KR20190099401A - 올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법 - Google Patents

올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190099401A
KR20190099401A KR1020197016704A KR20197016704A KR20190099401A KR 20190099401 A KR20190099401 A KR 20190099401A KR 1020197016704 A KR1020197016704 A KR 1020197016704A KR 20197016704 A KR20197016704 A KR 20197016704A KR 20190099401 A KR20190099401 A KR 20190099401A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
norbornene
oligopeptide
polymer
peptide
thr
Prior art date
Application number
KR1020197016704A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102497769B1 (ko
Inventor
나오야 이치무라
Original Assignee
니폰 제온 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 니폰 제온 가부시키가이샤 filed Critical 니폰 제온 가부시키가이샤
Publication of KR20190099401A publication Critical patent/KR20190099401A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102497769B1 publication Critical patent/KR102497769B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/10—Methods of screening libraries by measuring physical properties, e.g. mass
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

목적의 단백질이나 펩타이드의 말단에 결합시킬 수 있는 올리고펩타이드를, 펩타이드 라이브러리로부터 효율 좋게 탐색하는 방법을 제공한다. 또한, 효율적이고 안전성이 높은 면역 측정 방법을 제공한다.

Description

올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법
본 발명은, 올리고펩타이드의 탐색 방법, 그리고 특정한 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법에 관한 것이다.
노르보르넨계 중합체로 이루어지는 성형체를 배양 용기로서 사용함으로써, 재조합 세포의 증식성이나 재조합 유전자의 발현량이 향상되는 것이 알려져 있다(특허문헌 1).
또한, 노르보르넨계 중합체로 이루어지는 성형체는, 단백질의 응집, 변성, 분해를 일으키기 어렵기 때문에, 단백질 용액 제제의 장기 보존에 호적한 것이 알려져 있다(특허문헌 2 등).
또한, 미량 함유의 물질을 검출하고, 정량하는 방법으로서, ELISA법(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)이라고 총칭되는 항원 항체 반응법이 범용되고 있다. 일반적으로, ELISA법에서는, 플라스틱제의 마이크로웰 플레이트 등의 용기 내표면에 고상화된 항체나 항원 등의 단백질과, 검체 중의 피험물의 반응을, 직접적으로 또는 간접적으로 검출한다.
그런데, 근년, 기재에 펩타이드 등의 생리 활성 물질 등을 고정화하여, 생체 시료 중의 대상 물질의 병렬 검출 및 분석 등을 행하는 기술이 개발되고 있다.
이러한 검출 및 분석 등에 사용하는 생리 활성 물질 고정화용 기판으로서, 예를 들어, 노르보르넨계 중합체로 이루어지는 기판 표면에, 검출 대상 물질의 비특이적인 흡착·결합을 억제하고, 생리 활성 물질을 고정화하기 위하여, 포스포릴콜린기를 갖는 유닛, 소수성기를 갖는 유닛 및 알데히드기 또는 말레이미드기를 갖는 유닛으로 구성되는 고분자 화합물을 피복하는 것이 제안되어 있다(특허문헌 3).
국제 공개 제2015/199119호 일본 공개특허공보 2011-168610호 일본 공개특허공보 2010-117189호 일본 공개특허공보 2009-080119호
그러나, 특허문헌 3의 방법에서는, 성형체의 단백질과 접하는 면이 노르보르넨계 중합체 이외의 고분자 화합물로 피복되기 때문에, 노르보르넨계 중합체가 갖는 단백질의 안정화 효과가 감소되어 버린다는 문제가 있었다.
또한, 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체는, 저형광인 것이 알려져 있기(특허문헌 4) 때문에, 형광 검출을 범용하는 ELISA에 호적하다고 생각된다. 그러나, 단백질 등의 물질의 소재 표면으로의 물리적 흡착성이 폴리스티렌과 비교하여 약하기 때문에, 항체나 항원을 표면에 고상화하는 것이 어렵다는 문제가 있었다.
또한, ELISA법에서는, 측정 시료를 웰 내에 첨가한 뒤, 웰 내로부터 측정 시료를 제거하는 조작과, 웰을 세정하는 조작이 필요한데, 측정 시료 중에는 감염증을 일으키는 바이러스나 미생물이 혼입되어 있을 가능성이 있어, 측정 조작 중에 액의 비말을 받는다는 것에서 기인하는 감염 리스크의 문제도 있다.
본 발명은, 이러한 종래 기술의 실정을 감안하여 이루어진 것으로, 목적의 단백질이나 펩타이드의 말단에 결합시킬 수 있는 올리고펩타이드를, 펩타이드 라이브러리로부터 효율 좋게 탐색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 효율적이고 안전성이 높은 면역 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 목적의 단백질이나 펩타이드의 말단에 결합시킬 수 있고, 또한, 노르보르넨계 중합체에 접착성을 갖는 올리고펩타이드를 사용함으로써, 노르보르넨계 중합체가 갖는 단백질의 안정화 효과를 감소시키지 않고, 노르보르넨계 중합체에, 직접 목적의 단백질이나 펩타이드를 효율 좋게 고정화할 수 있는 것을 착상하여, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 행하였다.
그 결과, 노르보르넨계 중합체로 이루어지는 성형체에 펩타이드 라이브러리를 폭로한 후에, 수계 용매로 세정한 결과, 당해 성형체의 표면에, 노르보르넨계 중합체로의 접착성이 높은 펩타이드가 얻어지는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
이렇게 하여 본 발명에 의하면, 하기의 (1)~(4)의 올리고펩타이드의 탐색 방법, (5)~(7)의 올리고펩타이드, (8)의 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드, (9)~(12)의 면역 측정 방법이 제공된다.
(1) 랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 펩타이드 라이브러리를, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체의 상기 표면에 폭로하는 단계(I)와,
폭로된 상기 표면을 수계 용매로 세정하는 단계(II)와,
상기 표면에 잔류하는 화합물을, 그 표면을 유기 용매로 세정함으로써 회수하는 단계(III)와,
회수한 상기 화합물의 펩타이드 서열 정보를 해석하는 단계(IV)를 포함하는, 올리고펩타이드의 탐색 방법.
(2) 상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인 (1)에 기재된 올리고펩타이드의 탐색 방법.
(3) 상기 수계 용매가, 완충액인 (1) 또는 (2)에 기재된 올리고펩타이드의 탐색 방법.
(4) 상기 유기 용매가 극성 유기 용매인 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 올리고펩타이드의 탐색 방법.
(5) Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 올리고펩타이드.
(6) 노르보르넨계 중합체에 대하여 접착성을 갖는, (5)에 기재된 올리고펩타이드.
(7) 상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인, (6)에 기재된 올리고펩타이드.
(8) Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 노르보르넨계 중합체에 접착성을 갖는, 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드.
(9) 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기의 내표면에, 청구항 1~4 중 어느 한 항에 기재된 탐색 방법에 의해 탐색된 올리고펩타이드를 고상화하고,
내표면에 올리고펩타이드를 고상화한 상기 용기를 사용하여 측정을 행하는, 면역 측정 방법.
(10) 상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인, (9)에 기재된 면역 측정 방법.
(11) 상기 올리고펩타이드가 Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는, (9) 또는 (10)에 기재된 면역 측정 방법.
(12) 상기 측정 전에 블로킹 처리를 더 행하고,
블로킹 처리제로서, Tween20을 사용하는, (9)~(11) 중 어느 하나에 기재된 면역 측정 방법.
본 발명에 의하면, 목적의 단백질이나 펩타이드의 말단에 결합시킬 수 있는 올리고펩타이드를, 펩타이드 라이브러리로부터 효율 좋게 탐색할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 효율적이고 안전성이 높은 면역 측정 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른, 노르보르넨계 중합체에 접착성이 있는 올리고펩타이드의 탐색 방법 순서를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 2에 있어서 얻어진 올리고펩타이드의, 각종 폴리머 성형체로의 접착성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예 3에 있어서의, 폴리펩타이드 3이 접착된 1060R 디쉬 상의 CHO 세포의 현미경 사진이다.
도 4는 실시예 3에 있어서의, 폴리펩타이드 2가 접착된 1060R 디쉬 상의 CHO 세포의 현미경 사진이다.
도 5는 실시예 3에 있어서의, 폴리펩타이드 2도 3도 접착되지 않은 1060R 디쉬 상의 CHO 세포의 현미경 사진이다.
도 6은 항원 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 7은 항원 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 8은 블로킹제가 흡광도에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 BNP 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대하여, 1) 올리고펩타이드의 탐색 방법, 2) 올리고펩타이드, 및 3) 노르보르넨계 중합체에 접착성을 갖는 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드, 4) 면역 측정 방법으로 항을 나누어, 상세하게 설명한다.
