KR20190103996A - 신규 항-tigit 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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이준형
이나래
정은정
박영봉
장낙호
이은정
김기홍
최성현
최병현
박주영
송무영
이종서
김규태
고봉국
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Abstract

본 발명은 종양면역 억제인자인 TIGIT(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif [ITIM] domain)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물과 그의 용도에 대한 것이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 바람직하게는 암 또는 종양 치료용도로 사용될 수 있다.

Description

신규 항-TIGIT 항체 및 그의 용도{Anti-TIGIT Antibodies and Uses Thereof}
본 발명은 종양면역 억제인자인 TIGIT(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif [ITIM] domain)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물과 그의 용도에 대한 것이다.
본 발명에 따른 TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 바람직하게는 암 또는 종양 치료용도로 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
우리 몸의 면역 시스템(immune system)은 외부에서 유입되는 병원균이나 바이러스(항원) 및 암세포 등의 비정상적인 세포를 공격하여 우리 몸을 보호하는 기능을 수행한다. 즉 우리 몸의 면역시스템의 주요 기능은 몸 안의 정상세포와, 외부 침입자 및 암세포 등의 비정상적인 세포를 구분하여, 공격할지 여부를 결정한다. 우리 몸의 면역 시스템에서 암세포를 구분해 낼 수 있는 대표적인 면역세포는 T-세포로서, 건강한 사람은 몸에서 암 세포가 발생하더라도 면역반응을 통해 효과적으로 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서 암의 진행은 면역체계에 이상이 있음을 의미한다.
우리 몸의 면역 시스템은 T-세포의 과다증식으로 인한 과다면역 반응을 억제하기 위한 면역검문 체계를 가지고 있다. 이러한 면역검문 체계를 면역관문(immune checkpoint)이라고 하며, 면역관문에 관여되는 단백질들을 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)이라고 한다.
본질적으로 면역관문은 T-세포의 과활성화 및/또는 과다증식에 의한 과잉면역 반응을 억제하는 기능을 수행하지만, 암 세포는 이런 면역관문을 악용하여 T-세포가 자신을 공격하지 못하도록 함으로써 면역 시스템에 의한 공격에서 벗어나게 되며, 궁극적으로 암이 진행되는 결과를 초래한다.
이러한 면역관문의 억제제를 이용하여, 암 등의 질환을 치료할 수 있음은 이미 해당 기술분야에 알려져 있으며, 현재 면역관문 단백질을 표적으로 하는 항체 의약품이 시판 중에 있고, 다양한 면역관문 억제제가 개발 중에 있다.
최초로 개발된 면역관문 억제제 형태의 치료제는 면역관문 수용체인 CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4) 특이적인 단클론 항체인 이필리무맙(ipilimumab)으로, 전이성 악성 흑색종에서 그 효과를 보여 주었다. 이어서, PD-1(programmed cell death-1)과 PD-1에 대한 리간드인 PD-L1(programmed death ligand-1)에 특이적인 단클론 항체들이 개발되고 있으며, 대표적인 것들로는 니볼루맘(nivolumab), 펨브롤리주맘(pembrolizumab), 아벨루맙(avelumab), 아테졸리주맙(atezolizumab)과 둘바루맙(durvalumab) 등이 있다. PD-1 또는 PD-L1 억제제는 악성 흑색종뿐만 아니라 그 효과가 다양한 종양들에서 나타난다.
TIGIT(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif [ITIM] domain)은 주로 활성화된 T 세포 및 NK (natural killer) 세포에서 발현되는 수용체로서, 넓은 의미에서의 면역관문 단백질에 포함된다.
TIGIT은 암세포 표면의 CD155, CD112 등의 리간드와 결합하여 면역세포의 활성화를 저해한다. 이러한 TIGIT을 표적으로 하는 항체는 PD-1/PD-L1 차단 항체와 함께 CD8+ T 세포를 활성화를 유도하여 종양이나 바이러스를 효과적으로 제거하는 것으로 보고되었다.
현재까지 수 종류의 항-TIGIT 항체가 보고된 바 있지만(US 9,713,641B, US 2016/0176963A, US 9,499,596B 등), 그 구체적인 기작에 대한 연구는 아직 미미한 실정일 뿐 아니라, 실제 치료제로 사용가능한 정도의 효력(efficacy)을 가지는 항체가 개발되고 있지는 못한 실정으로, 여전히 높은 수준의 효력을 가지는 TIGIT 특이적 항체에 대한 요구는 여전히 절실한 상황이다.
이에, 본 발명자들은, TIGIT에 특이적으로 결합하는 신규 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 암세포에서 과발현되는 TIGIT에 대한 높은 친화력을 갖는 상기 신규 항-TIGIT 항체를 발명하였으며, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효율적인 항암 치료제로서의 가능성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
미국 등록특허공보 제9,713,641호 (2017. 7. 25.) 미국 공개특허공보 제2016/0176963호 (2016. 6. 23.) 미국 등록특허공보 제9,499,596호 (2016. 11. 22.)
본 발명의 목적은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 신규 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 특히 면역 항암 치료제로서의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다른 암 치료제를 포함하는 암 또는 종양 치료용 병용 투여 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 이를 이용한 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TIGIT에 특이적으로 결합하는 신규한 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체, 또는 항원 결합 단편은
서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR(complementarity determining region, 상보성 결정영역)1;
서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역과,
서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1;
서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체, 또는 항원 결합 단편은 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 항원 결합 단편은 매우 특이적이고, 강력하게 TIGIT에 결합하며, 기존의 항-TIGIT 항체들에 비해 매우 우수한 치료 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 면역 세포 활성화를 통한 항암 면역 치료제로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항-TIGIT 항체와 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 화학 의약품 및 기타 다른 항암 치료제와 병용 치료 요법 등에 활용이 가능하다.
도 1은 초기 선별된 항-TIGIT 항체들의 종간 교차반응성(species cross reactivity)을 확인하기 위해 인간(human), 마우스(mouse) 및 레서스(rhesus)의 TIGIT 항원에 대한 항-TIGIT 항체들의 결합여부를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 초기 선별된 항-TIGIT 항체들의 TIGIT 슈퍼 패밀리(super-family)간 특이성을 확인하기 위해 TIGIT, CD96, CD155, CD112, CD113, CD226에 대한 결합여부를 ELISA로 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 초기 선별된 항-TIGIT 항체들의 세포표면에 발현된 TIGIT 항원에 대한 결합여부를 확인하기 위해 형광유세포분석기를 이용해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 항-TIGIT 항체와 TIGIT 단백질의 세포 표면에서의 결합 정도를 형광유세포분석기를 이용해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 항-TIGIT 항체 처리에 따른 TIGIT과 CD155간의 결합을 억제하는 정도를 보여주는 블로케이드 분석(blockade assay) 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 TIGIT이 과발현된 NK92 세포주와 PVR이 과발현된 HeLa 세포주를 공생배양 한 조건에서, 항-TIGIT 항체 처리에 따른 NK92 세포주에서 유래된 IFN-g 분비량을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 7은 TIGIT이 과발현된 NK92 세포주와 PVR이 과발현된 HeLa 세포주를 공생배양한 조건에서, 항-TIGIT 항체 처리에 따른 NK92 세포주의 NKG2D 발현을 형광유세포분석기를 이용해 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 in vivo 효력을 평가하기 위해, 평가 시험의 종료일 종양체적을 나타낸 그래프로, CT26 종양 모델에서의 효능을 보여주는 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 일 실시예에 따른 항-TIGIT 항체의 in vivo 용량별 단독 및 항-PD-L1 항체와의 병용효력을 평가하기 위해, 평가 시험의 종료일 종양체적을 나타낸 그래프로, CT26 종양 모델에서의 효능을 보여주는 결과를 나타낸 도면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역과,
서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 바람직하게는
(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역; 과
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역;
(2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역; 과
서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역;
(3) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 과
서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
(4) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 과
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;
을 포함하는 것을 특징으로 한다.
