CN111886240A - 血脑屏障迁移化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了一种淀粉样蛋白‑β结合肽的大脑穿透组合物。这在阿尔茨海默病的治疗中可能是有用的，例如作为双功能分子，所述双功能分子包括血脑屏障跨越抗体和通过Fc片段连接的淀粉样蛋白‑β靶向肽，所述双功能分子能够跨越血脑屏障迁移至大脑，以及包括所述双功能分子的组合物。公开了使用该组合物治疗阿尔茨海默病的方法。

Description

血脑屏障迁移化合物及其用途
技术领域
本发明涉及迁移过血脑屏障的化合物，及其用途。更具体地，本发明涉及化合物、融合蛋白和其组合物以及其在治疗阿尔茨海默病中的用途，所述化合物可包括跨越血脑屏障的抗体或其片段、免疫球蛋白Fc结构域或其片段，以及结合β-淀粉样蛋白的多肽。
背景技术
神经退行性疾病(诸如阿尔茨海默病和帕金森病)，给我们老龄化的社会带来了越来越大的负担，因为对于这些致残(disabling)病症目前还没有有效的治疗。阿尔茨海默病(AD)是一种不可逆转的神经退行性紊乱，影响着65岁年龄以上人口中约15％的人并且是导致老龄人口进行性智力和认知衰竭的主要原因(Hardy等人，2014年)。
在AD中，胆碱能神经元严重丧失，导致乙酰胆碱(ACh)水平下降，乙酰胆碱(ACh)是参与记忆处理和储存的关键神经递质。此外，神经递质谷氨酸引起的兴奋性毒性也参与了AD的发病机制。因此，胆碱能增强和/或抑制谷氨酸毒性可能改善AD的认知功能。事实上，FDA批准的唯一用于治疗AD的药物是乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂(例如多奈哌齐、利凡斯明、加兰他敏)，以防止ACh的丧失，和特定谷氨酸受体抑制剂(例如美金刚)(Mangialasche等人，2010年；Ji和Ha，2010年；Savonenko等人，2012年)。然而，这些对症药物的有益效果是有限的和短暂的，提供了认知功能的暂时改善，并不能阻止疾病的进展。虽然考虑了其他治疗，包括抗氧化剂、抗炎药(NSAIDS)、降胆固醇药物和雌激素治疗，但这些治疗似乎都没有任意长期的益处，特别是在改善AD患者的记忆和认知功能方面(Magialasche等人，2010年；Ji和Ha，2010年)。
阿尔茨海默病的一个主要标志是39-43个氨基酸的肽β-淀粉样蛋白(Aβ)以聚集体和斑块的形式在大脑中积累。基于遗传、病理和生化研究的大量证据表明，Aβ，特别是其寡聚物聚集体，在AD病理的发展中发挥着核心作用(Hardy等人，2014年；DeLaGarza，2003年；Selkoe和Hardy，2016年)。根据淀粉样蛋白假说，大脑中Aβ的产生和清除的长期失衡导致其随着年龄的增长而积累和聚集。这些Aβ聚集体被认为启动了一系列事件，导致突触丧失和神经元功能丧失，导致记忆和其他认知功能的进行性丧失(Hardy等人，2014年；DeLaGarza，2003年；Selkoe和Hardy，2016年；Sengupta等人，2016年)。
从Aβ前体蛋白APP生成Aβ是通过蛋白酶β和γ分泌酶对APP的顺序蛋白水解而实现的(Barageb和Sonawane，2015年)。这些酶的抑制剂已被证明可以减少Aβ的产生，并正在被开发为治疗AD的潜在药物(Hardy等人，2014年；Mangialasche等人，2010年；Selkoe和Hardy，2016年；Ji和Ha，2010年)。同样，隔离(sequester)和/或促进Aβ清除的试剂也在开发中。其中值得注意的是AD疫苗免疫疗法的发展。在转基因AD动物模型和涉及AD患者的临床试验中，已证明主动免疫(Aβ肽)和被动免疫(Aβ抗体)都有效地防止淀粉样蛋白沉积物和清除预先形成的淀粉样蛋白斑块(Mangialasche等人，2010年；Ji和Ha，2010年；Morrone等人，2015年；LannFet等人，2014年；Selkoe和Hardy等人，2016年；Goure等人，2014年)。
正在开发β和γ分泌酶抑制剂(例如，达仑氟比利、赛马西特、verubecestat)，以防止淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的蛋白水解，并从而减少或抑制大脑Aβ的产生。然而，它们在减少Aβ负担方面的疗效尚不清楚，并且其中许多药物在临床前或临床试验中都失败了(Savonenko等人，2012年；Musiek和Holtzman，2015年)。此外，由于这些酶还参与处理其他酶和信号分子(诸如与神经元发育有关的Notch)(Savonenko等人，2012年；Musiek和Holtzman，2015年)，这些抑制剂可能有严重的非特异性副作用。
诸如主动免疫(Aβ疫苗，AN1792)和被动免疫(例如，Bapineuzumab、Solanezumab、Crenezumab、Aducanumab等)等免疫治疗方法已被证明在减少转基因动物的Aβ沉积物和部分消除记忆缺陷方面相当有效(Monsonego和Weiner，2003年；Bard等人，2000年，Sevigny J等人，2016年)。几项使用主动和被动免疫的临床试验表明，在认知适度改善的情况下，大脑Aβ沉积物减少。然而，由于AD患者的严重炎症反应(脑膜脑炎表现)、血管源性水肿和微小出血，临床试验不得不放弃。尽管有这些限制，免疫疗法方法表明，有效隔离Aβ，并防止其沉积和毒性的试剂，有可能成为阻止AD进展，甚至可以阻止其发展的有效药物(Rafii和Aisen，2015年，Selkoe和Hardy，2016年)。
AD和其他起源于大脑的疾病的治疗和早期诊断仍然具有挑战性，因为大多数合适的治疗分子和诊断无法穿透紧密和高度限制性的血脑屏障(BBB)(Abbott，2013年)。BBB构成由排列血管的脑内皮细胞(BEC)并通过紧密连接相互连接形成的物理屏障(Abbott，2013年)。BEC之间形成的紧密连接对于BBB的完整性和阻止大于500道尔顿(Da)的分子的细胞旁运输是必不可少的。由于脑内皮细胞表现出非常低的吞噬速率(Abbott，2013年)，大分子的跨细胞运输仅限于高度特异性的受体介导的胞吞转运(RMT)途径，以及被动的基于电荷的吸附介导的胞吞转运(Abbott，2013年；Pardridge，2002年)。此外，高密度的外排泵(诸如P-糖蛋白或多药耐药蛋白-1(MDR-1))，有助于从大脑中清除不需要的物质(Abbott，2013年)。
虽然所有这些特征都能保护大脑免受病原体和毒素的侵袭，但它们也同样能阻止大多数治疗药物的进入。事实上，只有不到5％的小分子治疗药物和几乎没有一种较大的治疗药物可以在药理学上相关的浓度(即足以结合中枢神经系统(CNS)靶点并引发药理学/治疗反应)跨越BBB，除非它们被专门‘运送’，即偶联到转运蛋白分子上。由于缺乏有效的“载体”来跨越BBB转运分子，许多治疗神经退行性疾病的药物因为不能被足够的量递送至大脑而被“搁置”或被淘汰。
尽管对AD的分子机制的了解有了长足的进步，但目前还没有有效的药物或治疗可以防止该病的进展或治愈该病。此外，缺乏大容量和高选择性的BBB载体阻碍了对起源于大脑的疾病(包括脑瘤和神经退行性疾病)的新的治疗和诊断的发展。
发明内容
本发明涉及迁移过血脑屏障的化合物或组合物，及其用途。
本发明提供了结合beta-淀粉样蛋白(β-淀粉样蛋白)的肽。结合β-淀粉样蛋白的肽(或蛋白)可以选择性地结合病理上相关的β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)聚集体，并且在本文中简称为ABP，其中，本文的ABP包括任意ABP肽、ABP变体、任意C-末端切割的ABP，或其等效功能性β-淀粉样蛋白结合肽。本发明提供结合β-淀粉样蛋白的特异性ABP肽种(peptidespecies)，并且有利地提供功能性β-淀粉样蛋白结合肽的混合物，并从而提供包括所述特异性ABP肽的稳定和功能性融合蛋白的混合物。
本发明另外提供融合蛋白(本文也称为化合物、组合物、单链多肽或构建体)，其包括连接至能跨越血脑屏障(BBB)的抗体或其片段的β-淀粉样蛋白(β-淀粉样蛋白)结合肽(本文提供的任意ABP)，其中，本文BBB指的是迁移过血脑屏障的载体抗体或片段的缩写。在一个实施方案中，融合蛋白包括ABP和BBB载体，或其片段，其中，所述融合蛋白的ABP和BBB组分可以通过Fc区域或其部分连接。在一个实施方案中，包括ABP和BBB的融合蛋白进一步包括免疫球蛋白效应器结构域(称为Fc)，或其片段，其中，融合蛋白的ABP和BBB组分可以通过Fc区域或其部分连接。例如，本发明的构建体进一步可以包括接头(L)，其中，L是小连接肽或类肽链。包括BBB-Fc-ABP的单链多肽可以通过Fc形成二聚体，从而使得融合蛋白能够二聚化。本发明的化合物可以被称为融合蛋白、构建体、融合分子、制剂或组合物。
包括BBB-Fc-L-ABP融合蛋白的单链多肽可以通过Fc二聚化形成二聚体，其中，所述BBB-Fc-L-ABP可以是关于ABP的同源二聚体或异源二聚体。也就是说，所提供的BBB-Fc-L-ABP融合蛋白可以是单链多肽或其二聚体多肽，二聚体可以是其中两个ABP臂都是功能性(ABP和/或C-末端切割的功能性ABP)的同源二聚体，或者二聚体可以是包括功能性ABP臂(ABP或C-末端切割的功能性ABP)和非功能性ABP臂，或者包括两个功能性的ABP臂的异源二聚体。术语“功能性”表示能够结合β-淀粉样蛋白的ABP肽，诸如具有SEQ ID NO:31(40aa)及其C-末端切割功能性产物的共同序列，或具有SEQ ID NO:46(29aa)的共同序列的肽；而术语“非功能性”表示使得ABP不能与β-淀粉样蛋白结合的任意C-末端切割产物。Fc的二聚化可能是通过在包括BBB-Fc-ABP的构建体中两个Fc CH3结构域之间的大的紧密堆积的疏水界面的相互作用来介导的。应当注意，本文BBB-Fc-ABP和BBB-Fc-L-ABP是指关于包括BBB、Fc部分和ABP的单链多肽融合蛋白的等效简称，其中，融合蛋白的每个组分通过任意合适的接头连接或偶联以形成能够迁移过血脑屏障的β-淀粉样蛋白结合融合蛋白。BBB、Fc、ABP和接头(L)可以是本文提供的任意BBB、Fc、ABP或L。在一个实施方案中，BBB是FC5(例如SEQ IDNO:17)，Fc是hFc1X7(例如SEQ ID NO:49)，ABP是β-淀粉样蛋白结合肽，诸如具有SEQ IDNO:31(40aa)的任意肽(例如ABP(6G)SEQ ID NO:36(40aa))或其任意β-淀粉样蛋白结合C-末端切割产物(例如SEQ ID NO:37(38aa)、SEQ ID NO:38(37aa)、SEQ ID NO:39(36aa)、SEQID NO:40(35aa)、SEQ ID NO:41(34aa)、SEQ ID NO:42(33aa)或SEQ ID NO:43(32aa))或任意包括或由SEQ ID NO:46(29aa)组成的肽(例如SEQ ID NO:47(29aa))；并且L可以是(GGGGS)n、(GGGS)n或其任意合适的接头，例如T(GGGGS)2。应当理解，所提供的融合蛋白不限于特定的接头并且可以是允许融合蛋白的每个组分的可操作生物学功能(即血脑屏障迁移和β-淀粉样蛋白结合)的任意接头。例如，本发明的融合蛋白可以是SEQ ID NO:56、71中提供的FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)或其任意等效(equivalent)的融合蛋白，诸如包括本文提供的任意β-淀粉样蛋白结合蛋白或其C-末端切割产物的融合蛋白。
其等效融合蛋白可以包括任意β-淀粉样蛋白结合蛋白(SEQ ID NO:31)，SEQ IDNO:36的C-末端切割产物(例如，SEQ ID NO:37至SEQ ID NO 43)，或包括或由SEQ ID NO:46组成的蛋白，或其等效的β-淀粉样蛋白结合蛋白。例如，C-末端切割ABP可以包括SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQID NO:43的序列。
所提供的BBB-Fc-ABP构建体可以是单链多肽(称为单链融合蛋白的单体)或其二聚体多肽。包括两个单链多肽的二聚体肽可以是同源二聚体-两个ABP肽是相同的(例如，两个SEQ ID NO:36)；或者二聚体肽可以是异源二聚体(例如，SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:40，或SEQ ID NO:31至47的任意组合)-二聚体的ABP肽可以是任意两个不同的序列，其中，单链的APB肽中的两个或至少一个选自由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43组成的组。形成二聚体的单链多肽的ABP肽可以是任意生物学功能性β-淀粉样蛋白结合ABP肽；具体地，选自以下项组成的组任意ABP：SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、44、45、46、47或C-末端切割的生物学功能性SEQ ID NO:36产物(具体地，SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43或其任意组合)。
包括两个BBB-Fc-L-ABP单链多肽的二聚体肽可以包括两个不同的ABP序列，其中，所述ABP序列中的至少一个是生物学功能性分子(即能结合β-淀粉样蛋白)。相当有利的且意想不到的是，二聚体肽可以容纳单一的非功能性ABP肽并且仍然保持关于β-淀粉样蛋白结合的等效的功能性生物活性。在包括两个不同的ABP序列的二聚体(即，关于ABP的异源二聚体)中，当在异源二聚体中提供两个功能性ABP肽时，在所述异源二聚体中提供的ABP肽中的至少一个是生物学功能性ABP，即SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或其任意组合。异源二聚体中的两个ABP肽不一定都是生物学功能性β-淀粉样蛋白结合蛋白，至少有一个具有生物学功能性ABP肽的异源二聚体保持了融合蛋白关于β-淀粉样蛋白结合活性的总体生物活性。有利的是，异源二聚体能容纳单个非功能性ABP肽并且保持为生物学有效的异源二聚体。这一优点有助于所提供的融合蛋白的可制造性，并使得生物学活性产物的混合物的产率显著提高。
本发明提供了一种结合β-淀粉样蛋白的经分离肽，其包括或由以下氨基酸序列组成：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
其中，X1＝K、G或者A，X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，(SEQ ID NO:46；29aa)。
本发明提供了一种结合β-淀粉样蛋白的经分离肽，其包括或由以下氨基酸序列组成：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI(SEQ ID NO:31；40aa)
其中，X1＝K、G或者A，X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，X7＝K、G或者V，X8＝R、G或者A，X9＝K、G或者A，
或其任意C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合产物。
经分离肽氨基酸序列包括选自由以下序列组成的组的序列：
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:32；40aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:33；40aa)；
KTFKTRGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:34；40aa)；
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:35；40aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:36；40aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK(SEQ ID NO:37；38aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV(SEQ ID NO:38；37aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR(SEQ ID NO:39；36aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS(SEQ ID NO:40；35aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK(SEQ ID NO:41；34aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL(SEQ ID NO:42；33aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ(SEQ ID NO:43；32aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTVKNI(SEQ ID NO:44；35aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRG(SEQ ID NO:45；29aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGG(SEQ ID NO:47；29aa)；和
与其基本等效的序列，或其C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合肽。还提供了C-末端切割一个氨基酸(即异亮氨酸的缺失)，以产生39个氨基酸的切割产物。在共同序列SEQ IDNO:31中，X10＝1或没有氨基酸(即，氨基酸X10从SEQ ID NO:30中缺失)，其中，可以在39aa肽的C-末端而不是第40个氨基酸的C-末端处存在-OH基团。(SEO ID NO:31)
更具体地，C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合肽包括选自由以下序列组成的组的序列：
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK(SEQ ID NO:37；38aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV(SEQ ID NO:38；37aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR(SEQ ID NO:39；36aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS(SEQ ID NO:40；35aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK(SEQ ID NO:41；34aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL(SEQ ID NO:42；33aa)；和
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ(SEQ ID NO:43；32aa)。
本发明的任意经分离肽都可以与能够迁移过血脑屏障的抗体或抗体片段融合。所述经分离肽可以连接至Fc片段，其中，所述经分离肽、所述抗体或其片段，与所述Fc片段形成单链多肽融合蛋白。在一个实施方案中，Fc片段包括具有减弱效应器功能的Fc。
因此，本发明提供了包括本文提供的任意经分离肽，以及迁移过血脑屏障(BBB)的抗体或抗体片段的融合蛋白。该融合蛋白可以是进一步包括Fc片段的单链多肽，其中，该单链多肽形成二聚体。，二聚体可以是关于该二聚体中包括的ABP的同源二聚体或异源二聚体，并且异源二聚体可以是双功能性(两个功能性ABP臂)或单功能性的(只有一个功能性ABP臂)。非常有利的是，无论其中包括的功能性ABP蛋白如何，单功能性二聚体都等效于双功能性二聚体。也就是说，例如，异源二聚体能包括在二聚体的一条臂上具有SEQ ID NO:37，在二聚体的另一臂上具有SEQ ID NO:41的ABP，或者能包括在二聚体的一臂上具有SEQID NO:43，另一臂上具有非功能性ABP的ABP，并且这两个二聚体有利地表现出等效的β-淀粉样蛋白结合功能性。这有利地使得能够生产具有等效功能性的二聚体的混合物，从而使得产物产率能够增加。
因此，提供了融合蛋白，其中，所述二聚体是关于ABP的同源二聚体或异源二聚体，并且包括至少一个能够结合β-淀粉样蛋白的ABP。
所提供的单链多肽可以包括抗体或其抗体片段、结合β-淀粉样蛋白的肽，和Fc片段。单链多肽可以进一步包括使得结合β-淀粉样蛋白的肽能够连接至Fc片段的任意合适的接头。抗体或其片段可以偶联或连接至Fc，并且ABP可以通过任意合适的接头连接至Fc以形成单链多肽。所提供的融合蛋白不限于包括本文提供的接头，并且可以包括任意合适的接头，所述接头使得各组分(即抗体、Fc和ABP)能够连接以形成与本文提供的融合蛋白等效的融合蛋白。
抗体或其片段可以是选自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26组成的组的任意抗体；结合β-淀粉样蛋白的肽选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，和SEQ ID NO:47组成的组；并且Fc片段选自由SEQ IDNO:SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50组成的组。
抗体或其片段可以包括序列，所述序列包括的互补决定区(CDR)1序列GFKITHYTMG(SEQ ID NO:1)、CDR2序列RITWGGDNTFYSNSVKG(SEQ ID NO:2)、CDR3序列GSTSTATPLRVDY(SEQ ID NO:3)。具体地，抗体或其片段包括选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17任一序列以及与上述任意序列基本相同的序列的序列。
抗体或其片段可以包括选自由以下序列组成的组的序列：
抗体或其片段，包括CDR1序列EYPSNFYA(SEQ ID NO:4)、CDR2序列VSRDGLTT(SEQID NO:5)、CDR3序列AIVITGVWNKVDVNSRSYHY(SEQ ID NO:6)；
抗体或其片段，包括CDR1序列GGTVSPTA(SEQ ID NO:7)、CDR2序列ITWSRGTT(SEQID NO:8)、CDR3序列AASTFLRILPEESAYTY(SEQ ID NO:9)；以及
抗体或其片段，包括CDR1序列GRTIDNYA(SEQ ID NO:10)；CDR2序列IDWGDGGX(SEQID NO:11)，其中X为A或者T；CDR3序列AMAROSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO:12)。
具体地，抗体或其片段可以包括选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26和/或与其基本相同的序列的任一序列的序列。
抗体或其片段可以是人源化的。抗体或其片段可以是单域抗体(SdAb)。
包括抗体或其片段的融合蛋白单链多肽通过Fc片段连接至结合β-淀粉样蛋白的肽。单链多肽可以包括选自由SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71和与其基本相同的序列组成的组中的任意序列。单链多肽可以形成二聚体，具体地，包括所提供的任意单链多肽的同源二聚体，或包括所提供的单链多肽中的至少一种的异源二聚体。
