KR20190106821A - 신규 균주 페니실리움 애시둠 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)은 항진균 효과를 가지는 균주로서 이의 배양액 또는 배양액 추출물에 의한 생물학적 방제를 달성할 수 있고, 항진균 대상인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) 등에 대한 항진균 효과가 매우 뛰어나다. 또한, 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 이의 배양액 또는 이의 배양 여과액은 세포 내에서 일어나는 특정 활성을 억제하거나 향상시킬 수 있고,특정 화합물의 생산 능력이 우수하여 약학, 식품, 미용 등 다양한 분야의 조성물에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 페니실리움(Penicillium) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
자연에는 세균, 곰팡이, 효모, 조류 등 다양한 미생물이 존재하고 이들을 이용한 연구가 지속되고 있다. 미생물의 활용 분야는 매우 다양한데 대표적으로 의료 분야의 치료제, 식품 분야의 건강 기능 식품, 미용 분야의 화장료 조성물 등이 있다.
미생물은 현재까지 수십만 종이 발견되고 보고되었으나, 계속하여 새로운 균주가 보고되고 있고 새로운 균주의 발견은 이를 이용한 새로운 용도의 발명에 이르게 될 수 있다. 예를 들어, 한국 공개특허 제10-2016-0087438호에서는 신규 페니실리움 균주를 이용하여 장류 등 발효물을 제조하는 방법을 개시하고 있다.
본 발명은 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)을 제공하고, 이를 이용한 항균용 미생물 제제를 포함하여, 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 사료, 항균제 등을 포함하는 다양한 형태의 활용 방안을 제공한다.
본 발명은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 항진균용 미생물 제제는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 항진균용 미생물 제제에 있어서, 상기 미생물 제제의 항진균 대상은 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 라이코펄시사이 (Fusariumoxyporum f. sp. lycopersici), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라이조퍼스 스토로니퍼 var. 스토로니퍼(Rhizopus stolonifer var. stolonifer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병원균일 수 있으며, 바람직하게는 알터나타(Alternaria alternata) 또는 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) (기탁번호: KCTC13490BP)은 항진균 효과를 가지는 균주로서 이의 배양액 또는 배양액 추출물에 의한 생물학적 방제를 달성할 수 있고, 항진균 대상인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) 등에 대한 항진균 효과가 매우 뛰어나다.
또한, 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 이의 배양액 또는 이의 배양 여과액은 세포 내에서 일어나는 특정 활성을 억제하거나 향상시킬 수 있고, 특정 화합물의 생산 능력이 우수하여 약학, 식품, 미용 등 다양한 분야의 조성물에 활용할 수 있다.
도 1은 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2 균주의 계통수(Phylogenetic tree)를 보여준다.
도 2는 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFC-DLW4-1 균주의 형태학적 구조를 보여준다[a 및 e는 Czapek yeast auto lysate agar (CYA) 배지에서의 콜로니, b 및 f는 malt extract agar (MEA) 배지에서의 콜로니, c 및 g는 yeast extract sucrose agar (YES) 배지에서의 콜로니, d 및 h는 creatine sucrose agar (CREA) 배지에서의 콜로니, i~k 및 m~r은 분생자경(conidiophore), l 및 s는 분생포자(conidia)를 보여준다. 스케일 바(scale bar)는 m은 20㎛, i~l 및 p는 10㎛, n, o, q 및 r은 5㎛, s는 2㎛이다].
도 3은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 BenA gene 서열이다.
도 4는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 CaM gene 서열이다.
도 5는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 RPB2 gene 서열이다.
도 6은 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1 균주의 항진균 활성에 관한 것이다. A. 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 앞면도, B. 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 뒷면도, C. 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 앞면도, D. 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 뒷면도
도 7은 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 효소 활성을 나타낸다.
A. 탈지유 한천에 페니실리움 애시둠 CNUFCDLW4-1의 배양에 의해 형성된 콜로니 주변의 클리어 존의 앞면도, B: 탈지유 한천에 페니실리움 애시둠 CNUFCDLW4-1의 배양에 의해 형성된 콜로니 주변의 클리어 존의 뒷면도.
