JP7024730B2 - オリゴペプチドの探索方法、オリゴペプチド、修飾ペプチド、及び免疫測定方法 - Google Patents

オリゴペプチドの探索方法、オリゴペプチド、修飾ペプチド、及び免疫測定方法 Download PDF

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Description

本発明は、オリゴペプチドの探索方法、並びに特定のアミノ酸配列を含むオリゴペプチド、修飾ペプチド、及び免疫測定方法に関する。
ノルボルネン系重合体からなる成形体を培養容器として用いることで、組み換え細胞の増殖性や組み換え遺伝子の発現量が向上することが知られている（特許文献１）。
また、ノルボルネン系重合体からなる成形体は、タンパク質の凝集、変性、分解を生じさせにくいため、タンパク質溶液製剤の長期保存に好適であることが知られている（特許文献２等）。
また、微量含有の物質を検出し、定量する方法として、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）と総称される抗原抗体反応法が汎用されている。一般に、ＥＬＩＳＡ法では、プラスチック製のマイクロウェルプレートなどの容器内表面に固相化された抗体や抗原などのタンパク質と、検体中の被験物との反応を、直接的に又は間接的に検出する。
ところで、近年、基材にペプチド等の生理活性物質等を固定化し、生体試料中の対象物質の並列検出及び分析等を行う技術が開発されてきている。
このような検出及び分析等に用いる生理活性物質固定化用基板として、例えば、ノルボルネン系重合体からなる基板表面に、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、生理活性物質を固定化するために、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及びアルデヒド基又はマレイミド基を有するユニットから構成される高分子化合物を被覆することが提案されている（特許文献３）。
国際公開第2015/199119号 特開2011-168610号公報 特開2010-117189号公報 特開2009-080119号公報
しかしながら、特許文献３の方法では、成形体のタンパク質と接する面がノルボルネン系重合体以外の高分子化合物で被覆されるため、ノルボルネン系重合体が有するタンパク質の安定化効果が減じてしまうという問題があった。
また、ノルボルネン系重合体で構成される成形体は、低蛍光であることが知られている（特許文献４）ため、蛍光検出を汎用するＥＬＩＳＡに好適であると考えられる。しかしながら、タンパク質などの物質の素材表面への物理的吸着性がポリスチレンに比較して弱いため、抗体や抗原を表面に固相化することが難しいという問題があった。
また、ＥＬＩＳＡ法では、測定試料をウェル内に添加したあと、ウェル内から測定試料を除く操作と、ウェルを洗浄する操作が必要であるが、測定試料中には感染症を引き起こすウイルスや微生物が混入している可能性があり、測定操作中に液の飛沫を受けるといったことに起因する感染リスクの問題もある。
本発明は、かかる従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、目的のタンパク質やペプチドの末端に結合させることができるオリゴペプチドを、ペプチドライブラリーから効率よく探索する方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、効率的で安全性の高い免疫測定方法を提供することを目的とする。
本発明者は、目的のタンパク質やペプチドの末端に結合させることができ、かつ、ノルボルネン系重合体に接着性を有するオリゴペプチドを用いることにより、ノルボルネン系重合体が有するタンパク質の安定化効果を減じることなく、ノルボルネン系重合体に、直接、目的のタンパク質やペプチドを効率よく固定化できることを着想し、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。
その結果、ノルボルネン系重合体からなる成形体にペプチドライブラリーを曝露した後に、水系溶媒で洗浄したところ、当該成形体の表面に、ノルボルネン系重合体への接着性が高いペプチドが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
かくして本発明によれば、下記の（１）～（４）のオリゴペプチドの探索方法、（５）～（７）のオリゴペプチド、（８）の修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド、（９）～（１２）の免疫測定方法が提供される。
（１）ランダムなアミノ酸配列を内在するペプチドライブラリーを、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体の前記表面に曝露するステップ（Ｉ）と、
暴露された前記表面を水系溶媒で洗浄するステップ（ＩＩ）と、
前記表面に残留する化合物を、該表面を有機溶媒で洗浄することにより回収するステップ（ＩＩＩ）と、
回収した前記化合物のペプチド配列情報を解析するステップ（ＩＶ）とを含む、オリゴペプチドの探索方法。
（２）前記ノルボルネン系重合体が、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物である（１）に記載のオリゴペプチドの探索方法。
（３）前記水系溶媒が、緩衝液である（１）又は（２）に記載のオリゴペプチドの探索方法。
（４）前記有機溶媒が極性有機溶媒である（１）～（３）のいずれかに記載のオリゴペプチドの探索方法。
（５）Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、オリゴペプチド。
（６）ノルボルネン系重合体に対して接着性を有する、（５）に記載のオリゴペプチド。
（７）前記ノルボルネン系重合体が、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物である、（６）に記載のオリゴペプチド。
（８）Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ノルボルネン系重合体に接着性を有する、修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド。
（９）ノルボルネン系重合体で構成される容器の内表面に、請求項１～４のいずれかに記載の探索方法により探索されたオリゴペプチドを固相化し、
内表面にオリゴペプチドを固相化した前記容器を用いて測定を行う、免疫測定方法。
（１０）前記ノルボルネン系重合体が、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物である、（９）に記載の免疫測定方法。
（１１）前記オリゴペプチドがＴｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、（９）または（１０）に記載の免疫測定方法。
（１２）前記測定の前にブロッキング処理をさらに行い、
ブロッキング処理剤として、Ｔｗｅｅｎ２０を用いる、（９）～（１１）のいずれかに記載の免疫測定方法。
本発明によれば、目的のタンパク質やペプチドの末端に結合させることができるオリゴペプチドを、ペプチドライブラリーから効率よく探索することができる。さらに、本発明によれば、効率的で安全性の高い免疫測定方法を提供することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る、ノルボルネン系重合体に接着性のあるオリゴペプチドの探索方法手順を示す図である。 図２は、実施例２において得られたオリゴペプチドの、各種ポリマー成形体への接着性評価結果を示すグラフである。 図３は、実施例３における、ポリペプチド３が接着した１０６０Ｒディッシュ上のＣＨＯ細胞の顕微鏡写真である。 図４は、実施例３における、ポリペプチド２が接着した１０６０Ｒディッシュ上のＣＨＯ細胞の顕微鏡写真である。 図５は、実施例３における、ポリペプチド２も３も接着していない１０６０Ｒディッシュ上のＣＨＯ細胞の顕微鏡写真である。 図６は、抗原濃度と吸光度との関係を示すグラフである。 図７は、抗原濃度と吸光度との関係を示すグラフである。 図８は、ブロッキング剤が吸光度に与える影響を示すグラフである。 図９は、ＢＮＰ濃度と吸光度との関係を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について、１）オリゴペプチドの探索方法、２）オリゴペプチド、及び、３）ノルボルネン系重合体に接着性を有する修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド、４）免疫測定方法に項分けして、詳細に説明する。