T 세포나 NK 세포, 수지상 세포 같은 면역 세포의 표면에 발현되는 TIGIT은 암세포 표면의 PVR(poliovirus receptor, CD155)과 결합하여 면역 세포의 활성을 저해한다. 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT의 CD155 결합부위에 특이적으로 결합하여 TIGIT/CD155 상호작용에 의한 신호전달을 저해하여, 면역 세포의 활성화를 유도하고, 종양 세포의 성장을 저해하는 기능을 가진다. CD155는 인간, 원숭이, 마우스, 래트 등의 다양한 포유동물의 세포 표면에서 발현되며, TIGIT과의 결합을 통해 면역 세포의 활성화를 억제하는 신호를 전달한다.
즉, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TIGIT/CD155 상호작용에 의한 신호전달을 저해하며, 이에 따라 암세포에 의한 면역 세포들의 억제 신호가 상쇄되고, 면역 반응의 재활성화를 유도함으로써 효과적으로 암세포를 공격하게 하여 항암 효과를 나타내게 되며, 궁극적으로 종양면역 억제인자인 TIGIT을 표적으로 하는 면역항암 치료용도로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암을 가진 개체에서 TIGIT의 발현 또는 활성을 감소시키거나 억제하여 T 세포나 NK 세포의 지속적인 항암 반응을 유도함으로써 암을 치료하는 효과를 가진다.
본 발명에서 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원으로 작용하는 TIGIT 단백질은 면역 세포의 활성 억제와 밀접한 관련이 있으며, 면역 세포의 표면에 존재하는 막 단백질로서, 면역 세포의 보조 억제 수용체로서 작용한다. 상기 TIGIT은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 레트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "TIGIT"는 세포에 의해 천연적으로 발현되는, TIGIT의 임의의 변이체, 이소형 및 종 상동체를 총칭하는 개념이며, 바람직하게는 인간의 TIGIT를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 다른 동물 등의 TIGIT를 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체는 인간 TIGIT (hTIGIT; 서열번호 21; NCBI accession No. NP_776160)의 CD155 결합 부위 또는 결합을 저해하는 부위에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열 및 가변영역의 서열은 표 1 내지 표 4에 기재된 바와 같다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1 CDRH2 CDRH3
SYYMS
(서열번호 1)		 SIGSGSPSSTYYADSVKG
(서열번호 3)		 SSYSGGNGYYYYAYAFDY
(서열번호 5)
NYAMS
(서열번호 2)		 GISPSGSSIYYADSVQG
(서열번호 4)		 AIRTCSLSHCYYYYGMDV
(서열번호 6)
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1 CDRL2 CDRL3
RASQSVSSSYLA
(서열번호 7)		 GASSRAT
(서열번호 9)		 QQGYHRYAT
(서열번호 11)
SSSSSNIGSNAVN
(서열번호 8)		 YDNQRPS
(서열번호 10)		 ATWDYSLSGYV
(서열번호 12)
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 (밑줄로 표시된 부분이 CDR 영역)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSIGSGSPSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSYSGGNGYYYYAYAFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISPSGSSIYYADSVQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIRTCSLSHCYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 14)
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 (밑줄로 표시된 부분이 CDR 영역)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYHRYATFGQGTKVEIK (서열번호 15)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSSSSSNIGSNAVNWYQQLPGTAPKLLIYYDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVL (서열번호 16)
한편, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3과 각각 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하며, 본 발명에 따른 TIGIT와 동일한 특성을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 권리범위에 포함되며,
서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하며, 본 발명에 따른 TIGIT와 동일한 특성을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 권리범위에 포함된다.
또한, 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3과 각각 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며, 본 발명에 따른 TIGIT와 동일한 특성을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 권리범위에 포함되며,
서열번호 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 99%의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며, 본 발명에 따른 TIGIT와 동일한 특성을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
본 명세서에서의 용어 "TIGIT 특이적 항체"는 TIGIT에 결합하여 TIGIT의 생물학적 활성의 억제를 초래하는 항체를 의미하며, "항-TIGIT 항체"와 혼용되어 사용된다.
본 명세서에서의 "항-TIGIT 항체"는 다클론 항체(polyclonal antibody) 및 단클론 항체(단일클론 항체, monoclonal antibody)를 모두 포함하는 개념으로, 바람직하게는 단클론 항체이며, 온전한 전체 항체(whole antibody) 형태를 가질 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조로서, 불변영역을 포함하는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG 형태를 포함하는 개념으로, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체는 인간 항체 라이브러리(human antibody library)로부터 선별된 완전 인간 항체(fully human antibody)인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체의 “항원 결합 단편”은 항-TIGIT 항체의 항원, 즉 TIGIT와 결합할 수 있는 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv (scFv)2, scFv-Fc, 및 Fv 등을 포함하는 개념으로, 본 명세서에서는“항체 단편”과 동일한 의미로 혼용되어 사용된다.
상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
상기 Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 이의 가변영역을 코딩하는 DNA 및 경쇄 또는 이의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 주형으로 하고, 프라이머쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)법에 의해 증폭시키고, 펩티드 링커를 코딩하는 DNA와 양 말단이 각각 중쇄 또는 이의 가변영역 및 경쇄 또는 이의 가변영역과 연결되도록 하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭)을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴드화(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기 영동 및 해당 기술분야에 잘 알려진 기타의 것을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 기타 오염 물질, 예를 들어 다른 세포의 핵산 또는 단백질로부터 정제되어 나올 경우 "단리"되거나 "실질적으로 순수하게 된" 것이다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위하여, 부분적이거나 전장인 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술(예를 들어 PCR 증폭 또는 목적 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용한 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있으며, DNA가 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 결합"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 항체를 코딩하는 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주세포와 상용성 있도록 선택된다. 항체의 경쇄 유전자 및 항체의 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되거나, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체는 표준 방법(예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 경우에 따라서, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포로부터의 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 프레임에 맞게 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 결합되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 면역글로불린 외 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절서열을 지닌다. "조절서열"은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음을 인식할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로는 본 발명에 따른 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다.
또한 식물이나 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포가 사용될 수 있다.
상기 핵산 또는 상기 벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2℃ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 숙주세포를 배양하여 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우 항체는 숙주세포에서 항체가 발현되게 하기에 충분한 기간 동안, 또는 더 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 항체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
경우에 따라서, 발현된 항체는 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 상기 항체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 프로틴 A 컬럼, 프로틴 G 컬럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
용어 "암" 또는 "종양"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.
