KR100523942B1

KR100523942B1 - 신규한 갈색 팽이버섯

Info

Publication number: KR100523942B1
Application number: KR10-2003-0047700A
Authority: KR
Inventors: 김규용; 이상균; 이한승; 윤혜성; 이용준; 안우석
Original assignee: 주식회사 엘지생명과학
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-10-25
Also published as: KR20050008027A

Abstract

본 발명은 트레할로스와 비타민 성분의 함량이 높은 신규한 갈색 팽이버섯을 제공하는바, 이는 일본산 참팽이의 포자 배양 균사체를 세포벽 분해효소로 처리하여 얻은 원형질체를 돌연변이시킨 것으로서, 고삼투압배지에서 배양하여 균체생장속도가 우수한 균사체들 중에서 선별한 것이다. 이러한 신규 갈색 팽이버섯은 모균주인 일본산 참팽이와 비교하여 약 2.5 배의 트레할로스 함량과 약 1.5 배의 비타민의 함량을 가지므로 열에 의한 영양성분의 변화가 적고 보존성이 좋으며 영양성분이 강화되었으며, 종래의 백색 팽이버섯보다는 약 2 배나 높은 비타민 B1 함량을 가질 뿐만 아니라, 항암효과가 우수하고, 생육속도의 증가로 인하여 수확시기가 7 일 단축되어 생산성 향상의 효과도 가진다.

Description

신규한 갈색 팽이버섯 {Novel Brown Flammulina velutipes （ENOKI MUSHROOM）}

본 발명은 신규한 갈색 팽이버섯에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트레할로스 함량과 비타민 함량이 높아 고삼투압 조건에서의 성장이 가능하고 영양성분이 강화되어 식품으로서의 가치가 증가된 신규한 갈색 팽이버섯에 관한 것이다.

팽이버섯(Flammulina velutipes)은 분류학상 담자균아문(Basidiomycota), 주름버섯목(Agaricales), 송이과(Tricholomataceae), 팽나무버섯속(Flammulina)의 5 종 가운데 하나인 벨루티페스(velutipes)로 분류된다. 야생종의 경우, 온대에서 한대에 걸쳐 늦가을부터 초봄까지 저온기에 활엽수의 그루터기나 고목에서 셀루로즈와 헤미설루로즈를 분해하여 영양에 이용하는 목재부후균이다. 야생종의 경우 자실체 색상이 황갈색 내지 밤색을 나타내고, 갓의 직경과 대의 굵기가 크고 대의 길이가 짧다(공원식, 박사학위논문, 건국대학교 대학원, 1997을 참조).

팽이버섯의 인공재배는 1899년 일본에서 시작된 이래 재배법이 계속 발전하였으며, 식용버섯 생산량 중 양송이, 표고 느타리에 이어 4 번째로 많이 생산되고 있다. 한국에서는 1936년에 원목재배방법으로 소개되었고 80년대 후반에 환경조절 재배를 실시하는 병재배가 본격화되었다. 90년대에는 분자생물학적 실험방법이 발달하면서 세계 각지에서 수집한 야생종의 다양한 형질을 이용한 특성의 조사와 여러 가지 돌연변이 유발 등을 통해 우수한 특성을 가진 새로운 균주의 발굴에 대한 노력이 증가되고 있다.

야생의 팽이버섯에 대해 인공재배가 가능해지면서 처음에는 갈색에 대한 선호도가 낮아 품종 개량을 통해 자실체의 색을 백색 내지 담황백색으로 변형하여 재배하였으나, 현재에는 자연식품에 대한 관심과 소비가 늘면서 자실체가 갈색인 팽이버섯에 대한 선호도가 증가하고 있는 추세이다.

