KR20190103895A

KR20190103895A - 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에 jef-214 균주, 이를 이용한 닭진드기 방제용 조성물 및 닭진드기 방제방법

Info

Publication number: KR20190103895A
Application number: KR1020180024886A
Authority: KR
Inventors: 김재수; 이미롱; 김시현; 김종철; 이세진; 박소은; 신태영
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-09-05
Also published as: KR102054577B1

Abstract

본 발명은 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주, 이를 이용한 닭진드기 방제용 조성물 및 닭진드기 방제방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 이용한 닭진드기 방제방법을 이용하여 닭진드기에 분무 또는 침지처리 하는 경우 기존에 보고된 살충용 조성물보다 현저히 높은 방제효과를 나타내었다. 본 발명의 닭진드기 방제용 조성물은 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 포자형태로 포함하고 있으므로 조성물에 직접적으로 접촉하지 않은 닭진드기에 대하여도 방제효과가 나타날 수 있다. 또한 본 발명은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 이용한 액상, 분말 또는 입상제형의 제조방법을 제공한다.

Description

닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에 JEF-214 균주, 이를 이용한 닭진드기 방제용 조성물 및 닭진드기 방제방법{Composition for controlling Red mite using Metarhizium anisopliae JEF-214 and method for preventing Red mite using the same}

본 발명은 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주, 이를 이용한 닭진드기 방제용 조성물 및 닭진드기 방제방법에 관한 것이다.

닭진드기(와구모, red mite)는 봄부터 가을까지 산란계 농가 생산성 하락의 주요 원인으로, 주요 질병을 전파하는 요인으로 양계업에 큰 영향을 미치고 있다. 유럽 11개국의 조사 결과, 전체 농가 중 83%가 닭진드기에 감염된 것으로 나타났으며, 이로 인한 손실액은 연간 약 1,982억 달러로 추정되고 있음. 우리나라에서도 닭진드기 감염률이 90% 이상으로 추정되며, 연간 손실액은 약 1,050억원으로 알려져 있다.

닭진드기에 감염된 양계는 흡혈에 의한 스트레스를 받게 되며, 이로 인해 빈혈, 쇠약, 깃털 탈락 등을 유발시켜 산란율은 약 20% 감소하고, 폐사율이 최대 4%까지 증가한다고 보고 되고 있다. 이러한 닭진드기는 생존력이 뛰어나 1년 내내 번식이 가능하고, 섭식 활동 없이 9개월 간 생존이 가능한 것으로 알려져 있으며, 25℃ 조건에서 6일만에 개체수가 2배로 증가되어 방제가 매우 어려운 해충으로 알려져 있다.

현재 우리나라에서 닭진드기 방제에 등록된 살충제 수는 13종류로 알려져 있으나, 5종류는 판매가 중단되었고, 나머지 중 4종류의 살충제는 빈 축사에서만 사용해야하는 적용상의 한계점이 있다. 현실적으로 닭이 사육되는 상태에서 사용할 수 있는 닭진드기 방제용 약품의 수는 4종류로 인식되고 있으나, 닭진드기의 약제 저항성 증가와, 잔류독성 및 환경오염 등이 근래 크게 대두되고 있음에 따라, 새로운 생물적 살충제에 대한 개발이 사회적으로 강하게 요구되고 있다.

종래 기술에서는 닭진드기 방제와 관련하여 천연 식물추출물을 이용한 닭진드기 살비제 조성물이 대한민국 공개특허 제10-2017-0141409호에 의해 제시된바 있다. 하지만 식물 추출물은 작용 특성상 식물 추출물에 직접 접촉한 닭진드기에만 방제 효과가 있고, 축사 내에 숨어있는 등 직접 접촉하지 않은 닭진드기에는 방제효과가 없는 한계점을 가지고 있다. 최근까지 살충제와 직접적으로 접촉하지 않은 닭진드기들까지도 효과적으로 방제할 수 있는 곤충병원성 진균을 이용하는 기술에 대하여는 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은, 기존 합성 살충제의 저항성 문제와 환경 잔류 문제를 획기적으로 극복하면서도, 닭진드기에 간접적으로 접촉하여도 방제효과가 있는 미생물 기반 신규 곤충병원성 진균의 발굴 및 효과적인 닭진드기 관리 시스템을 구축하고자 예의 노력하였다.