도 2는 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFC-DLW4-1 균주의 형태학적 구조를 보여준다[a 및 e는 Czapek yeast auto lysate agar (CYA) 배지에서의 콜로니, b 및 f는 malt extract agar (MEA) 배지에서의 콜로니, c 및 g는 yeast extract sucrose agar (YES) 배지에서의 콜로니, d 및 h는 creatine sucrose agar (CREA) 배지에서의 콜로니, i~k 및 m~r은 분생자경(conidiophore), l 및 s는 분생포자(conidia)를 보여준다. 스케일 바(scale bar)는 m은 20㎛, i~l 및 p는 10㎛, n, o, q 및 r은 5㎛, s는 2㎛이다].
도 3은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 BenA gene 서열이다.
도 4는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 CaM gene 서열이다.
도 5는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 RPB2 gene 서열이다.
도 6은 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1 균주의 항진균 활성에 관한 것이다. A. 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 앞면도, B. 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae) (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 뒷면도, C. 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 앞면도, D. 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 (대조군)에 대한 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 뒷면도
도 7은 페니실리움 애시둠 (Penicillium acidum) CNUFCDLW4-1의 효소 활성을 나타낸다.
A. 탈지유 한천에 페니실리움 애시둠 CNUFCDLW4-1의 배양에 의해 형성된 콜로니 주변의 클리어 존의 앞면도, B: 탈지유 한천에 페니실리움 애시둠 CNUFCDLW4-1의 배양에 의해 형성된 콜로니 주변의 클리어 존의 뒷면도.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) 균주 및 이를 포함하는 항진균용 미생물 제제에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)을 제공한다.
상기 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)은 작은 연못에서 채취한 물에서 분리 및 동정하고, 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) sp. nov. CNUFC-DLW4-2로 명명하여, 2018년 03월 05일 자로 한국생물자원센터에 기탁번호 KCTC13490BP로 기탁하였다.
본 발명의 신규 진균인 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)은 신규 균주는 페니실리움 존크루기(Penicillium johnkrugii), 페니실리움 말로치(Penicillium mallochii) 및 페니실리움 엑수단스(P. exsudans) HMAS248735와 연관성이 높으나, 특정 배지인 CYA 및 YES에서 느린 성장을 보이고, CREA 배지에서 강산을 생성하여 이들과 구분되는 특징을 가진다.
본 발명의 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)은 다양한 생물학적 활성 효과를 가지고 있고, 특정 물질을 다량 생산할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)는 균체 자체 뿐만 아니라, 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액, 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액을 여과한 배양 여과액도 다양한 생물학적 활성 효과를 가질 수 있다.
배양액 및 배양액의 여과액 외에도 배양액의 동결건조 분말, 배양 여과액의 동결건조 분말 또는 동결건조 분말을 용해한 용액을 여러 분야에서 활용할 수 있다.
본 발명에서 배양액은 균체를 배지에 배양하여 균체가 생성한 물질, 균체 자체 및 배지를 포함할 수 있다.
본 발명에서 배양 여과액은 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액, 상층액을 여과하여 얻은 액체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 조성물, 식품 등의 제조 방법은 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)을 배양 배지에 배양하는 단계 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)을 배양하여 얻은 배양액을 수득하여 제형화 하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 얻어 상등액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 여과하여 얻은 배양 여과액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)을 배양하기 위한 배지는 MEA(Blakeslee's malt extract agar) 배지, YES(yeast extract sucroseagar) 배지, CREA(Czapek yeast autolysateagar) 배지 및 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 선택되는 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에 따르면 바람직하게는 MEA 및 CREA 배지이고, CYA 및 YES 배지에서는 성장이 느릴 수 있다.
본 발명의 항진균용 미생물 제제는 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 항진균용 미생물 제제에 있어서, 상기 미생물 제제의 항진균 대상은 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 라이코펄시사이 (Fusariumoxyporum f. sp. lycopersici), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라이조퍼스 스토로니퍼 var. 스토로니퍼(Rhizopus stolonifer var. stolonifer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병원균일 수 있으며, 바람직하게는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 또는 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 곰팡이에 의해 발병한 식물은 검은곰팡이썩음병, 잎 점무늬, 마름증상, 궤양, 가지마름, 뿌리썩음 등의 병징을 나타내며, 잎이나 줄기가 시들게 되고, 열매의 질이 떨어지게 된다.