1) 올리고펩타이드의 탐색 방법
본 발명의 제1 양태는, 랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 펩타이드 라이브러리를, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체의 상기 표면에 폭로하는 단계(I)와, 폭로된 상기 표면을 수계 용매로 세정하는 단계(II)와, 상기 표면에 잔류하는 화합물을, 그 표면을 유기 용매로 세정함으로써 회수하는 단계(III)와, 회수한 상기 화합물의 펩타이드 서열 정보를 해석하는 단계(IV)를 포함하는, 올리고펩타이드의 탐색 방법이다.
<단계(I)>
단계(I)는, 랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 펩타이드 라이브러리를, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체의 상기 표면에 폭로하는 단계이다.
상기 탐색 방법에 사용하는 펩타이드 라이브러리는, 랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 것으로, 일반적으로 펩타이드 라이브러리로서 널리 사용되는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열을 랜덤하게 하여 유기 합성하여 얻어지는 펩타이드나, 단백질을 랜덤하게 절단하여 얻어지는 펩타이드 등의 펩타이드 혼합물; 파지 등의 바이러스 입자의 표면에, 말단 영역의 아미노산 서열이 랜덤한 단백질이 제시되어 있는, 디스플레이 라이브러리; 등이어도 된다.
본 발명의 일 양태에 따른 탐색 방법에서는, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체를 사용한다. 즉, 상기 성형체는, 펩타이드 라이브러리가 폭로되는 성형체 표면이, 적어도 노르보르넨계 중합체로 구성되어 있으면 된다. 또한, 성형체 표면이 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 되고, 혹은, 성형체 전체가 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 된다.
노르보르넨계 중합체는, 노르보르넨 골격을 갖는 단량체 단위를, 노르보르넨계 중합체를 구성하는 전체 단량체 단위에 대하여 50 질량% 이상, 바람직하게는 60 질량% 이상 포함하는 중합체이다. 보다 구체적으로는, 노르보르넨계 중합체는, 노르보르넨 골격을 갖는 단량체인 노르보르넨계 단량체를 중합하여 이루어지는 것으로, 개환 중합에 의해 얻어지는 것과, 부가 중합에 의해 얻어지는 것으로 대별된다.
개환 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체, 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체, 및 이들의 수소화물 등을 들 수 있다.
부가 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 부가 중합체 및 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 중합체는, 각각 단독으로, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
이들 중에서도, 본원발명의 효과가 보다 얻어지기 쉬운 점에서, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물이 바람직하다.
노르보르넨계 중합체의 합성에 사용 가능한 노르보르넨계 단량체로는, 비시클로[2.2.1]헵타-2-엔(관용명: 노르보르넨), 5-메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5,5-디메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸리덴-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-비닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-프로페닐비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-시아노비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메틸-5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔 등의 2고리식 단량체;
트리시클로[4.3.01,6.12,5]데카-3,7-디엔(관용명: 디시클로펜타디엔), 2-메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디하이드록시디시클로펜타디엔 등의 3고리식 단량체;
테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센(테트라시클로도데센), 테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8,9-디메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸-8-카르복시메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 7,8-벤조트리시클로[4.3.0.12,5]데카-3-엔(관용명: 메타노테트라하이드로플루오렌: 1,4-메타노-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌이라고도 한다), 1,4-메타노-8-메틸-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-클로로-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-브로모-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌 등의 4고리식 단량체; 등을 들 수 있다.
이들 노르보르넨계 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 시클로헥센, 시클로헵텐, 시클로옥텐, 1,4-시클로헥사디엔, 1,5-시클로옥타디엔, 1,5-시클로데카디엔, 1,5,9-시클로도데카트리엔, 1,5,9,13-시클로헥사데카테트라엔 등의 단환의 시클로올레핀계 단량체를 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 부가 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 에틸렌, 프로필렌, 1-부텐, 1-펜텐, 1-헥센 등의 탄소수 2~20의 α-올레핀계 단량체; 시클로부텐, 시클로펜텐, 시클로헥센, 시클로옥텐, 테트라시클로[9.2.1.02,10.03,8]테트라데카-3,5,7,12-테트라엔(3a,5,6,7a-테트라하이드로-4,7-메타노-1H-인덴이라고도 한다) 등의 시클로올레핀계 단량체; 1,4-헥사디엔, 4-메틸-1,4-헥사디엔, 5-메틸-1,4-헥사디엔, 1,7-옥타디엔 등의 비공액 디엔계 단량체; 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 노르보르넨계 단량체와 부가 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, α-올레핀계 단량체가 바람직하고, 에틸렌이 보다 바람직하다.
이들 그 밖의 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 개환 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다.
개환 중합 촉매로는, 예를 들어, 루테늄, 오스뮴 등의 금속의 할로겐화물과, 질산염 또는 아세틸아세톤 화합물, 및 환원제로 이루어지는 촉매, 혹은, 티탄, 지르코늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속의 할로겐화물 또는 아세틸아세톤 화합물과, 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물은, 통상, 상기 개환 중합체의 중합 용액에, 니켈, 팔라듐 등의 전이 금속을 포함하는 공지의 수소화 촉매를 첨가하여, 탄소-탄소 불포화 결합을 수소화함으로써 얻을 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 부가 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 부가 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다.
부가 중합 촉매로는, 예를 들어, 티탄, 지르코늄 또는 바나듐 화합물과 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
노르보르넨계 중합체의 분자량에 특별한 제한은 없지만, 시클로헥산 용액(중합체가 용해되지 않는 경우에는 톨루엔 용액)의 겔·퍼미에이션·크로마토그래피(GPC)로 측정한 폴리스티렌 환산의 중량 평균 분자량으로, 통상 5,000 이상이고, 바람직하게는 5,000~500,000, 보다 바람직하게는 8,000~200,000, 특히 바람직하게는 10,000~100,000이다. 중량 평균 분자량이 이 범위 내일 때에, 기계적 강도와 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
노르보르넨계 중합체의 유리 전이 온도는, 사용 목적에 따라 적당히 선택되면 되는데, 통상 50~300℃, 바람직하게는 100~280℃, 특히 바람직하게는 115~250℃, 더욱 바람직하게는 130~200℃이다. 유리 전이 온도가 이 범위 내일 때에, 내열성과 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
상기 노르보르넨계 중합체의 유리 전이 온도는, JIS K 7121에 기초하여 측정된 것이다.
노르보르넨계 중합체는, 각각 단독으로, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 성형체 표면을 구성하는 수지 성분으로서, 노르보르넨계 중합체에 더하여, 임의로, 열가소성 수지 재료에서 통상 사용되고 있는 배합제, 예를 들어, 연질 중합체, 산화 방지제, 자외선 흡수제, 광 안정제, 근적외선 흡수제, 이형제, 염료나 안료 등의 착색제, 가소제, 대전 방지제, 형광 증백제 등의 배합제를, 통상 채용되는 양, 첨가할 수 있다. 여기서, 노르보르넨계 중합체에 대하여 연질 중합체를 혼합하여 사용하는 경우에는, 노르보르넨계 중합체인 지환 구조 함유 중합체 100 질량부에 대하여, 통상 0.01~20 질량부, 바람직하게는 0.05~10 질량부, 보다 바람직하게는 0.05~5 질량부이다.
또한, 성형체 표면을 구성하는 수지 성분으로서, 노르보르넨계 중합체, 및 상술한 배합제의 하나인 연질 중합체 이외에, 그 밖의 중합체(이하, 간단히 「그 밖의 중합체」라고 한다)를 혼합해도 된다. 노르보르넨계 중합체에 혼합되는 그 밖의 중합체의 양은, 노르보르넨계 중합체 100 질량부에 대하여, 통상 200 질량부 이하, 바람직하게는 150 질량부 이하, 보다 바람직하게는 100 질량부 이하이다.
노르보르넨계 중합체에 대하여 배합하는 각종 배합제나 그 밖의 중합체의 비율이 지나치게 많으면 세포가 부유하기 어려워지기 때문에, 모두 지환 구조 함유 중합체의 성질을 손상시키지 않는 범위에서 배합하는 것이 바람직하다.
노르보르넨계 중합체와, 배합제나 그 밖의 중합체의 혼합 방법은, 폴리머 중에 배합제가 충분히 분산되는 방법이면, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 배합의 순서에 특별한 제한은 없다. 배합 방법으로는, 예를 들어, 믹서, 1축 혼련기, 2축 혼련기, 롤, 브라벤더, 압출기 등을 사용하여 수지를 용융 상태에서 혼련하는 방법; 적당한 용제에 용해하여 분산시킨 후, 응고법, 캐스트법, 또는 직접 건조법에 의해 용제를 제거하는 방법; 등을 들 수 있다.
2축 혼련기를 사용하는 경우, 혼련 후에는, 통상은 용융 상태에서 봉상으로 압출하고, 스트랜드 커터로 적당한 길이로 잘라, 펠릿화하여 사용되는 경우가 많다.