그 결과, 인축에 무해하며 환경에 안전한 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주의 뛰어난 살충력을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명자들은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 및 이를 포함하는 닭진드기 방제용 조성물과 이의 적용 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 닭진드기 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 닭진드기 방제용 조성물을 포함하는 현탁액을 이용한 닭진드기 방제방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 닭진드기는 데르마니수스 갈리나에(Dermanyssus gallinae)인 것일 수 있다.

본 발명은 또한 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 포함하는 닭진드기 방제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 상기 균주의 현탁액을 곡물배지에 접종하여 고체배양을 통해 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 액상제형, 분말제형 및 입상제형으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 제형화되는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 증량제 및 계면활성제를 추가로 포함하여 제형화하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 계면활성제는 닭진드기 방제용 조성물이 액상제형인 경우 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate), 이소트리데실 알코올 에톡실레이트(isotridecyl alcohol ethoxylate) 및 아세틸렌 다이올(acetylene diol)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 비이온 계면활성제인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 계면활성제는 닭진드기 방제용 조성물이 분말제형 또는 입상제형인 경우 소듐 리그노설포테이트(Sodium lignosulfonate) 또는 E0/P0/E0 블록 중합체(EO/PO/EO block copolymer)인 비이온 계면활성제인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 증량제는 광물성 분말인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, a) 전술한 닭진드기 방제용 조성물을 현탁액으로 제조하는 단계; 및 b) 상기 현탁액으로 침지처리하거나 또는 분무처리하는 단계;

를 포함하는 닭진드기 방제방법을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명의 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 이용한 닭진드기 방제방법을 이용하여 닭진드기에 분무 또는 침지처리 하는 경우 기존에 보고된 살충용 조성물보다 현저히 높은 방제효과를 나타내었다. 본 발명의 닭진드기 방제용 조성물은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주를 포자형태로 포함하고 있으므로 조성물에 직접적으로 접촉하지 않은 닭진드기에 대하여도 방제효과가 나타날 수 있다. 또한 본 발명은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 이용한 액상, 분말 또는 입상제형의 제조방법을 제공한다.

도 1은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 육안으로 관찰한 것(도 1(a)) 및 실체현미경으로 관찰한 균사와 포자의 생장 형태 (도 1(b),(c)), 광학현미경으로 관찰한 그 균사와 포자(도 1(d),(e))를 나타낸다.
도 2는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214의 ITS region, β-튜블린 region 및 18s rRNA region의 염기서열을 나타낸다.
도 3은 기존에 보고된 메타리지움(Metarhizium anisopliae)과 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214의 유연관계를 나타낸다. 유전적인 측면에서 기존에 보고된 균주와 차이가 있는 것을 확인하였다.
도 4는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214의 기장(millet), 쌀 (rice), 조 (Italian millet)배지에서의 고체 배양 후 생산된 고체배양체 (도 4(a))와 각각의 고체배지에서 생산된 포자의 생산량 (도 4(b))을 나타낸다.
도 5는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주의 현탁액에 닭진드기를 침지처리한 경우 그 살충률(도 5(a))과 닭진드기 및 감염증(진균증(mycosis))이 일어난 닭진드기 성충(도 5(b))을 나타낸다. 침지처리 후 5일차에 JEF-214를 처리한 닭진드기 성충이 모두 치사된 것을 확인하였다.
도 6은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주의 현탁액을 닭진드기에 분무처리한 경우 그 살충효과를 나타낸다. 양성대조군인 알파사이퍼메트린에 비하여 JEF-214의 분무처리에 의한 살충률은 6배 이상, 다른 균주들의 분무처리에 비하여 약 4배 이상 닭진드기 방제효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
도 7은 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주의 현탁액을 닭진드기에 분무처리한 반복실험의 경우 그 살충률(도 7(a))과 닭진드기 및 진균증(mycosis)이 일어난 닭진드기 성충(도 7(b))을 나타낸다. 이때, 다른 균주에 비해 JEF-214의 닭진드기 성충에 대한 방제효과가 빨리 일어나며, 최대 4배 이상 높은 살충성(병원성)을 확인하였다.
도 8은 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주(도 8(A)), 수확된 포자(도 8(B)) 및 원제, 계면활성제, 증량제(도 8(C))를 나타낸다.
도 9는 메타리지움 아니소플리에( Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주(도 9(A), 수확된 포자(도 9(B)), 원제와 계면활성제의 혼합가루(도 9(C)) 및 제조된 액상 제형(도 9(d))을 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 기존 합성 살충제의 저항성 문제와 환경 잔류 문제를 획기적으로 극복할 수 있으며, 기존 식물 추출물 기반의 살충성분이 닭진드기에 직접적으로 접촉하는 경우에만 방제효과가 나타나는 점을 개선하는 미생물 기반 신규 살충성 진균의 발굴 및 효과적인 닭진드기 관리 시스템의 개발이 요구되고 있다.