더욱이, 버섯의 효능에 대한 새로운 사실들이 밝혀지면서 식용 버섯에 대한 많은 관심들이 집중되고 있는 현재의 실정을 감안할 때, 영양소의 함량이 높고 항암작용이 우수하며 생산성이 높은 버섯에 대한 필요성은 점점 커지고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 버섯 포자를 발아시킨 균사체로부터 얻은 원형질체를 돌연변이시킨 다음 고삼투압조건에서 균사생장속도가 월등히 높은 균주를 선별하여 팽이버섯의 성분 중 트레할로스의 함량을 증가시켜, 열에 의한 영양성분의 변화가 적고 보존성이 좋으며 비타민과 같은 영양성분이 강화된 새로운 품종의 갈색 팽이버섯을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 다양한 실험과 심도있는 연구를 거듭한 끝에, 일본산 참팽이의 자실체를 친주(모균주)로 하는 돌연변이로서, 트레할로스와 비타민 B1, B6 등의 함량이 높은 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)을 개발함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상기 트레할로스는 2 개의 포도당이 각각의 1 번 탄소위치가 서로 결합된 비환원성 이당류로 대부분 알파, 알파-트레할로스 형태로 존재한다. 많은 종류의 생물에 이용되고 있는데 식물에 있어서는 저장 탄수화물로, 곤충에게는 비행을 위한 동력원으로 효모와 대장균은 외부의 물리적 영향에 대한 저항물질로 작용한다(한국공개특허공보 제2000-37638호 참조). 트레할로스는 동일 농도의 설탕에 비해 절반 정도의 당미를 가진 감미료로, 건조 또는 냉동 식품의 안정제로 열응집과 열변성을 방지하는 효과가 있으며 화장품에 있어 보습제로 사용되기도 한다. 또한, 식품 건조나 가공식품 제조시 방향성분의 잔류량을 증가시키므로, 품질 향상을 위한 식품첨가물로 이용되기도 한다(한국공개특허공보 제1999-29104호 참조). 트레할로스의 함량을 증가시킨 농작물의 경우, 가뭄 또는 극한온도에 대한 내성이 강하여 야채류나 과일 장식용 식품의 저장특성이 개선된다고 알려져 있다(대한민국 공개특허정보 1997-704047호를 참조). 본 발명의 갈색 팽이버섯은 트레할로스 함량이 동결건조한 버섯 자실체 1.0 g 당 30 ㎎ 내지 100 ㎎이다.

상기 비타민 B1은 티아민(thiamin)이라고도 하며, 조효소 형태인 TPP(Thiamin pyrophosphate)가 탄수화물 대사를 비롯한 에너지 대사에 참여하고 Na+ channel의 성분으로 신경전도에도 참여한다. 과음, 당뇨병, 인스턴트 식품의 과량 섭취는 결핍증을 유발하여 각기병이나 당대사 장애를 유발하는 것으로 알려져 있으며, 과량섭취시 배설되므로 부작용은 없다. 본 발명의 갈색 팽이버섯은 비타민 B1 함량이 동결건조한 버섯 자실체 1.0 g 당 0.400 ㎎ 내지 1.000 ㎎이다.

상기 비타민 B6는 피리독신(pyridoxine)이라고도 하며, 아미노산과 단백질 대사에 사용되고, 신경전달물질의 합성에 관여하여 심장 질환 예방과 당뇨병성 신경병증과 자폐증, 그리고 파킨슨병에 효능이 있는 것으로 알려진 물질이다.

본 발명에 따른 갈색 팽이버섯은, 야생형 갈색 팽이버섯, 백색 팽이버섯, 및 친주인 일본산 참팽이와도 유전적 차이를 가지는 새로운 균주로서, 한국생명공학연구원(KRIBB: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 수탁번호 "KCTC 10470BP"로 기탁되었다. 본 발명의 갈색 팽이버섯은, URP12R을 이용한 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석에서 850bp 위치에 밴드가 존재하고, selective primer set 4를 사용한 AFLP(Amplified Restriction Fragment Polymorphism) 분석시 지정된 구간(AFLP 구간 4)에서 band A, B, C, D가 존재하는 유전적 특이성을 가진다.

본 발명의 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)은, 일본산 참팽이의 포자를 발아시켜 배양한 균사체를 세포벽 분해효소로 처리하여 얻은 원형질체를 3% EMS(Ethylmethane sulfonic acid)와 반응시키고 분해효소(Lysing enzyme) 첨가 배지에 접종함으로써 형질변환시킨 돌연변이로서, 고삼투압배지에서 배양하였을 때 균체 생장속도가 우수한 균사체들 중에서 선별된 것이다.

본 발명의 보다 자세한 내용을 하기 실시예와 다양한 실험예를 참조하여 설명하지만, 본 발명의 범주가 이들 내용에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예] : 돌연변이 갈색 팽이버섯 균사체(LG1)의 제조

일본의 중부 배양소에서 입수한 일본산 참팽이의 자실체를 친주로 하여 포자를 분리발아시킨 뒤, 감자한천배지(PDA plate)에 셀로판지를 깔고 균사를 중앙에 접종하여 배양한 다음, 배양된 균사체를 모아 0.6M 수크로오스 용액에 첨가한 후, 유리 알맹이(Glass Bead)를 넣고 Vortex로 균사를 분쇄시켰다. 분쇄된 균사체를 원심분리기에서 약 3000 rpm으로 15 분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이러한 상등액에 세포벽 분해효소인 노보짐(Novozym 234) 용액을 5 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 다음, 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 5000 rpm으로 15 분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 새로운 0.6M 수크로오스 용액으로 바꾸어 주어, 안정한 원형질체를 얻었다.