이러한 노르보르넨계 중합체를 사용하여, 통상, 임의의 성형 방법, 예를 들어, 사출 성형법, 압출 성형법, 블로우 성형법, 진공 성형법, 프레스 성형법, 압축 성형법, 회전 성형법, 캐스트 성형법 등에 의해, 임의의 형상을 갖는 성형체로 성형할 수 있다.
노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체(노르보르넨계 중합체 성형체)로는, 예를 들어, 노르보르넨계 중합체 성형체를 세포 배양에 사용하는 경우에 있어서는, 노르보르넨계 중합체제 배양 용기를 들 수 있다.
예를 들어, 디쉬상의 배양 용기이면, 사출 성형법 등에 의해 성형할 수 있다.
한편, 상기 배양 용기는, 펩타이드 라이브러리가 폭로되는 부분의 표면이, 적어도 노르보르넨계 중합체로 구성되어 있으면 된다.
또한, 당해 펩타이드 라이브러리가 폭로되는 표면은, 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 되고, 혹은, 배양 용기 전체가 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 된다.
성형하여 얻어진 성형체는, 플라즈마 조사 등에 의한 친수화 처리를 실시하지 않고, 본 발명의 일 양태에 따른 펩타이드의 탐색 방법에 사용하는 것이 바람직하다. 친수화 처리를 실시함으로써 표면이 산화되고, 이에 의해, 산화된 표면에 펩타이드가 비특이적으로 접착되기 때문에, 당해 표면에 잔류하는 펩타이드의 종류가 많아져, 특정한 펩타이드를 탐색하는 것이 곤란해질 우려가 있기 때문이다.
상기 노르보르넨계 중합체 성형체는, 통상, 멸균 처리하여 사용된다.
멸균 처리의 방법에 특별한 제한은 없고, 고압 증기법이나 건열법 등의 가열법; γ선이나 전자선 등의 방사선을 조사하는 방사선법이나 고주파를 조사하는 조사법; 산화에틸렌 가스(EOG) 등의 가스를 접촉시키는 가스법; 멸균 필터를 사용하는 여과법; 등, 의료 분야에서 일반적으로 채용되는 방법으로부터, 성형체의 형상이나 사용하는 세포에 따라, 적당히 선택할 수 있다.
성형된 노르보르넨계 중합체 성형체의 표면(노르보르넨계 중합체제 배양 용기의 내면)에, 본 발명의 일 양태인 올리고펩타이드나 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드를 접촉시킴으로써, 성형체 표면(배양 용기 내면)에 당해 올리고펩타이드나 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드를 부착시킬 수 있다.
랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 펩타이드 라이브러리를, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체의 상기 표면에 폭로하는 단계에서는, 예를 들어, 인산 완충액이나 세포 배양액 등 펩타이드 라이브러리의 변성을 초래하지 않는, 대략 중성의 액상 매체로, 펩타이드 라이브러리를 용해 또는 현탁시킨 펩타이드 라이브러리액을, 상기 표면에 접촉시키는 방법이 채용된다. 접촉 시간은, 통상 1분~10시간, 바람직하게는 5분 내지 2시간이다. 접촉 시간이 지나치게 짧으면, 접착성이 있는 펩타이드가 성형체에 충분히 접착되지 못할 우려가 있고, 반대로 접촉 시간이 지나치게 길면 펩타이드의 변성 등에 의해 본래 성형체에 접착성을 갖지 않는 것이 접착될 우려가 있어, 모두 바람직하지 않다. 접촉시의 온도는, 통상 15~35℃, 바람직하게는 20~30℃이다. 온도가 지나치게 높으면, 펩타이드 라이브러리액의 증발이 진행되고, 온도가 지나치게 낮으면 펩타이드 라이브러리의 본래의 접착성이 얻어지지 않을 가능성이 있어, 모두 바람직하지 않다.
<단계(II)>
단계(II)는, 단계(I)의 폭로 후에, 폭로된 당해 표면을 수계 용매로 세정하는 단계이다.
사용하는 수계 용매는, 노르보르넨계 중합체로의 특이적인 접착성을 갖는 것을 선택하기 쉬운 점에서, 완충액, 산성 수용액, 및 염기성 수용액의 3종의 조합이 바람직하다. 수계 용매에 의한 세정의 순서는 임의로 설정할 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명의 효과가 보다 얻어지기 쉬운 점에서, 완충액이 바람직하다.
완충액은 소량의 산이나 염기를 첨가하거나, 다소 농도가 변화하거나 해도 pH가 크게 변화하지 않도록 한 용액이다.
완충액으로는, 통상 pH 5~9, 바람직하게는 pH 6.8~8.3의 것을 사용한다. 구체적으로는, 인산을 완충 성분으로 하는 인산 완충액, 인산 완충액에 염화나트륨을 첨가한 인산 완충 식염수, 아세트산을 완충 성분으로 하는 아세트산 완충액, 시트르산을 완충 성분으로 하는 시트르산 완충액, 붕산을 완충 성분으로 하는 붕산 완충액, 트리스하이드록시메틸아미노메탄을 완충 성분으로 하는 트리스 완충액, 및 트리스 완충액에 EDTA 등의 금속 킬레이팅제 또는 붕산 또는 아세트산을 첨가한 완충액 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이들은 단독으로, 또는 복수 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
산성 수용액으로는, 통상 pH 1~4, 바람직하게는 pH 2.5~3의 것을 사용한다. 산성 수용액의 조제에 사용하는 산으로는, 염산, 황산, 인산, 트리플루오로아세트산, 산으로 pH 조제한 글리신 수용액, 산으로 pH 조제한 시트르산 수용액 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 산성 수용액의 pH에 폭로된 펩타이드 라이브러리를 회수 후에, 신속하게 pH를 중성 조건으로 하기 위한 조작 상의 관점에서, 수 mM 정도의 농도의 희박한 산 용액이나, 1 M 정도의 트리스하이드록시메틸아미노메탄 수용액을 혼합함으로써 중성 pH로 용이하게 조제할 수 있는 pH 2.5 정도로 조제된 글리신 용액 등이 바람직하다.
이들은 단독으로, 또는 복수 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
염기성 수용액으로는, 통상 pH 8~11.5, 바람직하게는 pH 10~11.5의 것을 사용한다. 염기성 수용액의 조제에 사용하는 염기로는, 트리에틸아민 또는 트리에탄올아민과 같은 수용성 아민, 암모니아, 수산화암모늄과 같은 암모늄염, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화나트륨으로 pH 조제된 글리신 수용액 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 염기성 수용액의 pH에 폭로된 펩타이드 라이브러리를 회수 후에, 신속하게 pH를 중성 조건으로 하기 위한 조작 상의 관점에서, 상술한 염기성 수용액에서, 200 mM 이하의 희박 농도로 한 암모니아염 수용액 또는 글리신 수용액 등이 바람직하다. 이들은 단독으로, 또는 복수 종류를 조합하여 사용할 수 있다.
수계 용매에 의한 세정 횟수나 세정에 사용하는 수계 용매의 양은, 세정하고 싶은 부분의 형상이나 세정하고 싶은 면적에 따라 임의로 선택할 수 있다. 통상의 배양 디쉬와 같은 평면이면, 완충액 산성 수용액, 및 염기성 수용액의 세정 횟수는, 모두 통상 1~5회, 바람직하게는 2~4회이다. 1회의 세정에 사용하는 수계 용매의 양은, 세정 대상 면적당, 통상 10~0.01 ml/cm2, 바람직하게는 2~0.1 ml/cm2이다. 수계 용매의 양이 지나치게 적으면 세정이 불충분해지고, 한편, 많이 사용해도, 세정 효과에 한계가 있기 때문에 낭비가 된다.
<단계(III)>
단계(III)는, 단계(II)의 세정 후에, 성형체 표면에 잔류하는 화합물을, 당해 성형체 표면을 유기 용매로 세정함으로써 회수하는 단계이다.
단계(II)에 있어서의 수계 용매에 의한 세정 후에, 노르보르넨계 중합체 성형체의 표면에 잔류하는 화합물을 회수하기 위하여 유기 용매로 세정한다.
수계 용매에 의한 세정에도 견뎌, 노르보르넨계 중합체 성형체의 표면에 잔류하는 펩타이드는, 노르보르넨계 중합체로의 접착성이 높은 것이라고 생각할 수 있다.
세정에 사용하는 유기 용매는, 수계 매체로 희석하지 않고 사용할 수도 있으나, 수계 매체로 희석한 희석액으로서 사용하는 것이, 디스플레이 라이브러리 등의 바이러스 증식 특성을 이용한 스크리닝계인 경우에는, 그 증식 특성에 미치는 영향을 적게 할 수 있기 때문에 바람직하다. 따라서, 본 발명에 사용하는 유기 용매는, 물과 혼화성을 갖는 극성 유기 용매인 것이 바람직하다.
