KR20200116143A - 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

아밀로이드-β 결합 펩티드의 뇌-관통 조성물이 개시되어 있다. 이는 예를 들어 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 및 혈액-뇌 장벽을 횡단하여 뇌로 관통이동할 수 있는 Fc 단편을 통해 연결된 아밀로이드-β 표적 펩티드를 포함하는 이관능성 분자 및 이를 포함하는 조성물로서, 알츠하이머병 치료에서 유용할 수 있다. 알츠하이머병 치료를 위한 상기 조성물을 사용하는 방법이 개시되어 있다.

Description

혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 및 이의 용도
본 발명은 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier)을 관통이동 (transmigrate)하는 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편, 면역글로불린 Fc 도메인 또는 이의 단편, 및 베타-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함할 수 있는 화합물, 융합 단백질 및 조성물, 및 알츠하이머병 치료에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 파킨슨병은 현재 이들 장애 상태에 대한 효과적인 치료제가 없기 때문에 고령화 사회에 점점 더 부담이 되고 있다. 알츠하이머병 (AD)은 65세 이상 인구의 대략 15%가 이환된 비가역적 신경퇴행성 장애이고, 노령 인구에서 진행성 지적 인지 장애의 주된 원인이다 (Hardy et al, 2014).
AD에서, 콜린성 뉴런의 심각한 손실이 있으며, 이와 함께 결과적으로, 기억 처리 및 저장에 관여하는 중요 신경전달물질인 아세틸콜린 (ACh) 수준이 감소되었다. 또한, 신경전달물질인 글루타메이트에 의해 유도되는 흥분독성이 또한 AD의 발병기전에 관여되어 있다. 따라서, 콜린성 증강 및/또는 글루타메이트 독성의 억제가 AD에서 인지를 개선할 수 있다. 실제로, AD 치료를 위해 유일하게 FDA 승인된 약물은 ACh의 손실을 방지하기 위한 아세틸콜린 에스테라제 (AChE) 억제제 (예: 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민) 및 특정 글루타메이트 수용체의 억제제 (예: 메만틴)이다 (Mangialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010; Savonenko et al, 2012). 그러나, 이들 대증 약물의 유익한 효과는 제한적이고 일시적이어서, 인지 기능에 있어서 일시적인 개선은 제공하지만, 이 질병의 진행을 중단시키지 못한다. 항산화제, 항염증 약물 (NSAID), 콜레스테롤-저하 약물 및 에스트로겐 요법을 포함한 다른 치료제가 고려되고 있지만, 이들 치료제 중 어느 것도, 특히 AD 환자에서 기억 및 인지 기능을 개선하는데 있어서 어떠한 장기간의 유익한 효과를 갖지 않는 것으로 보인다 (Magialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010).
알츠하이머병의 주요 특징은 뇌에서 응집체 및 플라크 (plaque) 형태로 39 내지 43개의 아미노산 펩티드 β-아밀로이드 (Aβ)가 축적되는 것이다. 유전자적, 병리학적 및 생화학적 연구에 기초한 상당한 증거는 Aβ, 특히 이의 올리고머 응집체가 AD 병리의 발생에서 중추적인 역할을 함을 나타낸다 (Hardy et al, 2014; DeLaGarza, 2003; Selkoe and Hardy, 2016). 아밀로이드 가설에 따르면, 뇌에서 Aβ의 생성 및 제거에 있어서 만성 불균형은 나이가 듦에 따라 이의 축적 및 응집을 초래한다. 이들 Aβ 응집체는, 시냅스 소실 및 뉴런 기능의 손실로 이어져서, 기억 및 다른 인지 기능의 진행성 손실로 이어지는 이벤트들의 캐스케이드를 개시하는 것으로 여겨진다 (Hardy et al, 2014; DeLaGarza, 2003; Selkoe and Hardy, 2016; Sengupta et al, 2016).
전구체 단백질 APP로부터 Aβ의 생성은 프로테아제 β 및 γ 세크레타제에 의한 APP의 순차적인 단백질분해에 의해 달성된다 (Barageb and Sonawane, 2015). 이들 효소의 억제제는 Aβ 생성을 감소시키는 것으로 밝혀져 있으며, AD를 치료하기 위한 잠재적인 약물로서 개발 중이다 (Hardy et al, 2014; Mangialasche et al, 2010; Selkoe and Hardy, 2016; Ji and Ha, 2010). 유사하게, Aβ를 봉쇄 및/또는 Aβ 제거를 촉진하는 작용제가 또한 개발 중이다. 이들 중에서 주목할 만한 것은 AD 백신에 의한 면역요법의 개발이다. 능동적 면역화 (Aβ 펩티드) 및 수동적 면역화 (Aβ-항체) 모두는 AD의 유전자이식 동물 모델에서 및 AD 환자를 수반하는 임상 시험에서 아밀로이드 침착을 예방할 뿐만 아니라 이미 형성된 아밀로이드 플라크를 제거하는데 효과적인 것으로 밝혀져 있다 (Mangialasche et al, 2010; Ji and Ha, 2010; Morrone et al, 2015; Lannfelt et al, 2014; Selkoe and Hardy, 2016; Goure et al, 2014).
아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 단백질분해 절단을 예방하고 그럼으로써 뇌 Aβ 생성을 감소시키거나 억제하는 β 및 γ 세크레타제의 억제제가 개발 중이다 (예: 타렌플루르빌, 세마가세스타트, 베루베세스타트). 그러나, Aβ 부하를 감소시키는데 있어서 이들의 치료적 효능은 아직 알려져 있지 않으며, 이들 약물 중 다수가 전임상 또는 임상 시험에서 실패하였다 (Savonenko et al, 2012; Musiek and Holtzman, 2015). 더욱이, 이들 효소는 또한 다른 효소 및 신호전달 분자, 예컨대 뉴런 발달과 연관된 Notch의 처리에 관여하기 때문에 (Savonenko et al, 2012; Musiek and Holtzman, 2015), 이들 억제제는 심각한 비특이적 부작용을 가질 수 있다.
면역요법 접근법, 예컨대 능동적 면역화 (Aβ 백신, AN1792) 및 수동적 면역화 (예: 바피뉴주맙, 솔라네주맙, 크레네주맙, 아두카누맙 등)는 유전자이식 동물에서 Aβ 침착을 감소시키고, 기억 결손의 부분 제거에 매우 효과적인 것으로 밝혀져 있다 (Monsonego and Weiner, 2003; Bard et al, 2000, Sevigny J et al., 2016). 능동적 면역화 및 수동적 면역화 모두를 사용하는 몇몇 임상 시험은 중간 정도의 인지 개선과 함께 뇌 Aβ 침착의 감소를 나타내었다. 그러나, 임상 시험은 AD 환자에서 심각한 염증 반응 (수막뇌염 제시), 혈관성 부종, 및 미세출혈로 인해 포기되어야 했다. 이러한 제한에도 불구하고, 면역요법 접근법은 Aβ를 효과적으로 봉쇄하고 이의 침착 및 독성을 방지하는 작용제가 AD의 진행을 정지시키는데 있어서, 심지어는 이의 발생을 예방하는데 있어서 효과적인 약물로서 잠재적으로 제공할 수 있음을 나타낸다 (Rafii and Aisen, 2015, Selkoe and Hardy, 2016).
뇌에서 기원하는 AD 및 다른 질병의 치료뿐만 아니라 조기 진단은 대다수의 적절한 치료용 분자 및 진단제가 조밀하고 고도로 제한적인 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통할 수 없기 때문에 과제로 남아 있다 (Abbott, 2013). BBB는 혈관을 둘러싸고, 밀착 연접 (tight junction)을 통해 서로 연결된 뇌 내피 세포 (BEC)에 의해 형성되는 물리적 방어벽을 구성한다 (Abbott, 2013). BEC들 사이에 형성된 밀착 연접은 BBB의 완전성에 필수적이며, 500 달톤 (Da) 보다 큰 분자의 세포주위 (paracellular) 수송을 방지한다. 뇌 내피 세포는 매우 느린 음세포작용 속도를 나타내기 때문에 (Abbott, 2013), 더 큰 분자의 세포관통 (transcellular) 수송은 고도로 특이적인 수용체 매개 트랜스사이토시스 (RMT) 경로, 및 수동적인 전하-기반 흡착 매개 트랜스사이토시스로 제한된다 (Abbott, 2013; Pardridge, 2002). 또한, 고밀도의 유출 펌프, 예컨대 P-당단백질 또는 다중-약물 저항성 단백질-1 (MDR-1)은 뇌로부터 원치 않는 물질의 제거에 기여한다 (Abbott, 2013).
이러한 모든 특징들은 병원체 및 독소로부터 뇌를 보호하지만, 이들은 마찬가지로 대부분의 치료제의 진입을 방해한다. 실제로, 수송체 분자에 특이적으로 '운송', 즉 커플링되지 않는 한, 소분자 치료제 중 5% 미만이, 약리학적으로 관련된 농도 (즉, 중추 신경계 (CNS) 표적에 교합하고 (engage), 약리학적/치료적 반응을 유발하는데 충분한 농도)로 BBB를 횡단할 수 있으며, 사실상 더 큰 치료제는 어느 것도 그렇게 할 수 없다. BBB를 가로질러 분자를 수송하기에 효과적인 '운반체'의 결여로 인해, 신경퇴행성 질환에 대한 다수의 약물은, 그들이 충분한 양으로 뇌에 전달될 수 없기 때문에 추가 개발로부터 '보류되거나' 제거되어 왔다.
AD 병리의 분자 기전에 대한 이해에 있어서 상당한 진보에도 불구하고, 상기 질환의 진행을 예방하거나 이를 치유할 수 있는 현재 이용 가능한 효과적인 약물 또는 치료제는 없다. 더욱이, 고용량 및 고선택성 BBB 운반체의 결여는 뇌 종양 및 신경퇴행성 질환을 비롯한 뇌에서 기원하는 질병에 대한 새로운 치료제 및 진단제의 개발을 지연시킨다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물 또는 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 베타-아밀로이드 (β-amyloid)에 결합하는 펩티드를 제공한다. β-아밀로이드에 결합하는 펩티드 (또는 단백질)은 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드1 -42 (Aβ1 -42) 응집체에 선택적으로 결합할 수 있고, 본원에서 ABP로 약기되고 언급될 수 있으며, 상기 ABP는 본원에서 임의의 ABP 펩티드, ABP 변이체, 임의의 C-말단 절단된 ABP, 또는 이의 동등한 기능성 β-아밀로이드 결합 펩티드를 포함한다. 본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 특정 ABP 펩티드 종을 제공하고, 유익하게는 기능성 β-아밀로이드 결합 펩티드의 혼합물, 따라서 상기 특정 ABP 펩티드를 포함하는 안정한 기능성 융합 단백질의 혼합물을 제공한다.
본 발명은 추가로 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 횡단하는 항체 또는 이의 단편에 연결된 베타-아밀로이드 (β-아밀로이드) 결합 펩티드 (본원에서 임의의 ABP로 제공됨)를 포함하는 융합 단백질 (본원에서 화합물, 조성물, 단쇄 폴리펩티드 또는 작제물 (constructs)로도 지칭됨)을 제공하며, 본원에서 BBB는 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 운반체 항체 또는 단편에 대한 약어로 지칭된다. 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 ABP 및 BBB 운반체 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부를 통해 연결될 수 있다. 일 구체예에서, ABP 및 BBB를 포함하는 융합 단백질은 Fc로 알려진 면역글로불린 단백질 이펙터 도메인 또는 이의 단편을 추가로 포함하고, 상기 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 링커 (L)를 추가로 포함할 수 있고, 상기 L은 작은 연결 펩티드 또는 펩티드-유사 사슬이다. BBB-Fc-ABP를 포함하는 단쇄 폴리펩티드는 Fc를 통해 이량체를 형성할 수 있고, 이는 상기 융합 단백질의 이량체화를 가능하게 한다. 본 발명의 화합물은 융합 단백질, 작제물, 융합 분자, 제제 또는 조성물로 지칭될 수 있다.
BBB-Fc-L-ABP 융합 단백질을 포함하는 단쇄 폴리펩티드는 Fc 이량체화에 의해 이량체를 형성할 수 있고, 상기 BBB-Fc-L-ABP는 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 즉, 제공된 BBB-Fc-L-ABP 융합 단백질은 단쇄 폴리펩티드 또는 이의 이량체 폴리펩티드일 수 있고, 상기 이량체는 ABP 아암 모두가 기능성 (ABP 및/또는 C-말단 절단된 기능성 ABP)이면 동종이량체일 수 있거나, 또는 상기 이량체는 기능성 ABP 아암 (ABP 또는 C-말단 절단된 기능성 ABP) 및 비-기능성 ABP 아암, 또는 2개의 기능성 ABP 아암을 포함하는 이종이량체일 수 있다. 상기 용어 '기능성 (functional)'은 상기 ABP 펩티드가 β-아밀로이드에 결합할 수 있는 것, 예컨대 서열 번호: 31 (40 aa)의 컨센서스 서열 (consensus sequence) 및 이의 C-말단 절단된 기능성 산물을 갖거나, 또는 서열 번호: 46 (29 aa)의 컨센서스 서열을 갖는 펩티드를 나타내고; 반면 상기 용어 '비-기능성 (non-functional)'은 ABP가 β-아밀로이드에 결합하는 것을 허용하지 않는 임의의 C-말단 절단 산물을 나타낸다. Fc 이량체화는 BBB-Fc-ABP를 포함하는 작제물에서 2개의 Fc CH3 도메인들 사이의 크고 밀집된 소수성 계면의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. 본원에서 BBB-Fc-ABP 및 BBB-Fc-L-ABP는 BBB, Fc 부분 및 ABP를 포함하는 단쇄 폴리펩티드 융합 단백질을 지칭하는 동등한 약어임에 주목해야 하고, 상기 융합 단백질의 각 성분은 임의의 적절한 링커를 통해 연결 또는 접합되어 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 β-아밀로이드 결합 융합 단백질을 형성한다. 상기 BBB, Fc, ABP 및 링커 (L)는 본원에서 임의의 BBB, Fc, ABP 또는 L로 제공될 수 있다. 일 구체예에서, BBB는 FC5 (예를 들어, 서열 번호: 17)이고, Fc는 hFc1X7 (예를 들어, 서열 번호: 49)이며, ABP는 β-아밀로이드 결합 펩티드, 예컨대 서열 번호: 31 (40 aa)을 갖는 임의의 펩티드, 예를 들어 ABP(6G) 서열 번호: 36 (40 aa) 또는 이의 임의의 β-아밀로이드 결합 C-말단 절단된 산물, 예를 들어 서열 번호: 37 (38 aa), 서열 번호: 38 (37 aa), 서열 번호: 39 (36 aa), 서열 번호: 40 (35 aa), 서열 번호: 41 (34 aa), 서열 번호: 42 (33 aa), 또는 서열 번호: 43 (32 aa) 또는 서열 번호: 46 (29 aa)을 포함하거나 또는 이로 구성되는 임의의 펩티드, 예를 들어 서열 번호: 47 (29 aa)이고; L은 (GGGGS)n, (GGGS)n 또는 이의 임의의 적절한 링커, 예를 들어, T(GGGGS)2일 수 있다. 제공된 융합 단백질은 특정 링커에 한정되지 않으며, 상기 융합 단백질의 각 성분의 작동가능한 생물학적 기능, 즉 혈액-뇌 장벽 관통이동 및 β-아밀로이드 결합을 허용하는 임의의 링커일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 서열 번호: 56, 71에서 제공되는 FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G) 또는 이들의 임의의 동등한 융합 단백질, 예컨대 본원에서 제공된 임의의 β-아밀로이드 결합 단백질 또는 이의 C-말단 절단된 산물을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
이의 동등한 융합 단백질은 임의의 β-아밀로이드 결합 단백질 (서열 번호: 31), 서열 번호: 36의 C-말단 절단된 산물 (예: 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43), 또는 서열 번호: 46을 포함하거나 또는 이로 구성되는 단백질, 또는 이의 동등한 β-아밀로이드 결합 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, C-말단 절단된 ABP는 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 또는 서열 번호: 43의 서열을 포함할 수 있다.
제공된 BBB-Fc-ABP 작제물은 단쇄 폴리펩티드 (상기 단쇄 융합 단백질의 단량체로서 지칭됨) 또는 이의 이량체 폴리펩티드일 수 있다. 2개의 단쇄 폴리펩티드를 포함하는 이량체 펩티드는 ABP 펩티드 모두가 동일한 (예: 모두 서열 번호: 36) 동종이량체일 수 있거나; 또는 상기 이량체 펩티드는 상기 이량체의 ABP 펩티드가 임의의 2개의 상이한 서열일 수 있는 이종이량체 (예: 서열 번호: 36 및 서열 번호: 40 또는 서열 번호: 31 내지 47의 임의의 조합)일 수 있고, 여기서 상기 단쇄의 APB 펩티드 모두 또는 이 중 적어도 하나는 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 또는 서열 번호: 43으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이량체를 형성하는 단쇄 폴리펩티드의 ABP 펩티드는 임의의 생물학적으로 기능성인 β-아밀로이드 결합 ABP 펩티드; 특히 서열 번호: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 44, 45, 46, 47로 구성된 그룹으로부터 선택되는 임의의 ABP, 또는 C-말단 절단된 생물학적으로 기능성인 서열 번호: 36 산물, 특히 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 또는 서열 번호: 43 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
2개의 BBB-Fc-L-ABP 단쇄 폴리펩티드를 포함하는 이량체 펩티드는 2개의 상이한 ABP 서열을 포함할 수 있고, 상기 ABP 서열 중 적어도 하나는 생물학적으로 기능성인 분자 (즉, β-아밀로이드에 결합할 수 있음)이다. 상기 이량체 펩티드가 단일 비-기능성 ABP 펩티드를 수용할 수 있고, β-아밀로이드 결합과 관련하여 동등한 기능적 생물학적 활성을 여전히 유지할 수 있다는 것은 매우 유리하고, 예상치 못한 것이었다. 2개의 상이한 ABP 서열을 포함하는 이량체 (즉, ABP와 관련하여 이종이량체)에서, 상기 이종이량체에 제공된 ABP 펩티드 중 적어도 하나는 생물학적으로 기능성인 ABP 즉, 서열 번호: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 2개의 기능성 ABP 펩티드가 이종이량체에 제공되는 경우 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 이종이량체에서 ABP 펩티드 모두가 생물학적으로 기능성인 β-아밀로이드 결합 단백질일 필요는 없고, 상기 이종이량체에서 적어도 하나의 생물학적으로 기능성인 ABP가 있으면 β-아밀로이드 결합 활성과 관련하여 융합 단백질의 전체적인 생물학적 활성을 유지한다. 이종이량체가 단일 비-기능성 ABP 펩티드를 수용할 수 있고, 생물학적으로 유효한 이종이량체를 유지하는 것이 유익하다. 이러한 이점은 제공된 융합 단백질의 제조가능성 (manufacturability)을 돕고, 생물학적으로 활성인 산물의 혼합물의 수율을 크게 향상시킨다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 펩티드를 제공한다:
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
상기에서 X1 =K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, (서열 번호: 46; 29 aa).
본 발명은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 펩티드 또는 이의 임의의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 산물을 제공한다:
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI (서열 번호: 31; 40 aa)
상기에서 X1 =K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, X7 = K, G 또는 V, X8 = R, G 또는 A, X9 = K, G 또는 A.
상기 단리된 펩티드 아미노산 서열은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열 또는 이의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 펩티드를 포함한다:
Figure pct00001
39개의 아미노산 절단 산물을 수득하기 위해 하나의 아미노산의 C-말단 절단 (즉, 이소류신의 결실)이 또한 제공된다. 컨센서스 서열 서열 번호: 31에서, X10 = I 또는 아미노산 없음 (즉, 아미노산 X10이 서열 번호: 30으로부터 결실됨), 여기서 -OH 기는 아미노산 40 대신에 39aa 펩티드의 C-말단에 존재할 수 있다. (서열 번호: 31)
보다 구체적으로, 상기 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다:
Figure pct00002
본 발명의 임의의 단리된 펩티드는 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 항체 또는 항체 단편에 융합될 수 있다. 상기 단리된 펩티드는 Fc 단편에 연결될 수 있고, 상기 단리된 펩티드, 항체 또는 이의 단편, 및 Fc 단편은 단쇄 폴리펩티드 융합 단백질을 형성한다. 일 구체예에서, Fc 단편은 감쇠된 이펙터 기능을 가진 Fc를 포함한다.
따라서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 단리된 펩티드, 및 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통이동하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 Fc 단편을 추가로 포함하는 단쇄 폴리펩티드일 수 있고, 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체를 형성한다. 상기 이량체는 그 안에 포함된 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있고, 상기 이종이량체는 이관능성 (2개의 기능성 ABP 아암) 또는 일관능성 (단 1개의 기능성 ABP 아암)일 수 있다. 일관능성 이량체는 그 안에 포함된 기능성 ABP 단백질에 관계 없이, 이관능성 이량체와 동등하다는 것이 매우 유리하다. 즉, 예를 들어 이종이량체는 상기 이량체의 하나의 아암에서 서열 번호: 37, 및 상기 이량체의 다른 아암에서 서열 번호: 41을 가진 ABP를 포함할 수 있거나, 또는 상기 이량체의 하나의 아암에서 서열 번호: 43을 가진 ABP 및 상기 이량체의 다른 아암에서 비-기능성 ABP를 포함할 수 있고, 이량체 모두는 유리하게는 동등한 β-아밀로이드 결합 관능성을 나타낸다. 이는 유리하게 동등한 기능성을 가진 이량체의 혼합물의 생성을 가능하게 하고, 따라서 산물 수율의 증가를 가능하게 한다.
따라서, 이량체가 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체이고, β-아밀로이드에 결합할 수 있는 적어도 하나의 ABP를 포함하는 융합 단백질이 제공된다.
제공된 단쇄 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항체 단편, β-아밀로이드에 결합하는 펩티드, 및 Fc 단편을 포함할 수 있다. 상기 단쇄 폴리펩티드는 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드를 Fc 단편에의 연결을 허용하는 임의의 적절한 링커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 Fc에 접합 또는 연결될 수 있고, 상기 ABP는 임의의 적절한 링커를 통해 Fc에 연결되어 단쇄 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 제공된 융합 단백질은 본원에서 제공된 링커를 포함하는데 한정되지 않으며, 성분들 (즉 항체, Fc 및 ABP)의 연결을 허용하는 임의의 적절한 링커를 포함하여 본원에서 제공된 융합 단백질에 동등한 융합 단백질을 형성할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25 및 서열 번호: 26으로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 항체일 수 있고; β-아밀로이드에 결합하는 펩티드는 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며; Fc 단편은 서열 번호: 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편은 GFKITHYTMG (서열 번호: 1)의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR) 1 서열, RITWGGDNTFYSNSVKG (서열 번호: 2)의 CDR2 서열, GSTSTATPLRVDY (서열 번호: 3)의 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 상기 서열들 중 임의의 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함한다.
상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다:
EYPSNFYA (서열 번호: 4)의 CDR1 서열, VSRDGLTT (서열 번호: 5)의 CDR2 서열, AIVITGVWNKVDVNSRSYHY (서열 번호: 6)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
GGTVSPTA (서열 번호: 7)의 CDR1 서열, ITWSRGTT (서열 번호: 8)의 CDR2 서열, AASTFLRILPEESAYTY (서열 번호: 9)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및
GRTIDNYA (서열 번호: 10)의 CDR1 서열, IDWGDGGX (상기 X는 A 또는 T임) (서열 번호: 11)의 CDR2 서열, AMARQSRVNLDVARYDY (서열 번호: 12)의 CDR3 서열의 항체 또는 이의 단편.
구체적으로, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및/또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편은 인간화 (humanized)될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 단일-도메인 항체 (sdAb)일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질 단쇄 폴리펩티드는 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드에 Fc 단편을 통해 연결된다. 상기 단쇄 폴리펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 서열을 포함할 수 있다: 서열 번호: 51 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열. 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체, 구체적으로 제공된 임의의 단쇄 폴리펩티드를 포함하는 동종이량체 또는 제공된 단쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함하는 이종이량체를 형성할 수 있다.
상기 융합 단백질은 임의의 적절한 펩티드 링커를 포함하는 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 융합 단백질의 연결된 성분들이 비-제한적인 원하는 생물학적 기능을 유지하도록 하는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 링커는 서열 (GGGS)n, (GGGGS)n, 또는 임의의 적절한 펩티드 연결 서열을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 제공된 단쇄 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드를 형성하고, 상기 이량체 폴리펩티드는 그 안에 포함된 β-아밀로이드 결합 단백질 (ABP)과 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체를 포함한다. 상기 이종이량체는 β-아밀로이드에 결합할 수 있는 적어도 하나의 기능성 ABP를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질의 Fc 단편은 마우스 (mouse) Fc2a 또는 인간 (human) Fc1일 수 있고; 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50을 포함하는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 Fc 단편의 N-말단에 연결된 항체 또는 이의 단편 및 Fc 단편의 C-말단에 연결된 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 항체 또는 단편은 본원에 제공된 임의의 항체이고, 예를 들어 항체 또는 단편은 서열 번호: 1, 2, 3의 CDR (FC5); 서열 번호: 4, 5, 6의 CDR (IGF1R-3), 서열 번호: 7, 8, 9의 CDR (IGF1R-4); 서열 번호: 10, 11, 12의 CDR (IGF1R-5); 서열 번호: 14 내지 서열 번호: 17 (FC5 항체); 또는 서열 번호: 18 내지 서열 번호: 26 (IGF1R 항체)을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 융합 단백질은 Fc 단편의 C-말단에 연결된 항체 또는 이의 단편 및 Fc 단편의 N-말단에 연결된 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 항체 또는 단편은 하기를 포함하는 임의의 항체 또는 단편이다: 서열 번호: 4, 5, 6의 CDR (IGF1R-3), 서열 번호: 7, 8, 9의 CDR (IGF1R-4); 서열 번호: 10, 11, 12의 CDR (IGF1R-5); 또는 서열 번호: 18 내지 서열 번호: 26 (IGF1R 항체).
상기 융합 단백질은 링커를 포함할 수 있고, 상기 링커는 상기 Fc에 상기 항체 또는 이의 단편을 연결하고 및/또는 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 연결하는 독립적으로 선택된 링커 서열이다. 상기 링커는 서열 (GGGS)n, (GGGGS)n, GGGGSGGGGS, GGGSGGGGS, 당 분야에서 제공되거나 또는 서열 번호: 71의 컨센서스 링커에서 제공되는 바와 같은 임의의 적절한 링커, 또는 임의의 적절한 링커를 포함할 수 있다.
본 발명은 제공된 임의의 융합 단백질의 이량체를 제공하고, 상기 이량체는 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 펩티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
보다 구체적으로, 상기 융합 단백질 이량체는 2개의 단쇄 폴리펩티드를 포함하고, 상기 2개의 단쇄 폴리펩티드는 하기이다: 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 2개의 ABP를 포함하는 이관능성 동종이량체; 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 2개의 상이한 ABP를 포함하는 이관능성 이종이량체; 또는 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 하나의 ABP를 포함하는 일관능성 이종이량체.
또한, 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나의 단리된 펩티드 또는 이들의 임의의 조합, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 환자에서 알츠하이머병을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 임의의 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 본 발명의 임의의 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 제공된다. 상기 약학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임의의 융합 단백질, 또는 이의 이량체를 포함하는 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
뇌 (brain) 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상의 뇌에서 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상에게 충분한 양의 제공된 약학적 조성물의 반복된 비경구 투여 단계를 포함한다. 상기 비경구 투여는 피하 또는 정맥내 투여일 수 있다. β-아밀로이드 수준의 감소는 뇌에 한정되지 않고, β-아밀로이드 수준이 증가된 대상의 뇌, 조직 또는 생체액 (biofluids) (CSF 및 혈액)일 수 있다.