１）オリゴペプチドの探索方法
本発明の第１の態様は、ランダムなアミノ酸配列を内在するペプチドライブラリーを、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体の前記表面に曝露するステップ（Ｉ）と、暴露された前記表面を水系溶媒で洗浄するステップ（ＩＩ）と、前記表面に残留する化合物を、該表面を有機溶媒で洗浄することにより回収するステップ（ＩＩＩ）と、回収した前記化合物のペプチド配列情報を解析するステップ（ＩＶ）とを含む、オリゴペプチドの探索方法である。
＜ステップ（Ｉ）＞
ステップ（Ｉ）は、ランダムなアミノ酸配列を内在するペプチドライブラリーを、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体の前記表面に曝露するステップである。
上記探索方法に用いるペプチドライブラリーは、ランダムなアミノ酸配列を内在するものであり、一般にペプチドライブラリーとして広く用いられるものが挙げられる。例えば、アミノ酸配列をランダムにして有機合成して得られるペプチドや、タンパク質をランダムに切断して得られるペプチド等のペプチド混合物；ファージ等のウイルス粒子の表面に、末端領域のアミノ酸配列がランダムなタンパク質が呈示されている、ディスプレイライブラリー；等であってもよい。
本発明の一態様に係る探索方法では、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体を用いる。すなわち、上記成形体は、ペプチドライブラリーが曝露される成形体表面が、少なくともノルボルネン系重合体で構成されていればよい。また、成形体表面がノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよく、あるいは、成形体全体がノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよい。
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体単位を、ノルボルネン系重合体を構成する全単量体単位に対して５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上含む重合体である。より具体的には、ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体、ノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、及び、これらの水素化物等が挙げられる。
付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体等が挙げられる。
ノルボルネン系重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
これらの中でも、本願発明の効果がより得られ易いことから、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物が好ましい。
ノルボルネン系重合体の合成に使用可能なノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン（慣用名：ノルボルネン）、５－メチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５，５－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－エチリデン－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－ビニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン、５－メチル－５－メトキシカルボニル－ビシクロ［２．２．１］ヘプタ－２－エン等の２環式単量体；
トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ－３，７－ジエン（慣用名：ジシクロペンタジエン）、２－メチルジシクロペンタジエン、２，３－ジメチルジシクロペンタジエン、２，３－ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；
テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８，９－ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチル－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－エチリデン－９－メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、８－メチル－８－カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］－３－ドデセン、７，８－ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ－３－エン（慣用名：メタノテトラヒドロフルオレン：１，４－メタノ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４－メタノ－８－メチル－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－クロロ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン、１，４－メタノ－８－ブロモ－１，４，４ａ，９ａ－テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
これらのノルボルネン系単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４－シクロヘキサジエン、１，５－シクロオクタジエン、１，５－シクロデカジエン、１，５，９－シクロドデカトリエン、１，５，９，１３－シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン等の炭素数２～２０のα－オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ－３，５，７，１２－テトラエン（３ａ，５，６，７ａ－テトラヒドロ－４，７－メタノ－１Ｈ－インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４－ヘキサジエン、４－メチル－１，４－ヘキサジエン、５－メチル－１，４－ヘキサジエン、１，７－オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α－オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらのその他の単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウム等の金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデン等の金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウム等の遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素－炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。