본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 이러한 암의 예로는 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암은 대장암, 유방암, 폐암 및 신장암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 치료 유효량의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. "제약상(약학적으로) 허용되는 담체"는 제제를 제제화하거나 또는 안정화시키는 것을 돕기 위해서 활성 성분에 추가될 수 있는 물질이고, 환자에게 유의한 해로운 독성 효과를 야기하지 않는다.
상기 담체는 환자를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 다른 담체는 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 치료 유효량의 1종 이상의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제를 즉각 투여용(extemporaneous)으로 제조하기 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 조성물은 바람직하게는 비경구 주사용으로 제제화된다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 주문된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 멸균 주사가능한 용액제는 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터의 기타 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클로 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 일부 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 이것의 미리 멸균-여과시킨 용액으로부터 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 특별하게 한정되지는 않으나, 환자의 건강 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약제의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 변경될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하루에 1회량 또는 다회 용량으로 쥐(rat), 생쥐(mouse), 가축, 인간 등을 포함하는 포유류 내로 전형적으로 허용된 경로, 예를 들면, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 형태로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 필요에 따라 볼루스로서 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Fab 단편으로 제시되는 본 발명의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 볼루스 투여는 0.01μg/kg 체중 내지 100mg/kg 체중, 바람직하게는 1μg/kg 체중 내지 10mg/kg 체중의 양일 수 있다.
본 명세서에서 "치료 유효량"은 치료가 필요한 환자에게 생체 내 측정가능한 이점을 야기하는데 요구되는, 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 조합물의 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 조성물의 성분 및 물리적 특징, 의도된 환자 집단, 개개의 환자의 고려사항 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 인자에 따라 달라질 것이고 통상의 기술자가 쉽게 결정할 수 있다. 이들 요인들을 완전하게 고려할 때, 부작용 없이 최대의 효과를 얻기에 충분한 최소량을 투여하는 것이 중요하며, 이 복용량은 분야의 전문가에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
약학적으로 효과적인 양은 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에서, "개체"는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다.
본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 사용하는 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다른 암 치료제를 포함하는 암 또는 종양 치료용 병용 투여 조성물에 관한 것이다.
상기 다른 암 치료제는 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외에, 암 치료를 위해 사용될 수 있는 모든 치료제를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 암 치료제는 면역관문억제제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문억제제는 immune checkpoint inhibitor 또는 checkpoint inhibitor를 의미하고, 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 구체적으로는 이필리무맵(Ipilimumab), 니볼루맵(Nivolumab), 펨브로리주멥(Pembrolizumab), 아테조리주맵(Atezolizumab), 아베루맵(Avelumab) 또는 더바루맵(Durvalumab) 등이 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"병용"은 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 다른 암 치료제 각각이 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로, 통상의 기술자의 범위 내 적절한 유효량의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항-PD-L1 항체와 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체를 병용투여한 경우, 종양의 성장을 더욱 억제하는 것을 확인하였다.
상기 병용 투여 조성물은 항-TIGIT 항체를 포함하고, 이와 관련된 구성은 앞서 설명한 암의 예방 또는 치료용 조성물에 포함된 구성과 동일하므로 각 구성에 대한 설명은 병용 투여용 조성물에서도 동일하게 적용된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통하여 약물에 결합될 수 있다. 상기 링커는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약물 사이를 연결하는 부위로, 예를 들어 상기 링커는 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 링커의 절단을 통해 방출될 수 있도록 한다.
상기 링커는 세포 내 환경 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있으며, 예를 들어 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커일 수 있다. 일반적으로 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 상기 절단제는 카텝신 B 및 카텝신 D, 플라스민을 포함할 수 있으며, 펩타이드를 가수분해 하여 약물을 표적 세포 내로 방출할 수 있도록 한다.
상기 펩타이드 링커는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있고, 이는 암 조직에서 과발현되며, 예를 들어 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커가 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커는 예를 들어 세포 내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로, Val-Cit 링커이거나 Phe-Lys 링커일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드 (cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다.
상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.
또한, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기 (maleimidocaproyl)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.
상기 항체-약물 접합체에서의 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있으며, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA (miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제 및 항바이러스제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 약물에는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리도마이드, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2- 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin; 미토마이신 A, 미토마이신 C), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레블리미드(Revlimid), 탈로미드(thalomid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 항- TIGIT 항체의 선별
1.1 항- TIGIT 인간항체 scFv와 Fab 클론 선별
TIGIT에 특이적으로 결합하는 항체는 scFv와 Fab 인간항체 라이브러리를 이용하여 파지 디스플레이(phage display) 스크리닝(screening) 방법으로 선별하였다. scFv library는 “Construction of a Large Synthetic Human scFv Library with Six Diversified CDRs and High Functional Diversity(Yang HY et al Molecules and Cells 27, 225-235)”에 개시된 내용을 참고하여 제조하였고, Fab library는 한국등록특허 제1694832호에 개시된 내용을 참고하여 제조하였다. Phage display screening은 총 4차 라운드까지 진행하였으며, 라운드 차수가 진행될 때마다 항원양은 줄이고 wash 횟수는 늘리는 조건으로 진행하였다. 1차와 3차는 인간 TIGIT-ECD-Fc 항원을, 2차와 4차는 mouse TIGIT-ECD-Fc 항원을 이용하는 항원교차 방식으로 진행하였다. PBS buffer에 희석한 TIGIT 항원 20 μg을 immune tube에 넣고 4℃에서 overnight incubation하여 tube의 표면에 coating하였다. TIGIT 항원이 coating된 immune tube에 PBS-T/BSA(5%) 용액을 넣고 상온에서 1시간 동안 blocking한 다음, scFv 또는 Fab 인간항체 라이브러리 phage를 각각 4.7 x 1012과 1.2 x 1013의 양만큼 넣어주고 상온에서 2시간 동안 incubation하여 TIGIT 항원과 결합시켰다. PBST (pH 7.4) 용액으로 wash하여 TIGIT 항원에 결합하지 않는 phage를 제거한 다음, 0.1 M Glycine (pH 3.0) 용액을 사용하여 phage를 elution하고, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액으로 중화시켰다. Elution된 phage는 OD600 0.5의 ER2537 E. coli에 37℃에서 infection한 후, VCSM13 helper phage를 넣어 증폭시키고 다음 screening 라운드에 사용하였다. 각 panning screening 라운드마다 phage의 수를 확인하고, 넣어준 총 phage수와 elution된 phage 수의 비율을 확인함으로써, panning 차수가 늘어남에 따라 TIGIT 항원에 결합하는 phage의 수가 늘어남을 확인하였다.