상기 제공된 방법에서, 뇌 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상의 뇌에 제공된 조성물의 반복된 비경구 투여 후에, 독성 β-아밀로이드 수준이 감소된다. 독성 β-아밀로이드는 상기 조성물의 반복된 비경구 투여 후 4주 이내에 감소된다. β-아밀로이드의 CNS (중추신경계) 수준이 증가된 대상의 뇌척수액 (CSF) 중 독성 β-아밀로이드 수준은 상기 조성물의 비경구 투여 후에 감소된다. 상기 제공된 방법 및 이의 조성물은 유리하게 CNS 수준이 증가된 대상에서 뇌척수액 (CSF) 중 독성 β-아밀로이드 수준이 상기 조성물의 단일 비경구 투여 후 24시간 이내에 감소된다. 구체적으로 독성 β-아밀로이드 수준은 제공된 융합 단백질의 투여를 포함하는 방법으로 뇌 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상의 뇌에서 감소되었다.
상기 약학적 조성물은 제공된 융합 단백질의 임의의 혼합물을 포함할 수 있고; 상기 융합 단백질의 혼합물은 ABP 이관능성 동종이량체 융합 단백질, ABP 이관능성 이종이량체 융합 단백질 및 ABP 일관능성 이종이량체 융합 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 단쇄 폴리펩티드 융합체의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 동등한 기능적 활성을 가진 약학적으로 유효한 수율의 기능성 융합 단백질을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 알츠하이머병 증상을 개선하기 위한 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 뇌 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상의 뇌에서 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 알츠하이머병 (AD) 치료에 사용될 수 있다.
β-아밀로이드에 결합하는 펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00003
하기 서열을 포함하는 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드, 또는 이의 C-말단 절단 단백질 [서열 번호: 37 (38 aa) 내지 서열 번호: 43 (32 aa)]이 제공된다:
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI
상기에서 X1 =K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, X7 = K, G 또는 V, X8 = R, G 또는 A, X9 = K, G 또는 A (서열 번호: 31; 40 aa).
서열 번호: 31의 컨센서스 서열에서, 또한 가변 아미노산에서 치환의 변화 또는 서열 번호: 31에서 이들 아미노산 치환들의 임의의 조합이 제공된다; 상기 X1 = G 또는 A; X2 = G 또는 V; X3 = G 또는 A, X4 = G 또는 A, X5 = G 또는 V.
또한, 하기 서열을 포함하는 β-아밀로이드 단백질에 결합하는 펩티드가 제공된다:
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
상기에서 X1 =K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V (서열 번호: 46; 29 aa)
서열 번호: 46의 컨센서스 서열에서, 또한 가변 아미노산에서 치환의 변화 또는 서열 번호: 46에서 이들 아미노산 치환들의 임의의 조합이 제공된다; 상기 X1 = G 또는 A; X2 = G 또는 V; X3 = G 또는 A, X4 = G 또는 A, X5 = G 또는 V.
특정 비-제한되는 구체예에서, 상기 ABP, 이의 변이체, 또는 이의 C-말단 산물은 β-아밀로이드에 결합할 수 있는, 하기 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다:
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI
상기에서 X1 = K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, X7 = K, G 또는 V, X8 = R, G 또는 A, X9 = K, G 또는 A (서열 번호: 31; 40 aa),
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 32; 40 aa);
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 33; 40 aa);
KTFKTRGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 34; 40 aa);
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 35; 40 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 36; 40 aa); 또는 하나의 아미노산 (이소류신)이 C-말단으로부터 결실된, 서열 번호: 36의 C-말단 절단 산물
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVK (서열 번호: 37; 38 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRV (서열 번호: 38; 37 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSR (서열 번호: 39; 36 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKS (서열 번호: 40; 35 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLK (서열 번호: 41; 34 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQL (서열 번호: 42; 33 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQ (서열 번호: 43; 32 aa);
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTVKNI (서열 번호: 44; 35 aa);
KTFKTRKASAQASLASKDKTPKSKSKKRG (서열 번호: 45; 29 aa);
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
상기에서 X1 = K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V (서열 번호: 46; 29 aa); 및
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGG (서열 번호: 47; 29 aa)
또는 상기 서열들 중 임의의 서열과 실질적으로 동일한 서열.
β-아밀로이드에 결합하는 ABP는 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 및 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 및 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 ABP는 ABP, ABP 변이체, C-말단 절단 산물 또는 임의의 동등한 β-아밀로이드 결합 펩티드로서 언급될 수 있다. 본 발명은 서열 번호: 31의 컨센서스 서열 또는 이의 C-말단 기능성 산물, 또는 서열 번호: 46의 컨센서스 서열을 가진 ABP 서열을 추가로 포함하고; 예를 들어, ABP는 서열 번호: 32 내지 서열 번호: 36의 서열, 또는 서열 번호: 36의 임의의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 산물 (즉 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43), 또는 서열 번호: 46을 포함하는 β-아밀로이드 결합 단백질을 포함할 수 있다. C-말단 절단된 산물은 서열 번호: 36의 임의의 C-말단 절단일 수 있고, 상기 C-말단 절단된 산물은 β-아밀로이드에 결합할 수 있으며, 포유동물 발현 시스템에서 융합 단백질의 발현 및 생성 중에 펩티드 안정성을 가진 동등하게 안정한 펩티드 서열이다. 예를 들어, 본 발명의 ABP 변이체는 선행 기술 (참조문헌 WO2006/133566)의 ABP 펩티드에 비해 개선된 펩티드 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 폴리펩티드를 제공하고, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 폴리펩티드는 서열 번호: 31의 컨센서스 서열 또는 서열 번호: 46의 컨센서스 서열 또는 이들의 임의의 β-아밀로이드 결합 펩티드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 β-아밀로이드 결합 펩티드는 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 및 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 동등하게 안정한 폴리펩티드 서열을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 서열 번호: 31, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 ABP 또는 동등한 폴리펩티드 서열을 포함하는 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 융합 단백질을 제공한다. 비-제한적인 예에서, 상기 ABP 변이체는 하기 서열:
KTFKTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKRGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 35; 40 aa);
GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 36; 40 aa) 또는 이의 임의의 β-아밀로이드 결합 C-말단 절단된 산물, 예컨대 서열 번호: 46; 29 aa를 포함하거나 또는 이로 구성되는 임의의 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 관통이동하는 항체 또는 이의 단편 (BBB)을 포함할 수 있다 (상기에 언급된 바와 같이, BBB는 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 운반체의 약어임). 상기 항체 또는 이의 단편 (BBB)은 혈액-뇌 장벽을 통한 관통이동을 허용하는 뇌 내피 세포 상의 표면 수용체 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 표면 수용체 에피토프는 TMEM30A 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 에피토프, 또는 이의 이소형 (isoform), 변이체, 일부분, 또는 단편일 수 있다.
상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
GFKITHYTMG (서열 번호: 1)의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 서열, RITWGGDNTFYSNSVKG (서열 번호: 2)의 CDR2 서열, GSTSTATPLRVDY (서열 번호: 3)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
EYPSNFYA (서열 번호: 4)의 CDR1 서열, VSRDGLTT (서열 번호: 5)의 CDR2 서열, AIVITGVWNKVDVNSRSYHY (서열 번호: 6)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
GGTVSPTA (서열 번호: 7)의 CDR1 서열, ITWSRGTT (서열 번호: 8)의 CDR2 서열, AASTFLRILPEESAYTY (서열 번호: 9)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및
GRTIDNYA (서열 번호: 10)의 CDR1 서열, IDWGDGGX (상기 X는 A 또는 T임) (서열 번호: 11)의 CDR2 서열, AMARQSRVNLDVARYDY (서열 번호: 12)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다:
X1VQLVX2SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX3RQAPGKX4X5EX6VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX7YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 13), 여기서 X1=D 또는 E, X2=A 또는 E, X3=F 또는 V, X4=E 또는 G, X5=R 또는 L, X6=F 또는 W, X7=L 또는 V;
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5ASEYPSNFYAMSWX6RQAPGKX7X8EX9VX10GVSRDGLTTLYADSVKGRFTX11SRDNX12KNTX13X14LQMNSX15X16AEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSYHYWGQGTX17VTVSS (서열 번호: 18), 여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이며; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이며; X5는 V 또는 A이고; X6은 F 또는 V이며; X7은 E 또는 G이고; X8는 R 또는 L이며; X9는 F 또는 W이고; X10은 A 또는 S이며; X11은 M 또는 I이고; X12는 A 또는 S이며; X13은 V 또는 L이고; X14는 D 또는 Y이며; X15는 V 또는 L이고; X16은 K 또는 R이며; X17은 Q 또는 L임;
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX10VX11HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWGQGTX19VTVSS (서열 번호: 21), 여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이며; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이며; X5는 A 또는 E이고; X6은 V 또는 A이며; X7은 V 또는 F이고; X8는 G 또는 E이며; X9는 L 또는 R이고; X10은 F 또는 W이며; X11은 G 또는 S이고; X12는 V 또는 Y이며; X13은 D 또는 G이고; X14는 N 또는 S이며; X15는 A 또는 S이고; X16은 L 또는 V이며; X17은 K 또는 R이고; X18은 A 또는 S이며; X19는 L 또는 Q임; 및
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS (서열 번호: 24), 여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이며; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이며; X5는 V 또는 S이고; X6은 D 또는 G이며; X7은 L 또는 R이고; X8은 F 또는 W이며; X9는 A 또는 S이고; X10은 A 또는 T이며; X11은 A 또는 S이고; X12는 G 또는 N이며; X13은 M 또는 L이고; X14는 N 또는 R이며; X15는 E 또는 R이고; X16는 P 또는 A이며; X17은 S 또는 Y이고; X18은 Q 또는 L임.
특정 비-제한적인 구체예에서, 상기 항체, 또는 이의 단편은 하기의 임의의 서열로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 BBB는 항체 또는 이의 단편일 수 있으며, 일 구체예에서, 상기 BBB는 단일-도메인 항체(sdAb)일 수 있다. 상기 sdAb는 인간화될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편 (BBB)은 Fc 또는 이의 단편에 연결될 수 있으며, 이때 BBB-Fc 작제물은 이량체를 형성할 수 있다. 본 발명은 BBB-Fc-L-ABP를 포함하는 융합 펩티드를 추가로 제공하며, 상기 융합 펩티드의 BBB-Fc 부분은 짧은 펩티드 링커 (예를 들어, 12개 미만의 아미노산을 갖는 링커)를 통해 ABP에 연결되고, 상기 Fc 또는 Fc 단편은 상기 융합 펩티드의 이량체화를 가능하게 하여 이량체를 제공하며, 이에 따라 작제물을 분해로부터 보호하고, 그의 혈청 반감기를 증가시킨다. 상기 Fc 단편은 바람직한 약동학적 특성을 부여하기 위하여 선택되는 임의의 적절한 Fc 단편일 수 있으며, 상기 Fc 또는 Fc 단편은 융합 분자의 긴 반감기에 기여한다. 다른 Fc 또는 Fc 단편의 구체예는 면역학적 이펙터 기능을 조절, 변경 또는 억제할 수 있다 (Shields et al., 2001). 다른 Fc 단편의 구체예는 뇌로부터 융합 펩티드의 제거를 매개할 수 있다 (Caram-Salas N, 2011). 비-제한적인 예에서, Fc 또는 Fc 단편은, 상기 융합 펩티드 내에 포함될 때, 뇌로부터 아밀로이드의 제거를 향상시킬 수 있는, 감쇠된 이펙트 기능을 갖는, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 Fc 마우스 Fc2a 또는 인간 Fc1일 수 있다.
본 발명의 화합물에서, 상기 BBB는 Fc 단편 및/또는 임의의 추가의 적절한 링커 L을 통해 상기 ABP에 연결될 수 있다.
본 발명의 화합물은 융합 단백질을 포함하고; 상기 융합 단백질은 항체 또는 이의 단편, Fc 단편, 및 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드를 포함한다. 상기 융합 단백질은 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있고, β-아밀로이드에 결합하는 펩티드는 연결 펩티드 또는 화학적 링커인 L을 통해 Fc 단편의 C-말단에 연결된다. 상기 항체 또는 이의 단편은 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있고, β-아밀로이드에 결합하는 펩티드는 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열 번호: 48 내지 서열 번호: 50으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 Fc 단편을 통해 연결된, 서열 번호: 27 내지 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택되는 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드; 서열 번호: 13 내지 서열 번호: 26으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 단쇄 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 제공된 Fc는 감쇠된 이펙터 기능을 가진 Fc를 포함할 수 있다. 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체를 형성할 수 있고, 상기 이량체는 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있으며, 상기 동종이량체는 기능성 ABP를 포함하고, 상기 이종이량체는 적어도 하나의 기능성 ABP를 포함한다.
예를 들어, 상기 융합 단백질은 서열 번호: 51 내지 서열 번호: 70, 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 단쇄 폴리펩티드일 수 있으며, 상기 융합 단백질의 단쇄 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드를 위한 것일 수 있다. 서열 번호: 51 내지 서열 번호: 70에 포함되는 융합 단백질에 제공되는 (GGGSGGGGS 또는 GGGGSGGGGS) 링커가 임의의 적절한 링커 서열일 수 있음에 유의한다. 예를 들어, 강조 처리된 링커 서열 (예: GGGGSGGGGS)은 서열 번호: 71에 예시된 바와 같은, 제공된 융합 단백질의 성분들의 연결을 가능하게 하는 임의의 동등한 펩티드 연결 서열일 수 있으며, 상기 링커는 임의의 펩티드 또는 화학적 링커일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 BBB는 Fc 단편에 연결되며, 이에 따라 이량체를 형성할 수 있다. 상기 Fc 단편은 감쇠된 이펙터 기능을 갖는 임의의 적절한 Fc 단편, 예를 들어 마우스 Fc2a 또는 인간 Fc1일 수 있다 (Shields et al., 2001).
본 발명의 ABP는 서열 번호: 31의 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 ABP 펩티드는 서열 번호: 32 내지 36 중 어느 하나의 서열로부터 선택된 서열, 또는 서열 번호: 36의 C-말단 절단된 기능성 산물, 구체적으로 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 또는 서열 번호: 46의 펩티드일 수 있으며, 상기 제공된 ABP 펩티드 중 어느 하나는 기능성 β-아밀로이드 결합 펩티드이다. 본원에 제공된 바와 같은 ABP는 선행 기술의 ABP 폴리펩티드에 비해 예기치 않은 상당한 이점을 나타낸다. 보다 구체적으로, 제공된 본 ABP는 증가된 안정성 및 바이오-제조성 (bio-manufacturability)을 나타낸다. 더욱이, 본원에 제공된 바와 같이, ABP를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 조성물은 본원에 제공된 바와 같은 링커 및/또는 Fc 단편을 통해 BBB에 커플링될 때, 혈액-뇌 장벽을 관통이동함에 있어서 상승적이고 예기치 않은 효능을 나타낸다. 그러한 ABP 변이체는 본원에 제공된 바와 같은 선택된 Fc 단편을 통해 BBB에 커플링될 때, 뇌로부터 Aβ를 예기치 않은 신속하고 개선된 제거를 제공한다. 더욱이, 본원에 제공된 바와 같이 ABP 변이체를 포함하는 본 발명의 융합 단백질은 BBB를 관통이동함에 있어서 상승적이고 예기치 않은 효능 및 뇌로부터 Aβ의 개선된 제거를 나타낸다. 본 발명의 융합 단백질은 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47 중 어느 하나의 ABP를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47의 임의의 ABP를 가진 단쇄 펩티드 또는 이의 이량체를 포함하는 임의의 융합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다.
따라서, 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편 (BBB), β-아밀로이드에 결합하는 펩티드 (ABP 또는 ABP 변이체, 또는 이의 C-말단 절단된 산물)에 연결된 Fc(Fc)를 포함하는 치료용 조성물이 제공되며, 상기 펩티드는 제공되는 치료용 조성물의 안정성 및 효능에 있어서 상승적 증가를 부여한다. 개시된 바와 같이, 예기치 않게 가장 유의하게, BBB-Fc-ABP의 단회 볼루스는 동물 (AD의 마우스 모델)에서 유사한 결과를 달성하는 유리 ABP에 의한 3개월의 다회 치료 (도 9a)와 비교하여, 치료 후 24시간 이내에 뇌 Aβ 부하를 50% 만큼 감소시켰다 (도 9b). 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 화합물은 뇌 Aβ 부하를 감소시키는데 있어서 유리 ABP보다 훨씬 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 추가로, Fc를 포함하는 이러한 융합 단백질은 유리 ABP 또는 BBB-ABP (WO 2006/133566)와 비교하여 실질적으로 더 긴 혈청 반감기를 제공하였으며, 이에 의해 개선된 치료용 화합물을 제공하였다 (도 10).
본 발명의 ABP 변이체, 및 ABP를 포함하는 융합 단백질 (이의 작제물)은 종래 기술의 단점을 극복한다. 종래 기술에서, ABP와 BBB 운반체 단독 (WO 2006/133566)과의 연결은 효과적인 분자의 생성을 보장하지 않는다. 혈청 반감기를 향상시키는 것을 목적으로 하는 Fc를 포함하는 융합체는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 ABP의 효율적인 수송을 보장하지 않는다. BBB 운반체-, Fc 단편- 및 ABP를 포함하는 융합 분자의 특별한 조작 및 제제는 효율적인 BBB-투과성 치료용 화합물을 제공한다. 제공되는 효율적인 혈액-뇌 장벽-투과성 치료용 화합물은 BBB-Fc-ABP의 특별히 조작된 제제를 포함하며, 상기 제제는 화합물 안정성 및 효능에 있어서 상승적 개선을 나타낸다. 도 9에 도시된 바와 같이, 융합 조성물의 안정성에 있어서의 예기치 않은 증가, 및 혈액-뇌 장벽의 관통이동 효능에 있어서 상승적 증가 및 뇌로부터 Aβ의 더 신속한 제거 (24시간 이내)가 상기 융합 단백질 작제물을 포함하는 조성물에 제공된다.
본원에 제공된 ABP C-말단 절단 산물 (예: 서열 번호: 37 내지 43 및 서열 번호: 46 내지 47)은 유리하게는 아밀로이드 단백질에 β-결합할 수 있는 기능성 융합 단백질의 단리 가능한 혼합물의 수율이 증가하도록 하는 특정의 신규한 예기치 못한 기능성 단백질의 서브세트를 제공한다. 제공된 단쇄 폴리펩티드의 융합 단백질은 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나를 포함할 수 있다는 것이 매우 유리하다. 상기 단쇄 폴리펩티드의 이량체는 동종이량체, 이종이량체, 일관능성 이종이량체 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다는 것이 추가로 유리하다. 이는 약학적 조성물에서 사용하기 위한 상기 융합 단백질의 제조에서 특히 중요하고 유리하며, 상기 약학적 조성물은 본원에 제공된 임의의 융합 단백질 (동종 또는 이종이량체는 서열 번호: 53 내지 서열 번호: 71 중 어느 하나를 포함하고; 이의 ABP는 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 임의의 ABP일 수 있음), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 화합물은 화합물, 융합 단백질, 제제, 조성물 또는 작제물로 지칭될 수 있다. 제공된 작제물은 항체 또는 이의 단편 (이는 BBB로 약기될 수 있음), Fc 단편 (Fc로 약기됨), 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드 (ABP로 약기됨)를 포함할 수 있다. 제공된 작제물 또는 조성물 (이는 본원에서 BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP로 약기될 수 있음)은 혈액-뇌 장벽 관통이동, 효능 및 화합물 안정성과 관련하여 종래 기술에서 겪게 되는 결점을 상승적으로 극복하는 성분들을 포함한다. 따라서, 본원에 제공된 화합물은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는데 있어서 우수하고 예기치 않은 효능, 치료적 효능 및 화합물 안정성을 갖는 신규한 제제를 포함한다.
혈청 반감기가 Fc 융합체에서 반드시 증가되는 것은 아니지만, Fc 융합체가 혈청 반감기를 증가시킬 수 있는 선행 기술의 예들이 있다. 더욱이, Fc 융합체는 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 관통이동을 반드시 개선하는 것은 아니다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드를 제공하고, 상기 펩티드 서열 또는 이의 β-아밀로이드 결합 C-말단 절단된 기능성 산물은 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47 또는 펩티드 안정성에서 실질적으로 동일한 서열로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드, 상기 펩티드 서열이 ABP 또는 ABP 변이체를 언급하는 경우, 또는 이의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 기능성 산물을 제공하고, 상기 ABP는 서열 번호: 31 또는 서열 번호: 46을 포함할 수 있고, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47 및 펩티드 안정성 또는 β-아밀로이드 결합 활성에서 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어, 서열 번호: 31 또는 서열 번호: 46의 임의의 서열 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 서열 번호: 31 또는 서열 번호: 46의 컨센서스 서열을 가진 ABP 변이체는 폴리펩티드 안정성과 관련하여 선행 기술의 단점을 극복한다. 더욱이, 본 발명의 ABP를 포함하는 화합물은 개선된 화합물 안정성 및 바이오-제조성을 나타낸다. 더욱이, 본원에 제공되는 바와 같은 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 화합물은 상승적이고 예기치 않은 치료적 개선을 나타낸다.
본 발명의 ABP 또는 β-아밀로이드 결합 활성이 유지되는 한 C-말단 절단 산물은 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47 중 어느 하나로부터 선택되는 서열 및 동등하게 안정한 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 ABP 변이체는 선행 기술의 ABP 서열에 비해 우수하고, 본 ABP 변이체 폴리펩티드는 개선된 안정성을 나타낸다 (도 2a와 도 16 사이의 비교에서 도시된 바와 같음).
본 발명은 또한 본 발명의 ABP 또는 ABP 변이체를 포함하는 융합 단백질 (화합물, 작제물 또는 융합 분자로도 지칭됨)을 제공한다. 상기 융합 단백질은 Fc 단편을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편, Fc 단편, 및 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 36으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있는 β-아밀로이드 결합 폴리펩티드 서열, 또는 서열 번호: 36의 C-말단 절단된 산물, 즉 서열 번호: 37 - 43, 또는 서열 번호: 46을 포함하거나 또는 이로 구성된 ABP (예: 서열 번호: 47)를 포함할 수 있다. 제공된 BBB-Fc-ABP 제제는 화합물 안정성 및 뇌로부터 독성 아밀로이드를 제거하는데 있어서 치료적 효능의 상승적 개선을 나타낸다.
본원에서 BBB-Fc-ABP로 지칭될 수 있는 융합 단백질 또는 작제물은 그 안에 포함된 성분들과 관련하여 배향이 변동될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 상기 융합 단백질은 이량체를 형성하고 (도 1에 도시된 바와 같음), 상기 융합 펩티드는 Fc 영역을 통해 이량체화된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 제공된 화합물은 C-말단에 부착된 짧은 펩티드 링커를 통해 Fc 단편의 C-말단에 연결된 ABP 또는 ABP 변이체 (ABP) 및 Fc 단편 (Fc)의 N-말단에 연결된 BBB를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있고 (도 1A에서, 상기 화합물은 융합 단백질의 이량체로 나타냄), 도 1Ai, 1Aii, 및 1Aiii에서 추가로 도시되는 바와 같이, 상기 이량체는 도 1Ai에 나타낸 바와 같이 2개의 기능성 ABP 펩티드 (예: 임의의 β-아밀로이드 결합 ABP 펩티드, 예컨대 서열 번호: 36)를 가진 이관능성 동종이량체, 또는 도 1Aii에서 도시된 바와 같이 이량체가 2개의 상이한 기능성 β-아밀로이드 결합 ABP 펩티드 (ABP 및/또는 C-말단 절단된 ABP, 예컨대 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43)를 가진 이관능성 이종이량체, 또는 하나는 기능성 β-아밀로이드 결합 ABP 펩티드 (ABP 또는 C-말단 절단된 ABP, 1Aiii) 다른 아암은 비-기능성 펩티드를 가진 일관능성 이종이량체이다. 구성 1Ai 내지 1Aiii에서, ABP 또는 ABP 변이체의 N-말단 (융합) 또는 C-말단 (화학적 연결)은 Fc에 융합/연결될 수 있음에 유의한다. 추가의 일 구체예에서, 제공된 화합물은 Fc 단편 (Fc)의 C-말단에 연결된 BBB를 포함할 수 있고, 상기 ABP 또는 ABP 변이체 (ABP)가 적절한 링커 (L)를 통해 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다 (도 1B). 다른 가능한 구성에서, 상기 BBB는 상기 ABP의 N-말단에 연결될 수 있고, 상기 ABP는 Fc 단편의 N-말단에 연결될 수 있다 (도 1C). 또 다른 가능한 구성에서, 상기 BBB는 상기 ABP의 C-말단에 연결될 수 있고, 상기 ABP는 상기 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있다 (도 1D).
본원에 제공된 화합물은 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71 및 이들 서열들에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택된 단쇄 폴리펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질, 또는 이의 이량체를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질 (BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP, 상기 L은 임의의 적절한 링커일 수 있음) 이량체 (도 1, 바람직하게는, 도 1A 또는 1B에 도시된 바와 같음)이다. 비-제한적인 예에서, 제공된 화합물 또는 융합 단백질은 서열 번호: 35 (ABP-GG-G) 또는 서열 번호: 36 (ABP-6G)의 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 C-말단 절단된 기능성 산물 (서열 번호: 37 내지 43); 서열 번호: 17 (FC5-H3)의 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및 서열 번호: 49 (hFc1X7)의 서열을 포함하는 Fc 단편을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
본 발명의 특정 비-제한적인 구체예에서, 상기 화합물은 서열 번호: 55 [FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(GG-G)] 또는 서열 번호: 56 [FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)]의 서열 또는 이들의 임의의 C-말단 절단된 ABP 기능성 산물을 포함할 수 있고, 상기 L은 임의의 적절한 링커일 수 있다.
본 발명의 화합물은 혈액-뇌 장벽을 관통이동한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 임의의 화합물을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질 또는 화합물의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 키트는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 조성물은 환자에서 알츠하이머병 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 뇌 Aβ 수준이 증가된 대상의 뇌 또는 CSF에서 독성 β-아밀로이드 (Aβ) 수준을 감소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공하고, 본 발명의 약학적 조성물이 치료를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명은 뇌 Aβ 수준이 증가된 대상의 뇌에서 독성 β-아밀로이드 (Aβ) 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 AD를 가진 환자에게 본 발명의 화합물의 투여를 포함한다. 보다 구체적으로는, 본 방법은 대상에게 본 발명의 충분한 양의 약학적 조성물의 반복된 비경구 투여 단계들을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 비경구 투여는 피하 또는 정맥내 투여이다.
본 발명의 방법은 Aβ의 뇌 수준이 증가된 대상의 뇌에서 본원에 제공된 조성물의 반복된 비경구 투여 후에 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시킨다. 보다 구체적으로는, 독성 β-아밀로이드 수준이 본 발명의 조성물의 반복된 비경구 투여 후 4주 이내에 감소된다.