付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００～５００，０００、より好ましくは８，０００～２００，０００、特に好ましくは１０，０００～１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
ノルボルネン系重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０～３００℃、好ましくは１００～２８０℃、特に好ましくは１１５～２５０℃、さらに好ましくは１３０～２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
上記ノルボルネン系重合体のガラス転移温度は、ＪＩＳ Ｋ ７１２１に基づいて測定されたものである。
ノルボルネン系重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
また、成形体表面を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体に加えて、任意で、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料等の着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤等の配合剤を、通常採用される量、添加することができる。ここで、ノルボルネン系重合体に対して軟質重合体を混合して用いる場合には、ノルボルネン系重合体である脂環構造含有重合体１００質量部に対して、通常０．０１～２０質量部、好ましくは０．０５～１０質量部、より好ましくは０．０５～５質量部である。
また、成形体表面を構成する樹脂成分として、ノルボルネン系重合体、及び上述した配合剤の一つである軟質重合体以外に、その他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。ノルボルネン系重合体に混合されるその他の重合体の量は、ノルボルネン系重合体１００質量部に対して、通常２００質量部以下、好ましくは１５０質量部以下、より好ましくは１００質量部以下である。
ノルボルネン系重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
ノルボルネン系重合体と、配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合の順番に格別な制限はない。配合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機等を用いて樹脂を溶融状態で混練する方法；適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法；等が挙げられる。
二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
このようなノルボルネン系重合体を用いて、通常、任意の成形方法、例えば、射出成形法、押出成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、キャスト成形法等により、任意の形状を有する成形体に成形することができる。
ノルボルネン系重合体で構成される成形体（ノルボルネン系重合体成形体）としては、例えば、ノルボルネン系重合体成形体を細胞培養に用いる場合においては、ノルボルネン系重合体製培養容器が挙げられる。
例えば、ディッシュ状の培養容器であれば、射出成形法等により成形することができる。
なお、上記培養容器は、ペプチドライブラリーが曝露される部分の表面が、少なくともノルボルネン系重合体で構成されていればよい。
また、当該ペプチドライブラリーが曝露される表面は、ノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよく、あるいは、培養容器全体がノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよい。
成形して得られた成形体は、プラズマ照射等による親水化処理を施すことなく、本発明の一態様に係るペプチドの探索方法に用いることが好ましい。親水化処理を施すことで表面が酸化され、これにより、酸化した表面にペプチドが非特異的に接着するため、当該表面に残留するペプチドの種類が多くなり、特定のペプチドを探索することが困難となるおそれがあるからである。
上記ノルボルネン系重合体成形体は、通常、滅菌処理して用いられる。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法等の加熱法；γ線や電子線等の放射線を照射する放射線法や高周波を照射する照射法；酸化エチレンガス（ＥＯＧ）等のガスを接触させるガス法；滅菌フィルタを用いる濾過法；など、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、適宜選択することができる。
成形されたノルボルネン系重合体成形体の表面（ノルボルネン系重合体製培養容器の内面）に、本発明の一態様であるオリゴペプチドやノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドを接触させることで、成形体表面（培養容器内面）に当該オリゴペプチドやノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドを付着させることができる。
ランダムなアミノ酸配列を内在するペプチドライブラリーを、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体の前記表面に曝露するステップでは、例えば、リン酸緩衝液や細胞培養液などペプチドライブラリーの変性をもたらさない、ほぼ中性の液状媒体で、ペプチドライブラリーを溶解又は懸濁させたペプチドライブラリー液を、上記表面に接触させる方法が採用される。接触時間は、通常１分～１０時間、好ましくは５分から２時間である。接触時間が短過ぎると、接着性のあるペプチドが成形体に十分に接着できないおそれがあり、逆に接触時間を長過ぎるとペプチドの変性などにより本来成形体に接着性を有しないものが接着するおそれがあり、いずれも好ましくない。接触時の温度は、通常１５～３５℃、好ましくは２０～３０℃である。温度が高すぎると、ペプチドライブラリー液の蒸発が進行し、温度が低すぎるとペプチドライブラリーの本来の接着性が得られない可能性があり、いずれも好ましくない。
＜ステップ（ＩＩ）＞
ステップ（ＩＩ）は、ステップ（Ｉ）の曝露の後に、暴露された当該表面を、水系溶媒で洗浄するステップである。
用いる水系溶媒は、ノルボルネン系重合体への特異的な接着性を持つものを選択しやすいことから、緩衝液、酸性水溶液、及び塩基性水溶液の３種の組み合わせが好ましい。水系溶媒での洗浄の順番は任意に設定することができる。これらの中でも、本発明の効果がより得られ易いことから、緩衝液が好ましい。
緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないようにした溶液である。
緩衝液としては、通常ｐＨ５～９、好ましくはｐＨ６．８～８．３のものを用いる。具体的には、リン酸を緩衝成分とするリン酸緩衝液、リン酸緩衝液に塩化ナトリウムを加えたリン酸緩衝食塩水、酢酸を緩衝成分とする酢酸緩衝液、クエン酸を緩衝成分とするクエン酸緩衝液、ホウ酸を緩衝成分とするホウ酸緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを緩衝成分とするトリス緩衝液、及び、トリス緩衝液にＥＤＴＡ等の金属キレーティング剤又はホウ酸又は酢酸を加えた緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
これらは単独で、又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