融合蛋白可以是包括任意合适的肽接头的单链多肽。肽接头可以包括使得融合蛋白的连接组分能够保持其不受限制的所期望的生物学功能的任意氨基酸序列。例如，肽接头可以包括(GGGS)n、(GGGGS)n，或任意合适的肽连接序列的序列。
在一个实施方案中，提供的单链多肽形成二聚体多肽，其中，所述二聚体多肽包括关于二聚体多肽中包括的β-淀粉样蛋白结合蛋白(ABP)的同源二聚体或异源二聚体。异源二聚体可以包括至少一个能够结合β-淀粉样蛋白的功能性ABP。
融合蛋白的Fc片段可以是小鼠Fc2a或人Fc1；并且可以包括Fc片段，所述Fc片段包括SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50。
在一个实施方案中，融合蛋白包括连接至Fc片段的N-末端的抗体或其片段，和连接至Fc片段的C-末端的结合β-淀粉样蛋白的多肽；其中，所述抗体或片段是本文提供的任意抗体，例如，包括SEQ ID NO:1、2、3的CDR(FC5)；SEQ ID NO:4、5、6的CDR(IGF1R-3)，SEQID NO:7、8、9的CDR(IGF1R-4)；SEQ ID NO:14至SEQ ID NO:17(FC5抗体)；或SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:26(IGF1R抗体)。
在另一实施方案中，融合蛋白包括连接至Fc片段的C-末端的抗体或其片段，和连接至Fc片段的N-末端结合β-淀粉样蛋白的多肽；其中，所述抗体或片段是任意抗体或片段，包括：SEQ ID NO:4、5、6的CDR(IGF1R-3)，SEQ ID NO:7、8、9的CDR(IGF1R-4)；SEQ ID NO:10、11、12的CDR(IGF1R-5)；或SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:26(IGF1R抗体)。
融合蛋白可以包括接头，其中，所述接头是连接抗体或其片段和/或连接结合β-淀粉样蛋白的多肽至Fc的独立选择的接头序列。接头可以包括序列(GGGS)n、(GGGGS)n、GGGGSGGGGS、GGGSGGGGS、本领域提供的任意合适的接头，或如SEQ ID NO:71提供的共有接头或任意合适的接头。
本发明提供了所提供的任意融合蛋白的二聚体，其中，所述二聚体包括根据SEQID NO:31至SEQ ID NO:47中的至少一种肽或其任意组合。
更具体地，融合蛋白二聚体包括两个单链多肽，其中，两个单链多肽是：包括选自SEQ ID NO:31至47中任一序列的两个ABP的双功能同源二聚体；包括选自SEQ ID NO:31至47中任一序列的两个不同ABP的双功能异源二聚体；或包括选自SEQ ID NO:31至47中任一序列的一个ABP的单功能异源二聚体。
还提供了一种药物组合物，其包括SEQ ID NO:31至47中任一的经分离肽或其任意组合，和药理学上可接受的载体。该药物组合物可用于治疗患者的阿尔茨海默病。
还提供了编码本发明的任意蛋白或融合蛋白的核酸分子。提供了包括编码本发明的任意蛋白或融合蛋白的核酸分子的载体。提供了包括药物组合物的试剂盒(kit)。
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，包括将包括任意融合蛋白或其二聚体的药物组合物施用至有需要的受试者。
提供了一种降低具有升高的大脑淀粉样蛋白β水平的受试者的大脑中的有毒的β-淀粉样蛋白水平的方法，该方法包括重复非肠道施用所提供的足够量的药物组合物至受试者的步骤。非肠道施用可以是皮下或静脉施用。β-淀粉样蛋白水平的降低并不局限于大脑，并能出现在具有升高的β-淀粉样蛋白水平的受试者的大脑、组织或生物液(CSF和血液)中。
提供了方法，其中，在具有升高的大脑淀粉样蛋白β水平的受试者的大脑中提供组合物的重复非肠道施用之后，降低了有毒的β-淀粉样蛋白水平。在重复非肠道施用的四周内，减少了有毒的β-淀粉样蛋白。非肠道施用该组合物后，具有升高的中枢神经系统(CNS)β-淀粉样蛋白水平的受试者脑脊液(CSF)中的有毒的β-淀粉样蛋白水平降低。在组合物的单次非肠道施用24小时内，所提供的方法及其组合物有利地降低了具有升高的CNS水平的受试者脑脊液(CSF)中的有毒β-淀粉样蛋白水平。具体地，在具有升高的大脑淀粉样蛋白β水平的受试者中，通过包括施用提供的融合蛋白的方法，降低了有毒的β-淀粉样蛋白水平。
所述药物组合物可以包括所提供的融合蛋白的任意混合物；其中，所述融合蛋白的混合物包括ABP双功能同源二聚体融合蛋白、ABP双功能异源二聚体融合蛋白和ABP单功能异源二聚体融合蛋白或其任意组合。包括单链多肽融合的混合物的药物提供了具有等效功能性活性的功能性融合蛋白的药学上有效产率。药物组合物可以包括用于改善阿尔茨海默病症状的药学上可接受的稀释剂、载体、溶媒或赋形剂。该药物组合物可用于降低具有升高的大脑淀粉样蛋白β水平的受试者大脑中有毒的β-淀粉样蛋白水平。
本发明的化合物可用于治疗阿尔茨海默病(AD)。
结合β-淀粉样蛋白的肽可以包括选自由以下序列组成的组的序列：
SGKTEYMAFPKPFESSSSIGAEKPRNKKLPEEEVESSRTPWLYEQEGEVEKPFIKTGFSVSVEKSTSSNRKNQLDTNGRRRQFDEESLESFSSMPDPVDPTTVTKTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRNSTQLKSRVKNITHARRILQQSNRNACNEAPETGSDFSMFEA(SEQ ID NO:27；174aa)；
FSSMPDPVDPTTVTKTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSK(SEQ ID NO:28；40aa)；
KDKTPKSKSKKRNSTQLKSRVKNITHARRILQQSNRNACN(SEQ ID NO:29；40aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRNSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:30；40aa)；
提供了一种结合β-淀粉样蛋白的肽，包括序列：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI
其中，X1＝K、G或者A，X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，X7＝K、G或者V，X8＝R、G或者A，X9＝K、G或者A(SEQ ID NO:31，40aa)，或其C-末端切割蛋白[SEQ ID NO:37(38aa)至SEQ ID NO:43(22aa)]。
在SEQ ID NO:31的共同序列中，还提供了可变氨基酸处替换的变体；其中，X1＝G或A；X2＝G或V；X3＝G或A，X4＝G或A，X5＝G或V；或SEQ ID NO:31中的这些氨基酸替换的任意组合。
还提供了一种结合β-淀粉样蛋白的肽，其包括序列：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTTPKSKKX5X6
这里，X1＝K、G或A，X1＝G或A，X2＝K、G或V，X3＝R、G或A，X4＝K、G或A，X5＝R、G或V，X6＝N、G或V，(SEQ ID NO:46；29aa)。
在SEQ ID NO:46的共同序列中，还提供了可变氨基酸处替换的变体；其中，X1＝G或A；X2＝G或V；X3＝G或A，X4＝G或A，X5＝G或V；或SEQ ID NO:46中的这些氨基酸替换的任意组合。
X在特定的非限制性实施方案中，ABP、其变体或其C-末端产物可以包括选自以下任一序列的序列：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI
其中，X1＝K、G或者A，X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，X7＝K、G或者V，X8＝R、G或者A，X9＝K、G或者A，(SEQ ID NO:31，40aa)，
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:32；40aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:33；40aa)；
KTFKTRGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:34；40aa)；
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:35；40aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:36；40aa)；或SEQ IDNO:36的C-末端切割产物，其中，C-末端缺失一个氨基酸(异亮氨酸)。
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK(SEQ ID NO:37；38aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV(SEQ ID NO:38；37aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR(SEQ ID NO:39；36aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS(SEQ ID NO:40；35aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK(SEQ ID NO:41；34aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL(SEQ ID NO:42；33aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ(SEQ ID NO:43；32aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTVKNI(SEQ ID NO:44；35aa)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRG(SEQ ID NO:45；29aa)；
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
其中，X1＝K、G或A，X1＝G或A，X2＝K，G或V，X3＝R、G或A，X4＝K、G或A，X5＝R、G或V，X6＝N、G或V，(SEQ ID NO:46；29aa)；和
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGG(SEQ ID NO:47；29aa)
或与上述任意序列基本相同的序列，其能够结合β-淀粉样蛋白。
结合β-淀粉样蛋白的ABP可以包括选自由以下序列组成的组的肽序列：SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47。包括或由肽序列组成的组的ABP可以被称为ABP、ABP变体、C-末端切割产物或任意等效β-淀粉样蛋白结合肽，所述肽序列选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47。本发明额外包括具有共同序列SEQ ID NO:31或其C-末端功能性产物，或共同序列SEQ ID NO:46的ABP序列；例如，ABP可以包括序列SEQ ID NO:32至SEQ IDNO:36，或SEQ ID NO:36的任意C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合产物(即SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:43)，或包括SEQ ID NO:46的β-淀粉样蛋白结合蛋白。C-末端切割产物可以是SEQ ID NO:36的任意C-末端切割，其中，C-末端切割产物能够结合β-淀粉样蛋白，是在哺乳动物表达系统中表达和生产融合蛋白期间具有肽稳定性的等效稳定肽序列。例如，本发明的ABP变体可以表现出比现有技术的ABP肽(Ref.WO2006/133566)更好的肽稳定性。
本发明提供了一种结合β-淀粉样蛋白的经分离多肽，所述结合β-淀粉样蛋白的经分离多肽可以包括选自由共同序列SEQ ID NO:31或共同序列SEQ ID NO:46或其任意β-淀粉样蛋白结合肽序列组成的组的序列。例如，本发明的β-淀粉样蛋白结合肽可以包括选自由以下序列组成的组的序列：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47，或包括等效稳定的多肽序列的序列。
本发明提供融合蛋白，所述融合蛋白包括或由ABP组成，所述ABP选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46，和SEQ ID NO:47，或包括等效多肽序列的序列。在非限制性实例中，ABP变体可以包括序列
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:35；40aa)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:36；40aa)或其任意β-淀粉样蛋白结合C-末端切割产物，诸如包括或由SEQ ID NO:46；29aa组成的任意肽。
本发明的融合蛋白可以包括迁移跨越血脑屏障(BBB)(如上所述，BBB是迁移过血脑屏障的抗体载体的缩写)的抗体或其片段。抗体或其片段(BBB)可以与大脑内皮细胞表面受体表位结合，从而使得能够迁移跨越血脑屏障。例如，这种表面受体表位可以是TMEM30A或胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)表位，或其异构体、变体、部分或片段。
所述抗体或其片段可以包括选自由以下序列组成的组的序列：
抗体或其片段，包互补决定区(CDR)1序列括GFKITHYTMG(SEQ ID NO:1)、CDR2序列RITWGGDNTFYSNSVKG(SEQ ID NO:2)、CDR3序列GSTSTATPLRVDY(SEQ ID NO:3)；
抗体或其片段，包括CDR1序列EYPSNFYA(SEQ ID NO:4)、CDR2序列VSRDGLTT(SEQID NO:5)、CDR3序列AIVITGVWNKVDVNSRSYHY(SEQ ID NO:6)；
抗体或其片段，包括CDR1序列GGTVSPTA(SEQ ID NO:7)、CDR2序列ITWSRGTT(SEQID NO:8)、CDR3序列AASTFLRILPEESAYTY(SEQ ID NO:9)；和
抗体或其片段，包括CDR1序列GRTIDNYA(SEQ ID NO:10)，CDR2序列IDWGDGGX(SEQID NO:11)；其中，X是A或T，CDR3序列AMARQSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO:12)。
所述抗体或其片段可以包括选自由以下序列组成的组的序列：
X1VQLVX2SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX3RQAPGKX4X5EX6VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX7YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)，其中，X1＝D或E，X2＝A或E，X3＝F或V，X4＝E或G，X5＝R或L，X6＝F或W，X7＝L或V；
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5ASEYPSNFYAMSWX6RQAPGKX7X8EX9VX10GVSRDGLTTLYADSVKGRFTX11SRDNX12KNTX13X14LQMNSX15X16AEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSYHYWGQGTX17VTVSS(SEQ ID NO:18)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是V或A；X6是F或V；X7是E或G；X8是R或L；X9是F或W；X10是A或S；X11是M或I；X12是A或S；X13是V或L；X14是D或Y；X15是V或L；X16是K或R；以及X17是Q或L；
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX10VX11HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWGQGTX19VTVSS(SEQ ID NO:21)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是A或E；X6是V或A；X7是V或F；X8是G或E；X9是L或R；X10是F或W；X11是G或S；X12是V或Y；X13是D或G；X14是N或S；X15是A或S；X16是L或V；X17是K或R；X18是A或S；以及X19是L或Q；和
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS(SEQ ID NO:24)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是V或S；X6是D或G；X7是L或R；X8是F或W；X9是A或S；X10是A或T；X11是A或S；X12是G或N；X13是M或L；X14是N或R；X15是E或R；X16是P或A；X17是S或Y；以及X18是Q或L。
在一些特定的非限制性实施方案中，所述抗体或其片段可以包括选自以下任一序列的序列：
DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWG KGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASEYPSNFYAMSWFRQAPGKEREFVAGVSRDGLTTLYADSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSVKAEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRS YHYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:19)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYPSNFYAMSWFRQAPGKEREFVSGVSRDGLTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSY HYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHITWSRGTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:22)；
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHITWSRGTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYD YWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:25)；
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARY DYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:26)；和
与上述任一序列基本相同的序列。
BBB可以是抗体或其片段。在一个实施方案中，BBB可以是单域抗体(SdAb)。SdAb可以是人源化的。
在一个实施方案中，抗体或其片段(BBB)可以连接至Fc或其片段，其中，BBB-Fc构建体可以形成二聚体。本发明进一步提供了一种包括BBB-Fc-L-ABP的融合肽，其中，融合肽的BBB-Fc部分通过短肽接头(例如，少于12个氨基酸的接头)连接至ABP，并且Fc或Fc片段使得所述融合肽能够二聚化以提供二聚体，从而保护构建体不被降解并增加其血清半衰期。Fc片段可以是任意合适的Fc片段，选择所述Fc片段是为了给予所需的药代动力学，其中，Fc或Fc片段有助于融合分子的长半衰期。其他Fc或Fc片段实施方案可以调节、改变或抑制免疫效应器功能(Shields等人，2001年)。其他Fc片段实施方案可以介导从大脑中融合肽的清除(Caram-Salas N，2011)。在非限制性实例中，Fc或Fc片段可以是Fc小鼠Fc2a或人Fc1，选自SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50，以及与其基本相同的具有减弱效应器功能的序列中的任一序列，当其包括在所述融合肽中时，可以增强淀粉样蛋白从大脑中的清除。
在本发明的化合物中，BBB可以通过Fc片段和/或任意额外的合适接头L连接至ABP。
本发明的化合物包括融合蛋白；其中，所述融合蛋白包括抗体或其片段、Fc片段和结合β-淀粉样蛋白的肽。融合蛋白可以包括通过L、连接肽或化学连接物连接至Fc片段的N-末端的抗体或其片段，和连接至Fc片段的C-末端的结合β-淀粉样蛋白的肽。抗体或其片段可以连接至Fc片段的C-末端并且结合β-淀粉样蛋白的肽连接至Fc片段的N-末端。
因此，本发明提供包括单链多肽的融合蛋白，所述单链多肽包括选自由SEQ IDNO:13至SEQ ID NO:26组成的组的抗体或其片段；选自由SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:47组成的组的结合β-淀粉样蛋白的肽；通过选自由SEQ ID NO:48至SEQ ID NO:50组成的组的Fc片段连接。所提供的Fc可以包括具有减弱效应器功能的Fc。单链多肽可以形成二聚体，其中，所述二聚体可以是关于ABP的同源二聚体或异源二聚体，其中，所述同源二聚体包括功能性ABP，并且其中，所述异源二聚体包括至少一个功能性ABP。
例如，融合蛋白可以包括SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:70，或与其基本相同的序列。融合蛋白可以是单链多肽，并且融合蛋白的单链多肽可以是二聚体多肽。注意，SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:70包括的融合蛋白中提供的(GGGSGGGGS或GGGGSGGGGS)接头可以是任意合适的接头序列。例如，突出显示的接头序列(例如，GGGGSGGGGS)可以是使得能够连接所提供的融合蛋白的组分的任意等效肽连接序列，如SEQ ID NO:71中所示，其中，所述接头可以是任意肽或化学接头。
在一个实施方案中，BBB可以连接至Fc片段，从而形成二聚体。Fc片段可以是具有减弱效应器功能的任意合适的Fc片段，例如小鼠Fc2a或人Fc1(Shields等，2001年)。