본 발명에 따른 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주을 이용한 닭진드기 방제용 조성물은 인축에 무해하고, 환경에 안전하며 뛰어난 살충력을 제공하므로, 닭진드기 방제용 조성물로서 효과적이다.

따라서, 본 발명은 닭진드기 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토양에서 수득한 곤충병원성 진균들을 갈색거저리 유충에 대한 높은 병원성을 가진 균주(baiting method)들을 분리 및 배양하였고, 이들이 메타리지움(Metarhizium)속의 균주임을 확인하였다(실시예 1, 도 1).

본 발명의 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 [실시예 1]에서 얻은 균주를 시퀀싱하여 최종적으로 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 으로 동정하고(도 2), 기존에 보고된 14종의 메타리지움(Metarhizium) 속의 균주와 β-튜블린 시퀀스의 유연관계를 비교하여(도 3) 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214가 기존에 보고되지 않은 새로운 균주임을 확인하였다.

본 발명의 상기 닭진드기는 와구모 내지 Red Mite라고 불리는 데르마니수스 갈리나에(Dermanyssus gallinae)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 포함하는 닭진드기 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 닭진드기 방제용 조성물은 상기 균주의 현탁액을 곡물배지에 접종하여 고체배양을 통해 제조된 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 곡물배지는 기장(millet), 쌀(rice), 조(Italian millet), 보리, 콩, 수수, 조, 쌀 및 현미로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 곡물로 이루어진 배지를 사용하는 것이고, 그 중 기장(millet)배지에 접종하여 고체배양하는 것이 가장 바람직하다(도 4).

본 발명의 상기 닭진드기 방제용 조성물에 있어서, 상기 고체배양은 상기 균주의 현탁액을 배지에 접종한 후, 바람직하게는 20 내지 30℃에서 5일 내지 20일 동안 배양한 후, 실온 조건에서 1 내지 10일 동안 건조할 수 있고, 더욱 바람직하게는 25℃ 조건에서 7일간 배양 후, 실온 조건에서 1일간 건조시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 닭진드기 방제용 조성물은 JEF-214의 포자를 포함하고 있으므로, 포자가 숙주곤충에 부착한 후 발아하여 진균증 등을 일으켜 살충효과가 나타나게 된다. 또한 이에 직접적으로 접촉한 닭진드기 외에 조성물에 직접적으로 접촉하지 않은 닭진드기라도 포자의 전달로 인해 방제효과가 나타날 수 있다.

본 발명의 상기 닭진드기 방제용 조성물은 액상, 분말 또는 입상제형인 것이 바람직하다. 상기 분말제형은 가루형태를 의미하며, 상기 입상제형은 고체 배양체를 증량제를 이용하여 중량 대비 1~100 배로 희석한 낟알이나 알갱이 형태를 의미하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 분말 또는 입상제형은, 닭진드기 방제용 조성물과 계면활성제 및 증량제를 바람직하게는 각각 0.01~50%, 0.01~30% 및 1~70%의 중량비율로 혼합하여 제조하며, 더욱 바람직하게는 각각 5 : 5 : 90 의 중량비율로 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다(도 8, 실시예 <6-1>). 만일 계면활성제의 함량이 상기 비율보다 높아지는 경우에는 경제성이 떨어지고 닭진드기로부터 방제용 조성물이 흘러내려 방제 비용 대비 적합한 방제효과를 볼 수 없으며, 상기 비율보다 낮아지는 경우에는 닭진드기에 방제용 조성물이 충분하게 부착되지 않아 방제효과가 떨어질 수 있다.