이러한 원형질체에 3% EMS(Ethylmethane sulfonic acid)를 전체 부피의 1/10이 되도록 첨가한 후, 잘 혼합하여 100 분 동안 반응시켰다. 반응 후, 5000 rpm으로 15 분 동안 원심분리하고, 0.6M 수크로오스 용액으로 씻어 주었다. 감자배지에 분해효소(Lysing enzyme)을 100 unit/㎖이 되도록 첨가한 후, 상기 원형질체를 접종하였다. 7 일간 25℃, 150 rpm에서 배양한 다음, 새로운 분해효소(Lysing enzyme) 100 unit/㎖ 첨가 배지에 재접종하여, 확실한 돌연변이가 얻어지도록 하였다. 이러한 배양액을 대두 케이크(soybean cake) 3.0 g/L, 흑설탕(brown sugar) 30.0 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L, KH₂PO₄ 0.5 g/L, 및 우뭇가사리(agar) 20.0 g/L를 포함하고 있는 고체 배지에 접종하여 20℃로 유지되는 항온장치에서 배양하고, 배양된 균총을 상기 고체 배지에서 흑설탕을 제외한 후, 여기에 3 중량%, 5 중량%, 10 중량%의 흑설탕이 함유된 고삼투압 배지에서 배양하여 균체 생장속도가 우수한 균사체들 중에서 선별한 균사체를 "LG1"이라고 명명한 뒤, 한국생명공학연구원(KRIBB: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 10470BP).

[실험예 1] : 분자생물학적 유전분석

본 발명에 따른 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)이 기존의 팽이버섯들(표 1의 균주들)과 모균주인 일본산 참팽이와 유전적으로 차이가 있음을 증명하기 위하여, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석법과 AFLP(Amplified Restriction Fragment Polymorphism) 분석법을 수행하였다. 실험에 사용된 균주들이 하기 표 1에 개시되어 있다.

Entry No.	Strain name	자실체 색깔
1	ASI 4019	갈색
2	ASI 4065	갈색
3	ASI 4074	백색
4	ASI 4031	백색
5	일본산 참팽이	갈색
6	LG1	갈색
7	ASI 4020	갈색
8	ASI 4028	갈색

버섯의 DNA 분리는 졸란과 푹킬라의 방법(M. E. Zolan and P. J. Pukkila, "Inheritance of DNA methylation in Coprinus cinereus", Molecular and Cellular Biology (1986) Vol. 6 No. 1 195-200)을 일부 변형하여 사용하였다. 냉동 건조된 자실체를 유발에서 곱게 마쇄하여 시료 40 ㎎에 600 ㎕의 완충액(1% CTAB, 0.7 M NaCl, 50 mM Tris-KCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% 2-mercaptoethanol)을 넣어 60℃에서 30 분간 반응시켰다. 여기에 동량의 클로로포름/이소아밀알코올 혼합액(24:1)을 넣고, 1.5 ㎖ 튜브에서 탁상 원심분리기(CAT No. 5415C, Eppendorf, USA)를 사용하여, 15000 rpm에서 5 분간 원심분리한 다음, 상등액을 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 동량의 이소프로판올을 가하였다. 침전된 핵산을 탁상 원심분리기에서 15000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 수거한 후, 300 ㎕ TE용액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)에 용해시켰다. 이 시료에 RNA 분해효소인 리보뉴클레아제 100 g/㎖을 가하여 37℃에서 30 분간 처리한 후, 동량의 클로로포름/이소아밀알코올 혼합액(24:1)을 가하고 탁상 원심분리기를 사용하여 원심분리하였다. 상등액을 옮겨 50 ㎕ 7.5 M 아세트산 암모늄을 가하고, 2.5 배량의 에탄올로 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA에 0.2 M 아세트산 암모늄을 가하여 용해시키고, 다시 2 배량의 에탄올에 침전시킨 후, 건조시켜 50 ㎕ TE용액(10 mM Tris-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA)에 용해시켰다. DNA는 분광분석기(GeneQuant pro, Phamacia, USA)로 260 ㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. RAPD 분석법의 PCR 반응조건은 공원식(박사학위논문, 건국대학교 대학원, 1997)의 결과에 따라, 반응액 총량을 20 ㎕ 기준으로 하여, template DNA 100 ng/㎕과 프라이머 150 ng/㎕, MgCl₂ 2.5 mM, dNTP 1.5 mM, Taq polymerase 1 unit로 조정한 후, 나머지는 살균한 증류수를 첨가하였다. 프라이머는 SRILS사의 UniPrimer Kit(Cat No. SS4101)를 사용하였다. 실험에 사용된 프라이머의 종류가 표 2에 개시되어 있다.