本发明的ABP可以包括序列SEQ ID NO:31，例如，ABP肽可以是选自以下任一序列的序列：SEQ ID NO:32至36，或SEQ ID NO:36的C-末端切割功能性产物，具体地，SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43，或SEQ ID NO:46的肽，其中，任一所提供的ABP肽是功能性β-淀粉样蛋白结合肽。本文提供的ABP与现有技术的ABP多肽相比显示出意想不到的显著优点。更具体地，本发明提供的ABP表现出更高的稳定性和生物可制造性。此外，本文提供的包括ABP的本发明的化合物或组合物，当通过本文提供的接头和/或Fc片段连接至BBB时，在迁移过血脑屏障方面表现出协同的和意想不到的效果。当通过本文提供的选择的Fc片段与BBB偶联时，这种ABP变体提供了意想不到的、快速的和改善的Aβ从大脑中的清除。此外，本发明的包括本文提供的ABP变体的融合蛋白在迁移过BBB和改善Aβ从大脑中的清除方面表现出协同和意想不到的效果。本发明的融合蛋白可以包括SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:47中任一ABP。本发明的组合物可以包括任意融合蛋白的混合物，所述融合蛋白包括具有SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:47的任意ABP的单链肽或其二聚体。
因此，提供了一种治疗组合物，所述治疗组合物包括迁移过血脑屏障抗体或其片段(BBB)、Fc(Fc)，连接至结合β-淀粉样蛋白的肽(ABP或ABP变体，或其C-末端切割产物)，其中，所述肽协同增加了所提供的治疗组合物的稳定性和有效性。如所示，出人意料且最显著的是，与在动物(AD小鼠模型)中进行三个月的多次游离ABP处理(图9A)相比，单剂(singlebolus)BBB-Fc-ABP在治疗后24小时内将大脑Aβ负担降低了50％(图9B)。因此，本文提供的化合物在降低大脑Aβ负担方面远比游离的ABP强得多。此外，与游离ABP或BBB-ABP(WO2006/133566)相比，这种包括Fc的融合蛋白提供了更长的血清半衰期，从而提供了一种改善的治疗化合物(图10)。
本发明的ABP变体和包括ABP的融合蛋白(其构建体)克服了现有技术的缺点。在现有技术中，仅将ABP与BBB载体(WO2006/133566)连接并不能确保产生有效的分子。包括旨在增强血清半衰期的Fc的融合体并不能确保ABP有效地跨越血脑屏障转运。包括BBB载体、Fc片段和ABP的融合分子的特定设计和制定(formulation)提供了有效的BBB穿透性治疗化合物。所提供的高效血脑屏障穿透性治疗组合物包括BBB-Fc-ABP的特定设计和制定，其中，所述制定在化合物稳定性和有效性方面表现出协同改善。如图9所示，在包括所述融合蛋白构建体的组合物中提供了融合组合物的稳定性的意外增加，以及血脑屏障迁移效率的协同增加和更快地(在24小时内)从大脑中清除Aβ。
本文提供的ABP C-末端切割产物(例如，SEQ ID NO:37至43和SEQ ID NO:46至47)有利地提供了特定的新颖且意想不到的功能性蛋白子集，其使得在能够结合β淀粉样蛋白的功能性融合蛋白的可分离混合物中能够提高产率。相当有利的是，所提供的单链多肽的融合蛋白可以包括SEQ ID NO:31至47中的任一。另外有利的是，所述单链多肽的二聚体可以是同源二聚体、异源二聚体、单功能异源二聚体或其任意组合。这在用于药物组合物的所述融合蛋白的生产中尤其重要和有利，其中，所述药物组合物可以包括本文提供的任意融合蛋白(包括SEQ ID NO:53到SEQ ID NO:71中的任一的同源或异源二聚体；其中，其ABP可以是选自由SEQ ID NO:31到SEQ ID NO:47组成的组中的任意ABP)，或其任意组合。
本文提供的化合物可以被称为化合物、融合蛋白、制剂、组合物或构建体。所提供的构建体可以包括抗体或其片段(可以缩写为BBB)、Fc片段(缩写为Fc)，和结合β-淀粉样蛋白的多肽(缩写为ABP)。所提供的构建体或组合物(本文可缩写为BBB-Fc-ABP或BBB-Fc-L-ABP)包括协同克服现有技术中有关血脑屏障迁移、效力和化合物稳定性遇到的缺陷的组分。因此，本文提供的化合物包括在血脑屏障迁移、治疗效果和化合物稳定性方面具有优异和意想不到的效果的新制剂。
现有技术中存在Fc融合可以增加血清半衰期的情况，尽管Fc融合不一定会增加血清半衰期。此外，Fc融合不一定能改善跨越血脑屏障的迁移。
本发明提供一种结合β-淀粉样蛋白的肽，所述肽序列可以选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47或其在肽稳定性基本相同的序列或其β-淀粉样蛋白结合C-末端切割的功能性产物。
本发明提供了一种结合β-淀粉样蛋白的肽，其中，当所述肽序列被称为ABP，或ABP变体、或其C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合功能性产物时，其中，所述ABP可以包括SEQ IDNO:31或者SEQ ID NO:46，并可以选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和在肽稳定性或β-淀粉样蛋白结合活性上基本相同的序列，例如SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:46的任意序列变体。具有共同序列SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:46的ABP变体克服了现有技术在多肽稳定性方面的缺点。此外，包括本发明的ABP的化合物表现出改善的化合物稳定性和生物可制造性。再则，包括本文提供的ABP或ABP变体的化合物表现出协同的和意想不到的治疗改善。
本发明的ABP可以包括选自SEQ ID NO:31到SEQ ID NO:47任一的，以及保持β-淀粉样蛋白结合活性的等效稳定的多肽序列或C-末端切割产物。本发明的ABP变体优于现有技术的ABP序列，其中，本ABP变体多肽表现出改善的稳定性(如图2A和图16之间的比较所示)。
本发明还提供包括本发明的ABP或ABP变体的融合蛋白(也称为化合物、构建体，或融合分子)。融合蛋白可以包括Fc片段。融合蛋白可包括迁移过血脑屏障的抗体或其片段、Fc片段，和β-淀粉样蛋白结合多肽序列，所述β-淀粉样蛋白结合多肽序列选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:36，或SEQ ID NO:36的C-末端切割产物(即SEQ IDNO:37-43)，或包括或由SEQ ID NO:46组成的ABP(例如，SEQ ID NO:47)。提供的BBB-Fc-ABP制定在化合物稳定性和从大脑中去除有毒的淀粉样蛋白的治疗效果方面显示出协同改善作用。
本文可称为BBB-Fc-ABP的融合蛋白或构建体可以关于其包括的组分在取向上变化。在本发明的化合物中，融合蛋白形成二聚体(如图1所示)，其中，融合肽通过Fc区域二聚化。例如，在一个实施方案中，所提供的化合物可以包括融合蛋白，所述融合蛋白包括连接至Fc片段(Fc)的N-末端的BBB和通过附接至C-末端的短肽接头连接至Fc片段的C-末端的ABP或ABP变体(ABP)(图1A，其中化合物被示为融合蛋白的二聚体)，如图1Ai、1Aii和1Aiii进一步所示，其中，如图1Ai所示的二聚体是具有两个功能性ABP肽(例如，任意β-淀粉样蛋白结合ABP肽，诸如SEQ ID NO:36)的双功能同源二聚体，或如图1Aii所示的双功能异源二聚体，其中，所述二聚体具有两个不同的功能性β-淀粉样蛋白结合ABP肽(ABP和/或C-末端切割ABP，例如SEQ ID NO:37至43)，或仅有一个功能性β-淀粉样蛋白结合ABP肽(ABP和/或C-末端切割ABP，1Aiii)，另一个臂具有非功能肽的单功能异源二聚体。值得注意的是，在1Ai至1Aiii的构象中，ABP或ABP变体的N-末端(融合)或C-末端(化学连接)可以被融合/连接至Fc。在一个进一步的实施方案中，所提供的化合物可以包括连接至Fc片段(Fc)的C-末端的BBB，其中，ABP或ABP变体(ABP)可以通过合适的接头(L)连接至Fc片段的N-末端(图1B)。在其他可能的构象中，BBB可以连接至ABP的N-末端，并且ABP连接至Fc片段的N-末端(图1C)。在另一种可能的构象中，BBB可以连接至ABP的C-末端，并且ABP连接至Fc片段的C-末端(图1D)。
本文提供的化合物包括融合蛋白，所述融合蛋白包括单链多肽或其二聚体，所述单链多肽选自以下序列中的任一：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71以及与任意这些序列基本相同的序列。本发明的融合蛋白是融合蛋白(BBB-Fc-ABP或BBB-Fc-L-ABP，其中，L可以是任意合适的接头)二聚体(如图1所示，优选是图1A或1B)。在非限制性实例中，所提供的化合物或融合蛋白可以包括或由多肽组成，所述多肽包括序列SEQ ID NO:35(ABP-GG-G)或SEQ ID NO:36(ABP-6G)或其C-末端切割的功能性产物(SEQ ID NO:37～43)；包括序列SEQ ID NO:17的抗体或其片段(FC5-H3)；以及包括序列SEQ ID NO:49的Fc片段(HFC1X7)。
在本发明的特定的非限制性实施方案中，所述化合物可以包括序列SEQ ID NO:55[FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(GG-G)]或SEQ ID NO:56[FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)]或其任意C-末端切割的ABP功能性产物，其中，L可以是任意合适的接头。
本发明的化合物迁移过血脑屏障。
本发明包括编码本文描述的本发明的任意化合物的核酸分子。包括本发明的融合蛋白或化合物的核酸分子的载体也包括在本发明的范围内。
本发明包括组合物，所述组合物包括本发明的化合物或融合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
包括本发明的药物组合物的试剂盒也包括在本发明的范围内。
本发明的组合物可用于治疗患者的阿尔茨海默病。
本发明的组合物可用于降低具有升高的大脑Aβ水平的受试者的大脑或CSF中的有毒的β-淀粉样蛋白(Aβ)水平。
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，其中，本发明的药物组合物可施用至需要的受试者。
本发明提供了一种降低具有升高的大脑Aβ水平的受试者的大脑中的有毒β-淀粉样蛋白(Aβ)水平的方法。本发明的方法包括给AD患者施用本发明的化合物。更具体地，本方法包括向受试者重复非肠道施用足够量的本发明药物组合物的步骤。
在本发明的方法中，非肠道施用是皮下或静脉施用。
本发明的方法在重复非肠道施用本文提供的组合物之后，降低了具有升高的大脑Aβ水平的受试者的大脑中的有毒的β-淀粉样蛋白水平。更具体地，在重复非肠道施用本发明组合物的四周内降低有毒的β-淀粉样蛋白水平。
本发明的方法在非肠道施用本发明组合物后降低受试者脑脊液(CSF)中的有毒的β-淀粉样蛋白水平。更具体地，受试者的脑脊液(CSF)中的有毒的β-淀粉样蛋白水平在单次非肠道施用本发明组合物的24小时内显著降低；其中，在24小时内显著降低高达50％。
本发明提供了一种血脑屏障穿透性单域抗体(SdAb)，其中，sdAb为骆驼FC5或其人源化版本。与VHH格式的FC5相比，在Fc上以二价形式展示的FC5已被证明具有更好的血脑屏障跨越特性(Farrington等人，2014年)。
本发明提供一种化合物，包括促进血脑屏障体外迁移的BBB，并增加融合分子的血清半衰期的Fc片段，其中，Fc融合的血清半衰期变得类似于全IgG的血清半衰期。延长FC5-Fc-ABP的血清半衰期还会增加大脑的整体暴露，这对治疗诸如阿尔茨海默病等慢性病尤为重要。
FC5-Fc-ABP融合分子和人源化FC5(H3)-hFc-ABP和IGF1R5-H2-ABP融合分子是CHO细胞产生的二聚体单链多肽。如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:46中所提供的本发明的ABP变体，用改善融合分子的生物可制造性和稳定性的特定点突变或缺失被有方法地重新设计(SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55；SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO.69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71)。所提供的ABP可以是SEQ ID NO:36的C-末端切割种，或者可以包括SEQ ID NO:46的任意序列。所述单链多肽的二聚体可以是同源或异源二聚体，前提是至少有一个包括SEQID NO:31的序列的功能性ABP、其C-末端切割产物或SEQ ID NO:46的序列。本发明的包括ABP的融合分子保留淀粉样蛋白-β(Aβ)结合能力，迁移过血脑屏障，并有利地使得Aβ能够从大脑中清除，例如，在施用24小时内从大脑中快速清除Aβ。
本发明的ABP变体，例如ABP(GG-G)(SEQ ID NO:35)，或ABP(6G)(SEQ ID NO:36)或其任意C-末端切割β-淀粉样蛋白结合产物(即，包括或由SEQ ID NO:46序列组成的ABP)被特定地设计以改善构建体的稳定性和可制造性(如图16所示)。本发明构建体的改善的稳定性和生物可制造性是本领域中的显著优势。因此，本发明包括ABP和ABP变体，其改善了所提供的融合分子的稳定性和生物可制造性，但也保持了治疗活性(如图15A中所提供的)。本文提供的C-末端切割产物，其中，所述切割产物包括SEQ ID NO:46序列，使得功能性融合蛋白(包括功能性ABP肽的混合物)能够混合，其中，所述混合物有利地增加功能性产物的产率。
因此，SEQ ID NO:31中提供的包括不同ABP变体的融合分子(诸如SEQ ID NO:32-47)保留了亲本ABP在体外的Aβ寡聚体结合能力(图2B、2C、12和15A、B和C、23A和B)以及在体外和体内亲本FC5的血脑屏障穿透性(图4、5A、6、7、17A、17B、18、19、22A和B、24、25)。ABP通过载体(例如FC5)在体外和体内跨越BBB转运，如其在大鼠和犬CSF中的存在所确定的那样(图5和图6)。诸如在野生型和AD转基因小鼠海马体和皮质中，ABP融合也被转运和递送到大脑的靶标区域(图8 19和24)。大脑内递送的ABP还促进了AD转基因小鼠和大鼠的脑脊液(图9C和11A和11B)以及皮质和海马体区域(图9B和11C)中Aβ的清除。此外，最重要的是，大鼠AD模型中的Aβ清除与海马体容积和神经元连接的改善相关(图12A和12B)，表明对治疗的期望药理/生理反应。
出乎意料并是最重要地，与在动物身上进行三个月的多次游离ABP处理相比(图9A)，单剂BBB-Fc-ABP在治疗后24小时内将大脑Aβ负担降低了50％(图9B)，以达到类似的结果。因此，BBB激活的ABP在减轻大脑Aβ负担方面远比游离的ABP更有效。此外，因为其与Fc融合(图10)，与游离或FC5-ABP相比，这种化合物的血清半衰期要长得多，这是一种更好的治疗方法的基本特征。
在现有技术中，仅将ABP与BBB(WO2006/133566)连接并不能确保产生有效的分子。与Fc融合以改善血清半衰期也不能确保ABP有效地跨越血脑屏障转运。本发明的融合蛋白构建体中提供的BBB载体、Fc片段和ABP融合分子的适当设计和制定提供了有效的BBB穿透性治疗化合物。
与目前正在开发的传统治疗性抗体相比，这种新型的双功能融合分子具有明显的优势。首先，BBB融合的治疗性ABP能以更高的水平和更快的速度穿透大脑，大幅度改善了治疗效果。此外，ABP和BBB(例如FC5)对各自受体的亲和力相对较低，并因此可能会更快地从大脑中清除，并从而有助于更快地清除ABP结合的Aβ。与主要使用反应性小胶质细胞/星形胶质细胞来清除Aβ的治疗性抗体(例如，阿杜卡努单抗)不同(其是一个较慢的过程)，本发明的融合分子可能采用更快的血管周围引流途径来清除Aβ。与需要数月的重复多次剂量治疗才能达到类似的结果的游离ABP(图9B)和基于抗体的疗法相比，治疗后24小时内的CNS Aβ降低了近50％，这一点得到了支持。
此外，与基于抗体的疗法相比，本化合物不太可能引起神经炎症反应。
附图说明
现在将通过参考附图的实施例的方式描述本发明的这些和其他特征，其中：
图1：示出了跨越血脑屏障的淀粉样蛋白结合的融合蛋白二聚体的示意图。提供了单链多肽融合蛋白的示意图，其包括通过接头肽融合的BBB跨越的单域抗体(BBB或BBB载体)、Fc片段(Fc)和淀粉样蛋白结合肽(ABP)，并显示为二聚体。图1示出了包括BBB-Fc-ABP的融合蛋白的相应二聚体。融合蛋白的二聚体能是关于ABP的双功能同源二聚体或双功能异源二聚体，因为两个ABP臂都包含功能性ABP肽(例如，SEQ ID No:36，图1Ai)和/或各种C-末端切割的功能性ABP(例如，SEQ ID No:36和/或SEQ ID No:37至SEQ ID No:43，图1Aii)，或者单功能异源二聚体，其中，一个ABP臂是功能性的(ABP或其C-末端切割的功能性切割产物)，而另一个臂是非功能性的肽(图1Aiii)。单链多肽的组分(即BBB、Fc和ABP)以各种构型描述，如图1A、1B、1C和1D所示。
图2：示出了在CHO细胞中FC5-mFc-ABP和人源化FC5(H3)-hFc-ABP(ABP SEQ IDNo:32)融合分子的产生。如图2A所示，通过SDS-PAGE(NR-非还原和R-还原条件)分离FC5融合分子后的考马斯蓝染色凝胶显示重组融合分子的成功生产。图2B和图2C：通过ELISA和蛋白质印迹(WB)重叠分析，游离抗体和BBB-Fc-ABP融合蛋白的Aβ-寡聚体结合。将游离或融合的ABP固定在ELISA试验板上并暴露于Aβ。用Aβ-特异性抗体6E10或4G8检测结合的Aβ。融合分子也用SDS-PAGE分离，转移到PVDF纸上并暴露给Aβ。用如上所述的特异性抗体检测结合的Aβ。结果表明，ABP在与BBB载体融合后仍保持其Aβ寡聚体结合能力。Mo：Aβ单体；Oli：Aβ寡聚体
图3：示出了在AD-Tg小鼠中FC5-Fc-ABP与淀粉样蛋白沉积物结合的免疫组织荧光分析(B6.Cg-Tg,Jackson Lab)。通过免疫组化荧光分析示出了ABP保留了在AD-Tg小鼠脑中结合天然产生的Aβ聚集体的能力。将野生型和阿尔茨海默病转基因小鼠的脑切片与IR 800标记的FC5-mFc-ABP孵育，并在荧光显微镜下观察结合的融合分子。在产生Aβ沉积物的AD-Tg小鼠的脑切片中观察到选择性结合(亮点)，而在不产生淀粉样蛋白沉积物的野生型小鼠的脑切片中没有观察到选择性结合。
图4：示出了在与ABP体外融合后，FC5的BBB穿透性得以保留。在大鼠和人的体外BBB模型中评估了FC5-ABP融合分子的血脑屏障跨越。通过nanoLC-MRM方法(图4A，图4B和图4C)和使用Fc特异性抗体的蛋白质印迹分析(图4D，重复三次)检测跨越BBB的融合分子。FC5-mFc-ABP与FC5-mFc一样有效地跨越了BBB，而没有BBB载体部分FC5的Fc-ABP没有跨越大脑内皮细胞单层。不出所料，对照单域抗体EG2和A20.1，或对照全IgG(抗-HEL)并未跨越血脑屏障。用人源化的FC5-H3-hFc-ABP融合蛋白获得了相似的结果(图4C和图4D)。
图5：示出了体内FC5-Fc-ABP的血清和CSF药代动力学。通过指定剂量(2.5、6.25、12.5和25mg/kg)的尾静脉注射，将FC5-mFc-ABP静脉内施用于大鼠。连续收集血清和脑脊液。使用nanoLC-MRM方法定量FC5-Fc-ABP水平。如图5所示，FC5-mFc-ABP以时间和剂量依赖性方式出现在CSF中且Cmax在12至24小时之间，表明在体内通过FC5将ABP转运到脑和CSF隔室中。血清PK参数(图5和表1)示出了FC5-mFc-ABP的α和β半衰期与完整IgG(包含大鼠Fc的基准抗体)相似。
图6：示出了比格犬FC5-mFc-ABP的血清和CSF PK曲线。通过向10-12岁的比格犬静脉内注射施用FC5-mFc-ABP，并连续收集血清和CSF，并通过nanoLC-MRM(图6A)和使用Fc特异性抗体的蛋白质印迹进行分析(图6B)。星号表示受血液污染的样品(MRM分析中未显示)。可以看出，FC5-mFc-ABP以时间依赖的方式出现在CSF中，表明在体内通过FC5跨越犬血脑屏障转运ABP。PK参数和CSF暴露通过WinNonlin软件进行分析，并显示在下表2中。
图7：示出了在体内(大鼠模型)与人Fc(hFc)融合并化学连接至ABP(FC5-hFc-ABP)的FC5的BBB穿透性和CSF表象(appearance)。根据制造商的说明(ThermoFisherScientific)，使用杂双功能交联剂磺基SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)将FC5-hFc与ABP-胱酰胺连接。化学偶联分子通过尾静脉以6.25mg/kg的剂量静脉内施用于大鼠，并在4和24小时收集血清和CSF样品，并通过nanoLC-MRM分析。与没有BBB载体的Fc-ABP相反，FC5-hFc-ABP以时间依赖性方式出现在CSF中。应当指出的是，在该化学连接的构建体中，ABP的C-末端与Fc片段(随机区)连接，而N-末端是游离的，这与融合构建体不同，在融合构建体中，ABP的N-末端与Fc的C-末端融合，而ABP的C-末端是游离的。ABP方向的这种逆转不影响其Aβ结合能力和跨越血脑屏障的转运。
图8：显示了在小鼠静脉内注射后在各个大脑区域(皮质和海马体)中测得的FC5-mFc-ABP的水平。将15mg/kg剂量的FC5-mFc-ABP静脉注射到野生型(WT)或AD转基因(AD-Tg，B6.Cg-Tg，Jackson Lab)小鼠的尾静脉中，并在4和24小时心内生理盐水灌注后收集大脑。解剖海马体和皮质组织，并通过nanoLC-MRM(图8A)和通过使用Fc特异性抗体的蛋白质印迹进行分析(图8B)。通过MRM在皮质和海马体中检测到了属于融合分子所有三个组分(BBB，在此实例中为FC5，Fc和ABP)的特定肽，这表明FC5载体已成功将ABP递送至大脑的靶标区域。与通常为仅融合至Fc或Fc片段的对照单域抗体A20.1测得的～50ng/g组织相比，在不同时间点测得的水平在750-1400ng/g脑组织之间。通过蛋白质印迹分析检测组织提取物中的Fc和ABP进一步证实了这一点(图8B)。通过蛋白质印迹在仅接受生理盐水的动物中未检测到融合分子的蛋白信号。通过蛋白质印迹在大脑的靶标区域检测到的FC5-mFc-ABP水平呈剂量依赖性增加。
图9：示出了ABP对转基因(Tg)小鼠中Aβ水平的影响：单独用ABP(图9A)或与BBB载体FC5融合的ABP(图9B和图9C)处理之间的比较。使用两种不同的AD Tg小鼠模型，三重转基因(3X Tg-AD，含有PS1M146V，APPSwe和tauP301L转基因的sv129/C57BL6小鼠，Dr.F.M.LaFerla,University of California)和双重转基因(B6.Cg-Tg，含有PSEN1dE9和APPSwe转基因，Jackson Lab)；在3个月或2个月周期内，每隔一天分别对小鼠皮下(sc)施用300nmol/kg的游离ABP。在处理结束时，通过ELISA测量大脑中的Aβ水平。单独使用ABP的处理在2-3个月的多次处理后(每隔一天)使得脑Aβ降低25-50％(图9A)。将FC5-mFc-ABP构建体静脉内注射到双转基因AD小鼠中(B6.Cg-Tg，15mg/kg；当量为220nmol/kg)，并通过ELISA和nanoLC-MRM测定注射24小时后的脑Aβ水平。出乎意料的是，在用FC5-mFc-ABP处理的24小时内观察到约50％的淀粉样蛋白减少(图9B)，表明通过FC5(适当地与Fc连接)有效地将ABP递送至大脑，大大提高了ABP在减少大脑中Aβ水平的效果。CSF分析还表明在FC5-mFc-ABP处理后24小时内Aβ1-42水平显著降低(图9C)。通过MRM或ELISA分析检测到的Aβ的特征肽或表位与ABP识别的Aβ抗原表位相距遥远/不同(因此，不会干扰ELISA或MRM对其的定量)。
