KR102189644B1 - 신규 균주 카스타네디엘라 카멜리아 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새로운 카스타네디엘라(Castanediella) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)는 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 활성을 갖는 균주로서 이의 배양액 또는 이의 배양 여과액은 세포 내에서 일어나는 특정 활성을 억제하거나 향상시킬 수 있고, 특정 화합물의 생산 능력이 우수하여 약학, 식품, 미용 등 다양한 분야의 조성물에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 카스타네디엘라(Castanediella) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
자연에는 세균, 곰팡이, 효모, 조류 등 다양한 미생물이 존재하고 이들을 이용한 연구가 지속되고 있다. 미생물의 활용 분야는 매우 다양한데 대표적으로 의료 분야의 치료제, 식품 분야의 건강 기능 식품, 미용 분야의 화장료 조성물 등이 있다.
미생물은 현재까지 수십만 종이 발견되고 보고되었으나, 계속하여 새로운 균주가 보고되고 있고 새로운 균주의 발견은 이를 이용한 새로운 용도의 발명에 이르게 될 수 있다. 예를 들어, 유산균인 락토바실러스는 다양한 분야에서 활용되는 대표적인 미생물로서 한국 등록특허 제10-1795499호에서는 사료에 이용하고 있고, 한국 등록특허 제10-1736033호에서는 비만 치료제로 사용하는 등 용도가 매우 다양하다.
본 발명은 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)를 제공하고, 이를 이용한 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 사료, 항균제 등을 포함하는 다양한 형태의 활용 방안을 제공한다.
본 발명은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물, 사료 또는 항균제 등을 제공한다.
본 발명은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)를 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 카스타네디엘라 카멜리아는 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 활성을 갖을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)는 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 활성을 갖는 균주로서 이의 배양액 또는 이의 배양 여과액은 세포 내에서 일어나는 특정 활성을 억제하거나 향상시킬 수 있고, 특정 화합물의 생산 능력이 우수하여 약학, 식품, 미용 등 다양한 분야의 조성물에 활용할 수 있다.
도 1은 ITS-rDNA의 최대 우도 분석(maximum likelihood analysis)에 따른 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFCDLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2 균주의 계통수(Phylogenetic tree)를 보여준다.
도 2는 28SrDNA의 최대 우도 분석(maximum likelihood analysis)에 따른 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2 균주의 계통수(Phylogenetic tree)를 보여준다.
도 3은 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)의 형태학적 구조를 보여준다[a~c는 동백나무 잎의 병변 부위, d는 PDA 배지에서 형성된 콜로니, e 및 f는 분생포자를 생성하는 분생포자 형성 세포(붉은 화살), g~j는 가늘고 부푼 분생포자를 보여준다(노란 화살), 스케일 바(scale bar)는 e,g는 20㎛, f,h,i 및 j는 10㎛이다].
도 4는 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)의 ITS 서열이다.
도 5는 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) 28S rDNA large subunit서열이다.
도 6은 고체 배지에서 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-1의 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 생산을 보여준다.
도 2는 28SrDNA의 최대 우도 분석(maximum likelihood analysis)에 따른 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2 균주의 계통수(Phylogenetic tree)를 보여준다.
도 3은 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)의 형태학적 구조를 보여준다[a~c는 동백나무 잎의 병변 부위, d는 PDA 배지에서 형성된 콜로니, e 및 f는 분생포자를 생성하는 분생포자 형성 세포(붉은 화살), g~j는 가늘고 부푼 분생포자를 보여준다(노란 화살), 스케일 바(scale bar)는 e,g는 20㎛, f,h,i 및 j는 10㎛이다].
도 4는 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)의 ITS 서열이다.
도 5는 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) 28S rDNA large subunit서열이다.
도 6은 고체 배지에서 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-1의 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 생산을 보여준다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)를 제공한다.
본 발명의 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아는 발병된 동백나무(Camellia japonica)의 잎을 채취하여 분리 및 동정되었고, 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) sp. nov CNUFC-DLHBS5-2로 명명하여, 2018년 03월 05일 자로 한국생물자원센터에 기탁번호 KCTC13491BP로 기탁하였다.
본 발명의 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP) 신규 균주는 카스타네디엘라 말리시아나(C. malysiana), 카스타네디엘라 히알로페니실라타(C. hyalopenicillata)및 카스타네디엘라 유칼립티(C. eucalypti)와 연관성이 높으나, 분생포자의 형태가 이들보다 더 가늘고 길어 형태학적으로 이들과 구분될 수 있다.