Code	염기서열
URP1F	5'-ATCCAAGGTCCGAGACAACC-3'
URP2R	5'-CCCAGCAACTGATCGCACAC-3'
URP2F	5'-GTGTGCGATCAGTTGCTGGG-3'
URP4R	5'-AGGACTCGATAACAGGCTCC-3'
URP6R	5'-GGCAAGCTGGTGGGAGGTAC-3'
URP9F	5'-ATGTGTGCGATCAGTTGCTG-3'
URP12R	5'-GGTGAACAGTGAGATGAACC-3'
URP13R	5'-TACATCGCAAGTGACACAGG-3'
URP17R	5'-AATGTGTGGCAAGCTGGTGG-3'
URP25F	5'-GATGTGTTCTTGGAGCCTGT-3'
URP30F	5'-GGACAAGAAGAGGATGTGGA-3'

PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성시키고 94℃에서 30 초, 35℃에서 30 초, 72℃에서 30 초로 35 사이클을 돌리고 4℃로 유지하였다. PCR 산물은 1.8% 아가로스 겔에서 100 V로 전기영동을 실시한 후, EtBr에 15 분간 염색하여 자외선 램프 상에서 밴드를 관찰하였다. RAPD에 의한 다형성 비교에서 각 프라이머당 12 내지 15개의 게놈 DNA 단편을 형성하였는데 야생형 갈색 팽이버섯인 ASI 4019, 4065는 서로 상동성이 낮았고, 백색 팽이버섯인 ASI 4074, 4031은 서로 상동성이 매우 높아, 11 개의 URP 프라이머를 이용한 RAPD 분석법으로는 유전적 다형성을 보이지 않았다. 일본산 참팽이와 LG1도 유전적 유사도가 매우 높은 것으로 나타났으나, 도 1에서 보는 바와 같이, URP12R을 이용한 실험에서 850bp 위치에 일본산 참팽이에서는 나타나지 않으나 LG1에서 나타나는 밴드가 확인됨으로써, 두 균주 사이에 유전적 차이가 존재함을 알 수 있다.

AFLP 방법은 식물체 등에서 NIL(Near isogenic line)의 분석에 사용되는 방법으로서, 게놈 DNA를 두 가지 제한효소(EcoRI, MseI)로 완전히 절단한 후 여기에 어뎁터(Adapter)를 붙인 후 프리엠플리피케이션(Preamplification) PCR을 수행하고 이어서 선택적 엠플리피케이션(Selective amplification)을 실시한 후 6% 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동을 실시하고 Bioneer사의 silverstar Staining Kit를 이용하여 실버스테이닝(silverstaining)을 실시하였으며 24 시간 건조작업 후 필름에 감광 후 현상하였다. 실험에 사용한 방법은 Life Technology사(CAT No. 10482-016, Gibco BRL, USA)의 AFLP Core Reagent Kit를 사용하였다. 반응조건으로는 프리엠플리피케이션 PCR의 경우 94℃ 30 초, 56℃ 60 초, 72℃ 60 초를 1 사이클로 하는 작업을 20 사이클 실시하였고, 선택적 엠플리피케이션 PCR은 94℃ 30 초, 65℃ 30 초, 72℃ 60 초를 1 사이클로 수행한 후, 어닐링 온도를 0.7℃씩 내리면서 12 사이클을 수행하고, 94℃ 30 초, 56℃ 60 초, 72℃ 60 초를 23 사이클을 수행하였다. 본 실험에 사용된 어뎁터 DNA와 프라이머들의 염기서열이 하기 표 3에, EcoRI 선택적 프라이머(selective primer)와 MseI 선택적 프라이머의 종류들이 하기 표 4에 개시되어 있다.

세부항목	염기서열
EcoRI adapter DNA	5-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5
MseI adapter DNA	5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5
Preamplification primers	5'-GACTGCGTACCAATTC-3'5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'

Code	EcoRI selective primer	MseI selective primer
Primer set 1	5'-GACTGCGTACCAATTCTG-3'	5'-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3'
Primer set 2	5'-GACTGCGTACCAATTCAC-3'	5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3'
Primer set 3	5'-GACTGCGTACCAATTCTG-3'	5'-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3'
Primer set 4	5'-GACTGCGTACCAATTCTT-3'	5'-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3'
Primer set 5	5'-GACTGCGTACCAATTCAG-3'	5'-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3'

PCR 단편들의 크기를 비교분석한 결과 RAPD 분석에서 차이점을 나타내지 않았던 ASI 4074와 4031이 균주간 구분을 할 만큼 차이를 나타내었고, 일본산 참팽이와 LG1의 경우는 primer set 4에서 확연한 차이가 나타나 LG1의 유전적 특이성을 알 수 있었다(도 2 참조).