图10：示出了与FC5-ABP(即不含Fc组分)相比，FC5-Fc-ABP构建体的血清半衰期延长的实例：通过尾静脉将FC5-ABP和FC5-Fc-ABP注入大鼠体内，并在不同的时间点收集了一系列血清样品，并通过用FC5特异性抗体的直接ELISA进行分析。从图10A中可以看出，与FC5-Fc-ABP(图10B)相比，FC5-ABP构建体在血清中快速清除(少于1小时)，表明包括Fc片段的分子的血清稳定性显著提高。
图11：示出了FC5-mFc-ABP对Tg大鼠大脑淀粉样蛋白负担的影响：在四个星期的时间内，每周通过尾静脉给AD-Tg大鼠注射生理盐水或FC5-mFc-ABP(负担剂量为30mg/kg以及随后的四次每周15mg/kg的剂量)。通过nanoLC MRM分析了FC5-mFc-ABP和Aβ的CSF水平(图11A和图11B)。在处理的四个星期前后，使用特异性Aβ结合剂[18F]NAV4694通过PET扫描确定大脑Aβ水平。示踪剂注入后，获取60分钟动态图像，获得透射扫描，重建图像并生成结合势(BPND)参数图。FC5-mFc-ABP在24小时内降低了大鼠的CSF Aβ水平(图11A和图11B)。如在Tg大鼠中，观察到FC5-mFc-ABP的CSF水平与Aβ之间的反比关系，表明通过FC5将ABP递送至大脑和CSF的靶标结合(engagement)和Aβ的快速清除(图11B)。PET扫描进一步证实了这一点，PET扫描清楚地表明在用FC5-mFc-ABP处理四个星期后大鼠脑Aβ水平显著降低(30-50％)(图11C)。
图12：示出了在用生理盐水或FC5-mFc-ABP处理之前和之后，Tg大鼠的容积磁共振成像(MRI，使用具有稳态进动的快速成像)和功能性MRI(fMRI)。如图12A所示，与生理盐水处理的Tg大鼠(Tg-Sal)相比，在用ABP处理的Tg大鼠(Tg-ABP)中观察到海马体容积在处理四周后增加。如图12B所示，处理四周后的组比较示出了，与盐水处理的Tg大鼠(Tg-Sal)相比，ABP处理的Tg大鼠(Tg-ABP)具有更大的前扣带回皮质(ACC)连接性。
图13：示出了在比格犬的CSF中FC5-mFc-ABP的时间和剂量依赖性的出现以及Tg小鼠(图9C)和Tg大鼠(图11A和B)CSF Aβ水平的降低。将FC5-mFc-ABP分别以15mg/kg和30mg/kg的剂量静脉内注射施用至10-12岁的比格犬，并连续收集血清和CSF，并通过nanoLC-MRM分析FC5-mFc-ABP和Aβ水平。可以看出，FC5-mFc-ABP以时间和剂量依赖性方式出现在CSF中。重要的是，如在Tg小鼠和Tg大鼠中所见，在注射FC5-mFc2a-ABP后24小时内，CSF Aβ水平显著降低，这表明FC5载体在较大动物中具有平移性质(translational nature)，并且还提示ABP在减轻CNS Aβ负担中的扩种族的效果。
图14：示出了具有不同BBB载体的ABP融合分子的生成。为了评估ABP融合分子的多功能性，将ABP与另一种人源化BBB载体IGF1R5(H2)成功融合。如图所示，分子的双功能(ABP结合Aβ寡聚体的能力(ELISA和重叠测定)，以及IGF1R5在体外通过BBB模型递送ABP的能力(数据未显示))得以保留。这清楚地表明，ABP可以与不同的BBB跨越单域抗体融合，以递送至大脑。
图15：示出了不同的单域抗体-Fc-ABP构建体结合Aβ寡聚体(图15A、15B和15C)。这些构建体中的一些中，ABP已通过位点特异性突变或去除了分子的C-末端部分而被修饰，如SEQ ID NOs所示。通过ELISA方法，所有构建体在结合Aβ寡聚体上均保持相似的效力。
图16：示出了具有特定突变以改善稳定性和生物可制造性的FC5-hFc1X7-ABP的产生。在CHO细胞中产生带有特定突变(诸如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的ABP)的FC5-hFc1X7-ABP，并在还原(R)和非还原(NR)条件下在SDS-PGE上分离并用考马斯蓝染色，如图2所述。将经分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用FC5特异性或hFc特异性或ABP特异性抗体进行免疫印迹。在另一组中，还通过重叠测定法测试了融合分子中ABP的Aβ结合。用Aβ特异性抗体6E10检测到结合的Aβ。可以看出，如在还原和非还原条件下的单个蛋白质条带所表明的，具有特异性突变的ABP的方法修饰实质上改善了所产生分子的稳定性。
图17A，图17B：示出了各种FC5-Fc-ABP构建体和IGF1R5-Fc-ABP构建体在体外的血脑屏障穿透性。如图4所述，在体外大鼠BBB模型中评估了BBB跨越，并通过nanoLC-MRM方法检测了跨越血脑屏障的分子。与人源化FC5和IGF1R载体融合的所有ABP变体均有效地跨越了血脑屏障。如所期望的，非BBB可穿透的sdAb A20.1没有跨越血脑屏障，同样地，与A20.1融合的ABP也没有跨越BBB(图17A)。在图17B中，示出了用nanoLC-MRM检测到融合分子FC5、Fc和ABP的所有三个组分的“指纹”肽，从而表明完整的FC5、Fc和ABP的迁移跨越过BBB。
图18：示出了人源化的FC5(H3)-hFc1X7-ABP构建体(ABP，SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36)通过FC5完整地跨越体外血脑屏障转运。如图4所述，在体外大鼠BBB模型中评估了血脑屏障跨越，并通过蛋白质印迹和ELISA分析检测了跨越BBB的分子。图18(1)A和B分别示出了用hFc和ABP特异性抗体检测的免疫印迹。分子大小与应用于体外血脑屏障模型的融合分子完全相同。图18(1)C示出了夹心ELISA，其中，跨越BBB的分子在ELISA板上被FC5-特异性抗体捕获并用ABP特异性抗体检测。此夹心ELISA证实，FC5(H3)-hFc1X7-ABP在体外跨越大鼠血脑屏障后仍保持完整。用FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP，SEQ ID NO:36)获得了相似的结果；图18(2)A、B和C。
图19：示出了人源化的FC5(H3)-hFc1X7-ABP构建体(ABP，SEQ ID NO:35和SEQ IDNO:36)跨越体内血脑屏障转运并通过FC5完整地递送至大脑。如图8所述，将FC5-ABP融合分子通过尾静脉静脉内施用至野生型和AD-Tg小鼠，并在心脏内灌注后收集大脑。将大脑皮质匀浆并在RIPA缓冲液中提取，并然后如图18所述，将提取物进行蛋白质印迹和夹心ELISA分析。图19A示出了用ABP特异性抗体检测的免疫印迹。分子大小与注射入动物的融合分子完全相同。图19B示出了相同提取物的夹心ELISA，提取物中的分子用ELISA板上的FC5特异性抗体捕获并用ABP特异性抗体检测。这证实了免疫印迹结果，即FC5(H3)-hFc1X7-ABP在体内跨越BBB转运并完整地递送至大脑。
图20：示出了FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP，SEQ ID NO:36)与AD-Tg小鼠大脑中内源性Aβ沉积物(B6.Cg-Tg，Jackson Lab)的离体结合(A)和体内结合(B)的免疫组织化学分析。将来自AD转基因小鼠的大脑切片与FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP，SEQ ID NO:36)一起孵育，并用偶联有HRP的FC5特异性抗体观察结合的融合分子。使用FC5(H3)-hFc1X7-ABP构建体可看到选择性结合(黑点)，而没有ABP的FC5(H3)-hFc1X7不可见(A)，表明大脑中Aβ沉积物(靶标结合)依赖于ABP结合。在未产生淀粉样蛋白沉积物的野生型小鼠的大脑切片中未观察到结合(数据未显示)。在将FC5(H3)-hFc-ABP构建体海马体内注射(注射后4小时)注射到AD转基因小鼠中后(使用ABP特异性抗体)检测到了类似的Aβ沉积物结合(B)。
图21：示出了FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP，SEQ ID NO:32)在体内的靶标结合。图21A示出了在海马体内注射后，Alexa 647标记的FC5-hFc-ABP构建体与AD转基因小鼠体内的天然淀粉样蛋白β(Aβ)沉积物的体内结合。通过用Alexa 488标记的Aβ特异性抗体6E10检测大脑切片并证实两个信号的共定位(合并)来确认Aβ的身份。图21B示出了通过ELISA的靶标结合的证明。将FC5(H3)-hFc-ABP构建体海马体内(注射后4小时)注射入野生型和AD转基因小鼠后，解剖海马体形成并匀浆。通过使用FC5抗体作为捕获抗体和ABP抗体作为检测抗体的夹心ELISA来检测FC5-ABP融合构建体。通过相同的夹心ELISA但用Aβ特异性抗体作为检测抗体检测ABP与内源性Aβ的体内结合。从图21A和21B清楚地看出，FC5-ABP构建体在野生型和AD转基因小鼠中都在注射后4小时保持完整。最重要的是，在表达人Aβ的Tg小鼠中，注射的ABP与Aβ结合，并以复合物(FC5(H3)-hFc-ABP*Aβ)的形式下拉，表明ABP在体内参与了Aβ-靶标结合。
图22A，B：示出了非人源化和人源化FC5-Fc-ABP构建体之间的PK、PD比较。如图5所述，以15mg/kg的剂量通过尾静脉注射将FC5-mFc2a-ABP或FC5(H3)-hFc1x7-ABP静脉内施用至大鼠体内。连续收集血清和CSF。使用nanoLC-MRM方法定量FC5-Fc-ABP水平。如图22A所示，对于非人源化和人源化构建体，血清和CSF PK谱非常相似。如图9B中所述，通过以15mg/kg的尾静脉注射向Tg小鼠静脉内施用FC5-mFc2a-ABP或FC5(H3)-hFc1x7-ABP。如图9B所述，通过nanoLC-MRM测量CSF中的FC5-Fc-ABP和Aβ水平。如图22B所示，CSF中非人源化和人源化的FC5-Fc-ABP水平相似，最重要的是，CSF Aβ水平的变化(降低)也非常相似，表明FC5-Fc-ABP构建体的人源化不影响融合构建体的PK和PD曲线。
图23A，B，C：示出了在稳定的CHO细胞系中产生的FC5(H3)-hFc1x7-ABP(SEQ IDNO:56)的阳离子交换(CEX)色谱图，表明制造过程中产生了多种形式的FC5(H3)-hFc1x7-ABP(ABP变体)。用抗hFc抗体进行的详细蛋白质印迹分析(图23A)和质谱分析(图23B)显示，在生产过程中，由于ABP肽在不同位置的C-末端切割，产生了不同形式的融合蛋白(如SEQID NO:36的SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:43所示)，产生了双功能二聚体，即关于ABP功能性的双功能同源二聚体和异源二聚体(ABP臂均具有功能)和单功能性融合蛋白的异源二聚体(一个功能性ABP臂和另一个非功能性臂)，如图1Ai，1Aii和1Aiii所示。在CHO细胞中产生的FC5(H3)-hFc1x7-L-ABP(6G)(SEQ ID NO:56)二聚体的CEX部分的代表性质谱数据示出了存在完整和C-末端切割的ABP(图23B)。包括ABP的SEQ ID NO:56的同源二聚体SEQ ID NO:36(完整链二聚体峰)，包括C-末端切割的ABP变体的异源二聚体[SEQ ID NO:57(NI，Asn-Ile峰)；示出了SEQ ID NO:60(RVKNI峰)和非功能的ABP(ASAQ/ASLA峰)(图23B)。融合蛋白(SEQID NO:56)的切割产物的精确性质是未知的且非显而易见的，直到进行详细的分析。进一步示出了含同源二聚体(双功能)和异源二聚体(单和双功能)(峰2)的混合物的CEX部分包的β-淀粉样蛋白结合活性(蛋白质印迹Aβ重叠分析和ELISA分析，EC 50)，图23A，(代表大约25％的总蛋白质)，与双功能同源二聚体和异源二聚体(峰3)非常相似(代表大约65％的总蛋白质)。这有力地表明，异源二聚体和同源二聚体部分(CEX的中峰和主峰)可以合并使用，而不会显著降低β-淀粉样蛋白的结合活性。在大规模生物制造期间，特别是在融合蛋白产物的下游加工期间，这有利地将实质上增加FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白的产率。这在图23C中得到证明，其显示修饰的CEX条件产生了由同源二聚体和异源二聚体(单功能和双功能)组成的具有高产率的部分(柱上施加的总蛋白质的85％以上)。该组合库(部分B3至B6)的β-淀粉样蛋白结合活性(EC 50)与主要包含同源二聚体(C10-D2，E12)或异源二聚体形式(C6-C8)的其他CEX部分非常相似。
图24：示出了如通过夹心ELISA(24A)和蛋白质印迹分析(24B)进行评估的野生型(wt)和Tg小鼠的静脉注射(尾静脉)后FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白(同源二聚体和异源二聚体的混合物)在体内的大脑递送(参见图8和19的详细信息)，这与FC5(H3)-hFc1x7-ABP(SEQ ID NO:56，请参见图19)的主要同源二聚体形式的大脑递送非常相似，证实了混合物中FC5(H3)-hFc1x7-ABP的异源二聚体形式不会影响融合蛋白在体内跨越血脑屏障的大脑递送。
图25：示出了静脉注射Tg小鼠后，FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白(同源二聚体和异源二聚体的混合物)的CSF暴露及其对CSFβ-淀粉样蛋白的影响(参见图22和24)。如图25所示，FC5(H3)-hFc1x7-ABP的CSF暴露和CSF Aβ水平的变化(降低)与用FC5(H3)-hFc1x7-ABP(SEQ ID NO:56参见图22)的主要同源二聚体形式所看见的非常相似，进一步证实了混合物中的FC5(H3)-hFc1x7-ABP在体内不影响FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白的功能效果。
具体实施方式
本发明提供多肽、包括所述多肽的融合蛋白、以及包括所述多肽和抗体或其片段的融合蛋白，所述抗体或其片段迁移过血脑屏障。
本发明提供了结合beta-淀粉样蛋白(β-淀粉样蛋白)的肽。结合β-淀粉样蛋白的肽(或蛋白)可以选择性地结合病理上相关的β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)聚集体，并且可以缩写并在本文中称为ABP或ABP变体(或统称为ABP)，或C-末端切割的ABP产物。
本发明提供了包括连接至跨越血脑屏障的抗体或其片段的ABP(ABP变体及其C-末端切割产物)的融合蛋白。在一个实施方案中，包括ABP和BBB的融合蛋白还包括Fc或其片段，其中，融合蛋白的ABP和BBB组分可以通过Fc区域或其部分连接以形成单链多肽(这里简称为BBB-Fc-ABP或BBB-Fc-L-ABP)。例如，本发明的构建体可以包括BBB-Fc-ABP或BBB-Fc-L-ABP，其中，L可以是任意合适的接头。所提供的BBB-Fc-ABP(也简称BBB-Fc-L-ABP)构建体可以是单链多肽或其二聚体多肽，其中，包括BBB-Fc-ABP的单链多肽可以通过组分Fc区域形成多聚体(优选为二聚体)，多聚体关于融合蛋白中的ABP可以是同源二聚体或异源二聚体，关于分别具有一个功能性ABP臂或者具有两个不同的功能性ABP臂的异源二聚体可以是单功能或双功能的。
本发明涉及迁移过血脑屏障的化合物，及其用途。更具体地，本发明涉及包括BBB和ABP的化合物及其在治疗阿尔茨海默病(AD)中的用途。
需要能够有效地跨越血脑屏障的迁移ABP，并通过ABP的结合清除Aβ的治疗性制剂。在现有技术中，鉴定了一种40个氨基酸的Aβ结合肽(ABP)，其选择性地结合与AD发生有关的Aβ1-42寡聚体(WO2006/133566)。这种Aβ结合肽在体外抑制Aβ与细胞蛋白的结合，并抑制Aβ1-42诱导的细胞毒性(Chakravarthy等人，2013年)。这种Aβ结合肽可以结合AD转基因小鼠大脑中的淀粉样蛋白沉积物，也可以在体外结合AD患者大脑中的淀粉样蛋白沉积物。更重要地，当直接注射到活的AD转基因小鼠的大脑中时(Chakravarthy等人，2014年)，ABP靶向体内的天然淀粉样蛋白沉积物。因此，人ABP能潜在地靶向CNS Aβ，有助于清除大脑内的Aβ，并降低其毒性作用。然而，全身施用的ABP自身跨越BBB并进入大脑实质的能力有限。
因此，虽然已经证明当直接施用时，ABP能结合Aβ沉积物，但为了结合和清除大脑内的Aβ，非肠道注射ABP需要穿透血脑屏障。本发明有利地提供了通过Fc片段与BBB穿透性单域抗体(诸如FC5或IGF1R)融合的ABP，以提供双特异性血脑屏障穿透性治疗药物(Farrington等，2014年)。本发明的BBB-Fc-ABP构建体可以二聚化，即BBB-Fc-ABP单链融合蛋白可以形成两个单链融合蛋白的二聚体，以产生二聚体化合物，其中，二聚体的每个单链包括BBB、Fc片段和ABP，以提供BBB-Fc-ABP二聚体。BBB-Fc-ABP或BBB-Fc-L-ABP构建体及其二聚体使得ABP能够有效地跨越血脑屏障迁移。因此，在本发明的构建体和方法中提供了通过CSF和大脑实质中ABP的结合来有利的治疗性清除Aβ。
为了能够大脑传递ABP并改善其效果，目前将ABP肽融合到Fc片段的C-末端，而将血脑屏障穿透性单域抗体(诸如FC5(WO2002/057445))融合到同一Fc片段的N-末端，以产生双特异性血脑屏障穿透性治疗药物(Farrington等，2014年)。在本发明的非限制性实施方案中，Fc片段可以是小鼠(SEQ ID NO:48)或人(SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50)。在一个实施方案中，本发明的Fc片段被设计成减少效应器功能(Shields等人，2001年)。例如，Fc片段可以是hFc1x7(SEQ ID NO:49)，其中，BBB-Fc-ABP融合蛋白中的Fc片段有利地使得融合蛋白能够二聚化，以产生能够迁移过血脑屏障的治疗有效的融合分子(BBB-Fc-ABP二聚体)。在一个实施方案中，BBB-Fc-ABP融合蛋白可以是FC5-H3-hFc1x7-ABP(6G)(SEQ ID NO:56)及其二聚体，或者是SEQ ID NO:56的功能性等效的融合蛋白，即包括能够结合β-淀粉样蛋白的C-末端切割的ABP产物的SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65。融合蛋白可以包括SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:71中体现的接头序列L，或任意合适的接头序列。
本发明提供了结合beta-淀粉样蛋白(β-淀粉样蛋白)的经分离肽。本发明的肽可以包括或由序列组成。
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI(SEQ ID NO:31；40aa)
其中，X1＝K、G或者A，X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，X7＝K、G或者V，X8＝R、G或者A，X9＝K、G或者A，或其任意C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合产物。
本发明提供了SEQ ID NO:36(40aa)的C-末端切割产物，即SEQ ID NO:37(38aa)至SEQ ID NO:43(32aa)。本发明提供了特定的C-末端缺失和包括这些C-末端缺失的混合物。具体地，SEQ ID NO:36可以从C-末端切割1个氨基酸[-1aa，以通过去除氨基酸异亮氨酸(I)而产生39个氨基酸的切割产物]；或者可以从C-末端切割2aa(NI的-2aa缺失，即，NI(天冬酰胺和异亮氨酸)的去除；或者它可以从C-末端切割3个氨基酸(去除KNI)；或者它可以从C-末端切割4个氨基酸(去除VKNI)；或者它可以从C-末端切割5个氨基酸(去除RVKNI)；或者它可以从C-末端切割6个氨基酸(去除SRVKNI)；或者可以从C-末端切割7个氨基酸(去除KSRVKNI)；或者可以从C-末端切割8个氨基酸(去除LKSRVKNI)。所提供的切割产物产生可包括在所提供的融合蛋白中的功能性(β-淀粉样蛋白结合)肽，其中，所提供的融合蛋白可以是同源或异源二聚体，或者包括其任意组合的混合物，并且同源和异源二聚体包括至少一个功能性的ABP臂(在同源二聚体的情况下，两个臂都是功能性的)。本发明的融合蛋白二聚体可以包括SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71任一，或其任意组合的单链多肽，或具有至少一个已定义的单链多肽二聚体。
本发明提供了一种包括或由SEQ ID NO:46(29aa)组成的β-淀粉样蛋白结合肽。
本发明的ABP肽(ABP、ABP变体或其C-末端切割产物)可选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:27至SEQ ID NO:36或与其基本相同的序列，或能够结合β-淀粉样蛋白的C-末端切割的ABP肽，诸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43。在一个实施方案中，所提供的多肽ABP变体，所述ABP变体包括与SEQ ID NO:31基本等效的序列、或其生物学功能性C-末端切割产物、或包括序列SEQ ID NO:46的任意ABP。与其基本等效的序列可以赋予融合分子等效的稳定性。
本发明提供一种化合物，即融合蛋白，包括迁移跨越血脑屏障(BBB)的抗体或其片段和结合β-淀粉样蛋白的多肽。本发明提供了包括BBB、结合β-淀粉样蛋白的多肽，和Fc的融合蛋白。
术语“抗体”在本领域中也称为“免疫球蛋白”(Ig)，本文使用的是指由成对的重多肽链和轻多肽链构成的蛋白质；存在各种Ig同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。当抗体正确折叠时，每条链都折叠成许多不同的球状结构域，并由更线性的多肽序列连接在一起。例如，免疫球蛋白轻链折叠成可变(VL)和恒定(CL)结构域，而重链折叠成可变(VH)和三个恒定(CH、CH2、CH3)结构域。重链可变区和轻链可变区(VH和VL)的相互作用使得抗原结合区(Fv)的形成。每个结构域都具有本领域技术人员熟悉的已建立的结构。
轻链可变区和重链可变区负责结合靶标抗原，并因此抗体之间可以显示出显著的序列多样性。恒定区显示较少的序列多样性，并负责与许多天然蛋白结合以引发重要的生化事件。抗体的可变区包含分子的抗原结合决定因素，并从而决定抗体对其靶标抗原的特异性。大部分序列可变性发生在6个高变区，可变重链(VH)和轻链(VL)各3个；高变区结合以形成抗原结合位点，并有助于抗原决定簇的结合和识别。抗体对其抗原的特异性和亲和力取决于高变区的结构，以及它们呈现给抗原的表面的大小、形状和化学成分。识别高可变性区域的方案有多种，最常见的两个是Kabat、Chothia和Lesk。Kabat等人(1991年)根据VH和VL结构域抗原结合区的序列可变性定义了“互补决定区”(CDR)。Chothia和Lesk(1987年)根据VH和VL结构域中结构环区的位置定义了“高变环”(H或L)。这些单独的方案定义了相邻或重叠的CDR和高变环区域，抗体领域的技术人员经常互换地使用术语“CDR”和“高变环”，并且在本文中可以这样使用它们。本文根据Kabat方案识别CDR/环。