본 발명의 상기 액상 제형은 닭진드기 방제용 조성물과 계면활성제를 각각 0.01~80% 및 0.01~20%의 중량비율로 혼합하고, 물에 1 : 10 내지 1 : 2000의 중량비율로 희석하여 제조하며, 이때 증량제를 전체 중량대비 1 ~ 95%로, 바람직하게는 1 ~ 50%로 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게는 닭진드기 방제용 조성물과 계면활성제를 100 : 1으로, 더욱 바람직하게는 2 : 1로 중량비율로 혼합하여 물에 1 : 10 내지 1 : 1000으로, 더욱 바람직하게는 1 : 100 내지 1 : 1000의 중량비율로 희석하여 제조하는 것이 바람직하다(도 9, 실시예 <6-2>). 만일 계면활성제의 함량이 상기 비율보다 높아지는 경우에는 경제성이 떨어지고 닭진드기로부터 방제용 조성물이 흘러내려 방제 비용 대비 적합한 방제효과를 볼 수 없으며, 상기 비율보다 낮아지는 경우에는 닭진드기에 방제용 조성물이 충분하게 부착되지 않아 방제효과가 떨어질 수 있다.

본 발명의 상기 계면활성제는 작물보호제에 사용가능한 모든 계면활성제를 의미하며, 그 중 비이온 계면활성제인 것이 바람직하다. 상기 비이온 계면활성제는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate), 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate), 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate),소듐 알킬 설포네이트(sodium alkyl sulfonate),폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate),이소트리데실 알코올 에톡실레이트(isotridecyl alcohol ethoxylate), 아세틸렌 다이올(acetylene diol), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonatenaphthalene formaldehyde), E0/P0/E0 블록 중합체(EO/PO/EO block copolymer), 트리톤 100 및 트윈 80 등인 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는 상기 닭진드기 방제용 조성물이 액상 제형인 경우 상기 계면활성제는 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate), 이소트리데실 알코올 에톡실레이트(isotridecyl alcohol ethoxylate) 및 아세틸렌 다이올(acetylene diol)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고, 상기 닭진드기 방제용 조성물이 분말 또는 입상제형인 경우 상기 계면활성제는 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate) 및 E0/P0/E0 블록 중합체(EO/PO/EO block copolymer)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 증량제는 규조토, 탈크, 석회, 인회석, 돌로마이트(dolomite), 운모(mica), 카올리나이트(kaolinite), 벤토나이트(bentonite) 또는 파이로필라이드(Pyrophyllite) 등의 광물성 분말인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 파이로필라이드(Pyrophyllite)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주 및 이를 이용한 닭진드기 방제용 조성물을 제공한다. 이는 액상, 분말 또는 입상제형 등 다양한 제형으로 제조 가능하며, 닭진드기 성충에 진균증(mycosis)를 일으켜 닭진드기 방제용 조성물로서 탁월한 효과를 나타낸다.

본 발명은 또한, a) 전술한 닭진드기 방제용 조성물을 현탁액으로 제조하는 단계; 및

b) 상기 현탁액으로 침지처리하거나 또는 분무처리하는 단계;

를 포함하는 닭진드기 방제방법을 제공한다.

본 발명의 상기 현탁액은 닭진드기 방제용 고체 배양체 내지 조성물인 배양된 균주의 포자를 수확하여 세포계산기(hemocytometer)로 계수한 후, 다양한 계면활성제를 이용하여 처리 농도에 맞춰 희석하여 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 배양된 균주는 본 발명의 균주를 곡물배지를 이용하여 고체배양한 균주를 의미한다. 상기 고체배양의 바람직한 조건은 전술하였는바 그 기재로 대신한다.

이때, 고체배양 완료 후 포자를 세포계산기(hemocytometer)로 계수하였을 때, 포자수는 1x10⁷ 포자(conidia)/g 내지 1x10¹⁰ 포자(conidia)/g 일 수 있으며, 바람직하게는 5x10⁸ 포자(conidia)/g 내지 5x10⁹ 포자(conidia)/g 인 것이 바람직하다.