본 발명의 방법은 본 발명의 조성물의 비경구 투여 후에 대상의 뇌척수액 (CSF)에서 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시킨다. 보다 구체적으로는, 대상의 뇌척수액 (CSF)에서 독성 β-아밀로이드 수준이 본 발명의 조성물의 단일 비경구 투여 후 24시간 이내에 유의하게 감소되며; 이때 유의한 감소는 24시간 이내에 최대 50%이다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽-투과성 단일 도메인 항체 (sdAb)를 제공하고, 상기 sdAb는 낙타류 (camelid) FC5 또는 이의 인간화 버전이다. Fc에서 2가 포맷으로 표시되는 FC5는 VHH 포맷의 FC5와 비교하여 개선된 혈액-뇌 장벽-횡단 특성을 갖는 것으로 밝혀져 있다 (Farrington et al., 2014).
본 발명은 인 비트로에서 혈액-뇌 장벽 관통이동을 촉진하는 BBB 및 Fc 단편을 포함하는 화합물을 제공하고, 융합 분자의 혈청 반감기를 증가시키며, 상기 Fc 융합체의 혈청 반감기는 전장 IgG의 혈청 반감기와 유사해진다. FC5-Fc-ABP의 연장된 혈청 반감기는 또한 전체 뇌 노출을 증가시키는데, 이는 알츠하이머병과 같은 만성 질환 치료에 특히 중요하다.
상기 FC5-Fc-ABP 융합 분자뿐만 아니라 인간화 버전 FC5(H3)-hFc-ABP, 및 IGF1R5-H2-ABP 융합 분자는 이량체로서 CHO 세포에서 생산된 단쇄 폴리펩티드이다. 서열 번호: 31 및 서열 번호: 46에서 제공된 바와 같이, 본 발명의 ABP 변이체는 상기 융합 분자의 바이오-제조성 및 안정성을 증진시키는 특정 점-돌연변이 또는 결실에 의해 체계적으로 재-조합된다 (서열 번호: 54, 서열 번호: 55; 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71). 제공된 ABP는 서열 번호: 36의 C-말단 절단된 종일 수 있거나 또는 서열 번호: 46의 임의의 서열을 포함할 수 있다. 상기 단쇄 폴리펩티드의 이량체는 동종 또는 이종이량체일 수 있고, 단 서열 번호: 31의 서열, 그의 C-말단 절단 산물 또는 서열 번호: 46의 서열을 포함하는 적어도 하나의 기능성 ABP가 있다. 상기 ABP를 포함하는 본 발명의 융합 분자는 아밀로이드-β (Aβ) 결합 능력을 유지하고, 혈액-뇌 장벽을 관통이동하며, 유리하게는 뇌로부터 Aβ의 제거, 예를 들어 투여 후 24시간 이내에 뇌로부터 Aβ의 신속한 제거를 가능하게 한다.
본 발명의 ABP 변이체, 예를 들어 ABP(GG-G) (서열 번호: 35), 또는 ABP(6G) (서열 번호: 36) 또는 이의 임의의 C-말단 절단 β-아밀로이드 결합 산물 (즉, ABP는 서열 번호: 46의 서열을 포함하거나 또는 이로 구성됨)은 작제물의 안정성 및 제조성이 개선되도록 특별히 조작된다 (도 16에 도시된 바와 같음). 본 발명의 작제물의 개선된 안정성 및 바이오-제조성은 본 기술에서 유의한 이점이다. 따라서, 본 발명은 제공된 융합 분자의 안정성 및 바이오-제조성을 증진시킬 뿐만 아니라 치료적 활성을 유지하는 ABP 및 ABP 변이체를 포함한다 (도 15a에서 제공된 바와 같음). 상기 절단 산물이 서열 번호: 46의 서열을 포함하는, 본원에 제공된 C-말단 절단 산물은 기능성 ABP 펩티드들의 혼합물을 포함하는 기능성 융합 단백질의 혼합물에 대해 허용되고, 상기 혼합물은 유리하게는 기능성 산물의 수율을 증가시킨다.
그러므로, 서열 번호: 31, 예컨대 서열 번호: 32 내지 47에 제공되는 상이한 ABP 변이체를 포함하는 융합 분자는 모체 (parent) ABP의 Aβ 올리고머 결합 능력을 인 비트로에서 보유할 뿐만 아니라 (도 2b, 도 2c, 도 12, 도 15a, 도 15b 및 도 15c, 및 도 23a 및 23b), 모체 FC5의 BBB-관통 특성을 인 비트로 및 인 비보 (in vivo) 모두에서 보유한다 (도 4, 도 5A, 도 6, 도 7, 도 17a, 도 17b, 도 18, 도 19, 도 22a 및 22b, 도 24, 도 25). 상기 ABP는 래트 및 개의 CSF에서 그의 존재에 의해 수립된 바와 같이, 인 비트로 및 인 비보에서 운반체, 예를 들어 FC5에 의해 BBB를 통해 수송된다 (도 5 및 도 6). 상기 ABP 융합체는 또한 야생형 및 AD 유전자이식 마우스 모두에서 뇌 내의 표적 영역, 예컨대 해마 및 피질에 수송 및 전달되었다 (도 8, 도 19 및 도 24). 뇌-전달된 ABP는 또한 AD 유전자이식 마우스 및 래트의 CSF에서 (도 9c 및 도 11a 및 도 11b) 및 피질 및 해마 영역에서 (도 9b 및 도 11c) Aβ 제거를 촉진하였다. 또한, 가장 중요한 점은, 래트 AD 모델에서 Aβ 제거는 향상된 해마 부피 및 뉴런 연결성 (neuronal connectivity)과 상관관계가 있으며 (도 12a 및 도 12b), 이는 치료에 대한 원하는 약리학적/생리학적 반응을 나타낸다.
예기치 않게 가장 유의하게, BBB-Fc-ABP의 단회 볼루스는 동물에서 유사한 결과를 달성하는 유리 ABP에 의한 3개월의 다회 치료 (도 9a)와 비교하여, 치료 후 24시간 이내에 뇌 Aβ 부하를 50% 만큼 감소시켰다 (도 9b). 따라서, BBB-가능 ABP는 뇌 Aβ 부하를 감소시키는데 있어서 유리 ABP보다 훨씬 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 추가로, 본 화합물은 Fc와의 그의 융합으로 인해, 더 우수한 치료제의 기본적인 특징인 유리 ABP 또는 FC5 ABP와 비교하여 실질적으로 더 긴 혈청 반감기를 갖는다 (도 10).
종래 기술에서, ABP와 BBB 운반체 단독 (WO 2006/133566)과의 연결은 효과적인 분자의 생성을 보장하지 않는다. 혈청 반감기를 향상시키기 위한 Fc와의 융합체는 또한 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 ABP의 효율적인 수송을 보장하지 않는다. 본 발명의 융합 단백질 작제물에 제공된 바와 같이, BBB 운반체-, Fc 단편- 및 ABP 융합 분자의 적절한 조작 및 제제는 효율적인 BBB-투과성 치료용 화합물을 제공한다.
이러한 신규한 이관능성 융합 분자는 현재 개발 중에 있는 기존의 치료용 항체에 비해 구별되는 이점을 갖는다. 먼저, BBB-융합된 치료용 ABP는 훨씬 더 높은 수준 및 더 빠른 속도로 뇌를 관통할 수 있으며, 이는 치료적 효능을 실질적으로 개선한다. 또한, ABP 및 BBB (예: FC5)는 이들 각 수용체에 대해 비교적 더 낮은 친화도를 가지며, 이에 따라 뇌로부터 더 신속히 제거될 가능성이 높으며, 따라서 ABP-결합된 Aβ의 더 신속한 제거를 촉진시킨다. Aβ 제거를 위하여 반응성 미세아교세포 (microglia)/성상세포 (astrocyte)를 주로 사용하는 치료용 항체 (예: 아두카누맙)와 달리 (이는 더 느린 과정임), 본 발명의 융합 분자는 Aβ 제거를 위하여 더 신속한 혈관주위 배출 경로를 사용할 가능성이 높다. 이는, 유사한 결과를 달성하기 위하여 반복된 다회 용량에 의해 수개월의 치료를 필요로 하는 유리 ABP (도 9b) 및 항체-기반 치료제와 비교하여, 치료 후 24시간 이내에 CNS Aβ의 거의 50% 감소에 의해 뒷받침된다.
더욱이, 본 화합물은 항체-기반 치료제와 비교하여 신경-염증 반응을 유발할 가능성이 더 적다.
본 발명의 이들 및 다른 특성들이 첨부된 도면을 참조하여 예로서 기재될 것이다:
도 1: 혈액-뇌 장벽-횡단, 아밀로이드-결합 융합 단백질 이량체의 개략도를 나타낸다. BBB-횡단 단일-도메인 항체 (BBB 또는 BBB 운반체), Fc 단편 (Fc) 및 링커 펩티드를 통해 융합된 아밀로이드-결합 펩티드 (ABP)를 포함하는 단쇄 폴리펩티드 융합 단백질의 개략도가 제공되고, 이량체로 도시된다. 도 1은 BBB-Fc-ABP를 포함하는 융합 단백질의 상응하는 이량체를 나타낸다. 상기 융합 단백질의 이량체는 ABP와 관련하여 즉 ABP 아암 모두가 기능성 ABP 펩티드 (예: 서열 번호: 36, 도 1Ai) 및/또는 다양한 C-말단 절단된 기능성 ABP들 (예: 서열 번호: 36 및/또는 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43, 도 1Aii)을 함유하는 이관능성 동종이량체 또는 이관능성 이종이량체, 또는 ABP 아암들 중 하나가 기능성이고 (ABP 또는 이의 C-말단 절단된 기능성 절단 산물) 다른 아암은 비-기능성 펩티드인 일관능성 이종이량체 (도 1Aiii)일 수 있다. 상기 단쇄 폴리펩티드의 성분들 (즉, BBB, Fc 및 ABP)은 도 1A, 1B, 1C 및 1D에서 도시된 바와 같이 다양한 구성으로 도시된다.
도 2: CHO 세포에서 FC5-mFc-ABP 및 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP (ABP 서열 번호: 32) 융합 분자의 생성을 나타낸다. 도 2a에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE (NR - 비환원 조건 및 R - 환원 조건)에 의한 FC5 융합 분자의 분리 후 Coomassie 블루 염색된 겔은 재조합 융합 분자의 성공적인 생성을 나타낸다. 도 2b 및 도 2c: ELISA 및 Western 블롯 (WB) 오버레이 (overlay) 분석에 의한 유리 ABP 및 BBB-Fc-ABP 융합 단백질의 Aβ-올리고머 결합. 유리 ABP 또는 융합된 ABP를 ELISA 플레이트 상에 고정시키고, Aβ에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10 또는 4G8로 검출하였다. 융합 분자를 또한 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 페이퍼에 옮기고, Aβ에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 상기에서와 같이 특이적 항체로 검출하였다. 결과는 ABP가 BBB 운반체와의 융합 후에 그의 Aβ 올리고머 결합 능력을 보유하였음을 나타낸다. Mo: Aβ 단량체; Oli: Aβ 올리고머
도 3: AD-Tg 마우스 (B6.Cg-Tg, Jackson Lab)에서 아밀로이드 침착물에 대한 FC5-Fc-ABP의 결합의 면역조직형광 분석을 나타낸다. ABP는 면역조직형광 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 AD-Tg 마우스 뇌에서 자연 생성된 Aβ 응집체에 결합하는 능력을 보유한다. 야생형 및 AD-유전자이식 마우스로부터 뇌 절편을 IR 800-표지 FC5-mFc-ABP와 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 형광 현미경 하에서 시각화하였다. Aβ 침착물을 생성하는 AD-Tg 마우스로부터의 뇌 절편에서는 선택적 결합 (밝은 스폿)이 관찰되었으며, 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 그렇지 않았다.
도 4: FC5의 BBB 투과성이 인 비트로에서 ABP와의 융합 후에 보유됨을 나타낸다. FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽-횡단을 래트 및 인간으로부터의 인 비트로 BBB 모델에서 평가하였다. BBB를 횡단하는 융합 분자를 nanoLC-MRM 방법 (도 4A, 도 4B 및 도 4D)에 의해 및 Fc-특이적 항체를 사용하는 Western 블롯 분석 (도 4D, 3회 반복하여 수행됨)에 의해 검출하였다. FC5-mFc-ABP는 FC5-mFc만큼이나 효과적으로 BBB를 횡단한 반면, BBB 운반체 모이어티 (moiety) FC5를 함유하지 않은 Fc-ABP는 뇌 내피 세포 단층을 통해 횡단하지 않았다. 예상된 바와 같이, 대조군 단일 도메인 항체 EG2 및 A20.1, 또는 대조군 전장 IgG (항-HEL)는 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았다. 인간화 FC5-H3-hFc-ABP 융합 단백질에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다(도 4C 및 도 4D).
도 5: 인 비보에서 FC5-Fc-ABP의 혈청 및 CSF 약동학적 특성을 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 지시된 용량 (2.5, 6.25, 12.5 및 25 mg/kg)으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준은 nanoLC-MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 12시간 내지 24시간의 Cmax를 갖는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였고, 이는 뇌 및 CSF 구획 내로 FC5에 의한 ABP의 인 비보 수송을 나타낸다. 혈청 PK 파라미터 (도 5 및 표 1)는 FC5-mFc-ABP의 알파- 및 베타-반감기가 전장 IgG (래트 Fc를 함유하는 벤치마크 항체)의 것과 유사함을 나타낸다.
도 6: 비글개 (beagle dog)에서 FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사로 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, nanoLC-MRM에 의해 (도 6의 A) 및 Fc-특이적 항체를 사용하여 Western 블롯에 의해 (도 6의 B) 분석하였다. 별표는 혈액-오염된 샘플을 나타낸다 (MRM 분석에는 나타나 있지 않음). 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였고, 이는 개의 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 FC5에 의한 ABP의 인 비보 수송을 나타내는 것이다. WinNonlin 소프트웨어에 의해 PK 파라미터 및 CSF 노출을 분석하였고, 이는 하기 표 2에 나타나 있다.
도 7: 인 비보에서 인간 Fc(hFc)와 융합되고 ABP에 화학적으로 연결된 FC5 (FC5-hFc-ABP)의 BBB 투과성 및 CSF 출현 (래트 모델)을 나타낸다. 제조자의 사용설명서 (ThermoFisher Scientific)에 따라 이종이관능성 가교제 (heterobifunctional cross-linker) 설포-SMCC (설포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 시클로헥산-1-카르복실레이트)를 사용하여 FC5-hFc를 ABP-시스타미드와 연결하였다. 화학적으로 접합된 분자를 6.25 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 래트에게 정맥내 투여하고, 혈청 및 CSF 샘플을 4시간 및 24시간에 수집하고, nanoLC-MRM에 의해 분석하였다. FC5-hFc-ABP는 BBB 운반체를 갖지 않는 Fc-ABP와 대조적으로 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현했다. 이러한 화학적으로 연결된 작제물에서, ABP의 C-말단이 Fc 단편 (랜덤 영역)에 연결되어 있고, N-말단은 유리되어 있는 반면, 이와 달리 융합 작제물에서, ABP의 N-말단은 Fc의 C-말단에 융합되어 있고, ABP의 C-말단은 유리되어 있다는 것에 유의해야 한다. ABP의 배향에서 이러한 역전은 그의 Aβ-결합 능력 및 혈액-뇌 장벽을 통한 수송에 영향을 주지 않았다.
도 8: 마우스에서 정맥내 주사 후에 다양한 뇌 영역 (피질 및 해마)에서 측정된 FC5-mFc-ABP의 수준을 나타낸다. 15 mg/kg 용량의 FC5-mFc-ABP를 야생형 (WT) 또는 AD-유전자이식 (AD-Tg, B6.Cg-Tg, Jackson Lab) 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 주사하고, 심장내 식염수 관류 후 4시간 및 24시간에 뇌를 수집하였다. 해마 및 피질 조직을 절개하고, nanoLC-MRM (도 8a) 및 Fc-특이적 항체를 사용하는 Western 블롯 (도 8b)에 의해 분석하였다. 융합 분자의 3가지 성분 모두 (BBB, 이 예에서는 FC5, Fc 및 ABP)에 속하는 특정 펩티드를 MRM에 의해 피질 및 해마 모두에서 검출하였고, 이는 FC5 운반체가 ABP를 뇌의 표적 영역에 성공적으로 전달하였음을 나타낸다. 측정된 수준은, Fc에 융합된 대조군 단일-도메인 항체 A20.1, 또는 Fc 단편 단독의 경우에 전형적으로 ~ 50 ng/g 조직으로 측정된 것과 비교하여, 상이한 시점에서 750 내지 1400 ng/g 뇌 조직의 범위였다. 이는 조직 추출물에서 Fc 및 ABP에 대해 프로빙하는 (probing) Western 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다 (도 8b). 단지 식염수만을 제공받은 동물에서는 Western 블롯에 의해 융합 분자의 어떠한 단백질 신호도 검출되지 않았다. 뇌의 표적 영역에서 Western 블롯에 의해 검출된 FC5-mFc-ABP 수준의 용량-의존적 증가가 있었다.
도 9: 유전자이식 (Tg) 마우스에서 Aβ 수준에 대한 ABP의 효과를 나타낸다: ABP 단독 (도 9a) 또는 BBB 운반체 FC5와 융합된 ABP에 의한 치료 (도 9b 및 도 9c) 사이의 비교. 2개의 상이한 AD Tg 마우스 모델, 즉 삼중 유전자이식 (3X Tg-AD, 즉 PS1M146V, APPSwe 및 tauP301L 이식유전자를 포함하는 sv129/ C57BL6 마우스, Dr. F.M. LaFerla, University of California) 및 이중 유전자이식 (B6.Cg-Tg, 즉 PSEN1dE9 및 APPSwe 이식유전자를 포함함, Jackson Lab)을 사용하였고; 마우스에 각각 3개월 또는 2개월의 기간에 걸쳐 격일로 300 nmol/kg의 유리 ABP를 피하로 (sc) 투여하였다. 치료 기간의 종료 시점에서, 뇌에서 Aβ 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. ABP 단독에 의한 치료는 2 내지 3개월의 다회 치료 (격일로) 후에 뇌 Aβ의 25-50% 감소를 가져왔다 (도 9a). FC5-mFc-ABP 작제물을 이중 유전자이식 AD 마우스 (B6.Cg-Tg, 15 mg/kg; 220 nmol/kg과 등가임)에게 정맥내 주사하고; 주사 후 24시간에 ELISA 및 nanoLC-MRM 모두에 의해 뇌 Aβ 수준을 측정하였다. 예기치 않게도, FC5-mFc-ABP에 의한 치료 후 24시간 이내에 약 50%의 아밀로이드 감소가 관찰되었으며 (도 9b), 이는 Fc에 적절하게 연결된 FC5에 의한 ABP의 효과적인 뇌 전달이 뇌 Aβ 수준을 감소시키는데 있어서 ABP의 효능을 대폭 증가시켰음을 나타낸다. CSF 분석은 또한 FC5-mFc-ABP 치료 후 24시간 이내에 Aβ1 -42 수준의 유의한 감소를 나타내었다 (도 9c). MRM 또는 ELISA 분석에 의해 검출된 Aβ의 시그니처 펩티드 또는 에피토프는 ABP에 의해 인식되는 Aβ 에피토프로부터 멀리 있고/이와 상이하다 (따라서, ELISA 또는 MRM에 의한 그의 정량화를 방해하지 않음).
도 10: FC5-ABP (즉, Fc 성분을 갖지 않음)와 비교하여 FC5-Fc-ABP 작제물의 향상된 혈청 반감기의 예를 나타낸다: FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP를 꼬리 정맥을 통해 래트에게 주사하고, 일련의 혈청 샘플을 다양한 시점에서 수집하고, FC5-특이적 항체를 사용하여 직접 ELISA에 의해 분석하였다. 도 10A에서 알 수 있는 바와 같이, FC5-ABP 작제물은 FC5-Fc-ABP (도 10B)와 비교하여 혈청 중에서 신속하게 제거되었으며 (1시간 미만), 이는 Fc 단편을 포함하는 분자의 혈청 안정성의 실질적인 증가를 나타낸다.
도 11: Tg 래트에서 뇌 아밀로이드 부하에 대한 FC5-mFc-ABP의 효과를 나타낸다: AD-Tg 래트에게 4주의 기간에 걸쳐 매주마다 꼬리 정맥을 통해 식염수 또는 FC5-mFc-ABP를 투여하였다 (30 mg/kg의 로딩 용량 및 15 mg/kg의 후속 4회의 매주 용량). FC5-mFc-ABP 및 Aβ의 CSF 수준을 nanoLC MRM에 의해 분석하였다 (도 11a 및 도 11b). 치료 전과 치료 4주 후에, 특정 Aβ-결합제 [18F] NAV4694를 사용하여 PET 스캔에 의해 뇌 Aβ 수준을 결정하였다. 트레이서 주사 후에, 60분 동적 이미지를 획득하고, 투과 스캔을 획득하고, 이미지를 재구성하고, 결합능 (BPND) 파라미터 맵 (parametric map)을 생성하였다. FC5-mFc-ABP는 24시간 이내에 래트에게 CSF Aβ 수준을 감소시켰다 (도 11a 및 도 11b). Tg 래트에서와 같이 FC5-mFc-ABP와 Aβ의 CSF 수준 사이의 반비례 관계가 관찰되었으며, 이는 FC5에 의해 뇌 및 CSF에 전달된 ABP에 의한 표적 교합 및 Aβ의 신속한 제거를 시사한다 (도 11b). 이는 PET 스캔에 의해 추가로 확증되었고, PET 스캔은 FC5-mFc-ABP에 의한 4주의 치료 후에 래트 뇌 Aβ 수준의 유의한 감소 (30-50%)를 명확하게 나타내었다 (도 11c).
도 12: 식염수 또는 FC5-mFc-ABP에 의한 치료 전과 후에 Tg 래트의 용적측정 (volumetric) 자기 공명 영상 (MRI, FISP (Fast Imaging with Steady-state Precession)를 사용) 및 기능적 MRI (fMRI)를 나타낸다. 도 12a에 나타낸 바와 같이, 4주의 치료 후에 식염수-치료된 Tg 래트 (Tg-Sal)와 비교하여 ABP-치료된 Tg 래트 (Tg-ABP)에서 증가된 해마 부피가 관찰되었다. 도 12b에 나타낸 바와 같이, 4주의 치료 후에 그룹 비교는 ABP-치료된 Tg 래트 (Tg-ABP)가 식염수-치료된 Tg 래트 (Tg-Sal)와 비교하여 더 큰 전대상 피질 (ACC) 연결성을 가졌음을 나타내었다.
도 13: Tg 마우스 (도 9c) 및 Tg 래트 (도 11a 및 도 11b)에서 관찰되는 바와 같이 비글개의 CSF에서 FC5-mFc-ABP의 시간- 및 용량-의존적 출현 및 CSF Aβ 수준의 감소를 나타낸다. FC5-mFc-ABP를 15 mg/kg 및 30 mg/kg으로 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사에 의해 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, FC5-mFc-ABP 및 Aβ 수준에 대하여 nanoLC-MRM에 의해 분석하였다. 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였다. 중요한 점은, Tg 마우스 및 Tg 래트에서 관찰되는 바와 같이, FC5-mFc2a-ABP 주사 후 24시간 이내에 CSF Aβ 수준의 유의한 감소가 있었고, 이는 대형 동물에서 FC5 운반체의 전이 성질 (translational nature) 및 CNS Aβ 부하를 감소시키는데 있어서 ABP의 이종간 효능 (cross-species efficacy)을 시사한다.
도 14: 상이한 BBB 운반체를 갖는 ABP 융합 분자의 생성을 나타낸다. ABP 융합 분자의 다능성을 평가하기 위하여, ABP를 다른 인간화 BBB 운반체 IGF1R5(H2)와 성공적으로 융합시켰다. 도시된 바와 같이, 상기 분자의 이관능성, 즉 Aβ 올리고머에 결합하는 ABP의 능력 (ELISA 및 오버레이 분석) 및 인 비트로 BBB 모델을 통해 ABP를 전달하는 IGF1R5의 능력 (데이터는 나타나 있지 않음)을 보유하였다. 이는 ABP가 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체에 융합되어 뇌에 전달될 수 있음을 명백하게 나타낸다.
도 15: 상이한 단일-도메인 항체-Fc-ABP 작제물에 의한 Aβ 올리고머 결합을 나타낸다 (도 15a, 도 15b 및 도 15c). 이들 작제물 중 일부에서, ABP는 서열 번호로 나타낸 바와 같은 분자들의 부위-특이적 돌연변이 또는 C-말단 부분의 제거에 의해 변형되었다. 모든 작제물은 ELISA 방법에 의해 Aβ 올리고머를 결합시키는데 있어서 유사한 잠재성을 보유하였다.
도 16: 안정성 및 바이오-제조성을 개선하기 위한 특이적 돌연변이를 갖는 FC5-hFc1X7-ABP의 생성을 나타낸다. 특이적 돌연변이 (예컨대, 서열 번호: 35 또는 서열 번호: 36의 ABP)를 갖는 FC5-hFc1X7-ABP를 CHO 세포에서 생성하고, 환원 (R) 및 비환원 (NR) 조건하에 SDS-PGE 상에서 분리하고, Coomassie 블루로 염색하고, 이는 도 2에 도시된 바와 같다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, FC5-특이적 또는 hFc-특이적 또는 ABP-특이적 항체로 면역블로팅하였다. 다른 세트에서, 융합 분자에서 ABP의 Aβ-결합을 또한 오버레이 분석에 의해 시험하였다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10으로 검출하였다. 알 수 있는 바와 같이, 특이적 돌연변이에 의한 ABP의 체계적인 변형은 생성된 분자의 안정성을 실질적으로 향상시켰으며, 이는 환원 및 비환원 조건하에 단일 단백질 밴드에 의해 나타난 바와 같다.
도 17a, 17b: 인 비트로에서 다양한 FC5-Fc-ABP 작제물 및 IGF1R5-Fc-ABP 작제물의 혈액-뇌 장벽 투과성을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이 인 비트로 래트 BBB 모델에서 BBB-횡단을 평가하였고, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 분자를 nanoLC-MRM 방법에 의해 검출하였다. 인간화 FC5 및 IGF1R 운반체에 융합된 모든 ABP 변이체는 혈액-뇌 장벽을 효과적으로 횡단하였다. 예상된 바와 같이, BBB 비투과성 sdAb인 A20.1은 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았고, 마찬가지로 A20.1에 융합된 ABP는 BBB를 횡단하지 않았다 (도 17a). 도 17b에서, 융합 분자의 3가지 성분 모두, 즉 FC5, Fc 및 ABP의 "핑거-프린트 (finger-print)" 펩티드를 nanoLC-MRM에 의해 검출하였고, 이에 의해 BBB를 횡단하는 온전한 FC5, Fc 및 ABP의 관통이동을 나타내었다.
도 18: 인간화 FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물 (ABP, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36)이 FC5에 의해 인 비트로 혈액-뇌 장벽을 통해 온전하게 수송됨을 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이 인 비트로 래트 BBB 모델에서 혈액-뇌 장벽-횡단을 평가하였고, BBB를 횡단하는 분자는 Western 블롯 및 ELISA 분석에 의해 검출되었다. 도 18의 (1) A 및 B는 각각 hFc- 및 ABP-특이적 항체에 의해 프로빙된 면역블롯 (immunoblot)을 나타낸다. 분자 크기는 인 비트로 혈액-뇌 장벽 모델에 적용된 융합 분자의 분자 크기와 정확히 동일하다. 도 18의 (1) C는 샌드위치 ELISA를 나타내는데, 여기서 BBB를 횡단한 후에 분자를 ELISA 플레이트 상에 FC5-특이적 항체에 의해 포획하고, ABP-특이적 항체에 의해 검출하였다. 이 샌드위치 ELISA는 FC5(H3)-hFc1X7-ABP가 인 비트로에서 래트 혈액-뇌 장벽을 횡단한 후에 온전하게 유지되었음을 확인하였다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP (ABP, 서열 번호: 36)에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다: 도 18 (2) A, B 및 C.