酸性水溶液としては、通常ｐＨ１～４、好ましくはｐＨ２．５～３のものを用いる。酸性水溶液の調製に用いる酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、酸でｐＨ調製したグリシン水溶液、酸でｐＨ調製したクエン酸水溶液等が挙げられる。
これらの中でも、酸性水溶液のｐＨに暴露したペプチドライブラリーを回収後に、速やかにｐＨを中性条件とするための操作上の観点から、数ｍＭ程度の濃度の希薄な酸溶液や、１Ｍ程度のトリスヒドロキシメチルアミノメタン水溶液を混ぜ合わせることで中性ｐＨに容易に調製できるｐＨ２．５程度に調製されたグリシン溶液等が好ましい。
これらは単独で、又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
塩基性水溶液としては、通常ｐＨ８～１１．５、好ましくはｐＨ１０～１１．５のものを用いる。塩基性水溶液の調製に用いる塩基としては、トリエチルアミン又はトリエタノールアミンのような水溶性アミン、アンモニア、水酸化アンモニウムのようなアンモニウム塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウムでｐＨ調製されたグリシン水溶液等が挙げられる。
これらの中でも、塩基性水溶液のｐＨに暴露したペプチドライブラリーを回収後に、速やかにｐＨを中性条件とするための操作上の観点から、上述の塩基性水溶液で、２００ｍＭ以下の希薄濃度としたアンモニア塩水溶液又はグリシン水溶液等が好ましい。これらは単独で、又は複数種類を組み合わせて用いることができる。
水系溶媒での洗浄回数や洗浄に用いる水系溶媒の量は、洗浄したい部分の形状や洗浄したい面積に応じて任意に選択することができる。通常の培養ディッシュのような平面であれば、緩衝液酸性水溶液、及び塩基性水溶液の洗浄回数は、いずれも通常１～５回、好ましくは２～４回である。１回の洗浄に用いる水系溶媒の量は、洗浄対象面積当たり、通常１０～０．０１ｍｌ／ｃｍ２、好ましくは２～０．１ｍｌ／ｃｍ２である。水系溶媒の量が少なすぎると洗浄が不十分となり、一方、多く用いても、洗浄効果に限界があるため無駄になる。
＜ステップ（ＩＩＩ）＞
ステップ（ＩＩＩ）は、ステップ（ＩＩ）の洗浄後に、成形体表面に残留する化合物を、当該成形体表面を有機溶媒で洗浄することにより回収するステップである。
ステップ（ＩＩ）における水系溶媒での洗浄後に、ノルボルネン系重合体成形体の表面に残留する化合物を回収するために有機溶媒で洗浄する。
水系溶媒による洗浄にも耐えて、ノルボルネン系重合体成形体の表面に残留するペプチドは、ノルボルネン系重合体への接着性が高いものであると考えられる。
洗浄に用いる有機溶媒は、水系媒体で希釈せずに用いることもできるが、水系媒体で希釈した希釈液として用いることが、ディスプレイライブラリー等のウイルス増殖特性を利用したスクリーニング系である場合には、その増殖特性に与える影響を少なくすることができるため好ましい。従って、本発明に用いる有機溶媒は、水と混和性を有する極性有機溶媒であること好ましい。
極性有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド等の含硫黄系有機溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系有機溶媒；メタノール、イソプロパノール等のアルコール系有機溶媒；アセトニトリル等のニトリル系有機溶媒；等が挙げられる。
水系媒体で希釈して用いる場合の極性溶媒の濃度は、希釈液全体に対し、通常５重量％～９０重量％、好ましくは５重量％～５０重量％である。
有機溶媒での洗浄回数や洗浄に用いる有機溶媒の量は、洗浄したい部分の形状や洗浄したい面積に応じて任意に選択することができる。成形体表面が通常の培養ディッシュのような平面であれば、洗浄回数は通常１～５回、好ましくは１～２回である。
１回の洗浄に用いる有機溶媒（水系媒体で希釈した場合は、その希釈液）の量は、通常０．０１～１０ｍｌ／ｃｍ２、好ましくは０．１～２ｍｌ／ｃｍ２である。
洗浄に用いる有機溶媒の量が少なすぎると洗浄が不十分となり、一方多く用いても洗浄効果に限界があるため無駄になる。
＜ステップ（ＩＶ）＞
ステップ（ＩＶ）は、ステップ（ＩＩＩ）で回収した前記化合物のペプチド配列情報を解析するステップである。
すなわち、有機溶媒で洗浄して回収された洗浄処理後の液中のペプチド配列情報を解析して、ノルボルネン系重合体に接着性のあるポリオリゴペプチドのアミノ酸配列を確認する。
ペプチドライブラリーとして、ペプチド混合物、及び一部（通常は末端領域）のアミノ酸配列がランダムなタンパク質が呈示されているポリマー粒子を含むディスプレイライブラリーを用いた場合は、既存のアミノ酸配列解析法（マス分析等）により直接アミノ酸配列を確認することができる。
また、ジディスプレイライブラリーを用いた場合は、ファージの遺伝子を解析し、対応するアミノ酸配列を求めることができる。
２）オリゴペプチド
本発明の第２の態様は、特定のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドである。オリゴペプチドとは、２～１０個程度という比較的少数のアミノ酸からなるペプチドである。オリゴペプチドは、例えば、タンパク質（ポリペプチド）を、酵素的、化学的に分解して得られるポリペプチド鎖が挙げられる。
本発明の一態様に係るオリゴペプチドは、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列(以下、「特定のアミノ酸配列」ということがある)を含む。こうしたアミノ酸配列を含むオリゴペプチドは、ノルボルネン系重合体に接着性のあるオリゴペプチドである。なお、オリゴペプチドは、Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）で表されるアミノ酸配列のみからなることとしてもよい。
本発明の第２の態様に係るオリゴペプチドは、上述した本発明の第１の態様に係るノルボルネン系重合体に接着性のあるペプチドの探索方法により探索することができるオリゴペプチドの一種である。
３）ノルボルネン系重合体に接着性を有する修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド
本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体に接着性のある修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド（以下、「ノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチド」という）は、その末端に又はその内部に、前記特定のアミノ酸配列を含有するものである。ノルボルネン系重合体接着性修飾(ポリ)ペプチドは、直鎖状であっても分岐状であっても良い。
本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドは、本発明の第２の態様に係るオリゴペプチドに、任意の（ポリ）ペプチドを付加、挿入、又は一部のアミノ酸と置換させて得ることができる。
任意の（ポリ）ペプチドとしては、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン等の細胞外マトリックス；インターロイキン、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、神経成長因子、腫瘍壊死因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、アディポネクチン等のサイトカイン類；インテグリンやＰＤ－１等の細胞膜受容体、ＣＤ２やＣＤ６０等の細胞表面抗原等の生理活性を有する（ポリ）ペプチドや、ハプテン抗原・タンパク質抗原を認識できる抗体；ヒスチジンタグ、チオレドキシンタグ、グルタチオン Ｓ－トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグや、ＧＦＰやルシフェラーゼ等の蛍光標識タンパク質等の遺伝子工学的において有用な機能を有する（ポリ）ペプチド；機能不明なアミノ酸配列からなる（ポリ）ペプチド；が挙げられる。