극성 유기 용매로는, 디메틸술폭시드 등의 함황계 유기 용매; 디메틸포름아미드 등의 아미드계 유기 용매; 메탄올, 이소프로판올 등의 알코올계 유기 용매; 아세토니트릴 등의 니트릴계 유기 용매; 등을 들 수 있다.
수계 매체로 희석하여 사용하는 경우의 극성 용매의 농도는, 희석액 전체에 대하여, 통상 5 중량%~90 중량%, 바람직하게는 5 중량%~50 중량%이다.
유기 용매에 의한 세정 횟수나 세정에 사용하는 유기 용매의 양은, 세정하고 싶은 부분의 형상이나 세정하고 싶은 면적에 따라 임의로 선택할 수 있다. 성형체 표면이 통상의 배양 디쉬와 같은 평면이면, 세정 횟수는 통상 1~5회, 바람직하게는 1~2회이다.
1회의 세정에 사용하는 유기 용매(수계 매체로 희석한 경우에는, 그 희석액)의 양은, 통상 0.01~10 ml/cm2, 바람직하게는 0.1~2 ml/cm2이다.
세정에 사용하는 유기 용매의 양이 지나치게 적으면 세정이 불충분해지고, 한편 많이 사용해도 세정 효과에 한계가 있기 때문에 낭비가 된다.
<단계(IV)>
단계(IV)는, 단계(III)에서 회수한 상기 화합물의 펩타이드 서열 정보를 해석하는 단계이다.
즉, 유기 용매로 세정하여 회수된 세정 처리 후의 액 중의 펩타이드 서열 정보를 해석하여, 노르보르넨계 중합체에 접착성이 있는 폴리올리고펩타이드의 아미노산 서열을 확인한다.
펩타이드 라이브러리로서, 펩타이드 혼합물, 및 일부(통상은 말단 영역)의 아미노산 서열이 랜덤한 단백질이 제시되어 있는 폴리머 입자를 포함하는 디스플레이 라이브러리를 사용한 경우에는, 기존의 아미노산 서열 해석법(질량 분석 등)에 의해 직접 아미노산 서열을 확인할 수 있다.
또한, 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 경우에는, 파지의 유전자를 해석하여, 대응하는 아미노산 서열을 구할 수 있다.
2) 올리고펩타이드
본 발명의 제2 양태는, 특정한 아미노산 서열로 이루어지는 올리고펩타이드이다. 올리고펩타이드란, 2~10개 정도라는 비교적 소수의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드이다. 올리고펩타이드로는, 예를 들어, 단백질(폴리펩타이드)을, 효소적, 화학적으로 분해하여 얻어지는 폴리펩타이드 사슬을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따른 올리고펩타이드는, Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr로 나타내어지는 아미노산 서열(이하, 「특정한 아미노산 서열」이라고 하는 경우가 있다)을 포함한다. 이러한 아미노산 서열을 포함하는 올리고펩타이드는, 노르보르넨계 중합체에 접착성이 있는 올리고펩타이드이다. 한편, 올리고펩타이드는, Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)로 나타내어지는 아미노산 서열만으로 이루어지는 것으로 해도 된다.
본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드는, 상술한 본 발명의 제1 양태에 따른 노르보르넨계 중합체에 접착성이 있는 펩타이드의 탐색 방법에 의해 탐색할 수 있는 올리고펩타이드의 1종이다.
3) 노르보르넨계 중합체에 접착성을 갖는 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드
본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체에 접착성이 있는 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드(이하, 「노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드」라고 한다)는, 그 말단에 또는 그 내부에, 상기 특정한 아미노산 서열을 함유하는 것이다. 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드는, 직쇄형이어도 되고 분기형이어도 된다.
본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드는, 본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드에, 임의의 (폴리)펩타이드를 부가, 삽입, 또는 일부의 아미노산과 치환시켜 얻을 수 있다.
임의의 (폴리)펩타이드로는, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 비트로넥틴 등의 세포외 매트릭스; 인터류킨, 혈소판 유래 성장 인자, 간세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 종양 괴사 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 트랜스포밍 성장 인자, 아디포넥틴 등의 사이토카인류; 인테그린이나 PD-1 등의 세포막 수용체, CD2나 CD60 등의 세포 표면 항원 등의 생리 활성을 갖는 (폴리)펩타이드나, 합텐 항원·단백질 항원을 인식할 수 있는 항체; 히스티딘 태그, 티오레독신 태그, 글루타티온 S-트랜스페라아제 태그, 말토오스 결합 단백질 태그나, GFP나 루시페라아제 등의 형광 표지 단백질 등의 유전자 공학적에 있어서 유용한 기능을 갖는 (폴리)펩타이드; 기능 불명의 아미노산 서열로 이루어지는 (폴리)펩타이드;를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드와, 임의의 (폴리)펩타이드의 연결이나 펩타이드 길이 조절 등을 위하여, 링커 서열을 삽입할 수도 있다.
본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드는, 상기 특정한 아미노산 서열을, 1개 또는 복수개 함유하는 것이다.
본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드의, 「본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드를 구성하는 총 아미노산수/본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드에 포함되는 본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드수」(α)는, 바람직하게는 7 이상 80 이하, 보다 바람직하게는 10 이상 50 이하이다.
상기 α가 80을 초과하는 경우, 본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드는, 본 발명의 제3 양태에 따른 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드의 말단으로부터 바람직하게는 20, 보다 바람직하게는 10개의 아미노산 이내에 적어도 하나의 상기 특정한 아미노산 서열이 존재하는 것이, 노르보르넨계 중합체와의 접착성의 관점에서 바람직하다.
4) 면역 측정 방법
본 발명의 제4 양태에 따른 면역 측정 방법은, 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기의 내표면에, 본 발명의 제2 양태에 따른 올리고펩타이드를 고상화한 용기를 사용하여 행한다.
사용하는 용기로는, 예를 들어, 96 웰 플레이트나 384 웰 플레이트나 큐벳을 들 수 있다. 이들 용기는, 사출 성형법 등에 의해 성형할 수 있는 것 외에, 노르보르넨계 중합체의 필름을 저면에 인서트 형성한 웰 플레이트여도 되고, 판상의 노르보르넨계 중합체를 절삭 가공 등에 의해 제작한 유로 칩이어도 된다.
한편, 상기 용기는, 상기 올리고펩타이드가 고상화되는 부분의 표면이, 적어도 앞서 상세히 서술한 노르보르넨계 중합체로 구성되어 있으면 된다.
또한, 상기 올리고펩타이드를 고상화하는 표면은, 앞서 상세히 서술한 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 되고, 혹은, 용기 전체가 앞서 상세히 서술한 노르보르넨계 중합체만으로 이루어지는 것으로 해도 된다.
노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기의 내표면에 상기 올리고펩타이드를 고정하는 방법은, 고상화하는 올리고펩타이드를 포함하는 수용액을 용기 내표면으로 일정 시간 폭로하면 된다. 수용액에는, 인산 완충 생리 식염수와 같이 완충액 성분이 포함되어 있어도 되고, 디메틸술폭시드 등의 물에 용해되는 유기 용매가 포함되어 있어도 된다.
용기 표면으로의 폭로 조작으로는, 용기 내에 고상화하는 올리고펩타이드를 포함하는 수용액을 첨가하는 방법이어도 되고, 잉크젯이나 제트 디스펜서와 같은 디스펜서, 분무 등의 방법이어도 되며, 스탬프 조작에 의한 방법이어도 된다.
고상화 조작의 온도는, 실온이면 되며, 가온하는 경우에는, 상기 올리고펩타이드가 열변성을 받지 않는 온도 범위에서, 물이 증산하여 용액 농도가 변화하지 않도록 할 수 있으면 된다. 또한, 보냉 상태여도 되고, 고상화하는 항원을 포함하는 수용액이 동결되지 않는 온도이면 된다.
이렇게 하여, 상기 올리고펩타이드를 접촉시킨 후, 당해 용액을 제거하고, 인산 완충 생리 식염수 등으로 세정한다.
고상화 조작 후에는, 특별한 건조 조작을 행할 필요는 없지만, 고상화 조작으로 용기 내에 잔류한 미소한 액적을 제거하기 위하여, 송풍이나 감압 등의 처리를 행하는 것으로 해도 된다.
고상화한 올리고펩타이드가 항원 또는 그 일부의 항체 인식 부위(이하, 종합하여 「항원 등」이라고 한다)인 경우, 면역 측정 방법에서는, 항원 등과 결합하는 표지 항체를 결합시킬 수 있다.
항체의 표지 물질은, 공지의 면역 측정에서 사용되고 있는 표지 물질과 동일한 것을 사용할 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 구체예로는, 효소, 형광 물질, 화학 발광 물질, 비오틴, His 태그 등의 태그, 금 등의 나노 입자, 합텐 항원, 염색 물질, 동위체, 유로퓸, 방사성 물질 등을 들 수 있다. 효소로는, 알칼리포스파타아제(ALP), 페록시다아제, β갈락토시다아제 등, 공지의 것을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 면역 측정 방법에 있어서는, 상기 올리고펩타이드를 고상화한 후, 용기 내표면에 비특이적인 (폴리)펩타이드 등의 흡착을 방지할 목적에서, 블로킹 처리를 행할 수 있다.