本文所指的“抗体片段”可以包括本领域已知的任意合适的抗原结合抗体片段。抗体片段可以是自然产生的抗体片段，或者可以通过操纵自然存在的抗体或使用重组方法获得。例如，抗体片段可以包括但不限于Fv、单链Fv(scFv；由与肽接头连接的VL和VH组成的分子)、Fab、F(ab’)2、单域抗体(sdAb；由单个VL或VH组成的片段)，以及这些中的任意的多价呈现。诸如刚才描述的那些抗体片段可能需要接头序列、二硫键或其它类型的共价键来连接片段的不同部分；本领域技术人员将熟悉不同类型片段和各种方法的要求以及用于构建它们的各种方法。
在非限制性实例中，抗体片段可以是源自自然存在的来源的sdAb。骆驼来源的重链抗体(Hamers-Casterman等人，1993年)缺少轻链，并因此它们的抗原结合位点由一个结构域组成，称为VHH。在鲨鱼中也观察到了sdAb，并将其命名为VNAR(Nutall等人，2003年)。其它sdAb可以基于人Ig重链和轻链序列进行设计(Jespers等人，2004年；To等人，2005年)。如本文所用的，术语“sdAb”包括通过噬菌体展示或其他技术从任意来源的VH、VHH、VL或VNAR库直接分离的sdAb、从前述sdAb衍生的sdAb、重组生产的sdAb、以及通过人源化、亲和力成熟、稳定、增溶、驼化或其他抗体工程方法进一步修饰这种sdAb而产生的sdAb。本发明还包括保留sdAb的抗原结合功能和特异性的同系物、衍生物或片段。
SdAb具有理想的抗体分子特性，诸如高热稳定性、高抗洗剂能力、相对较高的蛋白酶抗性(Dumoulin等人，2002年)和高产率(Arbabi-Ghahroudi等人，1997年)；也可以通过从免疫库中分离(Li等人，2009年)或通过体外亲和成熟(Davies&Riechmann，1996年)来使其具有非常高的亲和力。对sdAb进行进一步的修饰(诸如引入非典型二硫键)也还可以增加稳定性(Hussack等人，2011a，b；Kim等人，2012年)。
本领域技术人员将熟知单域抗体的结构(例如参见蛋白质数据库中的3DWT，2P42)。sdAb包括一个保留免疫球蛋白折叠的单一免疫球蛋白结构域；最值得注意的是，只有三个CDR/高变环形成抗原结合位点。然而，本领域技术人员可以理解，并不是所有的CDR都需要结合抗原。例如，并且不希望是限制性的，CDR中的一个、两个或三个可以有助于通过本发明的sdAb结合和识别抗原。SdAb或可变结构域的CDR在这里称为CDR1、CDR2和CDR3。
本文描述的抗体或其片段可以迁移过血脑屏障。大脑与身体的其他部分由一种被称为血脑屏障(BBB)的特殊内皮组织隔开。BBB的内皮细胞通过紧密连接连接在一起，并有效地阻止了许多治疗化合物进入大脑。除了低速率的囊泡运输，BBB的一个特殊特征是在血脑屏障的开腔(脑)侧存在酶屏障和高水平的ATP依赖转运蛋白的表达，包括P-糖蛋白(Gottesman和Pastani，1993年；Watanabe，1995年)，其积极地将各种分子从大脑输送到血流中(Samuels，1993年)。只有小分子(<500道尔顿)和疏水分子(Pardridge，1995年)才能更容易通过血脑屏障。因此，如上所述的抗体或其片段特异性地结合表面受体、内化到脑内皮细胞、并通过避免溶酶体降解而经历跨越血脑屏障的跨细胞作用的能力在神经学领域是有用的。跨越血脑屏障的抗体或其片段可以用来携带其他分子(诸如治疗药物)，以便递送至大脑组织。该抗体或其片段可以是本领域已知的任意合适的抗体或其片段以迁移过血脑屏障。
本发明提供一种化合物，或融合蛋白，包括迁移过血脑屏障(BBB)的抗体或其片段。本发明的抗体或片段可以结合到例如跨膜蛋白30A(TMEM30A)(如WO2007/036021中所述)，或者结合到胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)表位，或其异构体、变体、部分或片段。
本发明组合物的抗体或其片段可以包括互补决定区(CDR)1序列GFKITHYTMG(SEQID NO:1)、CDR2序列RITWGGDNTFYSNSVKG(SEQ ID NO:2)、和CDR3序列GSTSTATPLRVDY(SEQID NO:3)；或者
CDR1序列EYPSNFYA(SEQ ID NO:4)、CDR2序列VSRDGLTT(SEQ ID NO:5)、CDR3序列AIVITGVWNKVDVNSRSYHY(SEQ ID NO:6)；或者
CDR1序列GGTVSPTA(SEQ ID NO:7)、CDR2序列ITWSRGTT(SEQ ID NO:8)、CDR3序列AASTFLRILPEESAYTY(SEQ ID NO:9)；或
CDR1序列GRTIDNYA(SEQ ID NO:10)、CDR2序列IDWGDGGX(SEQ ID NO:11)的；其中，X是A或T，CDR3序列AMARQSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO:12)。
如前所述，抗体或其片段可以是骆驼来源的sdAb或来自骆驼VHH的sdAb，并因此可以基于骆驼框架区域；或者，可以将上述CDR嫁接到VNAR、VHH、VH或VL框架区域上。还在另一种选择中，可以将上述高变环嫁接到任意来源(例如，小鼠或人)的其他类型的抗体片段(Fv、ScFv、Fab)的框架区域上，或者可以将CDR嫁接到类似大小和性质的蛋白上(例如，参见Nicaise等人，2004年)。
本发明进一步包括嵌合(或嵌合化的)、饰面(veneered)或人源化的抗体或其片段。嵌合抗体或其片段是天然可变域(小鼠或骆驼起源的)与人恒定结构域连接的构建体(参见Gonzales等人，2005年)。抗体的饰面或重修整包括用其人类对应物中的氨基酸残基替换天然抗体或其片段框架区域中暴露的残基(Padlan，1991年；Gonzales等人，2005年)。抗体或抗体片段的人源化包括将序列中的氨基酸替换为人类共同序列中找到的人类对应物，而不损失抗原结合能力或特异性；当抗体或其片段被引入人体受试者中时，这种方法降低了抗体或其片段的免疫原性。在这个过程中，本文定义的CDR中的一个或更多个可以融合或嫁接到人可变区(VH或VL)、其他人抗体(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)、人抗体片段框架区(Fv、scFv、Fab)，或者可以将CDR嫁接到大小和性质相似的人蛋白上(Nicaise等人，2004年)。在这种情况下，所述一个或更多个高变环的构象可能被保存，并且sdAb对其靶标(即，脑内皮细胞上的表位(诸如TMEM30A)，或IGF1R表位)的亲和力和特异性可能受到最小程度的影响。如本领域技术人员所公知的，可能需要将某些天然氨基酸残基结合到人体框架中以保持结合性和特异性。通过CDR嫁接实现的人源化在本领域中是公知的(例如，参见Tsurushita等人，2005年；Jones等人，1986年；Tempest等人，1991年；Riechmann等人，1988年；Queen等人，1989年；Gonzales等人，2005年综述-也参见其中引用的参考文献)，并因此本领域的技术人员将非常熟悉制备这种人源化抗体或其片段的方法。
所提供的抗体或其片段可以是人源化版本的FC5抗体(在WO2002/057445中描述)或IGF1R抗体。FC5(包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17中的任一序列)和IGF1R(包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25，或SEQ ID NO:26中的任一序列)与大脑内皮细胞上受体表面的表位结合，并随后迁移过血脑屏障(BBB)。还已经表明FC5充当载体来跨越BBB引入各种大小的分子(例如，参见WO 2011/127580)。将介导FC5迁移的抗原暂时鉴定为跨膜结构域蛋白30A(TMEM30A；WO 2007/036021)，其富集在大脑内皮细胞表面。
例如，并且不希望是限制性的，抗体或其片段可以包括序列：
X1VQLVX2SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX3RQAPGKX4X5EX6VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX7YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)，其中，X1＝D或E，X2＝A或E，X3＝F或V，X4＝E或G，X5＝R或L，X6＝F或W，X7＝L或V，或与其基本相同的序列；
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5ASEYPSNFYAMSWX6RQAPGKX7X8EX9VX10GVSRDGLTTLYADSVKGRFTX11SRDNX12KNTX13X14LQMNSX15X16AEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSYHYWGQGTX17VTVSS(SEQ ID NO:18)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是V或A；X6是F或V；X7是E或G；X8是R或L；X9是F或W；X10是A或S；X11是M或I；X12是A或S；X13是V或L；X14是D或Y；X15是V或L；X16是K或R；以及X17是Q或L，或与其基本相同的序列；
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX10VX11HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWGQGTX19VTVSS(SEQ ID NO:21)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是A或E；X6是V或A；X7是V或F；X8是G或E；X9是L或R；X10是F或W；X11是G或S；X12是V或Y；X13是D或G；X14是N或S；X15是A或S；X16是L或V；X17是K或R；X18是A或S；以及X19是L或Q，或与其基本相同的序列；
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS(SEQ ID NO:24)，其中，X1是E或Q；X2是K或Q；X3是V或E；X4是A或P；X5是V或S；X6是D或G；X7是L或R；X8是F或W；X9是A或S；X10是A或T；X11是A或S；X12是G或N；X13是M或L；X14是N或R；X15是E或R；X16是P或A；X17是S或Y；以及X18是Q或L，或与其基本相同的序列。
更具体地，不希望以任意方式限制，抗体或其片段可以包括选自以下任一序列的序列：
DVQLQASGGGLVQAGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKEREFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAGSTSTATPLRVDYWG KGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWVRQAPGKGLEWVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCVASEYPSNFYAMSWFRQAPGKEREFVAGVSRDGLTTLYADSVKGRFTMSRDNAKNTVDLQMNSVKAEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRS YHYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:19)；
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYPSNFYAMSWFRQAPGKEREFVSGVSRDGLTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSY HYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:20)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCEVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKEREFVGHITWSRGTTRVASSVKDRFTISRDSAKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:22)；
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGGTVSPTAMGWFRQAPGKGLEFVGHITWSRGTTRYASSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:23)；
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWSRQAPGKDREFVATIDWGDGGARYANSVKGRFTISRDNAKGTMYLQMNNLEPEDTAVYSCAMARQSRVNLDVARYD YWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:25)；
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWVRQAPGKGLEWVATIDWGDGGTRYANSVKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCAMARQSRVNLDVARY DYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:26)；和
与其基本相同的序列。抗体或其片段可以是单域抗体。
关于本发明的融合蛋白中的任意组成肽，“基本相同”的序列可以包括一个或更多个保守的氨基酸突变，或氨基酸缺失，以使得能够保持生物学功能性活性(诸如，在本文提供的C-末端切割的ABP肽中)。在本领域中已知，对参考序列的一个或更多个保守氨基酸突变可产生与参考序列相比在生理、化学、理化或功能性质上没有实质变化的突变肽；在这种情况下，参考序列和突变序列将被认为是“基本相同”的多肽。保守的氨基酸取代在本文中被定义为将一个氨基酸残基替换为另一个具有相似化学性质(例如，大小、电荷，或极性)的氨基酸残基。这些保守的氨基酸突变可以在保持上面列出的CDR序列和抗体或片段的CDR的整体结构的同时，对sdAb的框架区域进行这些保守的氨基酸突变，从而保持抗体的特异性和结合性。
关于本发明的融合蛋白中的任意组成肽，“基本等效”的序列可以包括一个或更多个保守的氨基酸突变或氨基酸缺失，以使得能够保持生物学功能性活性(例如，在本文提供的C-末端切割的ABP肽中)；其中，突变肽关于肽稳定性和生物可制造性是基本等效的。基本等效可指关于融合分子稳定性的等效性；例如，如SDS PAGE(还原和非还原条件)中所见，缺少降解产物或低分子量带。在本领域中已知，对参考序列的一个或更多个保守氨基酸突变可产生与参考序列相比在生理、化学、理化或功能性质上没有实质变化的突变肽；在这种情况下，参考序列和突变序列将被认为是“基本等效”的多肽。
在非限制性实例中，保守突变可以是维持功能性的氨基酸替换或缺失。这种保守的氨基酸取代可以用碱性的、中性的、疏水性的，或酸性的氨基酸取代同一组的另一种氨基酸。术语“碱性氨基酸”是指侧链pk值大于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带正电荷。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸(Arg或R)，和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)是指具有侧链的亲水性氨基酸，其在生理pH下不带电荷，但至少有一个键，其中两个原子共有的电子对被其中一个原子持有得更紧密。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)，和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)是指根据Eisenberg(1984)的标准化共同疏水性标尺(scale)，表现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)，和甘氨酸(Gly或G)。术语“酸性氨基酸”是指侧链pk值小于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)，和天冬氨酸(Asp或D)。
序列同一性用于评估两个序列的相似性；其是通过计算当用于残基位置之间的最大一致性的两个序列比对时残基相同的百分比来确定的。可以使用任意已知的方法来计算序列同一性；例如，可以使用计算机软件来计算序列同一性。不希望成为限制，可以通过诸如由瑞士生物信息学研究所维护的NCBI BLAST2服务(如在ca.expasy.org/tools/BLAST/找到的)、BLAST-P、BLAST-N或FASTA-N之类的软件，或本领域公知的任意其他合适的软件来计算序列同一性。
本发明的基本相同的序列可以至少74％相同；在另一个实例中，基本相同的序列可以在氨基酸水平上与本文描述的序列至少74、75、76、77、78、79、80-90、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同，或它们之间的任意百分比相同。重要的是，基本相同的序列保持了参考序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守的氨基酸突变造成的。在非限制性实例中，本发明可以针对包括与本文描述的抗体的序列至少95％、98％或99％相同的序列的抗体或其片段。在另一个非限制性实例中，如本文所提供的，本发明的ABP肽可以包括与SEQ ID NO:36(40aa)至少74％相同的序列；也就是说，本发明包括SEQ ID NO:36的C-末端切割产物的ABP肽，并且可以与其至少74％、75％、76％、77％、78％-100％相同，或它们之间的任意百分比相同。应当注意，基于关于参考肽序列的每个组成肽来计算同源性百分比(即，比较ABP组成肽序列)。本发明的ABP包括SEQ IDNO:46(29aa)的序列，或其等效的β-淀粉样蛋白结合蛋白。
本发明化合物中的抗体或其片段可以连接至例如Fc结构域，但不限于人的Fc结构域。Fc结构域可以选自各种类别，包括但不限于IgG、IgM，或各种子类，包括但不限于IgG1、IgG2等。在这种方法中，Fc基因与sdAb基因一起插入到载体中，产生sdAb-Fc融合蛋白(Bell等人，2010年；Iqbal等人，2010年)；融合蛋白被重组表达然后纯化。例如，并且不希望以任意方式限制，多价展示格式可以包括FC5-H3的嵌合式及其链接到Fc结构域的突变变体。这种抗体易于设计和生产，能大大延长sdAb的血清半衰期(Bell等人，2010年)。
刚才描述的化合物中的Fc结构域可以是本领域中已知的任意合适的Fc片段。Fc片段可以来自任意合适的来源；例如，Fc可以是鼠源或人源。其它Fc或Fc片段实施方案可以调节、修改或抑制免疫效应器功能(Shields，2001年)。其它Fc片段实施方案可以介导融合肽从大脑中的清除(Caram-Salas N，2011)。在特定的非限制性实例中，Fc可以是小鼠Fc2a片段或人Fc1片段(Bell等人，2010年；Iqbal等人，2010年)。在特定的非限制性的实例中，多聚构建体可以包括本文描述的经分离或纯化的抗体或片段以及序列为SEQ ID NO:48；SEQ IDNO:49；SEQ ID NO:50的Fc。因此，本文提供的BBB-Fc-ABP融合蛋白可以通过Fc形成二聚体，以提供双价、双功能的BBB-Fc-ABP。
本发明的化合物包括连接至结合β-淀粉样蛋白的多肽的抗体或其片段。接头可以是包括中性或亲水性氨基酸的适当长度的任意多肽。在非限制性实例中，长度优选小于12个氨基酸，并且多肽是GGGGSGGGGS或TGGGGSGGGGS或任意合适的接头(例如(GGGSGGGGS)n或(GGGGSGGG)n或任意合适的组合)。其他化学接头可以采用正确取向的非肽形式，诸如酰胺或酯键。例如，SEQ ID NO:71提供包括任意合适的接头的融合蛋白，其中，本发明的任意融合蛋白(即SEQ ID NO:51-70)可以包括如SEQ ID NO:71所示的任意合适的接头。结合β-淀粉样蛋白(Aβ)的多肽可能与病理相关的β-淀粉样蛋白(诸如与AD病理有关的Aβ1-42聚集体)结合；所述多肽可能以高亲和力结合Aβ(在nM范围内)，在体外抑制Aβ与细胞蛋白的结合和Aβ1-42诱导的细胞毒性，并在体外结合AD转基因小鼠大脑和AD患者的大脑中淀粉样蛋白沉积物。本发明化合物中的多肽不与反转肽Aβ42-1结合。
在本文提供的化合物中，结合β-淀粉样蛋白的多肽可以包括选自由以下序列组成的组：SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ IDNO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36或其β-淀粉样蛋白结合C-末端切割产物(即SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43；或SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQID NO:47和与其基本相同的序列)。“基本相同”的序列如上所述。
因此，本发明提供了一种结合β-淀粉样蛋白的多肽及其变体(即，ABP和ABP变体)。ABP变体可以包括例如，具有SEQ ID NO:31的序列，所提供的ABP变体可以包括选自由SEQID NO:31至SEQ ID NO:47的序列或与其基本等效的序列组成的组的序列。
因此，提供了包括基于ABP的详细生物物理特征的特定系统和方法修饰的ABP多肽序列。对ABP多肽的特异性和有方法的定向修饰包括如SEQ ID NO:31提供的本发明新颖的和非显而易见的ABP变体，或具有β-淀粉样蛋白结合活性的C-末端切割产物。
本文提供的肽可以包括ABP，所述ABP包括选自由SEQ ID NO:27-SEQ ID NO:47组成的组的序列，和与其基本等效的序列或具有β-淀粉样蛋白结合活性的C-末端切割产物。
本文提供的融合蛋白可以包括ABP，所述ABP包括可以选自SEQ ID NO:31到SEQ IDNO:47中的任一序列的序列。所述ABP可以是SEQ ID NO:31的任意等效序列或SEQ ID NO:31或36的C-末端切割产物(诸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:43)，其中，所述C-末端产物具有β-淀粉样蛋白结合活性。ABP可以是等效于SEQ ID NO:46的任意序列。本文提供的包括ABP、ABP变体或C-末端切割产物的构建体在化合物稳定性和生物可制造性方面表现出有利的改善(如图16所示)。
更具体地，本文提供的特定ABP切割种类(即SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42，或SEQ ID NO:43)不能被预测，并且现在从SEQ ID NO:36切割的特定切割位点是未知的并且也不能被预测。在融合肽的生物制造过程中，这些特定的C-末端切割产物是无法预测的。ABP蛋白及其C-末端切割产物的稳定性和生物可制造性是无法预测的。