본 발명의 신규 진균인 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)는 다양한 배지에서 성장이 가능하고, 25℃ 부근에서 최적으로 성장할 수 있고, 10℃ 부근에서도 느리게 성장할 수 있으나, 35℃ 부근에서는 성장할 수 없는 특징이 있다.
종래 보고에 따르면 카스타네디엘라 종(species)에 속하는 진균류 균주에서 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 활성이 보고된 바가 없었다. 그러나, 본 발명의 일 실시예로부터, 본 발명에서 분리한 신규 균주인 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 경우 셀룰라아제 및 아밀라아제의 과생산이 가능하며, 이를 통한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
본 발명의 약학적 조성물은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 건강기능식품은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)는 균체 자체 뿐만 아니라, 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액, 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액을 여과한 배양 여과액도 다양한 생물학적 활성 효과를 가질 수 있다.
배양액 및 배양액의 여과액 외에도 배양액의 동결건조 분말, 배양 여과액의 동결건조 분말 또는 동결건조 분말을 용해한 용액을 여러 분야에서 활용할 수 있다.
본 발명에서 배양액은 균체를 배지에 배양하여 균체가 생성한 물질, 균체 자체 및 배지를 포함할 수 있다.
본 발명에서 배양 여과액은 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액, 상층액을 여과하여 얻은 액체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 조성물, 식품 등의 제조 방법은 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)을 배양 배지에 배양하는 단계 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)을 배양하여 얻은 배양액을 수득하여 제형화 하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 얻어 상등액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제조 방법은 배양액을 원심분리하여 층분리가 일어난 배양액의 상등액을 여과하여 얻은 배양 여과액을 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)을 배양하기 위한 배지는 MEA(Blakeslee's malt extract agar) 배지, OA(oatmeal agar) 배지 및 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 선택되는 배지일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae)(기탁번호: KCTC13491BP)는 약학적 조성물, 건강기능식품, 화장료, 사료, 항생제 등 다양한 분야에서 사용되는 형태로 제조될 수 있다.
일예로, 본 발명에 따른 조성물을 건강기능식품 또는 식품첨가물의 형태로 제조하는 경우 그 형태나 유형은 특별히 제한되지 않으며 활성을 증가시킬 수 있는 타 성분과 혼합하여 제조할 수도 있다. 식품의 종류에도 특별히 제한은 없고, 예를 들어 드링크제, 비타민제, 각종 음료수, 가공 육류, 가공 소세지, 가공 면류, 가공 유지류, 사탕, 껌 등 통상적으로 제조 및 판매되는 식품류를 포함할 수 있다.
바람직하게는 드링크제나 기타 음료 형태 조성물로 제조하는 것이 좋고, 감미료와 같은 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유하여 섭취에 도움을 줄 수 있다. 단당, 과당, 포도당 등 다양한 맛을 탄수화물류를 포함할 수 있고, 솔비톨이나 자일리톨과 같은 당알콜도 포함할 수 있다. 감미제의 예로는 천연 감미제뿐만 아니라 사카린과 같은 합성 감미제 등도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물을 약학 조성물 또는 약제의 형태로 제조하는 경우 그 형태나 유형은 특별히 제한되지 않으며 투여 또는 섭취 방식에 따라 다양한 제형으로 제조할 수 있다. 또한 약학 조성물의 제조시 해당 분야에서 통상적으로 사용하는 부형제, 담체 혹은 희석제도 적절히 더 포함할 수 있다. 제형의 예로는 정제, 시럽, 캡슐, 산제 등의 경구형태 외에도 외용제나 주사용제 등 다양한 제형이 가능할 수 있다. 담체나 부형제 등의 예로는 솔비톨, 자일리톨이나 말티올과 같은 당알코올류, 단당류, 다당류, 젤라틴, 물, 알코올, 전분, 식용가능한 고무류, 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 제제화시 일반적으로 사용하는 습윤제, 계면활성제, 부형제, 충진제나 결합제 등의 종류도 특별히 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1]
진균의 동정
실시예
1-1. 새로운 진균의 동정을 위한 샘플링 및 분리
진도 금골산(Korea, Geumgol Mountain, Jin Island)에서 병변이 발생한 동백나무(Camellia japonica)의 잎(leaf lesion)을 채취하였다. 병징을 보이는 감염된 잎을 길이 1cm, 폭 0.5cm의 작은 조각으로 자르고, 자른 조각을 2 % 차아 염소산나트륨(sodium hypochlorite)으로 1 분 동안 표면 살균한 다음 멸균 증류수(sterile distilled water)로 3 회 세척하였다. 표면이 멸균된 샘플을 에어플루 챔버(air flow chamber)에서 무균 티슈 페이퍼 타월상에 건조시켰다. 10 개의 잎 조각을 습한 흡착지에 놓고 25℃에서 5~7 일간 배양하였다. 곰팡이의 개별 균사를 취해 감자 포도당 한천배지(PDA 배지)(39g potato dextrose agar [Becton, Dickinson, and Co., Sparks, MD, USA]) 플레이트에 놓고 5~7 일간 배양했다. 순수 균주는 PDA 슬랜트 튜브(slant tube)및 -80℃의 20 % 글리세롤에 보관하여 사용하였다.