각 panning 라운드의 결과물에서 얻은 phage clone들을 ER2537 E. coli strain에 infection한 다음, ampicillin 플레이트에 도말해 colony 형태로 얻은 후, periplasmic extract를 이용하여 TIGIT 항원에 대한 결합특이성을 다음과 같은 ELISA방법으로 확인하였다. SB/carbenicillin (50 μg/mL) media를 120 μL씩 분주한 96-well 플레이트에 colony를 picking해서 접종한 다음, OD600이0.6이 될 때까지 37℃ plate shaker 2 speed 조건으로 culture하였다. SB/carbenicillin (50 μg/mL)/IPTG 5 mM media를 30 μL씩 넣고, 37℃ plate shaker 2 speed 조건으로 overnight incubation하였다. Sample을 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 생성된 pellet을 BBS solution (200 mM boric acid, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) 100 μL를 넣고 잘 풀어준 다음, 4 ℃에서 1시간 동안 incubation하였다. 3,000 rpm에서 20분간 원심분리한 다음, 상층액만을 분리하여 periplasmic extract를 얻었다. Periplasmic extract 80 μL와 TBST(5% BSA) 80 μL 섞은 다음, 상온에서 1시간 동안 blocking하였다. Human IgG, human TIGIT-Fc, mouse TIGIT-Fc 항원이 coating된 96-well 플레이트에 blocking시킨 periplasmic extract를 well당 80 μL 넣어준 다음, 실온에서 1시간 동안 incubation하여 항체가 항원에 결합하도록 하였다. 이후 TBST로 3번 wash 후 anti-HA-HRP (Roche)를 1:3,000으로 희석한 TBST(5% BSA) solution을 well당 30 μL씩 넣고 실온에서 1시간 동안 incubation하였다. TBST로 3번 wash한 후 TMB solution을 well당 30 μL씩 넣고 발색하였다. 1 N H2SO4로 반응을 멈춘 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Antibody periplasmic extract를 이용한 ELISA screening을 통해 TIGIT 항원에 대한 결합성이 있는 항체클론으로 scFv library에서는 14종(S02, S03, S04, S05, S06, S11, S12, S14, S19, S32, S39, S43, S62, S64), Fab library에서는 4종(F01, F02, F03, F04)을 각각 선별하였다.
1.2 선별된 scFv와 Fab 클론의 IgG 클로닝과 항체 생산, 정제
선별된 scFv와 Fab 클론을 IgG 형태로 생산하기 위해 각각의 가변부위 유전자를 IgG1 항체의 불변부위 유전자를 포함하고 있는 발현벡터를 이용하여 유전자 클로닝을 진행하였다. scFv와 Fab 클론으로부터 PCR 증폭된 중쇄사슬과 경쇄사슬의 가변부위 유전자는 각각 ClaI (NEB)과 NheI (NEB) 그리고 ClaI과 BsiWI(NEB) 조합의 제한효소를 각각 이용하여 클로닝함으로써 IgG 형태로 발현될 수 있는 벡터를 제작하였다. 중쇄사슬은 pcDNA3.3 (Invitrogen), 경쇄사슬은 pOptiVEC (Invitrogen) 벡터를 이용하였다. IgG 형태의 항체 생산은 293F cell line (Invitrogen)을 이용하여 transient transfection 방법으로 진행하였다. IgG 형태가 클로닝된 pcDNA3.3과 pOptiVEC 벡터 DNA를 293F cell에transfection한 후 6일차에 세포배양액을 harvest하여 정제에 사용하였다. 항체 배양액에서 항체를 정제하기 위해 Protein A resin을 이용한 Fc 정제를 수행하였다. 1X PBS (pH 7.4)로 equilibration한 MabSelect SuRe Protein A resin(GE Healthcare)에 항체 배양액을 1 mL/min의 속도로 흘려 binding시켰다. 항체의 binding이 완료된 후, resin을 1X PBS (pH 7.4)로 1차 wash하고, 0.1 M Glycine (pH 5.5) 용액을 사용하여 2차 wash를 진행하였다. 최종 항체를 얻기 위해 0.1 M Glycine (pH 3.5) 용액을 사용하여 elution을 진행하였고, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액을 이용하여 중화하였다.
Phage display screening으로 선별된 항-TIGIT 항체들의 species cross reactivity를 확인하기 위해 human TIGIT (R&D Systems), mouse TIGIT (R&D Systems), 그리고 rhesus TIGIT 항원에 대한 결합여부를 ELISA로 확인하였다. Rhesus TIGIT 항원은 Rhesus TIGIT 유전자 서열 (NCBI accession No. XP_014985303.1)을 참고하여 유전자합성을 통해 Fc-fusion 형태로 발현, 정제하여 사용하였다. PBS에 1 mg/mL 농도로 희석된 3종의 TIGIT 항원을 각각 96-well 플레이트에 well당 30 μL씩 넣고 4℃에서 overnight incubation하여 coating한 다음, 선별된 항체를 각각 30 ng씩 처리하여 TIGIT 항원에 결합시켰다. 1:3,000으로 희석한 TBST(5% BSA) 용액을 well당 30 μL씩 넣고 상온에서 1시간 동안 incubation하였다. TBST로 3번 wash한 후 TMB 용액을 well당 30 μL씩 넣고 발색하였다. 1 N H2SO4로 반응을 멈춘 다음 absorbance 450 nm에서 발색 정도를 확인하였다. 선별된 항체들의 3종 TIGIT 항원에 대한 species cross reactivity를 확인하였다(도 1). 이를 통해서 시험에 사용된 항체들 대부분이 인간 TIGIT과 mouse TIGIT에 모두 결합함을 확인하였다.
Phage display screening으로 선별된 항-TIGIT 항체들의 TIGIT 특이성을 확인하기 위해 TIGIT의 super-family인 CD96 (Sinobiological), CD155 (Sinobiological), CD112 (R&D Systems), CD113 (R&D Systems), CD226 (R&D Systems) 항원에 대한 결합여부를 ELISA로 확인하였다. TIGIT을 포함한 항원 6종을 96-well 플레이트에 well당 100 ng씩 coating한 다음, 선별된 항체를 각각 30 ng씩 처리하고 상온에서 1시간 동안 incubation하였다. TBST로 3회 wash한 후, anti-human Fab-HRP secondary antibody (Jackson)를 1:3,000으로 희석한 TBST(5% BSA) 용액을 well당 30 μL씩 넣고 상온에서 1시간 동안 incubation하였다. TBST로 3번 wash한 후 TMB 용액을 well당 30 μL씩 넣고 발색하였다. 1 N H2SO4로 반응을 멈춘 다음 absorbance 450 nm에서 발색 정도를 확인하였다. 선별된 항체들의 6종 항원에 대한 결합여부를 측정한 결과, 모든 항체가 TIGIT 항원에만 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 2).
마지막으로, 세포표면에 발현된 TIGIT 항원에 대한 선별된 항체들의 결합여부를 확인하기 위해, 사람 TIGIT 단백질을 과발현하는 CHO-S 세포주(CHO-hTIGIT)를 이용하여 FACS 분석을 진행하였다. CHO-hTIGIT 세포주는 lentiviral 벡터를 이용하여 full-length 인간 TIGIT 유전자 CHO-S 세포에 transduction시킨 다음, blasticidin antibiotics로 인간 TIGIT을 과발현하는 CHO세포만을 선별하는 방법으로 제작하였다. 제작된 CHO-hTIGIT 세포주를 ice-cold PBS로 wash하고 5 x 104개의 세포를 tube에 옮긴 다음, IgG 형태로 준비된 항체들을 각각 1 μg씩 처리하고 얼음 위에서 1시간 동안 incubation하였다. 이후 anti-human IgG FITC secondary 항체 (Invitrogen) 를 1 μg씩 처리하고 얼음 위에서 1시간 동안 incubation하였다. 세포들을 ice-cold PBS로 wash한 다음 FACS 분석하여 세포표면에 발현된 사람 TIGIT 항원에 대한 항체의 결합여부를 확인하였다(도 3). 양성 대조군으로 사용한 10A7 항체는 햄스터 유래 항 인간, 마우스 교차결합이 가능한 항체로, US 2015/0216970 특허에 기술된 서열을 기반으로 하여 가변영역을 마우스 IgG2a의 constant region을 갖는 항체의 형태로 유전자를 제작하여 자체 생산하였다. 사람 TIGIT 항원에 대하여 10A7 항체는 결합하지만, 음성 대조군으로 사용한 니보루맵(nivolumab, anti-PD1 항체)은 결합하지 않는 것으로 보아 CHO-hTIGIT 세포가 정상적으로 제작되었음을 확인하였다. 선별된 항체들은 모두 CHO-hTIGIT 세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
실시예 2. 항- TIGIT 항체의 최적화
2.1 F04와 S64 항체의 최적화
상기 항체 screening 과정을 통해 항-TIGIT 인간 항체로 F04와 S64의 두가지 클론을 최종 선별하였다. 이들 항체의 안정성을 높이기 위해 F04와 S64 항체의 아미노산 서열을 바탕으로 sub-library를 제작하였으며, 고온 조건과 extended wash 방법을 이용하여 안정성을 높이기 위한 screening을 진행하였다. F04 항체의 sub-library는 CDRH1과 CDRH2를 동시에 shuffling한 library로 1종을 overlapping 방법으로 제작하였다. S64의 sub-library는 CDRH1과 CDRH2를 동시에 shuffling한 것과, CDRL1, 2, 3를 동시에 shuffling한 것, 그리고 CDRH3를 제외한 나머지 CDR을 모두 shuffling한 library형태의 총 3종의 sub-library를 overlapping PCR 방법으로 제작하였다. F04와 S64 클론 최적화를 위해 아미노산 서열 다양화를 준 CDR 영역을 하기 표 5(밑줄로 표시된 부분이 CDR 영역)에 나타내었다.
F04 및 S64의 가변영역 서열
클론
F04 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMSWVRQAPGKGLEWVSSIGSYYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSYSGGNGYYYYAYAFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 17)
경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGYHRYATFGQGTKVEIK (서열번호 18)
S64 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPGGGSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAIRTCSLSHCYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 19)
경쇄 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSCSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYYDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 20)
Parent 클론보다 안정성이 향상된 클론을 선별하기 위해 제작된 sub-library로부터phage를 rescue한 다음, 항원에 결합시키기 전에 phage를 가열하여 안정성이 떨어지는 클론들을 우선 제거하는 과정을 거쳤다. 1차와 2차 phage display screening에서는 60℃로, 3차부터 6차까지의 screening에서는 80℃로 10분 동안 phage를 처리하여 진행하였다. 또한, ELISA 단계에서는 wash 시간을 2시간으로 늘리고 37℃로 온도를 높인 조건에서 parent 클론 대비 안정성이 향상된 클론을 구별할 수 있도록 remaining ratio를 도출하여 screening을 진행하였다. 이를 바탕으로 안정성이 향상된 클론을 선별하였고, 그 서열을 분석하였다(표 6 및 표 7).
F04 클론에 기반하여 선별된 항체의 CDR 서열
클론 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
F04-1 GYYMS SIGSYYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-2 GYYMS SIGSYYSTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-3 YYYMS SIGSSYSTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-4 SYYMS SIGGYSYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-5 GYYMS SIGSSYYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-6 SYYMS SIGSYSSTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-7 SYYMS SIGYGSGYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-8 GYYMS SIGYGSGYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-9 YYYMS SIGGGSSYTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
F04-10 SYYMS SIGSGSPSSTYYADSVKG SSYSGGNGYYYYAYAFDY RASQSVSSSYLA GASSRAT QQGYHRYAT
scFv 클론에 기반하여 선별된 항체의 CDR 서열
클론 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
S64-1 NYAMS SISPSSGSTYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SCSSSNIGNNAVS YDSNRPS GSWDYSLSAYV
S64-2 NYAMS AISPGSGNTYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SCSSSNIGNNAVS YDSNRPS GSWDYSLSAYV
S64-3 NYAMS GIYPSGGNTYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SGFSSNIGNNAVN YDNKRPS GTWDYSLSAYV
S64-5 DYAMN SIYPNGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SCSSSNIGNNAVS YDSNRPS GSWDYSLSAYV
S64-6 DYAMS LIYPSGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV TGSSSNIGSNYVS ADSQRPS GTWDYSLNGYV
S64-9 DYAMS LIYPSGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SGSSSNIGNNYVS ADNNRPS GTWDSSLSAYV
S64-14 DYAMS SIYPSGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV TGSSSNIGSNYVS ADSHRPS GAWDASLSAYV
S64-39 NYAMS GISPSGSSIYYADSVQG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SSSSSNIGSNAVN YDNQRPS ATWDYSLSGYV
S64-56 NYSMS GIYPSGGSTYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SGSSSNIGSNTFN YDSNRPS GTWDYSLNGYV
S64-65 NYAMS SIYPNGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SSSSSNIGSNYVS ADSQRPS GAWDYSLNAYV
S64-73 NYAMS WISPSSGSIYYADSVQG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SCSSSNIGNNAVS YDSNRPS GSWDYSLSAYV
S64-80 NYAMS LIYPSGGSKYYADSVKG AIRTCSLSHCYYYYGMDV SGSSSNIGSNYVS ADSNRPS GAWDSILIAYV
최종적으로 F04 sub-library를 이용한 screening에서는 F04-10 클론을 선별하였으며, S64 sub-library에서는 S64-39 클론을 최종 선별하였다.
F04-10 클론에 따른 항체는 서열번호 13에 따른 아미노산 서열을 중쇄 가변영역으로, 서열번호 15에 따른 아미노산 서열을 경쇄 가변영역으로 포함하며, S64-39 클론에 따른 항체는 서열번호 14에 따른 아미노산 서열을 중쇄 가변영역으로, 서열번호 16에 따른 아미노산 서열을 경쇄 가변영역으로 포함한다.
또한, F04-10 클론에 따른 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역;과 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하며,
S64-39 클론에 따른 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역;과 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
2.2 항- TIGIT 항체의 유전자 클로닝과 항체정제
F04-10-IgG1과 S64-39-IgG1 항체의 발현벡터는 상기 실시예 1.2와 같은 방법으로 제작하였다. S64-39-IgG4 항체의 중쇄사슬 발현벡터는 다음과 같이 제작하였다. S64-39-IgG1 발현벡터로부터 NheI과 XhoI (NEB) 제한효소를 이용하여 IgG1 불변부위에 해당하는 유전자를 제거하고, 여기에 항 PD-1 항체인 nivolumab의 중쇄사슬 불변부위를 NheI과 XhoI으로 처리한 유전자를 서브클로닝하여 넣음으로써, 최종적으로 S64-39 중쇄사슬이 IgG4 형태로 발현되도록 제작하였다. F04-10과 S64-39 항체의 경쇄사슬 가변부위는 각각 ClaI과 XhoI 제한효소를 이용하여 pOptiVEC 벡터에 서브클로닝하였다.
IgG 형태로 제작된 3종의 항체의 생산과 정제는 상기 실시예 1.2와 같이 293F 세포주를 이용한 transient expression과 MabSelect SuRe protein A resin을 이용하여 진행하였다.
실시예 3. 항- TIGIT 항체의 세포 표면의 TIGIT 결합 확인 시험
위 실시예 2에서 제조된 3종의 항-TIGIT 항체의 세포 표면에 발현되어 있는 TIGIT에 대한 결합능을 확인하기 위하여, TIGIT을 과발현시킨 CHO 세포주(이하 CHO-TIGIT 세포주)에 항-TIGIT 항체를 처리한 후 형광유세포분석기를 이용해 세포 표면의 TIGIT에 결합한 항-TIGIT 항체를 탐지하였다.
구체적으로, 화학 조성 배지(CD FortiCHO Chemically Defined Medium + 8 mM L-Glutamine + 20 μg/mL Blasticidin + 1% Anti-clumping agent)를 사용하여 CHO-TIGIT 세포주를 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 48 ~ 72시간 배양하였다. 배양이 완료된 CHO-TIGIT 세포주는 원심분리를 통해 수확하여 FACS 용액(PBS + 5% FBS)에 희석한 후, 96-well 둥근 바닥 플레이트(Corning)에 well당 1x105개씩 분주하였다. 이후 세포 표면에 남아있는 화학 조성 배지를 완전히 제거하기 위해 FACS 용액을 첨가하여 2,000 rpm에서 3분간 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하는 세척 작업을 3회 반복하였다. 세척이 완료된 CHO-TIGIT 세포주는 FACS 용액을 100 μL씩 첨가하여 재부유시켰다. FACS 용액을 이용하여 최종 처리 농도의 2배 농도로 희석한 각 농도별 항-TIGIT 항체를 CHO-TIGIT 세포주가 분주되어 있는 96-well 둥근 바닥 플레이트에 100 μL씩 첨가하여 4℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 이후 세포 표면 TIGIT에 결합하지 않고 상층액에 남아있는 항-TIGIT 항체를 제거하기 위해, 각 well에 FACS 용액을 첨가하여 2,000 rpm에서 3분간 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하는 세척 작업을 3회 반복하였다. 세포 표면 TIGIT에 결합한 항-TIGIT 항체를 탐지하기 위해 FACS 용액을 이용하여 Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody (Invitrogen)를 10 μg/mL 농도로 희석하여 각 well에 100 μL씩 첨가한 후 4℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 세척 작업을 3회 반복한 후, 각 샘플을 12x75 mm 튜브(BD Biosciences)에 옮겨 형광유세포분석기를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 세포 표면 TIGIT에 대한 항-TIGIT 항체의 결합능(EC50)은 평균형광강도(MFI) 값 기준으로 F04-10-IgG1은 16.41 ng/mL, S64-39-IgG1은 69.01 ng/mL, S64-39-IgG4는 80.78 ng/mL, 10A7은 16.54 ng/mL 수준으로 각각 확인되었다 (도 4).
실시예 4. 항- TIGIT 항체의 TIGIT /CD155 결합 저해 시험
위 실시예 2에서 제조된 3종의 항-TIGIT 항체의 활성을 확인하기 위하여, TIGIT과 CD155간의 결합 저해 시험을 수행하였다.
구체적으로, 본 시험은 TIGIT/CD155 blockade assay kit (Promega)를 이용하여, CD155 발현 aAPC/CHO-K1 세포주와 TIGIT 발현 effector 세포주의 co-culture system에서 항TIGIT 항체의 TIGIT과 CD155에 대한 결합 억제능을 확인하였다.
CD155 발현 aAPC/CHO-K1 세포주를 녹여 기본 배지 (10% FBS가 포함된 F-12 배지) 14.5 mL에 희석하여 준비하고, 96-well 플레이트 (Costar)에 100 μL 첨가한 후 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 16~24시간 보관하였다. 항-TIGIT 항체가 포함된 농축물을 분석용 배지 (10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지)를 이용하여, F04-10-IgG1은 처리농도보다 2배 높은 2 mg/mL에서 4배 계열 희석하였고, S64-39-IgG1과 S64-39-IgG4는 3 mg/mL에서 2배 계열 희석하여 준비하였다. 대조물질로 사용한 10A7 항체는 2.4 mg/mL에서 3배 계열 희석하여 준비하였다. CD155 발현 aAPC/CHO-K1 세포주가 있는 96-well 플레이트의 배지를 모두 제거한 후, 준비한 항-TIGIT 항체를 각 well에 40 μL씩 첨가하여 실제 농도가 F04-10-IgG1은 1 mg/mL에서 4배 계열 희석된 시료가 처리되고, S64-39-IgG1과 S64-39 IgG4는 1.5 mg/mL에서 2배 계열 희석된 시료가 처리되도록 하였다. 대조물질인 10A7은 1.2 mg/mL에서 3배 계열 희석된 시료가 처리되도록 하였다. 다음으로, TIGIT 발현 effector 세포주를 녹인 후 분석용 배지 6 mL에 희석하여 각 well에 40 μL씩 첨가한 다음 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 6시간 반응시켰다. Bio-GloTM substrate에 Bio-GloTM buffer를 첨가하여 만든 Bio-GloTM reagent를 각 well에 80 μL씩 처리하고 10분간 상온에서 반응시켰다. Luminescence 측정 가능한 microplate reader (Molecular devices, SpectraMax L)로 반응값 (RLU)을 측정하여 항-TIGIT 항체를 처리하지 않은 반응값 대비 항체 처리 시 반응값의 비 (Fold response = RLUAbdilution/RLUnoantibodycontrol)를 계산하였고, 그 결과는 다음과 같다. 항-TIGIT 항체의 결합 억제능 (EC50)은 F04-10-IgG1은 23.89 nM, S64-39-IgG1은 0.581 μM, S64-39-IgG4은 1.08 μM, 10A7은 0.752 μM 수준으로 확인하였다(도 5).
실시예 5. 항- TIGIT 항체의 NK 세포 활성화 시험
위 실시예 2에서 제조된 3종의 항-TIGIT 항체 처리시 NK92 세포주의 활성을 분석하기 위하여, TIGIT이 과발현된 NK92 세포주와 PVR이 과발현된 인간 유래 난소암 세포주인 HeLa 세포를 공생 배양한 조건에서 NK92 세포주의 IFN-g 분비량 측정과 형광유세포분석기를 이용한 NKG2D 발현 확인 시험을 진행하였다.
구체적으로, TIGIT이 과발현된 NK92 세포주를 녹여 완전배지 (Alpha-MEM + 12.5% FBS + 12.5% horse serum + 0.1mM 2-mercaptoethanol + 100U/mL IL-2) 2 x 105/mL농도로 희석하여 준비한 후, T25 플라스크 (Corning)에 5 mL 부피로 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 16 ~ 24시간 배양하였다. 앞서 배양이 완료된 NK92 세포주의 과발현된 TIGIT을 억제하기 위하여 항-TIGIT 항체를 25 μg/mL 농도로 처리 후, 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 72시간 배양하였다. NK92 세포주와 항-TIGIT 항체의 배양이 진행되는 동안 PVR이 과발현된 HeLa 세포주를 녹여 완전배지 (10% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지)에 3 x 105/mL 농도로 T75 플라스크 (Corning)에 15 mL의 부피로 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24~48시간 배양하였다. 그 후 NK92 세포주와 HeLa 세포주를 1:10 (1x105 NK92:1x106 HeLa)의 비율로 12-well 플레이트 (Corning)에 1mL의 부피로 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 4~6시간 공생 배양하였다. 공생 배양이 완료된 후 배양 상층액은 IFN-g ELISA 시험을 진행하기 위해 확보 후 -20℃ 냉동 보관하였고, 배양하던 세포는 PBS (Gibco)에 희석하여 확보하였다.