상기 계면활성제의 바람직한 종류는 전술하였는 바 그 기재로 대신한다. 현탁액의 처리 농도는 1x10⁵ 포자(conidia) 내지 1x10⁸ 포자(conidia)/㎖인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1×10⁷ 포자(conidia)/㎖인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 닭진드기 방제방법에 있어서, 닭진드기에 침지처리 하는 것은 닭진드기를 현탁액에 1 내지 30초 동안 담그는 것을 의미하며, 바람직하게는 약 5 내지 10초 동안 침지처리하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 닭진드기 방제방법에 있어서, 닭진드기에 분무처리 하는 것은 닭진드기에 100마리당 0.1 내지 10 ㎖의 현탁액을 뿌리는 것을 의미하며, 바람직하게는 1㎖의 현탁액으로 분무처리하는 것이 바람직하다. 상기 용량을 초과하여 현탁액을 처리하는 경우 처리량 대비 방제의 경제성을 확보하기 어려우며, 상기 용량보다 미만으로 현탁액을 처리하는 경우 높은 방제 활성을 보기 어렵다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 이용한 포자 현탁액을 제조하여 닭진드기 성충에 침지처리 하거나 분무 처리하는 경우, 닭진드기 성충에 진균증(mycosis)를 유발함으로써 높은 병원성을 가짐을 확인하였다(도 5 및 6).

따라서, 본 발명은 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주를 고체배양하여 생산한 포자를 현탁액으로 제조하여 닭진드기에 침지처리 하거나 분무처리 하는 닭진드기 방제방법의 경우, 닭진드기에 진균증(mycosis)를 일으켜 닭진드기 방제용 조성물로서 탁월한 효과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

균주의 분리 및 동정

<1-1> 균주의 분리

다양한 지역에서 채집한 토양으로부터 갈색거저리-베이팅 시스템(Tenebrio molitor-mediated baiting system)을 이용하여 곤충병원성 진균을 분리하였다.

구체적으로, 60×15 ㎜의 1/4 사브로드 포도당 한천 배지(Sabouraud Dextrose Agar; SDA)에 토양으로부터 수득한 곤충병원성 진균을 1.0×10⁷conidia/㎖의 농도로 200 ㎕를 도말하고, 25±2℃ 조건의 항온기에서 5-14일간 배양하였다. 곤충병원성 진균이 배양된 플레이트(plate)에 갈색거저리 유충 5마리를 처리하였다. 25±2℃의 실험실 조건에서 갈색거저리 유충 5마리를 10일 이내로 모두 치사시킨 균주는 ITS(Internal Transcribed Spacer) primer를 이용하여 PCR을 통해 동정되었다.

<1-2> Metarhizium anisopliae JEF-214 균주의 생육 및 형태

상기 실시예 <1-1>에서 분리한 균주를 사브로드 한천 배지(Sabraud Dextrose Agar; SDA)에서 14일간 배양(25℃, 암배양)한 후 육안 및 광학현미경(400배)에서 관찰하였다.

그 결과, [도 1]에 나타나는 바와 같이, Metarhizium 속의 전형적인 특징 (녹색의 포자, 포자형성 방법)이 관찰되었다.

Metarhizium anisopliae 균주의 DNA 시퀀싱

본 발명자들은 [실시예 1]에서 분리한 M. anisopliae 균주를 동정하고자 하였다.

구체적으로, 다음과 같은 조건에서 PCR를 수행하였다. 94℃에서 5분, 94℃ 60초, 62℃ 30초, 72℃ 30초를 30회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 3분간 후처리(post maturation)시켰다. 시퀀싱(Sequncing)은 3개의 프라이머(primer; ITS(Internal Transcribed Spacer), β-tublin, 18s rRNA)를 이용하여 진행하였다. 각 프라이머 염기 서열은 하기 [표 1]과 같다.

프라이머	방향	서열	서열목록 번호
ITS	정방향	5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCG G- 3'	1
ITS	역방향	5` -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3`	2
β-tublin	정방향	5' -GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC- 3'	3
β-tublin	역방향	5' -ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC- 3'	4
18s rRNA	정방향	5` -TTA CGT CCC TGC CCT TTG TA- 3`	5
18s rRNA	역방향	5' -CCA ACG GAG ACC TTG TTA CG- 3`	6

PCR 산물의 전기영동은 0.8% 아가로스 젤(agarose gel)과 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide; EtBr)을 사용하여 140V로 25분 동안 진행하였다. 최종적으로 얻어진 산물을 마크로젠(http://dna.macrogen.com/kor/)에 보내 시퀀싱 의뢰를 진행하여 최종적으로 M. anisopliae로 동정하였다(도 2). 동정한 ITS 서열은 서열목록 7번, β-tublin 서열은 서열목록 8번, 18s rRNA 서열은 서열목록 9번으로 기재하였다.