また、本発明の第２の態様に係るオリゴペプチドと、任意の（ポリ）ペプチドとの連結やペプチド長調節等のために、リンカー配列を挿入することもできる。
本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドは、前記特定のアミノ酸配列を、１つ又は複数個含有するものである。
本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドの、「本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドを構成する総アミノ酸数／本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドに含まれる本発明の第２の態様に係るオリゴペプチド数」（α）は、好ましくは７以上８０以下、より好ましくは１０以上５０以下である。
前記αが８０を超える場合、本発明の第２の態様に係るオリゴペプチドは、本発明の第３の態様に係るノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチドの末端から好ましくは２０、より好ましくは１０個のアミノ酸以内に少なくとも１の前記特定のアミノ酸配列が存在することが、ノルボルネン系重合体との接着性の観点から好ましい。
４）免疫測定方法
本発明の第４の態様に係る免疫測定方法は、ノルボルネン系重合体で構成される容器の内表面に、本発明の第２の態様に係るオリゴペプチドを固相化した容器を用いて行う。
使用する容器としては、例えば、９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートやキュベットが挙げられる。これらの容器は、射出成形法等により成形することができるほか、ノルボルネン系重合体のフィルムを底面にインサート形成したウェルプレートでもよく、板状のノルボルネン系重合体を切削加工などにより作製した流路チップでもよい。
なお、上記容器は、上記オリゴペプチドが固相化される部分の表面が、少なくとも先に詳述したノルボルネン系重合体で構成されていればよい。
また、上記オリゴペプチドを固相化する表面は、先に詳述したノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよく、あるいは、容器全体が先に詳述したノルボルネン系重合体のみからなることとしてもよい。
ノルボルネン系重合体で構成される容器の内表面に上記オリゴペプチドを固定する方法は、固相化するオリゴペプチドを含む水溶液を容器内表面へ一定時間暴露すればよい。水溶液には、リン酸緩衝生理食塩水のように緩衝液成分が含まれていてもよく、ジメチルスルホキシドなどの水に溶解する有機溶媒が含まれていても良い。
容器表面への暴露操作としては、容器内に固相化するオリゴペプチドを含む水溶液を添加する方法でもよく、インクジェットやジェットディスペンサーのようなディスペンサー、噴霧などの方法でもよく、スタンプ操作による方法でもよい。
固相化操作の温度は、室温でよく、加温する場合には、上記オリゴペプチドが熱変性を受けない温度範囲で、水が蒸散して溶液濃度が変化しないようにできればよい。また、保冷状態でもよく、固相化する抗原を含む水溶液が凍結しない温度であればよい。
こうして、上記オリゴペプチドを接触させた後、当該溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水等で洗浄する。
固相化操作後には、特段の乾燥操作を行う必要はないが、固相化操作で容器内に残留した微小な液滴を除去するために、送風や減圧などの処理を行うこととしてもよい。
固相化したオリゴペプチドが抗原又はその一部の抗体認識部位（以下、まとめて「抗原等」という）である場合、免疫測定方法では、抗原等と結合する標識抗体を結合させることができる。
抗体の標識物質は、公知の免疫測定で使用されている標識物質と同様のものを用いることができ、特に限定されない。具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、Ｈｉｓタグなどのタグ、金などのナノ粒子、ハプテン抗原、染色物質、同位体、ユーロピューム、放射性物質などが挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等、公知のものを用いることができるが、これに限定されるものではない。
また、免疫測定方法においては、上記オリゴペプチドを固相化した後、容器内表面に非特異的な（ポリ）ペプチド等の吸着を防止する目的で、ブロッキング処理を行うことができる。
ブロッキング処理は、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を用いることが好ましい。あるいは、アルブミンやミルクカゼインなどのタンパク質を用いてもよい。
このようにして得られた、ノルボルネン系重合体で構成される容器内表面にオリゴペプチドが固相化された容器を用いて、免疫測定を行う。当該免疫測定は、ノルボルネン系重合体で構成される容器内表面に固相化されたオリゴペプチドと溶液内の抗体との抗原抗体反応を利用するものであるが、当該容器との組み合わせによる免疫測定において、測定方法に格別な制限はなく、一般的に知られているＥＬＩＳＡ法の直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などに基づく測定原理を適用することができる。
上記ノルボルネン系重合体で構成される容器内表面に固相化されたオリゴペプチドと溶液内の抗体との抗原抗体反応を利用する代表的な測定方法として、（ｉ）あらかじめ抗体を、容器内に固相化されたオリゴペプチドに結合させた後、被験物を含む試料を添加する方法と、（ｉｉ）オリゴペプチドを固相化した後、被験物を含む試料を抗体と同時に添加する方法とが挙げられる。
（ｉ）の方法においては、酵素や蛍光色素やビオチンなど標識を修飾した抗体であって、オリゴペプチドに特異的に認識する抗体を、オリゴペプチドをノルボルネン系重合体で構成される容器内表面に固相化した容器に添加して、固相化抗原に反応させて、未反応の余剰の抗体を洗浄除去する。次いで、測定対象の試料を容器内に添加して、試料中の抗原と容器内の抗体を反応させて、容器内にある標識抗体を回収する。その後、回収した標識抗体に起因する標識信号を測定することにより、試料中の抗原濃度を計測する。
（ｉｉ）の方法においては、オリゴペプチドをノルボルネン系重合体で構成される容器内表面に固相化した容器に、酵素や蛍光色素やビオチンなど標識を修飾した抗体であって、抗原を特異的に認識する抗体と、被験物を含む試料を混合し、又は混合せず独立して同時に、添加して、抗体を固相化抗原に反応させて、固相化抗原に反応しなかった標識抗体を回収する。その後、回収した標識抗体に起因する標識信号を測定することにより、試料中の抗原濃度を計測する。
上記の（ｉ）の方法と（ｉｉ）の方法においては、測定対象の試料を上記の容器に入れて測定を行うが、一般的なＥＬＩＳＡ法の直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などのように、測定試料を添加した後の容器内の洗浄操作を必要としない。
（ｉ）の方法では、測定試料中の測定対象抗原を、測定容器内に予め固相化オリゴペプチドに吸着した標識抗体と反応させ、その後、標識抗体を試料溶液中に溶出させて、その溶出抗体を取り出し、標識による信号を得ることで、測定試料中の測定抗原の濃度を測定できる。そのため、測定試料を添加した後の容器内の洗浄操作は不要となる。
（ｉｉ）の方法では、測定試料中の測定対象抗原と標識抗体とを同時に測定容器内に添加する。測定試料中の測定対象抗原と反応しなかった標識抗体が、容器内の固相化オリゴペプチドと反応するが、測定試料を取り出し、試料中に含まれる標識抗体の標識による信号を検出することで、測定試料中の測定対象抗原と反応した標識抗体を反映した信号を測定できる。そのため、測定試料を添加した後の容器内の洗浄操作は不要となる。
このように、測定試料を容器内に添加して、免疫反応させた後、その試料液を取り出す操作のみが必要となる。