위의 과정을 통해 확보된 배양 상층액과 세포주를 이용하여,
첫째로, 배양 상층액을 이용하여 NK92 세포주로부터 분비되는 IFN-g의 양을 측정하기 위해 ELISA 시험을 진행하였다. 이 시험은 Human IFN-gamma Quantikine ELISA assay Kit (R&D systems)를 이용하여 진행하였다. 위 시험을 통하여 항-TIGIT 항체 처리시 NK92 cell에서 분비되는 IFN-g의 양을 분석한 결과, 대조항체 처리 그룹 대비, F04-10-IgG1, S64-39-IgG1 항체 처리 그룹에서 IFN-g 분비의 유의적인 증가를 확인할 수 있었고, S64-39-IgG4 항체 처리 그룹에서는 대조항체 처리 그룹과 동등한 수준의 IFN-g 분비량을 확인할 수 있었다(도 6).
둘째로, 위의 공생 배양을 통해 확보된 세포주에 대한 NK 세포 활성 마커 단백질 중 하나인 NKG2D 발현을 확인하기 위해 형광유세포분석기를 통해 분석을 진행하였다. 세포주에 대한 면역염색을 위하여 우선 cell staining buffer (Biolegend)에 1x106/mL농도로 세포주를 희석하였고, NK92 세포만을 특이적으로 분리하기 위해 eFluor-anti-CD56 antibody (eBioscience) 염색 및 PE-anti-NKG2D antibody (BD Biosciences) 염색을 4℃에서 빛을 차단한 상태로 20분간 진행하였다. 이후, 염색을 세척하기 위하여 cell staining buffer를 1 mL씩 첨가하여 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 하였고, 위 작업을 3회 반복 진행하였다. 이후 각 샘플을 12x75 mm 형광유세포분석용 튜브 (BD Biosciences)에 옮겨 형광유세포분석기를 이용하여 CD56을 발현하는 세포주에 대한 NKG2D 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 대조항체 처리 그룹 대비 F04-10-IgG1, S64-39-IgG1, S64-39-IgG4 항체 처리 그룹에서 모두 NKG2D 발현이 유의적으로 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7).
실시예 6. 항- TIGIT 항체의 TIGIT 항원 친화도 측정 시험
위 실시예 2에서 제조된 3종의 항-TIGIT 항체의 사람 TIGIT(rhTIGIT-Fc)과 쥐 TIGIT(rmTIGIT-Fc)에 대한 결합력을 측정하기 위하여 BIAcore T200 (GE Healthcare)을 이용한 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리며 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 친화도 (affinity, KD)값을 계산한다.
10 mM 아세테이트 용액 (pH 4.0)과 아민 커플링 키트 (amine coupling kit, GE Healthcare)를 이용하여 항-TIGIT 항체를 500 RU 레벨까지 Series S CM5 센서칩 (GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 사람 또는 쥐의 TIGIT-Fc (R&D Systems) 단백질을 40 nM 농도부터 HBS-EP 버퍼 (0.01 M HEPES, pH7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20, GE Healthcare)에 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 고정된 항체와 결합 (association), 분리 (dissociation), 해리 (regeneration)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. TIGIT-Fc 단백질의 결합은 30 μL/min 속도로 600초, 분리는 2,000초 동안 측정하였고, 해리는 10 mM 글리신 용액 (pH 1.5) 또는 40 mM NaOH 용액을 100 μL/min 속도로 25초 동안 흘려주었다. rhTIGIT-Fc와 rmTIGIT-Fc에 대한 결합력 측정 결과는 하기 표 8 및 표 9와 같다.
rhTIGIT-Fc에 대한 결합력 측정 결과
항체명 온 레이트
( On rate ) (1/ Ms ) 		오프 레이트
( Off rate ) (1/s) 		친화도
(K D , nM )
F04-10-IgG1 7.052 x 104 3.760 x 10-5 0.533
S64-39-IgG1 3.366 x 104 4.414 x 10-5 1.311
S64-39-IgG4 2.821 x 104 3.232 x 10-5 1.146
10A7 1.624 x 105 1.927 x 10-4 1.187
rmTIGIT-Fc에 대한 결합력 측정 결과
항체명 온 레이트
( On rate ) (1/ Ms ) 		오프 레이트
( Off rate ) (1/s) 		친화도
(K D , nM )
F04-10-IgG1 1.196 x 105 2.933 x 10-5 0.245
S64-39-IgG1 6.283 x 104 2.008 x 10-4 3.196
S64-39-IgG4 6.218 x 104 1.942 x 10-4 3.123
10A7 4.904 x 105 8.913 x 10-5 0.182
실시예 7. 항- TIGIT 항체의 종양 성장 저해 효과
항-TIGIT 항체의 생체 내 활성을 평가하기 위해, 마우스 종양모델(syngeneic CT26 colorectal carcinoma model using BALB/c mice)을 제작하였다. 여기에, 위 실시예 2에서 제조된 항체 3종(F04-10-IgG1, S64-39-IgG1, S64-39-IgG4) 및 양성대조항체(10A7)를 단독투여 또는 항 PD-L1항체(10F.9G2-rat IgG2b)와 병용투여하여 종양 성장 저해 효과를 비교평가하였다.
먼저 마우스 종양모델을 제작하기 위해, 배양한 CT26 종양세포를 마우스 당 100 μL(1 x 106cells)씩 주입하여 피하이식하고(Day 0), 종양이 일정크기 이상 성장하도록 방치하였다. 8일 경과 후 종양체적이 119 mm3에 도달했을 때 (Day 8, 투여개시일), 각 시험군의 평균종양체적이 유사하도록 무작위 군분리하고, 음성대조물질(rat IgG2b, 10 mg/kg용량) 및 시험물질 4종(25 mg/kg용량)을 단독 또는 항 PD-L1 항체(10 mg/kg용량)와 병용하여 3일 간격으로 총 3회 복강투여하였다. 이후, 종양체적 및 체중을 주 2회 간격으로 측정하였고, 종양 성장 저해 효과는 생체 내 실험종료일(Day 28)에 측정한 종양체적으로 다음 공식에 대입하여 산출한 TGI로 나타내었다.
TGI rate (%) = 100 × (1-ΔT/ ΔC)
ΔT = 종료일 측정한 시험물질 투여군의 평균 종양체적 - 투여개시일 측정한 시험물질 투여군의 평균 종양체적
ΔC = 종료일 측정한 음성대조물질 투여군의 평균 종양체적 - 투여개시일 측정한 음성대조물질 투여군의 평균 종양체적
종양체적은 종료일 기준으로 투여개시일에 비해, 음성대조물질투여군에서 약 23배 증가하였다. 이러한 음성대조군과 비교하여, 양성대조항체 및 항 PD-L1 항체는 단독투여시 중등도의 항종양 효과를 보여주었으며, 이 둘의 병용은 강력하고 유의적인 종양억제효과를 나타내었다(도 8). 항-TIGIT 항체의 경우, IgG1 타입의 2종의 항체 (S64-39-IgG1, F04-10-IgG1)가 단독투여시 양성대조항체와 유사한 수준의 약효를 나타내었으며, 병용투여시에는 S64-39-IgG1이 동등한 수준의 효과를 나타내었다. S64-39-IgG4 항체의 경우는 S64-39-IgG1에 비해 단독 및 병용투여에서 다소 약효가 떨어지는 것으로 나타났다.
결론적으로, 위 실시예 2에서 제조된 항체 3종(F04-10-IgG1, S64-39-IgG1, S64-39-IgG4)은 단독 또는 항 PD-L1 항체와 병용투여시 음성대조물질투여군 대비 유의적인 항 종양효과를 보여주었으며, 특히, 단독투여시에는 2종(F04-10-IgG1, S64-39-IgG1), 병용투여시에는 1종(S64-39-IgG1)의 항체가 양성대조항체와 동등한 수준의 종양 억제 효과를 나타내었다.
도 8의 통계분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 Dunnett’s multiple comparison을 실시하였으며, 음성대조물질투여군 대비 차이에 대한 통계적 유의성을 다음과 같이 표기하였다. *: p<0.05, **: p<0.01 및 ***: p<0.001
실시예 8. 항- TIGIT 항체의 용량 및 병용에 따른 종양 성장 저해 효과
항-TIGIT 항체의 용량 및 병용에 따른 생체 내 활성을 평가하기 위해, 마우스 종양모델(syngeneic CT26 colorectal carcinoma model using BALB/c mice)을 제작하였다. 여기에, 위 실시예 2에서 제조된 항체 F04-10을 용량별 단독투여 또는 항-PD-L1 항체(10F.9G2-rat IgG2b)와 병용투여하여 종양 성장 저해 효과를 비교평가 하였다.
먼저 마우스 종양모델을 제작하기 위해, 배양한 CT26 종양세포를 마우스 당 100 μL(1 x 106cells)씩 주입하여 피하이식하고(Day 0), 종양이 일정크기 이상 성장하도록 방치하였다. 7일 경과 후 종양체적이 80 mm3에 도달했을 때 (Day 7, 투여개시일), 각 시험군의 평균종양체적이 유사하도록 무작위 군분리하고, 음성대조물질(rat IgG2b 10 mg/kg과 human IgG1 25 mg/kg 병용) 또는 F04-10(5, 10, 25 mg/kg)을 단독 또는 항-PD-L1 항체(10 mg/kg용량)와 병용하여 3일 간격으로 총 3회 복강투여하였다. 이후, 종양체적 및 체중을 주 2회 간격으로 측정하였고, 종양 성장 저해 효과는 생체 내 실험종료일(Day 24)에 측정한 종양체적으로 다음 공식에 대입하여 산출한 TGI로 나타내었다.
TGI rate (%) = 100 × (1-ΔT/ ΔC)
ΔT = 종료일 측정한 시험물질 투여군의 평균 종양체적 - 투여개시일 측정한 시험물질 투여군의 평균 종양체적
ΔC = 종료일 측정한 음성대조물질 투여군의 평균 종양체적 - 투여개시일 측정한 음성대조물질 투여군의 평균 종양체적
종양체적은 종료일 기준으로 투여개시일에 비해, 음성대조물질투여군에서 약 16배 증가한 반면에, F04-10 단독투여군의 경우, 3 및 10 mg/kg 용량에서는 미약한 항종양 효과를, 25 mg/kg에서는 최대 약효에 도달하며 강력한 종양성장 억제효과를 나타냈다. 항-PD-L1 항체 10 mg/kg 단독 투여군의 경우 중등도의 종양억제효과를 보여주었으며, 이를 F04-10 3 및 10 mg/kg과 병용투여한 경우, 동일용량의 F04-10 단독투여에 비해 종양성장 억제효과가 더 강력하였다. 반면 최대효과를 보여주었던 F04-10 25 mg/kg의 경우 항-PD-L1과 병용에 인한 약효 증가는 관찰되지 않았다(도 9).
결론적으로, 위 실시예 2에서 제조된 항체 F04-10은 단독투여시 25 mg/kg에서 유의적인 최대 종양억제효과를 보여주었고, 이보다 낮은 3, 10 mg/kg 용량의 경우 항-PD-L1 항체와 병용에 의해 각각의 단독투여보다 약효가 증가하는 경향을 보여주었다.
도 9의 통계분석은 GraphPad Prism 5를 이용하여 Dunnett’s multiple comparison을 실시하였으며, 음성대조물질투여군 대비 차이에 대한 통계적 유의성을 다음과 같이 표기하였다. *: p<0.05
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Asp Tyr <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable heavy chain CDR 3 <400> 6 Ala Ile Arg Thr Cys Ser Leu Ser His Cys Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04-10_Variable light chain CDR 1 <400> 7 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable light chain CDR 1 <400> 8 Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04-10_Variable light chain CDR 2 <400> 9 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable light chain CDR 2 <400> 10 Tyr Asp Asn Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04-10_Variable light chain CDR 3 <400> 11 Gln Gln Gly Tyr His Arg Tyr Ala Thr 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable light chain CDR 3 <400> 12 Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 13 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04-10_Variable heavy chain <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Ser Tyr Ser Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ala 100 105 110 Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable heavy chain <400> 14 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ile Arg Thr Cys Ser Leu Ser His Cys Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04-10_Variable light chain <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr His Arg Tyr 85 90 95 Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64-39_Variable light chain <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ser Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04_Variable heavy chain <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 65 70 75 80 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 85 90 95 Ser Ser Tyr Ser Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Tyr Ala Phe 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone F04_Variable light chain <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr His Arg Tyr 85 90 95 Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64_Variable heavy chain <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Ile Arg Thr Cys Ser Leu Ser His Cys Tyr Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Clone S64_Variable light chain <400> 20 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Cys Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 21 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains precursor [Homo sapiens] <400> 21 Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn 20 25 30 Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser 35 40 45 Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln 85 90 95 Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr 100 105 110 Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu 115 120 125 Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly 130 135 140 Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val 145 150 155 160 Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu 165 170 175 Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser 180 185 190 Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala 195 200 205 Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp 210 215 220 Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe 225 230 235 240 Thr Glu Thr Gly

Claims (17)

  1. 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(heavy chain) CDR1;
    서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
    서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3;을 포함하는 중쇄 가변영역; 과
    서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(light chain) CDR1;
    서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및
    서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;을 포함하는 경쇄 가변영역;
    을 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 13 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 경쇄 가변영역을 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항-TIGIT 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 암 또는 종양 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암 또는 종양은 피부암, 간암, 간세포암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 다른 암 치료제를 포함하는 암 또는 종양 치료용 병용 투여 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 다른 암 치료제는 면역관문억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate).
  11. 제10항에 따른 항체-약물 접합체를 포함하는 암 또는 종양 치료용 조성물.
  12. 제1항 또는 제2항에 따른 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  13. 제12항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  14. 제13항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  15. 제14항에 있어서, 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 숙주세포.
  16. 제15항에 있어서, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포, 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.),피치아 파스토리스(Pichiapastoris),사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurosporacrassa)에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주세포.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-TIGIT 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
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