[실험예 2] : 자실체의 배양

본 발명에 따른 신규한 균사체 LG1의 자실체를 재배하기 위하여, pH 6.5로 맞추어진 대두 케이크(soybean cake) 3.0 g/L, 흑설탕(brown sugar) 30.0 g/L MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L 및 KH₂PO₄ 0.5 g/L의 액체 배지에 접종하여 온도 20℃에서 약 9 일간 진탕배양한 후, 이를 생육 배지가 든 병에 접종하여, 온도 15℃, 습도 75%, 이산화탄소 농도 3000 ppm 이하로 유지되는 배양실에서 22 일간 배양하면서, 표면의 1 내지 2 cm를 긁어내어 자실체의 성장이 일정하도록 하였다. 발이조건으로 13 내지 15℃, 습도 95%, 이산화탄소 농도 1000 ppm 이하에서 10 일 동안 배양하였다. 이후 일정한 생육을 위해 7 내지 8℃에서 약 3 일간 키우고, 4℃, 습도 70 내지 80%에서 1 주일간 배양하여 성장속도를 조절하였다. 그런 다음, 자실체가 쓰러지지 않도록 권지씌우기를 하고, 온도를 다시 올려 7 내지 8℃, 습도 70 내지 80%에서 1 주일 정도 배양하여 수확하였다. 이는 기존의 백색 팽이버섯이 접종 후 수확까지 걸리는 시간이 57 일인 것에 비해, 본 발명의 갈색 팽이버섯(LG1)은 수확까지의 시간이 50 일 정도로서, 약 1 주일 정도 수확시기가 빨라서, 생산성이 그만큼 향상되는 효과를 가져왔다.

[실험예 3] : 당분석

당분석 실험에 앞서, 수분을 제외한 성분의 변화를 최소한으로 하기 위하여, 상기 실험예 2에서 수득한 갈색 팽이버섯(LG1)의 자실체와, 백색 팽이버섯(SH1)의 자실체, 및 모균주인 일본산 참팽이의 자실체를 동결건조하였다. 즉, 포장된 버섯의 기부에서 약 4 ㎝ 정도 위쪽을 잘라내어 동결건조기(FD-81: TOKYO RIKAKIKAI사)를 이용하여 54 시간 동안 건조시켰다. 건조된 시료 500 ㎎을 준비하여 40 ㎖의 80% 에탄올을 넣어 상온에서 2 시간 동안 200 rpm에서 혼합하면서 당을 추출하였다. 이 추출용액을 여과지(Watmann #4 membrane, 미국 와트만사)로 여과하였다. 여과기의 잔여물은 4 회에 걸쳐 50 ㎖의 80% 에탄올로 다시 추출하였다. 여과용액 240 ㎖을 회전진공건조기(Rotary vaccum dryer, 상품명 Rotavapor, 독일 Buchi사)로, 항온조의 온도는 40℃로 유지하고, 응축기(콘덴서)의 온도는 4℃로 유지하였다. 건조된 후에는 4 mM 황산용액 10 ㎖를 넣어서, 건조된 추출물을 용해시킨 다음, 0.2 ㎛ 필터로 여과한 후, 고속액체크로마토그래피(HPLC ; High performance liquid chromatography)로 분석하였다. 고속액체크로마토그래피와 검출기는 미합중국 소재 Agilent technologies사의 Agilent 1100 series와 Agilent 1100RI 검출기를 사용하였으며, 분석컬럼으로는 미합중국 소재 Biorad사의 Aminex HPX-87H, 이동상으로는 4 mM 황산용액을 사용하였으며, 유속은 0.6 ㎖/min이었고, 컬럼의 온도는 30℃를 유지하였다. 이렇게 분석된 결과가 하기 표 5에 개시되어 있다.

당	품종
당	LG1(㎎/g)	SH1(㎎/g)	일본산 참팽이(㎎/g)
D 만니톨	16.6	20.0	24.3
D 트레할로스	41.7	50.6	18.7
L 아라비톨	266.5	236.2	176.1
미오-이노시톨	0.6	0.2	4.2
총량	325.4	307.0	223.3

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 갈색 팽이버섯(LG1)은 트레할로스의 함량이 SH1 보다는 낮지만, 모균주 일본산 참팽이의 18.7 ㎎/g 보다 2.5 배 정도 큼을 알 수 있다.