測定対象の試料が、ヒト等の生体由来の試料、あるいは、培養細胞由来の試料である場合には、試料への感染性微生物の混入に起因する感染症のリスクがあり、試料の取扱時における感染防止のための注意が必要となる。
ＥＬＩＳＡ法では、試料を通常の測定容器に入れて抗原抗体反応を行った場合、容器を洗浄することが一般的な操作となっている。その洗浄操作では、洗浄水が多く発生し、また、洗浄溶液を容器から除去する操作においても、洗浄溶液のミスト・飛沫が発生して、操作者への暴露や、自動装置内への暴露などが起きる可能性が懸念される。このため、試料に感染性微生物が混入している可能性が否定できない場合には、感染症のリスクが高まる。
これに対し、上記（ｉ）および（ｉｉ）の方法では、測定対象試料を測定の容器に添加した後は、洗浄操作を行わずに測定できるので、感染性微生物の混入が否定できない測定対象試料を測定する場合に、感染性リスクを顕著に低減できる。そのため、安全に効率よく免疫測定を行うことができる。
なお、上記（ｉ）および（ｉｉ）の操作は、ヒトの手作業での操作で実施することもできるが、マルチチャンネルの自動分注装置、ロボットや、アーム型のロボット装置などで操作することとしてもよい。
また、洗浄操作を必要とする測定方法では、洗浄操作を複数回繰り返して行うため、時間を要するが、上記（ｉ）および（ｉｉ）の方法であれば、洗浄操作を行う必要がないため、より短時間で効率的に計測が可能となる。
以下、本発明を、実施例によりさらに詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
＜第一次ファージ溶液の取得＞
ファージディスプレイペプチドライブラリーとして、Ｐｈ．Ｄ．－Ｃ７Ｃ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｏ社製）を用いた。
ファージ溶液をリン酸緩衝液（ＰＢＳ；１３７ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／リットルＮａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ／リットルＫＣｌ、１．４７ｍｍｏｌ／リットルＫＨ２ＰＯ４の混合液、ｐＨ７．４）に溶解して、ペプチドライブラリー溶液を調製した。
ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ、日本ゼオン社製〕からなる直径１０ｃｍの培養ディッシュ底面に、調製したペプチドライブラリー溶液を滴下して、室温（２５℃）で３０分間静置した。
その後、前記培養ディッシュ底面をＰＢＳで３回洗浄した。
続いて、ｐＨ２に調製した４０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ・ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．２）で１回洗浄し、さらに、ｐＨ１０に調製した４０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ・ＮａＯＨ（ｐＨ１０）を滴下した。
滴下した液を回収し、直ちに希薄塩酸でｐＨを中和（ｐＨ＝７．０）して、「アルカリで洗浄して回収したファージ溶液」とした。
続いて、前記培養ディッシュ底面に１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳを滴下して、滴下した溶液を回収して、「ＤＭＳＯで洗浄して回収したファージ溶液」とした。
これまでの工程図を図１に示す。
＜第二次ファージ溶液の取得＞
回収したファージの増殖を促すため、以下の方法でファージ感染大腸菌を調製した。
アルカリで洗浄して回収したファージ溶液及び、ＤＭＳＯで洗浄して回収したファージ溶液を、それぞれ、ファージのホストとなる大腸菌培養液に滴下して、３７℃で１６時間、振とう培養し、ファージ感染大腸菌培養液を得た。
調製したペプチドライブラリー溶液の代わりに、ファージ感染大腸菌培養液を、ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオノア１０６０Ｒ、日本ゼオン社製〕からなる直径１０ｃｍの培養ディッシュ底面に滴下すること以外は、上述（第一次ファージ溶液の取得）と同様にして、アルカリで洗浄して回収したファージ溶液と、ＤＭＳＯで洗浄して回収したファージ溶液を得た。
＜第三次ファージ溶液の取得＞
こうして得られた上記２つのファージ溶液を用いて、再度ファージの増殖を促すために、大腸菌に感染させ、第二次ファージ溶液の取得と同様にして、アルカリで洗浄して回収したファージ溶液とＤＭＳＯで洗浄して回収したファージ溶液を得た。
＜ファージの遺伝子解析＞
第三次ファージ溶液の取得により得られた２つのファージ溶液に含まれるファージの遺伝子配列を読み取り、対応するアミノ酸配列を得た。
アルカリで洗浄して回収したファージ溶液から得られた、即ち、高いｐＨで溶出する特性を有するアミノ酸配列は、ＴＶＤＮＳＬＡ（Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｌａ）（配列番号２）であった。
ＤＭＳＯで洗浄して回収したファージ溶液から得られた、即ち、アルカリ洗浄しても接着し続け、有機溶媒で溶出するアミノ酸配列は、ＴＶＤＳＣＬＴ（Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ）（配列番号１）であった。
［実施例２］
＜ポリペプチドの合成＞
実施例１で得られたアミノ酸配列を基に、末端にポリペプチド検出のために、ヒスチジンを６残基ならべたヒスチジンタグ配列を持つポリペプチドで、実施例１で得られたアミノ酸配列とヒスチジンタグ配列との間に、グリシンを連結したポリペプチドを有機合成した。
高いｐＨで溶出する特性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド１として、ＡＹＴＶＤＮＳＬＡＣＧＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨ（Ａｌａ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ）（配列番号３）を合成した。
また、ＤＭＳＯで溶出する特性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド２として、ＡＣＴＶＤＳＣＬＴＣＧＧＧＧＧＨＨＨＨＨＨ（Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ）（配列番号４）を合成した。
＜ポリペプチド溶液の調製＞
ポリペプチド１、ポリペプチド２、及び、ヒト正常ＩｇＧ抗体（和光純薬工業社製）を、それぞれＰＢＳ溶液、及び、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ（１０％ＤＭＳＯ ＰＢＳ）に、それぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解し各種の溶液を調製した。
＜容器への接着性評価＞
上記で調製された各ポリペプチド溶液を、ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ、日本ゼオン社製〕を射出成型して得られた９６ウェルプレート（以下、「１０６０Ｒプレート」という）、及びポリスチレン製の９６ウェルプレート（製品名「ファルコン（登録商標）」、コーニング社製；以下、「ＴＣＰＳプレート」という）に、それぞれ１ウェルあたり５０μＬを添加（Ｎ＝３）して、室温（２５℃）で１時間、静置した。
静置後に、１０６０ＲプレートとＴＣＰＳプレートのウェル内を、Ｔ－ＴＢＳ（０．０５ｍＴｒｉｓ塩酸、０．１５ｍ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．６）を用いて、３回洗浄した後に、ナカライテスク社製のブロッキングワン試薬の５倍希釈溶液をブロッキング溶液として、１ウェルあたり２００μＬずつ分注して、室温１時間、静置することにより、ブロッキング操作を行った。