실시예
1-2. DNA 추출,
PCR
및 시퀀싱(sequencing)
분리 보관한 균주는 게놈 DNA prep kit (Solgent, Daejeon, Korea)를 이용하여 곰팡이 균주의 균사체에서 직접 게놈 DNA를 추출 하였다. rDNA의 ITS(The internal transcribed spacer) 영역 과 큰 단위체(large subunit) 은 각각 ITS4 및 ITS5 (White TJ, Bruns T, Lee S, et al. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: a guideto methods and applications (Innis MA, Gelfand DH, Shinsky TJ, White TJ, eds). Academic Press Inc, New York: 315-32)와 LROR 및 LR5F (Lee HB. Molecular phylogenetic status of Korean strain of Podosphaera xanthii, a causal pathogen of powdery mildew on Japanese thistle(Cirsium japonicum) in Korea. J Microbiol 2012;50: 1075-80) 프라이머 쌍으로 증폭하였다. PCR 증폭 혼합물(총 부피, 20 ㎕)은 DNA 주형(fungal DNA template), 각각 프라이머 5pmol/㎕, Accupower PCR Premix (Bioneer, 대전, 한국)를 포함하였다. Accuprep PCR PurificationKit (Bioneer Corp.)를 사용하여 PCR 산물을 제조자의 지시에 따라 정제하였다. DNA 시퀀싱은 ABI 3700 automated DNA sequencer(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행 하였다. 시퀀싱 결과에 따른 CNUFCDLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2 균주의 서열은 [표 1]에 나타낸 바와 같이 접근 번호에 따라 NCBI 데이터베이스에 기탁하였다.
[표 1]
실시예
1-3. 계통발생분석(Phylogenetic analysis)
시퀀싱 결과와 GenBank 데이터베이스([표 1])에서 얻은 서열 데이터를 Clustal_X v.1.83(Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997) The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research: 4876-82) 및 Bioedit v. 5.0.9.1 소프트웨어(Hall TA. BioEdit: a user- friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser 1999;41:95-8)를 사용하여 분석하였다. 계통 발생 분석은 MEGA 6 소프트웨어(Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, KumarS. 2013. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729)를 사용하여 수행되었다. Kim(Kimura)의 two-parameter correction 방법에 의한 최대 우도 분석(maximum likelihood analysis, ML)을 구축하였고, Diatrype disciformis가 아웃 그룹(outgroup)으로 선정되었다. 각각의 균주에 대한 BLBI(Basic Local Alignment Search Tool)(NCBI) 검색에 의해 서열 일치율을 얻었다. 내부 브랜치의 신뢰성은 1000 부트 스트랩 복제를 사용하는 p-거리 대체 모델을 사용하여 평가하였다.
실시예
1-4. 형태학적 분석
자세한 형태 연구를 위해 분리한 균주를 감자 포도당 한천배지(potato dextrose agar)(Difco PDA, 39g PDA, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA, 1L 탈이온수), 맥아 추출물 한천배지(malt extract agar)(Difco MEA; MEA 33.6g, Becton, Dickinson and Co. 및 탈이온수 1L) 및 오트밀 한천배지(oatmeal agar, OA)(오트밀 30g, 한천 15g 및 탈이온수 1L) 플레이트에서 25℃ 암실에서 7일 동안 배양했다. 배양 후 균주를 락토 페놀 용액(lactophenol solution)(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 마운팅(mounted)하고 DIC 광학 장치(Olympus, Tokyo, Japan)가 장착된 Olympus BX51 현미경으로 관찰하였다.