도 19: 인간화 FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물 (ABP, 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36)이 인 비보 혈액-뇌 장벽을 통해 수송되고 FC5에 의해 뇌에 온전하게 전달됨을 나타낸다. FC5-ABP 융합 분자를 꼬리 정맥을 통해 야생형 및 AD-Tg 마우스에게 정맥내 투여하고, 도 8에 나타낸 바와 같이 심장내 관류 후에 뇌를 수집하였다. 뇌 피질을 균질화하고, RIPA 버퍼 중에 추출하고, 도 18에 나타낸 바와 같이 추출물은 Western 블롯 및 샌드위치 ELISA 분석을 실시하였다. 도 19의 A는 ABP-특이적 항체에 의해 프로빙된 면역블롯을 나타낸다. 분자 크기는 동물에게 주사된 융합 분자의 분자 크기와 정확히 동일하다. 도 19의 B는 동일한 추출물의 샌드위치 ELISA를 나타내고, 여기서 추출물 중의 분자를 ELISA 플레이트 상에 FC5-특이적 항체로 포획하고, ABP-특이적 항체로 검출하였다. 이는 FC5(H3)-hFc1X7-ABP가 인 비보에서 BBB를 통해 수송되고 뇌에 온전하게 전달되는 면역블롯 결과를 확인하였다.
도 20: AD-Tg 마우스 뇌 (B6.Cg-Tg, Jackson Lab)에서 내인성 Aβ 침착물에 대한 FC5(H3)-hFc1X7-ABP (ABP, 서열 번호: 36)의 엑스 비보 결합 (A) 및 인 비보 결합 (B)의 면역조직화학적 분석을 나타낸다. AD-유전자이식 마우스로부터의 뇌 절편을 FC5(H3)-hFc1X7-ABP (ABP, 서열 번호: 36)와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 HRP-접합된 FC5-특이적 항체로 시각화하였다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물에 대해서는 선택적 결합 (검정색 스폿)이 관찰되었지만, ABP를 갖지 않는 FC5(H3)-hFc1X7에 대해서는 관찰되지 않았고 (A), 이는 뇌에서 Aβ 침착물의 ABP-의존적 결합 (표적 교합)을 나타낸다. 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 결합이 관찰되지 않았다 (데이터는 나타나 있지 않음). AD 유전자이식 마우스에게 FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 해마내 주사 후에 (주사 후 4시간에) (ABP-특이적 항체를 사용하여) Aβ 침착물의 유사한 결합을 검출하였다 (B).
도 21: 인 비보에서 FC5(H3)-hFc1X7-ABP (ABP, 서열 번호: 32)에 의한 표적 교합을 나타낸다. 도 21의 A는 해마내 주사 후에 인 비보에서 AD 유전자이식 마우스에서 천연 아밀로이드-β (Aβ) 침착물에 대한 Alexa 647-표지 FC5-hFc-ABP 작제물의 결합을 나타낸다. 뇌 절편을 Alexa 488로 표지된 Aβ-특이적 항체 6E10으로 프로빙하고 2개의 신호의 공동-국소화 (Merge)를 입증함으로써 Aβ의 정체를 확인하였다. 도 21의 B는 ELISA에 의한 표적 교합의 입증을 나타낸다. FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 야생형 및 AD 유전자이식 마우스에게 해마내 주사 후에 (주사 후 4시간에), 해마체 (hippocampal formation)를 절개하고 균질화하였다. 포획 항체로서 FC5 항체 및 검출 항체로서 ABP 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 FC5-ABP 융합 작제물을 검출하였다. 내인성 Aβ에 대한 ABP의 인 비보 결합을, 검출 항체로서 Aβ-특이적 항체를 사용한 것을 제외하고는 동일한 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 도 21의 A 및 도 21의 B로부터, FC5-ABP 작제물이 야생형 마우스 및 AD 유전자이식 마우스 모두에서 주사후 4시간에 온전하게 유지됨이 명백하다. 가장 중요한 것은, 인간 Aβ를 발현하는 Tg 마우스에서, 주사된 ABP가 Aβ에 결합하고, 복합체 (FC5(H3)-hFc-ABP*Aβ)로서 아래로 당겨지며, 이는 인 비보에서 ABP에 의한 Aβ-표적 교합을 나타낸다.
도 22a, 22b: 비인간화 FC5-Fc-ABP 작제물과 인간화 FC5-Fc-ABP 작제물 사이의 PK, PD 비교를 나타낸다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 5에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 혈청 및 CSF PK 프로파일은 비인간화 및 인간화 작제물에 대한 것과 매우 유사하였다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 9b에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 Tg 마우스에게 정맥내 투여하였다. CSF에서 FC5-Fc-ABP 및 Aβ 수준을 도 9b에 나타낸 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해 측정하였다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, CSF에서 비인간화 및 인간화 FC5-Fc-ABP의 수준은 유사하였고, 가장 중요한 것은 CSF Aβ 수준의 변화 (감소)가 또한 매우 유사하다는 것이고, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물의 인간화가 융합 작제물의 PK 및 PD 프로파일에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
도 23a, 23b, 23c: 안정한 CHO 세포주에서 생성된 FC5(H3)-hFc1x7-ABP (서열 번호: 56)의 양이온-교환 (CEX) 크로마토그래피 프로파일을 나타내고, 이는 제조 중 여러 형태의 FC5(H3)-hFc1x7-ABP (ABP 변이체)의 생성을 나타낸다. 항-hFc 항체에 의한 상세한 Western 블롯 분석 (도 23a) 및 질량 분광 분석 (도 23b)은 상이한 형태의 융합 단백질이 제조 중에 상이한 위치에서 ABP 펩티드의 C-말단 절단으로 인해 생성되는 것을 나타내고 (서열 번호: 36의 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43에 예시된 바와 같음), 도 1Ai, 1Aii 및 1Aiii에서 도시된 바와 같이, 융합 단백질의 이관능성 이량체, 즉 ABP 관능성과 관련하여 이관능성 동종이량체 및 이종이량체 (ABP 아암 모두가 기능성임) 및 일관능성 이종이량체 (하나는 기능성 ABP 아암 및 다른 것은 비-기능성 아암)를 생성한다. CHO 세포에서 생성된 FC5(H3)-hFc1x7-L-ABP (6G) (서열 번호: 56) 이량체의 CEX 분획의 대표적인 질량 분광분석 데이터는 온전한 및 C-말단 절단된 ABP의 존재를 나타낸다 (도 23b). ABP 서열 번호: 36 (온전한 사슬 이량체 피크)을 포함하는 서열 번호: 56의 동종이량체, C-말단 절단된 ABP 변이체 [서열 번호: 57 (NI, Asn-Ile 피크); 서열 번호: 60 (RVKNI 피크)] 및 비-기능성 ABP (ASAQ/ASLA 피크)를 포함하는 이종이량체가 도시되어 있다 (도 23b). 융합 단백질 (서열 번호: 56)의 절단 산물의 정확한 특성은 알려져 있지 않고, 상세한 분석이 수행될 때까지 명백하지 않다. 동종이량체 (이관능성) 및 이종이량체 (일관능성 및 이관능성)의 혼합물을 함유하는 CEX 분획 (피크2), 전체 단백질의 약 25%를 나타냄, 도 23a)의 β-아밀로이드 결합 활성 (Western 블롯 Aβ 오버레이, 및 ELISA 분석, EC 50)은 이관능성 동종- 및 이종- 이량체 (피크3), 전체 단백질의 대략 65%를 나타냄)와 매우 유사하다는 것을 추가로 나타내었다. 이는 상기 이종이량체 및 동종이량체 분획 (CEX의 중간 및 주요 피크)이 β-아밀로이드 결합 활성을 유의하게 손실하지 않고 조합될 수 있다는 것을 강력하게 나타내었다. 이는 유리하게는 대규모 바이오 제조, 특히 융합 단백질 산물의 다운스트림 처리 중에 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질의 수율을 실질적으로 증가시킬 것이다. 이는 도 23c에서 입증된 바와 같이, 변형된 CEX 조건이 동종이량체 및 이종이량체 (일관능성 및 이관능성) 모두로 구성된 높은 수율 (컬럼 상에 적용된 전체 단백질의 85% 초과)로 분획을 생성하는 것을 나타낸다. 상기 조합된 풀 (분획 B3 내지 B6)의 β-아밀로이드 결합 활성 (EC 50)은 주로 동종이량체 (C10-D2, E12) 또는 이종이량체 형태 (C6-C8)를 함유하는 다른 CEX 분획과 매우 유사했다.
도 24: 샌드위치 ELISA (24A) 및 Western 블롯 분석 (24B)에 의해 평가된 바와 같이 야생형 (wt) 및 Tg 마우스 (자세한 사항은 도 8 및 19의 범례를 참조)의 정맥내 주사 (꼬리 정맥) 후에 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질 (동종- 및 이종-이량체의 혼합물)의 인 비보 뇌 전달을 나타내며, 이는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP (서열 번호: 56, 도 19 참조)의 주로 동종이량체 형태의 뇌 전달과 매우 유사하였고, 상기 혼합물 중 FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 이종이량체 형태가 혈액-뇌 장벽을 통해 융합 단백질의 인 비보 뇌 전달에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
도 25: Tg 마우스의 정맥내 주사 후에 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질 (동종- 및 이종-이량체의 혼합물)의 CSF 노출 및 CSF β-아밀로이드에서 이의 효과를 나타낸다 (도 22 및 24 참조). 도 25에 도시된 바와 같이, FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 CSF 노출 및 CSF Aβ 수준의 변화 (감소)는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 주로 동종이량체 형태에서 나타난 것과 매우 유사했고 (서열 번호: 56, 도 22 참조), 상기 혼합물 중 FC5(H3)-hFc1x7-ABP가 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질의 인 비보 기능적 효능에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 확인하였다.
본 발명은 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 폴리펩티드 및 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 베타-아밀로이드 (β-아밀로이드)에 결합하는 펩티드를 제공한다. β-아밀로이드에 결합하는 펩티드 (또는 단백질)는 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드1-42 (Aβ1 -42) 응집체에 선택적으로 결합할 수 있으며, 본원에서 ABP 또는 ABP 변이체 (또는 집합적으로 ABP), 또는 C-말단 절단된 ABP 산물로 약기되고, 지칭될 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편에 연결된 ABP (ABP 변이체 및 이의 C-말단 절단 산물)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 일 구체예에서, ABP 및 BBB를 포함하는 융합 단백질은 Fc 또는 이의 단편을 추가로 포함하며, 상기 융합 단백질의 ABP 및 BBB 성분은 Fc 영역 또는 이의 일부를 통해 연결되어 단쇄 폴리펩티드 (본원에서 BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP 약기됨)를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 작제물은 BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP를 포함할 수 있고, 상기 L은 임의의 적절한 링커일 수 있다. 제공된 BBB-Fc-ABP (또한, BBB-Fc-L-ABP로 약기됨) 작제물은 단쇄 폴리펩티드 또는 이의 이량체 폴리펩티드일 수 있고, BBB-Fc-ABP를 포함하는 단쇄 폴리펩티드는 성분 Fc 영역을 통해 다량체 (바람직하게는 이량체)를 형성할 수 있고, 상기 다량체는 상기 융합 단백질에서 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있으며, 상기 이종이량체는 각각 하나의 기능성 ABP 아암을 갖거나 또는 2개의 상이한 기능성 ABP 아암을 갖는 ABP와 관련하여 일관능성 또는 이관능성일 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 화합물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 BBB 및 ABP를 포함하는 화합물 및 알츠하이머병 (AD) 치료에 있어서 이의 용도에 관한 것이다.
혈액-뇌 장벽을 통해 ABP를 효율적으로 관통이동하고 ABP의 결합을 통해 Aβ의 제거를 제공할 수 있는 치료용 제제에 대한 필요성이 있다. 종래 기술에서, AD 발병에 관여된 Aβ1 -42 올리고머에 선택적으로 결합하는 40-아미노산 Aβ-결합 펩티드 (ABP)가 확인되었다 (WO 2006/133566). 이러한 Aβ-결합 펩티드는 인 비트로에서 세포 단백질에 대한 Aβ 결합을 억제하고 Aβ1 -42-유도 세포 독성을 억제한다 (Chakravarthy et al, 2013). 이러한 Aβ-결합 펩티드는 AD 유전자이식 마우스 뇌에서 아밀로이드 침착물에 결합할 뿐만 아니라, 인 비트로에서 AD 환자로부터의 뇌에서 아밀로이드 침착물에도 결합한다. 더 중요한 것은, 살아있는 AD 유전자이식 마우스 뇌에 직접 주사될 때 (Chakravarthy et al, 2014), ABP는 인 비보에서 천연 아밀로이드 침착물을 표적으로 한다는 것이다. 따라서, ABP는 잠재적으로 CNS Aβ를 표적으로 할 수 있고, 뇌로부터 Aβ의 제거에 도움을 주며, 이의 독성 효과를 감소시킬 수 있다는 것이다. 그러나, 전신 투여된 ABP는 BBB를 횡단하여 그 자체로 뇌 실질에 접근하는 능력은 제한적이다.
따라서, ABP는 Aβ에 결합하여 뇌로부터 Aβ를 제거하기 위하여 직접 적용될 때 Aβ 침착물에 결합하는 것으로 밝혀져 있기는 하지만, 비경구 투여된 ABP는 혈액-뇌 장벽을 투과할 필요성이 있다. 본 발명은 유리하게는 Fc 단편을 통해 BBB-투과성 단일-도메인 항체, 예컨대 FC5 또는 IGF1R에 융합된 ABP를 제공하여, 이중특이성 혈액-뇌 장벽-투과성 치료제를 제공한다 (Farrington et al, 2014). 본 발명의 BBB-Fc-ABP 작제물은 이량체화될 수 있으며, 즉 BBB-Fc-ABP 단쇄 융합 단백질은 2개의 단쇄 융합 단백질의 이량체를 형성하여 이량체 화합물 (여기서, 상기 이량체의 각각의 단쇄는 BBB, Fc 단편 및 ABP를 포함함)을 생성하여 BBB-Fc-ABP 이량체를 제공할 수 있다. BBB-Fc-ABP 또는 BBB-Fc-L-ABP 작제물 및 이들의 이량체는 혈액-뇌 장벽을 통해 ABP의 효율적인 관통이동을 가능하게 한다. 따라서, CSF 및 뇌 실질에서 ABP의 결합을 통한 Aβ의 유리한 치료적 제거가 본 발명의 작제물 및 방법에서 제공된다.
ABP의 뇌 전달을 가능하게 하고 그의 효능을 개선하기 위하여, ABP 펩티드는 현재 Fc 단편의 C-말단에 융합되는 반면, BBB-투과성 단일-도메인 항체, 예컨대 FC5 (WO 2002/057445)는 동일한 Fc 단편의 N-말단에 융합되어 이중특이성 BBB-투과성 치료제를 형성한다 (Farrington et al, 2014). 본 발명의 비-제한적인 구체예에서, Fc 단편은 마우스 (서열 번호: 48) 또는 인간 (서열 번호: 49; 서열 번호: 50)일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 Fc 단편은 이펙터 기능을 감소시키도록 조작되었다 (Shields et al., 2001). 예를 들어, Fc 단편은 hFc1x7 (서열 번호: 49)일 수 있으며, BBB-Fc-ABP 융합 단백질에서 Fc 단편은 유리하게는 융합 단백질의 이량체화를 가능하게 하여, 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있는 치료적으로 유효한 융합 분자 (BBB-Fc-ABP 이량체)를 수득한다. 일 구체예에서, BBB-Fc-ABP 융합 단백질은 FC5-H3-hFc1x7-ABP(6G) (서열 번호: 56) 및 이의 이량체, 또는 서열 번호: 56의 기능적으로 동등한 융합 단백질, 즉 β-아밀로이드 단백질에 결합할 수 있는 C-말단 절단된 ABP 산물을 포함하는 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65일 수 있다. 융합 단백질은 서열 번호: 56 또는 서열 번호: 71에서 구체화된 바와 같은 링커 서열 L, 또는 임의의 적절한 링커 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 베타-아밀로이드 (β-아밀로이드)에 결합하는 단리된 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드 또는 이의 β-아밀로이드 결합 C-말단 절단 산물은 하기 서열을 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI (서열 번호: 31; 40 aa)
상기에서 X1 =K, G 또는 A, X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, X7 = K, G 또는 V, X8 = R, G 또는 A, X9 = K, G 또는 A.
본 발명은 서열 번호: 36 (40 aa)의 C-말단 절단 산물, 즉 서열 번호: 37 (38 aa) 내지 서열 번호: 43 (32 aa)을 제공한다. 본 발명은 특정 C-말단 결실 및 이들 C-말단 결실들을 포함하는 혼합물을 제공한다. 특히, 서열 번호: 36은 C-말단으로부터 1개의 아미노산을 절단할 수 있거나 [-1aa로 아미노산 이소류신 (I)의 제거에 의한 39개의 아미노산 절단 산물을 수득]; 또는 이는 C-말단으로부터 2aa를 절단할 수 있거나 (NI의 -2aa 결실, 즉 NI의 제거 (아스파라긴 및 이소류신); 또는 이는 C-말단으로부터 3개의 아미노산을 절단할 수 있거나 (마이너스 KNI); 또는 이는 C-말단으로부터 4 aa를 절단할 수 있거나 (VKNI의 제거); 또는 이는 C-말단으로부터 5개의 아미노산을 절단할 수 있거나 (마이너스 RVKNI); 또는 이는 C-말단으로부터 6개의 아미노산을 절단할 수 있거나 (마이너스 SRVKNI); 또는 이는 C-말단으로부터 7개의 아미노산을 절단할 수 있거나 (마이너스 KSRVKNI); 또는 이는 C-말단으로부터 8개의 아미노산을 절단할 수 있다 (마이너스 LKSRVKNI). 제공된 절단 산물은 제공된 융합 단백질에 포함될 수 있는 기능성 (β-아밀로이드 결합) 펩티드를 수득하고, 제공된 융합 단백질은 동종 또는 이종이량체일 수 있으며, 상기 동종 및 이종이량체는 적어도 하나의 기능성 ABP 아암 (동종이량체의 경우에, 아암 모두가 기능성임), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 혼합물을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질 이량체는 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나의 단쇄 폴리펩티드, 또는 상기 정의된 단쇄 폴리펩티드의 적어도 하나를 갖는 이량체를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열 번호: 46 (29 aa)을 포함하거나 또는 이로 구성되는 β-아밀로이드 결합 펩티드를 제공한다.
본 발명의 ABP 펩티드 (ABP, ABP 변이체 또는 이의 C-말단 절단된 산물)는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다: 서열 번호: 27 내지 서열 번호: 36 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열, 또는 β-아밀로이드 단백질에 결합할 수 있는 C-말단 절단된 ABP 펩티드, 예컨대 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 또는 서열 번호: 43. 일 구체예에서, 제공된 폴리펩티드는 서열 번호: 31에 실질적으로 동등한 서열을 포함하는 ABP 변이체, 또는 이의 생물학적으로 기능성인 C-말단 절단 산물, 또는 서열 번호: 46의 서열을 포함하는 임의의 ABP이다. 이에 대해 실질적으로 동등한 서열은 상기 융합 분자에 동등한 안정성을 부여할 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통해 관통이동하는 항체 또는 이의 단편 및 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 화합물, 즉 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 BBB, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드 및 Fc를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 당업계에서 "면역글로불린" (Ig)으로도 지칭되는 용어 "항체"는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드로부터 작제된 단백질을 지칭하며; IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함한 다양한 Ig 이소형이 존재한다. 항체가 올바르게 접히는 경우, 각각의 사슬은 더 선형인 폴리펩티드 서열에 의해 결합된 다수의 별개의 구형 도메인으로 접힌다. 예를 들어, 면역글로불린 경쇄는 가변 (VL) 및 불변 (CL) 도메인으로 접히는 반면, 중쇄는 가변 (VH) 및 3개의 불변 (CH, CH2, CH3) 도메인으로 접힌다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (VH 및 VL)의 상호작용은 항원 결합 영역 (Fv)의 형성을 초래한다. 각 도메인은 당업자에게 알려져 있는 잘 확립된 구조를 갖는다.
상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 표적 항원에 결합하는 것을 담당하며, 이에 따라 항체들 사이의 유의한 서열 다양성을 나타낸다. 상기 불변 영역은 더 적은 서열 다양성을 나타내며, 다수의 천연 단백질에 결합하여 중요한 생화학적 이벤트를 유발하는 것을 담당한다. 항체의 가변 영역은 분자의 항원-결합 결정인자를 함유하며, 이에 따라 항체의 그의 표적 항원에 대한 특이성을 결정한다. 서열 가변성의 대부분은 각 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 당 3개씩, 6개의 초가변 영역에서 발생하며; 상기 초가변 영역은 조합하여 항원-결합 부위를 형성하고, 항원성 결정인자의 결합 및 인식에 기여한다. 항체의 그의 항원에 대한 특이성 및 친화도는 초가변 영역의 구조뿐만 아니라, 이들의 크기, 형상, 및 이들이 항원에 제시하는 표면의 화학에 의해 결정된다. 초가변성 영역의 확인을 위한 다양한 체계 (scheme)가 존재하며, 가장 일반적인 2가지는 Kabat의 것과 Chothia and Lesk의 것이다. Kabat et al (1991)은 VH 및 VL 도메인의 항원-결합 영역에서 서열 가변성에 기초하여 "상보성-결정 영역" (CDR)을 정의한다. Chothia and Lesk (1987)은 VH 및 VL 도메인에서 구조적 루프 영역의 위치에 기초하여 "초가변 루프" (H 또는 L)를 정의한다. 이들 개별 체계는 인접하거나 중첩하는 CDR 및 초가변 루프 영역을 정의하고, 항체 분야의 당업자는 종종 용어 "CDR"과 "초가변 루프"를 상호교환 가능하게 이용하며, 이들은 본원에서 그렇게 사용될 수 있다. 본원에서 CDR/루프가 Kabat 체계에 따라 확인된다.
본원에서 지칭되는 "항체 단편"은 당업계에 알려진 임의의 적절한 항원-결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 단편은 자연-발생 항체 단편일 수 있거나, 자연-발생 항체의 조작에 의해 또는 재조합 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fv, 단쇄 Fv (scFv; 펩티드 링커와 연결된 VL 및 VH로 구성된 분자), Fab, F(ab')2, 단일-도메인 항체 (sdAb; 단일 VL 또는 VH로 구성된 단편), 및 이들 중 임의의 것의 다가 제시를 포함할 수 있지만, 이로 한정되지 않는다. 항체 단편, 예컨대 방금 기재된 것들은 링커 서열, 디설파이드 결합, 또는 단편들의 상이한 부분들을 연결시키는 다른 유형의 공유 결합을 필요로 할 수 있으며; 당업자는 상이한 유형의 단편 및 이들의 작제를 위한 다양한 접근법 및 다양한 접근법들의 요건에 익숙할 것이다.
비-제한적인 예에서, 상기 항체 단편은 자연-발생 공급원으로부터 유래된 sdAb일 수 있다. 낙타류 기원의 중쇄 항체 (Hamers-Casterman et al, 1993)는 경쇄가 결여되어 있으며, 이에 따라 이들의 항원 결합 부위는 VHH로 불리는 하나의 도메인으로 구성된다. sdAb는 또한 상어에서 관찰되었고, VNAR로 불린다 (Nuttall et al, 2003). 다른 sdAb는 인간 Ig 중쇄 및 경쇄 서열에 기초하여 조작될 수 있다 (Jespers et al, 2004; To et al, 2005). 본원에서 사용되는, 용어 "sdAb"는 파지 디스플레이 또는 다른 기술을 통해 임의의 기원의 VH, VHH, VL 또는 VNAR 저장소로부터 직접 단리된 sdAb, 상기 언급된 sdAb로부터 유래된 sdAb, 재조합으로 생성된 SdAb뿐만 아니라, 그러한 sdAb를 인간화, 친화성 성숙, 안정화, 가용화, 낙타화 (camelization), 또는 다른 항체 조작 방법에 의한 추가 변형을 통해 생성된 sdAb를 포함한다. 또한, 본 발명은 sdAb의 항원-결합 기능 및 특이성을 보유하는 호모로그, 유도체, 또는 단편을 포함한다.
sdAb는 항체 분자에 대한 바람직한 특성, 예컨대 높은 열안정성, 높은 세제 (detergent) 저항성, 프로테아제에 대한 비교적 높은 저항성 (Dumoulin et al, 2002) 및 높은 생산 수율 (Arbabi-Ghahroudi et al, 1997)을 가지며; 이들은 또한 면역 라이브러리로부터의 단리에 의해 (Li et al, 2009) 또는 인 비트로 친화성 성숙에 의해 (Davies & Riechmann, 1996) 매우 높은 친화도를 갖도록 조작될 수 있다. 안정성을 증가시키기 위한 추가의 변형, 예컨대 비표준 디설파이드 결합의 도입 (Hussack et al, 2011a,b; Kim et al, 2012)이 또한 sdAb에 제공될 수 있다.
당업자는 단일-도메인 항체의 구조 (예를 들어, Protein Data Bank에서 3DWT, 2P42 참조)를 잘 숙지하고 있을 것이다. sdAb는 면역글로불린 접힘을 보유하는 단일 면역글로불린 도메인을 포함하고; 가장 주목할 만한 점은, 3개의 CDR/초가변 루프만이 항원-결합 부위를 형성한다는 것이다. 그러나, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원에 결합하기 위해 모든 CDR이 요구되는 것은 아닐 수 있다. 예를 들어, 제한적이고자 함이 없이, CDR 중 1개, 2개 또는 3개가 본 발명의 sdAb에 의한 항원의 결합 및 인식에 기여할 수 있다. 본원에서 sdAb 또는 가변 도메인의 CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭된다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동할 수 있다. 뇌는 혈액-뇌 장벽 (BBB)으로 알려진 특수화된 내피 조직에 의해 신체의 나머지로부터 분리된다. BBB의 내피 세포들은 밀착 연접에 의해 연결되어 있어서 많은 치료용 화합물이 뇌로 진입하는 것을 효율적으로 방해한다. 낮은 속도의 소포 수송 (vesicular transport)에 더하여, BBB의 한 가지 특별한 특징은 효소 장벽(들)의 존재 및 BBB의 강외측 (뇌) (abluminal (brain) side)에서 ATP-의존적 수송체 (P-당단백질을 포함함)의 높은 발현 수준이 있고 (Gottesman and Pastani, 1993; Watanabe, 1995), 이는 다양한 분자를 뇌로부터 혈류로 능동적으로 수송한다 (Samuels, 1993). 작고 (<500 달톤) 소수성인 (Pardridge, 1995) 분자만이 BBB를 더 용이하게 횡단할 수 있다. 따라서, 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 표면 수용체에 특이적으로 결합하고, 뇌 내피 세포 내로 내재화되며, 리소좀 분해를 피함으로써 혈액-뇌 장벽을 통한 트란스사이토시스 (transcytosis)를 거치는 능력은 신경학적 분야에서 유용하다. 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 항체 또는 이의 단편은 다른 분자, 예컨대 치료제를 뇌 조직에 전달하기 위해 이를 운반하는데 사용할 수 있다. 상기 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동하는 것으로 당 업계에 알려진 임의의 적절한 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명은 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통이동하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 화합물 또는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 항체 또는 단편은, 예를 들어, WO 2007/036021에 기재된 바와 같이 막횡단 단백질 30A (TMEM30A)에, 또는 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 에피토프, 또는 이의 이소형, 변이체, 일부분, 또는 단편에 결합할 수 있다.