상기 곰팡이에 의해 발생하는 식물 곰팡이병(plant fungal diseases)의 종류는 본 발명에서 특별히 제한되는 것은 아니나, 상기 미생물 제제를 통해 방제될 수 있는 곰팡이에 의해 발명할 수 있는 곰팡이병을 포함할 수 있으며, 구체적인 일예로, 흰가루병, 잿빛곰팡이병 또는 잎곰팡이병 등의 곰팡이에 의한 식물병 등을 들 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)은 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료, 사료, 항생제 등 다양한 분야에서 사용되는 형태로 제조될 수 있다.
일예로, 본 발명에 따른 조성물을 건강기능식품 또는 식품첨가물의 형태로 제조하는 경우 그 형태나 유형은 특별히 제한되지 않으며 활성을 증가시킬 수 있는 타 성분과 혼합하여 제조할 수도 있다. 식품의 종류에도 특별히 제한은 없고, 예를 들어 드링크제, 비타민제, 각종 음료수, 가공 육류, 가공 소세지, 가공 면류, 가공 유지류, 사탕, 껌 등 통상적으로 제조 및 판매되는 식품류를 포함할 수 있다.
바람직하게는 드링크제나 기타 음료 형태 조성물로 제조하는 것이 좋고, 감미료와 같은 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유하여 섭취에 도움을 줄 수 있다. 단당, 과당, 포도당 등 다양한 맛을 탄수화물류를 포함할 수 있고, 솔비톨이나 자일리톨과 같은 당알콜도 포함할 수 있다. 감미제의 예로는 천연 감미제뿐만 아니라 사카린과 같은 합성 감미제 등도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물을 약학 조성물 또는 약제의 형태로 제조하는 경우 그 형태나 유형은 특별히 제한되지 않으며 투여 또는 섭취 방식에 따라 다양한 제형으로 제조할 수 있다. 또한 약학 조성물의 제조시 해당 분야에서 통상적으로 사용하는 부형제, 담체 혹은 희석제도 적절히 더 포함할 수 있다. 제형의 예로는 정제, 시럽, 캡슐, 산제 등의 경구형태 외에도 외용제나 주사용제 등 다양한 제형이 가능할 수 있다. 담체나 부형제 등의 예로는 솔비톨, 자일리톨이나 말티올과 같은 당알코올류, 단당류, 다당류, 젤라틴, 물, 알코올, 전분, 식용가능한 고무류, 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 제제화시 일반적으로 사용하는 습윤제, 계면활성제, 부형제, 충진제나 결합제 등의 종류도 특별히 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1]
진균의 동정
실시예
1-1. 새로운 진균의 동정을 위한 샘플링 및 분리
전남대학교(Chonnam National University, Gwangju, Korea)의 작은 연못에서 담수 샘플을 채취하였다. 채취한 샘플을 멸균된 50㎖ 원추형 튜브에 옮기고 4℃에서 보관하였다. 곰팡이 균은 연속 희석 평판법(serial dilution plating method)으로 분리 하였다. 구체적으로, 샘플인 물 1㎖를 멸균 증류수 9㎖와 혼합하고 실온에서 15 분간 흔들어 섞은 다음 10-1에서 10-4의 농도까지 단계별로 희석하였다. 각 희석액 0.1㎖를 감자 포도당 한천 배지(PDA 배지)(39g potato dextrose agar [Becton, Dickinson, and Co., Sparks, MD, USA])에 옮겨 25℃에서 3 ~ 7 일 동안 배양하였다. 순수한 배양물을 분리하기 위해, 다양한 형태의 개별 콜로니를 PDA 플레이트로 옮겼다. 순수 균주는 PDA 슬랜트 튜브(slant tube)및 -80℃의 20 % 글리세롤에 보관하여 사용하였다.