블로킹 처리는, Tween20 등의 계면 활성제를 사용하는 것이 바람직하다. 혹은, 알부민이나 밀크 카세인 등의 단백질을 사용해도 된다.
이와 같이 하여 얻어진, 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기 내표면에 올리고펩타이드가 고상화된 용기를 사용하여, 면역 측정을 행한다. 당해 면역 측정은, 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기 내표면에 고상화된 올리고펩타이드와 용액 내의 항체의 항원 항체 반응을 이용하는 것인데, 당해 용기와의 조합에 의한 면역 측정에 있어서, 측정 방법에 특별한 제한은 없고, 일반적으로 알려져 있는 ELISA법의 직접법, 간접법, 샌드위치법, 경합법 등에 기초하는 측정 원리를 적용할 수 있다.
상기 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기 내표면에 고상화된 올리고펩타이드와 용액 내의 항체의 항원 항체 반응을 이용하는 대표적인 측정 방법으로서, (i) 미리 항체를, 용기 내에 고상화된 올리고펩타이드에 결합시킨 후, 피험물을 포함하는 시료를 첨가하는 방법과, (ii) 올리고펩타이드를 고상화한 후, 피험물을 포함하는 시료를 항체와 동시에 첨가하는 방법을 들 수 있다.
(i)의 방법에 있어서는, 효소나 형광 색소나 비오틴 등 표지를 수식한 항체로서, 올리고펩타이드에 특이적으로 인식하는 항체를, 올리고펩타이드를 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기 내표면에 고상화한 용기에 첨가하여, 고상화 항원에 반응시키고, 미반응의 잉여의 항체를 세정 제거한다. 이어서, 측정 대상의 시료를 용기 내에 첨가하여, 시료 중의 항원과 용기 내의 항체를 반응시키고, 용기 내에 있는 표지 항체를 회수한다. 그 후, 회수한 표지 항체에서 기인하는 표지 신호를 측정함으로써, 시료 중의 항원 농도를 계측한다.
(ii)의 방법에 있어서는, 올리고펩타이드를 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기 내표면에 고상화한 용기에, 효소나 형광 색소나 비오틴 등 표지를 수식한 항체로서, 항원을 특이적으로 인식하는 항체와, 피험물을 포함하는 시료를 혼합하거나, 또는 혼합하지 않고 독립적으로 동시에, 첨가하여, 항체를 고상화 항원에 반응시키고, 고상화 항원에 반응하지 않은 표지 항체를 회수한다. 그 후, 회수한 표지 항체에서 기인하는 표지 신호를 측정함으로써, 시료 중의 항원 농도를 계측한다.
상기의 (i)의 방법과 (ii)의 방법에 있어서는, 측정 대상의 시료를 상기의 용기에 넣어 측정을 행하는데, 일반적인 ELISA법의 직접법, 간접법, 샌드위치법, 경합법 등과 같이, 측정 시료를 첨가한 후의 용기 내의 세정 조작을 필요로 하지 않는다.
(i)의 방법에서는, 측정 시료 중의 측정 대상 항원을, 측정 용기 내에 미리 고상화 올리고펩타이드에 흡착한 표지 항체와 반응시키고, 그 후, 표지 항체를 시료 용액 중에 용출시키고, 그 용출 항체를 취출하여, 표지에 의한 신호를 얻음으로써, 측정 시료 중의 측정 항원의 농도를 측정할 수 있다. 그 때문에, 측정 시료를 첨가한 후의 용기 내의 세정 조작은 불필요하게 된다.
(ii)의 방법에서는, 측정 시료 중의 측정 대상 항원과 표지 항체를 동시에 측정 용기 내에 첨가한다. 측정 시료 중의 측정 대상 항원과 반응하지 않은 표지 항체가, 용기 내의 고상화 올리고펩타이드와 반응하지만, 측정 시료를 취출하여, 시료 중에 포함되는 표지 항체의 표지에 의한 신호를 검출함으로써, 측정 시료 중의 측정 대상 항원과 반응한 표지 항체를 반영한 신호를 측정할 수 있다. 그 때문에, 측정 시료를 첨가한 후의 용기 내의 세정 조작은 불필요하게 된다.
이와 같이, 측정 시료를 용기 내에 첨가하여, 면역 반응시킨 후, 그 시료액을 취출하는 조작만이 필요하게 된다.
측정 대상의 시료가, 인간 등의 생체 유래의 시료, 혹은, 배양 세포 유래의 시료인 경우에는, 시료로의 감염성 미생물의 혼입에서 기인하는 감염증의 리스크가 있어, 시료의 취급시에 있어서의 감염 방지를 위한 주의가 필요하게 된다.
ELISA법에서는, 시료를 통상의 측정 용기에 넣어 항원 항체 반응을 행한 경우, 용기를 세정하는 것이 일반적인 조작으로 되어 있다. 그 세정 조작에서는, 세정수가 많이 발생하고, 또한, 세정 용액을 용기로부터 제거하는 조작에 있어서도, 세정 용액의 미스트·비말이 발생하여, 조작자에게의 폭로이나, 자동 장치 내로의 폭로 등이 일어날 가능성이 염려된다. 이 때문에, 시료에 감염성 미생물이 혼입되어 있을 가능성을 부정할 수 없는 경우에는, 감염증의 리스크가 높아진다.
이에 대하여, 상기 (i) 및 (ii)의 방법에서는, 측정 대상 시료를 측정의 용기에 첨가한 후에는, 세정 조작을 행하지 않고 측정할 수 있으므로, 감염성 미생물의 혼입을 부정할 수 없는 측정 대상 시료를 측정하는 경우에, 감염성 리스크를 현저하게 저감할 수 있다. 그 때문에, 안전하게 효율 좋게 면역 측정을 행할 수 있다.
한편, 상기 (i) 및 (ii)의 조작은, 인간의 수작업에 의한 조작으로 실시할 수도 있으나, 멀티채널의 자동 분주 장치, 로봇이나, 아암형의 로봇 장치 등으로 조작하는 것으로 해도 된다.
또한, 세정 조작을 필요로 하는 측정 방법에서는, 세정 조작을 복수회 반복하여 행하기 때문에, 시간을 필요로 하지만, 상기 (i) 및 (ii)의 방법이면, 세정 조작을 행할 필요가 없기 때문에, 보다 단시간에 효율적으로 계측이 가능하게 된다.
[실시예]
이하, 본 발명을, 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
<제1차 파지 용액의 취득>
파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로서, Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit(NewEnglandBioLabo사 제조)를 사용하였다.
파지 용액을 인산 완충액(PBS; 137 mmol/리터 NaCl, 8.1 mmol/리터 Na2HPO4, 2.68 mmol/리터 KCl, 1.47 mmol/리터 KH2PO4의 혼합액, pH 7.4)에 용해하여, 펩타이드 라이브러리 용액을 조제하였다.
노르보르넨계 개환 중합체 수소화물〔제오노아(등록상표) 1060R, 닛폰 제온사 제조〕로 이루어지는 직경 10 cm의 배양 디쉬 저면에, 조제한 펩타이드 라이브러리 용액을 적하하여, 실온(25℃)에서 30분간 정치하였다.
그 후, 상기 배양 디쉬 저면을 PBS로 3회 세정하였다.
계속해서, pH 2로 조제한 40 mM Glycine·HCl Buffer(pH 2.2)로 1회 세정하고, 추가로, pH 10으로 조제한 40 mM Glycine·NaOH(pH 10)를 적하하였다.
적하한 액을 회수하고, 즉시 희박 염산으로 pH를 중화(pH = 7.0)하여, 「알칼리로 세정하여 회수한 파지 용액」으로 하였다.
계속해서, 상기 배양 디쉬 저면에 10% DMSO를 포함하는 PBS를 적하하고, 적하한 용액을 회수하여, 「DMSO로 세정하여 회수한 파지 용액」으로 하였다.
지금까지의 공정도를 도 1에 나타낸다.
<제2차 파지 용액의 취득>
회수한 파지의 증식을 촉진하기 위하여, 이하의 방법으로 파지 감염 대장균을 조제하였다.
알칼리로 세정하여 회수한 파지 용액 및, DMSO로 세정하여 회수한 파지 용액을, 각각, 파지의 호스트가 되는 대장균 배양액에 적하하고, 37℃에서 16시간, 진탕 배양하여, 파지 감염 대장균 배양액을 얻었다.
조제한 펩타이드 라이브러리 용액 대신에, 파지 감염 대장균 배양액을, 노르보르넨계 개환 중합체 수소화물〔제오노아 1060R, 닛폰 제온사 제조〕로 이루어지는 직경 10 cm의 배양 디쉬 저면에 적하하는 것 이외에는, 상술(제1차 파지 용액의 취득)과 동일하게 하여, 알칼리로 세정하여 회수한 파지 용액과, DMSO로 세정하여 회수한 파지 용액을 얻었다.
