결합하는 폴리펩티드를 제공한다. β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드(또는 단백질)는 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드1-42(Aβ1-42) 응집체에 선택적으로 결합할 수 있으며, 본 명세서에서 ABP 또는 ABP 변이체로 약기되고 지칭될 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편(BBB)에 연결된 베타-아밀로이드(β-아밀로이드) 결합 폴리펩티드(ABP 또는 ABP 변이체)를 포함하는 융합 단백질(본 명세서에서 화합물, 조성물 또는 작제물로도 지칭됨)을 제공하며, 본 명세서에서 BBB는 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 운반체 항체 또는 단편에 대한 약어를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 ABP 또는 ABP 변이체 및 BBB 운반체 또는 이의 단편을 포함하며, 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부분을 통해 연결될 수 있다. 바람직한 구현예에서, ABP 또는 ABP 변이체 및 BBB를 포함하는 융합 단백질은 Fc로 알려진 면역글로불린 단백질 이펙터 도메인 또는 이의 단편을 추가로 포함하며, 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부분을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 링커(L)를 추가로 포함할 수 있으며, L은 작은 연결 펩티드 또는 펩티드-유사 사슬이다. 예를 들어, 제공된 BBB-Fc-L-ABP 작제물은 단일쇄 폴리펩티드 또는 이량체 폴리펩티드일 수 있으며, BBB-Fc-L-ABP를 포함하는 단일쇄 폴리펩티드는 Fc 이량체화에 의해 이량체를 형성할 수 있다. Fc 이량체화는 2개의 Fc CH3 도메인 사이의 조밀하게 패킹된 큰 소수성 계면의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 BBB-Fc-ABP를 포함할 수 있다. 제공된 BBB-Fc-ABP 작제물은 단일쇄 폴리펩티드(1가) 또는 이량체 폴리펩티드(2가)일 수 있으며, BBB-Fc-ABP를 포함하는 단일쇄 폴리펩티드는 Fc를 통해 이량체를 형성할 수 있으며, 이는 융합 단백질의 이량체화를 가능하게 한다. 본 발명의 화합물은 융합 단백질, 작제물, 융합 분자, 제형 또는 조성물로 지칭될 수 있다.
본 발명의 화합물은 알츠하이머병(AD)의 치료에 사용될 수 있다.
β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
.
β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기 서열을 포함하는 변이체일 수 있다:
Figure pct00003
(여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 G 또는 V이고, X3은 G 또는 A이고, X4는 G 또는 A이고, X5는 G 또는 V이고, X6은 G 또는 V이고, X7은 G 또는 V이고, X8은 G 또는 A이고, X9는 G 또는 A임)(서열 번호 31).
구체적인 비제한적 구현예에서, ABP 또는 이의 변이체는 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00004
상기 서열들 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열.
β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드(ABP) 변이체는 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 ABP는 ABP 또는 ABP 변이체로 지칭될 수 있다. 본 발명은 컨센서스 서열인 서열 번호 31을 갖는 ABP 변이체 서열을 추가로 포함하며, 예를 들어 서열 번호 35, 또는 서열 번호 36, 또는 임의의 동등하게 안정적인 폴리펩티드 서열일 수 있다. 동등하게 안정적인 폴리펩티드 서열은 포유류 발현 시스템에서 융합 단백질의 발현 및 생성 동안 펩티드 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 ABP 변이체는 종래 기술의 ABP 펩티드(WO2006/133566 참조)에 비하여 개선된 펩티드 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 폴리펩티드를 제공하며, β-아밀로이드에 결합하는 단리된 폴리펩티드는 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38, 또는 동등하게 안정적인 폴리펩티드 서열을 포함하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 서열 번호 31, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 비제한적인 예에서, ABP 변이체는 서열
Figure pct00005
(서열 번호 35);
Figure pct00006
(서열 번호 36)를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 관통이동하는 항체 또는 이의 단편(BBB)을 포함할 수 있다(상기에 기재된 바와 같이, BBB는 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 운반체의 약어임). 항체 또는 이의 단편(BBB)은 뇌 내피 세포 상의 표면 수용체 에피토프에 결합할 수 있으며, 표면 수용체 에피토프는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 관통이동을 가능하게 한다. 예를 들어, 그러한 표면 수용체 에피토프는 TMEM30A 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R) 에피토프, 또는 이들의 아이소형(isoform), 변이체, 일부분, 또는 단편일 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00007
(서열 번호 1)의 상보성 결정 영역(CDR) 1 서열,
Figure pct00008
(서열 번호 2)의 CDR2 서열,
Figure pct00009
(서열 번호 3)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
Figure pct00010
(서열 번호 4)의 CDR1 서열,
Figure pct00011
(서열 번호 5)의 CDR2 서열,
Figure pct00012
(서열 번호 6)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
Figure pct00013
(서열 번호 7)의 CDR1 서열,
Figure pct00014
(서열 번호 8)의 CDR2 서열,
Figure pct00015
(서열 번호 9)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및
Figure pct00016
(서열 번호 10)의 CDR1 서열,
Figure pct00017
(여기서, X는 A 또는 T임)(서열 번호 11)의 CDR2 서열,
Figure pct00018
(서열 번호 12)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00019
(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 A 또는 E이고, X3은 F 또는 V이고, X4는 E 또는 G이고, X5는 R 또는 L이고, X6은 F 또는 W이고, X7은 L 또는 V임);
Figure pct00020
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 A이고; X6은 F 또는 V이고; X7은 E 또는 G이고; X8은 R 또는 L이고; X9는 F 또는 W이고; X10은 A 또는 S이고; X11은 M 또는 I이고; X12는 A 또는 S이고; X13은 V 또는 L이고; X14는 D 또는 Y이고; X15는 V 또는 L이고; X16은 K 또는 R이고; X17은 Q 또는 L임);
Figure pct00021
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이고; X6은 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이고; X8은 G 또는 E이고; X9는 L 또는 R이고; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이고; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이고; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이고; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임); 및
Figure pct00022
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 S이고; X6은 D 또는 G이고; X7은 L 또는 R이고; X8은 F 또는 W이고; X9는 A 또는 S이고; X10은 A 또는 T이고; X11은 A 또는 S이고; X12는 G 또는 N이고; X13은 M 또는 L이고; X14는 N 또는 R이고; X15는 E 또는 R이고; X16은 P 또는 A이고; X17은 S 또는 Y이고; X18은 Q 또는 L임).
구체적인 비제한적 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00023
Figure pct00024
상기 서열들 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열.
BBB는 항체 또는 이의 단편일 수 있으며, 바람직한 구현예에서, BBB는 단일-도메인 항체(sdAb)일 수 있다. sdAb는 인간화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편(BBB)은 Fc 또는 이의 단편에 연결될 수 있으며, 이때 BBB-Fc 작제물은 이량체를 형성할 수 있다. 본 발명은 BBB-Fc-L-ABP를 포함하는 융합 펩티드를 추가로 제공하며, 융합 펩티드의 BBB-Fc 일부분은 짧은 펩티드 링커(예를 들어, 12개 미만의 아미노산을 갖는 링커)를 통해 ABP에 연결되고, Fc 또는 Fc 단편은 상기 융합 펩티드의 이량체화를 가능하게 하여 이량체를 제공하며, 이에 따라 이량체는 분해로부터 작제물을 보호하고, 그의 혈청 반감기를 증가시킨다. Fc 단편은 바람직한 약동학적 특성을 부여하기 위하여 선택되는 임의의 적합한 Fc 단편일 수 있으며, Fc 또는 Fc 단편은 융합 분자의 긴 반감기에 기여한다. 기타 다른 바람직한 Fc 또는 Fc 단편의 구현예는 면역학적 이펙터 기능을 조절, 변경 또는 억제할 수 있다(문헌[Shields et al., 2001]). 기타 다른 매우 바람직한 Fc 단편의 구현예는 뇌로부터의 융합 펩티드의 제거를 매개할 수 있다(문헌[Caram-Salas N, 2011]). 비제한적인 예에서, Fc 또는 Fc 단편은, 상기 융합 펩티드 내에 포함될 때, 뇌로부터 아밀로이드의 제거를 향상시킬 수 있었던 감쇠된 이펙트 기능을 갖는, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 Fc 마우스 Fc2a 또는 인간 Fc1일 수 있다.
본 발명의 화합물에서, BBB는 Fc 단편 및/또는 임의의 추가의 적합한 링커 L을 통해 ABP에 연결될 수 있다.
본 발명의 화합물은 융합 단백질을 포함하며, 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편, Fc 단편, 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 융합 단백질은 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 연결 펩티드 또는 화학적 링커인 L을 통해 Fc 단편의 C-말단에 연결된다. 항체 또는 이의 단편은 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있고, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 13 내지 서열 번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편; 서열 번호 27 내지 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 b-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드; 및 서열 번호 39 내지 서열 번호 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 제공된 Fc는 감쇠된 이펙터 기능을 갖는 Fc를 포함할 수 있다.
예를 들어, 융합 단백질은 서열 번호 42 내지 서열 번호 52, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 단일쇄 폴리펩티드일 수 있으며, 융합 단백질의 단일쇄 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드에 대한 것일 수 있다. 서열 번호 42 내지 서열 번호 52에 포함되는 융합 단백질 내에 제공되는 (GGGSGGGGS 또는 GGGGSGGGGS) 링커가 임의의 적합한 링커 서열일 수 있음에 유의한다. 예를 들어, 강조처리된 링커 서열(예를 들어, GGGSGGGGS)은 제공된 융합 단백질의 성분들의 연결을 가능하게 하는 임의의 등가의 펩티드 연결 서열일 수 있으며, 상기 제공된 융합 단백질은 서열 번호 53에 예시된 바와 같은 것으로, 여기서 링커는 임의의 펩티드 또는 화학적 링커일 수 있다.
일 구현예에서, BBB는 Fc 단편에 연결되며, 이에 따라 이량체를 형성할 수 있다. Fc 단편은 감쇠된 이펙터 기능을 갖는 임의의 적합한 Fc 단편, 예를 들어 마우스 Fc2a 또는 인간 Fc1일 수 있다(문헌[Shields et al., 2001]).
본 발명의 ABP 변이체는 서열 번호 31을 포함할 수 있으며, 예를 들어 서열 번호 32 내지 38 중 어느 하나로부터 선택되는 서열일 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은 ABP 변이체는 종래 기술의 ABP 폴리펩티드에 비하여 예기치 않은 상당한 이점을 나타낸다. 더 구체적으로, 본 ABP 변이체는 증가된 안정성 및 바이오-제조성(bio-manufacturability)을 나타낸다. 더욱이, 본 명세서에 제공된 바와 같은, ABP 또는 변이체를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 조성물은 본 명세서에 제공된 바와 같은 링커 및/또는 Fc 단편을 통해 BBB에 커플링될 때, 혈액-뇌 장벽을 관통이동함에 있어서 상승적이고 예기치 않은 효능을 나타낸다. 그러한 ABP 변이체는 본 명세서에 제공된 바와 같은 선택된 Fc 단편을 통해 BBB에 커플링될 때, 뇌로부터의 Aβ의 제거의 예기치 않은 신속하고 개선된 제거를 제공한다. 더욱이, 본 명세서에 제공된 바와 같은 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 BBB를 관통이동함에 있어서 상승적이고 예기치 않은 효능 및 뇌로부터의 Aβ의 개선된 제거를 나타낸다.
따라서, 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편(BBB), β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드(ABP 또는 ABP 변이체)에 연결된 Fc(Fc)를 포함하는 치료적 조성물이 제공되며, 상기 폴리펩티드는 제공되는 치료적 조성물의 안정성 및 효능에 있어서 상승적 증가를 부여한다. 나타낸 바와 같이, 예기치 않게도 그리고 가장 유의하게, 동물(AD의 마우스 모델)에서 유사한 결과를 달성하기 위하여 유리 ABP의 경우 3개월의 다회 처리를 수행한 것에 비하여(도 9a), BBB-Fc-ABP의 단회 볼루스는 처리 후 24시간 이내에 뇌 Aβ 부하를 50%만큼 감소시켰다(도 9b). 따라서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 화합물은 뇌 Aβ 부하를 감소시키는 데 있어서 유리 ABP보다 훨씬 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 추가로, Fc를 포함하는 이러한 융합 단백질은 유리 ABP 또는 BBB-ABP(WO 2006/133566)에 비하여 실질적으로 더 긴 혈청 반감기를 제공하였으며, 그럼으로써 개선된 치료적 화합물을 제공하였다(도 10).
본 발명의 ABP 변이체, 및 ABP를 포함하는 융합 단백질(작제물)은 종래 기술의 불리한 점을 극복한다. 종래 기술에서, ABP와 단독으로의 BBB 운반체(WO 2006/133566)의 연결은 효과적인 분자의 생성을 보장하지 않는다. 혈청 반감기를 향상시키는 것을 겨낭한 Fc를 포함하는 융합체는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 ABP의 효율적인 수송을 보장하지 않는다. BBB 운반체-, Fc 단편- 및 ABP를 포함하는 융합 분자의 특별한 조작 및 제형은 효율적인 BBB-투과성 치료적 화합물을 제공한다. 제공되는 효율적인 혈액-뇌 장벽-투과성 치료적 화합물은 BBB-Fc-ABP의 특별히 조작된 제형을 포함하며, 상기 제형은 화합물 안정성 및 효능에 있어서 상승적 개선을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 융합 조성물의 안정성에 있어서의 예기치 않은 증가, 및 혈액-뇌 장벽의 관통이동의 효능에 있어서의 상승적 증가 및 뇌로부터의 Aβ의 더 신속한 제거(24시간 이내)가 상기 융합 단백질 작제물을 포함하는 조성물에서 제공된다.
본 명세서에 제공된 화합물은 화합물, 융합 단백질, 제형, 조성물 또는 작제물로 지칭될 수 있다. 제공된 작제물은 항체 또는 이의 단편(이는 BBB로 약기될 수 있음), Fc 단편(Fc로 약기됨), 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드(ABP로 약기됨)를 포함할 수 있다. 제공된 작제물 또는 조성물(이는 본 명세서에서 BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP로 약기될 수 있음)은 혈액-뇌 장벽 관통이동, 효능 및 화합물 안정성에 대하여 종래 기술에서 접하게 되는 결점을 상승적으로 극복하는 성분들을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 제공된 화합물은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 데 있어서의 월등하고 예기치 않은 효능, 치료적 효능 및 화합물 안정성을 갖는 신규한 제형을 포함한다.
종래 기술에 Fc 융합체가 혈청 반감기를 증가시킬 수 있는 경우가 있지만, 혈청 반감기는 Fc 융합체에서 반드시 증가되는 것은 아니다. 더욱이, Fc 융합체는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 관통이동을 반드시 개선하는 것은 아니다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 38 및 펩티드 안정성이 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 제공하며, 폴리펩티드 서열이 ABP 또는 ABP 변이체로 지칭될 때, ABP 변이체 서열은 서열 번호 31을 포함할 수 있으며, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 및 펩티드 안정성이 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어 서열 번호 31의 임의의 서열 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 서열 번호 31을 갖는 ABP 변이체는 폴리펩티드 안정성에 대하여 종래 기술의 불리한 점을 극복한다. 더욱이, 본 발명의 ABP를 포함하는 화합물은 개선된 화합물 안정성 및 바이오-제조성을 나타낸다. 더욱이, 본 명세서에 제공되는 바와 같은 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 화합물은 상승적이고 예기치 않은 치료적 개선을 나타낸다.
본 발명의 ABP 변이체는 서열 번호 31 내지 서열 번호 38, 및 동등하게 안정적인 폴리펩티드 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 ABP 변이체는 종래 기술의 ABP 서열에 비하여 월등하며, 본 ABP 변이체 폴리펩티드는 개선된 안정성을 나타낸다(도 2a와 도 16 사이의 비교에서 밝혀진 바와 같음).
본 발명은 또한 본 발명의 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 융합 단백질(화합물, 작제물, 또는 융합 분자로도 지칭됨)을 제공한다. 융합 단백질은 Fc 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편, Fc 단편, 및 서열 번호 31, 서열 번호 32 내지 38로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 β-아밀로이드 결합 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 제공된 BBB-Fc-ABP 제형은 화합물 안정성 및 뇌로부터 독성 아밀로이드를 제거하는 데 있어서의 치료적 효능의 상승적 개선을 나타낸다.
본 명세서에서 BBB-Fc-ABP로 지칭될 수 있는 융합 단백질 또는 작제물은 그 안에 포함된 성분들에 대하여 배향이 변동될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 융합 단백질은 이량체를 형성하는데(도 1에 나타낸 바와 같음), 이때 융합 펩티드는 Fc 영역을 통해 이량체화된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 제공된 화합물은 Fc 단편(Fc)의 N-말단에 연결된 BBB, 및 C-말단에 부착된 짧은 펩티드 링커를 통해 Fc 단편의 C-말단에 연결된 ABP 또는 ABP 변이체(ABP)를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다(도 1a, 여기서는 화합물이 융합 단백질의 이량체로 나타남). 추가의 구현예에서, 제공된 화합물은 Fc 단편(Fc)의 C-말단에 연결된 BBB를 포함할 수 있으며, 여기서는 ABP 또는 ABP 변이체(ABP)가 적합한 링커(L)를 통해 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1b). 구성 1a에서, ABP 또는 ABP 변이체는 Fc에 N-말단(융합) 또는 C-말단(화학적 연결) 융합/연결될 수 있음에 유의한다. 기타 다른 가능한 구성에서, BBB는 ABP의 N-말단에 연결될 수 있고, ABP는 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1c). 또 다른 가능한 구성에서, BBB는 ABP의 C-말단에 연결될 수 있고, ABP는 Fc 단편의 C-말단에 연결된다(도 1d).
본 명세서에 제공된 화합물은 서열 번호 42 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 이들 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질(BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP, 여기서 L은 임의의 적합한 링커일 수 있음) 이량체(도 1에 나타낸 바와 같으며, 바람직하게는 도 1a 또는 도 1b임)이다. 비제한적인 예로서, 제공된 화합물 또는 융합 단백질은 서열 번호 35(ABP-GG-G) 또는 서열 번호 36(ABP-6G)의 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열 번호 17(FC5-H3)의 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및 서열 번호 40(hFc1X7)의 서열을 포함하는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 비제한적 구현예에서, 화합물은 서열 번호 46[FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(GG-G)] 또는 서열 번호 47[FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)]의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 L은 임의의 적합한 링커일 수 있다.