미세 균질 구조는 주사 전자 현미경(SEM)(Hitachi S4700; Hitachi, Tokyo, Japan)로 관찰하였다. 분리 균주를 0.05M 인산 완충액(pH 7.2) 중 2.5% 파라 포름알데히드 - 글루타르알데히드 paraformaldehyde-glutaraldehyde)에 2시간 동안 고정시킨 후, 카코딜염산(cacodylate) 버퍼(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 세척 하였다. 카코딜염산에 1 시간 동안 희석한 1% 오스뮴테트록시드(Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)에 시료를 고정시킴으로써 세포막을 보존하였다. 샘플을 다시 카코딜염산 버퍼로 세척하고, 에탄올(graded ethanol)(Emsure, Darmstadt, Germany) 및 이소아밀아세테이트(isoamyl acetate)(Junsei Chemical Co. Ltd.)로 탈수시키고 흄 후드(fume hood)에서 건조시켰다. 마지막으로, 샘플을 금으로 스퍼터 코팅하고 한국기초과학연구소에서 Hitachi S4700 FE-SEM(field emission scanning electron microscope)을 사용하여 관찰하였다.
실시예
1-5. 계통발생분석 결과(Phylogenetic analysis)
BLASTn 검색은 CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2의 ITS 서열로 수행하였다([표 1], 실시예 1-2 및 실시예 1-3 참조). BLASTn 검색에 의한 서열 분석 결과, CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2는 가장 근연종인 카스타네디엘라 말리시아나(Castanediella malysiana) (GenBank 접근번호 KX306752)와 93.9%(509/542bp)의 유전자 상동성(homology)을 나타내었다.
28S rDNA 서열 분석 결과로는 CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2 균주가 상기 카스타네디엘라 말리시아나(GenBank 접근번호 KX306781)와 98.5%(814/826bp)의 상동성을 나타내었다. ITS와 28S rDNA서열 분석에 기초하여, 분리 균주 CNUFCDLHBS5-1과 CNUFC-DLHBS5-2는 별개의 클레드(clade)를 형성하여 이것이 새로운 카스타네디엘라(Castanediella)종에 해당(도 1 및 2)한다는 것을 보여 주었다.
실시예
1-6. 형태학적 분석 결과
진균 콜로니는 MEA에서 천천히 자라며 63 내지 65mm의 직경에 도달하였다. 25℃ 조건의 7 일 동안, 처음에는 흰색이었고 회색에서 회황색(isabelline)으로 변하였다. 균사체(Mycelium)는 투명한(hyaline), 격막으로 분할된(septate), 직경 2~4.5㎛의 균사(hyphae)였다. 분생자경(Conidiophores)은 분생 포자 형성 세포(conidiogenous cell)로 감소 하였다. 분생포자 형성 세포는 원통형, 플라스크 모양의 앰플리폼(ampulliform), 구형에서 반구형 또는 불규칙한 모양의 5.5~20.5 Х 2.0~4.5㎛ 크기였다. 분생포자(conidia)는 단생으로 형성되었고, 곧거나 약간 구부러져 있었으며, 격막은 희미하였고, 포자의 중간 부분은 때때로 둥근 부푼 모양을 하였으며, 크기는 18.5~51.5 Х 1.6~2.5㎛ 이었다(도 3).
신규 균주는 분생 포자의 형태에 의해 카스타네디엘라 말리시아나(C. malysiana), 카스타네디엘라 히알로페니실라타(C. hyalopenicillata)및 카스타네디엘라 유칼립티(C. eucalypti)와 구별될 수 있었다. 신규 균주의 분생 포자는 18.5~51.5 Х 1.6~2.5㎛ 크기로 카스타네디엘라 말리시아나(C. malysiana) (18-30 Х 2-3㎛), 카스타네디엘라 히알로페니실라타(C. hyalopenicillata) (14-24 Х 2-3㎛) 및 카스타네디엘라 유칼립티(C. eucalypti)보다 더 가늘며 길고, 분생포자 형성 세포(conidiogenous cell)는 다양한 모양을 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 신규 군주는 OA, PDA, MEA 배지에서 다양한 성장률을 나타냈고 성장 온도 범위도 다양하였다. 최적 성장 온도는 25℃였고, 10℃에서 느린 성장이 관찰되었으며 35℃에서는 성장이 관찰되지 않았다. 25℃에서 평균 성장 정도 OA, PDA, MEA 배지 각각에서 24시간 동안 6.0mm, 8.0mm 및 5.5mm로 성장하였다.
새로운 진균을 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-1 및 CNUFC-DLHBS5-2로 명명하고 이 중 CNUFC-DLHBS5-2를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다.
기탁번호 : KCTC13491BP
기탁일자 : 2018.03.05.
기탁처 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
[
실시예
2]
신규
카스타네디엘라
카멜리아
(
Castanediella
camelliae
) 활성 확인
실시예
2-1.
카스타네디엘라
카멜리아
(
Castanediella
camelliae
)
CNUFC
-DLHBS5-2의 셀룰라아제 및 아밀라아제 활성 측정(
cellulase
and amylase activity assay)
카스타네디엘라 카멜리아 CNUFC-DLHBS5-1의 셀룰라아제 및 아밀라아제 활성은 Hankin 및 Anagnostakis(1975) 및 Oyeleke et al.(2012)에 기술된 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 상세한 측정 방법은 하기와 같다.
아밀라아제 활성: 아밀라아제 활성 측정을 위해, 전분(starch) 분해 능력을 기준으로 사용하였다. 1% 가용성 전분(Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA) 및 증류수 1 L를 함유하는 배지를 사용하였다.
배양 7일 후, 플레이트를 루갈 용액(lugol solution; 요오드, 5g, 요오드화 칼륨, 10g, 증류수 85 mL)에 침수시켰다. 상기 방법을 통해 콜로니 주변에 형성되는 투명한 구역으로부터 전분 분해 활성을 확인할 수 있다.
셀룰라아제 활성: 셀룰라아제 활성의 측정 방법은 아밀라아제 활성 측정 방법으로부터 배지 성분을 포테이토 덱스트로스 한천 + 1% 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC) (Sigma-Aldrich, Co., USA) 및 증류수 1 L를 함유하는 배지를 사용하는 점을 제외하고 동일하게 실시하였다.
그 결과, 카스타네디엘라 카멜리아 CNUFC-DLHBS5-1 균주 배양액은 셀룰라아제 및 아밀라아제 활성을 갖는 것을 확인하였다(표 2, 도 6).
[표 2]
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> Novel fungus Castanediella camelliae and use thereof
<130> P-2017-0305
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 544
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITS region of Castanediella camelliae sp. nov. CNUFC-DLHBS5-2
<400> 1
ggatcattac ggagttttct aaactcccaa ccctatgtga acttaccttt gttgcctcgg 60
cggagcctac ccggtaacga ccccttaatt gggggaacct accctgtagc ccgccggtgg 120
atctccaaac tcttgttatt ataactgtat ctgaatgtct tattttaata agtcaaaact 180
ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta 240
atgtgaattg cagaatttag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccattagt 300
attctagtgg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct taagcctagc ttagtgttgg 360
gagtctacgg aagcggtaac ctagttgccc tgtagttccc gaaatacaac ggcggatctg 420
cggtatcctc tgagcgtagt aaatcttttt ctcgcttttg tcaggtgctg tggctcttgc 480
cgctaaaccc ccaattttta atggttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt 540
aagc 544
<210> 2
<211> 830
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 28S rDNA large subunit of Castanediella camelliae sp. nov.
CNUFC-DLHBS5-2
<400> 2
gccctagtaa cggcgagtga agcggcaaca gctcaaattt gaaatctggc cttctggtcc 60
gaattgtaat ttgtagagga tgcttttggt gcggtacctt ccgagttccc tggaacggga 120
cgccttagag ggtgagagcc ccgtacggtt ggataccaaa cctctgtata gctccttcga 180
cgagtcgagt agtttgggaa tgctgctcta aatgggaggt aaatttcttc taaagctaaa 240
taccggccag agaccgatag cgcacaagta gagtgatcga aagatgaaaa gcactttgaa 300
aagagggtta aatagcacgt gaaattgttg aaagggaagc gtttatgacc agactttttc 360
caggcggatc atccggtgtt ctcaccggtg cacttcgcct ggtggaggcc agcatcggtt 420
tccgtagagg gataaaagct taaggaatgt ggctccctcg ggagtgttat agccttctgt 480
ataatacctt tatggggacc gaggtacgcg cattgcaagg atgctggcgt aatggtcatc 540
aacgacccgt cttgaaacac ggaccaagga gtcgaacatt tatgcgagtg tttgggtgtt 600
aaaccctcac gcgtaatgaa agtgaacgga ggtgagagcc gcaaggtgca tcatcgaccg 660
atcctgatgt cttcggatgg atttgagtaa gagcataact gttcggaccc gaaagatggt 720
gaactatgcg tggatagggt gaagccagag gaaactctgg tggaggctcg cagcggttct 780
gacgtgcaaa tcgatcgtca aatctgcgca tgggggcgaa agactaatcg 830
Claims (5)
- 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-2(기탁번호: KCTC13491BP), 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-2(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양액 및 카스타네디엘라 카멜리아(Castanediella camelliae) CNUFC-DLHBS5-2(기탁번호: KCTC13491BP)의 배양 여과액으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 셀룰라아제(cellulase) 및 아밀라아제(amylase) 활성용 조성물.
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Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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-
2019
- 2019-03-11 KR KR1020190027353A patent/KR102189644B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 국립생물자원관 자생생물 조사발굴 연구 보고서 (2017.11.29.) 1부.* |
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