본 발명의 화합물에서 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함할 수 있다:
HYTMG (서열 번호: 1)의 상보성 결정 영역 (CDR) 1 서열; RITWGGDNTFYSNSVKG (서열 번호: 2)의 CDR2 서열; 및 GSTSTATPLRVDY (서열 번호: 3)의 CDR3 서열; 또는
EYPSNFYA (서열 번호: 4)의 CDR1 서열, VSRDGLTT (서열 번호: 5)의 CDR2 서열, AIVITGVWNKVDVNSRSYHY (서열 번호: 6)의 CDR3 서열; 또는
GGTVSPTA (서열 번호: 7)의 CDR1 서열, ITWSRGTT (서열 번호: 8)의 CDR2 서열, AASTFLRILPEESAYTY (서열 번호: 9)의 CDR3 서열; 또는
GRTIDNYA (서열 번호: 10)의 CDR1 서열, IDWGDGGX (여기서 X는 A 또는 T임) (서열 번호: 11)의 CDR2 서열, AMARQSRVNLDVARYDY (서열 번호: 12)의 CDR3 서열.
이전에 언급된 바와 같이, 상기 항체 또는 이의 단편은 낙타류 기원 또는 낙타류 VHH로부터 유래된 sdAb일 수 있으며, 이에 따라 낙타류 프레임워크 영역에 기초할 수 있으며; 대안으로서, 상기 기재된 CDR은 VNAR, VHH, VH 또는 VL 프레임워크 영역 상에 그래프팅될 수 있다. 또 다른 대안에서, 상기 기재된 초가변 루프는 임의의 공급원 (예를 들어, 마우스 또는 인간)의 다른 유형의 항체 단편 (Fv, scFv, Fab)의 프레임워크 영역 상에 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 성질의 단백질 상에 그래프팅될 수 있다 (예를 들어, Nicaise et al, 2004 참조).
본 발명은 키메라 (또는 키메라화된), 베니어링된 (veneered), 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 키메라 항체 또는 이의 단편은 (마우스 또는 낙타류 기원의) 천연 가변 도메인이 인간 불변 도메인(들)에 연결된 작제물이다 (Gonzales et al 2005 참조). 항체의 베니어링 또는 재표면화는 천연 항체 또는 이의 단편의 프레임워크 영역에서 노출된 잔기를 이들의 인간 대응물에서 아미노산 잔기로 대체하는 것을 수반한다 (Padlan, 1991; Gonzales et al 2005). 항체 또는 항체 단편의 인간화는 항원-결합 능력 또는 특이성의 손실 없이 서열 내의 아미노산을, 인간 컨센서스 서열에서 발견되는 바와 같은 그의 인간 대응물로 대체하는 것을 포함하며; 이러한 접근법은 인간 대상에게 도입되는 경우 항체 또는 이의 단편의 면역원성을 감소시킨다. 이러한 공정에서, 본원에 정의된 CDR 중 하나 또는 하나 초과의 CDR이 인간 가변 영역 (VH 또는 VL)에, 다른 인간 항체 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)에, 인간 항체 단편 프레임워크 영역 (Fv, scFv, Fab)에, 또는 CDR이 그래프팅될 수 있는 유사한 크기 및 성질의 인간 단백질에 융합되거나 그래프팅될 수 있다 (Nicaise et al., 2004). 그러한 경우에, 상기 하나 또는 하나 초과의 초가변 루프의 입체형태가 보존될 가능성이 있고, sdAb의 그의 표적 (즉, 뇌 내피 세포 상의 에피토프, 예컨대 TMEM30A 또는 IGF1R 에피토프)에 대한 친화도 및 특이성은 최소한의 영향을 받을 가능성이 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 결합 및 특이성을 보유하기 위하여 소정의 천연 아미노산 잔기를 인간 프레임워크 내로 혼입하는 것이 필요할 수 있다. CDR 그래프팅에 의한 인간화가 당업계에 알려져 있으며 (예를 들어, Tsurushita et al, 2005; Jones et al, 1986; Tempest et al, 1991; Riechmann et al, 1988; Queen et al, 1989; reviewed in Gonzales et al, 2005 참조; 또한 그 안에 인용된 문헌 참조), 이에 따라 당업자는 그러한 인간화 항체 또는 이의 단편을 제조하는 방법에 충분히 익숙할 것이다.
제공된 항체 또는 이의 단편은 FC5 항체 (WO 2002/057445에 기재됨) 또는 IGF1R 항체의 인간화 버전일 수 있다. FC5 (서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 중 어느 하나의 서열을 포함함), 및 IGF1R (서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25 또는 서열 번호: 26 중 어느 하나의 서열을 포함함)은 뇌 내피 세포 상의 수용체 에피토프의 표면에 결합하고 후속하여 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통이동한다. FC5는 또한 BBB를 횡단하는 다양한 크기의 분자를 안내하는 운반체로서 작용하는 것으로 나타났다 (예를 들어, WO 2011/127580 참조). FC5 관통이동을 매개하는 항원은 막횡단 도메인 단백질 30A (TMEM30A; WO 2007/036021)로서 실험으로 확인되었고, 이는 뇌 내피 세포의 표면에 풍부하다.
예를 들어, 제한적이고자 함이 없이, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 서열을 포함할 수 있다:
X1VQLVX2SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFKITHYTMGWX3RQAPGKX4X5EX6VSRITWGGDNTFYSNSVKGRFTISRDNSKNTX7YLQMNSLRAEDTAVYYCAAGSTSTATPLRVDYWGQGTLVTVSS (서열 번호: 13),
여기서 X1=D 또는 E, X2=A 또는 E, X3=F 또는 V, X4=E 또는 G, X5=R 또는 L, X6=F 또는 W, X7=L 또는 V, 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열;
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5ASEYPSNFYAMSWX6RQAPGKX7X8EX9VX10GVSRDGLTTLYADSVKGRFTX11SRDNX12KNTX13X14LQMNSX15X16AEDTAVYYCAIVITGVWNKVDVNSRSYHYWGQGTX17VTVSS (서열 번호: 18),
여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 A이고; X6은 F 또는 V이고; X7은 E 또는 G이고; X8은 R 또는 L이고; X9는 F 또는 W이고; X10은 A 또는 S이고; X11은 M 또는 I이고; X12는 A 또는 S이고; X13은 V 또는 L이고; X14는 D 또는 Y이고; X15는 V 또는 L이고; X16은 K 또는 R이고; X17은 Q 또는 L임; 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열;
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCX5X6SGGTVSPTAMGWX7RQAPGKX8X9EX10VX11HITWSRGTTRX12ASSVKX13RFTISRDX14X15KNTX16YLQMNSLX17X18EDTAVYYCAASTFLRILPEESAYTYWGQGT X19VTVSS (서열 번호: 21),
여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 A 또는 E이고; X6은 V 또는 A이고; X7은 V 또는 F이고; X8은 G 또는 E이고; X9는 L 또는 R이고; X10은 F 또는 W이고; X11은 G 또는 S이고; X12는 V 또는 Y이고; X13은 D 또는 G이고; X14는 N 또는 S이고; X15는 A 또는 S이고; X16은 L 또는 V이고; X17은 K 또는 R이고; X18은 A 또는 S이고; X19는 L 또는 Q임; 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열;
X1VX2LX3ESGGGLVQX4GGSLRLSCAASGRTIDNYAMAWX5RQAPGKX6X7EX8VX9TIDWGDGGX10RYANSVKGRFTISRDNX11KX12TX13YLQMNX14LX15X16EDTAVYX17CAMARQSRVNLDVARYDYWGQGTX18VTVSS (서열 번호: 24),
여기서 X1은 E 또는 Q이고; X2는 K 또는 Q이고; X3은 V 또는 E이고; X4는 A 또는 P이고; X5는 V 또는 S이고; X6은 D 또는 G이고; X7은 L 또는 R이고; X8은 F 또는 W이고; X9는 A 또는 S이고; X10은 A 또는 T이고; X11은 A 또는 S이고; X12는 G 또는 N이고; X13은 M 또는 L이고; X14는 N 또는 R이고; X15는 E 또는 R이고; X16은 P 또는 A이고; X17은 S 또는 Y이고; X18은 Q 또는 L임; 또는 이에 대해 실질적으로 동일한 서열.
보다 구체적으로, 어떠한 방식으로도 제한적이고자 함이 없이, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 항체 또는 이의 단편은 단일-도메인 항체일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질에서 임의의 성분 펩티드와 관련하여, "실질적으로 동일한" 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이 또는 생물학적으로 기능성인 활성이 유지되도록 하는 아미노산 결실 (예컨대 본원에서 제공된 C-말단 절단된 ABP 펩티드)을 포함할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이는 참조 서열과 비교하여 생리학적, 화학적, 물리화학적 또는 기능적 특성의 실질적인 변화 없이 돌연변이 펩티드를 생성할 수 있음이 당 업계에 알려져 있으며; 그러한 경우에, 참조 서열과 돌연변이 서열은 "실질적으로 동일한" 폴리펩티드로 간주될 것이다. 본원에서 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기의 유사한 화학적 특성 (예: 크기, 전하, 또는 극성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로의 치환으로서 정의된다. 이들 보존적 아미노산 돌연변이는 상기에 열거된 CDR 서열 및 항체 또는 단편의 CDR의 전체 구조를 유지하면서 sdAb의 프레임워크 영역에 대해 이루어질 수 있으며; 이에 따라 항체의 특이성 및 결합은 유지된다.
본 발명의 융합 단백질에서 임의의 성분 펩티드와 관련하여, "실질적으로 동등한" 서열은 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이 또는 생물학적으로 기능적인 활성이 유지되도록 하는 아미노산 결실 (예컨대 본원에서 제공된 C-말단 절단된 ABP 펩티드)을 포함할 수 있고; 상기 돌연변이 펩티드는 펩티드 안정성 및 바이오-제조성과 관련하여 실질적으로 동등하다. 실질적으로 동등함은 융합 분자 안정성, 예를 들어 SDS PAGE (환원 조건 및 비-환원 조건)에서 알 수 있는 바와 같이 분해 산물 또는 저분자량 밴드의 부재와 관련하여 동등하다고 할 수 있다. 참조 서열에 대한 하나 이상의 보존적 아미노산 돌연변이는 참조 서열과 비교하여 생리학적, 화학적, 물리화학적 또는 기능적 특성의 실질적인 변화 없이 돌연변이 펩티드를 생성할 수 있다고 당 업계에 알려져 있으며; 그러한 경우에, 참조 서열과 돌연변이 서열은 "실질적으로 동등한" 폴리펩티드로 간주될 것이다.
비-제한적인 예에서, 보존적 돌연변이는 기능성을 유지하는 아미노산 치환 또는 결실일 수 있다. 그러한 보존적 아미노산 치환은 염기성, 중성, 소수성 또는 산성 아미노산을 동일한 그룹의 다른 것으로 치환할 수 있다. 용어 "염기성 아미노산"은 7 초과의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 의미하며, 이는 전형적으로 생리학적 pH에서 양으로 하전된다. 염기성 아미노산은 히스티딘 (His 또는 H), 아르기닌 (Arg 또는 R) 및 리신 (Lys 또는 K)을 포함한다. 용어 "중성 아미노산" (또한 "극성 아미노산")은 생리학적 pH에서 하전되지 않지만, 2개의 원자에 의해 공통적으로 공유되는 전자들의 쌍이 원자들 중 하나에 의해 더 근접하게 유지되는 적어도 하나의 결합을 갖는 측쇄를 갖는 친수성 아미노산을 의미한다. 극성 아미노산은 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 시스테인 (Cys 또는 C), 티로신 (Tyr 또는 Y), 아스파라긴 (Asn 또는 N) 및 글루타민 (Gln 또는 Q)을 포함한다. 용어 "소수성 아미노산" (또한 "비극성 아미노산")은 Eisenberg (1984)의 정규화된 컨센서스 소수성 스케일에 따라 0 보다 큰 소수성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것으로 의미된다. 소수성 아미노산은 프롤린 (Pro 또는 P), 이소류신 (Ile 또는 I), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 발린 (Val 또는 V), 류신 (Leu 또는 L), 트립토판 (Trp 또는 W), 메티오닌 (Met 또는 M), 알라닌 (Ala 또는 A) 및 글리신 (Gly 또는 G)을 포함한다. "산성 아미노산"은 7 미만의 측쇄 pK 값을 갖는 친수성 아미노산을 지칭하며, 이는 전형적으로 생리학적 pH에서 음으로 하전된다. 산성 아미노산은 글루타메이트 (Glu 또는 E) 및 아스파르테이트 (Asp 또는 D)를 포함한다.
서열 동일성은 2개의 서열의 유사성을 평가하는데 사용되고; 이는 2개의 서열을 잔기 위치들 사이의 최대 일치도로 정렬한 경우 동일한 잔기의 퍼센트를 계산함으로써 측정된다. 임의의 알려진 방법이 서열 동일성을 계산하는데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 컴퓨터 소프트웨어가 서열 동일성을 계산하는데 이용 가능하다. 제한적이고자 함이 없이, 서열 동일성은 소프트웨어, 예컨대 Swiss Institute of Bioinformatics에 의해 관리되는 NCBI BLAST2 서비스 (ca.expasy.org/tools/blast/에서 찾아지는 바와 같음), BLAST-P, Blast-N, 또는 FASTA-N, 또는 당 업계에 알려진 임의의 다른 적절한 소프트웨어에 의해 계산될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 동일한 서열은 적어도 74% 동일할 수 있으며; 다른 예에서, 실질적으로 동일한 서열은 본원에 기재된 서열에 대한 아미노산 수준에서, 적어도 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80-90, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 동일할 수 있다. 중요한 점은, 실질적으로 동일한 서열은 참조 서열의 활성 및 특이성을 보유한다는 것이다. 비-제한적인 구체예에서, 서열 동일성의 차이는 보존적 아미노산 돌연변이(들)에 기인할 수 있다. 비-제한적인 예에서, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 서열과 적어도 95%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편에 관한 것일 수 있다. 다른 비-제한적인 예에서, 본원에 제공되는 바와 같이, 본 발명의 ABP 펩티드는 서열 번호: 36 (40 aa)에 대해 적어도 74% 동일한 서열을 포함할 수 있다; 즉 본 발명은 서열 번호: 36의 C-말단 절단 산물인 ABP 펩티드를 포함하고, 이에 대해 적어도 74%, 75%, 76%, 77%, 78% - 100% 동일, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트로 동일할 수 있다. 동일성 퍼센트는 참조 펩티드 서열에 대해 (즉, ABP 성분 펩티드 서열과 비교하여) 각 성분 펩티드에 기초하여 계산된다는 점에 유의해야 한다. 본 발명의 ABP는 서열 번호: 46 (29 aa)의 서열, 또는 이의 동등한 β-아밀로이드 결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 화합물에서 항체 또는 이의 단편은 Fc 도메인에 연결될 수 있으며, 예를 들어 인간 Fc 도메인을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 Fc 도메인은 IgG, IgM을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 부류, 또는 IgG1, IgG2 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 하위부류로부터 선택될 수 있다. 이러한 접근법에서, Fc 유전자는 sdAb 유전자와 함께 벡터로 삽입되어 sdAb-Fc 융합 단백질을 생성하며 (Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010); 융합 단백질은 재조합으로 발현되고, 이어서 정제된다. 예를 들어, 어떠한 방식으로도 제한적이고자 함이 없이, 다가 디스플레이 포맷은 FC5-H3의 키메라 포맷 및 Fc 도메인에 연결된 이의 돌연변이 변이체를 포함할 수 있다. 그러한 항체는 조작 및 생성이 용이하며, sdAb의 혈청 반감기를 대폭 연장할 수 있다 (Bell et al., 2010).
상기 기재된 바와 같은 화합물에서 Fc 도메인은 당 업계에 알려진 임의의 적절한 Fc 단편일 수 있다. Fc 단편은 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있으며; 예를 들어, Fc는 마우스 또는 인간 기원의 것일 수 있다. 다른 Fc 또는 Fc 단편의 구체예는 면역학적 이펙터 기능을 조절, 변경 또는 억제할 수 있다 (Shields 2001). 다른 Fc 단편의 구체예는 뇌로부터 융합 펩티드의 제거를 매개할 수 있다 (Caram-Salas N 2011). 구체적인 비-제한적 예에서, Fc는 마우스 Fc2a 단편 또는 인간 Fc1 단편일 수 있다 (Bell et al, 2010; Iqbal et al, 2010). 구체적인 비-제한적 예에서, 다량체화된 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 단리되거나 또는 정제된 항체 또는 단편 및 서열 번호: 48; 서열 번호: 49; 서열 번호: 50의 서열의 Fc를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 BBB-Fc-ABP 융합 단백질은 Fc를 통해 이량체를 형성하여 2가의 이관능성 BBB-Fc-ABP를 제공할 수 있다.
본 발명의 화합물은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드에 연결된 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 링커는 적절한 길이의, 중성 또는 친수성 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 비-제한적인 예에서, 길이는 바람직하게는 12개 미만의 아미노산이며, 폴리펩티드는 GGGGSGGGGS, 또는 TGGGGSGGGGS, 또는 임의의 적절한 링커 (예: (GGGSGGGGS)n 또는 (GGGGSGGG)n 또는 임의의 적절한 조합)이다. 올바른 배향으로 비펩티드 형태, 예컨대 아미드 또는 에스테르 연결을 사용하는 다른 화학적 링커가 이용될 수 있다. 예를 들어, 서열 번호: 71은 임의의 적절한 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 본 발명의 임의의 융합 단백질, 즉 서열 번호: 51 - 70은 서열 번호: 71에 예시된 바와 같은 임의의 적절한 링커를 포함할 수 있다. β-아밀로이드 (Aβ)에 결합하는 폴리펩티드는 AD 병리에 관여하는 병리학적으로 관련된 β-아밀로이드, 예컨대 Aβ1 -42 응집체에 결합할 수 있으며; 폴리펩티드는 고친화도 (nM 범위)로 Aβ에 결합하고, 인 비트로에서 세포 단백질에 대한 Aβ 결합 및 Aβ1 -42-유도 세포 독성을 억제할 수 있고, AD 유전자이식 마우스 뇌에서 아밀로이드 침착물에 결합할 뿐만 아니라 인 비트로에서 AD 환자로부터의 뇌에서 아밀로이드 침착물에도 결합한다. 본 발명의 화합물에서 폴리펩티드는 역 (reverse) 펩티드 Aβ42-1에 결합하지 않는다.
본원에 제공된 화합물에서, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다: 서열 번호: 27; 서열 번호: 28; 서열 번호: 29; 서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36 또는 이의 β-아밀로이드 결합 C-말단 절단 산물, 즉 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43; 또는 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46, 서열 번호: 47 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열. "실질적으로 동일한" 서열은 상기에 기재된 바와 같다.
따라서, 본 발명은 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드 및 이의 변이체(즉, ABP 및 ABP 변이체)를 제공한다. ABP 변이체는 서열 번호: 31을 갖는 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 제공된 ABP 변이체는 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열 또는 이에 대해 실질적으로 동등한 서열을 포함할 수 있다.
따라서, ABP의 상세히 설명된 생물물리학적 특성에 기초한 조직적이고 체계적인 특이적 변형을 포함하는 ABP 폴리펩티드 서열이 제공된다. ABP 폴리펩티드에 대해 특이적이고 체계적으로 유도된 변형은 서열 번호: 31에 제공된 바와 같은, 본 발명의 신규하고 자명하지 않은 ABP 변이체, 또는 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 C-말단 절단 산물을 포함한다.
본원에 제공된 펩티드는 서열 번호: 27 - 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있는 서열, 및 이에 대해 실질적으로 동등한 서열을 포함하는 ABP 또는 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 C-말단 절단 산물을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 융합 단백질은 서열 번호: 31 내지 서열 번호: 47 중 어느 하나로부터 선택될 수 있는 서열을 포함하는 ABP를 포함할 수 있다. 상기 ABP는 서열 번호: 31에 대해 동등한 임의의 서열 또는 서열 번호: 31 또는 36의 C-말단 절단 산물일 수 있고, 상기 C-말단 산물은 β-아밀로이드 결합 활성을 가질 수 있고, 예컨대 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 또는 서열 번호: 43이다. 상기 ABP는 서열 번호: 46에 대해 동등한 임의의 서열일 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, ABP, ABP 변이체 또는 C-말단 절단 산물을 포함하는 작제물은 화합물 안정성 및 바이오-제조성에서 유익한 개선을 나타내었다 (도 16에서 볼 수 있는 바와 같음).
보다 구체적으로, 본원에 제공된 특정 ABP 절단 종 (즉 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42 또는 서열 번호: 43)은 예측될 수 없었고, 서열 번호: 36으로부터 절단된 현재 명시된 절단 부위 C-말단은 알려져 있지도 예측되지도 않았다. 이들 특정 C-말단 절단 산물은 융합 펩티드의 바이오제조 중에 예측될 수 없었다. 상기 ABP 단백질 및 이의 C-말단 절단 산물의 안정성 및 바이오-제조성은 예측될 수 없었다.
더욱이, 본원에 제공된 융합 단백질은 이관능성 이량체 또는 일관능성 이량체일 수 있다는 것은 매우 유리하고 예상치 못한 일이며, 상기 일관능성 및 이관능성 이량체는 β-아밀로이드 결합 기능성 및 활성과 관련하여 동등한 융합 단백질을 제공한다. 제공된 C-말단 절단 산물의 유리한 안정성, 제조성 및 동등한 β-아밀로이드 결합 기능성은 알려져 있지도 자명하지도 않았다. 이는 동등한 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 ABP 펩티드들의 혼합물의 제조 및 동등한 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 융합 단백질들 및 이의 이량체들의 혼합물의 제조를 가능하게 한다. 더욱이, 일관능성 및 이관능성 이량체의 유리한 동등한 기능성은 알려져 있지도, 예측될 수도 없었다. 본 발명이 동등한 활성을 가진 융합 단백질 및 이량체 (일관능성 및 이관능성 이량체는 서열 번호: 46을 포함하는 최소 ABP 서열을 포함함)의 혼합물을 제공하는 것은 상당히 유리하며, 이에 의해 기능성 ABP 단백질 수율의 증가 및 바이오제조에서 기능성 융합 단백질 및 기능성 융합 단백질 이량체 수율의 증가를 가능하게 한다.
본원에 제공된 융합 단백질 및 화합물은 개선된 치료적 효능을 나타낸다. 보다 구체적으로, 제공된 화합물은 향상된 바이오-제조성 (인간 포유동물 발현 시스템에서 생성)을 위하여 안정적인 BBB-Fc-ABP 융합 분자의 생성을 가능하게 하는, 특이적으로 변형된 ABP를 포함하며, 이는 예를 들어 특정 부위 - ABP 서열 (서열 번호: 36)의 N-말단으로부터 위치 1, 4, 6, 7, 28 및 29에서 특정 아미노산 K (리신), R (아르기닌) 및 N (아스파라긴)의 G (글리신)으로의 돌연변이를 포함한다. 본원에 제공된 ABP에 대한 특이적 변형은 ABP의 상세히 설명된 생물물리학적 특성에 기초한 조직적이고 체계적인 변형이었다. 본원에 제공된 변형된 ABP는, 예를 들어 서열 번호: 32 - 서열 번호: 47로부터 선택된 서열, 및 예컨대 서열 번호: 31의 서열에 대해 실질적으로 동등한 서열, 또는 이의 C-말단 절단된 기능성 산물을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 화합물은 유리하게도 개선된 안정성 및 바이오-제조성, 및 뇌에서 Aβ 수준을 감소시키는 효능의 가장 유의한 증가를 나타내며; 여기서 본 발명의 작제물에 의한 치료 후 24시간 이내에 50% 아밀로이드 감소가 관찰되었다.
본원에서 "접합된"으로도 지칭되는, 용어 "연결된"은 2개의 모이어티가 공유적으로 또는 비공유적으로 (예: 흡착, 이온 상호작용) 직접 또는 간접적으로 (예: 링커를 통해) 결합됨을 의미한다. 공유 결합은 화학적 가교 반응을 통해, 또는 임의의 펩티드 발현 시스템, 예컨대 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포-기반 시스템과 조합된 재조합 DNA 방법을 사용한 융합을 통해 달성될 수 있다. 항체 또는 이의 단편을 Aβ에 결합하는 폴리펩티드 또는 Fc에 접합할 때, 적절한 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 링커는 BBB-Fc-ABP 단백질 융합체의 성분들의 접합을 가능하게 하는 적절한 길이의, 중성 또는 친수성 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 링커는 융합 단백질 (예를 들어, 서열 번호: 51-69)의 성분들이 맞추어 연결될 수 있게 하고, 그 안에 강조처리된 GGGGSGGGGS 또는 (GGGS)n 링커로 한정되지 않고, 임의의 적절한 링커 (즉, 서열 번호: 71의 비-제한된 융합 단백질에서와 같음)일 수 있다. 비-제한적인 예에서, 길이는 바람직하게는 12개 미만의 아미노산이며, 폴리펩티드는 GGGGSGGGS, 또는 GGGSGGGGS, 또는 TGGGGSGGGS, 또는 당 분야에서 임의의 적절한 링커일 수 있다. 올바른 배향으로 비펩티드 형태, 예컨대 아미드 또는 에스테르 연결을 사용하는 다른 화학적 링커가 이용될 수 있다. 당업자는 링커, 또는 항체 또는 이의 단편을 폴리펩티드에 연결하는 방법을 잘 알 것이다. 항체 또는 이의 단편을 폴리펩티드 또는 Fc에 연결하기 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 제공된 화합물은 항체 또는 이의 단편, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드, 및 Fc 단편을 포함하며, 이들은 연결되어 작제물 (이는 본원에서 화합물 또는 융합 분자로도 지칭됨)을 제공하며, 상기 작제물은 융합 단백질 및 이의 이량체를 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 Fc 단편 또는 적절한 링커를 통해 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드에 연결될 수 있다.
항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 14, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 중 어느 하나로부터 선택되는 서열, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 상기 항체 또는 이의 단편은 혈액-뇌 장벽을 관통이동한다. 상기 항체 또는 단편은 sdAb일 수 있으며; 상기 sdAb는 인간화될 수 있다.
β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다: 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열, 및 서열 번호: 31을 포함하거나 또는 이로 구성되는 서열 또는 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 C-말단 절단 산물, 또는 서열 번호: 46을 포함하거나 또는 이로 구성되는 서열.
상기 Fc 단편은 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50 중 어느 하나로부터 선택되는 서열, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 본 발명의 Fc 단편은 감쇠된 이펙터 기능을 가진 임의의 적절한 Fc 단편일 수 있다. 융합 단백질 내에 제공된 Fc 단편은 이량체 구조의 형성을 가능하게 하며; 예를 들어, 서열 번호: 51 내지 서열 번호: 71로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단쇄 융합 단백질은 그 안의 Fc 단편을 통해 접합된 이량체 구조를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물 또는 작제물은 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열, 또는 이의 이량체 구조를 포함할 수 있고, 상기 이량체 펩티드는 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열, 결실 변이체 예컨대 서열 번호: 47 또는 서열 번호: 31로부터 순차 또는 유래되고, 서열 번호: 46을 포함하는 기능성 산물로 구성된 임의의 C-말단 절단된 ABP 변이체를 포함하는 그룹으로부터 선택된 2개의 단쇄 폴리펩티드를 포함하고; 구체적으로, 서열 번호: 31의 순차적으로 하나의 아미노산 C-말단 결실 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 아미노산이 마이너스된 것 (서열 번호: 37 내지 43에서 제공되는 바와 같음)이 제공된다. 상기 이량체의 단쇄 폴리펩티드는 이관능성 동종이량체 (도 1Ai), 이관능성 이종이량체 (도 1Aii) 또는 일관능성 이종이량체 (도 1Aiii)일 수 있다. 예를 들어, 각 이량체의 ABP 부분은 동일하거나 또는 상이할 수 있고; 상기 ABP 부분이 상기 이량체에서 상이한 경우, 상기 단쇄 폴리펩티드에서 적어도 하나의 ABP는 생물학적으로 기능성인 펩티드이다 (즉, β-아밀로이드에 결합할 수 있음).
2개의 BBB-Fc-L-ABP 단쇄 폴리펩티드를 포함하는 이량체 펩티드는 2개의 상이한 ABP 서열 (이종이량체)을 포함할 수 있고, 상기 이종이량체에서 적어도 하나의 ABP 서열은 도 23, 24 및 25에서 기재된 바와 같이 생물학적으로 기능성인 ABP 분자이다 (즉, 도 1Aii 또는 1Aiii에서 나타내는 바와 같이, β-아밀로이드에 결합할 수 있음). 상기 이량체 펩티드가 단일 비-기능성 ABP 펩티드 (즉, 도 1Aiii에서 나타내는 바와 같이 일관능성 이종이량체)를 수용하고, β-아밀로이드 결합과 관련하여 동등한 기능적 생물학적 활성을 유지할 수 있다는 것이 매우 유리하다 (도 23b, c). 2개의 상이한 ABP 서열을 포함하는 이량체 (즉, ABP에 대해 이종이량체)에서, 상기 이종이량체에 제공된 적어도 하나의 ABP 펩티드는 생물학적으로 기능성인 ABP, 즉 서열 번호: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47 또는 2개의 기능성 ABP 펩티드가 이량체로 제공되는 경우 (이관능성 이종이량체) 이들의 임의의 조합이다. 제조성, 단리성 (isolability) 및 기능성 산물 수율과 관련하여 매우 유리하며, 즉 생물학적으로 기능성인 β-아밀로이드 결합 단백질이고, 일관능성 (또는 이관능성) 이종이량체를 가진 이종이량체에서 ABP 펩티드 모두는 인 비트로 β-아밀로이드 결합 활성과 관련하여 융합 단백질의 전체 생물학적 활성 (도 23) 및 인 비보 뇌 흡수율 및 효능 (도 24 및 25)을 유지하는 것이 필수적인 것은 아니다. 일관능성 및 이관능성 동종- 및 이종-이량체의 혼합물을 함유하는 분획의 β-아밀로이드 결합 활성 (EC 50) (PEAK 2, 도 23a)은 이관능성 동종- 및 이종-이량체의 것과 매우 유사하며 (PEAK 3, 도 23a), 이는 일관능성 및 이관능성 이종- 및 동종-이량체 분획 (CEX의 PEAKS 2 및 3)이 조합되도록 한다. 이종이량체가 제공된 융합 단백질에서 제조성을 돕기 때문에 이는 단일 비-기능성 ABP 펩티드 (일관능성)을 수용하고, 생물학적으로 유효한 이종이량체를 유지하는 것이 유리하다. 특정 예에서, FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질 (서열 번호: 56)의 다운-스트림 공정 (정제) 중에 동종이량체 및 이종이량체 풀 (pools)을 조합함으로써, 대규모 바이오제조 중에 산물 수율이 ~ 65%에서 ~ 86%로 상당히 증가하였고 (도 23 참조), 이는 매우 구별되는 이점이다. 상기 일관능성 이종이량체의 동등한 기능성의 예기치 못한 보유에 의해 제공되는 이점은 산물 수율을 증가시키고, 제조성을 촉진하여, 전체-활성의 약학적 조성물의 즉시 단리를 허용한다 (융합 단백질 수율을 증가시킴, 이는 생성된 기능성 융합 단백질 이량체의 수율이 증가되도록 함). 상응하는 이관능성 이량체에 동등한 활성이 있는 일관능성 이종이량체를 갖는 것은 제조된 융합 단백질의 수율을 증가시키고, 이에 따라 융합 단백질들 및 이들의 상응하는 이량체들의 혼합물을 포함하는 조성물의 제조성을 촉진 및 증가시킨다.
본 발명은 BBB-횡단 단일-도메인 항체 (BBB), Fc 단편 (Fc) 및 아밀로이드-결합 펩티드 (ABP)를 포함하는 융합 단백질을 제공하고, 도 1에 도시된 바와 같이, 각 모이어티는 연결되어, 융합 분자를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 비-제한적인 구체예에서, 상기 BBB는 Fc의 N-말단에 연결될 수 있고, ABP는 Fc 단편의 C-말단에 연결될 수 있다 (도 1A). 도 1은 BBB-Fc-ABP를 포함하는 단쇄 융합 단백질의 상응하는 이량체를 나타낸다. 상기 융합 단백질의 이량체는 ABP와 관련하여, ABP 아암 모두가 기능성 전장 (예: 이관능성 동종이량체, 예: 서열 번호: 36, 도 1Ai) 및/또는 다양한 C-말단 절단된 ABP (예: 이관능성 이종이량체 서열 번호: 36 및/또는 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43, 도 1Aii)를 함유하는 동종이량체, 또는 ABP 아암들 중 하나는 기능성 (ABP 또는 C-말단 절단)이고 다른 아암은 비-기능성 (즉, 일관능성 이종이량체)인 이종이량체일 수 있다. 도 1A, 1B, 1C 및 1D에 예시된 바와 같이, 3가지 성분들 (즉 BBB, Fc 및 ABP)이 다양한 구성으로 도시되어 있다. 본 발명의 화합물의 구체적인 비-제한적 예에서, β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 서열 번호: 31의 서열 또는 이의 C-말단 절단된 기능성 산물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 ABP 변이체는 하기 서열을 포함한다:
본원에서 ABP(6G)로 지칭되는 GTFGTGGASAQASLASKDKTPKSKSKKGGSTQLKSRVKNI (서열 번호: 36) 및 이에 대해 실질적으로 동등한 서열, 또는 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 임의의 C-말단 절단 산물, 예컨대 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 또는 서열 번호: 43. 일 구체예에서, 상기 ABP는 서열 번호: 46의 서열을 포함한다.
상기 항체 또는 이의 단편은 하기 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00008
상기 항체 또는 이의 단편은 인간 Fc의 서열, 예컨대 하기를 추가로 포함할 수 있다:
Figure pct00009
임의의 방식으로 제한되지 않고, 본 발명의 화합물은 하기 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00010
본 발명은 또한 서열 번호: 56의 융합 단백질을 제공하고, 상기 융합체의 Fc 및 ABP 성분들을 연결하는 링커는 (GGGGS)2, (GGGS)2, T(GGGGS)2 또는 당 분야에 알려져 있는 임의의 적절한 링커이고, 서열 번호: 56의 융합 단백질의 ABP 펩티드는 서열 번호: 36, 이에 대해 실질적으로 동등한 서열, 또는 기능성 β-아밀로이드 결합 활성을 가진 임의의 C-말단 절단 산물, 예컨대 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43 또는 서열 번호: 47 (서열 번호: 57-63, 서열 번호: 65)일 수 있다.
일부 대표적인 BBB-Fc-ABP 융합 단백질 작제물의 요약표
Figure pct00011
Figure pct00012
상기 표에서, BBB-Fc-ABP 융합 단백질 작제물은 또한 링커 (L)를 포함할 수 있음에 유의하며, 상기 BBB-Fc-ABP 작제물은 본 발명의 BBB-Fc-L-ABP 융합 단백질이고, 상기 L은 GGGGSGGGGS, GGGSGGGGS, TGGGGSGGGGS 또는 이들의 임의의 다중체, 또는 임의의 적절한 링커, 또는 서열 번호: 53에서 컨센서스 링커 서열로 예시된 임의의 링커일 수 있다.
본원에서 FC5-H3-hFc1X7-L-ABP(6G)로도 지칭되는 서열 번호: 56의 융합 단백질에 제공되는, 본 발명의 화합물은 그 안에 포함된 각 성분들의 변형을 포함할 수 있고, 예를 들어 ABP는 서열 번호: 55로 제공된 바와 같은 ABP(GG-G) 또는 ABP(6G) 서열 번호: 36, 또는 이의 임의의 C-말단 절단 산물일 수 있다. (예를 들어, 서열 번호: 51 내지 서열 번호: 71에 강조처리된 바와 같이) 그 안에 제공된 링커 서열은 BBB-Fc-ABP 융합 단백질의 연결을 가능하게 하는 임의의 링커일 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 재조합 항체 또는 이의 단편의 발현, 검출 또는 정제에 있어서 도움을 주는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 그러한 서열 또는 태그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한적이고자 함이 없이, 항체 또는 이의 단편은 표적화 또는 신호 서열 (예를 들어, ompA, 제한되지 않음), 검출/정제 태그 (예를 들어, c-Myc, His5, 또는 His6, 제한되지 않음), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 추가의 서열은 예컨대 Cronan et al (WO 95/04069) 또는 Voges et al (WO/2004/076670)에 의해 기재된 것과 같은 바이오틴 인식 부위일 수 있다. 또한 당 업자에게 알려진 바와 같이, 링커 서열은 추가의 서열 또는 태그와 함께 사용될 수 있거나, 검출/정제 태그로서의 역할을 할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 유전자 코드의 축퇴성을 고려하면, 다수의 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드를 코딩하는 효과를 가질 것이며, 이는 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같다. 핵산 서열은 다양한 미생물에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 기재된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포를 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 하나 또는 하나 초과의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제, 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제, 부형제 또는 담체는 당 업계에 알려진 임의의 적절한 희석제, 부형제 또는 담체일 수 있으며, 조성물 중 다른 성분과 상용성이 있어야 하고, 조성물의 전달 방법과 양립 가능해야 하며, 조성물의 수령자에게 유해하지 않아야 한다. 상기 조성물은 임의의 적절한 형태일 수 있으며; 예를 들어, 상기 조성물은 현탁 형태 또는 분말 형태 (예를 들어, 동결건조된 또는 캡슐화된 형태, 제한되지 않음)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 제한적이고자 함이 없이, 상기 조성물이 현탁 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 식염수, 적절한 버퍼, 또는 용해도 및/또는 안정성을 개선하는 첨가제를 포함할 수 있으며; 현탁액을 생성하기 위한 재구성이 항체 또는 이의 단편의 생존력을 보장하는 적절한 pH의 버퍼에서 수행된다. 건조 분말은 또한 안정성을 개선하는 첨가제 및/또는 벌크/부피를 증가시키는 담체를 포함할 수 있으며; 예를 들어, 제한적이고자 함이 없이, 건조 분말 조성물은 수크로스 또는 트레할로스를 포함할 수 있다. 본 화합물을 포함하는 적절한 조성물을 제조하는 것은 당업자의 역량 내에 있을 것이다.
알츠하이머병을 치료하는 방법이 또한 제공되며, 본 발명의 화합물 또는 조성물이 치료를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 임의의 적절한 투여 경로가 이용될 수 있으며, 이는 정맥내, 복강내, 비경구, 두개내, 근육내, 피하, 경구 또는 비강 경로가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 최적 투여 용량 및 투여 경로는 일반적으로 실험으로 결정된다.
β-아밀로이드 수준이 증가된 대상의 뇌척수액 (CSF) 및 뇌 실질에서 독성 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 보다 구체적으로, 대상의 뇌척수액 (CSF) 및 뇌 실질에서 독성 β-아밀로이드 수준이 본 발명의 조성물의 단회 비경구 투여 후 24시간 정도로 조기에 감소된다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되어서는 안된다.
실시예 1: BBB- Fc -L- ABP 융합 분자의 작제
하기를 포함하는 융합 분자를 제조하였다:
a) FC5 sdAb (서열 번호: 14), 뮤린 Fc (서열 번호: 48) 및 ABP (서열 번호: 30),
b) FC5의 인간화 버전 (FC5-H3; 서열 번호: 17), 인간 Fc (서열 번호: 49, 서열 번호: 50) 및 ABP (서열 번호: 30; 서열 번호: 31; 서열 번호: 32; 서열 번호: 33; 서열 번호: 34; 서열 번호: 35; 서열 번호: 36; 서열 번호: 37; 서열 번호: 38; 서열 번호: 39; 서열 번호: 40; 서열 번호: 41; 서열 번호: 42; 서열 번호: 43; 서열 번호: 44; 서열 번호: 45; 서열 번호: 46; 서열 번호: 47),
c) IGF1R-5 sdAb의 인간화 버전 (IGF1R-5-H2; 서열 번호: 26), 뮤린 Fc (서열 번호: 48) 및 ABP (서열 번호: 30).
융합 단백질 작제물의 개략도가 도 1에 도시되어 있다. 융합 단백질은 이량체로서 아밀로이드-결합 펩티드, Fc 단편 및 BBB-횡단 단일-도메인 항체를 포함한다.
실시예 2: BBB- Fc -L- ABP 융합 분자의 생성
실시예 1에 기재된 작제물 FC5-mFc-ABP 및 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP를 이량체로서 CHO 세포에서 발현시켰으며, 발현된 화합물을 MabSelect Sure 친화성 컬럼 상에서 정제하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 마우스 또는 인간 Fc 항체 단편의 N-말단에 융합된 FC5 변이체 FC5 및 FC5-H3 VHH를 C-말단에서 ABP 변이체에 융합시킨 작제물을 제조하고, 발현시키고, 정제하였다.
FC5-Fc-ABP 변이체 DNA (DNA 합성 공급원)를 포유동물 발현 벡터 pTT5 내로 클로닝하였다 (Durocher 2002). 세포 1 리터당 1 mg의 DNA의 최종 농도를 위한 폴리플렉스 (polyplex)를 플라스미드 벡터 (80%), pTT-AKTdd (15%, 단백질 키나제 B의 활성화된 돌연변이체), 및 pTTo-GFP (5%, 형질감염 효율을 모니터링하기 위함)의 배합물을 PEI MAX 용액 (Polysciences 카탈로그 번호 24765)과 혼합함으로써 사전 형성하였다. PEI:DNA 비율은 4:1 (W:W)이었으며, 둘 모두는 보충된 F17 배지 (4 mM 글루타민, 0.1% Kolliphor) 중에 제조되었다. 상기 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양물에 첨가하였다. DNA/PEI 폴리플렉스의 부피는 최종 배양 부피의 10% (즉, 1 L 배양물당 100 ml)를 나타낸다. 형질감염 24시간 후에, 상기 배양물에 1%의 최종 농도로 트립톤 N1 (40% w/v 용액을 사용함, Organotechnie) 및 0.5 mM 발프로산 (200 mM 용액)을 공급하였다. 형질감염/생성을 세포 밀도 및 생존력에 대해서뿐만 아니라, 생산성 역가 (productivity titer) (L당 Fc의 mg)에 대해서도 모니터링하였으며, 세포 생존력이 최소한 65%에 도달하였을 때 원심분리에 의해 수집하였다 (상등액). 청징화된 세포 배양 배지를 0.45 μm 막을 통해 여과한 후, 5 ml의 단백질-A MabSelect SuRe 수지 (GE Healthcare)로 패킹된 컬럼 상에 적용하였다. 로딩 후에, 상기 컬럼을 5 부피의 인산염 완충 식염수 (pH 7.1) (PBS)로 세척하고, 100 mM 소듐 시트레이트 버퍼 (pH 3.0)를 사용하여 융합 단백질을 용출시켰다. 용출된 융합 단백질을 함유하는 분획을 풀링 (pooling)하고, PBS 중에서 평형화된 탈염 Econo-Pac 컬럼 (BioRad) 상에 로딩함으로써 버퍼 교환을 수행하였다. 탈염된 융합 단백질을 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의해 추가로 정제하고, Millex GP (Millipore) 필터 유닛 (0.22 μm)에 통과시킴으로써 멸균-여과하고, 분취하였다. CEX 분획은 동종- 및 이종-이량체 변이체로서 질량 분광분석 및 Western 블롯 분석으로 특성 규명하였다.
SDS -PAGE 및 Aβ 오버레이: Laemmli 샘플 버퍼 (비-환원 겔, βME 또는 DTT의 경우 70℃에서 및 환원 겔, βME 또는 DTT의 경우 95℃에서 가열됨) 중에 준비된 단백질 샘플을 12% 트리스-트리신 겔 또는 TGX4-15% 겔 (BioRad) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 겔을 Coomassie 블루로 염색하거나, 단백질을 Western 블롯/Aβ 오버레이 분석을 위하여 PVDF 또는 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 면역블롯을 탈지 분유로 차단하고, 이어서 실온에서 45분 동안 Aβ 조제물에 노출시키고 (50-100 nM), 결합된 Aβ를 상기 기재된 바와 같이 6E10 항체를 사용하여 검출하였다 (Chakravarthy et al. 2013).
ELISA: Aβ-결합 분석을 Chakravarthy et al (2013)에 기재된 바와 같이 수행하였다. Maxisorp 96-웰 ELISA 플레이트 (Nunc)를 PBS 중에서 4℃에서 밤새 유리 ABP (합성) 또는 다양한 FC5-ABP 작제물로 코팅하였다 (100 내지 500 ng/웰). 웰을 TBS-T 중 1% BSA로 30분 동안 차단하고, 이어서 온화하게 교반하면서 TBS-T 중 단량체 및 이량체 (Mo) 또는 더 고차의 올리고머 (Oli)로 주로 구성된 Aβ1 -42 조제물과 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. TBS-T의 3회 세척 후에, 결합된 Aβ를 HRP-접합된 Aβ-특이적 항체 (6E10 또는 4G8)를 TBS-T 중에서 실온에서 90분 동안 인큐베이션함으로써 검출하였다. 결합된 항체를 SureBlueTM TMB 시약 키트 (KPL)로, 제조자의 사용설명서에 따라 450 nm에서 비색 측정함으로써 검출하였다.
SDS-PAGE (NR - 비-환원 조건 및 R - 환원 조건)에 의한 FC5 융합 분자의 분리 후에 Coomassie 블루 염색된 겔은 도 2a에 나타나 있고, 이는 재조합 융합 분자의 성공적인 생성을 나타낸다. ELISA 및 Western 블롯 (WB) 오버레이 분석에 의한 유리 ABP 및 FC5-Fc-ABP 융합 단백질의 Aβ-올리고머 결합이 도 2b 및 도 2c에 나타나 있다. 유리 ABP 또는 융합된 ABP를 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 샘플을 4℃에서 밤새 코팅함으로써 ELISA 플레이트 상에 고정시키고, Chakravarthy et al., 2013에 기재된 바와 같이 Aβ 조제물에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10 또는 4G8로 검출하였다 (Chakravarthy et al., 2013). 융합 분자를 또한 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 페이퍼에 옮기고, Aβ 올리고머에 노출시켰다. 결합된 Aβ를 상기에서와 같이 특이적 항체로 검출하였다. 결과는 ABP가 BBB 운반체와의 융합 후에 ABP의 Aβ 올리고머 결합 능력을 보유하였음을 나타낸다. Mo: Aβ 단량체; Oli: Aβ 올리고머.
실시예 3: 인 비트로에서 AD- Tg 마우스 ( B6.Cg - Tg , Jackson Lab)에서 Aβ 침착물에 대한 BBB- Fc -L- ABP 융합 분자의 결합
실시예 2에서 생성된 작제물에 면역조직형광 분석을 수행하여, FC5-Fc-ABP 융합 분자가 기재된 바와 같이 마우스 뇌에서 천연-생성된 아밀로이드 침착물에 결합하는 능력을 보유하였는지의 여부를 평가하였다 (Chakravarthy et al., 2014). 야생형 (Wt) 및 AD 유전자이식 (AD-Tg) 마우스로부터 냉동된 반구 뇌 (hemi-brain)를 OCT 중에 포매하고, Jung CM 3000 cryostat을 사용하여 10 μm 절편을 제조하고, -80℃에서 저장하였다. 조직 절편을 해동시키고, OCT를 면도날을 사용하여 절편으로부터 박리하고, 이어서 Dako 단백질 차단 시약과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 차단제를 제거하고, 절편을 TBS 중에서 온화하게 세척하였다. 항체 희석제 중 IR 800-표지 FC5-mFc-ABP (5.0 μg/μl 용액의 1:250 희석물)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 절편을 TBS로 2회 세척하고, Milli Q 물 중에 헹구고, 과량의 헹굼 용액을 제거하고, 절편을 Dako 형광 마운팅 배지 (Fluorescent Mounting Media)로 커버-슬립 (cover-slip)하였다. 절편을 형광 현미경 하에서 시각화하였다 (도 3). 선택적 결합 (밝은 스폿)이 Aβ 침착물을 생성하는 AD-Tg 마우스로부터의 뇌 절편에서 관찰되었고, 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 Wt 마우스로부터의 뇌 절편에서는 관찰되지 않았고, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물 중 ABP가 AD-Tg 마우스 뇌에서 천연 생성된 Aβ 응집체에 결합하는 능력을 보유함을 나타낸다. 제공된 BBB-Fc-ABP 작제물에서, BBB는 FC5 또는 항-IGF1R 항체일 수 있다.
실시예 4: 인 비트로에서 FC5- Fc -L- ABP 융합 분자의 BBB 관통이동
FC5-Fc-ABP 융합 분자의 BBB-횡단을 래트 및 인간으로부터의 인 비트로 BBB 모델에서 평가하였다 (도 4). BBB를 횡단하는 융합 분자를, Papp 결정을 위하여 단일 시점을 사용하여, 인 비트로 BBB 투과성 분석에서 스크리닝하였다. 변이체의 정량화는 MRM-ILIS에 의해 수행하였다 (도 4의 A, B 및 C).
SV40-불멸화 성체 래트 뇌 내피 세포 (SV-ARBEC) 및 인간 뇌 내피 세포 (HBEC)를 사용하여, 기재된 바와 같이 인 비트로 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델을 생성하였다 (Garberg et al., 2005; Haqqani et al., 2013). SV-ARBEC (80,000개 세포/막)를 1 ml의 성장 배지 중 0.1 mg/mL 래트 꼬리 콜라겐 타입 I-코팅된 조직 배양 삽입체 (공극 크기 1 μm; 표면적 0.9 cm2, Falcon) 상에 시딩 (seeding)하였다. 삽입체 어셈블리의 하부 챔버는 불멸화 신생 래트 성상세포-컨디셔닝된 배지가 1:1 (v/v) 비율로 보충된 2 ml의 성장 배지를 함유하였다. 등몰량 (5.6 μM)의 양성 대조군 (FC5 작제물) 또는 음성 대조군 (클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile) 독소 A 결합 VHH인 A20.1; 및 EGFR 결합 VHH인 EG2); 및 실시예 1로부터의 Fc-ABP를 래트 또는 인간 인 비트로 BBB 모델을 횡단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. BBB의 내강 측에 등몰량의 sdAb를 노출시킨 후에, 샘플을 15, 30 및 60분 후에 강외측에서 채취하였다. 이어서, 각 샘플의 sdAb 함량을 질량 분광분석에 의해 정량화하였다 (다중 반응 모니터링 - 이소형 표지된 내부 표준; MRM - ILIS) (도 4의 A, B, C).
MRM - ILIS: 방법은 모두 Haqqani et al. (2013)에 기재된 바와 같다. 간략하게 말하면, VHH에 대한 SRM (다중 반응 모니터링 (MRM)으로도 알려진 선택된 반응 모니터링) 분석을 개발하기 위해, 각 VHH를 먼저 nanoLC-MS/MS에 의해 데이터-의존적 획득을 사용하여 분석하여 모든 이온화 가능한 펩티드를 확인하였다. 각 펩티드에 대하여, 3 내지 5개의 가장 강한 단편 이온을 선택하였다. 초기 SRM 분석을 개발하여 이들 단편을 아토몰량 (attomole amount)의 소화물 (약 100 내지 300 amol)에서 모니터링하였다. 낮은 양에서 재현 가능한 세기 비율을 나타낸 (즉, 더 높은 양과 비교하여 피어슨 (Pearson) r2 ≥0.95를 가진) 단편을 안정적인 것으로 간주하고, 최종 SRM 분석을 위해 선택하였다. 이 분석을 추가로 최적화하기 위해, 각 펩티드에 대한 용출 시간을 또한 포함하였고, 이때 근접한 m/z (질량-대-전하 비율) 및 용출 시간을 갖는 펩티드를 선택하지 않도록 주의하였다.
세포 배지 또는 체액 (혈청 또는 뇌척수액 (CSF))에서 VHH의 전형적인 다중화 SRM 분석은 기지량의 ILIS (0.1-10 nM)를 스파이킹 (spiking)한 후, 100-400 ng의 CSF 또는 배양된 배지 단백질 (0.3-1 μL) 또는 약 50-100 ng의 혈청 단백질 (1-3 나노리터)을 nanoLC-MS 시스템 내로 주입하는 것을 포함하였다. 각 표적 펩티드 이온의 전구체 m/z를 상기 표적에 대한 명시된 용출 시간에서 이온 트랩에서 선택한 후 (남아 있는 관련되지 않은 이온은 폐기), 충돌 유도 해리 (CID) 단편화, 및 검출기에 의한 모니터링을 위한 이온 트랩에서 원하는 단편 이온만의 선택을 수행하였다. 정량화 분석을 위해, LTQ (ThermoFisher)에 의해 생성된 로우 파일 (raw files)을 표준 질량 분광분석 데이터 포맷 mzXML로 변환시키고, MatchRx 소프트웨어의 수정 버전인 Q-MRM (정량적-MRM; Haqqani et al. 2013 참조)으로 지칭되는 인-하우스 소프트웨어를 사용하여 세기를 추출하였다. 각 VHH에 대해, 전체 용출 시간에 걸쳐 단편 m/z의 0.25 Da 이내의 조합된 세기로 구성된 각 VHH의 단편 이온에 대해 추출된-이온 크로마토그램을 생성하였다. 각 단편에 대한 최종 세기 값을 수득하기 위해, 예상된 체류 시간의 0.5분 이내의 모든 세기를 합산하였다. VHH는, 그의 펩티드 중 적어도 하나의 단편이 예상된 세기 비율을 나타낸다면, 즉 최종 세기 값이 그의 상응하는 순수한 VHH의 최종 세기 값과 비교하여 강한 피어슨 상관 r ≥ 0.95 및 p < 0.05를 나타낸다면, 샘플에서 검출 가능한 것으로 정의되었다.
VHH의 혼합물 (배지, 혈청, CSF)을 함유하는 샘플을 상기 기재된 바와 같이 환원시키고, 알킬화하고, 트립신-소화하였다 (Haqqani et al., 2012; Gergov et al., 2003). 소화물 (트립신 분해 펩티드)을 아세트산 (5% 최종 농도)으로 산성화하고, LTQ XL ETD 또는 LTQ Orbitrap ETD 질량 분광분석계 (ThermoFisher, Waltham, MA)에 커플링된 역상 nanoAcquity UPLC (Waters, Milford, MA) 상에서 분석하였다. 샘플의 원하는 분취물을 300 μm I.D. x 0.5 mm 3 μm PepMaps C18 트랩 (ThermoFisher) 상으로 주입 및 로딩하고, 이어서 0%-20% 아세토니트릴 (0.1% 포름산 중), 1분; 20%-46%, 16분; 및 46%-95%, 1분의 구배를 사용하여 400 nL/분의 유량으로 100 μm I.D. x 10 cm 1.7 μm BEH130C18 nanoLC 컬럼 (Waters) 상으로 용출하였다. 용출된 펩티드를 펩티드 이온의 단편화를 위하여 CID를 사용하는 SRM 분석 및 MS/MS를 위하여 전기분무 이온화 (ESI)에 의해 질량 분광분석계 내로 이온화하였다. CID는 충돌 가스로서 헬륨을 사용하여 35%의 정규화된 충돌 에너지 및 30 ms의 활성화 시간으로 수행하였다. 선형 이온 트랩으로의 이온 주입 시간은 6 x 103의 자동 이득 제어 (AGC) 목표 값 및 200 ms의 최대 축적 시간을 사용하여 기기에 의해 조정되었다.
겉보기 투과 계수의 측정: 정량화된 값을 직접 플롯팅할 수 있거나, 또는 Papp (겉보기 투과 계수) 값을 주어진 식 [Qr/dt = 시간 대비 수용기 구획에서 누적량; A = 세포 단층의 면적; C0 = 투여 용액의 초기 농도]을 사용하여 결정하고, 플롯팅할 수 있다. Papp 값은 BBB를 횡단하는 분자의 능력을 결정하는데 일반적으로 사용된다. Papp 값은 뇌 내피 단층을 횡단하는 화합물의 비투과율 (specific permeability)의 척도이다.
FC5 작제물의 검출 및 정량화에 사용된 특정 펩티드는 하기 표 1에 개시되어 있다.
Figure pct00013
실시예 2에 기재된 바와 같이 Fc-특이적 항체를 사용하는 Western 블롯 분석에 의해 샘플을 또한 분석하였다 (도 4의 D, 3회 반복하여 수행함). FC5-mFc-ABP는 FC5-mFc 만큼이나 효과적으로 혈액-뇌 장벽을 횡단한 반면, BBB 운반체 모이어티 FC5를 함유하지 않은 Fc-ABP는 뇌 내피 세포 단층을 통해 횡단하지 않았다. 예상된 바와 같이, 대조군 단일 도메인 항체 EG2 및 A20.1, 또는 대조군 전장 IgG (항-HEL)는 혈액-뇌 장벽을 횡단하지 않았다. 인간화 FC5(H3)-hFc-ABP 융합 단백질에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다 (도 4의 C 및 D). IGF1R5-mFc-ABP ABP에 대해서도 유사한 결과가 수득되었다 (도 17a 및 도 17b).
실시예 5: 인 비보에서 FC5- Fc -L- ABP 융합 분자의 BBB 관통이동 및 약동학적 특성
실시예 2의 작제물이 혈액-뇌 장벽을 관통이동하여 뇌로, 구체적으로는 뇌척수액 (CSF)으로 들어가는 능력뿐만 아니라, CSF 및 혈청에서 작제물 존재를 정량화하기 위하여 인 비보에서 평가하였다. FC5-mFc-ABP를 지시된 용량 (2.5, 6.25, 12.5 및 25 mg/kg)으로 꼬리 정맥을 통해 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC-MRM 방법을 사용하여 정량화하였다.
대수조 (cisterna magna) CSF의 다중 샘플링에 사용된 기법은 이전에 기재된 방법을 수정함으로써 NRC에서 개발되었다 (Huang et al.,1995; Kornhuber et al., 1986). 모든 동물은 Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, USA)로부터 구입하였다. 동물들을 24℃의 온도, 50 ± 5%의 상대 습도에서 12시간 명/암 사이클에서 3 마리의 그룹으로 수용하고, 먹이 및 물에 자유롭게 접근 가능하게 하였다. 모든 동물 절차는 NRC의 ACC (Animal Care Committee)에 의해 승인받았으며, CCAC (Canadian Council of Animal Care) 가이드라인을 준수하였다. 8 내지 10 주령된 수컷 Wistar 래트 (체중 범위, 230-250 g)를 모든 연구에서 사용하였다.
모든 실험에서, 시험 항체 (FC5 Fc-융합체)를 등몰 용량 (7 mg/kg)으로 꼬리 정맥으로 정맥내 투여하였다. 96시간에 걸쳐 최대 5회까지 바늘 천자에 의해 대수조로부터 CSF 샘플 수집을 수행하였다. 샘플 수집을 위하여, 래트를 3% 이소플루란으로 짧고 가볍게 마취하고, 머리를 45° 각도로 하향으로 회전시킨 상태로 정위 프레임 내에 배치하였다. 후두 능선에서 시작하여 귀들 사이에 2 cm 정중선 절개를 수행하고, 근육들을 분리하여 대수조를 덮고 있는 경막을 노출시켰다.　튜빙 (tubing)이 1 ml 주사기에 부착된 27G 나비 바늘 (QiuckMedical, 카탈로그 번호 SV27EL)을 사용하여 경막을 천자하고, ~20 μl의 CSF를 흡인하였다. 이어서, CSF를 샘플 유리 바이알 (Waters, 카탈로그 번호 186000384c)로 옮기고, 추가 분석 시까지 -80℃ 냉동기에 넣어두었다.
혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 상업적으로 입수 가능한 튜브 (BD microtainer, 카탈로그 번호 365956) 내에 수집하였다. 실온에서 15-30분 동안 응고시킨 후, 1100 rcf (3422 rpm)로 10분 동안 원심분리에 의해 혈병 (clot)을 제거하고; 이어서, 혈청을 깨끗한 유리 바이알 (Waters, 카탈로그 번호 186000384c)로 옮기고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, 추가 분석 시까지 -80℃에서 저장하였다. 수집 종료 시점에서, 심장 천자에 의해 래트를 희생시켰다. WinLin 6.0 프로그램을 사용하여 혈액 및 CSF PK 분석을 수행하였다.
표 1에 나타낸 펩티드 시그니처를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 nanoLC-SRM 기반 정량화 및 질량 분광분석에 의해 혈청 및 CSF 샘플을 분석하였다.
CSF 수집은 까다로운 절차로서, 이때 CSF가 혈액으로 쉽게 오염될 수 있다. VHH의 양이 혈액보다 CSF 중에 훨씬 더 적게 (<0.1%) 존재할 것으로 예상되었기 때문에, 혈액에 의한 미약한 오염이라도 개별 CSF 샘플의 값을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 혈액-오염된 CSF 샘플에 대한 엄격한 제외 기준을 개발하는 것이 필요하였다. 혈액-CSF 알부민 비율을 평가하기 위하여, 혈장 및 CSF에서 알부민 수준을 정량화하기 위한 nanoLC-SRM 방법을 개발하였다. 다중화 분석에서 다른 펩티드 피크에 의한 방해를 최소화하기 위하여, 알부민 펩티드 APQVSTPTLVEAAR을 그의 특유의 체류 시간 및 m/z 값에 기초하여 선택하였다 (Mol Pharm). 상기 기재된 바와 같이 SRM을 사용하여 CSF 샘플 및 혈장 샘플 모두에서 펩티드의 세기를 정량화하였다. 각 래트에 대해 하기와 같이 알부민 비율을 계산하였다:
알부민 비율 = 분석되는 혈장의 nL당 세기 / 분석되는 CSF의 nL당 세기
1500 이하의 비율이면, 혈액에 의해 오염된 것으로 간주되었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 12시간 내지 24시간의 Cmax를 갖는 시간- 및 용량-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였고, 이는 인 비보에서 뇌 및 CSF 구획으로 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타낸다 (A). 혈청 PK 파라미터 (도 5 및 하기 표 2)는 FC5-mFc-ABP의 알파- 및 베타-반감기가 전장 IgG (래트 Fc를 함유하는 벤치마크 항체)의 것과 유사하고, ABP 또는 FC5 또는 Fc를 갖지 않는 FC5-ABP의 것보다 실질적으로 더 높음을 나타낸다.
Figure pct00014
실시예 6: 비-설치류 대형 동물에서 FC5- ABP 작제물의 뇌로의 전달
FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 비글개에서 평가하였다. FC5-mFc-ABP를 10 내지 12년된 비글개에게 정맥내 주사에 의해 투여하고, 혈청 및 CSF를 연속하여 수집하고, 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해 (좌측 패널) 및 Fc-특이적 항체를 사용한 Western 블롯에 의해 (도 6의 B) 분석하였다. 별표는 혈액-오염된 샘플을 나타낸다 (MRM 분석에는 나타나 있지 않음). 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였고, 이는 인 비보에서 개 혈액-뇌 장벽을 통한 FC5에 의한 ABP의 수송을 나타내고, 이는 BBB 운반체의 전이 성질을 확인하였다. WinNonlin 소프트웨어에 의해 PK 파라미터 및 CSF 노출을 분석하였고, 하기 표 3에 나타나 있다.
Figure pct00015
실시예 7: BBB 투과성
인 비보에서 인간 Fc (hFc)와 융합되고 ABP에 화학적으로 연결된 FC5 (FC5-hFc-ABP)의 BBB 투과성 및 CSF 출현 (래트 모델). 제조자의 사용설명서 (ThermoFisher Scientific)에 따라 이종이관능성 가교제 설포-SMCC (설포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸] 시클로헥산-1-카르복실레이트)를 사용하여 FC5-hFc를 ABP-시스타미드와 연결하였다. 화학적으로 접합된 분자를 6.25 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 래트에게 정맥내 투여하고, CSF 샘플을 4시간 및 24시간에 수집하고, 분석하였으며, 이는 도 5에 나타낸 바와 같다. FC5-hFc-ABP는 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하지만, BBB 운반체를 갖지 않는 Fc-ABP는 그렇지 않았고, 이는 혈액-뇌 장벽을 통한 ABP의 FC5-매개 수송체를 확인하였고, 도 7에 도시된 바와 같다.
실시예 8: BBB- Fc -L- ABP 작제물의 뇌로의 전달
실시예 2의 FC5-Fc-ABP 작제물이 인 비보 혈액-뇌 장벽을 관통이동하고 뇌 실질을 투과하는 능력을 마우스에서 평가하였다.
FC5-mFc-L-ABP를 야생형 (WT) 마우스 및 AD-유전자이식 (AD-Tg, B6.Cg-Tg, Jackson Lab) 마우스에게 15 mg/kg으로 (도 8a 및 도 8b) 또는 AD-Tg 마우스에게 7.5, 15 및 30 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사로 투여하고, 4시간 및 24시간 동안 순환시켰다. 이어서, 마우스를 좌총경동맥을 통해 1 ml/분의 속도로 10 ml의 헤파린 첨가 (100 U/ml) 식염수로 확실히 관류시켜 뇌의 특이적 관류를 촉진시켰다. 이어서, 뇌를 적출하고, 해마 및 피질 조직을 절개하고, 즉시 동결시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 동결된 조직을 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl 및 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma-Aldrich, Oakville, ON)을 함유하는 빙냉 균질화 버퍼 중에서 Dounce 균질기 (4℃에서 10 내지 12회 스트로크)를 사용하여 균질화하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 매회 10초 동안 3회 초음파 처리하고, 불용성 물질을 제거하였다 (4℃에서 10분 동안 10,000 xg). 단백질 함량에 대해 상등액을 분석하고, 약 0.5 μg의 단백질을 실시예 4에 기재된 방법 및 표 1에 나타낸 펩티드 시그니처를 사용하여 SRM 분석 (도 8a)에 사용하였다.　샘플을 또한 mFc-특이적 항체를 사용한 Western 블롯에 의해 분석하였다 (도 8b 및 도 8c). 융합 분자의 3가지 모든 성분 (FC5, Fc 및 ABP)에 속하는 특정 "시그니처" 펩티드는 MRM에 의해 피질 및 해마 모두에서 검출되었고, 이는 FC5 운반체가 ABP를 뇌의 표적 영역에 성공적으로 전달하였음을 나타낸다 (FC5 펩티드로부터의 데이터만이 도 8a에 나타나 있다). 측정된 수준은, Fc에 융합된 대조군 단일-도메인 항체 A20.1, 또는 Fc 단편 단독의 경우에 전형적으로 ~50 ng/g 조직으로 측정된 것과 비교하여, 상이한 시점에서 750-1400 ng/g 뇌 조직의 범위였다. 이는 조직 추출물에서 Fc 및 ABP에 대해 프로빙하는 Western 블롯 분석에 의해 추가로 확인되었다 (도 8b 및 도 8c). 식염수만을 제공받은 동물에서는 Western 블롯에 의해 융합 분자의 어떠한 단백질 신호도 검출되지 않았다. 뇌의 표적 영역에서 Western 블롯에 의해 검출된 FC5-mFc-ABP 수준에 있어서 용량-의존적 증가가 있었다 (도 8c). 이들 결과는 야생형 (WT) 및 AD-Tg 마우스에서 FC5가 ABP를 뇌의 표적 영역 (즉, 해마 및 피질)에 성공적으로 전달함을 명백히 나타낸다.
실시예 9: 마우스 뇌로부터 Aβ의 제거
Tg 마우스에서 아밀로이드 부하에 대한 ABP의 효능을 평가하기 위하여, ABP 단독 또는 FC5-ABP 작제물에 의한 치료 결과를 비교하였다.
ABP 단독 (도 9a) 또는 BBB 운반체 FC5와 융합된 ABP (도 9b 및 도 9c)에 의한 치료 사이의 비교. 2개의 상이한 AD Tg 마우스 모델, 즉 삼중 유전자이식 (3X Tg-AD, 즉 PS1M146V, APPSwe 및 tauP301L 이식유전자를 포함하는 sv129/ C57BL6 마우스, Dr. F.M. LaFerla, University of California) 및 이중 유전자이식 (B6.Cg-Tg, 즉 PSEN1dE9 및 APPSwe 이식유전자를 포함함, Jackson Lab)을 사용하였고; 마우스에 각각 3개월 또는 2개월의 기간에 걸쳐 격일로 300 nmol/kg의 유리 ABP를 피하로 (sc) 투여하였다. 치료 기간의 종료 시점에서, 제조자의 분석 절차에 따라 시판 분석 키트 (InVitrogen, KHB3544)를 사용하여 ELISA에 의해 뇌에서 Aβ 수준을 측정하였다. ABP 단독에 의한 치료는 2-3개월의 다회 치료 (격일로) 후에 뇌 Aβ의 25-50% 감소를 가져왔다 (도 9a). FC5-mFc-ABP 작제물을 이중-유전자이식 AD 마우스 (B6.Cg-Tg, 15 mg/kg; 220 nmol/kg과 등가임)에게 정맥내 주사하고; 상기 실시예 8에서 기재된 바와 같이 주사 후 24시간에 ELISA 및 nanoLC-MRM 모두에 의해 뇌 Aβ 수준을 측정하였다. 예기치 않게도, FC5-mFc-ABP에 의한 치료 후 24시간 이내에 약 50% 아밀로이드 감소가 관찰되었고 (도 9b), 이는 FC5에 의한 ABP의 효율적인 뇌 전달이 뇌 Aβ 수준을 감소시키는데 있어서 ABP의 효능을 대폭 증가시켰음을 나타낸다. CSF 분석은 또한 FC5-mFc-ABP 치료 후 24시간 이내에 Aβ1 -42 수준의 유의한 감소를 나타내었다 (도 9c). MRM (서열: LVFFAEDVGSNK, 표 1 / ELISA 분석에 의해 검출된 Aβ 펩티드 서열은 ABP에 의해 인식되는 Aβ 에피토프로부터 떨어져 있고/이와 상이하다 (따라서, ELISA 또는 MRM에 의해 이의 정량화가 방해되지 않음).
실시예 10: Fc 성분의 FC5- ABP 작제물로의 도입은 그의 혈청 반감기를 향상시킴
FC5-ABP (FC5 서열 번호: 17; 및 ABP 서열 번호: 36) 및 FC5-hFc-ABP (FC5 서열 번호: 17; hFc 1x7 서열 번호: 49 및 ABP 서열 번호: 36) 작제물을 실시예 2에 기재된 바와 같이 CHO 세포에서 생성하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 혈청 PK를 결정하였다. FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP 작제물을 15 mg/kg으로 래트 꼬리 정맥에 정맥내 투여하였다. 혈청을 연속으로 수집하고, FC5-ABP 및 FC5-Fc-ABP 수준을 FC5- 및 ABP-특이적 항체를 사용한 직접 ELISA에 의해 정량화하였다. 혈청 샘플을 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 희석시키고 (1:5,000), Maxisorb 플레이트에 적용하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 3 X 100 μl PBS로 세척하고, 실온 (RT)에서 30분 동안 TBST 중 1% BSA로 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 플레이트를 HRP-접합된 FC5 단일클론 항체와 함께 인큐베이션하였다 (90분). 인큐베이션 및 세척 후에, 100 μl SureBlue 시약을 첨가하고, 어두운 곳에서 실온에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션하였다. 반응 종료 시점에서, 100 μl 1 M HCl을 첨가하고, 플레이트 판독기에서 450 nm에서 발색을 판독하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Fc를 갖지 않는 FC5-ABP는 Fc 성분을 함유하는 FC5-ABP 작제물 (FC5-Fc-ABP)과 비교하여 혈청에서 매우 신속하게 제거되었다 (1시간 이내). 상기 분석을 또한 ABP-특이적 항체에 대해서도 반복하였고, 유사한 결과를 얻었다. 샘플 적용 후에, ELISA 플레이트를 먼저 ABP 토끼 다중클론 항체와 인큐베이션한 후 (90분), HRP-접합된 토끼 2차 항체와 인큐베이션하고 (30분), 결합된 항체를 상기 기재된 바와 같이 검출하였다 (데이터는 나타내지 않음).
실시예 11: 래트 뇌로부터 Aβ의 제거
AD-Tg 래트에 4주의 기간에 걸쳐 매주마다 꼬리 정맥을 통해 식염수 또는 FC5-mFc-ABP를 투여하였다 (30 mg/kg의 로딩 용량 및 후속하는 15 mg/kg의 용량의 4회의 매주 용량). FC5-mFc-ABP 및 Aβ의 CSF 수준을 nanoLC MRM에 의해 분석하였다. 치료 전 및 치료 4주 후에, 특정 Aβ-결합제 [18F] NAV4694를 사용하는 PET 스캔에 의해 뇌 Aβ 수준을 결정하였다. FC5-mFc-ABP는 24시간 이내에 래트에서 CSF Aβ 수준을 감소시켰다. Tg 마우스에서와 같이 FC5-mFc-ABP와 Aβ의 CSF 수준들 사이의 반비례 관계가 관찰되었고, 이는 FC5에 의해 뇌 및 CSF에 전달된 ABP에 의한 표적 교합 및 Aβ의 신속한 제거를 시사한다 (도 11a 및 도 11b). 이는 PET 스캔에 의해 추가로 확증되었고, PET 스캔은 FC5-mFc-ABP에 의한 4주의 치료 후에 래트 뇌 Aβ 수준의 유의한 감소 (30-50%)를 명백히 나타내었다 (도 11c).
실시예 12: 증가된 해마 부피 및 개선된 뉴런 연결성
실시예 11에 기재된 실험에서, 식염수- 및 FC5-mFc-ABP-처리된 Tg 마우스에 치료 전과 후에 용적측정 및 기능성 자기 공명 영상 (MRI)을 수행하였다. 용적측정 MRI (도 12a)는 식염수-처리된 대조군과 비교하여 ABP-처리된 Tg 마우스에서 증가된 해마 부피를 나타내었고, 이는 ABP 치료가 해마 위축을 정지시켰음을 시사한다. 기능성 MRI (도 12b)는 식염수-처리된 대조군과 비교하여 ABP-치료된 Tg 마우스에서 전대상 피질에서 개선된 연결성을 나타내었고, 이는 뉴런 연결성의 회복을 시사한다. 이 데이터로 제공된 유의성, 효능 및 우수한 치료적 이점을 확인하였다.
실시예 13: FC5- mFc2a - ABP 치료는 개에서 CSF Aβ의 감소된 수준을 나타냄
실시예 6에 기재된 바와 같이, FC5-mFc-ABP의 혈청 및 CSF PK 프로파일을 2가지 용량 (15 mg/kg 및 30 mg/kg)으로 비글개에서 평가하였다. nanoLC-MRM에 의해 FC5-mFc2a-ABP의 혈청 및 CSF 수준을 측정하는 것에 더하여, Aβ의 CSF 수준을 또한 실시예 9에 기재된 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해 측정하였다. 알 수 있는 바와 같이, FC5-mFc-ABP는 용량- 및 시간-의존적 방식으로 CSF 중에 출현하였다 (도 13b). 가장 중요한 것은, Tg 마우스 및 Tg 래트에서 관찰된 바와 같이, CSF FC5-mFc2a-ABP 수준에 반비례하는, CSF Aβ 수준의 유의한 감소가 있었다는 것이다.
실시예 14: 상이한 BBB 운반체를 갖는 ABP 융합 분자의 생성
ABP 융합 분자의 다능성을 평가하기 위하여, ABP를 다른 인간화 BBB 운반체 IGF1R5 (H2)와 성공적으로 융합시켰다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 분자의 이관능성, Aβ 올리고머에 결합하는 ABP의 능력 (ELISA 및 오버레이 분석) 및 또한 인 비트로 BBB 모델을 통한 ABP를 전달하는 IGF1R5의 능력 (데이터는 나타나 있지 않음)이 보유되었다. 이는 ABP가 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체에 융합되어 뇌에 전달될 수 있음을 명백히 나타낸다.
실시예 15: 상이한 BBB-횡단 단일-도메인 항체- Fc - ABP 작제물에 의한 Aβ 올리고머 결합
변형된 ABP들을 갖는 다양한 FC5-Fc-ABP 작제물들 (표 1 및 도 15에 나타낸 서열 번호들로 표시되는 바와 같은 분자의 부위-특이적 돌연변이 또는 C-말단 부분의 제거)이 제공된다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 모든 작제물은 ELISA 방법에 의해 Aβ 올리고머에 결합하는데 있어서 유사한 잠재성을 보유하였다.
실시예 16: 안정성 및 바이오- 제조성을 개선하기 위한 특이적 돌연변이를 갖는 FC5- hFc1X7 -L- ABP의 생성
특이적 돌연변이 (ABP, 서열 번호: 35; ABP, 서열 번호: 36)를 갖는 FC5-hFc1X7-L-ABP를 CHO 세포에서 생성하고, 환원 (R) 및 비-환원 (NR) 조건하에 SDS-PGE 상에서 분리하고, Coomassie 블루로 염색하였고, 이는 도 2에 나타낸 바와 같다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막에 옮기고, FC5-특이적, hFc-특이적 및 ABP-특이적 항체로 면역블로팅하였다. 다른 세트에서, 융합 분자에서 ABP의 Aβ-결합을 또한 오버레이 분석에 의해 시험하였다. 결합된 Aβ를 Aβ-특이적 항체 6E10으로 검출하였다. 알 수 있는 바와 같이, 특이적 돌연변이를 갖는 ABP의 체계적 변형 (본원에 나타낸 바와 같이, 예를 들어 ABP 서열 번호: 35, 및 ABP 서열 번호: 36)은 생성된 분자의 안정성을 실질적으로 향상시켰고, 이는 본원에서, 예를 들어 환원 및 비-환원 조건하에 단일 단백질 밴드에 의해 명백히 나타난 바와 같다 (도 2a의 다른 ABP 작제물과 비교하여, 여기서는 이중 단백질 밴드들이 관찰될 수 있음). 융합 분자의 안정성에 있어서 이러한 실질적인 향상은 유리하게는 동종 분자의 바이오-제조성을 촉진시킨다.
실시예 17: 인 비트로에서 다양한 FC5- Fc -L- ABP 작제물 및 IGF1R5 - Fc - ABP 작제물의 BBB 투과성
인 비트로 래트 BBB 모델에서 BBB-횡단을 평가하였고, 이는 도 4에 나타낸 바와 같으며, 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 분자를 nanoLC-MRM 방법에 의해 검출하였다. 인간화 FC5 및 IGF1R 운반체에 융합된 모든 ABP 변이체는 BBB를 효과적으로 횡단하였다. 예상된 바와 같이, BBB 비투과성 sdAb인 A20.1은 BBB를 횡단하지 않았으며, 마찬가지로, A20.1에 융합된 ABP는 BBB를 투과하지 않았다 (도 17a). 도 17b에는, 융합 분자의 3가지 모든 성분, 즉 FC5, Fc 및 ABP의 "핑거-프린트" 펩티드가 nanoLC-MRM에 의해 검출되었음이 나타나 있다.
본원에 기재된 구체예 및 실시예는 예시적이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨지지 않는다. 대안, 수정 및 등가물을 포함한 상기 구체예의 변형은 본 발명자들에 의해 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 더욱이, 논의된 특징들의 조합은 본 발명의 해결책에 반드시 필요한 것은 아닐 수 있다.
실시예 18: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물 [FC5(H3)- hFc - ABP ( ABP 서열 번호: 35 및 ABP 서열 번호: 36 을 가짐)] 은 인 비트로 래트의 혈액-뇌 장벽을 온전하게 횡단한다. 인간화 FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽 횡단을 실시예 4에 기재된 바와 같이 평가하였다. 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 융합 분자를 Western 블롯 및 ELISA 방법에 의해 분석하였다. 면역블롯을 hFc-특이적, 및 ABP-특이적 항체를 사용하여 프로빙하였다. 이들 항체 모두는 BBB를 횡단하는 분자 (하부 챔버)를 인식하였고, 분자 크기는 인 비트로 BBB에 적용된 FC5-ABP 융합 작제물의 것 (상부 챔버)과 동일하였고, 이는 BBB를 횡단한 분자가 온전하게 유지되었음을 나타낸다. 이는 샌드위치 ELISA 분석에 의해 입증되었고, 여기서 BBB-횡단된 분자가 FC5-특이적 항체에 의해 포획되었고, 포획된 분자는 ABP 항체에 의해 검출되었다.
실시예 19: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물 [FC5(H3)- hFc -L- ABP ( ABP 서열 번호: 35 및 ABP 서열 번호: 36을 가짐)] 은 인 비보에서 BBB를 통해 수송되고, FC5에 의해 온전하게 뇌에 전달된다. 마우스에서 인간화 FC5-ABP 융합 분자의 혈액-뇌 장벽 횡단 및 뇌 전달을 실시예 8에 기재된 바와 같이 평가하였다. 상기 분자의 정맥내 투여 및 심장내 관류 후 4시간에, 뇌를 적출하고, 피질을 RIPA 버퍼에서 추출하고, 주사된 FC5-ABP 융합 분자의 존재를 ABP-특이적 항체로 프로빙된 Western 블롯에 의해 및 분자를 FC5-특이적 항체로 포획하고 ABP-특이적 항체에 의해 검출함으로써 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. Western 블롯으로 피질내 전장 FC5-ABP 작제물의 존재를 밝혀주었다. 이는 샌드위치 ELISA에 의해 입증되었고, 이는 FC5-특이적 항체에 의해 분자를 포획하고, 포획된 분자를 ABP-특이적 항체에 의해 검출하는 능력에 의해 나타난 바와 같이 상기 분자의 온전한 성질을 밝혀주었다.