静置後の各プレートを、Ｔ－ＴＢＳで５回洗浄し、洗浄後に、ポリペプチドの検出用に、（マウス抗６ Ｈｉｓモノクローナル抗体、ナカライテスク社製）のＰＢＳ溶液を１ウェルあたり５０μＬ添加して、室温１時間、静置した。
さらに、静置後の各プレートを、Ｔ－ＴＢＳ（同上）で５回洗浄し、洗浄後に、ペルオキシダーゼ発色試薬を１ウェルあたり５０μＬ添加して、室温１０分間反応発色させて、１００ｍＭの塩酸水溶液を１００μＬ添加して、ペルオキシダーゼ反応を停止した。
各プレートのウェルについて、ウェルプレートリーダー装置（コロナ社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
測定結果を図２に示す。図２では、ポリペプチド別に、ポリペプチドを溶解した溶媒とプレートの組み合わせ別の結果を表示している。
ポリペプチド２は、ＴＣＰＳプレートに比較して、１０６０Ｒプレートで、より高い４５０ｎｍの吸光度を示す結果であり、ポリペプチド２に含まれるアミノ酸配列を有するオリゴペプチドに、ノルボルネン系重合体に対する高い接着性があることが示された。
〔実施例３〕
実施例２において、ノルボルネン系重合体に対する接着性の高いアミノ酸配列を含むポリペプチド２に、細胞表面のファイブロネクチン等の受容体であるインテグリンの認識アミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）を持たせるため、実施例２のヒスチジンタグの前に、ＲＧＤモチーフＲＧＤＳＰ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ）を挿入した、ノルボルネン系重合体接着性修飾（ポリ）ペプチド「ＡＣＴＶＤＳＣＬＴＣＧＧＧＧＧＲＧＤＳＰＨＨＨＨＨＨ（Ａｌａ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ）」（ポリペプチド３）（配列番号５）を合成した。
このポリペプチド３と実施例２で得たポリペプチド２を、それぞれＰＢＳに１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液をろ過滅菌して、ＥＯＧ滅菌済みの１０６０Ｒプレートに、１ウェルあたり、５０μＬ添加して、室温（２５℃）で１時間、静置した。
静置後、ポリペプチド３と、実施例２で得たポリペプチド２をインキュベーションした１０６０Ｒプレートを、それぞれ滅菌済みのＰＢＳで３回洗浄して、ポリペプチド３コート１０６０Ｒプレートと、ポリペプチド２コート１０６０Ｒプレートを得た。
こうして得られた２つのプレート及びポリペプチドでコーティングしていない１０６０Ｒプレートに、無血清培地（無血清培地ＥＳＦ ＳＦＭ Ｓｅｒｕｍ・Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，ＣＨＯ＆２９３Ｃｅｌｌｓ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）に懸濁したＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞をウェルに添加して、３７℃のＣＯ２インキュベータの中で、培養維持した。
培養開始後、５時間で細胞を顕微鏡で観察すると、ポリペプチド３コート１０６０Ｒプレートのウェル内のＣＨＯ細胞は、ＲＧＤ配列の効果があり、細胞が伸展した形状を示した。
ポリペプチド３が接着した１０６０Ｒプレート上のＣＨＯ細胞の顕微鏡写真を図３に示す。
しかしながら、ＲＧＤ配列を持たないポリペプチド２コート１０６０Ｒプレートのウェル内では、１０６０Ｒプレート表面に、ＲＧＤ配列を配置していないので、図４に示すように、細胞は丸い形状となった。
また、ポリペプチドをコーティングしていない１０６０Ｒプレートにおいても、ＣＨＯ細胞は丸い形状であり、図５に示すように、細胞が伸展形状を示すことはなかった。
これらの結果から、本発明の一態様に係るオリゴペプチドは、細胞の接着を制御するＲＧＤ配列等の他のペプチドと組み合わせることで、ノルボルネン系重合体表面に当該オリゴペプチドを含むポリペプチドのコーティングを可能にし、ＣＯＰ表面上での細胞の接着性等の状態を制御することができることが示された。
以下の実施例では、例示的に、測定対象の物質としてＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）を使用するが、測定対象の物質はこれに限定されない。
〔実施例４〕
抗原のマルチウェルプレートへの吸着条件を検討した。ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ、日本ゼオン社製〕を射出成型して得られた９６ウェルプレート（以下、「１０６０Ｒプレート」という）、及びポリスチレン製の９６ウェルプレート（製品名「スミロンＥＬＩＳＡ用プレートＨ（登録商標）」、住友ベークライト社製；以下、「ＰＳプレート」という）を用い抗原の吸着比較を行った。
ヒトＢＮＰ（ｂｒａｉｎ ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）の抗体認識部位のアミノ酸配列Cys－Lys－Val－Leu－Arg－Arg－His（配列番号６）のＮ末端側に、ノルボルネン系重合体に特異的に吸着する特性を有するアミノ酸配列である、Ala－Cys－Thr－Val－Asp－Ser－Cys－Leu－Thr－Cys－Gly－Gly－Gly－Gly－Gly－Ser－Ser－Ser－Gly－Leu－Gly（配列番号７）が結合したポリペプチド（以下、「合成ＢＮＰ抗原」という）を合成した。リン酸緩衝生理食塩水（ＮａＣｌ ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．２０ ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ／Ｌ；ｐＨ７．４；以下、同じ）に、合成ＢＮＰ抗原を、濃度１×１０７ｐｇ／μＬ、５３ｐｇ／μＬ、及び２７ｐｇ／μＬとなるように溶解した希釈試料を作り、各種希釈資料１００μＬを３ウェルずつ入れて、室温で３０分静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄したあと、リン酸緩衝生理食塩水で１０倍希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社製、製品名「ブロッキングワン」）を用いて、各ウェルに２００μＬ分注し、室温３０分静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、プレートに合成ＢＮＰ抗原を固相化した。
続いて、０．２５ｎｇ／μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水を、各ウェルに１００μＬ添加し、室温３０分静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。
次いで、発色試薬（ナカライテスク社製、製品名「ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液」）を用いて、プレート中に固定された合成ＢＮＰ抗原を発色させ、希硫酸水溶液で反応停止させた後に、吸光プレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸光を測定した。
その結果、図６に示されるように、ＰＳプレートには、合成ＢＮＰ抗原は吸着しないが、１０６０Ｒプレートには、合成ＢＮＰ抗原が吸着することが確認できた。
〔実施例５〕
＜ＢＮＰ測定用プレートの調製＞
実施例１で合成した合成ＢＮＰ抗原を濃度９８ｐｇ／μＬとなるようにリン酸緩衝生理食塩水に溶解して抗原溶液を調製し、１０６０Ｒプレートの各ウェル（７ウェル）に１００μＬ分注したこと以外は、実施例４と同様にしてプレートに合成ＢＮＰ抗原を固相化した。
続いて、０．２５ｎｇ／μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水リン酸緩衝生理食塩水で希釈して、各ウェル５０μＬ添加し、室温３０分静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ＢＮＰ測定用プレートを作製した。
＜ＢＮＰ測定＞
ヒトＢＮＰ（ペプチド研究所製）を、リン酸緩衝生理食塩水に濃度２．０ｐｇ／ｍｌ、３．９ｐｇ／ｍｌ、７．８ｐｇ／ｍｌ、１５．６ｐｇ／ｍｌ、３１．３ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、及び１２５ｐｇ／ｍｌとなるように溶解した希釈試料（７点）を調製し、得られたＢＮＰ測定用プレートに各ウェル１００μＬ入れて、室温３０分間静置し、ウェル内の溶液を５０μＬ回収して、別のマルチウェルプレートに移した。
移した溶液に対して、発色試薬（ナカライテスク社製、製品名「ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液」）を添加して発色させ、希硫酸水溶液で反応停止させた後に、吸光プレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、図７に示されるように、用いたＢＮＰ濃度に依存して発色がみられ、吸光度を測定することによりＢＮＰ濃度を算出可能であることが示された。
〔実施例６〕
ノルボルネン系重合体の表面のブロッキング操作として、ＥＬＩＳＡ法で汎用されているタンパク質を用いる方法と、Ｔｗｅｅｎ２０を用いる方法での効果比較を行った。
ブロッキング剤として、汎用されているカゼインを含有する１０％ブロッキング剤（ナカライテスク社製、製品名「ブロッキングワン」）を含むリン酸緩衝生理食塩水（「終濃度１０％ブロッキングワンＰＢＳ」）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（「終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ」）、および０．２％％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（「終濃度０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ」）を用いて、実施例５と同様にして合成ＢＮＰ抗原が固相化された容器をブロッキングし、ブロッキング処理しない条件との比較を行った。
マイクロウェルプレートとして、１０６０Ｒプレート（実験例）とＰＳプレート（比較例）を用いた。
ブロッキング処理は、ブロッキング剤をウェル内（ウェル数３）に各２００μＬ添加して、室温２０分静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、０．２５ｎｇ／μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗体を含むリン酸緩衝生理食塩水に溶解した抗体溶液を調製して、９６ウェルプレートのウェルに５０μＬ添加し、室温で６０分間静置した。
静置後、ウェル内の溶液を除去して、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で、３回洗浄し、続いて、発色試薬（ナカライテスク社製、製品名「ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液」）を、９６ウェルプレートのウェルに５０μＬ添加し、室温で５分間静置した。停止液として、０．１Ｍの硫酸液を添加したあと、吸光度４５０ｎｍを吸光プレートリーダーで計測した。
実験条件の組み合わせを表１に示す。
Figure 0007024730000001
１０６０Ｒプレートでのブロッキング未実施のウェルの測定した吸光値に対する相対値を用いて、各条件の値を求めた。
その結果、図８に示されるように、１０６０Ｒプレートでは、タンパク質を含有せず、Ｔｗｅｅｎ２０が含まれる溶液でのブロッキング効果が見られ、非特異的な抗体の吸着が抑えられていることが示された。ＰＳプレートでは、タンパク質を含有しなくても、未処理に比較して、吸着が少ない結果であったが、タンパク質を含有するブロッキング剤に比較して、ブロッキング効果が低かった。
〔実施例７〕
容器内には、固相化抗原を固相化し、試料と同時に抗体を添加する方法について実施例を示す。
＜ＢＮＰ測定用プレートの調製＞
実施例４で得た合成ＢＮＰ抗原をリン酸緩衝生理食塩水で濃度１２２ｐｇ／μＬとして抗原溶液を調製し、１０６０Ｒプレートの各ウェルに７５μＬ分注し、室温１時間静置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄したあと、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で室温１０分静置してブロッキング処理を行った。
＜ＢＮＰ測定＞
ヒトＢＮＰ（ペプチド研究所製）の希釈試料を濃度１８ｐｇ／μＬ、４ｐｇ／μＬ、および１ｐｇ／μＬで調製し、これらの希釈試料５０μＬと、ヒトＢＮＰを認識できるホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗体をリン酸緩衝生理食塩水で希釈した溶液５０μＬを混合し、上記のＢＮＰ測定用プレートに各ウェル１００μＬ添加（各３ウェル）して、室温３０分間静置した。
続いて、ウェル内溶液を５０μＬ取り出し、発色試薬（ナカライテスク社製、製品名「ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢ溶液」）を添加して吸光度を測定した。
その結果、図９に示されるように、ＢＮＰ濃度依存的に吸光が観察され、ノルボルネン系重合体からなる容器内に抗原を固相化したプレートを準備して、試料と同時に抗体を添加する方法によっても、免疫測定できることが示された。

Claims (9)

  1. ランダムなアミノ酸配列を内在するペプチドライブラリーを、少なくとも表面がノルボルネン系重合体で構成される成形体の前記表面に曝露するステップ（Ｉ）と、
    暴露された前記表面を水系溶媒で洗浄するステップ（ＩＩ）と、
    前記表面に残留する化合物を、該表面を有機溶媒で洗浄することにより回収するステップ（ＩＩＩ）と、
    回収した前記化合物のペプチド配列情報を解析するステップ（ＩＶ）と、
    を含む、オリゴペプチドの探索方法により探索されたオリゴペプチドを、ノルボルネン系重合体で構成される容器の内表面に固相化し、
    内表面にオリゴペプチドを固相化した前記容器を用いて測定を行う、免疫測定方法であって、
    前記オリゴペプチドがＴｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、免疫測定方法。
  2. 前記ノルボルネン系重合体が、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物である、請求項１に記載の免疫測定方法。
  3. 前記水系溶媒が緩衝液である、請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
  4. 前記有機溶媒が極性有機溶媒である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫測定方法。
  5. Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む、オリゴペプチド。
  6. ノルボルネン系重合体に対して接着性を有する、請求項５に記載のオリゴペプチド。
  7. 前記ノルボルネン系重合体が、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物である、請求項６に記載のオリゴペプチド。
  8. Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ノルボルネン系重合体に接着性を有する、修飾ペプチド又は修飾ポリペプチド。
  9. 前記測定の前にブロッキング処理をさらに行い、
    ブロッキング処理剤として、Ｔｗｅｅｎ２０を用いる、請求項１～４のいずれかに記載の免疫測定方法。
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