본 발명의 화합물은 혈액-뇌 장벽을 관통이동한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 화합물을 인코딩하는 핵산 분자를 포괄한다. 본 발명의 융합 단백질 또는 화합물의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포괄한다.
본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명의 조성물은 환자에서 알츠하이머병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 뇌 β-아밀로이드(Aβ)의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 또는 CSF 내의 독성 β-아밀로이드(Aβ) 수준을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공하며, 본 발명의 약제학적 조성물은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 뇌 β-아밀로이드(Aβ-)의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 내의 독성 β-아밀로이드(Aβ) 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 AD를 가진 환자에 대한 본 발명의 화합물의 투여를 포함한다. 더 구체적으로는, 본 방법은 대상체에 대한 본 발명의 약제학적 조성물의 충분한 양의 반복된 비경구 투여 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 비경구 투여는 피하 투여 또는 정맥내 투여이다.
본 발명의 방법은 Aβ의 증가된 뇌 수준을 갖는 대상체의 뇌에 본 명세서에 제공된 조성물의 반복된 비경구 투여 후에 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시킨다. 더 구체적으로는, 독성 β-아밀로이드 수준은 본 발명의 조성물의 반복된 비경구 투여 후 4주 이내에 감소된다.
본 발명의 방법은 본 발명의 조성물의 비경구 투여 후에 대상체의 뇌척수액(CSF) 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시킨다. 더 구체적으로는, 대상체의 뇌척수액(CSF) 내의 독성 β-아밀로이드 수준은 본 발명의 조성물의 단회 비경구 투여 후 24시간 이내에 유의하게 감소되며; 이때 유의한 감소는 24시간 이내에 최대 50%이다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽-투과성 단일 도메인 항체(sdAb)를 제공하며, sdAb는 낙타류 FC5 또는 이의 인간화 버전이다. Fc 상에 2가 포맷으로 나타나는 FC5는 VHH 포맷의 FC5에 비하여 개선된 혈액-뇌 장벽-횡단 특성을 갖는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Farrington et al., 2014]).
본 발명은 시험관내(in vitro)에서 혈액-뇌 장벽 관통이동을 촉진하는 BBB 및 Fc 단편을 포함하는 화합물을 제공하고, 융합 분자의 혈청 반감기를 증가시키며, 이때 Fc 융합체의 혈청 반감기는 완전 IgG의 것과 유사해진다. FC5-Fc-ABP의 연장된 혈청 반감기는 또한 전체 뇌 노출을 증가시키는데, 이는 알츠하이머병과 같은 만성 질병을 치료하는 데 특히 중요하다.
FC5-Fc-ABP 융합 분자뿐만 아니라 인간화 버전 FC5(H3)-hFc-ABP, 및 IGF1R5-H2-ABP 융합 분자를 CHO 세포에서 생성하였다. 서열 번호 31에 제공된 바와 같은 본 발명의 ABP 변이체는 융합 분자의 바이오-제조성 및 안정성을 향상시키는 특이적 점-돌연변이 또는 결실에 의해 체계적으로 재조작된다(서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53). ABP 변이체를 포함하는 본 발명의 융합 분자는 Aβ 결합 안정성을 보유할 뿐만 아니라, ABP 변이체를 포함하는 제공된 융합 분자는 혈액-뇌 장벽을 관통할 뿐만 아니라, 유리하게는 뇌로부터의 Aβ의 제거, 예를 들어 투여 후 24시간 이내에 뇌로부터의 Aβ의 신속한 제거를 가능하게 한다.
본 발명의 ABP 변이체, 예를 들어 ABP(GG-G)(서열 번호 35) 또는 ABP(6G)(서열 번호 36)를 특이적으로 조작하여 작제물의 안정성 및 제조성을 향상시켰다(도 16에 나타낸 바와 같음). 본 발명의 작제물의 향상된 안정성 및 바이오-제조성은 당업계에 의미가 있다. 따라서, 본 발명은 제공된 융합 분자의 안정성 및 바이오-제조성을 향상시키는 ABP 및 ABP 변이체를 포괄하지만, 또한 치료적 활성을 보유한다(도 15a에 제공된 바와 같음).
따라서, 서열 번호 31에, 예컨대 서열 번호 32 내지 38에 제공된 바와 같은 상이한 ABP 변이체를 포함하는 융합 분자는 시험관내에서 모(parent) ABP의 Aβ 올리고머 결합 능력을 보유할 뿐만 아니라(도 2b, 도 2c, 도 12, 도 15a, 도 15b 및 도 15c), 시험관내 및 생체내(in vivo) 둘 모두에서의 모 FC5의 BBB-관통 특성을 보유한다(도 4, 도 5a, 도 6, 도 7, 도 17a, 도 17b, 도 18 및 도 19). ABP는, 래트 및 개 CSF에서 그의 존재에 의해 확립된 바와 같이, 시험관내 및 생체내에서 운반체, 예를 들어 FC5에 의해 BBB를 가로질러 수송된다(도 5 및 도 6). ABP 융합체를 또한 야생형 및 AD 유전자도입 마우스 둘 모두에서 뇌 내의 표적 영역, 예컨대 해마 및 피질에 수송하고 전달하였다(도 8 및 도 19). 뇌-전달된 ABP는 또한 AD 유전자도입 마우스 및 래트의 CSF 내의(도 9c 및 도 11a 및 도 11b) 그리고 피질 및 해마 영역 내의 Aβ 제거를 촉진시켰다(도 9b 및 도 11c). 게다가, 그리고 가장 중요한 점은, 래트 AD 모델에서의 Aβ 제거는 향상된 해마 부피 및 뉴런 연결성(neuronal connectivity)과 상관이 있다는 것인데(도 12a 및 도 12b), 이는 치료에 대한 원하는 약리학적/생리학적 반응을 나타낸다.
예기치 않게도 그리고 가장 유의하게, 동물에서 유사한 결과를 달성하기 위하여 유리 ABP의 경우 3개월의 다회 처리를 수행한 것에 비하여(도 9a), BBB-Fc-ABP의 단회 볼루스는 처리 후 24시간 이내에 뇌 Aβ 부하를 50%만큼 감소시켰다(도 9b). 따라서, BBB-개입 ABP는 뇌 Aβ 부하를 감소시키는 데 있어서 유리 ABP보다 훨씬 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 추가적으로, 본 화합물은 Fc와의 그의 융합으로 인해, 더 우수한 치료제의 본질적인 특징인 유리 ABP 또는 FC5 ABP에 비하여 실질적으로 더 긴 혈청 반감기를 갖는다(도 10).
종래 기술에서, ABP와 단독으로의 BBB 운반체(WO 2006/133566)의 연결은 효과적인 분자의 생성을 보장하지 않는다. 혈청 반감기를 향상시키기 위한 Fc와의 융합체는 또한 혈액-뇌 장벽을 가로질러 ABP의 효율적인 수송을 보장하지 않는다. 본 발명의 융합 단백질 작제물 내에 제공된 바와 같은 BBB 운반체-, Fc 단편- 및 ABP 융합 분자의 적합한 조작 및 제형은 효율적인 BBB-투과성 치료적 화합물을 제공한다.
이러한 신규한 이작용성 융합 분자는 현재 개발 중에 있는 통상적인 치료적 항체에 비하여 구별되는 이점을 갖는다. 먼저, BBB-융합된 치료적 ABP는 훨씬 더 높은 수준으로 그리고 더 신속한 속도로 뇌를 관통할 수 있으며, 이는 치료적 효능을 실질적으로 개선한다. 게다가, ABP 및 BBB(예를 들어, FC5)는 그들 각각의 수용체에 대해 비교적 더 낮은 친화성을 가지며, 이에 따라 뇌로부터 더 신속히 제거될 가능성이 높으며, 따라서 ABP-결합된 Aβ의 더 신속한 제거를 촉진시킨다. Aβ 제거를 위하여 반응성 미세교세포/성상세포를 주로 사용하는 치료적 항체(예를 들어, 애두카누맙)와 달리(이는 더 느린 과정임), 본 발명의 융합 분자는 Aβ 제거를 위하여 더 신속한 혈관주위 배출 경로를 사용할 가능성이 높다. 이는, 유사한 결과를 달성하기 위하여 반복된 다회 용량에 의한 수개월의 치료를 필요로 하는 유리 ABP(도 9b) 및 항체-기반 치료제에 비하여, 치료 후 24시간 이내에 CNS Aβ의 거의 50% 감소에 의해 뒷받침된다.
더욱이, 본 화합물은 항체-기반 치료제에 비하여 신경-염증 반응을 유발할 가능성이 더 적다.
본 발명의 이들 및 기타 다른 특징을 이제 첨부된 도면을 참조하여 예로서 설명할 것이다:
도 1: 혈액-뇌 장벽-횡단 아밀로이드-결합 융합 단백질의 개략도를 나타낸다. 융합 단백질은 BBB-횡단 단일-도메인 항체(BBB 또는 BBB 운반체), Fc 단편(Fc) 및 아밀로이드-결합 펩티드(ABP)를 포함한다. 도 1은 BBB-Fc-ABP를 포함하는 융합 단백질의 상응하는 이량체를 나타낸다. 도 1a, 도 1b, 도 1c, 및 도 1d에 예시된 바와 같이, 3가지 성분(즉, BBB, Fc, 및 ABP)이 다양한 구성으로 도시되어 있다.
도 2: CHO 세포에서의 FC5-mFc-ABP 및 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP (ABP 서열 번호 32) 융합 분자의 생성을 나타낸다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE(NR - 비환원성 조건 및 R - 환원성 조건)에 의한 FC5 융합 분자의 분리 후의 쿠마시 블루 염색된 겔은 재조합 융합 분자의 성공적인 생성을 나타낸다. 도 2b 및 도 2c: ELISA 및 웨스턴 블롯(WB) 오버레이(overlay) 검정에 의한 유리 ABP 및 BBB-Fc-ABP 융합 단백질의 Aβ-올리고머 결합. 유리 ABP 또는 융합된 ABP를 ELISA 플레이트 상에 고정화하고, Aβ에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10 또는 4G8로 검출하였다. 융합 분자를 또한 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 종이에 옮기고, Aβ에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 상기에서와 같이 특이적 항체로 검출하였다. 결과는 ABP가 BBB 운반체와의 융합 후에 그의 Aβ 올리고머 결합 능력을 보유하였음을 나타낸다. Mo: Aβ 단량체; Oli: Aβ 올리고머
도 3: AD-Tg 마우스(B6.Cg-Tg, Jackson Lab)에서의 아밀로이드 침착물에 대한 FC5-Fc-ABP의 결합의 면역조직형광 검정을 나타낸다. ABP는 면역조직형광 검정에 의해 밝혀진 바와 같이 AD-Tg 마우스 뇌에서 천연 생성된 Aβ 응집체에 결합하는 능력을 보유한다. 야생형 및 AD-유전자도입 마우스로부터의 뇌 절편을 IR 800-표지 FC5-mFc-ABP와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 형광 현미경 하에서 시각화하였다. Aβ침착물을 생성하는 AD-Tg 마우스로부터의 뇌 절편에서는 선택적 결합(밝은 스폿)이 관찰되었으며, 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 그렇지 않았다.
도 4: FC5의 BBB 투과성이 시험관내에서 ABP와의 융합 후에 보유됨을 나타낸다. FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽-횡단을 래트 및 인간으로부터의 시험관내 BBB 모델에서 평가하였다. BBB를 횡단하는 융합 분자가 nanoLC-MRM 방법(도 4a, 도 4b 및 도 4c)에 의해 그리고 Fc-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석(도 4d, 3회 반복하여 수행됨)에 의해 검출되었다. FC5-mFc-ABP는 FC5-mFc만큼이나 효과적으로 BBB를 횡단한 반면, BBB 운반체 모이어티(moiety) FC5를 함유하지 않은 Fc-ABP는 뇌 내피 세포 단층을 가로질러 횡단하지 않았다. 예상된 바와 같이, 대조군 단일 도메인 항체 EG2 및 A20.1, 또는 대조군 완전 IgG(항-HEL)는 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았다. 인간화 FC5-H3-hFc-ABP 융합 단백질에 대해서도 유사한 결과가 획득되었다(도 4c 및 도 4d).
도 5: 생체내에서의 FC5-Fc-ABP의 혈청 및 CSF 약동학적 특성을 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 지시된 용량(2.5, 6.25, 12.5, 및 25 mg/kg)으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트 내로 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 12시간과 24시간 사이에서 Cmax를 가지면서 CSF 중에 출현하였는데, 이는 생체내에서의 뇌 및 CSF 구획 내로의 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타낸다. 혈청 PK 파라미터(도 5 및 표 1)는 FC5-mFc-ABP의 알파- 및 베타-반감기가 완전 IgG(래트 Fc를 함유하는 벤치마크 항체)의 것과 유사함을 나타낸다.
도 6: 비글개(beagle dog)에서의 FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사에 의해 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, nanoLC-MRM에 의해(도 6의 6A) 그리고 Fc-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해(도 6의 6B) 분석하였다. 별표는 혈액-오염된 샘플을 나타낸다(MRM 분석에는 나타나 있지 않음). 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였는데, 이는 생체내에서 개 혈액-뇌 장벽을 가로질러 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타내는 것이다. WinNonlin 소프트웨어에 의해 PK 파라미터 및 CSF 노출을 분석하였으며, 이는 하기 표 2에 나타나 있다.
도 7: 생체내에서의 인간 Fc(hFc)와 융합되고 ABP에 화학적으로 연결된 FC5(FC5-hFc-ABP)의 BBB 투과성 및 CSF 출현(래트 모델)을 나타낸다. 제조자의 사용설명서(ThermoFisher Scientific)에 따라 이종이작용성 크로스-링커(heterobifunctional cross-linker) 설포-SMCC(설포석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 사이클로헥산-1-카르복실레이트)를 사용하여 FC5-hFc를 ABP-시스타미드와 연결하였다. 화학적으로 접합된 분자를 6.25 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 정맥내 투여하고, 혈청 및 CSF 샘플을 4시간째 및 24시간째에 수집하고, nanoLC-MRM에 의해 분석하였다. FC5-hFc-ABP는 BBB 운반체를 갖지 않는 Fc-ABP와 대조적으로 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현한다. 이러한 화학적으로 연결된 작제물에서는, ABP의 C-말단이 Fc 단편(랜덤 영역)에 연결되어 있고, N-말단은 자유로운 반면, 이와 달리 융합 작제물에서는, ABP의 N-말단이 Fc의 C-말단에 융합되어 있고, ABP의 C-말단은 자유롭다는 것에 유의해야 한다. ABP의 배향에서의 이러한 역전은 그의 Aβ-결합 능력에 그리고 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 데 영향을 주지 않았다.
도 8: 마우스에서의 정맥내 주사 후에 다양한 뇌 영역(피질 및 해마)에서 측정된 FC5-mFc-ABP의 수준을 나타낸다. 15 mg/kg 용량의 FC5-mFc-ABP를 야생형(WT) 또는 AD-유전자도입(AD-Tg, B6.Cg-Tg, Jackson Lab) 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하고, 심장내 식염수 관류 후 4시간째 및 24시간째에 뇌를 수집하였다. 해마 및 피질 조직을 절개하고, nanoLC-MRM(도 8a)에 의해 그리고 Fc-특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯(도 8b)에 의해 분석하였다. 융합 분자의 3가지 모든 성분(BBB, 이 예에서는 FC5, Fc 및 ABP)에 속하는 특정 펩티드는 MRM에 의해 피질 및 해마 둘 모두에서 검출되었으며, 이는 FC5 운반체가 ABP를 뇌의 표적 영역에 성공적으로 전달하였음을 나타낸다. 측정된 수준은, Fc에 융합된 대조군 단일-도메인 항체 A20.1, 또는 단독으로의 Fc 단편의 경우에 통상적으로 약 50 ng/g 조직으로 측정된 것에 비하여, 상이한 시점에서 750 내지 1400 ng/g 뇌 조직의 범위였다. 이것은 조직 추출물 내의 Fc 및 ABP에 대해 프로빙하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다(도 8b). 단지 식염수만을 제공받은 동물에서는 웨스턴 블롯에 의해 융합 분자의 어떠한 단백질 신호도 검출되지 않았다. 뇌의 표적 영역에서 웨스턴 블롯에 의해 검출된 FC5-mFc-ABP 수준에 있어서 용량-의존적 증가가 있었다.
도 9: 유전자도입(Tg) 마우스에서의 Aβ 수준에 대한 ABP의 효과를 나타낸다: 단독으로의 ABP(도 9a) 또는 BBB 운반체 FC5와 융합된 ABP에 의한 처리(도 9b 및 도 9c) 사이의 비교. 2개의 상이한 AD Tg 마우스 모델, 즉 삼중 유전자도입(3X Tg-AD, 즉 PS1M146V, APPSwe 및 tauP301L 도입유전자를 포함하는 sv129/ C57BL6 마우스, 캘리포니아 대학(University of California)의 Dr. F.M. LaFerla) 및 이중 유전자도입(B6.Cg-Tg, 즉 PSEN1dE9 및 APPSwe 도입유전자를 포함함, Jackson Lab)을 사용하였으며; 마우스에 각각 3개월 또는 2개월의 기간에 걸쳐 격일로 300 nmol/kg의 유리 ABP를 피하(sc) 투여하였다. 처리 기간의 종료 시점에서, 뇌 내의 Aβ수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 단독으로의 ABP에 의한 처리는 2 내지 3개월의 다회 처리(격일로) 후에 뇌 Aβ의 25 내지 50% 감소를 가져왔다(도 9a). FC5-mFc-ABP 작제물을 이중 유전자도입 AD 마우스(B6.Cg-Tg, 15 mg/kg; 220 nmol/kg과 등가임) 내로 정맥내 주사하고; 주사 후 24시간째에 ELISA 및 nanoLC-MRM 둘 모두에 의해 뇌 Aβ 수준을 측정하였다. 예기치 않게도, FC5-mFc-ABP에 의한 처리 후 24시간 이내에 약 50% 아밀로이드 감소가 관찰되었으며(도 9b), 이는, Fc에 적합하게 연결된 FC5에 의한 ABP의 효율적인 뇌 전달이 뇌 Aβ 수준을 감소시키는 데 있어서의 ABP의 효능을 대폭 증가시켰음을 나타낸다. CSF 분석은 또한 FC5-mFc-ABP 처리 후 24시간 이내에 Aβ1-42 수준의 유의한 감소를 나타내었다(도 9c). MRM 또는 ELISA 분석에 의해 검출된 Aβ의 시그너처 펩티드 또는 에피토프는 ABP에 의해 인식되는 Aβ 에피토프로부터 멀리 있고/그와 상이하다(따라서, 그의 정량화가 ELISA 또는 MRM에 의해 방해되지 않음).