실시예 20: 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물 [FC5(H3)- hFc - ABP ( ABP 서열 번호: 36]의 엑스 비보 (A) 및 인 비보 (B) 결합 (표적 교합)
실시예 3에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 수행하였다. AD-유전자이식 마우스로부터의 뇌 절편을 FC5(H3)-hFc1X7-ABP (ABP, 서열 번호: 36)와 함께 인큐베이션하고, 결합된 융합 분자를 HRP-접합된 FC5-특이적 항체로 시각화하였다. 음성 대조군으로서, 절편을 작제물 없이, 또는 융합된 ABP가 없는 FC5-hFc 작제물과 함께 인큐베이션하였다. 간략하게 말하면, APP/PS1 유전자이식 마우스로부터의 피질 및 해마를 함유하는 포르말린-고정된 40 μm 자유-부유 절편에 80℃에서 30분 동안 10 mM 소듐 시트레이트 버퍼 (pH 9)에서 항원 복원 (antigen retrieval)을 실시하고, 이어서 실온까지 냉각시켰다. 절편을 PBS 중에 헹구고, PBS 중 3% H2O2로 30분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 차단하고, 이어서 다시 헹구었다. 절편을 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 Dako 혈청 무함유 단백질 차단제 중에서 1시간 인큐베이션한 후에, 0.3% 트리톤 X-100을 함유하는 Dako 희석제 중에서 실온에서 90분 동안 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 또는 몰당량의 FC5-hFc1x7과 함께 인큐베이션하였다. 절편을 PBS 중에서 철저하게 헹군 후에, Dako 희석제 중에서 실온에서 60분 동안 항-FC5-HRP와 함께 인큐베이션하고, 다시 헹구고, 이어서 키트 사용법에 따라 Vector Immpact DAB를 사용하여 발현시켰다. 절편을 Superfrost 플러스 슬라이드 상에 놓고, 밤새 공기 건조되게 하고, 이어서 재수화시키고, 메틸 그린으로 대비염색하고, 아세톤/0.05% 아세트산 (v/v) 중에 침지하고, 탈수시키고, 투명화하고, Permount를 사용하여 커버슬립하였다. FC5(H3)-hFc1X7-ABP 작제물에 대해서는 선택적 결합 (검정색 스폿)이 관찰되었지만, ABP를 갖지 않는 FC5(H3)-hFc1X7에 대해서는 관찰되지 않았고, 이는 뇌에서 Aβ 침착물의 ABP-의존적 결합 (표적 교합)을 나타낸다. 아밀로이드 침착물을 생성하지 않는 야생형 마우스로부터의 뇌 절편에서는 결합이 관찰되지 않았다 (데이터는 나타나 있지 않음).
AD 유전자이식 마우스에게 FC5(H3)-hFc-ABP 작제물의 해마내 주사 후에 Aβ 침착물의 유사한 결합을 검출하였다 (B). 해마내 주사 4시간 후에, Tg 마우스를 관류시키고, 뇌를 적출하고, 절편화하였다. Aβ 침착물에 대한 FC5(H3)-hFc-ABP 결합 (밝은 백색 점)이 ABP-특이적 다중클론 항체에 의해 시각화되었다. 뇌 절편을 먼저 ABP-특이적 단일클론 항체와 함께 인큐베이션한 후, Alexa-647 접합된 항 토끼-Fc 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
실시예 21: 인 비보에서 인간화 FC5- Fc - ABP 작제물 (FC5(H3)- hFc - ABP (서열 번호: 54))에 의한 표적 교합. 형광단-표지 (도 18의 A) 또는 나이브 (naive) FC5-ABP (도 18의 B) 융합 분자를 야생형 (Wt) 및 AD-Tg (Tg) 마우스의 해마 영역에 미세주사하였다. 형광단-표지 FC5-ABP 융합 분자의 미세주사 30분 후에, 뇌를 적출하고, 절편화하고, 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 도 21의 A에 나타낸 바와 같이, 주사된 분자는 Aβ-특이적 항체와의 공동-국소화에 의해 확인되는 바와 같이 Aβ 침착물에 결합하였다. 병행 연구에서, 나이브 FC5-ABP 융합 분자의 해마내 주사 4시간 후에, 주사된 (ips) 및 비주사된 (con) 영역으로부터 해마체를 수집하고, 트리스-완충 식염수 중에서 균질화하였다. 해마 추출물에 포획 항체로서 FC5 항체 및 검출 항체로서 ABP 또는 Aβ-특이적 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 도 21의 B에 나타낸 바와 같이, 미세주사된 FC5-ABP 분자는 온전하게 유지되었고, Aβ-특이적 항체에 의해 검출된, 아래로 당겨진 복합체에서 Aβ의 존재에 의해 나타난 바와 같이, ABP는 인 비보에서 교합하고 표적 Aβ에 결합할 수 있었다.
실시예 22: 비인간화 및 인간화 FC5- Fc -L- ABP 작제물 사이의 PK/PD 비교
FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 5에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 래트에게 정맥내 투여하였다. 혈청과 CSF를 연속해서 수집하였다. FC5-Fc-ABP 수준을 nanoLC- MRM 방법을 사용하여 정량화하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 혈청 및 CSF PK 프로파일은 비인간화 및 인간화 작제물에 대해 매우 유사하였다. FC5-mFc2a-ABP 또는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP를 도 9b에 나타낸 바와 같이 15 mg/kg으로 꼬리 정맥 주사를 통해 Tg 마우스에게 정맥내 투여하였다. CSF에서 FC5-Fc-ABP 및 Aβ 수준을 도 9b에 나타낸 바와 같이 nanoLC-MRM에 의해 측정하였다. 도 22b에 나타낸 바와 같이, CSF에서 비인간화 및 인간화 FC5-Fc-ABP의 수준은 유사하였고, 가장 중요한 것은, CSF Aβ 수준의 변화 (감소)가 또한 매우 유사하다는 것이고, 이는 FC5-Fc-ABP 작제물의 인간화가 융합 작제물의 PK 및 PD 프로파일에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.
실시예 23: CHO 세포에서 FC5-(H3)- hFc1x7 - ABP (6G) 융합 단백질 (서열 번호: 56)의 제조 중에 C-말단 절단된 산물의 생성.
실시예 2 및 16에 기재된 바와 같이 안정한 CHO 세포주에서 융합 단백질을 생성하였다. 단백질 A 친화성 컬럼을 사용한 정제 후에 (실시예 2), 상기 융합 단백질을 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다. CEX 크로마토그래피 프로파일로 FC5-(H3)-hFc1x7-ABP (6G)의 변이체의 존재를 밝혔다. 항-hFc 항체에 의한 Western 블롯 분석 (23a) 및 각 CEX 분획의 질량 분광분석 (23b) 하에, 상기 융합 단백질의 변이체의 생성이 제조 중에 ABP 펩티드의 C-말단 절단에 기인하는 것으로 결정되었다. 상기 C-말단 절단은 FC5-(H3)-hFc1x7-ABP (6G) 단백질에서 ABP 서열의 특정 부위에서 발생하였고, 이는 서열 번호: 36 ABP 서열의 C-말단 절단된 펩티드인 서열 번호: 37 내지 서열 번호: 43으로 예시된 바와 같다. 서열 번호: 36의 C-말단 절단 산물 또는 서열 번호: 47을 가진 ABP는 이량체 형식으로 융합 단백질 중에 혼입될 때 예상치 못한 안정성 및 β-아밀로이드 결합 활성을 보였다. 더욱이, 이러한 C-말단 절단 산물은 유리하게는 ELISA 및 Western 블롯 Aβ 오버레이 분석에 의해 평가되는 바와 같이 (실시예 2에서 기재된 바와 같음), 기능성 동종이량체 형식과 비교하여, β-아밀로이드 결합 활성의 동등한 생물학적 기능을 유지하였다 (EC50, 도 23a). 이들 C-말단 절단된 산물은 유리하게는 기능성이고 안정한 β-아밀로이드 결합 산물의 제조성 및 단리 가능한 수율을 증가시켰다. 이들 안정한 절단 산물은 명확하지 않으며, β-아밀로이드 결합 기능성 펩티드 및 상응하는 융합 펩티드 및 이량체 수율과 관련하여 유리하다. 따라서, CHO-세포에서 제조 중에 ABP의 C-말단 절단은 도 1Ai, 1Aii 및 1Aiii에 도시된 바와 같이 융합 단백질의 이관능성 동종이량체, 이관능성 이종이량체 (ABP 아암 모두는 기능성이고, 임의의 ABP 및/또는 임의의 C-말단 절단되었지만 기능성인 ABP를 함유할 수 있음) 및 일관능성 이종이량체 (이량체에서 하나는 기능성 ABP임)의 생성을 유도하였다. 상기 융합 단백질 (서열 번호: 56)의 절단 산물의 정확한 특성은 상세한 분석이 수행될 때까지 명확하지 않으며, 바이오 제조 및 단백질 생성이 예측될 수 없었다. 현재-정의된 C-말단 절단 산물이 유리하게는 β-아밀로이드에 결합할 수 있고, 안정한 펩티드가 된다는 것은 알려져 있지도 자명하지도 않았다. 이관능성 동종이량체, 및 일관능성 및 이관능성 이종이량체의 혼합물을 함유하는 CEX 분획의 β-아밀로이드 결합 활성 (PEAK 2, 도 23a, (EC 50 19nM)은 이관능성 동종이량체의 것 (PEAK 3, 도 23a, EC 50 13nM)과 매우 유사하며, 이는 상기 이종이량체 및 동종이량체 분획들 (CEX의 PEAKS 2 및 3)이 β-아밀로이드 결합 활성을 유의하게 손실하지 않고 조합될 수 있다는 것을 입증하였다. 이는 대규모 바이오제조 중에 완전히 기능성인, 안정한 융합 단백질로서 FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 수율 및 단리 가능성을 실질적으로 유리하게 증가시킨다. 이는 도 23c에서 입증되었고, 변형된 CEX 조건은 높은 수율의 분획 (PEAK 2, 도 23c)을 생성하는 것을 보여주었고, 이는 컬럼에 적용된 전체 단백질의 86.4%를 나타내었다. PEAK 2의 전형적인 질량 분광 분석은 도 23b에 도시된 바와 같이 서열 번호: 56, (MW 87,695)의 동종이량체 및 서열 번호: 56 및 서열 번호: 57 (MW=87,470); 서열 번호: 56 및 서열 번호: 60, (MW=87,085), 및 서열 번호: 56 및 완전 절단된 비-기능성 ABP, (MW= 84,040)를 포함하는 이종이량체의 혼합물로 구성된다. 상기 조합된 풀 (분획 B3 내지 B6)의 β-아밀로이드 결합 활성 (EC 50)은 도 23c, b 및 c에서 도시된 바와 같이 주로 동종이량체 (C10-D2, E12) 또는 이종이량체 형태 (C6-C8)를 함유하는 다른 CEX 분획과 매우 유사했다.
실시예 24: 동종- 및 이종- 이량체의 혼합물을 함유하는 FC5(H3)- hFc1x7 - ABP 융합 단백질의 뇌 전달
FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 혈액-뇌 장벽을 통한 수송 및 뇌의 표적 영역으로의 전달을 실시예 8 및 19에 기재된 바와 같이 평가하였다. FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질 (실시예 23에서 동종 및 이종이량체의 혼합물로서)을 야생형 (wt) 및 Tg 마우스의 꼬리 정맥을 통해 15 mg/kg으로 투여하였다. 주사 후 4시간 (데이터가 개시되지 않음) 또는 24시간 후에, 뇌의 피질 및 해마 영역을 절개하고, 실시예 8 및 19에 기재된 바와 같이 평가하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질은 샌드위치 ELISA (도 24의 A) 및 western 블롯 분석 (도 24의 B)에 의해 평가된 바와 같이 표적 영역에서 검출되었다. 결과는 주로 동종이량체 형태의 FC5(H3)-hFc1x7-ABP (서열 번호: 56, 도 19 참조)의 뇌 전달과 매우 유사했고, 혼합물 중에 이종이량체 형태의 FC5(H3)-hFc1x7-ABP는 융합 단백질의 혈액-뇌 횡단 및 뇌 전달에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 확인하였다.
실시예 25: 동종- 및 이종- 이량체의 혼합물을 함유하는 FC5(H3)- hFc1x7 - ABP 융합 단백질의 CSF 노출 및 CSF β-아밀로이드에 대한 이의 효과
FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 Tg 마우스로의 정맥내 주사 투여하고 24시간 후에, CSF를 수집하고, FC5(H3)-hFc1x7-ABP 및 β-아밀로이드의 수준을 실시예 5 및 22에 기재된 바와 같이 MRM에 의해 측정하였다. 도 25에 도시된 바와 같이, FC5(H3)-hFc1x7-ABP의 CSF 노출 및 CSF Aβ 수준의 변화 (감소)는 주로 동종이량체 형태의 FC5(H3)-hFc1x7-ABP (서열 번호: 56, 도 22 참조)에서 관찰되는 것과 매우 유사했고, 상기 혼합물 중에 FC5(H3)-hFc1x7-ABP는 FC5(H3)-hFc1x7-ABP 융합 단백질의 기능성 효능에 영향을 미치지 않는다는 것을 추가로 확인하였다.
Figure pct00016
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SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada CHAKRAVARTHY, Balu STANIMIROVIC , Danica DUROCHER, Yves <120> Blood-Brain Barrier Transmigrating Compounds and Uses Thereof <130> 2016-028-05 <140> PCT/IB2018/055747 <141> 2018-07-31 <150> PCT/IB2018/050576 <151> 2018-01-30 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 FC5 <400> 1 Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr Thr Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 FC5 <400> 2 Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 FC5 <400> 3 Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 IGF1R-3 <400> 4 Glu Tyr Pro Ser Asn Phe Tyr Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 IGF1R-3 <400> 5 Val Ser Arg Asp Gly Leu Thr Thr 1 5 <210> 6 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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 260 265 270 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 275 280 285 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 290 295 300 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 305 310 315 320 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 325 330 335 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 340 345 350 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 355 360 365 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 370 375 380 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 385 390 395 400 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 405 410 <210> 67 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FC5-H3-hFc1X0-L-ABP(GG-G) <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Cys 115 120 125 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 145 150 155 160 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 Glu Gly Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp His Val Asp Gly Val Glu Val 180 185 190 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 195 200 205 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 210 215 220 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 245 250 255 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 275 280 285 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 290 295 300 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 325 330 335 His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 340 345 350 Pro Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr Phe 355 360 365 Lys Thr Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ala Ser Leu Ala Ser Lys Asp Lys 370 375 380 Thr Pro Lys Ser Lys Ser Lys Lys Arg Gly Ser Thr Gln Leu Lys Ser 385 390 395 400 Arg Val Lys Asn Ile 405 <210> 68 <211> 407 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1R5-H2-hFc1X7-L-ABP(GG-G) <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Asp Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asp Trp Gly Asp Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Met Ala Arg Gln Ser Arg Val Asn Leu Asp Val Ala Arg Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 Ser His Glu Gly Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 180 185 190 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 195 200 205 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 210 215 220 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 245 250 255 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 260 265 270 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 275 280 285 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 290 295 300 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 305 310 315 320 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 325 330 335 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 340 345 350 Leu Ser Pro Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys 355 360 365 Thr Phe Lys Thr Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ala Ser Leu Ala Ser Lys 370 375 380 Asp Lys Thr Pro Lys Ser Lys Ser Lys Lys Arg Gly Ser Thr Gln Leu 385 390 395 400 Lys Ser Arg Val Lys Asn Ile 405 <210> 69 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ABP(GG-G)-L-hFc1X7- IGF1R5-H2 <400> 69 Lys Thr Phe Lys Thr Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ala Ser Leu Ala Ser 1 5 10 15 Lys Asp Lys Thr Pro Lys Ser Lys Ser Lys Lys Arg Gly Ser Thr Gln 20 25 30 Leu Lys Ser Arg Val Lys Asn Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Ser Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 65 70 75 80 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 85 90 95 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Gly Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 100 105 110 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 115 120 125 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 130 135 140 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 145 150 155 160 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 165 170 175 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 180 185 190 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 195 200 205 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 210 215 220 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 245 250 255 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 260 265 270 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 290 295 300 Ala Ser Gly Arg Thr Ile Asp Asn Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln 305 310 315 320 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Asp Trp Gly Asp 325 330 335 Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asn Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 340 345 350 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 355 360 365 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Met Ala Arg Gln Ser Arg 370 375 380 Val Asn Leu Asp Val Ala Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 385 390 395 400 Val Thr Val Ser Ser 405 <210> 70 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hFc1X7- L-ABP(GG-G)-L- IGF1R5-H2 <400> 70 Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Gly Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Lys Thr Phe Lys Thr Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ala Ser Leu Ala 245 250 255 Ser Lys Asp Lys Thr Pro Lys Ser Lys Ser Lys Lys Arg Gly Ser Thr 260 265 270 Gln Leu Lys Ser Arg Val Lys Asn Ile Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 290 295 300 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ile Asp 305 310 315 320 Asn Tyr Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 325 330 335 Trp Val Ala Thr Ile Asp Trp Gly Asp Gly Gly Thr Arg Tyr Ala Asn 340 345 350 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 355 360 365 Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 370 375 380 Tyr Cys Ala Met Ala Arg Gln Ser Arg Val Asn Leu Asp Val Ala Arg 385 390 395 400 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 405 410 <210> 71 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FC5-H3-hFc1X7-L(consensus)-ABP(6G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (357)..(357) <223> is A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (359)..(359) <223> is A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (360)..(360) <223> is S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (362)..(362) <223> is G or V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (363)..(363) <223> is A or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (365)..(365) <223> is S or T <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Ile Thr His Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Trp Gly Gly Asp Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Ser Thr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Arg Val Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Pro Lys Ser Ser 115 120 125 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 145 150 155 160 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 165 170 175 Glu Gly Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 180 185 190 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 195 200 205 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 210 215 220 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 225 230 235 240 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 245 250 255 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 260 265 270 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 275 280 285 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 290 295 300 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 325 330 335 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 340 345 350 Pro Gly Thr Gly Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gly Thr Phe 355 360 365 Gly Thr Gly Gly Ala Ser Ala Gln Ala Ser Leu Ala Ser Lys Asp Lys 370 375 380 Thr Pro Lys Ser Lys Ser Lys Lys Gly Gly Ser Thr Gln Leu Lys Ser 385 390 395 400 Arg Val Lys Asn Ile 405

Claims (58)

  1. 하기의 아미노산 서열을 포함하는 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 펩티드:
    X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6
    상기에서 X1 =K, G 또는 A 또는 X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V임 (서열 번호: 46).
  2. 하기의 아미노산 서열을 포함하는 β-아밀로이드에 결합하는 단리된 펩티드 또는 이의 임의의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 산물:
    X1TFX2TX3X4ASAQASLASKDKTPKSKSKKX5X6STQLX7SX8VX9NI (서열 번호: 31)
    상기에서 X1 =K, G 또는 A, 또는 X1 = G 또는 A, X2 = K, G 또는 V, X3 = R, G 또는 A, X4 = K, G 또는 A, X5 = R, G 또는 V, X6 = N, G 또는 V, X7 = K, G 또는 V, X8 = R, G 또는 A, X9 = K, G 또는 A임.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 단리된 펩티드 또는 이의 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 펩티드:
    Figure pct00028
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 C-말단 절단된 β-아밀로이드 결합 펩티드는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 단리된 펩티드:
    Figure pct00029
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 혈액-뇌 장벽 (blood brain barrier)을 관통이동 (transmigrating)할 수 있는 항체 또는 항체 단편에 융합되는 것인 단리된 펩티드.
  6. 청구항 5에 있어서, Fc 단편에 연결된 것인 단리된 펩티드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단리된 펩티드, 항체 또는 이의 단편, 및 Fc 단편은 단쇄 폴리펩티드 융합 단백질을 형성하는 것인 단리된 펩티드.
  8. 청구항 6 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단편은 감쇠된 이펙터 (effector) 기능을 가진 Fc를 포함하는 것인 단리된 펩티드.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 단리된 펩티드, 및 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통이동하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 융합 단백질은 Fc 단편을 추가로 포함하는 단쇄 폴리펩티드인 것인 융합 단백질.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체를 형성하는 것인 융합 단백질.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 이량체는 ABP와 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체이고, β-아밀로이드에 결합할 수 있는 적어도 하나의 ABP를 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩티드는 하기를 포함하는 것인 융합 단백질:
    항체 또는 이의 단편;
    서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46 및 서열 번호: 47로 구성된 그룹으로부터 선택된 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드; 및
    서열 번호: 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50으로 구성된 그룹으로부터 선택된 Fc 단편.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하는 서열을 포함하는 것인 융합 단백질:
    GFKITHYTMG (서열 번호: 1)의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR) 1 서열, RITWGGDNTFYSNSVKG (서열 번호: 2)의 CDR2 서열, GSTSTATPLRVDY (서열 번호: 3)의 CDR3 서열.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17 및 상기 서열들 중 임의의 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질:
    EYPSNFYA (서열 번호: 4)의 CDR1 서열, VSRDGLTT (서열 번호: 5)의 CDR2 서열, AIVITGVWNKVDVNSRSYHY (서열 번호: 6)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편;
    GGTVSPTA (서열 번호: 7)의 CDR1 서열, ITWSRGTT (서열 번호: 8)의 CDR2 서열, AASTFLRILPEESAYTY (서열 번호: 9)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편; 및
    GRTIDNYA (서열 번호: 10)의 CDR1 서열, IDWGDGGX (상기 X는 A 또는 T임) (서열 번호: 11)의 CDR2 서열; AMARQSRVNLDVARYDY (서열 번호: 12)의 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 이의 단편.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 18, 서열 번호: 21 및 서열 번호: 24 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26 및 상기 서열들 중 임의의 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  19. 청구항 13 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 단쇄 폴리펩티드는 β-아밀로이드에 결합하는 펩티드에 Fc 단편을 통해 연결되는 것인 융합 단백질.
  20. 청구항 13 또는 19에 있어서, 상기 융합 단백질은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 단쇄 폴리펩티드인 것인 융합 단백질:
    서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 서열 번호: 56, 서열 번호: 57, 서열 번호: 58, 서열 번호: 59, 서열 번호: 60, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 서열 번호: 66, 서열 번호: 67, 서열 번호: 68, 서열 번호: 69, 서열 번호: 70, 서열 번호: 71, 및 이에 대해 실질적으로 동일한 서열.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체를 형성하는 것인 융합 단백질.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 융합 단백질은 임의의 적절한 펩티드 링커를 포함하는 단쇄 폴리펩티드인 것인 융합 단백질.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 펩티드 링커는 상기 융합 단백질의 연결된 성분들이 이들의 비제한적인 원하는 생물학적 기능을 유지하도록 하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 상기 펩티드 링커는 서열 (GGGS)n, (GGGGS)n, 또는 임의의 적절한 펩티드 연결 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  25. 청구항 11 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단쇄 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드를 형성하는 것인 융합 단백질.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 이량체 폴리펩티드는 그 안에 포함된 β-아밀로이드 결합 단백질 (ABP)과 관련하여 동종이량체 또는 이종이량체를 포함하는 것인 융합 단백질.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 이종이량체는 β-아밀로이드에 결합할 수 있는 적어도 하나의 기능성 ABP를 포함하는 것인 융합 단백질.
  28. 청구항 9 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 인간화된 (humanized) 것인 융합 단백질.
  29. 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 단일-도메인 항체 (sdAb)인 것인 융합 단백질.
  30. 청구항 9 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단편은 마우스 (mouse) Fc2a 또는 인간 (human) Fc1인 것인 융합 단백질.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 Fc 단편은 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50을 포함하는 것인 융합 단백질.
  32. 청구항 9 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 Fc 단편의 N-말단에 연결된 항체 또는 이의 단편을 포함하고, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 상기 Fc 단편의 C-말단에 연결되는 것인 융합 단백질.
  33. 청구항 9 내지 13 및 16 내지 31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 상기 Fc 단편의 C-말단에 연결되고, 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드는 상기 Fc 단편의 N-말단에 연결되는 것인 융합 단백질.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 링커는 상기 Fc에 상기 항체 또는 이의 단편을 연결하고 및/또는 상기 β-아밀로이드에 결합하는 폴리펩티드를 연결하는 독립적으로 선택된 링커 서열인 것인 융합 단백질.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 링커 서열은 GGGGSGGGGS, GGGSGGGGS, 서열 번호: 71에 제공된 임의의 적절한 링커 또는 임의의 적절한 링커인 것인 융합 단백질.
  36. 청구항 9 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 이량체를 형성하는 것인 융합 단백질.
  37. 청구항 38에 있어서, 상기 이량체는 2개의 단쇄 폴리펩티드를 포함하고, 상기 2개의 단쇄 폴리펩티드는 하기인 것인 융합 단백질:
    서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 2개의 ABP를 포함하는 이관능성 동종이량체; 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 2개의 상이한 ABP를 포함하는 이관능성 이종이량체; 또는 서열 번호: 31 내지 47 중 어느 하나로부터 선택된 하나의 ABP를 포함하는 일관능성 이종이량체.
  38. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 단리된 펩티드 또는 이들의 임의의 조합, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  39. 청구항 9 내지 37 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 이들의 임의의 조합, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  40. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항의 임의의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  41. 청구항 40의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  42. 청구항 38 또는 39의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
  43. 환자에서 알츠하이머병 치료를 위한, 청구항 38 또는 39에 따른 약학적 조성물.
  44. 알츠하이머병을 치료하는 방법으로서, 청구항 9 내지 37 중 어느 한 항의 융합 단백질 또는 청구항 38 또는 39의 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상에서 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법으로서, 대상에게 충분한 양의 청구항 38 또는 39의 약학적 조성물의 반복된 비경구 투여 단계들을 포함하는 것인 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 비경구 투여는 피하 또는 정맥내 투여인 것인 방법.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상에서, 청구항 38 또는 39의 조성물의 반복된 비경구 투여 후에, 상기 β-아밀로이드 수준이 감소되는 것인 방법.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 β-아밀로이드는 청구항 38 또는 39의 조성물의 반복된 비경구 투여 4주 이내에 감소되는 것인 방법.
  49. 청구항 47에 있어서, 뇌척수액 (CSF)이 증가된 대상의 CSF 중 β-아밀로이드 수준이 청구항 38 또는 39의 조성물의 비경구 투여 후에 감소되는 것인 방법.
  50. 청구항 46에 있어서, 뇌척수액 (CSF)이 증가된 대상의 CSF 중 β-아밀로이드 수준이 청구항 38 또는 39의 조성물의 단일 비경구 투여 24시간 이내에 감소되는 것인 방법.
  51. 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상에서 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법으로서, 청구항 9 내지 37 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. 청구항 9 내지 37 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물.
  53. 청구항 52에 있어서, 상기 융합 단백질의 혼합물은 ABP 이관능성 동종이량체 융합 단백질, ABP 이관능성 이종이량체 융합 단백질 및 ABP 일관능성 이종이량체 융합 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  54. 청구항 52 및 53에 있어서, 상기 단리된 단쇄 폴리펩티드 융합체들의 혼합물은 유효한 수율의 기능성 융합 단백질을 포함하는 약학적으로 유효한 혼합물인 것인 약학적 조성물.
  55. 청구항 52 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 희석제, 담체, 비히클 또는 부형제를 더 포함하고, 알츠하이머병 증상을 개선하기 위한 것인 약학적 조성물.
  56. 청구항 55에 있어서, 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상에서 β-아밀로이드 수준 감소에 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
  57. 뇌 (brain) 아밀로이드 베타 수준이 증가된 대상에서 β-아밀로이드 수준을 감소시키는 방법으로서, 청구항 55의 약학적 조성물을 대상의 체내로 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  58. 청구항 56에 있어서, β-아밀로이드 수준이 증가된 대상의 뇌, 조직, 또는 생체액 (CSF 및 혈액)에서 β-아밀로이드 수준을 감소시키기 위한 것인 약학적 조성물.
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