[실험예 4] : 유리아미노산 분석

상기 실험예 3에서와 같이 동결건조된 자실체 각 500 ㎎을 취하여 액체질소로 냉동시킨 다음, 막자사발을 이용하여 분말로 만들었다. 이러한 분말 200 ㎎과 0.1 N 염산 20 ㎖을 1 시간 정도 혼합한 후, 예비필터가 장착된 0.45 ㎛ CA 필터(미국 코닝사)로 여과시켰다. 농도는 약 10 ㎎/㎖를 나타내었으며, 이를 0.1N 염산으로 희석시켜 0.1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 조절하였다. 유리 아미노산을 보다 정확하게 분석하기 위하여, 유도체화(derivatization)를 실시하였으며, 그 과정은 농도를 0.1 ㎎/㎖으로 조절한 추출액 20 ㎖를 10 분 동안 Speed-Vac(미국 Sarvant사, 상품명 SC110A)으로 건조시킨 후, 미합중국 소재 워터스사에서 추천하는 방법인 AccQ-Tag method(미국 워터스사)에 따라서 제조하였다.

아미노산 분석은 미합중국 소재 Agilent technologies사의 Agilent 1100series를 사용하여 역상 고속 액체크로마토그래피(RP-HPLC: Reverse phase high performance chromatography)로 행하였다. 측정조건은 파장 250 ㎚에서 여기하고 395 ㎚에서 발산하는 형광을 이용하였다. 시료의 아미노산 분리를 위한 컬럼은 미합중국 소재 워터스사의 제품명(WAT052885) AccQ-Tag(상품명) 컬럼을 사용하였다. 온도는 시료를 4℃, 컬럼을 37℃로 유지시켰다. 시료의 양은 표준물질의 경우, 5.0 ㎕, 추출액은 50 ㎕를 넣어주었다. 용매로는 이동상을 A와 B로 구분하고, 유속을 1.0 ㎖/min으로 하여, 시간에 따라 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 차등적으로 공급하였다. 이동상 A로는 AccQ-Tag용리액 A(미국 워터스사)를 사용하였고, 이동상 B로는 60% 아세트니트릴(미국 시그마사)를 사용하였다. 이러한 모든 공정은 미합중국 소재 Agilent technologies사의 켐스테이션(chemstation)이라는 프로그램을 사용하여 수행하였고, 자료분석에는 마이크로소프트사의 엑셀을 사용하였다. LG1과 SH1의 아미노산 함량의 분석 결과가 하기 표 7에 개시되어 있다.

시간(분)	유속(㎖/min)	A(%)	B(%)
0.01	1.0	100	0
0.50	1.0	98	2
15.0	1.0	94	6
19.0	1.0	90	10
32.0	1.0	67	33
33.0	1.0	67	33
34.0	1.0	0	100
37.0	1.0	0	100
38.0	1.0	100	0
50.0	1.0	100	0

아미노산	LG1(㎎/g)	SH1(㎎/g)
아스파르테이트	2.80(±0.06)	6.56(±0.04)
세린	7.10(±0.05)	8.79(±0.05)
글루타메이트	23.52(±0.23)	33.84(±0.08)
글리신	3.56(±0.05)	4.98(±0.05)
히스티딘	24.46(±0.24)	34.83(±0.14)
아르기닌	3.42(±0.05)	4.88(±0.02)
트레오닌	4.17(±0.04)	4.47(±0.03)
알라닌	13.69(±0.14)	8.37(±0.01)
프롤린	17.05(±0.20)	2.41(±0.01)
티로신	4.32(±0.05)	12.15(±0.04)
발린	4.39(±0.06)	4.77(±0.01)
메티오닌	0.62(±0.01)	0.98(±0.01)
라이신	3.00(±0.03)	11.42(±0.02)
이소류신	2.96(±0.04)	2.66(±0.01)
류신	5.01(±0.06)	4.95(±0.01)
페닐알라닌	4.14(±0.05)	12.78(±0.07)
총량	124.21	158.86

상기 표 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 갈색 팽이버섯(LG1)은, 백색 팽이버섯(SH1)과 비교하여, 티로신, 라이신, 페닐알라닌과 같은 아미노산의 함량이 적게 나타남을 알 수 있다.