실시예
1-2. DNA 추출,
PCR
및 시퀀싱(sequencing)
분리한 각각의 균을 셀로판으로 덮인 PDA에서 25℃에서 3~5일 동안 배양하였다. Solgent Genomic DNA prep kit(Solgent Co. Ltd., 대전, 한국)를 이용하여 총 게놈 DNA를 추출하였다. 프라이머 쌍 Bt2a/Bt2b(Glass & Donaldson 1995), CMD5/CMD6(Samson 등), RPB2-5F / RPB2-7cR (Liu et al., 1999)을 사용하여 베타 튜블린(beta tubulin)을 인코딩(encoding)하는 BenA 부분 유전자, CaM은 칼모듈린(calmodulin)을 인코딩하는 CaM 부분 유전자 및 RNA 폴리머레이즈 II를 인코딩하는 RPB2 부분 유전자를 증폭 및 확인하여 이용하였다.
각각의 PCR 증폭 혼합물(총 부피, 20 ㎕)은 2 ㎕의 균주 DNA 주형(10 ng), 각각의 프라이머 (5pM/㎕) 1.5㎕; Taq DNA 중합 효소, dNTP, 완충액 및 트래킹 염료(tracking dye)를 함유한 Accupower® PCR premix(Bioneer Corp., 대전, 한국) 1㎕ 및 멸균수 14㎕를 포함하였다. PCR 생성물을 Accuprep® PCR 정제 키트 (Bioneer)로 제조사의 지시에 따라 정제하였다. DNA 시퀀싱은 ABI 3700 automated DNA sequencer(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행 하였다.
[표 1]
실시예
1-3. 계통발생분석(Phylogenetic analysis)
시퀀싱 결과와 GenBank 데이터베이스에서 얻은 서열 데이터를 Clustal_X v.1.83(Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG(1997) The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research: 4876-82) 및 Bioedit v. 5.0.9.1 소프트웨어(Hall TA. BioEdit: a user friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser 1999;41:95-8)를 사용하여 분석하였다. 계통 발생 분석은 MEGA 6 소프트웨어(Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, KumarS. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729)를 사용하여 수행되었다.
CNUFC-DLW4-1, CNUFC-DLW4-2 및 Sclerotiora 섹션(the section Sclerotiora) 관련 종을 포함하는 계통 발생 수는 최대 우도 분석(the maximum likelihood analysis)에 의해 BenA, CaM 및 RPB2에 대한 복합 데이터 세트를 사용하여 구성되었고, 페니실리움 레비툼(Penicillium levitum)이 아웃 그룹으로 선정되었다.
각각의 균주에 대한 Basic Local Alignment Search Tool(BLASTn)(NCBI) 검색에 의해 서열 일치율을 얻었다. 내부 브랜치의 신뢰성은 1000 부트 스트랩 복제(1000 bootstrap replicates)를 사용하는 p-거리 대체 모델을 사용하여 평가하였다.
실시예
1-4. 형태학적 분석
자세한 형태 연구를 위해 분리한 균주를 블레이크슬리(Blakeslee)의 맥아 추출물 한천(MEA; Blakeslee, 1915), 효모 추출 수크로스(yeast extract sucrose) 한천(YES; Frisvad, 1981), Czapek yeast auto lysate agar(CYA; Pitt, 1979) 및 크레아틴 자당 한천(CREA; Frisvad 1981)에서 배양하였다. 플레이트 (각 배지에 대해 3 복제물)를 3-점(three-point)에 접종하였다. 7일간 배양한 후 암실에서 5℃, 20℃, 25℃, 30℃ 및 37℃에서 Rayner의 컬러 차트(the color charts of Rayner(1970))를 사용하여 성장을 확인하였다. 샘플을 락토페놀용액(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 마운팅하고 DIC 광학 장치(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 Olympus BX51 현미경으로 관찰 하였다.
미세 균질 구조는 주사 전자 현미경(SEM)(Hitachi S4700; Hitachi, Tokyo, Japan)로 관찰하였다. 분리 균주를 0.05M 인산 완충액(pH 7.2) 중 2.5% 파라 포름알데히드 - 글루타르알데히드 paraformaldehyde-glutaraldehyde)에 2시간 동안 고정시킨 후, 카코딜염산(cacodylate) 버퍼(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 세척 하였다. 카코딜염산에 1 시간 동안 희석한 1% 오스뮴테트록시드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)에 시료를 고정시킴으로써 세포막을 보존하였다. 샘플을 다시 카코딜염산 버퍼로 세척하고, 에탄올(graded ethanol)(Emsure, Darmstadt, Germany) 및 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate)(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 탈수시키고 흄 후드(fume hood)에서 건조시켰다.
마지막으로, 샘플을 금으로 스퍼터 코팅하고 한국기초과학연구소에서 Hitachi S4700 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)을 사용하여 관찰 하였다.
실시예
1-5. 계통발생분석 결과(Phylogenetic analysis)
신규 균주의 관련 종 계통 발생 관계를 분석하기 위해, ITS rDNA 서열을 GeneBank에서 추출한 관련 종과 비교한 서열 분석에 결과에 따라 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFC-DLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2로 NCBI 데이터베이스에 기탁하고, 이를 이용하여 분석하였다. 분석 수행은 ITS와 BenA(서열번호 9), CaM(서열번호 10) 및 RPB2(서열번호 11) 유전자를 이용하였다([표 2]). BenA은 베타 튜블린(beta tubulin)을 인코딩(encoding)하는 유전자이고, CaM은 칼모듈린(calmodulin)을 인코딩하는 유전자이고, RPB2는 RNA 폴리머레이즈 II를 인코딩하는 유전자이다.
CNUFC-DLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2 균주의 ITS rDNA 서열을 GenBank에서 추출한 관련 종과 비교했을 때, BLASTn 검색에 의한 서열 분석 결과 CNUFC-DLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2가 페니실리움 sp.(Penicillium sp.) YZ02(GenBank 접근번호 JQ809682) 및 페니실리움 sp.(Penicillium sp.) PE125(GenBank 접근번호 JX875942)와 가장 근접한 연관성을 보였다.
페니실리움 존크루기(Penicillium johnkrugii) DAOM 239945와 페니실리움 존크루기(Penicillium johnkrugii) DAOM 239942의 BenA 서열은 분리균의 BenA와 97.2%(412/424 bp)의 서열 상동성을 보였다. 페니실리움 말로치(Penicillium mallochii) DAOM 239919와 페니실리움 말로치(Penicillium mallochii) DAOM 239917의 CaM 서열은 분리균의 CaM과 97.3%(442/454 bp)의 서열 상동성을 보였다. 페니실리움 엑수단스(P. exsudans) HMAS248735의 RPB2 서열은 분리균의 RPB2와 99.1% (918/926 bp)의 서열 상동성을 보였다.
계통수(phylogenetic trees)는 CNUFC-DLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2의 BenA, CaM 및 RPB2와 GenBank에서 추출한 Sclerotiora 섹션에 속하는 관련 종(도 1)에 대한 데이터 세트를 통해 추론되었다. 계통 발생 분석은 Sclerotiora 섹션에 분리한 진균을 두었고, 분리 진균은 별도의 클레이드(clade)를 형성하여 분리 진균이 별개의 페니실리움(Penicillium) 종이라는 것을 보여 주었다.
실시예
1-6. 형태태학적 분석 결과
진균 콜로니는 MEA에서 빠르게 자라 25℃ 조건의 7 일 동안 31 내지 32mm의 직경에 도달하였다. 분생자경 (conidiophores)는 단일 윤생상(monoverticillate)으로 형성되며, 대(stipe)는 완만하고, 길이가 다양하며, 격벽을 형성하며, 2.5~4.0㎛ 폭을 가지며, 포자형성기관인 피알라이드(phialide)는 매끄러우며, 플라스크 모양이며, verticil 당 5-12개였고, 분생포자(conidia)는 약간 거칠며, 구형에서 반구형의 모양이며 크기는 2.5~3.5㎛ Х 2.0~3.0㎛ 이다(도 2).
신규 균주는 CYA 및 YES 배지에서 배양될 때 느린 성장을 나타내었고, 일부 배지에서 균핵(sclerotia)이 형성되어 페니실리움 존크루기(Penicillium johnkrugii) 및 페니실리움 말로치(Penicillium mallochii)와 구별되었다. 존크루기(Penicillium johnkrugii) 및 페니실리움 말로치(Penicillium mallochii)는 강산을 생성하지 않는 반면 신규 균주는 CREA 배지에서 강산(strong acid)을 생성하였다.
새로운 진균을 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFC-DLW4-1 및 CNUFC-DLW4-2로 명명하고 이 중 CNUFC-DLW4-2를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.
기탁번호 : KCTC13490BP
기탁일자 : 2018.03.05.
기탁처 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
[
실시예
2]
신규
페니실리움
애시둠(
Penicillium acidum
)의
활성 확인
실시예
2-1.
페니실리움
애시둠
(
Penicillium
acidum
)
CNUFC
-
DLW4
-2의 항진균 활성 측정(
antifungal
activity assay)
페니실리움 애시둠(Penicillium acidum) CNUFC-DLW4-2의 항진균 활성은 PDA 배지에서 이중 배양법을 사용하여 측정하였다.
곰팡이 병원균인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)의 균사 플러그(mycelial plug)를 각각 PDA 플레이트 중앙에 위치시키고, 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2 균주 배양액은 상기 병원성 곰팡이로부터 2.5 cm 떨어진 곳에 위치하도록 하였다.
모든 플레이트를 25℃의 암실에서 5-7일간 배양하고, 각 실험을 3회 반복하였다. 대조군 플레이트는 각 곰팡이 병원균의 균사 플러그만을 위치시켰다.
이후, 상기 곰팡이 병원균과 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2의 억제 영역의 폭을 밀리미터 단위로 측정하여 항진균 활성으로 사용하였다.
저해율(%)는 다음과 같이 계산된다.
저해율(%)= (R-r)/R × 100
R은 CNUFC-DLW4-1 배양 반대방향으로의 균사 성장
R은 CNUFC-DLW4-1 배양 방향으로의 균사 성장.
그 결과, 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2 균주 배양액은 PDA 배지에서 진균성 병원균인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)의 균사 생장을 각각 30.4% 및 42.5%씩 유의적으로 억제하여, 높은 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 2, 도 6).
그 결과, 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2 균주 배양액은 PDA 배지에서 진균성 병원균인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) EML-BLDF1-4 및 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae)의 생장이 현저히 억제되는 것을 확인하였다.
[표 2]
실시예
2-2.
페니실리움
애시둠
(
Penicillium
acidum
)
CNUFC
-
DLW4
-2의 단백질 분해 활성 측정(
proteolytic
activity assay)
2% 한천(agar)을 함유한 한천 플레이트에 본 발명의 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2 균주를 접종하고, 2% 탈지유를 보충하였다. 플레이트는 25℃에서 4일(3-5일)간 배양하였다.
신규 페니실리움 애시둠 CNUFC-DLW4-2의 단백질 분해활성에 대한 스크리닝 결과를 도 6에 도시하였다. 이로부터, 본 발명의 페니실리움 애시둠은 24시간 배양 후 단백질 분해 효소를 생산하였으며, 이는 콜로니를 둘러싸고 있는 클리어 존(clear zone)으로부터 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Novel fungus Penicillium acidum and use thereof
<130> P-0305-KCTC13490BP
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS rDNA forward primer(ITS-1)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS rDNA reverse primer(ITS-4)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BenA Forward primer(Bt2a)
<400> 3
ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BenA Reverse primer(Bt2b)
<400> 4
accctcagtg tagtgaccct tggc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaM Forward primer(CMD5)
<400> 5
ccgagtacaa ggargccttc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CaM Reverse primer(CMD6)
<400> 6
ccgatrgagg tcatracgtg g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPB2 Forward primer(5F)
<400> 7
gaygaymgwg atcayttygg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPB2 Reverse primer(7CR)
<400> 8
cccatrgctt gyttrcccat 20
<210> 9
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Penicillium acidum sp. nov. CNUFC-DLW4-2 (BenA gene [encoding
beta tubulin])
<400> 9
tcttcaattg atgaaaccag gaacctttga ctgacttgtt atataggcag aacattgcta 60
gcgagcatgg cctcgacggc gagggccagt aagtatcaat ttgcgtggaa ttgggtgata 120
tgagaatggc ggtctgatat ttttctttag cttcactggc cagtccgacc tccagctcga 180
gcgcatgaac gtctacttca accacgtaag tgtggaatca acactcgata cccgtcaacc 240
tcatctaata taatggtttt ccataggcct ctggtgaccg ttacgttccc cgtgccgtcc 300
tggtcgactt ggagcccggt accatggacg ctgtccgtgc cggtcctttc ggcaagcttt 360
tccgccccga caacttcgtc ttcggtcagt ccggtgctgg taacaactgg gccaagggtc 420
act 423
<210> 10
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Penicillium acidum sp. nov. CNUFC-DLW4-2 (CaM gene [encoding
calmodulin])
<400> 10
ccggtaatag gacaaggatg gcgatggtta gtgcgaccgt cggcgatttt ttaaattcca 60
taccgactgg agtaaaacca ctgagagaac cgaataactg agaccgatcg atctatagga 120
caaatcacca ccaaggagct gggcactgtc atgcgctccc tcggccagaa cccctccgag 180
tccgagcttc aggacatgat caacgaggtc gatgccgaca acaacggcac cattgacttc 240
cctggtacga tttttcttcc gatcgaatga ccccgtgctc cctccggata gatgttaacg 300
tgcggcacag agttcctgac catgatggcc cgtaagatga aggacaccga ctccgaggag 360
gagatccgtg aggccttcaa ggttttcgac cgcgacaaca acggtttcat ttccgctgcc 420
gagctgcgcc ac 432
<210> 11
<211> 934
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Penicillium acidum sp. nov. CNUFC-DLW4-2 (RPB2 gene [encoding RNA
polymerase II])
<400> 11
ttttccgtgt tcttttcacc cgtgtcaccc gtgatctcca gcgttacgtg cagcgctgcg 60
ttgagactgg ccgcgaaatt taccttaacg tgggtcttaa ggctgctaca ctcactggtg 120
gtctcaagta cgccctggct actggtaact ggggagagca gaagaaggct gccagcgcaa 180
aggccggtgt gtctcaagtg ctgagtcgtt acacatatgc ttctacctta tcccatcttc 240
ggcgtaccaa cactcctatc ggacgtgatg gtaagattgc caaacctcgc caacttcaca 300
atactcactg gggtctggtt tgcccggccg aaacacctga aggacaggct tgtggtctgg 360
tcaagaactt ggcacttatg tgctatatca cagtcggaac acctagtgag cccattatcg 420
atttcatgat tcagcgtaac atggaggtcc ttgaagagtt cgaaccgcag gtgacaccaa 480
acgctaccaa ggtgttcgtg aacggtgtgt gggttggtat ccatcgcgat ccctcccacc 540
tggtcaacac tatgcagaac ctccgtcgcc gcaacatgat ttcgaacgaa gtcagtttga 600
ttcgtgacat tcgtgagcga gagttcaaga tctttactga tgctggtcgt gtttgccgtc 660
ctctcttcgt tgttgacaat gaccccaaga gcgaaaatgc gggatctctg gttctcaaca 720
aggaacacat tcgcaagttg gagcaggaca aggacctgcc aaccgacatg gacttggagg 780
aacgccggga gcgctacttc ggatgggagg gtctggttcg atccggtgcc gttgaaattg 840
tggatgcaga ggaggaagag accatcatga tcgtcatgac acccgaagat ctagagatct 900
ccaagcaact gcaagccggc tacaccctgc caac 934
Claims (6)
- 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP).
- 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
- 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품.
- 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP), 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양액 및 페니실리움 애시둠(Penicillium acidum)(기탁번호: KCTC13490BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항진균용 미생물 제제.
- 제 5항에 있어서,
상기 미생물 제제의 항진균 대상은 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 알터나리아 말리 (Alternaria mali), 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 콜레토트리쿰 오비큘레어(Colletotrichum orbiculare), 실린드로카르폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 라이코펄시사이 (Fusariumoxyporum f. sp. lycopersici), 마그나포르테 오리재(Magnaporthe oryzae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 라이조퍼스 스토로니퍼 var. 스토로니퍼(Rhizopus stolonifer var. stolonifer)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항진균용 미생물 제제.
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