此外，相当有利和意想不到的是，本文提供的融合蛋白能是双功能二聚体或单功能二聚体，其中，单功能和双功能二聚体提供关于β-淀粉样蛋白结合功能性和活性的等效融合蛋白。所提供的C-末端切割产物的有利稳定性、可制造性和等效的β-淀粉样蛋白结合功能性是未知且非显而易见的。这使得能够制造具有等效β-淀粉样蛋白结合活性的ABP肽的混合物，以及制造具有等效β-淀粉样蛋白结合活性的融合蛋白及其二聚体的混合物。此外，单功能和双功能二聚体的有利等效功能性是未知的并且也是无法预测的。相当有利的是，本发明提供等效活性的融合蛋白和二聚体(包括最小ABP序列(其包括SEQ ID NO:46)的单功能和双功能二聚体)的混合物，从而使得在生物制造中能够增加功能性ABP蛋白产率和增加功能性融合蛋白和功能性融合蛋白二聚体产率。
本文提供的融合蛋白和化合物显示出改善的治疗效果。更具体地，所提供的化合物包括特定修饰的ABP，其包括例如在自ABP序列(SEQ ID NO:36)N-末端的特定位点1、4、6、7、28和29的特定氨基酸K(赖氨酸)、R(精氨酸)和N(天冬氨酸)到G(甘氨酸)的突变，其使得能够产生改善的生物可制造性(在人类哺乳动物表达系统中生产)的稳定的BBB-Fc-ABP融合分子。本文提供的对ABP的特定修饰是基于ABP的详细生物物理特征的系统和有方法的修饰。本文提供的修饰的ABP可以包括例如选自SEQ ID NO:32-SEQ ID NO:47的序列，和与其基本等效的序列(诸如SEQ ID NO:31)，或其C-末端切割的功能性产物。本文提供的化合物有利地表现出改善的稳定性和生物可制造性，并且在降低大脑中Aβ水平的有效性方面最显著地提高；其中，使用本发明的构建体在治疗24小时内观察到50％的淀粉样蛋白减少。
术语“连接的”，这里也称为“偶联的”，是指两个部分直接或间接地(例如，通过接头)共价或非共价地(例如，吸附、离子相互作用)连接。共价键可以通过化学交联反应实现，或者通过使用重组DNA方法与任意肽表达系统(诸如基于细菌、酵母或哺乳动物细胞系统)相结合的融合来实现。当将抗体或其片段偶联到结合Aβ或Fc的多肽时，可以使用合适的接头。例如，合适的接头可以是任意包含中性或亲水性氨基酸的合适长度的多肽，其使得BBB-Fc-ABP蛋白融合的各组分能够偶联的。例如，所述接头使得融合蛋白(例如，在SEQ ID NO:51-69中)中的各组分能够连接，并且不限于其中突出显示的GGGGSGGGGS或(GGGS)n接头，并且可以是任意合适的接头(即，如SEQ ID NO:71的非限制性融合蛋白中的)。在非限制性实例中，长度优选小于12个氨基酸，并且多肽可以是GGGGSGGGS，或GGGSGGGGS，或TGGGGGSGGGS，或本领域中任意合适的接头。其他化学接头可以采用正确取向的非肽形式，诸如酰胺或酯键。本领域的技术人员将很清楚将抗体或其片段连接至多肽的接头或方法。用于将抗体或其片段连接至多肽或Fc的方法是本领域技术人员公知的。
本文提供的化合物包括连接的抗体或其片段、结合β-淀粉样蛋白的多肽、以及Fc片段，以提供构建体(本文也称为化合物或融合分子)，其中，所述构建体包括融合蛋白及其二聚体。抗体或其片段通过Fc片段，或合适的接头可以连接至结合β-淀粉样蛋白的多肽。
抗体或其片段包括选自以下任一序列的序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO 23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和与其基本等同的序列。抗体或其片段迁移过血脑屏障。抗体或片段可以是sdAb；其中，所述sdAb可以是人源化的。
结合β-淀粉样蛋白的多肽包括选自由以下序列组成的组的序列：SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47，和与其基本等同的序列，以及包括或由SEQ ID NO:31或具有β-淀粉样蛋白结合活性的C-末端切割产物组成的序列，或包括或由SEQ ID NO:46组成的序列。
Fc片段包括选自以下任一序列的序列：SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50，和与其基本等同的序列。本发明的Fc片段可以是具有减弱效应器功能的任意合适的Fc片段。融合蛋白中提供的Fc片段使得能够形成二聚体结构；其中，例如包括选自由SEQ IDNO:51至SEQ ID NO:71组成的组的序列的单链融合蛋白可以通过其中的Fc片段形成二聚体结构。
因此，本发明的化合物或构建体可以包括选自由以下序列组成的组的序列：SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71，和与其基本相同的序列，或其二聚体结构，其中，所述二聚体肽包括两个单链多肽，所述单链多肽选自包括以下序列的组：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71，和与其基本相同的序列，缺失变体，诸如SEQ ID NO:47或源自SEQ ID NO:31的任意顺序或非顺序的C末端切割的ABP变体，由含SEQ ID NO:46的功能性产物组成；具体地，提供了SEQ ID NO:31连续一个氨基酸C-末端缺失，或缺失1、2、3、4、5、6、7，或8个氨基酸(如SEQ ID NO:37至43中所提供的)。二聚体的单链多肽可以是双功能同源二聚体(图1Ai)、双功能异源二聚体(图1Aii)或单功能异源二聚体(图1Aiii)。例如，每个二聚体的ABP部分可以相同或不同；当二聚体中的ABP部分不同时，单链多肽中的至少一个ABP是生物学功能性肽(即能够结合β-淀粉样蛋白)。
如图23、24和25所述，包括两个BBB-Fc-L-ABP单链多肽的二聚体肽可以包括两个不同的ABP序列(异源二聚体)，其中，异源二聚体中的至少一个所述ABP序列是生物学功能性ABP分子(即可以结合β-淀粉样蛋白，如图1Aii或1Aiii所示)。非常有利的是，二聚体肽可以容纳单个非功能性ABP肽(即，如图1Aiii所示的单功能异源二聚体)，并保持关于结合β-淀粉样蛋白等效的功能性生物活性(图23B、C)。当在二聚体中提供两个功能性ABP肽时(双功能异源二聚体)，在包括两个不同ABP序列的二聚体中(即关于ABP为异源二聚体)，异源二聚体中提供的至少一种ABP肽是生物学功能性ABP，即SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47或其任意组合。关于可制造性、可分离性和功能性产物产率，非常有利的是，异源二聚体中的ABP肽不必都是具有生物学功能的β-淀粉样蛋白结合蛋白，具有单功能(或双功能)的异源二聚体关于体外结合β-淀粉样蛋白(图23)和体内大脑摄取和效果(图24和25)保持融合蛋白的整体生物活性。包含单功能和双功能的同源二聚体和异源二聚体混合物的部分(峰2，图23A)的淀粉样蛋白结合活性(EC 50)与双功能同源二聚体和异源二聚体(峰3，图23A)非常相似，使得单功能和双功能同源二聚体和异源二聚体部分(CEX峰2和3)能够结合。有利的是，异源二聚体能容纳单个非功能性ABP肽(单功能)，并且保持生物学有效的异源二聚体，因为其有助于所提供的融合蛋白的可制造性。在一个具体的实例中，在FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白(SEQ ID NO:56)的下游加工(纯化)过程中，将同源二聚体和异源二聚体组合在一起，在大规模生物制造过程中，产物产率显著增加，从～65％增加到～86％(参见图23)，这是一个非常明显的优势。由单功能异源二聚体的等效功能性的意外保持所提供的优势增加了产物产率并促进了可制造性，使得能够容易地分离全活性药物组合物(增加融合蛋白产率，这使得所产生的功能性融合蛋白二聚体的产率能够增加)。具有对其相应的双功能二聚体同等活性的单功能异源二聚体使得能够增加所制造的融合蛋白的产率，并从而促进和增加包括融合蛋白和其相应二聚体的混合物的组合物的可制造性。
如图1所示，本发明提供包括BBB跨越单域抗体(BBB)、Fc片段(Fc)和淀粉样蛋白结合肽(ABP)的融合蛋白，其中，每个部分可以连接以提供融合分子。例如，在本发明的非限制性实例中，BBB可以连接至Fc的N-末端，并且ABP连接至Fc片段的C-末端(图1A)。图1示出了包括BBB-Fc-ABP的单链融合蛋白的相应二聚体。融合蛋白的二聚体可以是关于ABP的同源二聚体，因为两个ABP臂都包含功能性全长(例如，双功能同源二聚体，例如SEQ ID NO:36，图1Ai)和/或各种C-末端切割的ABP(例如，双功能异源二聚体SEQ ID NO:36和/或SEQ IDNO:37至SEQ ID NO:43，图1Aii)或异源二聚体，其中，一个ABP臂是功能性的(ABP或C-末端切割的ABP)以及另一个臂是非功能性的(即，单功能异源二聚体)。如图1A、1B、1C和1D所示，以各种构型描述了3个组分(即BBB、FC和ABP)。在本发明化合物的特定的、非限制性的实例中，结合β-淀粉样蛋白的多肽可以包括序列SEQ ID NO:31或其C-末端切割的功能性产物。
在一个实施方案中，ABP变体包括序列：
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:36)(本文称为ABP(6G))和与其基本等效的序列，或者具有β-淀粉样蛋白结合活性的任意C-末端切割产物，诸如SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42，或SEQ ID NO:43。在一个实施方案中，ABP包括SEQ ID NO:46的序列。
抗体或其片段可以包括序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVK GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWG QGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)，本文称为FC5-H3。
抗体或其片段进一步可以包括人Fc的序列，诸如
AEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEGPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:49)，本文也称为hFC1X7。
不希望以任意方式限制，本发明的化合物可以包括序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWFRQAPGKGLEFVSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSSAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEGPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGTGGGGSGGGGSGTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI[SEQ ID NO:56，本文也称为FC5-H3-hFc1X7-ABP(6G)]。本发明还提供了SEQ ID NO:56的融合蛋白，其中，所述连接融合蛋白的Fc和ABP组分的接头是(GGGGS)2、(GGGS)2、T(GGGGS)2或本领域已知的任意合适的接头，并且其中，SEQ IDNO:56的融合蛋白的ABP肽可以是SEQ ID NO:36、与其基本等效的序列，或具有功能性β-淀粉样蛋白结合活性的任意C-末端切割产物(诸如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:47)(SEQ IDNO:57-63，SEQ ID NO:65)。
表总结了一些代表性BBB-Fc-ABP融合蛋白构建体
Figure BDA0002680384190000281
Figure BDA0002680384190000291
注意的是在上表中，BBB-Fc-ABP融合蛋白构建体还可以包括接头(L)，其中，BBB-Fc-ABP构建体是本发明的BBB-Fc-L-ABP融合蛋白，其中，L可以是GGGGSGGGGS、GGGSGGGGS、TGGGGSGGGGS或其任意倍数，或者任意何合适的接头，或者如SEQ ID NO:53中的共同接头序列所示的任意接头。
如在SEQ ID NO:56的融合蛋白中提供的本发明的化合物，在本文也称为FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)，可以包括变体，所述变体包括每个组分的变体，例如，ABP可以是如SEQID NO:55提供的ABP(GG-G)或SEQ ID NO:36提供的ABP(6G)，或其任意C-末端切割产物。其中提供的接头序列(例如，如在SEQ ID NO:51至SEQ ID NO:71中突出的)可以是使得能够连接BBB-Fc-ABP融合蛋白的任意接头。本发明的化合物还可以包括辅助表达、检测或纯化重组抗体或其片段的额外序列。可以使用本领域技术人员已知的任意这样的序列或标签。例如，不希望是限制性的，抗体或其片段可以包括靶向或信号序列(例如，但不限于OmpA)、检测/纯化标签(例如，但不限于c-Myc、His5或His6)，或其组合。在另一实例中，额外序列可以是生物素识别位点，诸如Cronan等人(WO95/04069)或Voges等人(WO/2004/076670)所描述的位点。本领域技术人员也已知，接头序列可以与额外序列或标签结合使用，或者可以用作检测/纯化标签。
本发明还包括编码本文的化合物的核酸序列。考虑到遗传密码的简并性，许多核苷酸序列将具有编码多肽的效果，这是熟练的技术人员很容易理解的。所述核酸序列可以是密码子优化的，以便在各种微生物中表达。本发明还包括载体，所述载体包括刚才描述的核酸。此外，本发明还包括细胞，所述细胞包括所述核酸和/或载体。
本发明进一步包括组合物，所述组合物包括本文所述的一种或更多种化合物和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。所述组合物还可以包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。稀释剂、赋形剂或载体可以是本领域已知的任意合适的稀释剂、赋形剂或载体，并且必须与组合物中的其他成分、组合物的递送方法兼容，并且对组合物的接受者不有害。组合物可以是任意合适的形式；例如，组合物可以悬浮物形式或粉末形式提供(例如，但仅限于冻干或封装)。例如，不希望是限制性的，当组合物以悬浮液形式提供时，载体可以包括水、生理盐水、适当的缓冲液，或以改善溶解性和/或稳定性的添加剂；在适当pH的缓冲液中进行重组以产生悬浮液，以确保抗体或其片段的活性。干粉还可以包括改善稳定性的添加剂和/或增加容量/容积的载体；例如，但不希望是限制性的，干粉组合物可以包括蔗糖或海藻糖。制备包括本化合物的合适组合物在本领域技术人员的能力范围内。
还提供了一种治疗阿尔茨海默病的方法，其中，将本发明的化合物或组合物施用至有需要的受试者。可以使用任意适当的施用途径，包括但不限于静脉、腹腔、非肠道、颅内、肌肉内、皮下、口服或鼻腔。最佳给药剂量和施用途径一般由实验确定。
提供了一种降低具有升高的β-淀粉样蛋白水平的受试者的脑脊液(CSF)和大脑实质中的有毒的β-淀粉样蛋白水平的方法。更具体地，受试者的脑脊液(CSF)和大脑实质中有毒的β-淀粉样蛋白水平早在本发明组合物的单次非肠道施用的24小时内就降低了。
本发明将在以下实例中进一步说明。然而，应当理解，这些实例仅用于说明目的，并且不应用于以任意方式限制本发明的范围。
实施例1：BBB-Fc-L-ABP融合分子的构建
融合分子包括：
制备了a)FC5 sdAb(SEQ ID NO:14)、鼠Fc(SEQ ID NO:48)和ABP(SEQ ID NO:30)，
b)人源化形式的FC5(FC5-H3；SEQ ID NO:17)、人Fc(SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:50)和ABP(SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO：34；SEQID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:40；SEQID NO:41；SEQ ID NO:42；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46；SEQID NO:47；)，
c)人源化形式的IGF1R-5sdAb(IGF1R-5-H2；SEQ ID NO:26)、鼠Fc(SEQ ID NO:48)和ABP(SEQ ID NO:30)。融合蛋白构建体的示意图如图1所示。作为二聚体的融合蛋白包括跨越BBB的单域抗体，Fc片段和淀粉样蛋白结合肽。
实施例2：BBB-Fc-L-ABP融合分子的产生
实施例1中描述的构建体FC5-mFc-ABP和人源化FC5(H3)-hFc-ABP在CHO细胞中以二聚体表达，并且表达的化合物在MabSelect Sure亲和柱上纯化。
制备如实施例1中所述包括FC5变体FC5和FC5-H3 VHH融合到小鼠或人Fc抗体片段的N-末端，该抗体片段在其C-末端融合到ABP变体的构建体，表达，并纯化。
FC5-Fc-ABP变体DNA(DNA合成供应商)被克隆到哺乳动物表达载体pTT5中(Durocher 2002)。通过将质粒载体(80％)、pTT-AKTdd(15％、蛋白激酶B的活化突变体)和pTTo-GFP(5％，以监测转染效率)的组合与PEI MAX溶液(Polysciences cat no 24765)混合，预形成最终浓度为每升细胞1毫克DNA的人工合成多聚物。PEI:DNA的比例为4:1(W:W)，两者都是在补充的F17培养基中制备的(4mM谷氨酰胺，0.1％柯立波)。在加入细胞培养物之前，混合物在室温下孵育5分钟。DNA/PEI人工合成多聚物的体积占最终培养物体积的10％(即每1L培养物100ml)。转染后二十四小时，将终浓度为1％(含40％w/v溶液，Organotechnie)的胰蛋白N1和0.5mM丙戊酸(200mM溶液)加入培养物。监测转染/生产的细胞密度和生存力以及生产率效价(每升的Fc毫克数)，并且当细胞生存力达到最小65％时通过离心收获(上清液)。将澄清的细胞培养基滤过0.45μm膜，然后将其应用在装有5ml蛋白AMabSelect SuRe树脂(GE Healthcare)的色谱柱上。上样后，用5体积的磷酸盐缓冲液pH7.1(PBS)洗涤色谱柱，并用100mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0洗脱融合蛋白。合并包含经洗脱的融合蛋白的部分，并通过上样在PBS中平衡的脱盐Econo-Pac柱(BioRad)上进行缓冲液交换。脱盐的融合蛋白通过阳离子交换色谱法(CEX)进一步纯化，并通过Millex GP(Millipore)过滤器单元(0.22μm)进行无菌过滤，然后分装。通过质谱和蛋白质印迹分析将CEX部分表征为同源二聚体和异源二聚体变体。
SDS-PAGE和Aβ重叠：在Laemmli样品缓冲液中(加热至70℃用于非还原，加热至95℃用于还原凝胶，βME或DTT)制备的蛋白质样品，通过在12％Tris-Tricine凝胶或TGX4-15％凝胶(BioRad)上的SDS-PAGE分离。凝胶用考马斯蓝染色或将蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上进行蛋白质印迹/Aβ重叠分析。用脱脂奶粉封闭免疫印迹，并然后在室温下暴露于Aβ制剂(50-100nM)45分钟，并使用如先前所述的6E10抗体检测结合的Aβ(Chakravarthy等，2013年)。
ELISA：按照Chakravarthy等人(2013)的描述进行Aβ结合分析。将Maxisorp 96孔ELISA板(Nunc)用(100-500ng/孔)在PBS中游离ABP(合成的)或各种FC5-ABP构建体包被，于4℃过夜。将孔用TBS-T中的1％BSA封闭30分钟，并然后与主要由TBS-T中的单体和二聚体(Mo)或更高寡聚体(Oli)组成的Aβ1-42制剂一起在室温孵育45分钟并温柔地搅动。在进行三遍TBS-T洗涤后，通过将在TBS-T中HRP偶联的Aβ特异性抗体(6E10或4G8)于室温孵育90分钟来检测结合的Aβ。根据制造商的说明，使用SureBlueTM TMB试剂盒(KPL)通过比色法在450nm处检测结合的抗体。
通过SDS-PAGE(NR-非还原和R-还原条件)分离FC5融合分子后的考马斯亮兰色凝胶表明成功制备了重组融合分子，如图2A所示。图2B和C示出了通过ELISA和蛋白质印迹(WB)重叠分析的游离ABP和FC5-Fc-ABP融合蛋白的Aβ-寡聚体结合。游离或融合ABP通过将在磷酸盐缓冲液(PBS)中的样品在4℃下包被过夜而固定在ELISA板上，并暴露于如Chakravarthy等人，2013年所述的Aβ制剂中。用Aβ特异性抗体6E10或4G8(Chakravarthy等人，2013年)检测到结合的Aβ。融合分子也通过SDS-PAGE分离，转移到PVDF纸上并暴露于Aβ寡聚体。用上述特异性抗体检测到结合的Aβ。结果表明，在与BBB载体融合后，ABP保留了其Aβ寡聚体的结合能力。Mo：Aβ单体；Oli：Aβ寡聚体
实施例3：在体外AD-Tg小鼠(B6.Cg-Tg，JacksonLab)中，BBB-Fc-L-ABP融合分子与 Aβ沉积物的结合
将实施例2中产生的构建体进行免疫组织荧光分析，以评估FC5-Fc-ABP融合分子是否保留了结合所述小鼠大脑中天然产生的淀粉样蛋白沉积物的能力(Chakravarthy等，2014年)。将来自野生型(Wt)和AD转基因(AD-Tg)小鼠的冷冻半脑包埋在OCT中，并使用JungCM 3000低温恒温器制备10μm切片，并在-80℃下保存。将组织切片解冻，并用剃刀从切片上剥离OCT，然后在室温下与Dako蛋白封闭剂孵育30分钟。除去封闭剂，并在TBS中轻轻洗涤切片。加入在抗体稀释剂中的IR 800标记的FC5-mFc-ABP(5.0μg/μl溶液的1:250稀释液)，并在室温下孵育1小时。然后将切片用TBS洗涤两次，在Milli Q水中冲洗，除去多余的冲洗溶液，切片用Dako Fluorescent Mounting Media盖玻片盖上。在荧光显微镜下观察切片(图3)。在产生Aβ沉积物的AD-Tg小鼠的脑部可见选择性结合(亮点)，而在未产生淀粉样蛋白沉积物的Wt小鼠的脑部未见选择性结合(亮点)，表明FC5-Fc-ABP构建体中的ABP保留了在AD-Tg小鼠大脑中结合天然产生的Aβ聚集体的能力。在提供的BBB-Fc-ABP构建体中，BBB可以是FC5或抗IGF1R抗体。
实施例4：体外FC5-Fc-L-ABP融合分子的BBB迁移
在来自大鼠和人的体外BBB模型中评估了FC5-Fc-ABP融合分子的BBB跨越(图4)。跨越BBB的融合分子在体外BBB穿透性分析中进行筛选，其使用单个时间点进行Papp测定。变体的定量通过MRM-ILIS进行(图4A、4B和4C)。
SV40永生化成年大鼠大脑(SV-ARBEC)和人大脑内皮细胞(HBEC)用于生成所述体外血脑屏障(BBB)模型(Garberg等，2005年；Haqqani等，2013年)。将Sv-ARBEC(80000个细胞/膜)接种在1ml生长培养基中的0.1mg/mL大鼠尾胶原I型包被的组织培养插入物上(孔径1μm；表面积0.9cm2，Falcon)。插入组件的底室包含2ml生长培养基，以1:1(v/v)的比例添加了永生化新生大鼠星形胶质细胞条件培养基。测试了来自实施例1等摩尔量(5.6μM)的阳性(FC5构建体)或阴性对照(A20.1，艰难梭菌毒素A结合VHH；和EG2，EGFR结合VHH)和Fc-ABP跨越大鼠或人类体外BBB模型的能力。将等摩尔量的sdAb暴露于BBB的管腔侧后，在距管腔侧15、30和60分钟后取样。然后通过质谱法(多个反应监测–同种型标记的内标；MRM–ILIS)对每个样品的sdAb含量进行定量(图4A、4B、4C)。