[실험예 5] : 비타민 분석

상기 실험예 3에서와 같이 동결건조한 자실체 0.5 g을 50 ㎖ V-flask에 넣고, 추출을 위해 pic B7 용액(증류수 100 ㎖, 초산 100 ㎖, 1-Heptasulfonic acid 10.1 g)과 증류수를 1:50으로 섞은 용액을 40 ㎖ 넣은 다음, 20 분간 초음파로 추출하였다. 추출 후 용액의 부피를 50 ㎖에 맞추고, 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 거른 다음, 시험용액으로 사용하였다. 미합중국 소재 Agilent technologies사의 Agilent 1100series를 사용하여 역상 고속 액체크로마토그래피(RP-HPLC)로 행하였다. 파장 270 ㎚에서 측정하였다. 컬럼은 일본 소제 SHISEIDO사의 capcell pak C18을 사용하였다. 이동상으로는 두 가지를 이용했으며, 이동상 A로는 pic B7 용액과 증류수를 1:50으로 섞은 것을 사용하였고, 이동상 B로는 pic B7 용액과 55% 메탄올을 1:50으로 섞은 것을 사용하였다. 초기에 이동상 A만을 넣고, 25 분 후에 이동상 B가 100% 되도록 한 다음, 3 분 동안 이동상 B를 보내고, 30 분이 되었을 때 이동상 A가 100%가 되도록 기울기를 적용하였다. 유속은 모두 0.5 ㎖/min으로 하였다. 그와 같이 하여 얻어진 비타민 함량의 분석 결과가 하기 표 8에 개시되어 있다.

구분	LG1(㎎/100g)	SH1(㎎/100g)	일본산 참팽이(㎎/100g)
비타민 B1	0.651	0.325	0.407
비타민 B6	0.505	0.357	0.440

상기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 갈색 팽이버섯(LG1)은 비타민 B1 함량이 백색 팽이버섯보다는 약 2 배 정도 많았으며, 모균주인 일본산 참팽이보다는 1.5 배 정도 높다.

[실험예 6] : in vitro 항암효과 측정

항암 효과 측정에 널리 사용되는 SRB (sulphorhodamine B) 방법으로 여러 종양 세포주들(대장암세포주, HCT116; 방광암세포주, EJ; 폐암세포주, A549, NCI-H460; 위암세포주, AGS)에서 SH1과 LG1의 in vitro 항암 효과(세포 성장 억제: growth inhibition)를 측정하여 비교하였다. 실험내용을 살펴보면, 96-well plate에 well 당 각 세포를 1x 10³개 심고, 37℃ 항온, 5% 이산화탄소의 인큐베이터에서 2 일간 배양시킨 후, 각 버섯의 추출물을 여러 농도별로 (62.5 mM 500 mM) 종양세포에 처리하였다. 버섯 추출물로 처리된 세포를 4% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정시키고, SRB 용액(1% 아세트산에 녹인 0.4% SRB)으로 실온에서 30 분간 염색한 다음, 10 mM Tris(pH 10.5) 용액으로 추출하여, 530 nm에서 ELIZA reader로 흡광도를 측정하였다. 50%의 종양세포 성장을 억제시키는 버섯 추출물의 농도를 GI₅₀값으로 나타내었다. 하기 표 9에는 상기 각각의 종양 세포주들에 대한 LG1과 SH1의 GI₅₀ Value이 개시되어 있다.

종양세포주	LG1(㎎/㎖)	SH1(㎎/㎖)
HCT116	65	178
EJ	35	59
A549	100	115
AGS	31	139

상기 표 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 실험한 모든 종양 세포주에서 본 발명의 갈색 팽이버섯(LG1)이 SH1에 비해 종양 세포 성장 억제 효과가 큰 것을 알 수 있다. 특히, 위암 세포주와 방광암 세포주에서의 효과가 매우 우수한 것으로 나타났으며, 그 외의 다른 종양 세포들에서도 100 이하의 GI₅₀ 값을 나타내었다.

[실험예 7] : in vivo 항암효과 측정

LG1과 SH1의 in vivo 항암효과를 측정하기 위하여, 면역기능이 결핍된 누드마우스에 방광암 세포(EJ)를 접종하여 방광암 제노그라프트(xenograft)를 만든 후, 각 버섯 추출물에 의한 종양성장의 억제 정도를 측정하였다. 구체적으로는, EJ 세포를 누드마우스 피하 조직에 접종한 후, 접종 다음날부터 각 버섯의 추출물(멸균 증류수에 1 g/㎖로 준비함)을 5000 ㎎/㎏ 용량으로 1 일 3 회 경구로 12 일간 섭취시켰고, 3 일마다 각 동물의 체중과 종양크기를 측정하여 기록하고, 종양성장 억제 정도를 나타내는 색인(index)인 IR(inhibition rate)와 %T/C를 계산하여 종양성장이 억제되는 정도를 수치화하였다. 1 일 1 회 마우스의 임상증상 여부도 관찰하였다. 5000 ㎎/㎏ 용량으로 1 일 3 회로 12 일간의 투여한 결과, LG1과 SH1 모두 36.5%와 25%의 종양성장 억제 효과(IR)를 나타냈다. 그 결과가 도 3에 개시되어 있다.