도 10: FC5-ABP(즉, Fc 성분을 갖지 않음)에 비하여 FC5-Fc-ABP 작제물의 향상된 혈청 반감기의 예를 나타낸다: FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP를 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 주사하고, 일련의 혈청 샘플을 다양한 시점에서 수집하고, FC5-특이적 항체를 사용하여 직접 ELISA에 의해 분석하였다. 도 10a에서 알 수 있는 바와 같이, FC5-ABP 작제물은 FC5-Fc-ABP(도 10b)에 비하여 혈청 중에서 신속하게 제거되었는데(1시간 미만), 이는 Fc 단편을 포함하는 분자의 혈청 안정성의 실질적인 증가를 나타낸다.
도 11: Tg 래트에서의 뇌 아밀로이드 부하에 대한 FC5-mFc-ABP의 효과를 나타낸다: AD-Tg 래트에 4주의 기간에 걸쳐 매주마다 꼬리 정맥을 통해 식염수 또는 FC5-mFc-ABP를 투여하였다(30 mg/kg의 로딩 용량 및 15 mg/kg의 후속 4회의 매주 용량). FC5-mFc-ABP 및 Aβ의 CSF 수준을 nanoLC MRM에 의해 분석하였다(도 11a 및 도 11b). 4주의 처리 전과 후에, 특정 Aβ-결합제[18F] NAV4694를 사용하여 PET 스캔에 의해 뇌 Aβ 수준을 결정하였다. 트레이서 주사 후에, 60분 동적 이미지를 획득하고, 투과 스캔을 획득하고, 이미지를 재구성하고, 결합능(BPND) 모수 지도(parametric map)를 생성하였다. FC5-mFc-ABP는 24시간 이내에 래트 내의 CSF Aβ 수준을 감소시켰다(도 11a 및 도 11b). Tg 래트에서와 같이 FC5-mFc-ABP와 Aβ의 CSF 수준 사이의 반비례 관계가 관찰되었으며, 이는 FC5에 의해 뇌 및 CSF에 전달된 ABP에 의한 표적 교합 및 Aβ의 신속한 제거를 시사한다(도 11b). 이것은 PET 스캔에 의해 추가로 확증되었는데, PET 스캔은 FC5-mFc-ABP에 의한 4주의 처리 후에 래트 뇌 Aβ 수준의 유의한 감소(30 내지 50%)를 명백히 나타내었다(도 11c).
도 12: 식염수 또는 FC5-mFc-ABP에 의한 처리 전과 후의 부피측정적 자기 공명 영상(MRI, 이는 FISP(Fast Imaging with Steady-state Precession, 항정 상태 세차운동을 이용한 고속 영상)을 사용함)을 나타낸다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 4주의 처리 후에 식염수-처리된 Tg 래트(Tg-Sal)에 비하여 ABP-처리된 Tg 래트(Tg-ABP)에서 증가된 해마 부피가 관찰되었다. 도 12b에 나타낸 바와 같이, 4주의 처리 후의 그룹 비교는 ABP-처리된 Tg 래트(Tg-ABP)가 식염수-처리된 Tg 래트(Tg-Sal)에 비하여 더 큰 전대상 피질(ACC) 연결성을 가졌음을 나타내었다.
도 13: Tg 마우스(도 9c) 및 Tg 래트(도 11a 및 도 11b)에서 관찰되는 바와 같이 비글개의 CSF에서의 FC5-mFc-ABP의 시간- 및 용량-의존적 출현 및 CSF Aβ 수준의 감소를 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 15 mg/kg 및 30 mg/kg으로 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사에 의해 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, FC5-mFc-ABP 및 Aβ 수준에 대하여 nanoLC-MRM에 의해 분석하였다. 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였다. 중요한 점은, Tg 마우스 및 Tg 래트에서 관찰되는 바와 같이, FC5-mFc2a-ABP 주사 후 24시간 이내에 CSF Aβ 수준의 유의한 감소가 있었다는 것인데, 이는 더 큰 동물에서의 FC5 운반체의 통과이동 성질 및 또한 CNS Aβ 부하를 감소시키는 데 있어서의 ABP의 이종간 효능을 시사한다.
도 14: 상이한 BBB 운반체를 갖는 ABP 융합 분자의 생성을 나타낸다. ABP 융합 분자의 다능성을 평가하기 위하여, ABP를 또 다른 인간화 BBB 운반체 IGF1R5(H2)와 성공적으로 융합시켰다. 나타낸 바와 같이, 이 분자의 이작용성, Aβ 올리고머에 결합하는 ABP의 능력(ELISA 및 오버레이 검정) 및 또한 시험관내 BBB 모델을 가로질러 ABP를 전달하는 IGF1R5의 능력(데이터는 나타나 있지 않음)이 보유되었다. 이는 ABP가 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체에 융합되어 뇌에 전달될 수 있음을 명백히 나타낸다.
도 15: 상이한 단일-도메인 항체-Fc-ABP 작제물에 의한 Aβ 올리고머 결합을 나타낸다(도 15a, 도 15b 및 도 15c). 이들 작제물 중 일부에서, ABP는 서열 번호로 나타낸 바와 같은 분자들의 부위-특이적 돌연변이 또는 C-말단 일부분의 제거에 의해 변형되었다. 모든 작제물은 ELISA 방법에 의해 Aβ올리고머를 결합시키는 데 있어서 유사한 잠재성을 보유하였다.
도 16: 안정성 및 바이오-제조성을 개선하기 위한 특이적 돌연변이를 갖는 FC5-hFc1X7-ABP의 생성을 나타낸다. 특이적 돌연변이(예컨대, 서열 번호 35 또는 서열 번호 36의 ABP)를 갖는 FC5-hFc1X7-ABP를 CHO 세포에서 생성하고, 환원성(R) 및 비환원성(NR) 조건 하에서 SDS-PGE 상에서 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였으며, 이는 도 2에 나타낸 바와 같다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, FC5-특이적 또는 hFc-특이적 또는 ABP-특이적 항체로 면역블로팅하였다. 또 다른 세트에서는, 융합 분자 내의 ABP의 Aβ-결합을 또한 오버레이 검정에 의해 시험하였다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10으로 검출하였다. 알 수 있는 바와 같이, 특이적 돌연변이에 의한 ABP의 체계적인 변형은 생성된 분자의 안정성을 실질적으로 향상시켰는데, 이는 환원성 및 비환원성 조건 하에서 단일 단백질 밴드에 의해 나타난 바와 같다.
도 17: 시험관내에서의 다양한 FC5-Fc-ABP 작제물 및 IGF1R5-Fc-ABP 작제물의 혈액-뇌 장벽 투과성을 나타낸다. 시험관내 래트 BBB 모델에서 BBB-횡단을 평가하였으며, 이는 도 4에 나타낸 바와 같으며, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 분자를 nanoLC-MRM 방법에 의해 검출하였다. 인간화 FC5 및 IGF1R 운반체에 융합된 모든 ABP 변이체는 혈액-뇌 장벽을 효과적으로 횡단하였다. 예상된 바와 같이, BBB 비투과성 sdAb인 A20.1은 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았으며, 마찬가지로, A20.1에 융합된 ABP는 BBB를 횡단하지 않았다(도 17a). 도 17b에는, 융합 분자의 3가지 모든 성분, 즉 FC5, Fc 및 ABP의 "지문" 펩티드가 nanoLC-MRM에 의해 검출되었으며, 그럼으로써 BBB를 가로지르는 온전한 FC5, Fc 및 ABP의 관통이동을 나타내었음이 나타나 있다.
도 18: 인간화 FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물(ABP, 서열 번호 35 및 서열 번호 36)이 FC5에 의해 시험관내 혈액-뇌 장벽을 온전하게 가로질러 수송됨을 나타낸다. 시험관내 래트 BBB 모델에서 혈액-뇌 장벽-횡단을 평가하였으며, 이는 도 4에 나타낸 바와 같으며, BBB를 횡단하는 분자가 웨스턴 블롯 및 ELISA 검정에 의해 검출되었다. 도 18의 1의 A 및 B는 각각 hFc- 및 ABP-특이적 항체에 의해 프로빙된 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다. 분자 크기는 시험관내 혈액-뇌 장벽 모델에 적용된 융합 분자의 분자 크기와 정확히 동일하다. 도 18의 1의 C는 샌드위치 ELISA를 나타내는데, 여기서는 BBB를 횡단한 후의 분자를 ELISA 플레이트 상에 FC5-특이적 항체에 의해 포획하고, ABP-특이적 항체에 의해 검출하였다. 이 샌드위치 ELISA는 FC5(H3)-hFc1X7-ABP가 시험관내에서 래트 혈액-뇌 장벽을 횡단한 후에 온전하게 유지되었음을 확인시켜 주었다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP, 서열 번호 36)에 대해서도 유사한 결과가 획득되었다: 도 18의 2의 A, B 및 C.
도 19: 인간화 FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물(ABP, 서열 번호 35 및 서열 번호 36)이 생체내 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송되고 FC5에 의해 뇌에 온전하게 전달됨을 나타낸다. FC5-ABP 융합 분자를 꼬리 정맥을 통해 야생형 및 AD-Tg 마우스 내로 정맥내 투여하고, 심장내 관류 후에 뇌를 수집하였으며, 이는 도 8에 나타낸 바와 같다. 뇌 피질을 균질화하고 RIPA 완충액 중에 추출하였으며, 추출물에 웨스턴 블롯 및 샌드위치 ELISA 분석을 실시하였으며, 이는 도 18에 나타낸 바와 같다. 도 19의 A는 ABP-특이적 항체에 의해 프로빙된 면역블롯을 나타낸다. 분자 크기는 동물 내로 주사된 융합 분자의 분자 크기와 정확히 동일하다. 도 19의 B는 동일한 추출물의 샌드위치 ELISA를 나타내는데, 여기서는 추출물 내의 분자를 ELISA 플레이트 상에 FC5-특이적 항체로 포획하고, ABP-특이적 항체로 검출하였다. 이는, FC5(H3)-hFc1X7-ABP가 생체내에서 BBB를 가로질러 수송되고 뇌에 온전하게 전달된 면역블롯 결과를 확인시켜 준다.
도 20: AD-Tg 마우스 뇌(B6.Cg-Tg, Jackson Lab) 내의 내인성 Aβ 침착물에 대한 FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP, 서열 번호 36)의 생체외 결합(도 20의 A) 및 생체내 결합(도 20의 B)의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. AD-유전자도입 마우스로부터의 뇌 절편을 FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP, 서열 번호 36)와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 HRP-접합된 FC5-특이적 항체로 시각화하였다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물에 대해서는 선택적 결합(흑색 스폿)이 관찰되었지만, ABP를 갖지 않는 FC5(H3)-hFc1X7에 대해서는 관찰되지 않았는데(도 20의 A), 이는 뇌에서의 Aβ 침착물의 ABP-의존적 결합(표적 교합)을 나타낸다. 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 결합이 관찰되지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음). AD 유전자도입 마우스 내로의 FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 해마내 주사 후에(주사 후 4시간째에) (ABP-특이적 항체를 사용하여) Aβ 침착물의 유사한 결합이 검출되었다(도 20의 B).
도 21: 생체내에서의 FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP, 서열 번호 32)에 의한 표적 교합을 나타낸다. 도 21의 A는 생체내에서의 AD 유전자도입 마우스에서의 천연 아밀로이드-β(Aβ) 침착물에 대한 Alexa 647-표지 FC5-hFc-ABP 작제물의 해마내 주사 후의 결합을 나타낸다. 뇌 절편을 Alexa 488이 표지된 Aβ-특이적 항체 6E10으로 프로빙하고 2개의 신호의 공동-국재화를 입증함으로써(합병) Aβ의 정체를 확인하였다. 도 21의 B는 ELISA에 의한 표적 교합의 입증을 나타낸다. FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 야생형 및 AD 유전자도입 마우스 내로의 해마내 주사 후에(주사 후 4시간째에), 해마체를 절개하고 균질화하였다. 포획 항체로서 FC5 항체를 그리고 검출 항체로서 ABP 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 FC5-ABP 융합 작제물을 검출하였다. 내인성 Aβ에 대한 ABP의 생체내 결합을, 검출 항체로서 Aβ-특이적 항체를 사용한 것을 제외하고는 동일한 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 도 21의 A 및 도 21의 B부터, FC5-ABP 작제물이 야생형 마우스 및 AD 유전자도입 마우스 둘 모두에서 주사후 4시간째에 온전하게 유지됨이 명백하다. 가장 중요한 것은, 인간 Aβ를 발현하는 Tg 마우스에서, 주사된 ABP가 Aβ에 결합하고, 복합체((FC5(H3)-hFc-ABP*Aβ)로서 아래로 끌어당긴다는 것인데, 이는 생체내에서의 ABP에 의한 Aβ표적 교합을 나타낸다.
도 22: 비인간화 FC5-Fc-ABP 작제물과 인간화 FC5-Fc-ABP 작제물 사이의 PK/PD 비교를 나타낸다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 5에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트 내로 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 혈청 및 CSF PK 프로파일은 비인간화 및 인간화 작제물에 대한 것과 매우 유사하였다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 9b에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 Tg 마우스 내로 정맥내 투여하였다. CSF 내의 FC5-Fc-ABP 및 Aβ 수준을 nanoLC-MRM에 의해 측정하였으며, 이는 도 9b에 나타낸 바와 같다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, CSF 내의 비인간화 및 인간화 FC5-Fc-ABP의 수준은 유사하였으며, 가장 중요한 것은, CSF Aβ 수준의 변화(감소)가 또한 매우 유사하다는 것이었는데, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물의 인간화가 융합 작제물의 PK 및 PD 프로파일에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
본 발명은 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 베타-아밀로이드(β-아밀로이드)에 결합하는 폴리펩티드를 제공한다. β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드(또는 단백질)는 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드1-42(Aβ1-42) 응집체에 선택적으로 결합할 수 있으며, 본 명세서에서 ABP 또는 ABP 변이체(또는 집합적으로 ABP)로 약기되고 지칭될 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편에 연결된 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직한 구현예에서, ABP 및 BBB를 포함하는 융합 단백질은 Fc 또는 이의 단편을 추가로 포함하며, 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부분을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP를 포함할 수 있으며, 여기서 L은 임의의 적합한 링커일 수 있다. 제공된 BBB-Fc-APB 또는 BBB-Fc-L-ABP 작제물은 단일쇄 폴리펩티드 또는 이량체 폴리펩티드일 수 있으며, BBB-Fc-ABP를 포함하는 단일쇄 폴리펩티드는 성분 Fc 영역을 통해 다량체(바람직하게는 이량체)를 형성할 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 BBB 및 ABP를 포함하는 화합물 및 알츠하이머병(AD)의 치료에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 ABP를 효율적으로 관통이동하고 ABP의 결합을 통해 Aβ의 제거를 제공할 수 있는 치료적 제형에 대한 필요성이 있다. 종래 기술에서, AD 발생에 관여된 Aβ1 -42 올리고머에 선택적으로 결합하는 40-아미노산 Aβ-결합 펩티드(ABP)가 확인되었다(WO 2006/133566). 이러한 Aβ-결합 펩티드는 시험관내에서 세포 단백질에 대한 Aβ 결합을 억제하고 Aβ1 -42-유도 세포 독성을 억제한다(문헌[Chakravarthy et al, 2013]). 이러한 Aβ-결합 펩티드는 AD 유전자도입 마우스 뇌 내의 아밀로이드 침착물에 결합할 뿐만 아니라, 시험관내에서 AD 환자로부터의 뇌 내의 아밀로이드 침착물에도 결합한다. 더 중요한 것은, 살아있는 AD 유전자도입 마우스 뇌 내로 직접 주사될 때(문헌[Chakravarthy et al, 2014]), ABP는 생체내에서 천연 아밀로이드 침착물을 표적화한다는 것이다. 따라서, ABP는 잠재적으로 CNS Aβ를 표적화할 수 있고, 뇌로부터의 Aβ의 제거를 도울 수 있고, Aβ의 독성 효과를 감소시킬 수 있다는 것이다. 그러나, 전신 투여된 ABP는 그 자체만으로 BBB를 횡단하여 뇌 실질에 접근하는 능력이 제한되어 있다.
따라서, ABP는 Aβ에 결합하여 뇌로부터 Aβ를 제거하기 위하여 직접 적용될 때 Aβ 침착물에 결합하는 것으로 밝혀져 있기는 하지만, 비경구 투여된 ABP는 혈액-뇌 장벽을 투과할 필요성이 있다. 본 발명은 유리하게는 Fc 단편을 통해 BBB-투과성 단일-도메인 항체, 예컨대 FC5 또는 IGF1R에 융합된 ABP를 제공하여, 이중특이성 혈액-뇌 장벽-투과성 치료제를 제공한다(문헌[Farrington et al, 2014]). 본 발명의 BBB-Fc-ABP 작제물은 이량체화될 수 있으며, 즉 BBB-Fc-ABP 단일쇄 융합 단백질은 2개의 단일쇄 융합 단백질의 이량체를 형성하여 이량체 화합물(여기서, 이량체의 각각의 단일쇄는 BBB, Fc 단편 및 ABP를 포함함)을 생성하여 BBB-Fc-ABP 이량체를 제공할 수 있다. BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP 작제물 및 이들의 이량체는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 ABP의 효율적인 관통이동을 가능하게 한다. 따라서, CSF 및 뇌 실질에서의 ABP의 결합을 통한 Aβ의 유리한 치료적 제거가 본 발명의 작제물 및 방법에서 제공된다.
ABP의 뇌 전달을 가능하게 하고 그의 효능을 개선하기 위하여, 40-아미노산 ABP 폴리펩티드는 현재 Fc 단편의 C-말단에 융합되는 반면, BBB-투과성 단일-도메인 항체, 예컨대 FC5(WO 2002/057445)는 동일한 Fc 단편의 N-말단에 융합되어 이중특이성 BBB-투과성 치료제를 생성한다(문헌[Farrington et al, 2014]). 본 발명의 비제한적인 구현예에서, Fc 단편은 마우스(서열 번호 39) 또는 인간(서열 번호 40; 서열 번호 41)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 Fc 단편은 이펙터 기능을 감소시키도록 조작되었다(문헌[Shields et al., 2001]). 예를 들어, Fc 단편은 hFc1x7(서열 번호 40)일 수 있으며, BBB-Fc-ABP 융합 단백질 내의 Fc 단편은 유리하게는 융합 단백질의 이량체화를 가능하게 하여, 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 치료적으로 효과적인 융합 분자(BBB-Fc-ABP 이량체)를 생성한다. 일 구현예에서, BBB-Fc-ABP 융합 단백질은
Figure pct00025
(서열 번호 47) 및 이의 이량체일 수 있다. 융합 단백질은 서열 번호 47 또는 서열 번호 53 내에 구체화된 바와 같은 링커 서열 L, 또는 임의의 적합한 링커 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 베타-아밀로이드(β-아밀로이드)에 결합하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 하기 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00026
(여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 G 또는 V이고, X3은 G 또는 A이고, X4는 G 또는 A이고, X5는 G 또는 V이고, X6은 G 또는 V이고, X7은 G 또는 V이고, X8은 G 또는 A이고, X9는 G 또는 A임).
본 발명의 폴리펩티드(ABP 및 ABP 변이체)는 서열 번호 27 내지 서열 번호 38 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제공된 폴리펩티드는 서열 번호 31과 실질적으로 동등한 서열을 포함하는 ABP 변이체이다. 이와 실질적으로 동등한 서열은 융합 분자에 동등한 안정성을 부여할 수 있다.
본 발명은 화합물, 즉 융합 단백질을 제공하며, 융합 단백질은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 관통이동하는 항체 또는 이의 단편 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명은 BBB, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드, 및 Fc를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 당업계에서 "면역글로불린"(Ig)으로도 지칭되는 용어 "항체"는 쌍을 이룬 폴리펩티드 중쇄와 폴리펩티드 경쇄로부터 작제된 단백질을 지칭하며; IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM을 비롯한 다양한 Ig 동종형(isotype)이 존재한다. 항체가 올바르게 접히는 경우, 각각의 사슬은 더 선형인 폴리펩티드 서열에 의해 결합된 다수의 별개의 구형 도메인으로 접힌다. 예를 들어, 면역글로불린 경쇄는 가변(VL) 및 불변(CL) 도메인으로 접히는 반면, 중쇄는 가변(VH) 및 3개의 불변(CH, CH2, CH3) 도메인으로 접힌다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL)의 상호작용은 항원 결합 영역(Fv)의 형성을 가져온다. 각각의 도메인은 당업자에게 익숙한 잘 확립된 구조를 갖는다.
경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 결합하는 것을 담당하며, 이에 따라 항체들 사이의 유의한 서열 다양성을 나타낸다. 불변 영역은 더 적은 서열 다양성을 나타내며, 다수의 천연 단백질에 결합하여 중요한 생화학적 사건을 유발하는 것을 담당한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원-결합 결정인자를 함유하며, 이에 따라 표적 항원에 대한 항체의 특이성을 결정한다. 서열 가변성의 대부분은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 각각당 3개씩 해서 6개의 초가변 영역에서 발생하며; 이들 초가변 영역은 조합하여 항원-결합 부위를 형성하고, 항원 결정인자의 결합 및 인식에 기여한다. 항원에 대한 항체의 특이성 및 친화도는 초가변 영역의 구조뿐만 아니라, 이들의 크기, 형상, 및 이들이 항원에 제시하는 표면의 화학에 의해 결정된다. 초가변성의 영역의 확인을 위한 다양한 체계(scheme)가 존재하며, 가장 일반적인 2가지는 카바트(Kabat)의 것과 초티아 및 레스크(Chothia and Lesk)의 것이다. 문헌[Kabat et al (1991)]은 VH 및 VL 도메인의 항원-결합 영역에서의 서열 가변성에 기초하여 "상보성-결정 영역"(CDR)을 정의한다. 문헌[Chothia and Lesk (1987)]은 VH 및 VL 도메인에서의 구조적 루프 영역의 위치에 기초하여 "초가변 루프"(H 또는 L)를 정의한다. 이들 개별 체계는 인접하거나 중첩하는 CDR 및 초가변 루프 영역을 정의하고, 항체 분야의 당업자는 종종 용어 "CDR"과 "초가변 루프"를 상호교환 가능하게 이용하며, 이들은 본 명세서에서 그렇게 사용될 수 있다. 본 명세서에서는 CDR/루프가 카바트 체계에 따라 확인된다.
본 명세서에서 지칭되는 바와 같이, "항체 단편"은 당업계에 알려진 임의의 적합한 항원-결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 천연-발생 항체 단편일 수 있거나, 천연-발생 항체의 조작에 의해 또는 재조합 방법을 사용함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fv, 단일쇄 Fv(scFv; 펩티드 링커와 연결된 VL 및 VH로 이루어진 분자), Fab, F(ab')2, 단일-도메인 항체(sdAb; 단일 VL 또는 VH로 구성된 단편), 및 이들 중 임의의 것의 다가 제시물을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 항체 단편, 예컨대 방금 기재된 것들은 링커 서열, 이황화물 결합, 또는 단편의 상이한 일부분들을 연결시키는 기타 다른 유형의 공유 결합을 필요로 할 수 있으며; 당업자는 상이한 유형의 단편 및 이들의 작제를 위한 다양한 접근법 및 다양한 접근법의 요건에 익숙할 것이다.
비제한적인 예에서, 항체 단편은 천연-발생 공급원으로부터 유래된 sdAb일 수 있다. 낙타류 기원의 중쇄 항체(문헌[Hamers-Casterman et al., 1993])는 경쇄가 결여되어 있으며, 이에 따라 이들의 항원 결합 부위는 VHH로 칭해지는 하나의 도메인으로 이루어진다. sdAb는 또한 상어에서 관찰되고 있으며, VNAR로 칭해진다(문헌[Nuttall et al., 2003]). 기타 다른 sdAb는 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 서열에 기초하여 조작될 수 있다(문헌[Jespers et al., 2004]; 문헌[To et al., 2005]). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "sdAb"는 파지 디스플레이 또는 기타 다른 기술을 통해 임의의 기원의 VH, VHH, VL, 또는 VNAR 저장소로부터 직접 단리된 sdAb, 상기 언급된 sdAb로부터 유래된 sdAb, 재조합적으로 생성된 dAb뿐만 아니라, 그러한 sdAb를 인간화, 친화성 성숙, 안정화, 가용화, 낙타화, 또는 항체 조작의 기타 다른 방법에 의해 추가로 변형시킴으로써 생성된 sdAb를 포함한다. 또한, sdAb의 항원-결합 기능 및 특이성을 보유하는 호모로그, 유도체, 또는 단편이 본 발명에 의해 포괄된다.
sdAb는 항체 분자에 대한 바람직한 특성, 예컨대 높은 열안정성, 높은 표면활성제(detergent) 저항성, 프로테아제에 대한 비교적 높은 저항성(문헌[Dumoulin et al., 2002]) 및 높은 생산 수율(문헌[Arbabi-Ghahroudi et al., 1997])을 가지며; 이들은 또한 면역 라이브러리로부터의 단리에 의해(문헌[Li et al., 2009]) 또는 시험관내 친화성 성숙에 의해(문헌[Davies & Riechmann, 1996]) 매우 높은 친화도를 갖도록 조작될 수 있다. 안정성을 증가시키기 위한 추가의 변형, 예컨대 비표준 이황화물 결합의 도입(문헌[Hussack et al., 2011a,b]; 문헌[Kim et al., 2012])이 또한 sdAb에 제공될 수 있다.
당업자는 단일-도메인 항체의 구조(예를 들어, 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 내의 3DWT, 2P42 참조)를 잘 숙지하고 있을 것이다. sdAb는 면역글로불린 접힘부를 보유하는 단일 면역글로불린 도메인을 포함하며; 가장 주목할 만한 점은, 단지 3개의 CDR/초가변 루프만이 항원-결합 부위를 형성한다는 것이다. 그러나, 그리고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 모든 CDR이 항원에 결합할 것이 요구되지는 않을 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한적이고자 함이 없이, CDR 중 1개, 2개, 또는 3개가 본 발명의 sdAb에 의한 항원의 결합 및 인식에 기여할 수 있다. 본 명세서에서 sdAb 또는 가변 도메인의 CDR은 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있다. 뇌는 혈액-뇌 장벽(BBB)으로 알려진 특수화된 내피 조직에 의해 신체의 나머지로부터 분리된다. BBB의 내피 세포들은 밀착 연접에 의해 연결되어 있어서 많은 치료적 화합물이 뇌에 들어가는 것을 효율적으로 방해한다. 낮은 속도의 소포 수송에 더하여, BBB의 한 가지 특별한 특징은 효소 장벽(들)의 존재 및 BBB의 내강으로부터 떨어진 (뇌) 측에서의 ATP-의존적 수송체(P-당단백질을 포함함)의 고수준의 발현인데(문헌[Gottesman and Pastani, 1993]; 문헌[Watanabe, 1995]), 이때 상기 ATP-의존적 수송체는 다양한 분자를 뇌로부터 혈류 내로 능동적으로 수송한다(문헌[Samuels, 1993]). 단지 작고(500 달톤 미만) 소수성인(문헌[Pardridge, 1995]) 분자만이 BBB를 더 용이하게 횡단할 수 있다. 따라서, 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 표면 수용체에 특이적으로 결합하고, 뇌 내피 세포 내로 내재화되고, 리포좀 분해를 피함으로써 혈액-뇌 장벽을 가로질러 트랜스사이토시스를 거치는 능력은 신경학적 분야에서 유용하다. 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편은 기타 다른 분자, 예컨대 치료제를 뇌 조직에 전달하기 위하여 이를 운반하는 데 사용될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통수송하는 것으로 당업계에 알려진 임의의 적합한 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명은 화합물 또는 융합 단백질을 제공하며, 이것은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 단편은, 예를 들어, WO 2007/036021에 기재된 바와 같이 막관통 단백질 30A(TMEM30A)에, 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R) 에피토프, 또는 이의 이소형, 변이체, 일부분, 또는 단편에 결합할 수 있다.
본 발명의 화합물 내의 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함할 수 있다:
Figure pct00027
(서열 번호 1)의 상보성 결정 영역(CDR) 1의 서열;
Figure pct00028
(서열 번호 2)의 CDR2 서열; 및
Figure pct00029
(서열 번호 3)의 CDR3 서열; 또는
Figure pct00030
(서열 번호 4)의 CDR1 서열,
Figure pct00031
(서열 번호 5)의 CDR2 서열,
Figure pct00032
(서열 번호 6)의 CDR3 서열; 또는
Figure pct00033
(서열 번호 7)의 CDR1 서열,
Figure pct00034
(서열 번호 8)의 CDR2 서열,
Figure pct00035
(서열 번호 9)의 CDR3 서열; 또는
Figure pct00036
(서열 번호 10)의 CDR1 서열,
Figure pct00037
(여기서, X는 A 또는 T임)(서열 번호 11)의 CDR2 서열,
Figure pct00038
(서열 번호 12)의 CDR3 서열.
앞서 언급된 바와 같이, 항체 또는 이의 단편은 낙타류 기원의 또는 낙타류 VHH로부터 유래된 sdAb일 수 있으며, 이에 따라 낙타류 프레임워크 영역을 기반으로 할 수 있으며; 대안적으로, 상기 기재된 CDR은 VNAR, VHH, VH 또는 VL 프레임워크 영역 상에 그래프팅될 수 있다. 또 다른 대안에서, 상기 기재된 초가변 루프는 임의의 공급원(예를 들어, 마우스 또는 인간)의 기타 다른 유형의 항체 단편(Fv, scFv, Fab)의 프레임워크 영역 상에 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 성질의 단백질 상에 그래프팅될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nicaise et al, 2004] 참조).
본 발명은 키메라(또는 키메라화된), 베니어링된(veneered), 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 추가로 포괄한다. 키메라 항체 또는 이의 단편은 (마우스 또는 낙타류 기원의) 천연 가변 도메인이 인간 불변 도메인(들)에 연결된 작제물이다(문헌[Gonzales et al 2005] 참조). 항체의 베니어링 또는 재표면화는 천연 항체 또는 이의 단편의 프레임워크 영역 내의 노출된 잔기를 이들의 인간 대응물 내의 아미노산 잔기로 대체하는 것을 수반한다(문헌[Padlan, 1991]; 문헌[Gonzales et al 2005]). 항체 또는 항체 단편의 인간화는 항원-결합 능력 또는 특이성의 손실 없이 서열 내의 아미노산을, 인간 컨센서스 서열에서 발견되는 바와 같은 그의 인간 대응물로 대체하는 것을 포함하며; 이러한 접근법은 인간 대상체 내로 도입되는 경우 항체 또는 이의 단편의 면역원성을 감소시킨다. 이러한 프로세스에서는, 본 명세서에 정의된 CDR 중 하나 또는 하나 초과의 CDR이 인간 가변 영역(VH 또는 VL)에, 기타 다른 인간 항체(IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM)에, 인간 항체 단편 프레임워크 영역(Fv, scFv, Fab)에, 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 성질의 인간 단백질에 융합되거나 그래프팅될 수 있다(문헌[Nicaise et al., 2004]). 그러한 경우에, 상기 하나 또는 하나 초과의 초가변 루프의 입체구조는 보존될 가능성이 높으며, 표적(즉, 뇌 내피 세포 상의 에피토프, 예컨대 TMEM30A 또는 IGF1R 에피토프)에 대한 sdAb의 친화도 및 특이성은 최소한의 영향을 받을 가능성이 높다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 결합 및 특이성을 보유하기 위하여 특정의 천연 아미노산 잔기를 인간 프레임워크 내로 도입하는 것이 필요할 수 있다. CDR 그래프팅에 의한 인간화는 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, 문헌[Tsurushita et al, 2005]; 문헌[Jones et al, 1986]; 문헌[Tempest et al, 1991]; 문헌[Riechmann et al, 1988]; [Queen et al, 1989]을 참조하며; 문헌[Gonzales et al, 2005]에 검토되어 있으며, 또한 그 안에 인용된 참고문헌을 참조할 것), 이에 따라 당업자는 그러한 인간화 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법에 충분히 익숙할 것이다.
제공된 항체 또는 이의 단편은 FC5 항체(WO 2002/057445에 기재됨) 또는 IGF1R 항체의 인간화 버전일 수 있다. FC5(서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17 중 어느 하나의 서열을 포함함), 및 IGF1R(서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 또는 서열 번호 26 중 어느 하나의 서열을 포함함)은 뇌 내피 세포 상의 수용체 에피토프의 표면에 결합하고 후속으로 혈액-뇌 장벽(BBB)을 관통이동한다. FC5는 또한 BBB를 가로지르는 다양한 크기의 안내자 분자에 대한 운반체로서 작용하는 것으로 나타났다(예를 들어, WO 2011/127580 참조). FC5 관통이동을 매개하는 항원은 막관통 도메인 단백질30A(TMEM30A; WO 2007/036021)로서 실험적으로 확인되었는데, 이는 뇌 내피 세포의 표면 상에 풍부화되어 있다.
예를 들어, 그리고 제한적이고자 함이 없이, 항체 또는 이의 단편은 하기 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00039
(여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 A 또는 E이고, X3은 F 또는 V이고, X4는 E 또는 G이고, X5는 R 또는 L이고, X6은 F 또는 W이고, X7은 L 또는 V임), 또는 이와 실질적으로 동일한 서열;
Figure pct00040
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 A이고; X6은 F 또는 V이고; X7은 E 또는 G이고; X8은 R 또는 L이고; X9는 F 또는 W이고; X10은 A 또는 S이고; X11은 M 또는 I이고; X12는 A 또는 S이고; X13은 V 또는 L이고; X14는 D 또는 Y이고; X15는 V 또는 L이고; X16은 K 또는 R이고; X17은 Q 또는 L임); 또는 이와 실질적으로 동일한 서열;
Figure pct00041
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이고; X6은 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이고; X8은 G 또는 E이고; X9는 L 또는 R이고; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이고; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이고; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이고; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임); 또는 이와 실질적으로 동일한 서열;
Figure pct00042
(여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 S이고; X6은 D 또는 G이고; X7은 L 또는 R이고; X8은 F 또는 W이고; X9는 A 또는 S이고; X10은 A 또는 T이고; X11은 A 또는 S이고; X12는 G 또는 N이고; X13은 M 또는 L이고; X14는 N 또는 R이고; X15는 E 또는 R이고; X16은 P 또는 A이고; X17은 S 또는 Y이고; X18은 Q 또는 L임); 또는 이와 실질적으로 동일한 서열.
더 구체적으로, 그리고 어떠한 방식으로도 제한적이고자 함이 없이, 항체 또는 이의 단편은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00043
Figure pct00044
이와 실질적으로 동일한 서열. 항체 또는 이의 단편은 단일-도메인 항체일 수 있다.
실질적으로 동일한 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이는 참조 서열과 대비하여 생리학적, 화학적, 물리화학적 또는 기능적 특성의 실질적인 변화 없이 돌연변이 펩티드를 생성할 수 있음이 당업계에 알려져 있으며; 그러한 경우에, 참조 서열과 돌연변이 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주될 것이다. 본 명세서에서 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성(예를 들어, 크기, 전하, 또는 극성)을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로의 치환으로서 정의된다. 이들 보존적 아미노산 돌연변이는 상기에 열거된 CDR 서열 및 항체 또는 단편의 CDR의 전체 구조를 유지하면서 sdAb의 프레임워크 영역에 대해 이루어질 수 있으며; 이에 따라 항체의 특이성 및 결합은 유지된다.
실질적으로 동등한 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있으며; 여기서, 돌연변이 펩티드는 펩티드 안정성 및 바이오-제조성에 대해 실질적으로 동등하다. '실질적으로 동등한'이란 융합 분자 안정성, 예를 들어 SDS PAGE(환원성 조건 및 비환원성 조건)에서 알 수 있는 바와 같이 분해 생성물의 부재 또는 저분자량 밴드에 대해 동등함을 지칭할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이는 참조 서열과 대비하여 생리학적, 화학적, 물리화학적 또는 기능적 특성의 실질적인 변화 없이 돌연변이 펩티드를 생성할 수 있음이 당업계에 알려져 있으며; 그러한 경우에, 참조 서열과 돌연변이 서열은 "실질적으로 동등한" 폴리펩티드로 간주될 것이다.
비제한적인 예에서, 보존적 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있다. 그러한 보존적 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성, 또는 산성 아미노산을 동일한 기의 또 다른 것으로 치환할 수 있다. 용어 "염기성 아미노산"은 7 초과의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미하며, 이는 통상적으로 생리학적 pH에서 양으로 하전된다. 염기성 아미노산은 히스티딘(His 또는 H), 아르기닌(Arg 또는 R), 및 라이신(Lys 또는 K)을 포함한다. 용어 "중성 아미노산"(또한 "극성 아미노산")은, 생리학적 pH에서는 하전되지 않지만, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유되는 전자들의 쌍이 원자들 중 하나에 의해 더 근접하게 유지되는 적어도 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 극성 아미노산은 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 시스테인(Cys 또는 C), 티로신(Tyr 또는 Y), 아스파라긴(Asn 또는 N), 및 글루타민(Gln 또는 Q)을 포함한다. 용어 "소수성 아미노산"(또한 "비극성 아미노산")은 문헌[Eisenberg (1984)]의 정규화된 컨센서스 소수성 스케일에 따라 0 초과의 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것으로 의미된다. 소수성 아미노산은 프롤린(Pro 또는 P), 이소류신(Ile 또는 I), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 트립토판(Trp 또는 W), 메티오닌(Met 또는 M), 알라닌(Ala 또는 A), 및 글리신(Gly 또는 G)을 포함한다. "산성 아미노산"은 7 미만의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 지칭하며, 이는 통상적으로 생리학적 pH에서 음으로 하전된다. 산성 아미노산은 글루타메이트(Glu 또는 E), 및 아스파르테이트(Asp 또는 D)를 포함한다.
서열 동일성은 2개의 서열의 유사성을 평가하는 데 사용되는데; 이는 2개의 서열을 잔기 위치들 사이의 최대 일치도에 대해 정렬한 경우 동일한 잔기의 퍼센트를 계산함으로써 측정된다. 임의의 알려진 방법이 서열 동일성을 계산하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어가 서열 동일성을 계산하는 데 이용 가능하다. 제한적이고자 함이 없이, 서열 동일성은 소프트웨어, 예컨대 NCBI BLAST2 서비스(SIB(Swiss Institute of Bioinformatics, 스위스 생명정보학 연구소)에 의해 유지됨; 및 ca.expasy.org/tools/blast/에서 찾아지는 바와 같음), BLAST-P, Blast-N, 또는 FASTA-N, 또는 당업계에 알려진 임의의 기타 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 동일한 서열은 적어도 90% 동일할 수 있으며; 또 다른 예에서, 실질적으로 동일한 서열은 본 명세서에 기재된 서열에 대한 아미노산 수준에서, 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%, 또는 이들 사이의 임의의 백분율로 동일할 수 있다. 중요한 점은, 실질적으로 동일한 서열은 참조 서열의 활성 및 특이성을 보유한다는 것이다. 비제한적인 구현예에서, 서열 동일성의 차이는 보존적 아미노산 돌연변이(들)에 기인할 수 있다. 비제한적인 예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체의 서열과 적어도 95%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 화합물 내의 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인에 연결될 수 있으며, 예를 들어 인간 Fc 도메인을 들 수 있지만 이로 한정되지 않는다. Fc 도메인은 IgG, IgM을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 부류, 또는 IgG1, IgG2 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 하위부류로부터 선택될 수 있다. 이러한 접근법에서는, Fc 유전자가 sdAb 유전자와 함께 벡터 내로 삽입되어 sdAb-Fc 융합 단백질을 생성하며(문헌[Bell et al, 2010]; 문헌[Iqbal et al, 2010]); 융합 단백질은 재조합적으로 발현되고, 이어서 정제된다. 예를 들어, 그리고 어떠한 방식으로도 제한적이고자 함이 없이, 다가 디스플레이 포맷은 FC5-H3의 키메라 포맷 및 Fc 도메인에 연결된 이의 돌연변이 변이체를 포괄할 수 있다. 그러한 항체는 조작 및 생성이 용이하며, sdAb의 혈청 반감기를 대폭 연장할 수 있다(문헌[Bell et al., 2010]).
방금 기재된 바와 같은 화합물 내의 Fc 도메인은 당업계에 알려진 임의의 적합한 Fc 단편일 수 있다. Fc 단편은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있으며; 예를 들어, Fc는 마우스 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 기타 다른 바람직한 Fc 또는 Fc 단편의 구현예는 면역학적 이펙터 기능을 조절, 변경 또는 억제할 수 있다(문헌[Shields 2001]). 기타 다른 매우 바람직한 Fc 단편의 구현예는 뇌로부터의 융합 펩티드의 제거를 매개할 수 있다(문헌[Caram-Salas N 2011]). 구체적인 비제한적 예에서, Fc는 마우스 Fc2a 단편 또는 인간 Fc1 단편일 수 있다(문헌[Bell et al, 2010]; 문헌[Iqbal et al, 2010]). 구체적인 비제한적 예에서, 다량체화된 작제물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 단리된 또는 정제된 항체 또는 단편 및 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41의 서열의 Fc를 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 BBB-Fc-ABP 융합 단백질은 Fc를 통해 이량체를 형성하여 2가의 이작용성 BBB-Fc-ABP를 제공할 수 있다.
본 발명의 화합물은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 링커는 적합한 길이의, 중성 또는 친수성 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 비제한적인 예에서, 길이는 바람직하게는 12개 미만의 아미노산이며, 폴리펩티드는 GGGSGGGS이다. 기타 다른 화학적 링커가 사용될 수 있으며, 이는 올바른 배향으로 비펩티드 형태, 예컨대 아미드 또는 에스테르 결합을 사용한다. 예를 들어, 서열 번호 53은 임의의 적합한 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 본 발명의 임의의 융합 단백질, 즉 서열 번호 42 내지 52는 서열 번호 53에 예시된 바와 같이 임의의 적합한 링커를 포함할 수 있다. β-아밀로이드(Aβ)에 결합하는 폴리펩티드는 AD 병리에 관여하는 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드, 예컨대 Aβ1-42 응집체에 결합할 수 있으며; 폴리펩티드는 고친화도(nM 범위)로 Aβ에 결합하고, 시험관내에서 세포 단백질에 대한 Aβ 결합 및 Aβ1-42-유도 세포 독성을 억제할 수 있고, AD 유전자도입 마우스 뇌 내의 아밀로이드 침착물에 결합할 뿐만 아니라 시험관내에서 AD 환자로부터의 뇌 내의 아밀로이드 침착물에도 결합한다. 본 발명의 화합물 내의 폴리펩티드는 역 펩티드(reverse peptide) Aβ42-1에 결합하지 않는다.
본 명세서에 제공된 화합물에서, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 서열 번호 27; 서열 번호 28; 서열 번호 29; 서열 번호 30; 서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38; 및 이와 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. "실질적으로 동일한" 서열은 상기 기재된 바와 같다.
따라서, 본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드 및 이의 변이체(즉, ABP 및 ABP 변이체)를 제공한다. ABP 변이체는 서열 번호 31을 갖는 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 제공된 ABP 변이체는 서열 번호 31 내지 서열 번호 38 또는 이와 실질적으로 동등한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, ABP의 상세히 설명된 생물물리학적 특성화에 기초한 조직적이고 체계적인 특이적 변형을 포함하는 ABP 폴리펩티드 서열이 제공된다. ABP 폴리펩티드에 대해 특이적이고 체계적으로 유도된 변형은 서열 번호 31에 제공된 바와 같은, 본 발명의 신규하고 자명하지 않은 ABP 변이체를 포함한다.
본 명세서에 제공된 펩티드는 서열 번호 27 내지 서열 번호 38, 및 이와 실질적으로 동등한 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 서열을 포함하는 ABP를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 펩티드는 ABP 변이체, 예를 들어 서열 번호 32 내지 서열 번호 38 중 어느 하나, 또는 서열 번호 31과 동등한 임의의 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 서열을 포함하는 ABP를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 바와 같은, ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 작제물은 화합물 안정성 및 바이오-제조성에 있어서 유리한 개선을 나타낸다(도 14에서 알 수 있는 바와 같음).
본 명세서에 제공된 융합 단백질 및 화합물은 개선된 치료적 효능을 나타낸다. 더 구체적으로는, 제공된 화합물은 향상된 바이오-제조성(인간 포유류 발현 시스템에서의 생성)을 위하여 안정적인 BBB-Fc-ABP 융합 분자의 생성을 가능하게 하는 특이적으로 변형된 ABP를 포함한다. 본 명세서에 제공된 ABP에 대한 특이적 변형은 ABP의 상세히 설명된 생물물리학적 특성화에 기초한 조직적이고 체계적인 변형이었다. 본 명세서에 제공된 변형된 ABP는, 예를 들어 서열 번호 32 내지 서열 번호 38, 및 이와 실질적으로 동등한 서열, 예컨대 서열 번호 31로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 화합물은 유리하게도 개선된 안정성 및 바이오-제조성, 및 뇌 내의 Aβ 수준을 감소시키는 효능의 가장 유의한 증가를 나타내는데; 여기서는 본 발명의 작제물에 의한 처리 후 24시간 이내에 50% 아밀로이드 감소가 관찰되었다.
본 명세서에서 "접합된"으로도 지칭되는, 용어 "연결된"은 2개의 모이어티가 공유적으로 또는 비공유적으로(예를 들어, 흡착, 이온 상호작용) 직접 또는 (예를 들어, 링커를 통해) 간접적으로 결합됨을 의미한다. 공유 결합은 화학적 가교결합 반응을 통해, 또는 임의의 펩티드 발현 시스템, 예컨대 세균, 효모 또는 포유류 세포-기반 시스템과 조합하여 재조합 DNA 방법을 사용하여 융합을 통해 달성될 수 있다. 항체 또는 이의 단편을 Aβ에 결합하는 폴리펩티드 또는 Fc에 접합할 때, 적합한 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 링커는 BBB-Fc-ABP 단백질 융합체의 성분들의 접합을 가능하게 하는 적합한 길이의, 중성 또는 친수성 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 링커는 융합 단백질(예를 들어, 서열 번호 42 내지 52)의 성분들이 맞추어 연결될 수 있게 하고, 거기에서 강조처리된 GGGGSGGGGS 또는 (GGGS)n 링커로 한정되지 않고, 임의의 적합한 링커(즉, 서열 번호 53의 비제한된 융합 단백질에서와 같음)일 수 있다. 비제한적인 예에서, 길이는 바람직하게는 12개 미만의 아미노산이며, 폴리펩티드는 GGGSGGGS일 수 있다. 기타 다른 화학적 링커가 사용될 수 있으며, 이는 올바른 배향으로 비펩티드 형태, 예컨대 아미드 또는 에스테르 결합을 사용한다. 당업자는 링커, 또는 항체 또는 이의 단편을 폴리펩티드에 연결하는 방법을 잘 인식할 것이다. 항체 또는 이의 단편을 폴리펩티드 또는 Fc에 연결하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 명세서에 제공된 화합물은 항체 또는 이의 단편, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드, 및 Fc 단편을 포함하며, 이들은 연결되어 작제물(이는 본 명세서에서 화합물 또는 융합 분자로도 지칭됨)을 제공하며, 이때 작제물은 융합 단백질 및 이의 이량체를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 Fc 단편 또는 적합한 링커를 통해 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 서열 번호 14, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동한다. 항체 또는 단편은 sdAb일 수 있으며; 여기서, sdAb는 인간화될 수 있다.
β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 및 이와 실질적으로 동일한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 바람직하게는 서열 번호 31을 포함하는 서열을 포함한다.
Fc 단편은 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 및 이와 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함한다. 본 발명의 Fc 단편은 감쇠된 이펙터 기능을 갖는 임의의 적합한 Fc 단편일 수 있다. 융합 단백질 내에 제공된 Fc 단편은 이량체 구조의 형성을 가능하게 하며; 예를 들어, 서열 번호 42 내지 서열 번호 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단일쇄 융합 단백질은 그 안의 Fc 단편을 통해 접합된 이량체 구조를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물 또는 작제물은 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 이와 실질적으로 동일한 서열, 또는 이들의 이량체 구조로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 BBB-횡단 단일-도메인 항체(BBB), Fc 단편(Fc) 및 아밀로이드-결합 펩티드(ABP)를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 각각의 모이어티는 연결되어, 도 1에 예시된 바와 같은 융합 분자를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 비제한적인 구현예에서, BBB는 Fc의 N-말단에 연결될 수 있고, ABP는 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있다(도 1a). 도 1은 BBB-Fc-ABP를 포함하는 단일쇄 융합 단백질의 상응하는 이량체를 나타낸다. 도 1a, 도 1b, 도 1c, 및 도 1d에 예시된 바와 같이, 3가지 성분(즉, BBB, Fc, 및 ABP)이 다양한 구성으로 도시되어 있다. 본 발명의 화합물의 구체적인 비제한적 예에서, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 서열 번호 31의 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, ABP 변이체는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00045
(서열 번호 36)(본 명세서에서 ABP(6G)로 지칭됨) 및 이와 실질적으로 동등한 서열.
항체 또는 이의 단편은 하기 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00046
(본 명세서에서 FC5-H3으로 지칭됨).
항체 또는 이의 단편은 인간 Fc의 서열, 예컨대 하기 서열을 추가로 포함할 수 있다:
Figure pct00047
(본 명세서에서 hFc1X7로도 지칭됨).
어떠한 방식으로도 제한적이고자 함이 없이, 본 발명의 화합물은 하기 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00048
(본 명세서에서 FC5-H3-hFc1X7-ABP(6G)로도 지칭됨).
일부 대표적인 BBB-Fc-ABP 융합 단백질 작제물의 요약 표
Figure pct00049
상기 표에서, BBB-Fc-ABP 융합 단백질 작제물은 또한 링커(L)를 포함할 수 있음에 유의하며, 이때 BBB-Fc-ABP 작제물은 본 발명의 BBB-Fc-L-ABP 융합 단백질이며, 여기서 L은 GGGSGGGGS이거나, 서열 번호 53 내의 컨센서스 링커 서열에 예시된 바와 같은 임의의 적합한 링커일 수 있다.
본 명세서에서 FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)로도 지칭되는 서열 번호 47의 융합 단백질에 제공된 바와 같은 본 발명의 화합물은 그 안에 포함된 성분들 각각의 변형을 포함할 수 있으며, 예를 들어 ABP는 서열 번호 46에 제공된 바와 같이 ABP(GG-G)일 수 있다. (예를 들어, 서열 번호 42 내지 서열 번호 53에 강조처리된 바와 같은) 본 명세서에 제공된 링커 서열은 BBB-Fc-ABP 융합 단백질의 연결을 가능하게 하는 임의의 링커일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 재조합 항체 또는 이의 단편의 발현, 검출 또는 정제에 있어서 도움을 주는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 그러한 서열 또는 태그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한적이고자 함이 없이, 항체 또는 이의 단편은 표적화 또는 신호 서열(예를 들어, 그러나 제한 없이, ompA), 검출/정제 태그(예를 들어, 그러나 제한 없이, c-Myc, His5, 또는 His6), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 추가의 서열은 비오틴 인식 부위, 예컨대 Cronan외 다수(WO 95/04069)에 의해 기재된 것 또는 Voges외 다수(WO/2004/076670)에 의해 기재된 것일 수 있다. 또한 당업자에게 알려진 바와 같이, 링커 서열은 추가의 서열 또는 태그와 함께 사용될 수 있거나, 검출/정제 태그로서의 역할을 할 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물을 인코딩하는 핵산 서열을 포괄한다. 유전자 코드의 축퇴성을 고려하면, 다수의 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 인코딩하는 효과를 가질 것이며, 이는 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같다. 핵산 서열은 다양한 미생물에서의 발현에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 본 발명은 또한 방금 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 포괄한다. 더욱이, 본 발명은 기재된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 포괄한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 또는 하나 초과의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 포괄한다. 본 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함할 수 있다. 희석제, 부형제, 또는 담체는 당업계에 알려진 임의의 적합한 희석제, 부형제, 또는 담체일 수 있으며, 조성물 내의 기타 다른 성분과 상용성이어야 하고, 조성물의 전달 방법과 양립 가능해야 하고, 조성물의 수령자에게 유해하지 않다. 본 조성물은 임의의 적합한 형태일 수 있으며; 예를 들어, 본 조성물은 현탁액 형태 또는 분말 형태(예를 들어, 그러나 제한 없이, 동결건조된 또는 캡슐화된 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한적이고자 함이 없이, 본 조성물이 현탁액 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 식염수, 적합한 완충액, 또는 용해도 및/또는 안정성을 개선하는 첨가제를 포함할 수 있으며; 현탁액을 생성하기 위한 재구성은 완충액 중에서 항체 또는 이의 단편의 생존력을 보장하기에 적합한 pH에서 달성된다. 건조 분말은 또한 안정성을 개선하는 첨가제 및/또는 벌크/부피를 증가시키는 담체를 포함할 수 있으며; 예를 들어, 그리고 제한적이고자 함이 없이, 건조 분말 조성물은 수크로스 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 본 화합물을 포함하는 적합한 조성물을 제조하는 것은 당업자의 역량 내에 있을 것이다.
알츠하이머병을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법에서는 본 발명의 화합물 또는 조성물이 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 임의의 적절한 투여 경로가 이용될 수 있으며, 이에는 정맥내, 복막내, 비경구, 두개내, 근육내, 피하, 경구, 또는 비강 경로가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 최적 투여 용량 및 투여 경로는 일반적으로 실험적으로 결정된다.
증가된 β-아밀로이드 수준을 갖는 대상체의 뇌척수액(CSF) 및 뇌 실질 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 더 구체적으로는, 대상체의 뇌척수액(CSF) 및 뇌 실질 내의 독성 β-아밀로이드 수준은 본 발명의 조성물의 단회 비경구 투여 후 24시간 정도로 조기에 감소된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.
실시예 1: BBB- Fc -L- ABP 융합 분자의 작제
하기를 포함하는 융합 분자를 제조하였다:
a) FC5 sdAb(서열 번호 14), 뮤린 Fc(서열 번호 39) 및 ABP(서열 번호 30),
b) FC5의 인간화 버전(FC5-H3; 서열 번호 17), 인간 Fc(서열 번호 40) 및 ABP(서열 번호 30; 서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38),
c) IGF1R-5 sdAb의 인간화 버전(IGF1R-5-H2; 서열 번호 26), 뮤린 Fc(서열 번호 39) 및 ABP(서열 번호 30).
융합 단백질 작제물의 개략도가 도 1에 나타나 있다. 융합 단백질은 BBB-횡단 단일-도메인 항체, Fc 단편 및 아밀로이드-결합 펩티드를 포함한다.
실시예 2: BBB- Fc -L- ABP 융합 분자의 생성
실시예 1에 기재된 작제물 FC5-mFc-ABP 및 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP를 CHO 세포 내에서 발현시켰으며, 발현된 화합물을 MabSelect Sure 친화성 컬럼 상에서 정제하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 C-말단에서 ABP 변이체에 융합된 마우스 또는 인간 Fc 항체 단편의 N-말단에 융합된 FC5 변이체 FC5 및 FC5-H3 VHH를 포함하는 작제물을 제조하고, 발현시키고, 정제하였다.
FC5-Fc-ABP 변이체 DNA(DNA 합성 공급원)를 포유류 발현 벡터 pTT5 내로 클로닝하였다(문헌[Durocher 2002]). 세포 리터당 1 mg의 DNA의 최종 농도를 위한 폴리플렉스(polyplex)를 플라스미드 벡터(80%), pTT-AKTdd(15%, 단백질 키나제 B의 활성화된 돌연변이체), 및 pTTo-GFP(5%, 형질감염 효율을 모니터링하기 위함)의 배합물을 PEI MAX 용액(Polysciences 카탈로그 번호 24765)과 혼합함으로써 예비형성하였다. PEI:DNA 비는 4:1(W:W)이었으며, 둘 모두는 보충된 F17 배지(4 mM 글루타민, 0.1% Kolliphor) 중에 제조하였다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양액에 첨가하였다. DNA/PEI 폴리플렉스의 부피는 최종 배양 부피의 10%(즉, 1 L 배양물당 100 ml)를 나타낸다. 형질감염 후 24시간째에, 배양물에 1%의 최종 농도로의 트립톤 N1(40% w/v 용액을 사용함, Organotechnie) 및 0.5 mM 발프로산(200 mM 용액)을 공급하였다. 형질감염/생성을 세포 밀도 및 생존력에 대해서뿐만 아니라, 생산성 역가(productivity titer)(L당 Fc의 mg)에 대해서도 모니터링하였으며, 세포 생존력이 최소한 65%에 도달하였을 때 원심분리에 의해 수집하였다(상층액). 청징화된 세포 배양 배지를 0.45 μm 막을 통해 여과한 후, 5 ml의 단백질-A MabSelect SuRe 수지(GE Healthcare)로 패킹된 컬럼 상에 적용하였다. 로딩 후에, 컬럼을 5 부피의 인산염 완충 식염수(pH 7.1)(PBS)로 세척하고, 100 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 3.0)을 사용하여 항체를 용리시켰다. 용리된 항체를 함유하는 분획을 풀링(pooling)하고, PBS 중에서 평형화된 탈염 Econo-Pac 컬럼(BioRad) 상에 로딩함으로써 완충액 교환을 수행하였다. 이어서, 탈염된 항체를 Millex GP(Millipore) 필터 유닛(0.22 μm)에 통과시킴으로써 멸균-여과하고, 분취하였다.
SDS -PAGE 및 Aβ 오버레이: (비환원성 겔, βME 또는 DTT의 경우 70℃에서 그리고 환원성 겔, βME 또는 DTT의 경우 95℃에서 가열된) Laemmli 샘플 완충액 중에 준비된 단백질 샘플을 12% Tris-Tricine 겔 또는 TGX4-15% 겔(BioRad) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하거나, 단백질을 웨스턴 블롯/Aβ 오버레이 검정을 위하여 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 면역블롯을 탈지 분유로 블로킹하고, 이어서 실온에서 45분 동안 Aβ 조제물에 노출시키고(50 내지 100 nM), 결합된 Aβ를 앞서 기재된 바와 같이 6E10 항체를 사용하여 검출하였다(문헌[Chakravarthy et al. 2013]).
ELISA: Aβ-결합 검정을 문헌[Chakravarthy et al. (2013)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. Maxisorp 96웰 ELISA 플레이트(Nunc)를 PBS 중에서 4℃에서 밤새 유리 ABP(합성) 또는 다양한 FC5-ABP 작제물로 코팅하였다(100 내지 500 ng/웰). 웰을 TBS-T 중 1% BSA로 30분 동안 블로킹하고, 이어서 온화하게 교반하면서 실온에서 45분 동안 TBS-T 중 단량체 및 이량체(Mo) 또는 더 고차의 올리고머(Oli)로 주로 이루어진 Aβ1 -42 조제물과 함께 인큐베이션하였다. TBS-T의 3회 세척 후에, 결합된 Aβ를 HRP-접합된 Aβ-특이적 항체(6E10 또는 4G8)를 TBS-T 중에서 실온에서 90분 동안 인큐베이션함으로써 검출하였다. 결합된 항체를 SureBlueTM TMB 시약 키트(KPL)를 사용하여, 제조자의 사용설명서에 따라 450 nm에서 비색 측정함으로써 검출하였다.
SDS-PAGE(NR - 비환원성 조건 및 R - 환원성 조건)에 의한 FC5 융합 분자의 분리 후의 쿠마시 블루 염색된 겔이 도 2a에 나타나 있으며, 이는 재조합 융합 분자의 성공적인 생성을 나타낸다. ELISA 및 웨스턴 블롯(WB) 오버레이 검정에 의한 유리 ABP 및 FC5-Fc-ABP 융합 단백질의 Aβ-올리고머 결합이 도 2b 및 도 2c에 나타나 있다. 유리 ABP 또는 융합된 ABP를 인산염 완충 식염수(PBS) 중 샘플을 4℃에서 밤새 코팅함으로써 ELISA 플레이트 상에 고정화하고, 문헌[Chakravarthy et al., 2013]에 기재된 바와 같이 Aβ 조제물에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10 또는 4G8로 검출하였다(문헌[Chakravarthy et al., 2013]). 융합 분자를 또한 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 종이에 옮기고, Aβ 올리고머에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 상기에서와 같이 특이적 항체로 검출하였다. 결과는 ABP가 BBB 운반체와의 융합 후에 ABP의 Aβ 올리고머 결합 능력을 보유하였음을 나타낸다. Mo: Aβ 단량체; Oli: Aβ 올리고머.
실시예 3: 시험관내에서의 AD- Tg 마우스( B6.Cg - Tg , Jackson Lab)에서의 Aβ 침착물에 대한 BBB-Fc-L-ABP 융합 분자의 결합
실시예 2에서 생성된 작제물에 면역조직형광 검정을 수행하여, FC5-Fc-ABP 융합 분자가 기재된 바와 같이 마우스 뇌 내의 천연-생성된 아밀로이드 침착물에 결합하는 능력을 보유하였는지의 여부를 평가하였다(문헌[Chakravarthy et al., 2014]). 야생형(Wt) 및 AD 유전자도입(AD-Tg) 마우스로부터의 냉동된 반뇌(hemi-brain)를 OCT 중에 포매하고, Jung CM 3000 크라이오스탯을 사용하여 10 μm 절편을 제조하고 -80℃에서 저장하였다. 조직 절편을 해동시키고, OCT를 면도기 블레이드를 사용하여 절편으로부터 박리하고, 이어서 Dako 단백질 블로킹 시약과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 블로킹제를 제거하고, 절편을 TBS 중에서 온화하게 세척하였다. 항체 희석제 중 IR 800-표지 FC5-mFc-ABP(5.0 μg/μl 용액의 1:250 희석물)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 절편을 TBS로 2회 세척하고, Milli Q 물 중에 헹구고, 과량의 헹굼 용액을 제거하고, 절편을 Dako 형광 마운팅 배지(Fluorescent Mounting Media)를 사용하여 커버-슬립(cover-slip)하였다. 절편을 형광 현미경 하에서 시각화하였다(도 3). 선택적 결합(밝은 스폿)이 Aβ 침착물을 생성하는 AD-Tg 마우스로부터의 뇌 절편에서 관찰되었고, 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 Wt 마우스로부터의 뇌 절편에서는 관찰되지 않았는데, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물 내의 ABP가 AD-Tg 마우스 뇌 내의 천연 생성된 Aβ 응집체에 결합하는 능력을 보유함을 나타낸다. 제공된 BBB-Fc-ABP 작제물에서, BBB는 FC5 또는 항-IGF1R 항체일 수 있다.
실시예 4: 시험관내에서의 FC5- Fc -L- ABP 융합 분자의 BBB 관통이동
FC5-Fc-ABP 융합 분자의 BBB-횡단을 래트 및 인간으로부터의 시험관내 BBB 모델에서 평가하였다(도 4). BBB를 횡단하는 융합 분자를, Papp 결정을 위하여 단일 시점을 사용하여, 시험관내 BBB 투과성 검정에서 스크리닝하였다. 변이체의 정량화를 MRM-ILIS에 의해 행하였다(도 4의 A, B 및 C).
SV40-불멸화 성체 래트 뇌 내피 세포(SV-ARBEC) 및 인간 뇌 내피 세포(HBEC)를 사용하여, 기재된 바와 같이 시험관내 혈액-뇌 장벽(BBB) 모델을 생성하였다(문헌[Garberg et al., 2005]; 문헌[Haqqani et al., 2013]). SV-ARBEC(80,000개 세포/막)를 1 ml의 성장 배지 중 0.1 mg/mL 래트 꼬리 콜라겐 유형 I-코팅된 조직 배양 삽입체(기공 크기 1 μm; 표면적 0.9 cm2, Falcon) 상에 시딩(seeding)하였다. 삽입체 어셈블리의 하부 챔버는 불멸화 신생 래트 성상교세포-컨디셔닝된 배지가 1:1(v/v) 비로 보충된 2 ml의 성장 배지를 수용하였다. 등몰량(5.6 μM)의 양성 대조군(FC5 작제물) 또는 음성 대조군(클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 독소 A 결합 VHH인 A20.1; 및 EGFR 결합 VHH인 EG2); 및 실시예 1로부터의 Fc-ABP를 래트 또는 인간 시험관내 BBB 모델을 횡단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. BBB의 내강 측에 등몰량의 sdAb를 노출시킨 후에, 샘플을 15, 30 및 60분 후에 내강으로부터 떨어진 측에서 취하였다. 이어서, 각각의 샘플의 sdAb 함량을 질량 분석에 의해 정량화하였다(다중 반응 모니터링 - 동위원소 표지 내부 표준물; MRM - ILIS)(도 4의 A, B, C).
MRM - ILIS: 이들 방법은 모두 문헌[Haqqani et al. (2013)]에 기재된 바와 같다. 간략하게 말하면, VHH에 대한 SRM(다중 반응 모니터링(MRM)으로도 알려진 선택된 반응 모니터링(selected reaction monitoring)) 검정을 개발하기 위해, 각각의 VHH를 먼저 nanoLCMS/MS에 의해 데이터-의존적 획득을 사용하여 분석하여 모든 이온화 가능한 펩티드를 확인하였다. 각각의 펩티드에 대하여, 3 내지 5개의 가장 강한 단편 이온을 선택하였다. 초기 SRM 검정을 개발하여 이들 단편을 아토몰량(attomole amount)의 소화물(약 100 내지 300 amol)에서 모니터링하였다. 낮은 양에서 재현 가능한 강도 비를 나타낸(즉, 더 높은 양에 비해 피어슨(Pearson) r2 ≥0.95를 가진) 단편을 안정적인 것으로 간주하고, 최종 SRM 검정을 위해 선택하였다. 이 검정을 추가로 최적화하기 위해, 각각의 펩티드에 대한 용리 시간을 또한 포함하였는데, 이때는 근접한 m/z(질량-대-전하 비) 및 용리 시간을 갖는 펩티드를 선택하지 않도록 주의하였다.
세포 배지 또는 체액(혈청 또는 뇌척수액(CSF))에서의 VHH의 통상적인 다중화 SRM 분석은 기지량의 ILIS(0.1 내지 10 nM)를 스파이킹한 후, 100 내지 400 ng의 CSF 또는 배양된 배지 단백질(0.3 내지 1 μL) 또는 약 50 내지 100 ng의 혈청 단백질(1 내지 3 나노리터)을 nanoLC-MS 시스템 내로 주입하는 것을 포함하였다. 각각의 표적 펩티드 이온의 전구체 m/z를 표적에 대한 지정된 용리 시간에서 이온 트랩에서 선택한 후(그리고 남아 있는 관련되지 않은 이온을 폐기한 후), 충돌 유도 해리(CID) 단편화, 및 검출기에 의한 모니터링을 위한 이온 트랩에서의 단지 원하는 단편 이온의 선택을 수행하였다. 정량화 분석을 위해, LTQ(ThermoFisher)에 의해 생성된 원시 파일을 표준 질량 분석 데이터 포맷 mzXML로 변환시키고, MatchRx 소프트웨어의 수정 버전인 Q-MRM(정량적-MRM; 문헌[Haqqani et al. 2013] 참조)으로 지칭되는 인-하우스 소프트웨어를 사용하여 강도를 추출하였다. 각각의 VHH에 대해, 전체 용리 시간에 걸쳐 단편 m/z의 0.25 Da 이내의 합계 강도로 이루어진 VHH의 단편 이온 각각에 대해 추출된-이온 크로마토그램을 생성하였다. 각각의 단편에 대한 최종 강도 값을 획득하기 위해, 예상된 체류 시간의 0.5분 이내의 모든 강도를 합계하였다. VHH는, 그의 펩티드 중 적어도 하나의 단편이 예상된 강도 비를 나타낸다면, 즉 최종 강도 값이 그의 상응하는 순수한 VHH의 최종 강도 값과 비교하여 강한 피어슨 상관 r ≥ 0.95 및 p < 0.05를 나타낸다면, 샘플에서 검출 가능한 것으로 정의되었다.
VHH의 혼합물(배지, 혈청, CSF)을 함유하는 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 환원시키고, 알킬화하고, 트립신-소화하였다(문헌[Haqqani et al., 2012]; 문헌[Gergov et al., 2003]). 소화물(트립신 분해 펩티드)을 아세트산(5% 최종 농도)으로 산성화하고, LTQ XL ETD 또는 LTQ Orbitrap ETD 질량 분석계(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 ThermoFisher)에 커플링된 역상 nanoAcquity UPLC(미국 매사추세츠주 밀포드 소재의 Waters) 상에서 분석하였다. 샘플의 원하는 분취물을 300 μm I.D. x 0.5 mm 3 μm PepMaps C18 트랩(ThermoFisher) 상으로 주입하고 로딩하고, 이어서 0% 내지 20% 아세토니트릴(0.1% 포름산 중), 1분; 20% 내지 46%, 16분; 및 46% 내지 95%, 1분의 구배를 사용하여 400 nL/min의 유량으로 100 μm I.D. x 10 cm 1.7 μm BEH130C18 nanoLC 컬럼(Waters) 상으로 용리하였다. 용리된 펩티드를 펩티드 이온의 단편화를 위하여 CID를 사용하는 SRM 분석 및 MS/MS를 위하여 전기분사 이온화(ESI)에 의해 질량 분석계 내로 이온화하였다. CID는 충돌 가스로서 헬륨을 사용하여 35%의 정규화된 충돌 에너지 및 30 ms의 활성화 시간으로 수행하였다. 선형 이온 트랩 내로의 이온 주입 시간은 6 x 103의 자동 이득 제어(AGC) 목표 값 및 200 ms의 최대 축적 시간을 사용하여 기기에 의해 조정하였다.
겉보기 투과 계수의 측정: 정량화된 값을 직접 플롯팅할 수 있거나, Papp(겉보기 투과 계수) 값을 주어진 식[Qr/dt 시간 대비 수용기 구획에서의 누적량; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투여 용액의 초기 농도]을 사용하여 결정하고 플롯팅할 수 있다. Papp 값은 BBB를 횡단하는 분자의 능력을 결정하는 데 일반적으로 사용된다. Papp 값은 뇌 내피 단층을 가로지르는 화합물의 비투과율(specific permeability)의 척도이다.
FC5 작제물의 검출 및 정량화에 사용된 특정 펩티드가 하기 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00050
실시예 2에 기재된 바와 같이 Fc-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 샘플을 또한 분석하였다(도 4의 D, 3회 반복하여 행해짐). FC5-mFc-ABP는 FC5-mFc만큼이나 효과적으로 혈액-뇌 장벽을 횡단한 반면, BBB 운반체 모이어티 FC5를 함유하지 않은 Fc-ABP는 뇌 내피 세포 단층을 가로질러 횡단하지 않았다. 예상된 바와 같이, 대조군 단일 도메인 항체 EG2 및 A20.1, 또는 대조군 완전 IgG(항-HEL)는 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았다. 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP 융합 단백질에 대해서도 유사한 결과가 획득되었다(도 4의 C 및 도 4의 D). IGF1R5-mFc-ABP ABP에 대해서도 유사한 결과가 획득되었다(도 17a 및 도 17b).
실시예 5: 생체내에서의 FC5- Fc -L- ABP 융합 분자의 BBB 관통이동 및 약동학적 특성
실시예 2의 작제물이 혈액-뇌 장벽을 관통이동하여 뇌 내로, 구체적으로는 뇌척수액(CSF) 내로 들어가는 능력을 생체내에서 평가하였을 뿐만 아니라, CSF 및 혈청 내의 작제물 존재를 정량화하기 위하여 생체내에서 평가하였다. FC5-mFc-ABP를 지시된 용량(2.5, 6.25, 12.5, 및 25 mg/kg)으로 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다.
대수조(cisterna magna) CSF의 다중 샘플링에 사용된 기법은 이전에 기재된 방법을 수정함으로써 NRC에서 개발되었다(문헌[Huang et al.,1995]; 문헌[Kornhuber et al., 1986]). 모든 동물은 Charles River Laboratories International, Inc.(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 구매하였다. 동물들을 24℃의 온도, 50 ± 5%의 상대 습도에서 12시간 명/암 사이클에서 3 마리의 그룹에 수용하고, 먹이 및 물에 자유롭게 접근 가능하게 하였다. 모든 동물 절차는 NRC의 ACC(Animal Care Committee)에 의해 승인받았으며, CCAC(Canadian Council of Animal Care) 가이드라인을 준수하였다. 8 내지 10 주령된 수컷 위스타(Wistar) 래트(체중 범위, 230 내지 250 g)를 모든 연구에서 사용하였다.