MRM-ILIS：方法全部如Haqqani等人(2013)所述。简而言之，为了开发VHH的SRM(选定的反应监测，也称为多反应监测(MRM))分析，首先通过使用依赖于数据采集的nanoLC-MS/MS分析每个VHH，以鉴定所有可电离的肽。对于每种肽，选择3至5个最强的碎片离子。开发了最初的SRM分析以监测消化物中埃摩尔量(约100-300amol)的这些片段。在少量时显示可重现强度比的片段(即与较高数量相比Pearson r2≥0.95)被认为是稳定的，并被选择用于最终SRM分析。为了进一步优化分析，还包括每种肽的洗脱时间，请注意不要选择具有接近的m/z(质荷比)和洗脱时间的肽。
细胞培养基或体液(血清或脑脊髓液(CSF))中VHH的典型多重SRM分析涉及加标已知量的ILIS(0.1-10nM)，然后注射100-400ng CSF或培养基蛋白(0.3-1μL)或约50-100ng的血清蛋白(1-3纳升)进入nanoLC-MS系统。在靶标的特定洗脱时间在离子阱中选择每个靶标肽离子的前体m/z(并将剩余的不相关离子丢弃)，然后进行碰撞诱导解离(CID)片段化，仅选择所需的使离子阱中的离子碎片化，以供检测器监控。为了进行定量分析，将LTQ(ThermoFisher)生成的原始文件转换为标准质谱数据格式mzXML，并使用称为Q-MRM的内部软件(Quantitative-MRM；参见Haqqani等，2013年)(其是MatchRx软件的修改版本)提取强度。对于每个VHH，生成了每个碎片离子的提取离子色谱图，其中包括整个洗脱时间内碎片m/z的0.25Da以内的组合强度。为了获得每个片段的最终强度值，对预期保留时间的0.5分钟内的所有强度求和。如果VHH的至少一种肽的片段显示出预期的强度比，则VHH被定义为在样品中可检测到，即，与对应的纯VHH的最终强度值相比，最终强度值显示出强的皮尔逊相关r≥0.95和p<0.05。
如前所述，包含VHH混合物(培养基、血清、CSF)的样品被还原、烷基化和胰蛋白酶消化(Haqqani等人，2012年；Gergov等人，2003年)。消化物(胰蛋白酶肽)用乙酸(最终浓度为5％)酸化，并在与LTQ XL ETD或LTQ Orbitrap ETD质谱仪(ThermoFisher，Waltham，马萨诸塞州)偶联的反相nanoAcquity UPLC(ThermoFisher,Waltham,MA)上分析。将样品的所需等分试样注入并上样到300μm内径×0.5mm 3μm PepMaps C18捕集器(ThermoFisher)上，然后使用0％-20％乙腈(0.1％甲酸内)在1分钟内、20％-46％乙腈在16分钟内，和46％-95％乙腈在1分钟内以400nL/分钟的流速洗脱到100m内径×10cm 1.7μm BEH130C18 nanoLC柱(Waters)上。通过电喷雾电离(ESI)将洗脱的肽离子化到质谱仪中，用于使用CID的MS/MS和SRM对肽离子片段分析，在35％的标准化碰撞能量和30ms的激活时间下，用氦作为碰撞气体进行CID。通过使用6×103的自动增益控制(AGC)靶标值和200ms的最大累积时间的仪器来调整离子注入线性离子阱的时间。
表观穿透系数的确定:可以直接绘制量化值，或者可以使用给定的公式[Qr/dt＝接收器隔室中的累积量与时间的关系；A＝细胞单层的面积；C0＝给药溶液的初始浓度]确定Papp(表观穿透系数)值并标绘。Papp值通常用于确定分子跨越BBB的能力。Papp值是化合物穿过大脑内皮单层的特定穿透性的量度。
用于检测和定量FC5构建体的特定肽如下表1所示。
表1
Figure BDA0002680384190000331
如实施例2中所述，还使用Fc特异性抗体通过蛋白质印迹分析对样品进行分析(图4D，重复三次)。FC5-mFc-ABP与FC5-mFc一样有效地跨越血脑屏障，而Fc-ABP没有BBB载体部分的FC5不会跨越大脑内皮细胞单层。不出所料，对照单域抗体EG2和A20.1，或对照全IgG(抗-HEL)并未跨越血脑屏障。用人源化的FC5(H3)-hFc-ABP融合蛋白获得了相似的结果(图4C和图4D)。用IGF1R5-mFc-ABP ABP获得了相似的结果(图17A和B)。
实施例5：体内FC5-Fc-L-ABP融合分子的BBB迁移和药代动力学
在体内评估了实施例2的构建体迁移过血脑屏障进入大脑，特别是脑脊液(CSF)的能力，并定量了CSF和血清中存在的构建体。将FC5-mFc-ABP以指定剂量(2.5、6.25、12.5和25mg/kg)通过尾静脉静脉内施用于大鼠。连续收集血清和脑脊液。使用nanoLC-MRM方法定量FC5-Fc-ABP水平。
NRC通过修改先前描述的方法开发了用于小脑延髓池CSF多重采样的技术(Huang等，1995年；Kornhuber等，1986年)。所有动物均购自Charles River LaboratoriesInternational，Inc(Wilmington,MA,USA)。将动物分为三组，每组存放于12小时光照/黑暗周期，温度为24℃，相对湿度为50±5％，并使得其能够自由接触食物和水。所有动物程序均已获得NRC动物保护委员会的批准，并符合加拿大动物保护委员会的指导方针。所有研究均使用8-10周龄的雄性Wistar大鼠(体重范围230–250g)。
在所有实验中，均以等摩尔剂量(7mg/kg)将测试抗体(FC5 Fc-融合物)静脉内施用至尾静脉。CSF样品收集是通过在96小时内针刺最多5次从小脑延髓池中提取的。对于样品采集，将大鼠用3％异氟烷短暂并轻微麻醉，将其放置在立体定位框架中，头部向下旋转45°角。从枕骨顶开始在耳朵之间做一个2厘米的中线切口，并分离肌肉以露出覆盖小脑延髓池的硬脑膜。将27G蝶形针(QiuckMedical，Cat#SV27EL)的管接到1ml注射器上，以刺穿硬脑膜并抽吸约20μl的CSF。然后将CSF转移到样品玻璃小瓶(Waters，Cat#186000384c)中，并置于-80℃的冰箱中直至进一步分析。
在市售的试管(BD microtainer，Cat#365956)中从尾静脉收集血样。在室温下凝结15-30分钟后，通过在1100rcf(3422rpm)下离心10分钟去除凝块；然后将血清转移到干净的玻璃小瓶(Waters，Cat#186000384c)中，在干冰上冷冻并保存在-80℃下直至进一步分析。在收集结束时，通过心脏穿刺处死大鼠。使用WinLin 6.0程序进行血液和CSF PK分析。
如实施例4中所述，血清和CSF样品通过质谱和使用表1中所示的肽特征基于nanoLC-SRM的定量进行分析。
CSF的收集是一个精细的过程，在此过程中脑脊液很容易被血液污染。由于预计CSF中VHH的量要比血液小得多(<0.1％)，因此即使受到血液轻微污染也可能严重损害单个CSF样品的值。因此，有必要为血液污染的CSF样品制定严格的排除标准。为了评估血液-CSF白蛋白的比例，开发了一种nanoLC-SRM方法来定量测定血浆和CSF中的白蛋白水平。为了在多重分析中对其他肽峰的干扰最小，基于白蛋白肽APQVSTPTLVEAAR的独特保留时间和m/z值(Mol Pharm)。如上所述，使用SRM在CSF和血浆样品中定量肽的强度。每只大鼠的白蛋白比例计算如下：
白蛋白比例＝每nL分析血浆的强度/每nL CSF分析的强度
1500以下的比例被认为是血液污染。
如图5所示，FC5-mFc-ABP以时间和剂量依赖性方式出现在CSF中，Cmax在12至24小时之间，表明通过FC5在体内将ABP转运到大脑和CSF隔室中(A)血清PK参数(图5和下表2)显示，FC5-mFc-ABP的α和β半衰期与完整IgG(包含大鼠Fc的基准抗体)的半衰期相似，并显著高于没有Fc的ABP或FC5或FC5-ABP的半衰期。
表2
Figure BDA0002680384190000341
■基准mAb和FC5mFc产物的血清半衰期(分配期和终末期)相似
实施例6：将FC5-ABP构建体递送至非啮齿大型动物的大脑中
在比格犬中评估了FC5-mFc-ABP的血清和CSF PK曲线。通过向10-12岁的比格犬静脉内注射施用FC5-mFc-ABP，并连续收集血清和CSF，并通过如上文实施例5中所述的nanoLC-MRM(左图)和使用Fc特异性抗体的蛋白质印迹进行分析(图6B)。星号表示受血液污染的样品(在MRM分析中未显示)。可以看出，FC5-mFc-ABP以时间依赖性方式出现在CSF中，表明FC5在体内跨越犬血脑屏障转运了ABP，证实了BBB载体的平移性质。通过WinNonlin软件分析了PK参数和CSF暴露，并显示在下表3中。
表3
Figure BDA0002680384190000351
实施例7：BBB穿透性
与人Fc(hFc)融合并化学连接至ABP(FC5-hFc-ABP)的FC5在体内(大鼠模型)的BBB穿透性和CSF表象。根据制造商的说明(ThermoFisher Scientific)，使用杂双功能交联剂磺基SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)将FC5-hFc与ABP-胱酰胺连接。化学偶联分子以6.25mg/kg的剂量通过尾静脉静脉内施用于大鼠，并在4和24小时收集血清和CSF样品并分析，如图5所述。FC5-hFc-ABP以时间依赖方式出现在CSF中，但是没有BBB载体的Fc-ABP不能出现在CSF中，证实了FC5介导的ABP跨越血脑屏障的转运，并如图7所示。
实施例8：将BBB-Fc-L-ABP构建体递送至大脑
在小鼠中评估了实施例2的FC5-Fc-ABP构建体在体内迁移过血脑屏障并穿透大脑实质的能力。
通过尾静脉以15mg/kg的剂量施用于野生型和转基因(AD-Tg，B6，Jackson Lab)小鼠(图8A和8B)或以7.5、15和30mg/kg的剂量施用于AD-Tg小鼠，并循环4和24小时。然后通过左颈总动脉以1ml/min的速度用10ml肝素化(100U/ml)的生理盐水彻底灌注小鼠，以促进大脑的特异性灌注。然后除去大脑，解剖海马体和皮质组织，并立即冷冻并保存在-80℃直至使用。冷冻的组织在冰冷的均质缓冲液中进行使用Dounce均质器(4℃，10-12次)均质处理，所述缓冲液含有50mM Tris-HCl pH 8、150mM NaCl和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，Oakville，ON)。然后将样品在40℃下超声处理3次，每次10秒，除去不溶物质(4℃下10000xg 10分钟)。使用实施例4中描述的方法和表1中所示的肽特征，分析上清液的蛋白含量，并将约0.5g蛋白用于SRM分析(图8A)。还使用mFc特异性抗体通过蛋白质印迹分析样品(图8B和8C)。属于融合分子所有三个组分(FC5、FC和ABP)的特定“特征”肽在皮质和海马体中均被MRM检测到，表明FC5载体成功地将ABP递送至大脑的靶标区域(图8A中仅显示了来自FC5肽的数据)。与通常为融合至Fc或单独Fc片段的对照单域抗体A20.1测得的～50ng/g组织相比，在不同时间点测得的水平在750-1400ng/g脑组织之间。通过蛋白质印迹分析检测组织提取物中的Fc和ABP(8B和8C)进一步证实了这一点。通过蛋白质印迹在仅接受生理盐水的动物中未检测到融合分子的蛋白质信号。通过蛋白质印迹在大脑的靶标区域中检测到FC5-mFc-ABP水平的剂量依赖性增加(图8C)。这些结果清楚地表明，FC5在野生型(WT)和AD-Tg小鼠中成功地将ABP递送至大脑的靶标区域(即海马体和皮质)。
实施例9：清除小鼠大脑中的A
为了评估ABP对Tg小鼠淀粉样蛋白负担的效果，比较了单独使用ABP或FC5-ABP构建体处理的结果。
单独用ABP(图9A)或与BBB载体FC5融合的ABP(图9B和图9C)处理之间的比较。使用两种不同的AD Tg小鼠模型，三重转基因(3X Tg-AD，含有PS1M146V，APPSwe和tauP301L转基因的sv129/C57BL6小鼠，Dr.F.M.LaFerla，University of California)和双重转基因(B6.Cg-Tg，含有PSEN1dE9和APPSwe转基因，Jackson Lab)；在3个月或2个月周期内，每隔一天分别对小鼠皮下(sc)施用300nmol/kg的游离ABP。在处理结束时，根据制造商测定步骤，使用商业化分析试剂盒(InVitrogen,KHB3544)通过ELISA测量大脑中的Aβ水平。单独使用ABP的处理在2-3个月的多次处理后(每隔一天)使得脑Aβ降低25-50％(9A)。将FC5-mFc-ABP构建体静脉内注射到双转基因AD小鼠中(B6.Cg-Tg，15mg/kg；相当于220nmol/kg)，并如实施例8所述，通过ELISA和nanoLC-MRM测量注射后24小时的脑A水平。出乎意料的是，在用FC5-mFc-ABP处理的24小时内观察到约50％的淀粉样蛋白减少(图9B)，表明通过FC5有效地将ABP递送至大脑，大大提高了ABP在降低大脑中Aβ水平的效果。CSF分析还表明在FC5-mFc-ABP处理后24小时内Aβ1-42水平显著降低(图9C)。通过MRM或ELISA分析检测到的Aβ的肽序列(SEQ:LVFFAEDVGSNK，表1)与ABP识别的Aβ抗原表位相距遥远/不同(因此，不会干扰ELISA或MRM对其的定量)。
实施例10：将Fc组分引入FC5-ABP构建体中可延长其血清半衰期
如实施例2所述，在CHO细胞中产生了FC5-ABP(FC5 SEQ ID NO 17；和ABP SEQ IDNO 36)和FC5-hFc-ABP(FC5 SEQ ID NO 17；hFc 1x7 SEQ ID NO 49和ABP SEQ ID NO 36)构建体，如实施例5所述测量血清PK。将FC5-ABP和FC5-Fc-ABP构建体以15mg/kg静脉内注射施用至大鼠尾静脉中，连续收集血清并通过使用FC5-和ABP-特异性抗体的直接ELISA定量FC5-ABP和FC5-Fc-ABP水平，将血清样品在磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释(1：5000)，加到Maxisorb平板上，在4℃下孵育过夜。将ELISA平板用100μl PBS洗涤3次，并在室温(RT)下用TBST中的1％BSA封闭30分钟。除去封闭液，并将板与HRP偶联的FC5单克隆抗体一起孵育(90分钟)。孵育并洗涤后，100μl SureBlue试剂加入反应混合物并在室温避光孵育10-15分钟，反应结束时加入100μl 1M HCl，生成的颜色在酶标仪中于450nm读取。如图10所示，与包含Fc成分的FC5-ABP构建体(FC5-Fc-ABP)相比，没有Fc的FC5-ABP在血清中(一小时内)被非常快速地清除。还使用ABP特异性抗体重复此分析，结果相似。上样后，首先将ELISA板与ABP兔多克隆抗体孵育(90分钟)，然后与HRP偶联的兔第二抗体孵育(30分钟)，并如上所述检测结合的抗体(数据未显示)。
实施例11：从大鼠大脑清除A
在四个星期的时间内，每周通过尾静脉给AD-Tg大鼠注射生理盐水或FC5-mFc-ABP(负担剂量为30mg/kg以及随后的每周四次15mg/kg的剂量)。通过nanoLC MRM分析了FC5-mFc-ABP和Aβ的CSF水平。在处理的四个星期前后，使用特异性Aβ结合剂[18F]NAV4694通过PET扫描确定大脑Aβ水平。FC5-mFc-ABP在24小时内降低了大鼠的CSF Aβ水平。如在Tg小鼠中，观察到FC5-mFc-ABP的CSF水平与Aβ之间的反比关系，表明通过FC5将ABP递送至大脑和CSF的靶标结合和Aβ的快速清除(图11A和图11B)。PET扫描进一步证实了这一点，PET扫描清楚地表明在用FC5-mFc-ABP处理四个星期后大鼠大脑Aβ水平显著降低(30-50％)(图11C)。
实施例12：增加的海马体体积和改善的神经元连接性
在实施例11中描述的试验中，在处理之前和之后，生理盐水或FC5-mFc-ABP处理的Tg小鼠进行容积和功能性磁共振成像(MRI)。容积MRI(图12A)示出了与生理盐水处理的对照组相比，ABP处理的Tg小鼠海马体体积增加，表明ABP处理可阻止海马体萎缩。功能性MRI(图12B)示出了与生理盐水处理的对照组相比，ABP处理的Tg小鼠前扣带回皮质的连接性改善，表明神经元连接性得以恢复。该数据证实了目前提供的意义，效果和优越的治疗优势。
实施例13：FC5-mFc2a-ABP处理显示犬中CSFA水平降低
如实施例6所述，在两次剂量(15mg/kg和30mg/kg)的比格犬中评估FC5-mFc-ABP的血清和CSF PK曲线。除了测量FC5-mFc2a-ABP的血清和CSF水平外，还如实施例9所述通过nanoLC-MRM测量了Aβ的CSF水平。可以看出，FC5-mFc-ABP以剂量和时间依赖性方式出现在CSF中(图13B)。最重要的是，如Tg小鼠和Tg大鼠所见，CSF Aβ水平显著下降，与CSF FC5-mFc2a-ABP水平成反比。
实施例14：具有不同BBB载体的ABP融合分子的产生
为了评估ABP融合分子的多功能性，将ABP与另一种人源化BBB载体IGF1R5(H2)成功融合。如图12所示，分子的双功能(ABP结合Aβ寡聚体的能力(ELISA和重叠分析)以及IGF1R5在体外跨越BBB模型递送ABP的能力(数据未显示))得以保留。这清楚地表明，ABP可以与不同的BBB跨越单域抗体融合，以递送至大脑。
实施例15：通过不同的BBB-跨越单域抗体-Fc-ABP构建体的Aβ寡聚体结合
提供了具有修饰的ABP的各种FC5-Fc-ABP构建体(如表1和图15所示的SEQ ID No所示的分子的位点特异性突变或C-末端部分的去除)。如图15所示，通过ELISA方法，所有构建体在结合Aβ寡聚体上均保持相似的效力。
实施例16：为改善稳定性和生物可制造性的具有特定突变的FC5-hFc1X7-L-ABP的 产生
在CHO细胞中产生带有特定突变(ABP，SEQ ID NO 35；ABP，SEQ ID NO 36)的FC5-hFc1X7-L-ABP，并如图2所述在还原(R)和非还原(NR)条件下在SDS-PGE上分离，用考马斯蓝染色。经分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用FC5特异性，hFc特异性和ABP特异性抗体进行免疫印迹。在另一组中，还通过重叠分析测试了融合分子中ABP的Aβ结合。用Aβ特异性抗体6E10检测到结合的Aβ。可以看出，用特定突变对ABP进行系统修饰(如此处所示，例如ABP SEQ ID NO:35和ABP SEQ ID NO:36)，如本文清楚的表示，显著改善了所产生分子的稳定性，例如，通过在还原和非还原条件下的单个蛋白条带(与图2A的其他ABP构建体比较，其中，可以看到双蛋白条带)。融合分子稳定性的这种显著改善有利于促进均质分子的生物可制造性。
实施例17：各种FC5-Fc-L-ABP构建体和IGF1R5-Fc-ABP构建体在体外的BBB穿透 性。
如图4所述的在体外大鼠BBB模型中评估了BBB跨越，并通过nanoLC-MRM方法检测了跨越血脑屏障的分子。与人源化FC5和IGF1R载体融合的所有ABP变体均有效地跨越了血脑屏障。如预期的那样，非BBB可穿透的sdAb A20.1没有跨越BBB，同样，与A20.1融合的ABP也没有穿透BBB(图17A)。在图17B中，示出了通过nanoLC-MRM检测到融合分子的所有三个组分FC5，Fc和ABP的“指纹”肽。
本文描述的实施方案和实施例是说明性的，并不意味着限制要求保护的本发明的范围。发明人希望前述实施方案的变型，包括替代，修改和等同，被权利要求书涵盖。此外，所讨论的特征组合对于本发明的解决方案可能不是必需的。
实施例18：人源化的FC5-Fc-ABP构建体[FC5(H3)-hFc-ABP(具有ABP SEQ ID NO: 35和ABP SEQ ID NO:36)]在体外大鼠血脑屏障完整地跨越。如实施例4中所述评估人源化FC5-ABP融合分子的血脑屏障跨越。通过蛋白质印迹和ELISA方法分析跨越血脑屏障的融合分子。用hFc特异性和ABP特异性抗体检测免疫印迹。两种抗体均识别跨越BBB的分子(底室)，并且分子大小与应用于体外BBB(顶室)的FC5-ABP融合构建体的分子大小相同，表明跨越BBB的分子保持完整。这通过夹心ELISA分析得以证实，其中，在BBB跨越的分子中用FC5特异性抗体捕获并且在捕获的分子中用ABP抗体检测。
实施例19：人源化的FC5-Fc-ABP构建体[FC5(H3)-hFc-L-ABP(具有ABP SEQ ID NO:35和ABP SEQ ID NO:36)]在体内跨越BBB运输并通过FC5完整递送至大脑。如实施例8中所述评估小鼠中人源化FC5-ABP融合分子的血脑屏障跨越和大脑递送。静脉内施用该分子四小时后并进行心脏内灌注，去除大脑，并在RIPA缓冲液中提取皮质并通过用ABP特异性抗体检测的蛋白质印迹和夹心ELISA(通过用FC5特异性抗体捕获分子并用ABP特异性抗体检测)来检测是否存在注射的FC5-ABP融合分子。蛋白质印迹显示皮质中存在全长FC5-ABP构建体。通过夹心ELISA证实了这一点，其揭示了分子的完整性质，如通过FC5特异性抗体捕获分子并用ABP特异性抗体检测捕获的分子的能力所表明。
实施例20：人源化的FC5-Fc-ABP构建体[FC5(H3)-hFc-ABP(ABP SEQ ID NO 36)的 离体(A)和体内(B)结合(靶标结合)
如实施例3中所述进行免疫组织化学。将来自AD-转基因小鼠的脑切片与FC5(H3)-hFc1X7-ABP(ABP，SEQ ID NO:36)一起孵育，并用结合有HRP的FC5-特异性抗体观察结合的融合分子。作为阴性对照，将切片与无构建体或未融合ABP的FC5-hFc构建体一起孵育。简而言之，将来自APP/PS1转基因小鼠的包含皮质和海马体的福尔马林固定的40μm自由漂浮切片在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 9)中于80℃进行抗原恢复30分钟，然后冷却至室温。将切片在PBS中冲洗，用PBS中的3％H2O2处理30分钟以封闭内源性过氧化物酶，然后再次冲洗。在包含0.3％Triton X-100的Dako不含血清的蛋白质封闭中孵育1小时后，将切片与包含0.3％Triton X-100的Dako稀释剂中的FC5(H3)-hFc1x7-ABP或等摩尔量的FC5-hFc1x7一起在室温下孵育90分钟。在PBS中彻底冲洗后，将切片与Dako稀释剂中的抗FC5-HRP在室温下孵育60分钟，再次冲洗，并然后按照试剂盒说明使用Vector Immpact DAB显影。将切片放在Superfrost plus载玻片上，使得能够风干过夜，然后再水化，用甲基绿复染，浸入丙酮/0.05％乙酸(v/v)中，并脱水，清除并用Permount盖玻片。使用FC5(H3)-hFc1X7-ABP构建体会看到选择性结合(黑点)，而在没有ABP的FC5(H3)-hFc1X7中则看不到选择性结合(黑点)，表明大脑中Aβ沉积物(靶标结合)依赖于ABP结合。在未产生淀粉样蛋白沉积物的野生型小鼠的脑切片中未观察到结合(数据未显示)。
海马体内注射FC5(H3)-hFc-ABP构建体至AD转基因小鼠后，检测到了Aβ沉积物的相似结合(B)。海马体内注射后四小时，对Tg小鼠进行灌注，取出大脑并切成薄片。用ABP特异性多克隆抗体观察与Aβ沉积物结合的FC5(H3)-hFc-ABP(亮白色点)。首先将脑切片与ABP特异性单克隆抗体，然后与Alexa-647偶联的抗兔Fc二抗孵育。
实施例21：人源化的FC5-Fc-ABP构建体(FC5(H3)-hFc-ABP(SEQ ID NO:54))在体 内的靶标结合。荧光团标记的(图18A)或天然的FC5-ABP(图18B)的融合分子被显微注射到野生型(Wt)和AD-Tg(Tg)小鼠的海马体区中，在显微注射荧光团标记的FC5-ABP融合分子后30分钟，取出大脑，切成薄片并在荧光显微镜下观察。如图21A所示，注射的分子通过与Aβ特异性抗体的共定位证实与Aβ沉积物结合；在一项平行研究中，海马体内注射天然的FC5-ABP融合分子4小时后，收集注射区(ips)和非注射区(con)的海马体结构并在Tris缓冲盐水中匀浆。将海马体提取物用FC5抗体为捕获抗体，用ABP或Aβ特异性抗体作为检测抗体进行夹心ELISA。如图21B所示，通过Aβ特异性抗体检测到的下拉复合物中Aβ的存在所表明，显微注射的FC5-ABP分子保持完整，并且ABP能够在体内参与并与靶标Aβ结合。
实施例22：非人源化和人源化FC5-Fc-L-ABP构建体之间的PK/PD比较
如图5所述，以15mg/kg的剂量通过尾静脉注射将FC5-mFc2a-ABP或FC5(H3)-hFc1x7-ABP静脉内施用至大鼠体内。使用nanoLC-MRM方法定量FC5-Fc-ABP水平。如图22A所示，对于非人源化和人源化构建体，血清和CSF PK曲线非常相似。如图9B所述，通过以15mg/kg的尾静脉注射向Tg小鼠静脉内施用FC5-mFc2a-ABP或FC5(H3)-hFc1x7-ABP。如图9B所述，通过nanoLC-MRM测量CSF中的FC5-Fc-ABP和Aβ水平。如图22B所示，CSF中非人源化和人源化的FC5-Fc-ABP水平相似，并且最重要的是，CSF Aβ水平的变化(降低)也非常相似，表明FC5-Fc-ABP构建体的人源化不影响融合构建体的PK和PD曲线。
实施例23：在CHO细胞中产生FC5-(H3)-hFc1x7-ABP(6G)融合蛋白(SEQ ID NO:56) 的过程中C-末端切割产物的产生
如实施例2和16中所述，在稳定的CHO细胞系中产生融合蛋白。使用蛋白A亲和柱(实施例2)纯化后，使用阳离子交换(CEX)色谱法进一步纯化融合蛋白。CEX色谱图揭示了FC5-(H3)-hFc1x7-ABP(6G)变体的存在。对每个CEX部分进行抗hFc抗体的蛋白质印迹(23A)和质谱(23B)的分析后，确定融合蛋白变体的产生是由于生产过程中ABP肽的C-末端切割引起的。C-末端切割发生在FC5-(H3)-hFc1x7-ABP(6G)蛋白中ABP序列的特定位点，如SEQ IDNO:37至SEQ ID NO:43所示，其是SEQ ID NO:36ABP序列C-末端切割的肽。当以二聚体形式掺入融合蛋白中时，SEQ ID NO:36的C-末端切割产物或具有SEQ ID NO:47的ABP显示出意外的稳定性和β-淀粉样蛋白结合活性。而且，通过ELISA和Western blot A重叠分析(如实施例2中所述)评估，与功能性同源二聚体形式相比，这些C-末端切割产物有利地保持了β-淀粉样蛋白结合活性的等效生物学功能(EC50，图23A)。这些C-末端切割的产物有利地增加了功能性和稳定的β-淀粉样蛋白结合产物的可制造性和可分离的产率。这些稳定的切割产物并不明显，并且对于β-淀粉样蛋白结合功能肽以及相应的融合肽和二聚体产率而言是有利的。因此，在CHO细胞中生产过程中，ABP的C-末端切割得到如图1Ai，1Aii和1Aiii所示的双功能同源二聚体，双功能异源二聚体(ABP臂均具有功能性，并可能包含任意ABP和/或任意C-末端切割但具有功能性的ABP)和单功能性融合蛋白的异源二聚体(二聚体中的一个功能性ABP)。融合蛋白(SEQ ID NO:56)的切割产物的精确性质才是非显而易见的，并且在生物制造和蛋白生产中还没有被预测到，直到进行了详细的分析。现在未知或现在尚不清楚的是，现在定义的C-末端切割产物会有利地结合β-淀粉样蛋白并成为稳定的肽。包含双功能同源二聚体，单功能和双功能异源二聚体的混合物(峰2，图23A，(EC 50 19nM))的CEX部分的β-淀粉样蛋白结合活性与双功能同源二聚体(峰3，图23A(EC 50 13nM))非常相似，表明异源二聚体和同源二聚体部分(CEX的峰2和3)可以合并而不会显著丧失β-淀粉样蛋白的结合活性。从而显著并有利地提高了在大规模生物制造过程中，FC5(H3)-hFc1x7-ABP作为一种功能齐全，稳定的融合蛋白的分离和产率。如图23C所证实的，其表明改善的CEX条件产生了高产率(占施用于柱子的总蛋白的86.4％)的部分(峰2图23C)。如图23B所示，峰2的典型质谱分析由SEQ ID NO:56(MW 87695)的同源二聚体和包括SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57(MW＝87470)；SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:60(MW＝87085)和SEQ ID NO:56以及完全切割的非功能性ABP(MW＝84040)的异源二聚体的混合物组成。该组合库(B3至B6部分)的β-淀粉样蛋白结合活性(EC 50)与主要包含如图23C，B和C所示的同源二聚体(C10-D2，E12)或异源二聚体形式(C6-C8)的其他CEX部分非常相似。
实施例24：大脑内递送包含同源二聚体和异源二聚体的混合物的FC5(H3)- hFc1x7-ABP融合蛋白
如实施例8和19中所述评估FC5(H3)-hFc1x7-ABP跨越血脑屏障的转运并递送至大脑靶标区域。FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白(作为来自实施例23的同源和异源二聚体的混合物)经由野生型(wt)和Tg小鼠的尾静脉以15mg/kg施用，在注射后4小时(数据未显示)或24小时后，将大脑的皮质和海马体区域如实施例8和19所述解剖并评估。如图24所示，通过夹心ELISA(24A)和蛋白质印迹分析(24B)评估了在靶标区域中检测到FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白。结果与以FC5(H3)-hFc1x7-ABP(SEQ ID NO:56，见图19)为主要同源二聚体形式的大脑递送非常相似，进一步证实了混合物中的FC5(H3)-hFc1x7-ABP的异源二聚体形式不会影响血脑跨越和融合蛋白的大脑递送。
实施例25：包含同源二聚体和异源二聚体的混合物的FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋 白的CSF暴露及其对CSFβ-淀粉样蛋白的影响
静脉内注射FC5(H3)-hFc1x7-ABP到Tg小鼠中24小时后，收集CSF，并如实施例5和22中所述通过MRM测量FC5(H3)-hFc1x7-ABP和β-淀粉样蛋白的水平。如图25中所示，FC5(H3)-hFc1x7-ABP的CSF暴露和CSF Aβ水平的变化(降低)与FC5(H3)-hFc1x7-ABP的主要同源二聚体形式(SEQ ID ID NO:56，参见图22)中观察到的非常相似，进一步证实混合物中的FC5(H3)-hFc1x7-ABP不影响FC5(H3)-hFc1x7-ABP融合蛋白的功能效果。
序列
Figure BDA0002680384190000391
Figure BDA0002680384190000401
Figure BDA0002680384190000411
Figure BDA0002680384190000421
Figure BDA0002680384190000431
Figure BDA0002680384190000441
Figure BDA0002680384190000451
参考文献
本文和本申请全文所引用的所有专利、专利申请和出版物再次通过引用的方式并入。
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WO 2011/127580
WO 2007/036021
WO 2006/133566

Claims (58)

1.结合β-淀粉样蛋白的经分离肽，所述经分离肽包括以下氨基酸序列：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
其中，X1＝K、G或者A或者X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，(SEQ ID NO:46)。
2.结合β-淀粉样蛋白的经分离肽，所述经分离肽包括以下氨基酸序列：
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI(SEQ ID NO:31)
其中，X1＝K、G或者A，或者X1＝G或者A，X2＝K、G或者V，X3＝R、G或者A，X4＝K、G或者A，X5＝R、G或者V，X6＝N、G或者V，X7＝K、G或者V，X8＝R、G或者A，X9＝K、G或者A，
或其任意C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合产物。
3.权利要求1或2所述的经分离肽，其中，所述氨基酸序列包括选自由以下项组成的组的序列：
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:32)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:33)；
KTFKTRGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:34)；
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:35)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI(SEQ ID NO:36)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK(SEQ ID NO:37)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV(SEQ ID NO:38)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR(SEQ ID NO:39)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS(SEQ ID NO:40)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK(SEQ ID NO:41)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL(SEQ ID NO:42)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ(SEQ ID NO:43)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTVKNI(SEQ ID NO:44)；
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRG(SEQ ID NO:45)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGG(SEQ ID NO:47)；和
与其基本等效的序列，或其C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合肽。
4.权利要求3所述的经分离肽，其中，所述C-末端切割的β-淀粉样蛋白结合肽包括选自由以下项组成的组的序列：
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK(SEQ ID NO:37)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV(SEQ ID NO:38)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR(SEQ ID NO:39)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS(SEQ ID NO:40)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK(SEQ ID NO:41)；
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL(SEQ ID NO:42)；和
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ(SEQ ID NO:43)。
5.权利要求1至4中任一项所述的经分离肽，所述经分离肽与抗体或抗体片段融合，所述抗体和抗体片段能够迁移过血脑屏障。
6.权利要求5所述的经分离肽，所述经分离肽连接至Fc片段。
7.权利要求6所述的经分离肽，其中，所述经分离肽、所述抗体或其片段，和所述Fc片段形成单链多肽融合蛋白。
8.权利要求6至7中任一项所述的经分离肽，其中，所述Fc片段包括具有减弱效应器功能的Fc。
9.融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1至8中任一项所述的经分离肽，和抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段迁移过所述血脑屏障(BBB)。
10.权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是进一步包括Fc片段的单链多肽。
11.权利要求10所述的融合蛋白，其中，所述单链多肽形成二聚体。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述二聚体是关于ABP的同源二聚体或异源二聚体，并包括至少一个能够结合β-淀粉样蛋白的ABP。
13.权利要求10至12中任一项所述的融合蛋白，其中，所述单链多肽包括：
抗体或其片段；
结合β-淀粉样蛋白的肽，所述肽选自由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46，和SEQ ID NO:47组成的组；和
Fc片段，所述Fc片段选自由SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50组成的组。
14.权利要求13所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段包括含以下项的序列
互补决定区(CDR)1序列GFKITHYTMG(SEQ ID NO:1)、CDR2序列RITWGGDNTFYSNSVKG(SEQID NO:2)、CDR3序列GSTSTATPLRVDY(SEQ ID NO:3)。
15.权利要求14所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段包括选自以下任一项的序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和与上述任意序列基本相同的序列。
16.权利要求13所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段包括选自由以下项组成的组的序列：
抗体或其片段，包括CDR1序列EYPSNFYA(SEQ ID NO:4)、CDR2序列VSRDGLTT(SEQ IDNO:5)、CDR3序列AIVITGVWNKVDVNSRSYHY(SEQ ID NO:6)；
抗体或其片段，包括CDR1序列GGTVSPTA(SEQ ID NO:7)、CDR2序列ITWSRGTT(SEQ IDNO:8)、CDR3序列AASTFLRILPEESAYTY(SEQ ID NO:9)；和
抗体或其片段，包括CDR1序列GRTIDNYA(SEQ ID NO:10)，CDR2序列IDWGDGGX(SEQ IDNO:11)；其中，X是A或T，CDR3序列AMARQSRVNLDVARYDY(SEQ ID NO:12)。
17.权利要求16所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段包括选自以下任一项的序列：SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21，和SEQ ID NO:24。
18.权利要求17所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段包括选自以下任一项的序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26和与上述任意序列基本相同的序列。
19.权利要求13至18所述的融合蛋白，其中，包括所述抗体或其片段的单链多肽通过所述Fc片段连接至所述结合β-淀粉样蛋白的肽。
20.根据权利要求13或19所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是单链多肽，所述单链多肽包括选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71，和与其基本相同的序列。
21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中，所述单链多肽形成二聚体。
22.根据权利要求21所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白是含任意合适的肽接头的单链多肽。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中，所述肽接头包括氨基酸序列，所述氨基酸序列使得所述融合蛋白的连接组分能够维持其未受限制的所期望的生物学功能。
24.根据权利要求22或23所述的融合蛋白，其中，所述肽接头包括序列(GGGS)n、(GGGGS)n，或任意合适的肽连接序列。
25.根据权利要求11至24中任一项所述的融合蛋白，其中，所述单链多肽形成二聚体多肽。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中，所述二聚体多肽包括关于所述二聚体多肽中包括的β-淀粉样蛋白结合蛋白(ABP)的同源二聚体或异源二聚体。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中，所述异源二聚体包括至少一个能够结合β-淀粉样蛋白的功能性ABP。
28.权利要求9至27中任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段是人源化的。
29.权利要求9至28中任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段是单域抗体(sdAb)。
30.权利要求9至29中任一项所述的融合蛋白，其中，所述Fc片段是小鼠Fc2a或人Fc1。
31.权利要求30所述的融合蛋白，其中，所述Fc片段包括SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50。
32.权利要求9至31中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括连接至所述Fc片段的N-末端的所述抗体或其片段，和连接至所述Fc片段的C-末端的多肽结合β-淀粉样蛋白的所述多肽。
33.权利要求9至13和16至31中任一项所述的融合蛋白，其中，所述抗体或其片段连接至所述Fc片段的C-末端，并且结合β-淀粉样蛋白的所述多肽连接至所述Fc片段的N-末端。
34.权利要求33至33所述的融合蛋白，其中，所述接头独立选择的连接所述抗体或其片段，和/或连接结合β-淀粉样蛋白的所述多肽至所述Fc的接头序列。
35.权利要求34所述的融合蛋白，其中，所述接头序列是GGGGSGGGGS、GGGSGGGGS，如SEQID NO:71提供的任意合适的接头或任意合适的接头。
36.权利要求9至35中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白形成二聚体，所述二聚体包括至少一个根据权利要求1至8中任一项所述的肽。
37.权利要求38所述的融合蛋白，其中，所述二聚体包括两个单链多肽，其中，所述两个单链多肽是：包括两个ABP的双功能同源二聚体，所述ABP选自SEQ ID NO:31至47中任一项；包括两个不同ABP的双功能异源二聚体，所述ABP选自SEQ ID NO:31至47中任一项；或者包括一个ABP的单功能异源二聚体，所述ABP选自SEQ ID NO:31至47中任一项。
38.药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1至8中任一项所述的经分离肽或其任意组合，和药理学上可接受的载体。
39.药物组合物，所述药物组合物包括权利要求9至37中任一项所述的融合蛋白或其任意组合，和药理学上可接受的载体。
40.核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至39中任一项所述的任意蛋白。
41.载体，所述载体包括权利要求40所述的核酸分子。
42.试剂盒，所述试剂盒包括权利要求38或39所述的药物组合物。
43.根据权利要求38或39所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗患者的阿尔茨海默病。
44.治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括施用权利要求9至37中任一项所述的融合蛋白或者权利要求38或39所述的药物组合物至有需要的受试者。
45.降低受试者中β-淀粉样蛋白水平的方法，所述受试者具有升高的淀粉样蛋白β水平，所述方法包括重复非肠道施用足够量的权利要求38或39所述的药物组合物至受试者的步骤。
46.权利要求45所述的方法，其中，非肠道施用是皮下施用或静脉施用。
47.权利要求45或46所述的方法，其中，重复非肠道施用权利要求38或39所述的组合物后，具有升高的淀粉样蛋白β水平的受试者中β-淀粉样蛋白水平降低。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，重复非肠道施用权利要求38或39所述的组合物四周内，β-淀粉样蛋白降低。
49.根据权利要求47所述的方法，其中，非肠道施用权利要求38或39所述的组合物后，具有升高的脑脊液(CSF)的受试者的CSF中β-淀粉样蛋白水平降低。
50.根据权利要求46所述的方法，其中，单次非肠道施用权利要求38或39所述的组合物24小时内，具有升高的脑脊液(CSF)的受试者的CSF中β-淀粉样蛋白水平降低。
51.降低受试者中β-淀粉样蛋白水平的方法，所述受试者具有升高的淀粉样蛋白β水平，所述方法包括施用权利要求9至37中任一项所述的融合蛋白。
52.药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求9至37中任一项所述的融合蛋白的混合物。
53.权利要求52所述的药物组合物，其中，所述融合蛋白的混合物包括ABP双功能同源二聚体融合蛋白、ABP双功能异源二聚体融合蛋白和ABP单功能异源二聚体融合蛋白或其任意组合。
54.权利要求52和53所述的药物组合物，其中，经分离单链多肽融合物的所述混合物是药学上有效的混合物，所述混合物包括有效产率的功能性融合蛋白。
55.权利要求52至54中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物和药学上可接受的稀释剂、载体、溶媒或赋形剂用于缓解阿尔茨海默病的症状。
56.权利要求55所述的药物组合物，所述药物组合物用于降低受试者中β-淀粉样蛋白水平，所述受试者具有升高的淀粉样蛋白β水平。
57.降低受试者中β-淀粉样蛋白水平的方法，所述受试者具有升高的淀粉样蛋白β水平，所述方法包括将权利要求55所述的药物组合物引入受试者身体的步骤。
58.权利要求56所述的药物组合物，所述药物组合物用于降低受试者的所述大脑、组织，或体液(CSF和血液)中β-淀粉样蛋白水平，所述受试者具有升高的β-淀粉样蛋白水平。
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