이상 설명한 바와 같이, 새로운 균주인 본 발명에 따른 갈색 팽이버섯(LG1)은 모균주인 일본산 참팽이와 비교하여 약 2.5 배의 트레할로스 함량과 약 1.5 배의 비타민의 함량을 가지므로 열에 의한 영양성분의 변화가 적고 보존성이 좋으며 영양성분이 강화되었으며, 종래의 백색 팽이버섯보다는 약 2 배나 높은 비타민 B1 함량을 가진다. 또한, 항암효과가 우수하고, 생육속도의 증가로 인하여 수확시기가 7 일 단축되어 생산성 향상의 효과도 가진다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)의 유전자와 기타 다른 팽이버섯들의 유전자간 상동성을 비교하기 위한 RAPD 분석법의 실험결과에 대한 사진이다;

도 2는 본 발명에 따른 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)의 유전자와 기타 다른 팽이버섯들의 유전자간 상동성을 비교하기 위한 AFLP 분석법의 실험결과에 대한 사진이다.

도 3은 본 발명에 따른 신규한 갈색 팽이버섯(LG1)과 종래의 백색 팽이버섯(SH1)의 in vivo 항암효과를 나타내는 그래프이다.

<110> LG Life Sciences Ltd. <120> Novel brown Flammulina velutipes (ENOKI MUSHROOM) <130> LL03KR008P <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP1F (primer) <400> 1 atccaaggtc cgagacaacc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP2R (primer) <400> 2 cccagcaact gatcgcacac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP2F (primer) <400> 3 gtgtgcgatc agttgctggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP4R (primer) <400> 4 aggactcgat aacaggctcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP6R (primer) <400> 5 ggcaagctgg tgggaggtac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP9F (primer) <400> 6 atgtgtgcga tcagttgctg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP12R (primer) <400> 7 ggtgaacagt gagatgaacc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP13R (primer) <400> 8 tacatcgcaa gtgacacagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP17R (primer) <400> 9 aatgtgtggc aagctggtgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP25F (primer) <400> 10 gatgtgttct tggagcctgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URP30F (primer) <400> 11 ggacaagaag aggatgtgga 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI adapter DNA <400> 12 ctcgtagact gcgtacc 17 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI adapter DNA <400> 13 gacgatgagt cctgag 16 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Preamplification primer <400> 14 gactgcgtac caattc 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Preamplification primer <400> 15 gatgagtcct gagtaa 16 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI selective primer (set 1) <400> 16 gactgcgtac caattctg 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI selective primer (set 1) <400> 17 gatgagtcct gagtaacac 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI selective primer (set 2) <400> 18 gactgcgtac caattcac 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI selective primer (set 2) <400> 19 gatgagtcct gagtaactt 19 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI selective primer (set 3) <400> 20 gactgcgtac caattctg 18 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI selective primer (set 3) <400> 21 gatgagtcct gagtaacag 19 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI selective primer (set 4) <400> 22 gactgcgtac caattctt 18 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI selective primer (set 4) <400> 23 gatgagtcct gagtaacac 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI selective primer (set 5) <400> 24 gactgcgtac caattcag 18 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI selective primer (set 5) <400> 25 gatgagtcct gagtaactt 19

Claims

트레할로스와 비타민 함량이 높은 신규한 갈색 팽이버섯(수탁번호: KCTC 10470BP).
제 1 항에 있어서, 상기 팽이버섯은 URP12R을 이용한 RAPD 분석에서 850bp 위치에 밴드가 존재하고 selective primer set 4를 사용한 AFLP 분석시 지정된 구간(AFLP 구간 4)에서 band A, B, C, D가 존재하는 유전적 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 갈색 팽이버섯.
제 1 항에 있어서, 상기 팽이버섯은, 친주인 일본산 참팽이의 포자 배양 균사체의 원형질체를 돌연변이시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 갈색 팽이버섯.
제 1 항에 있어서, 상기 트레할로스 함량이 동결건조한 버섯 자실체 1.0 g 당 30 ㎎ 내지 100 ㎎인 것을 특징으로 하는 갈색 팽이버섯.
제 1 항에 있어서, 상기 비타민의 B1 함량이 동결건조한 버섯 자실체 1.0 g 당 0.400 ㎎ 내지 1.000 ㎎인 것을 특징으로 하는 갈색 팽이버섯.