모든 실험에서는, 시험 항체(FC5 Fc-융합체)를 등몰 용량(7 mg/kg)으로 꼬리 정맥 내로 정맥내 투여하였다. 96시간에 걸쳐 최대 5회까지의 바늘 천자에 의해 대수조로부터의 CSF 샘플 수집을 행하였다. 샘플 수집을 위하여, 래트를 3% 이소플루란으로 짧게 그리고 가볍게 마취하고, 머리를 45° 각도로 하향으로 회전시킨 상태로 정위 프레임 내에 배치하였다. 후두 능선에서 시작하여 귀들 사이에 2 cm 정중선 절개를 행하고, 근육들을 나누어서 대수조를 덮고 있는 경막을 노출시켰다.　튜빙이 1 ml 주사기에 부착된 27G 나비 바늘(QiuckMedical, 카탈로그 번호 SV27EL)을 사용하여 경막을 천자하고 약 20 μl의 CSF를 흡인하였다. 이어서, CSF를 샘플 유리 바이알(Waters, 카탈로그 번호 186000384c) 내로 옮기고, 추가의 분석 시까지 -80℃ 냉동기 내에 넣어두었다.
혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 구매 가능한 튜브 내에 수집하였다(BD microtainer, 카탈로그 번호 365956). 실온에서 15 내지 30분 동안 응고시킨 후, 10분 동안 1100 rcf(3422 rpm)로 원심분리에 의해 혈병을 제거하고; 이어서, 혈청을 깨끗한 유리 바이알(Waters, 카탈로그 번호 186000384c) 내로 옮기고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 추가의 분석 시까지 -80℃에서 저장하였다. 수집의 종료 시점에서, 심장 천자에 의해 래트를 희생시켰다. WinLin 6.0 프로그램을 사용하여 혈액 및 CSF PK 분석을 수행하였다.
표 1에 나타낸 펩티드 시그너처를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같은 nanoLC-SRM 기반 정량화 및 질량 분석에 의해 혈청 및 CSF 샘플을 분석하였다.
CSF 수집은 까다로운 절차로서, 이 동안에 CSF가 혈액으로 쉽게 오염될 수 있다. VHH의 양이 혈액보다 CSF(0.1% 미만) 중에 훨씬 더 적게 존재할 것으로 예상되었기 때문에, 심지어 혈액에 의한 미약한 오염도 개별 CSF 샘플의 값을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 혈액-오염된 CSF 샘플에 대한 엄격한 제외 기준을 개발하는 것이 필요하였다. 혈액-CSF 알부민 비를 평가하기 위하여, 혈장 및 CSF 내의 알부민 수준을 정량화하기 위한 nanoLC-SRM 방법을 개발하였다. 다중화 검정에서 기타 다른 펩티드 피크에 의한 방해가 최소한이 되도록 하기 위하여, 알부민 펩티드 APQVSTPTLVEAAR을 그의 특유의 체류 시간 및 m/z 값에 기초하여 선택하였다(Mol Pharm). 상기 기재된 바와 같이 SRM을 사용하여 CSF 샘플 및 혈장 샘플 둘 모두에서 펩티드의 강도를 정량화하였다. 각각의 래트에 대해 하기와 같이 알부민 비를 계산하였다:
알부민 비 = 분석되는 혈장의 nL당 강도 / 분석되는 CSF의 nL당 강도
1500 이하의 비이면, 혈액에 의해 오염된 것으로 간주하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 12시간과 24시간 사이에서 Cmax를 가지면서 CSF 중에 출현하였는데, 이는 생체내에서의 뇌 및 CSF 구획 내로의 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타낸다(A). 혈청 PK 파라미터(도 5 및 하기 표 2)는 FC5-mFc-ABP의 알파- 및 베타-반감기가 완전 IgG(래트 Fc를 함유하는 벤치마크 항체)의 것과 유사하고, ABP 또는 FC5 또는 Fc를 갖지 않는 FC5-ABP의 것보다 실질적으로 더 높음을 나타낸다.
Figure pct00051
실시예 6: 큰 비설치류 동물에서 뇌로의 FC5- ABP 작제물의 전달
FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 비글개에서 평가하였다. FC5-mFc-ABP를 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사에 의해 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해(좌측 패널) 그리고 Fc-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해(도 6의 6B) 분석하였다. 별표는 혈액-오염된 샘플을 나타낸다(MRM 분석에는 나타나 있지 않음). 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였는데, 이는 생체내에서 개 혈액-뇌 장벽을 가로질러 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타내는 것으로, 이는 BBB 운반체의 통과이동 성질을 확인시켜 준다. WinNonlin 소프트웨어에 의해 PK 파라미터 및 CSF 노출을 분석하였으며, 이는 하기 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00052
실시예 7: BBB 투과성
생체내에서의 인간 Fc(hFc)와 융합되고 ABP에 화학적으로 연결된 FC5(FC5-hFc-ABP)의 BBB 투과성 및 CSF 출현(래트 모델). 제조자의 사용설명서(ThermoFisher Scientific)에 따라 이종이작용성 크로스-링커 설포-SMCC(설포석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 사이클로헥산-1-카르복실레이트)를 사용하여 FC5-hFc를 ABP-시스타미드와 연결하였다. 화학적으로 접합된 분자를 6.25 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 래트 내로 정맥내 투여하고, CSF 샘플을 4시간째 및 24시간째에 수집하고 분석하였으며, 이는 도 5에 나타낸 바와 같다. FC5-hFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하지만, BBB 운반체를 갖지 않는 Fc-ABP는 그렇지 않으며, 이는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 ABP의 FC5-매개 수송체를 확인시켜 주며, 도 7에 예시된 바와 같다.
실시예 8: 뇌로의 BBB- Fc -L- ABP 작제물의 전달
실시예 2의 FC5-Fc-ABP 작제물이 생체내에서 혈액-뇌 장벽을 관통이동하고 뇌 실질을 투과하는 능력을 마우스에서 평가하였다.
FC5-mFc-L-ABP를 야생형(WT) 마우스 및 AD-유전자도입(AD-Tg, B6.Cg-Tg, Jackson Lab) 마우스에 15 mg/kg으로(도 8a 및 도 8b) 또는 AD-Tg 마우스에 7.5, 15 및 30 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사에 의해 투여하고, 4시간 및 24시간 동안 순환시켰다. 이어서, 마우스를 좌총경동맥을 통해 1 ml/min의 속도로 10 ml의 헤파린 첨가(100 U/ml) 식염수로 확실히 관류시켜 뇌의 특이적 관류를 촉진시켰다. 이어서, 뇌를 적출하고, 해마 및 피질 조직을 절개하고, 즉시 동결시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 동결된 조직을 50 mM Tris-HCl(pH 8), 150 mM NaCl 및 프로테아제 억제제 칵테일(미국 온타리오주 오크빌 소재의 Sigma-Aldrich)을 함유하는 빙랭 균질화 완충액 중에서 Dounce 균질기(4℃에서 10 내지 12회 스트로크)를 사용하여 균질화하였다. 이어서, 샘플을 매회마다 4℃에서 10초 동안 3회 초음파 처리하고, 불용성 물질을 제거하였다(4℃에서 10분 동안 10,000 xg). 단백질 함량에 대해 상층액을 분석하고, 약 0.5 μg의 단백질을 실시예 4에 기재된 방법 및 표 1에 나타낸 펩티드 시그너처를 사용하여 SRM 분석(도 8a)에 사용하였다.　샘플을 또한 mFc-특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(도 8b 및 도 8c). 융합 분자의 3가지 모든 성분(FC5, Fc 및 ABP)에 속하는 특정 "시그너처" 펩티드는 MRM에 의해 피질 및 해마 둘 모두에서 검출되었으며, 이는 FC5 운반체가 ABP를 뇌의 표적 영역에 성공적으로 전달하였음을 나타낸다(단지 FC5 펩티드로부터의 데이터만이 도 8a에 나타나 있다). 측정된 수준은, Fc에 융합된 대조군 단일-도메인 항체 A20.1, 또는 단독으로의 Fc 단편의 경우에 통상적으로 약 50 ng/g 조직으로 측정된 것에 비하여, 상이한 시점에서 750 내지 1400 ng/g 뇌 조직의 범위였다. 이것은 조직 추출물 내의 Fc 및 ABP에 대해 프로빙하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다(도 8b 및 도 8c). 단지 식염수만을 제공받은 동물에서는 웨스턴 블롯에 의해 융합 분자의 어떠한 단백질 신호도 검출되지 않았다. 뇌의 표적 영역에서 웨스턴 블롯에 의해 검출된 FC5-mFc-ABP 수준에 있어서 용량-의존적 증가가 있었다(도 8c). 이들 결과는 야생형(WT) 및 AD-Tg 마우스에서 FC5가 ABP를 뇌의 표적 영역(즉, 해마 및 피질)에 성공적으로 전달함을 명백히 나타낸다.
실시예 9: 마우스 뇌로부터의 Aβ의 제거
Tg 마우스에서의 아밀로이드 부하에 대한 ABP의 효능을 평가하기 위하여, 단독으로의 ABP 또는 FC5-ABP 작제물에 의한 처리의 결과를 비교하였다.
단독으로의 ABP(도 9a) 또는 BBB 운반체 FC5와 융합된 ABP(도 9b 및 도 9c)에 의한 처리 사이의 비교. 2개의 상이한 AD Tg 마우스 모델, 즉 삼중 유전자도입(3X Tg-AD, 즉 PS1M146V, APPSwe 및 tauP301L 도입유전자를 포함하는 sv129/ C57BL6 마우스, 캘리포니아 대학의 Dr. F.M. LaFerla) 및 이중 유전자도입(B6.Cg-Tg, 즉 PSEN1dE9 및 APPSwe 도입유전자를 포함함, Jackson Lab)을 사용하였으며; 마우스에 각각 3개월 또는 2개월의 기간에 걸쳐 격일로 300 nmol/kg의 유리 ABP를 피하(sc) 투여하였다. 처리 기간의 종료 시점에서, 제조자의 검정 절차에 따라 시판 검정 키트(InVitrogen, KHB3544)를 사용하여 ELISA에 의해 뇌 내의 Aβ 수준을 측정하였다. 단독으로의 ABP에 의한 처리는 2 내지 3개월의 다회 처리(격일로) 후에 뇌 Aβ의 25 내지 50% 감소를 가져왔다(도 9a). FC5-mFc-ABP 작제물을 이중 유전자도입 AD 마우스(B6.Cg-Tg, 15 mg/kg; 220 nmol/kg과 등가임) 내로 정맥내 주사하고; 상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이 주사 후 24시간째에 ELISA 및 nanoLC-MRM 둘 모두에 의해 뇌 Aβ 수준을 측정하였다. 예기치 않게도, FC5-mFc-ABP에 의한 처리 후 24시간 이내에 약 50% 아밀로이드 감소가 관찰되었으며(도 9b), 이는 FC5에 의한 ABP의 효율적인 뇌 전달이 뇌 Aβ 수준을 감소시키는 데 있어서의 ABP의 효능을 대폭 증가시켰음을 나타낸다. CSF 분석은 또한 FC5-mFc-ABP 처리 후 24시간 이내에 Aβ1-42 수준의 유의한 감소를 나타내었다(도 9c). MRM에 의해 검출된 Aβ 펩티드 서열(서열: LVFFAEDVGSNK, 표 1) / ELISA 분석에 의해 검출된 Aβ펩티드 서열은 ABP에 의해 인식되는 Aβ에피토프로부터 멀리 있고/그와 상이하다(따라서, 그의 정량화가 ELISA 또는 MRM에 의해 방해되지 않음).
실시예 10: FC5- ABP 작제물 내로의 Fc 성분의 도입은 그의 혈청 반감기를 향상시킨다
FC5-ABP(FC5 서열 번호 17; 및 ABP 서열 번호 36) 및 FC5-hFc-ABP(FC5 서열 번호 17; hFc 1x7 서열 번호 40 및 ABP 서열 번호 36) 작제물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 CHO 세포 내에서 생성하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 혈청 PK를 결정하였다. FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP 작제물을 15 mg/kg으로 래트 꼬리 정맥 내로 정맥내 투여하였다. 혈청을 연속으로 수집하고, FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP 수준을 FC5- 및 ABP-특이적 항체를 사용하여 직접 ELISA에 의해 정량화하였다. 혈청 샘플을 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 희석시키고(1:5,000), Maxisorb 플레이트에 적용하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 3 X 100 μl PBS로 세척하고, 실온(RT)에서 30분 동안 TBST 중 1% BSA로 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고, 플레이트를 HRP-접합된 FC5 단일클론 항체와 함께 인큐베이션하였다(90분). 인큐베이션 및 세척 후에, 100 μl SureBlue 시약을 첨가하고, 암소에서 실온에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 반응의 종료 시점에서, 100 μl 1 M HCl을 첨가하고, 플레이트 판독기에서 450 nm에서 발색을 판독하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Fc를 갖지 않는 FC5-ABP는 Fc 성분을 함유하는 FC5-ABP 작제물(FC5-Fc-ABP)에 비하여 혈청에서 매우 신속하게 제거되었다(1시간 이내). 이 검정을 또한 ABP-특이적 항체에 대해서도 반복하였으며, 유사한 결과를 얻었다. 샘플 적용 후에, ELISA 플레이트를 먼저 ABP 토끼 다중클론 항체와 인큐베이션한 후(90분), HRP-접합된 토끼 2차 항체와 인큐베이션하고(30분), 결합된 항체를 상기 기재된 바와 같이 검출하였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 11: 래트 뇌로부터의 Aβ의 제거
AD-Tg 래트에 4주의 기간에 걸쳐 매주마다 꼬리 정맥을 통해 식염수 또는 FC5-mFc-ABP를 투여하였다(30 mg/kg의 로딩 용량 및 15 mg/kg의 후속 4회의 매주 용량). FC5-mFc-ABP 및 Aβ의 CSF 수준을 nanoLC MRM에 의해 분석하였다. 4주의 처리 전과 후에, 특정 Aβ-결합제[18F] NAV4694를 사용하여 PET 스캔에 의해 뇌 Aβ 수준을 결정하였다. FC5-mFc-ABP는 24시간 이내에 래트 내의 CSF Aβ 수준을 감소시켰다. Tg 마우스에서와 같이 FC5-mFc-ABP와 Aβ의 CSF 수준 사이의 반비례 관계가 관찰되었으며, 이는 FC5에 의해 뇌 및 CSF에 전달된 ABP에 의한 표적 교합 및 Aβ의 신속한 제거를 시사한다(도 11a 및 도 11b). 이것은 PET 스캔에 의해 추가로 확증되었는데, PET 스캔은 FC5-mFc-ABP에 의한 4주의 처리 후에 래트 뇌 Aβ 수준의 유의한 감소(30 내지 50%)를 명백히 나타내었다(도 11c).
실시예 12: 증가된 해마 부피 및 개선된 뉴런 연결성
실시예 11에 기재된 실험에서, 처리 전과 후에, 식염수- 및 FC5-mFc-ABP-처리된 Tg 마우스에 부피측정적 및 기능적 자기 공명 영상(MRI)을 실시하였다. 부피측정적 MRI(도 12a)는 식염수-처리된 대조군에 비하여 ABP-처리된 Tg 마우스에서 증가된 해마 부피를 나타내었으며, 이는 ABP 처리가 해마 위축을 정지시켰음을 시사한다. 기능적 MRI(도 12b)는 식염수-처리된 대조군에 비하여 ABP-처리된 Tg 마우스에서 전대상 피질에서 개선된 연결성을 나타내었으며, 이는 뉴런 연결성의 회복을 시사한다. 이 데이터는 지금 제공된 유의성, 효능 및 월등한 치료적 이점을 확인시켜 준다.
실시예 13: FC5- mFc2a - ABP 치료는 개에서 CSF Aβ의 감소된 수준을 나타낸다
실시예 6에 기재된 바와 같이, FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 2개의 용량(15 mg/kg 및 30 mg/kg)으로 비글개에서 평가하였다. nanoLC-MRM에 의해 FC5-mFc2a-ABP의 혈청 및 CSF 수준을 측정하는 것에 더하여, Aβ의 CSF 수준을 또한 실시예 9에 기재된 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해 측정하였다. 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 용량- 및 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였다(도 13b). 가장 중요한 것은, Tg 마우스 및 Tg 래트에서 관찰된 바와 같이, CSF FC5-mFc2a-ABP 수준에 반비례하여 CSF Aβ 수준의 유의한 감소가 있었다는 것이다.
실시예 14: 상이한 BBB 운반체를 갖는 ABP 융합 분자의 생성
ABP 융합 분자의 다능성을 평가하기 위하여, ABP를 또 다른 인간화 BBB 운반체 IGF1R5(H2)와 성공적으로 융합시켰다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 이 분자의 이작용성, Aβ 올리고머에 결합하는 ABP의 능력(ELISA 및 오버레이 검정) 및 또한 시험관내 BBB 모델을 가로질러 ABP를 전달하는 IGF1R5의 능력(데이터는 나타나 있지 않음)이 보유되었다. 이는 ABP가 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체에 융합되어 뇌에 전달될 수 있음을 명백히 나타낸다.
실시예 15: 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체- Fc - ABP 작제물에 의한 Aβ 올리고머 결합
변형된 ABP를 갖는 다양한 FC5-Fc-ABP 작제물(표 1 및 도 15에 나타낸 서열 번호에 의해 나타낸 바와 같은 분자의 부위-특이적 돌연변이 또는 C-말단 일부분의 제거)이 제공된다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 ELISA 방법에 의해 Aβ 올리고머를 결합시키는 데 있어서 유사한 잠재성을 보유하였다.