<제3차 파지 용액의 취득>
이렇게 하여 얻어진 상기 2개의 파지 용액을 사용하여, 다시 파지의 증식을 촉진하기 위하여, 대장균에 감염시키고, 제2차 파지 용액의 취득과 동일하게 하여, 알칼리로 세정하여 회수한 파지 용액과 DMSO로 세정하여 회수한 파지 용액을 얻었다.
<파지의 유전자 해석>
제3차 파지 용액의 취득에 의해 얻어진 2개의 파지 용액에 포함되는 파지의 유전자 서열을 판독하여, 대응하는 아미노산 서열을 얻었다.
알칼리로 세정하여 회수한 파지 용액으로부터 얻어진, 즉, 높은 pH로 용출되는 특성을 갖는 아미노산 서열은, TVDNSLA(Thr-Val-Asp-Asn-Ser-Leu-Ala)(서열 번호 2)였다.
DMSO로 세정하여 회수한 파지 용액으로부터 얻어진, 즉, 알칼리 세정해도 계속 접착되어, 유기 용매로 용출되는 아미노산 서열은, TVDSCLT(Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr)(서열 번호 1)였다.
[실시예 2]
<폴리펩타이드의 합성>
실시예 1에서 얻어진 아미노산 서열을 기초로, 말단에 폴리펩타이드 검출을 위하여, 히스티딘을 6잔기 나열한 히스티딘 태그 서열을 갖는 폴리펩타이드로, 실시예 1에서 얻어진 아미노산 서열과 히스티딘 태그 서열 사이에, 글리신을 연결한 폴리펩타이드를 유기 합성하였다.
높은 pH로 용출되는 특성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 1로서, AYTVDNSLACGGGGGHHHHHH(Ala-Tyr-Thr-Val-Asp-Asn-Ser-Leu-Ala-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-His-His-His-His-His-His)(서열 번호 3)를 합성하였다.
또한, DMSO로 용출되는 특성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드 2로서, ACTVDSCLTCGGGGGHHHHHH(Ala-Cys-Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-His-His-His-His-His-His)(서열 번호 4)를 합성하였다.
<폴리펩타이드 용액의 조제>
폴리펩타이드 1, 폴리펩타이드 2, 및 인간 정상 IgG 항체(와코 순약 공업사 제조)를, 각각 PBS 용액, 및 10% DMSO를 포함하는 PBS(10% DMSO PBS)에, 각각 10 μg/ml의 농도로 용해하여 각종 용액을 조제하였다.
<용기로의 접착성 평가>
상기에서 조제된 각 폴리펩타이드 용액을, 노르보르넨계 개환 중합체 수소화물〔제오노아(등록상표) 1060R, 닛폰 제온사 제조〕을 사출 성형하여 얻어진 96 웰 플레이트(이하, 「1060R 플레이트」라고 한다), 및 폴리스티렌제의 96 웰 플레이트(제품명 「팔콘(등록상표)」, 코닝사 제조; 이하, 「TCPS 플레이트」라고 한다)에, 각각 1 웰당 50 μL를 첨가(N = 3)하여, 실온(25℃)에서 1시간 정치하였다.
정치 후에, 1060R 플레이트와 TCPS 플레이트의 웰 내를, T-TBS(0.05 m Tris 염산, 0.15 m 염화나트륨, 0.05% Tween20; pH 7.6)를 사용하여, 3회 세정한 후에, 나칼라이 테스크사 제조의 블로킹 원 시약의 5배 희석 용액을 블로킹 용액으로서, 1 웰당 200 μL씩 분주하여, 실온 1시간 정치함으로써, 블로킹 조작을 행하였다.
정치 후의 각 플레이트를, T-TBS로 5회 세정하고, 세정 후에, 폴리펩타이드의 검출용으로, (마우스항6 His 모노클로날 항체, 나칼라이 테스크사 제조)의 PBS 용액을 1 웰당 50 μL 첨가하여, 실온 1시간 정치하였다.
또한, 정치 후의 각 플레이트를, T-TBS(상동)로 5회 세정하고, 세정 후에, 페록시다아제 발색 시약을 1 웰당 50 μL 첨가하여, 실온 10분간 반응 발색시키고, 100 mM의 염산 수용액을 100 μL 첨가하여, 페록시다아제 반응을 정지시켰다.
각 플레이트의 웰에 대해, 웰 플레이트 리더 장치(코로나사 제조)를 사용하여, 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
측정 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에서는, 폴리펩타이드별로, 폴리펩타이드를 용해한 용매와 플레이트의 조합별의 결과를 표시하고 있다.
폴리펩타이드 2는, TCPS 플레이트와 비교하여, 1060R 플레이트에서, 보다 높은 450 nm의 흡광도를 나타내는 결과이며, 폴리펩타이드 2에 포함되는 아미노산 서열을 갖는 올리고펩타이드에, 노르보르넨계 중합체에 대한 높은 접착성이 있는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 3〕
실시예 2에 있어서, 노르보르넨계 중합체에 대한 접착성이 높은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 2에, 세포 표면의 파이브로넥틴 등의 수용체인 인테그린의 인식 아미노산 서열 RGD(Arg-Gly-Asp)를 갖게 하기 위하여, 실시예 2의 히스티딘 태그 앞에, RGD 모티브 RGDSP(Arg-Gly-Asp-Ser-Pro)를 삽입한, 노르보르넨계 중합체 접착성 수식 (폴리)펩타이드 「ACTVDSCLTCGGGGGRGDSPHHHHHH(Ala-Cys-Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-His-His-His-His-His-His)」(폴리펩타이드 3)(서열 번호 5)를 합성하였다.
이 폴리펩타이드 3과 실시예 2에서 얻은 폴리펩타이드 2를, 각각 PBS에 10 μg/ml의 농도로 용해한 용액을 여과 멸균하여, EOG 멸균 완료의 1060R 플레이트에, 1 웰당, 50 μL 첨가하여, 실온(25℃)에서 1시간 정치하였다.
정치 후, 폴리펩타이드 3과, 실시예 2에서 얻은 폴리펩타이드 2를 인큐베이션한 1060R 플레이트를, 각각 멸균 완료의 PBS로 3회 세정하여, 폴리펩타이드 3 코트 1060R 플레이트와, 폴리펩타이드 2 코트 1060R 플레이트를 얻었다.
이렇게 하여 얻어진 2개의 플레이트 및 폴리펩타이드로 코팅하지 않은 1060R 플레이트에, 무혈청 배지(무혈청 배지 ESF SFM Serum·Free Medium for Hybridoma, CHO&293Cells, Expression Systems사 제조)에 현탁한 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포를 웰에 첨가하여, 37℃의 CO2 인큐베이터 안에서 배양 유지하였다.
배양 개시 후, 5시간에 세포를 현미경으로 관찰하면, 폴리펩타이드 3 코트 1060R 플레이트의 웰 내의 CHO 세포는, RGD 서열의 효과가 있어, 세포가 신전된 형상을 나타냈다.
폴리펩타이드 3이 접착된 1060R 플레이트 상의 CHO 세포의 현미경 사진을 도 3에 나타낸다.
그러나, RGD 서열을 갖지 않는 폴리펩타이드 2 코트 1060R 플레이트의 웰 내에서는, 1060R 플레이트 표면에, RGD 서열을 배치하고 있지 않으므로, 도 4에 나타내는 바와 같이, 세포는 둥근 형상이 되었다.
또한, 폴리펩타이드를 코팅하지 않은 1060R 플레이트에 있어서도, CHO 세포는 둥근 형상이며, 도 5에 나타내는 바와 같이, 세포가 신전 형상을 나타내는 경우는 없었다.
이들의 결과로부터, 본 발명의 일 양태에 따른 올리고펩타이드는, 세포의 접착을 제어하는 RGD 서열 등의 다른 펩타이드와 조합함으로써, 노르보르넨계 중합체 표면에 당해 올리고펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드의 코팅을 가능하게 하여, COP 표면 상에서의 세포의 접착성 등의 상태를 제어할 수 있는 것이 나타내어졌다.
이하의 실시예에서는, 예시적으로, 측정 대상의 물질로서 BNP(뇌성나트륨이뇨펩타이드)를 사용하는데, 측정 대상의 물질은 이에 한정되지 않는다.
〔실시예 4〕
항원의 멀티웰 플레이트로의 흡착 조건을 검토하였다. 노르보르넨계 개환 중합체 수소화물〔제오노아(등록상표) 1060R, 닛폰 제온사 제조〕을 사출 성형하여 얻어진 96 웰 플레이트(이하, 「1060R 플레이트」라고 한다), 및 폴리스티렌제의 96 웰 플레이트(제품명 「스밀론 ELISA용 플레이트 H(등록상표)」, 스미토모 베이크라이트사 제조; 이하, 「PS 플레이트」라고 한다)를 사용하여 항원의 흡착 비교를 행하였다.