더불어 기존에 알려진 Metarhizium 속 균주들과 유연관계를 확인하고자, [도 3]에 나타나는 바와 같이 미국 국립생물정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 보고되어 있는 14종의 Metarhizium 속 균주의 베타-튜블린 시퀀스(β-tublin sequence)를 이용하여 M. anisopliae JEF-214와의 유연관계를 비교하였다.

기장 (Millet), 쌀(Rice), 조(Italian Millet)을 이용한 고체배양 조건에서의 포자 생산

배양용 폴리비닐 백(polyvinyl bag)에 기장(millet), 쌀(Rice), 조(Italian Millet)를 각각 200g씩 넣은 후, 오염방지를 위하여 50% 구연산(citric acid) 0.16 ㎖을 추가로 처리하였다. 항온수조(Water bath)를 이용하여 90℃ 조건에서 1시간 동안 열처리하여 수분이 충분히 곡물(기장, 쌀 또는 조)에 흡수되도록 하였다. 폴리비닐 백의 입구 부분은 원활한 산소공급을 위해 종이컵과 멸균 거즈를 이용하여 제조하였다. 기장이 담긴 폴리비닐 백은 121℃ 조건에서 15 분간 멸균되었다. 상온에서 냉각 후, M. anisopliae JEF-214 균주현탁액 (1×10⁷ conidia/㎖)을 1 ㎖ 씩 폴리비닐 백에 접종하였다. 25℃ 조건에서 7일간 배양 후, 실온 조건에서 1일간 건조 시킨 M. anisopliae JEF-214 포자를 최종 생산하였다.

그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이, JEF-214 균주는 기장 배지에서 7.8 x 10⁸ conidia/g, 쌀 배지에서 6.2 x 10⁸ conidia/g, 조 배지에서 3.9 x 10⁸ conidia/g의 포자 생산성을 보여 기장배지에서 포자가 가장 활발히 생성되는 것을 확인하였다.

Metarhizium anisopliae JEF-214 균주의 닭진드기에 대한 방제효과_침지처리

M. anisopliae JEF-214 균주의 닭진드기에 대한 방제효과를 확인하고, 다른 균주들의 방제효과와 비교하기 위하여 하기 실험을 진행하였다.

구체적으로, 1차 실험으로 기장(Millet)에 배양된 JEF-214을 이용하여 포자를 수확하였으며, 세포계산기(hemocytometer)로 계수하였다. 계수된 포자는 처리농도에 맞춰 계면활성제로 희석하여 현탁액으로 제조하였다. 조제된 현탁액(1×10⁷ conidia/㎖)에 닭진드기 성충을 약 5-10초간 침지 처리하였다. 이때, 대조군(control)으로서 계면활성제(0.03% silwet), 비교군으로서 JEF-143(Isaria fumosorosea), JEF-152(Beauveria brongniartii), JEF-186(Metarhizium lepidiotae), JEF-229(Isaria fumosorosea) 균주를 이용하여 상기 [실시예 3]과 동일한 방법으로 포자를 생산하여 제조한 현탁액으로 닭진드기 성충을 JEF-214와 동일하게 처리한 후 25℃ 조건에서 5일간 생충수와 사충수를 조사 및 비교하였다.

그 결과, [도 5(a)]에서 나타나는 바와 같이 처리 후 1일차부터 JEF-214을 처리한 처리구에서 사충이 확인되었으며, 처리 3일차에 대조군 10%, JEF-214 80%의 사충률이 확인되어 JEF-214 균주의 닭진드기 성충에 대한 높은 병원성을 확인하였다. 또한 [도 5(b)]에서 나타나는 바와 같이, 처리 5일 후, 대조군과 JEF-214 처리구의 성충을 관찰한 결과 균주 처리구에서 진균증(mycosis)가 나타남을 확인하였으며, 무처리구의 경우 대부분의 개체가 치사되지 않았음을 확인하였다.