실시예 16: 안정성 및 바이오- 제조성을 개선하기 위한 특이적 돌연변이를 갖는 FC5- hFc1X7 -L- ABP의 생성
특이적 돌연변이(ABP, 서열 번호 35; ABP, 서열 번호 36)를 갖는 FC5-hFc1X7-L-ABP를 CHO 세포에서 생성하고, 환원성(R) 및 비환원성(NR) 조건 하에서 SDS-PGE 상에서 분리하고 쿠마시 블루로 염색하였으며, 이는 도 2에 나타낸 바와 같다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, FC5-특이적, hFc-특이적 및 ABP-특이적 항체로 면역블로팅하였다. 또 다른 세트에서는, 융합 분자 내의 ABP의 Aβ결합을 또한 오버레이 검정에 의해 시험하였다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10으로 검출하였다. 알 수 있는 바와 같이, 특이적 돌연변이에 의한 ABP의 조직적인 변형(본 명세서에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 ABP 서열 번호 35, 및 ABP 서열 번호 36)은 생성된 분자의 안정성을 실질적으로 향상시켰는데, 이는 본 명세서에서, 예를 들어 환원성 및 비환원성 조건 하에서 단일 단백질 밴드에 의해 명백히 나타난 바와 같다(도 2a의 기타 다른 ABP 작제물과 비교하면, 여기서는 이중 단백질 밴드가 관찰될 수 있음). 융합 분자의 안정성에 있어서의 이러한 실질적인 향상은 균질한 분자의 바이오-제조성을 촉진시킨다.
실시예 17: 시험관내에서의 다양한 FC5- Fc -L- ABP 작제물 및 IGF1R5 - Fc - ABP 작제물의 BBB 투과성
시험관내 래트 BBB 모델에서 BBB-횡단을 평가하였으며, 이는 도 4에 나타낸 바와 같으며, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 분자를 nanoLC-MRM 방법에 의해 검출하였다. 인간화 FC5 및 IGF1R 운반체에 융합된 모든 ABP 변이체는 BBB를 효과적으로 횡단하였다. 예상된 바와 같이, BBB 비투과성 sdAb인 A20.1은 BBB를 횡단하지 않았으며, 마찬가지로, A20.1에 융합된 ABP는 BBB를 투과하지 않았다(도 17a). 도 17b에는, 융합 분자의 3가지 모든 성분, 즉 FC5, Fc 및 ABP의 "지문" 펩티드가 nanoLC-MRM에 의해 검출되었음이 나타나 있다.
본 명세서에 기재된 구현예 및 실시예는 예시적이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 여겨지지 않는다. 대안, 수정 및 등가물을 포함한 상기 구현예의 변형은 본 발명자들에 의해 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 더욱이, 특징들의 논의된 조합은 본 발명의 해결책에 반드시 필요한 것은 아닐 수 있다.
실시예 18: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물[FC5(H3)-hFc-ABP ( ABP 서열 번호 35 및 ABP 서열 번호 36)]은 시험관내 래트 혈액-뇌 장벽을 온전하게 횡단한다. 인간화 FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽 횡단을 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가하였다. 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 융합 분자를 웨스턴 블롯 및 ELISA 방법에 의해 분석하였다. 면역블롯을 hFc-특이적, 및 ABP-특이적 항체를 사용하여 프로빙하였다. 이들 항체 둘 모두는 BBB를 횡단하는 분자(하부 챔버)를 인식하였으며, 분자 크기는 시험관내 BBB에 적용된 FC5-ABP 융합 작제물(상부 챔버)과 동일하였으며, 이는 BBB를 횡단한 분자가 온전하게 유지되었음을 나타낸다. 이는 샌드위치 ELISA 검정에 의해 입증되었는데, 여기서는 BBB-횡단된 분자가 FC5-특이적 항체에 의해 포획되었으며, 포획된 분자는 ABP 항체에 의해 검출되었다.
실시예 19: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물[FC5(H3)-hFc-L-ABP ( ABP 서열 번호 35 및 ABP 서열 번호 36)] 은 생체내에서 BBB를 가로질러 수송되고 FC5에 의해 온전하게 뇌에 전달된다. 마우스에서의 인간화 FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽 횡단 및 뇌 전달을 실시예 8에 기재된 바와 같이 평가하였다. 이 분자의 정맥내 투여 및 심장내 관류 후 4시간째에, 뇌를 적출하고, 피질을 RIPA 완충액 중에 추출하고, 주사된 FC5-ABP 융합 분자의 존재를 ABP-특이적 항체로 프로빙되는 웨스턴 블롯에 의해 그리고 분자를 FC5-특이적 항체로 포획하고 ABP-특이적 항체에 의해 검출함으로써 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 웨스턴 블롯은 피질 내의 전장 FC5-ABP 작제물의 존재를 밝혀주었다. 이는 샌드위치 ELISA에 의해 입증되었는데, 이는 FC5-특이적 항체에 의해 분자를 포획하고, 포획된 분자를 ABP-특이적 항체에 의해 검출하는 능력에 의해 나타난 바와 같이 분자의 온전한 성질을 밝혀주었다.
실시예 20: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물 [FC5(H3)- hFc - ABP(ABP 서열 번호 36]의 생체외(A) 및 생체내 (B) 결합(표적 교합)
실시예 3에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 수행하였다. AD-유전자도입 마우스로부터의 뇌 절편을 FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP, 서열 번호 36)와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 HRP-접합된 FC5-특이적 항체로 시각화하였다. 음성 대조군으로서, 절편을 작제물 없이, 또는 융합된 ABP가 없는 FC5-hFc 작제물과 함께 인큐베이션하였다. 간략하게 말하면, APP/PS1 유전자도입 마우스로부터의 피질 및 해마를 함유하는 포르말린-고정된 40 μm 자유-부유 절편에 80℃에서 30분 동안 10 mM 시트르산나트륨 완충액(pH 9) 중에서 항원 회복을 실시하고, 이어서 실온까지 냉각시켰다. 절편을 PBS 중에 헹구고, PBS 중 3% H2O2로 30분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 블로킹하고, 이어서 다시 헹구었다. 절편을 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 Dako 혈청 무함유 단백질 블로킹제 중에서 1시간 인큐베이션한 후에, 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 Dako 희석제 중에서 실온에서 90분 동안 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 또는 몰당량의 FC5-hFc1x7과 함께 인큐베이션하였다. 절편을 PBS 중에서 확실히 헹군 후에, Dako 희석제 중에서 실온에서 60분 동안 항-FC5-HRP와 함께 인큐베이션하고, 다시 헹구고, 이어서 키트 사용법에 따라 Vector Immpact DAB를 사용하여 발현시켰다. 절편을 Superfrost 플러스 슬라이드 상에 놓고, 밤새 공기 건조되게 하고, 이어서 재수화시키고, 메틸 그린으로 대비염색하고, 아세톤/0.05% 아세트산(v/v) 중에 침지하고, 탈수시키고, 투명화하고, Permount를 사용하여 커버슬립하였다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물에 대해서는 선택적 결합(흑색 스폿)이 관찰되었지만, ABP를 갖지 않는 FC5(H3)-hFc1X7에 대해서는 관찰되지 않았는데, 이는 뇌에서의 Aβ 침착물의 ABP-의존적 결합(표적 교합)을 나타낸다. 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 결합이 관찰되지 않았다(데이터는 나타나 있지 않음).
AD 유전자도입 마우스 내로의 FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 해마내 주사 후에 Aβ 침착물의 유사한 결합이 검출되었다(B). 해마내 주사 후 4시간째에, Tg 마우스를 관류시키고, 뇌를 적출하고 절편화하였다. Aβ 침착물에 대한 FC5(H3)-hFc-ABP 결합(밝은 백색 점)이 ABP-특이적 다중클론 항체에 의해 시각화되었다. 뇌 절편을 먼저 ABP-특이적 단일클론 항체와 함께 인큐베이션한 후, Alexa-647 접합된 항 토끼-Fc 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
실시예 21: 생채내에서의 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물(FC5(H3)-hFc-ABP (서열 번호 46))에 의한 표적 교합. 형광단-표지(도 18의 A) 또는 나이브(naive) FC5-ABP(도 18의 B) 융합 분자를 야생형(Wt) 및 AD-Tg(Tg) 마우스의 해마 영역 내로 현미주사하였다. 형광단-표지 FC5-ABP 융합 분자의 현미주사 후 30분째에, 뇌를 적출하고, 절편화하고, 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 도 21의 A에 나타낸 바와 같이, 주사된 분자는 Aβ-특이적 항체와의 공동-국재화에 의해 확인되는 바와 같이 Aβ 침착물에 결합하였다. 병행 연구에서, 나이브 FC5-ABP 융합 분자의 해마내 주사 후 4시간째에, 주사된(ips) 및 비주사된(con) 영역으로부터의 해마체를 수집하고, Tris-완충 식염수 중에서 균질화하였다. 해마 추출물에 포획 항체로서의 FC5 항체 및 검출 항체로서의 ABP 또는 Aβ-특이적 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 실시하였다. 도 21의 B에 나타낸 바와 같이, 현미주사된 FC5-ABP 분자는 온전하게 유지되었으며, Aβ-특이적 항체에 의해 검출된, 아래로 끌어당겨진 복합체 내의 Aβ 존재에 의해 나타난 바와 같이, ABP는 생체내에서 교합하고 표적 Aβ에 결합할 수 있었다.
실시예 22: 비인간화 FC5- Fc -L- ABP 작제물과 인간화 FC5- Fc -L- ABP 작제물 사이의 PK/PD 비교
FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 5에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트 내로 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 혈청 및 CSF PK 프로파일은 비인간화 및 인간화 작제물에 대한 것과 매우 유사하였다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 9b에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 Tg 마우스 내로 정맥내 투여하였다. CSF 내의 FC5-Fc-ABP 및 Aβ 수준을 nanoLC-MRM에 의해 측정하였으며, 이는 도 9b에 나타낸 바와 같다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, CSF 내의 비인간화 및 인간화 FC5-Fc-ABP의 수준은 유사하였으며, 가장 중요한 것은, CSF Aβ 수준의 변화(감소)가 또한 매우 유사하다는 것이었는데, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물의 인간화가 융합 작제물의 PK 및 PD 프로파일에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
서열
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
참고문헌
여기에 그리고 본 출원 전체에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 명세서에 참고로 포함된다.
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Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
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Figure pct00062
SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada Stanimirovic, Danica Chakravarthy, Balu Durocher, Yves <120> Blood-Brain Barrier Transmigrating Compounds and Uses Thereof <130> 2016-028-04 <150> 62/452,015 <151> 2017-01-30 <150> 62/530,980 <151> 2017-07-11 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 FC5 <400> 1 Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr Thr Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 FC5 <400> 2 Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 FC5 <400> 3 Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 IGF1R-3 <400> 4 Glu Tyr Pro Ser Asn Phe Tyr Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 IGF1R-3 <400> 5 Val Ser Arg Asp Gly Leu Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 20 <212> 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Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 290 295 300 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 325 330 335 Trp Val Ala Thr Ile Asp Trp Gly Asp Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asn 340 345 350 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 355 360 365 Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 370 375 380 Tyr Cys Ala Met Ala Arg Gln Ser Arg Val Asn Leu Asp Val Ala Arg 385 390 395 400 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 405 410 <210> 53 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FC5-H3-hFc1X7-L(consensus)-ABP(6G) <220> <221> misc_feature <222> (357)..(357) <223> where X is A or G <220> <221> misc_feature <222> (359)..(359) <223> where X is A or G <220> <221> misc_feature <222> (360)..(360) <223> where X is S or T <220> <221> misc_feature <222> (362)..(362) <223> where X is G or V <220> <221> misc_feature <222> (363)..(363) <223> where X is G, A or V <220> <221> misc_feature <222> (365)..(365) <223> where X is S or T <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 145 150 155 160 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 Glu Gly Pro Glu 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Ser Lys Lys Gly Gly Ser Thr Gln Leu Lys Ser 385 390 395 400 Arg Val Lys Asn Ile 405

Claims (49)

  1. 혈액-뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 화합물.
  2. 제1항에 있어서, Fc 단편을 추가로 포함하는, 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기의 서열을 포함하는 것인, 화합물:
    Figure pct00063

    (여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 G 또는 V이고, X3은 G 또는 A이고, X4는 G 또는 A이고, X5는 G 또는 V이고, X6은 G 또는 V이고, X7은 G 또는 V이고, X8은 G 또는 A이고, X9는 G 또는 A임).
    [청구항 3]
    제2항에 있어서, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 화합물:
    Figure pct00064

    상기 서열들 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 화합물:
    Figure pct00065
    (서열 번호 1)의 상보성 결정 영역(CDR) 1 서열,
    Figure pct00066
    (서열 번호 2)의 CDR2 서열,
    Figure pct00067
    (서열 번호 3)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
    Figure pct00068
    (서열 번호 4)의 CDR1 서열,
    Figure pct00069
    (서열 번호 5)의 CDR2 서열,
    Figure pct00070
    (서열 번호 6)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
    Figure pct00071
    (서열 번호 7)의 CDR1 서열,
    Figure pct00072
    (서열 번호 8)의 CDR2 서열,
    Figure pct00073
    (서열 번호 9)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및
    Figure pct00074
    (서열 번호 10)의 CDR1 서열,
    Figure pct00075
    (여기서, X는 A 또는 T임) (서열 번호 11)의 CDR2 서열,
    Figure pct00076
    (서열 번호 12)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간화된 것인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 화합물:
    Figure pct00077

    (여기서, X1은 D 또는 E이고, X2는 A 또는 E이고, X3은 F 또는 V이고, X4는 E 또는 G이고, X5는 R 또는 L이고, X6은 F 또는 W이고, X7은 L 또는 V임);
    Figure pct00078

    (여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 A이고; X6은 F 또는 V이고; X7은 E 또는 G이고; X8은 R 또는 L이고; X9는 F 또는 W이고; X10은 A 또는 S이고; X11은 M 또는 I이고; X12는 A 또는 S이고; X13은 V 또는 L이고; X14는 D 또는 Y이고; X15는 V 또는 L이고; X16은 K 또는 R이고; X17은 Q 또는 L임);
    Figure pct00079

    (여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이고; X6은 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이고; X8은 G 또는 E이고; X9는 L 또는 R이고; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이고; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이고; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이고; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임); 및
    Figure pct00080

    (여기서, X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 S이고; X6은 D 또는 G이고; X7은 L 또는 R이고; X8은 F 또는 W이고; X9는 A 또는 S이고; X10은 A 또는 T이고; X11은 A 또는 S이고; X12는 G 또는 N이고; X13은 M 또는 L이고; X14는 N 또는 R이고; X15는 E 또는 R이고; X16은 P 또는 A이고; X17은 S 또는 Y이고; X18은 Q 또는 L임).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 화합물:
    Figure pct00081

    Figure pct00082

    상기 서열들 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 단일-도메인 항체(sdAb)인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단편은 마우스 Fc2a 또는 인간 Fc1인, 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Fc 단편은 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41을 포함하는 것인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이량체를 형성하는 것인, 화합물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편, Fc 단편, 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 것인, 화합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 융합 단백질은 Fc 단편의 N-말단에 연결된 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 Fc 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 화합물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 Fc 단편의 C-말단에 연결되고, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인, 화합물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 융합 단백질은 링커(linker)를 추가로 포함하는 것인, 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 링커는 Fc에 항체 또는 이의 단편을 연결하고/하거나 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 연결하는 독립적으로 선택된 링커 서열인, 화합물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 링커 서열은 GGGSGGGGS, 또는 임의의 적합한 링커 및 서열 번호 53 내에 있는 것인, 화합물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편; 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 b-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드; 및 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함하는 것인, 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 42 내지 서열 번호 53 중 어느 하나, 및 이들 서열 중 임의의 것과 실질적으로 동일한 서열 및/또는 이들의 이량체를 포함하는 것인, 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 융합 단백질은 임의의 적합한 링커 서열을 치환할 수 있는 링커 서열을 포함하는 것인, 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 융합 단백질의 이량체를 포함하는 것인, 화합물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 것인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 화합물을 인코딩하는 핵산 분자.
  24. 제23항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  26. 제25항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  27. 제25항에 있어서, 환자에서 알츠하이머병을 치료하기 위한, 조성물.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물 및 제25항의 조성물을 알츠하이머 병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머병을 치료하는 방법.
  29. 대상체에 대한 제25항의 약제학적 조성물의 충분한 양의 반복된 비경구 투여 단계를 포함하는 뇌 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 비경구 투여는 피하 투여 또는 정맥내 투여인, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 아밀로이드 베타의 증가된 뇌 수준을 갖는 대상체의 뇌에 제25항의 조성물의 반복된 비경구 투여 후에 독성 β-아밀로이드 수준이 감소되는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 독성 β-아밀로이드는 제22항의 조성물의 반복된 비경구 투여 후 4주 이내에 감소되는 것인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 증가된 뇌척수액(CSF)을 갖는 대상체의 CSF 내의 독성 β-아밀로이드 수준은 제25항의 조성물의 비경구 투여 후에 감소되는 것인, 방법.
  34. 제30항에 있어서, 증가된 뇌척수액(CSF)을 갖는 대상체의 CSF 내의 독성 β-아밀로이드 수준은 제25항의 조성물의 단회 비경구 투여 후 24시간 이내에 감소되는 것인, 방법.
  35. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 뇌 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법.
  36. 하기의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드:
    Figure pct00083

    (여기서, X1은 G 또는 A이고, X2는 G 또는 V이고, X3은 G 또는 A이고, X4는 G 또는 A이고, X5는 G 또는 V이고, X6은 G 또는 V이고, X7은 G 또는 V이고, X8은 G 또는 A이고, X9는 G 또는 A임).
  37. 제36항에 있어서, 상기 폴리펩티드 서열은 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 및 이와 실질적으로 동등한 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 폴리펩티드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 항체 또는 단편에 융합된, 단리된 폴리펩티드.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 항체 또는 단편을 추가로 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서, Fc 단편을 추가로 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  41. 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 26으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편; 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38로 이루어진 군으로부터 선택되는 b-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드; 및 서열 번호 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 상기 융합 단백질은 링커 펩티드(예를 들어, GGGSGGGGS)를 추가로 포함하며, 상기 융합 단백질은 단일쇄 폴리펩티드인, 융합 단백질.
  43. 제42항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이량체 폴리펩티드를 형성하는 것인, 융합 단백질.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  45. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 감쇠된 이펙터 기능을 갖는 Fc를 포함하는, 융합 단백질.
  46. 제41항 내지 제43항 및 제45항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산을 포함하는 벡터.
  47. 알츠하이머병의 증상을 개선하기 위한, 제36항 내지 제40항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 뇌 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  49. 대상체의 체내로 제48항의 약제학적 조성물을 도입하는 단계를 포함하는 뇌 아밀로이드 베타의 증가된 수준을 갖는 대상체의 뇌 내의 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법.
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