인간 BNP(brain natriuretic peptide)의 항체 인식 부위의 아미노산 서열 Cys-Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(서열 번호 6)의 N 말단측에, 노르보르넨계 중합체에 특이적으로 흡착하는 특성을 갖는 아미노산 서열인, Ala-Cys-Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly(서열 번호 7)가 결합한 폴리펩타이드(이하, 「합성 BNP 항원」이라고 한다)를 합성하였다. 인산 완충 생리 식염수(NaCl 8.0 g/L, KCl 0.20 g/L, Na2HPO4 1.44 g/L, KH2PO4 0.24 g/L; pH 7.4; 이하, 동일)에, 합성 BNP 항원을, 농도 1 Х 107 pg/μL, 53 pg/μL, 및 27 pg/μL가 되도록 용해한 희석 시료를 만들고, 각종 희석 시료 100 μL를 3 웰씩 넣어, 실온에서 30분 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정한 뒤, 인산 완충 생리 식염수로 10배 희석한 블로킹제(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「블로킹 원」)를 사용하여, 각 웰에 200 μL 분주하여, 실온 30분 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정하여, 플레이트에 합성 BNP 항원을 고상화하였다.
계속해서, 0.25 ng/μL의 호스래디시 페록시다아제 표지의 항체를 포함하는 인산 완충 생리 식염수를, 각 웰에 100 μL 첨가하여, 실온 30분 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정하였다.
이어서, 발색 시약(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「ELISA POD 기질 TMB 용액」)을 사용하여, 플레이트 중에 고정된 합성 BNP 항원을 발색시키고, 희황산 수용액으로 반응 정지시킨 후에, 흡광 플레이트 리더로 파장 450 nm의 흡광을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타내어지는 바와 같이, PS 플레이트에는, 합성 BNP 항원은 흡착하지 않지만, 1060R 플레이트에는, 합성 BNP 항원이 흡착하는 것을 확인할 수 있었다.
〔실시예 5〕
<BNP 측정용 플레이트의 조제>
실시예 1에서 합성한 합성 BNP 항원을 농도 98 pg/μL가 되도록 인산 완충 생리 식염수에 용해하여 항원 용액을 조제하고, 1060R 플레이트의 각 웰(7 웰)에 100 μL 분주한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 하여 플레이트에 합성 BNP 항원을 고상화하였다.
계속해서, 0.25 ng/μL의 호스래디시 페록시다아제 표지의 항체를 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 희석하여, 각 웰 50 μL 첨가하여, 실온 30분 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정하여, BNP 측정용 플레이트를 제작하였다.
<BNP 측정>
인간 BNP(펩타이드 연구소 제조)를, 인산 완충 생리 식염수에 농도 2.0 pg/ml, 3.9 pg/ml, 7.8 pg/ml, 15.6 pg/ml, 31.3 pg/ml, 62.5 pg/ml, 및 125 pg/ml가 되도록 용해한 희석 시료(7점)를 조제하고, 얻어진 BNP 측정용 플레이트에 각 웰 100 μL 넣어, 실온 30분간 정치하고, 웰 내의 용액을 50 μL 회수하여, 다른 멀티웰 플레이트로 옮겼다.
옮긴 용액에 대하여, 발색 시약(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「ELISA POD 기질 TMB 용액」)을 첨가하여 발색시키고, 희황산 수용액으로 반응 정지시킨 후에, 흡광 플레이트 리더로 파장 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타내어지는 바와 같이, 사용한 BNP 농도에 의존하여 발색이 보이고, 흡광도를 측정함으로써 BNP 농도를 산출 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 6〕
노르보르넨계 중합체의 표면의 블로킹 조작으로서, ELISA법에서 범용되고 있는 단백질을 사용하는 방법과, Tween20을 사용하는 방법에서의 효과 비교를 행하였다.
블로킹제로서, 범용되고 있는 카세인을 함유하는 10% 블로킹제(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「블로킹 원」)를 포함하는 인산 완충 생리 식염수(「종농도(終濃度) 10% 블로킹 원 PBS」), 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수(「종농도 0.05% Tween20 PBS」), 및 0.2% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수(「종농도 0.2% Tween20 PBS」)를 사용하여, 실시예 5와 동일하게 하여 합성 BNP 항원이 고상화된 용기를 블로킹하고, 블로킹 처리하지 않는 조건과의 비교를 행하였다.
마이크로웰 플레이트로서, 1060R 플레이트(실험예)와 PS 플레이트(비교예)를 사용하였다.
블로킹 처리는, 블로킹제를 웰 내(웰수 3)에 각 200 μL 첨가하여, 실온 20분 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정한 후, 0.25 ng/μL의 호스래디시 페록시다아제 표지의 항체를 포함하는 인산 완충 생리 식염수에 용해한 항체 용액을 조제하여, 96 웰 플레이트의 웰에 50 μL 첨가하고, 실온에서 60분간 정치하였다.
정치 후, 웰 내의 용액을 제거하여, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 3회 세정하고, 계속해서, 발색 시약(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「ELISA POD 기질 TMB 용액」)을, 96 웰 플레이트의 웰에 50 μL 첨가하여, 실온에서 5분간 정치하였다. 정지액으로서, 0.1 M의 황산액을 첨가한 뒤, 흡광도 450 nm를 흡광 플레이트 리더로 계측하였다.
실험 조건의 조합을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
1060R 플레이트에서의 블로킹 미실시의 웰의 측정한 흡광값에 대한 상대값을 이용하여, 각 조건의 값을 구하였다.
그 결과, 도 8에 나타내어지는 바와 같이, 1060R 플레이트에서는, 단백질을 함유하지 않고, Tween20이 포함되는 용액에서의 블로킹 효과가 보여, 비특이적인 항체의 흡착이 억제되어 있는 것이 나타내어졌다. PS 플레이트에서는, 단백질을 함유하지 않아도, 미처리와 비교하여, 흡착이 적은 결과였으나, 단백질을 함유하는 블로킹제와 비교하여, 블로킹 효과가 낮았다.
〔실시예 7〕
용기 내에는, 고상화 항원을 고상화하고, 시료와 동시에 항체를 첨가하는 방법에 대하여 실시예를 나타낸다.
<BNP 측정용 플레이트의 조제>
실시예 4에서 얻은 합성 BNP 항원을 인산 완충 생리 식염수로 농도 122 pg/μL로 하여 항원 용액을 조제하고, 1060R 플레이트의 각 웰에 75 μL 분주하여, 실온 1시간 정치하고, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 2회 세정한 뒤, 0.05% Tween20을 포함하는 인산 완충 생리 식염수로 실온 10분 정치하여 블로킹 처리를 행하였다.
<BNP 측정>
인간 BNP(펩타이드 연구소 제조)의 희석 시료를 농도 18 pg/μL, 4 pg/μL, 및 1 pg/μL로 조제하고, 이들 희석 시료 50 μL와, 인간 BNP를 인식할 수 있는 호스래디시 페록시다아제 표지의 항체를 인산 완충 생리 식염수로 희석한 용액 50 μL를 혼합하고, 상기의 BNP 측정용 플레이트에 각 웰 100 μL 첨가(각 3 웰)하여, 실온 30분간 정치하였다.
계속해서, 웰 내 용액을 50 μL 취출하고, 발색 시약(나칼라이 테스크사 제조, 제품명 「ELISA POD 기질 TMB 용액」)을 첨가하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타내어지는 바와 같이, BNP 농도 의존적으로 흡광이 관찰되어, 노르보르넨계 중합체로 이루어지는 용기 내에 항원을 고상화한 플레이트를 준비하여, 시료와 동시에 항체를 첨가하는 방법에 의해서도, 면역 측정할 수 있는 것이 나타내어졌다.
SEQUENCE LISTING <110> ZEON CORPORATION <120> 올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법 <130> G217151WO <150> JP 2016-248711 <151> 2016-12-22 <160> 7 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 1 Thr Val Asp Ser Cys Leu Thr 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 2 Thr Val Asp Asn Ser Leu Ala 5 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 3 Ala Tyr Thr Val Asp Asn Ser Leu Ala Cys 5 10 Gly Gly Gly Gly Gly His His His His His 15 20 His <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 4 Ala Cys Thr Val Asp Ser Cys Leu Thr Cys 5 10 Gly Gly Gly Gly Gly His His His His His 15 20 His <210> 5 <211> 26 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 5 Ala Cys Thr Val Asp Ser Cys Leu Thr Cys 5 10 Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Asp Ser Pro 15 20 His His His His His His 25 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 6 Cys Lys Val Leu Arg Arg His 5 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> ArtificialSequence <220> <223> Inventor: Ichimura, Naoya <400> 7 Ala Cys Thr Val Asp Ser Cys Leu Thr Cys 5 10 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Leu 15 20 Gly

Claims (12)

  1. 랜덤한 아미노산 서열을 내재하는 펩타이드 라이브러리를, 적어도 표면이 노르보르넨계 중합체로 구성되는 성형체의 상기 표면에 폭로하는 단계(I)와,
    폭로된 상기 표면을 수계 용매로 세정하는 단계(II)와,
    상기 표면에 잔류하는 화합물을, 그 표면을 유기 용매로 세정함으로써 회수하는 단계(III)와,
    회수한 상기 화합물의 펩타이드 서열 정보를 해석하는 단계(IV)를 포함하는, 올리고펩타이드의 탐색 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인, 탐색 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수계 용매가 완충액인, 탐색 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유기 용매가 극성 유기 용매인, 탐색 방법.