Metarhizium anisopliae JEF-214 균주의 닭진드기에 대한 방제효과_분무처리

<5-1> 제1차 반복실험

기장(Millet)에서 배양된 JEF-214을 이용하여 포자를 수확 하였으며, 세포계산기(hemocytometer)를 이용하여 포자를 계수하였다. 계수된 포자는 처리농도에 맞춰 계면활성제로 희석하여 현탁액으로 제조하였다. 포자 현탁액(1×10⁷ conidia/㎖)을 조제한 후 닭진드기 성충 12마리에 분무(1 ㎖) 처리하였다. 이때, 음성대조군으로서 실리콘 계면활성제(silwet, 0.03%), 양성대조군으로서 살충성분인 사이퍼메트린(cypermethrin), 비교군으로서 JEF-150(Isaria fumosorosea), JEF-229(Isaria fumosorosea), JEF-231(Beauveria bassiana)의 균주를 이용하여 상기 [실시예 3]과 동일한 방법으로 포자를 생산하여 제조한 현탁액으로 닭진드기 성충 12마리를 JEF-214와 동일하게 처리한 후 25℃ 조건에서 분무 후 7일차에 생충수와 사충수를 조사하였다.

그 결과, [도 6]에서 나타나는 바와 같이 모든 실험군에서 사충이 발생하긴 하였으나, JEF-214가 닭진드기 성충에 대하여 양성대조군과 비교하여서는 약 7배, 다른 곤충병원성 진균 처리구와 비교하여서는 약 4배 이상 높은 병원성을 확인하였다.

<5-2> 제2차 반복실험

상기 실시예 <5-1>와 동일한 방법으로 JEF-214 균주를 이용한 현탁액의 닭진드기에 대한 방제효과를 확인하였다.

그 결과, [도 7(a)]에 나타나는 바와 같이 처리 후 2일차부터 JEF-214을 처리한 처리구에서 사충이 확인되었으며, 처리 후 3일차에서는 대조군은 0%, JEF-214는 90%의 사충률을 확인하여 JEF-214의 닭진드기 성충에 대한 높은 병원성을 확인하였다. 또한 [도 7(b)]에서 나타나는 바와 같이, 처리 후 7일차에서 대조군 처리구와 JEF-214 처리구의 성충을 관찰한 결과 균주 처리구에서 진균증(mycosis)가 나타남이 확인되었다. 무처리구의 경우 대부분의 개체가 치사되지 않았으며, 생식을 통해 알이 부화하여 개체수 밀도가 증가한 것을 확인하였다. 반복실험에 따라 균주들의 방제효과가 상이한 것은 처리 시기 및 처리 환경의 차이에 의한 것으로 예상된다. 그러나 이는 단순반복실험이며 오차범위를 고려하였을 때 두 실험의 결과 차이가 크다고 볼 수 없다.

Metarhizium anisopliae JEF -214 균주의 분말, 입상 또는 액상제형 제조

<6-1> 분말 내지 입상제형의 제조

기장 (millet)을 이용하여 진행된 JEF-214 균주의 고체 배양체에서 포자를 수확하였다(도 8(A), (B)). 확보된 포자 분말(원제) : 증량제(pyrophyllite) : 계면활성제를 5 : 90 : 5 비율로 섞어주었다(도 8(C)). 300 mesh 이하의 분말 입도를 확보하기 위해 체(sieve)를 이용하여 필터링(filtering) 과정을 진행하였다. 이때, 사용한 계면활성제는 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate)와 E0/P0/E0 블락 중합체(E0/P0/E0 block copolymer)이다. 입상 제형은 고체 배양체의 성상(입상)을 그대로 유지하면서, 고체배양체를 고상 증량제를 이용하여 중량 대비 1~100배로 희석하여 제조하였다.

<6-2> 액상 제형 제조

기장 (millet)을 이용하여 진행된 JEF-214 균주의 고체 배양체에서 포자가 수확되었다(도 9(A), (B)). 확보된 포자 분말(원제)와 계면활성제(surfactant)를 약 2:1 비율로 혼합하였다(도 9(C)). 이때, M. anisopliae JEF-214의 계면장력에 따라 계면활성제는 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate), 이소트리데실 알코올 에톡실레이트(isotridecyl alcohol ethoxylate) 및 아세틸렌 다이올(acetylene diol)을 이용하였으며, 미세한 분말 입도를 확보하기 위해, 체(sieve)를 이용하여 분말을 걸러 주었다. 그 후 걸러진 가루를 물과 혼합하여 농축된 액상 제형을 제작하였다(도 9(D)).

한국미생물보존센터

KFCC11746P

20171101

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for controlling Red mite using Metarhizium anisopliae JEF-214 and method for preventing Red mite using the same <130> 1063457 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_primer_F <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_primer_R <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tublin_primer_F <400> 3 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tublin_primer_R <400> 4 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA_primer_F <400> 5 ttacgtccct gccctttgta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA_primer_R <400> 6 ccaacggaga ccttgttacg 20 <210> 7 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS_gene <400> 7 atcgaggtat ccactcccac ccctgtgaat atacctttaa ttgttgcttc ggcgggactt 60 cgcgcccgcc ggggacccaa accttctgaa ttttttaata agtatcttct gagtggttaa 120 aaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca 180 gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 240 acattgcgcc cgtcagtatt ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcatta cgcccctcaa 300 gtcccctgtg gacttggtgt tggggatcgg cgaggctggt tttccagcac agccgtccct 360 caaatcaatt ggcggtctcg ccgtggccct cctctgcgca gtagtaaaac actcgcaaca 420 ggagcccggc gcggtccact gccgtaaaac cccccaactt tttatagttg acctcgaatc 480 aggtaggact acccgctgaa cttaagcatt aaaagggggg gaggaaaaaa gggaacaaaa 540 acc 543 <210> 8 <211> 599 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tublin_gene <400> 8 ggtgtctctt ctggtgacac ggcctcgaca gcaatggtgt ctacaacggt acctctgagc 60 tccagctcga gcgtatgagc gtctacttca atgaggtaag tttgaatgag ccgaatccta 120 ggatgttgag gaaccatagg ttgttatcat ccatggggga gatcaaagac tgacgcgggg 180 actcccctca aaaggcctcc ggtaacaagt atgttcctcg cgccgtcctt gtcgatcttg 240 aacctggcac catggatgcc gtccgtgccg gtcctttcgg tcagcttttc cgtcccgaca 300 acttcgtctt tggtcagtct ggtgctggca acaattgggc caagggtcac acacctgagg 360 gtaagcgcct gaaaggagtg aaggccacat ggatcctctg aacttttgcc gcctgaattc 420 cttaccccct caattcgtaa gattaaggac acccactccc agggggaatc cccgggtttt 480 caaggtcttc catgcgagag ctatggagtg tctccgccgc ggagctcaac acgttgctgc 540 ccgcgccggg gcctcgtgag ctggtcccgg gagtcccccg gggcgggggt tggtaaaat 599 <210> 9 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA_gene <400> 9 cctctagctc taccgattga tggctcagtg aggcgtccgg actggcccag ggaggtgggc 60 aactaccacc cagggccgga aagctctcca aactcggtca tttagaggaa gtaaaagtcg 120 taacaaggtc tccgttggat tagttttttc ccccctcttt gttct 165

Claims

닭진드기의 방제효과를 갖는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주(KFCC11746P).
제1항에 있어서, 상기 닭진드기는 데르마니수스 갈리나에(Dermanyssus gallinae)인 것을 특징으로 하는 메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae) JEF-214 균주.
메타리지움 아니소플리에(Metarhizium anisopliae ) JEF-214 균주를 포함하는 닭진드기 방제용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 상기 균주의 현탁액을 곡물배지에 접종하여 고체배양을 통해 제조된 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 액상제형, 분말제형 및 입상제형으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 제형화되는 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 닭진드기 방제용 조성물은 증량제 및 계면활성제를 추가로 포함하여 제형화하는 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 계면활성제는 닭진드기 방제용 조성물이 액상제형인 경우 비이온 계면활성제인 소듐 리그노설포네이트(Sodium lignosulfonate), 이소트리데실 알코올 에톡실레이트(isotridecyl alcohol ethoxylate) 및 아세틸렌 다이올(acetylene diol)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 계면활성제는 닭진드기 방제용 조성물이 분말제형 또는 입상제형인 경우 비이온 계면활성제인 소듐 리그노설포테이트(Sodium lignosulfonate) 또는 E0/P0/E0 블록 중합체(EO/PO/EO block copolymer)인 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 증량제는 광물성 분말인 것을 특징으로 하는 닭진드기 방제용 조성물.
a) 제3항의 닭진드기 방제용 조성물을 현탁액으로 제조하는 단계; 및
b) 상기 현탁액으로 침지처리하거나 또는 분무처리하는 단계;
를 포함하는 닭진드기 방제방법.