  5. Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 올리고펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    노르보르넨계 중합체에 대하여 접착성을 갖는, 올리고펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인, 올리고펩타이드.
  8. Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하고, 노르보르넨계 중합체에 접착성을 갖는, 수식 펩타이드 또는 수식 폴리펩타이드.
  9. 노르보르넨계 중합체로 구성되는 용기의 내표면에, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 탐색 방법에 의해 탐색된 올리고펩타이드를 고상화하고,
    내표면에 올리고펩타이드를 고상화한 상기 용기를 사용하여 측정을 행하는, 면역 측정 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 노르보르넨계 중합체가, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물인, 면역 측정 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 올리고펩타이드가 Thr-Val-Asp-Ser-Cys-Leu-Thr(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는, 면역 측정 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 측정 전에 블로킹 처리를 더 행하고,
    블로킹 처리제로서, Tween20을 사용하는, 면역 측정 방법.
KR1020197016704A 2016-12-22 2017-12-21 올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법 KR102497769B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016248711 2016-12-22
JPJP-P-2016-248711 2016-12-22
PCT/JP2017/046019 WO2018117242A1 (ja) 2016-12-22 2017-12-21 オリゴペプチドの探索方法、オリゴペプチド、修飾ペプチド、及び免疫測定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190099401A true KR20190099401A (ko) 2019-08-27
KR102497769B1 KR102497769B1 (ko) 2023-02-07

Family

ID=62627677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197016704A KR102497769B1 (ko) 2016-12-22 2017-12-21 올리고펩타이드의 탐색 방법, 올리고펩타이드, 수식 펩타이드, 및 면역 측정 방법

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11485757B2 (ko)
EP (2) EP3907236A1 (ko)
JP (1) JP7024730B2 (ko)
KR (1) KR102497769B1 (ko)
CN (2) CN110191894B (ko)
WO (1) WO2018117242A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3907236A1 (en) * 2016-12-22 2021-11-10 Zeon Corporation Oligopeptide search method, oligopeptide, modified peptide, and immunoassay method

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006275769A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法
JP2007240461A (ja) * 2006-03-10 2007-09-20 Sumitomo Bakelite Co Ltd プラスチック製マイクロチップ、及びその接合方法、及びそれを利用したバイオチップ又はマイクロ分析チップ。
JP2009080119A (ja) 1997-06-02 2009-04-16 Aurora Biosciences Corp 生物学的および生化学的サンプルの蛍光測定用低バックグラウンドマルチウェルプレート
JP2010117189A (ja) 2008-11-12 2010-05-27 Sumitomo Bakelite Co Ltd 生理活性物質固定化用基板
JP2011168610A (ja) 1999-09-08 2011-09-01 Chugai Pharmaceut Co Ltd タンパク質溶液製剤およびその安定化方法
WO2015199119A1 (ja) 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法
JP5863045B2 (ja) * 2010-03-11 2016-02-16 国立研究開発法人理化学研究所 ポリペプチド配列の選択方法、並びに金属酸化物または含珪素化合物結合ペプチドおよびその利用
JP2016038265A (ja) * 2014-08-06 2016-03-22 住友ベークライト株式会社 糖鎖アレイ及びその製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2200084T3 (es) * 1995-12-18 2004-03-01 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Metodos para identificar compuestos que se unen a una diana.
WO2000053740A1 (fr) * 1999-03-10 2000-09-14 Ajinomoto Co.,Inc. Procede de criblage de regulateur d'activite de biomolecule
JP2002286724A (ja) * 2001-03-27 2002-10-03 Canon Inc タンパク質検出方法
CN1823086A (zh) * 2003-05-16 2006-08-23 住友电气工业株式会社 寡肽
JP2009136280A (ja) * 2007-11-16 2009-06-25 Institute Of Physical & Chemical Research 新規ペプチドおよびその利用
US20130316932A1 (en) 2010-11-26 2013-11-28 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Glycopeptide array
EP3907236A1 (en) * 2016-12-22 2021-11-10 Zeon Corporation Oligopeptide search method, oligopeptide, modified peptide, and immunoassay method

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009080119A (ja) 1997-06-02 2009-04-16 Aurora Biosciences Corp 生物学的および生化学的サンプルの蛍光測定用低バックグラウンドマルチウェルプレート
JP2011168610A (ja) 1999-09-08 2011-09-01 Chugai Pharmaceut Co Ltd タンパク質溶液製剤およびその安定化方法
JP2006275769A (ja) * 2005-03-29 2006-10-12 Sumitomo Bakelite Co Ltd ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法
JP2007240461A (ja) * 2006-03-10 2007-09-20 Sumitomo Bakelite Co Ltd プラスチック製マイクロチップ、及びその接合方法、及びそれを利用したバイオチップ又はマイクロ分析チップ。
JP2010117189A (ja) 2008-11-12 2010-05-27 Sumitomo Bakelite Co Ltd 生理活性物質固定化用基板
JP5863045B2 (ja) * 2010-03-11 2016-02-16 国立研究開発法人理化学研究所 ポリペプチド配列の選択方法、並びに金属酸化物または含珪素化合物結合ペプチドおよびその利用
WO2015199119A1 (ja) 2014-06-26 2015-12-30 日本ゼオン株式会社 接着型細胞の培養方法、培養容器およびタンパク質の産生方法
JP2016038265A (ja) * 2014-08-06 2016-03-22 住友ベークライト株式会社 糖鎖アレイ及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110191894B (zh) 2023-09-05
WO2018117242A1 (ja) 2018-06-28
US20230047436A1 (en) 2023-02-16
CN110191894A (zh) 2019-08-30
KR102497769B1 (ko) 2023-02-07
EP3560949A4 (en) 2020-10-21
EP3907236A1 (en) 2021-11-10
EP3560949A1 (en) 2019-10-30
JP7024730B2 (ja) 2022-02-24
JPWO2018117242A1 (ja) 2019-10-31
CN117209564A (zh) 2023-12-12
US20190331671A1 (en) 2019-10-31
US11926679B2 (en) 2024-03-12
US11485757B2 (en) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yurchenco et al. Models for the self-assembly of basement membrane.
US20060019309A1 (en) Self-assembling peptide surfaces for cell patterning and interactions
US11926679B2 (en) Oligopeptide search method, oligopeptide, modified peptide, and immunoassay method
KR101254512B1 (ko) 면역 크로마토그래피용 시험구 및 이것을 사용한 반정량방법
CN110687286A (zh) 胶乳增强免疫比浊法试剂盒
JP2008539755A (ja) ハイスループットスクリーニングのための細胞ベースのプラットフォーム
US20060063195A1 (en) Binding surface
CN106018347A (zh) 一种表面等离子体共振传感芯片及其制备方法和应用
Pollheimer et al. Reversible biofunctionalization of surfaces with a switchable mutant of avidin
Kang et al. An epidermal growth factor derivative with binding affinity for hydroxyapatite and titanium surfaces
Mathes Protein adsorption to vial surfaces-quantification, structural and mechanistic studies
JP2009031126A (ja) マイクロ流路形成体を利用したマイクロビーズアレイ用チップ、マイクロビーズアレイ及びこれらを用いた被検物質を検出する方法。
US20060084159A1 (en) Method for manufacturing of three dimensional composite surfaces for microarrays
Tada et al. Versatile Mitogenic and Differentiation‐Inducible Layer Formation by Underwater Adhesive Polypeptides
JP7384167B2 (ja) 心毒性評価方法
CN116338162B (zh) 一种点样液、使用点样液制备的蛋白质芯片及其制备方法
CN111936852B (zh) 区分细菌感染和病毒感染的多重横向流测定物
WO2021220759A1 (ja) 被験物質の神経作用評価方法及びそのためのキット及び神経細胞培養容器
CN111801575B (zh) 区分细菌感染和病毒感染的多重横向流测定物
Luk Biosurfaces: Water structure at interfaces
KR20200136705A (ko) 피콜린-1을 포함하는 표적물질 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출방법
IL256880B2 (en) Combining proteins for the diagnosis of schizophrenia

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant