KR20190097293A - 인간 이외의 동물에서 그람 양성균 및 그람 음성균에 의해 유발된 질병에 대한 리소박틴과 아미노글리코시드의 조합 - Google Patents

인간 이외의 동물에서 그람 양성균 및 그람 음성균에 의해 유발된 질병에 대한 리소박틴과 아미노글리코시드의 조합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 이외의 동물에서 그람 양성균 및 그람 음성균에 의해 유발된 질병의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 인간 이외의 동물에서 유방염의 치료와 관련하여 특히 유용하다고 입증되었다. 특히, 소의 유방염이 본 발명에 의해 잘 다루어질 수 있다.

Description

인간 이외의 동물에서 그람 양성균 및 그람 음성균에 의해 유발된 질병에 대한 리소박틴과 아미노글리코시드의 조합
본 발명은 인간 이외의 동물에서 그람 양성균 및 그람 음성균에 의해 유발된 질병의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이다. 본 발명은 인간 이외의 동물에서 유방염의 치료와 관련하여 특히 유용하다고 입증되었다. 특히, 소의 유방염이 본 발명에 의해 잘 다루어질 수 있다.
유방염은 유방 조직의 염증이며 젖소에서 계속해서 가장 빈번하고 비용이 많이 드는 질환이 되고 있다. 유방염으로 인한 재정적 손실은 질환의 준임상 및 임상 단계 모두에 대해 발생한다. 준임상적 유방염에 의해 초래된 손실은 잘 문서화되어 있다. 50,000개 세포/㎖ 초과의 체세포수 (SCC)의 각 배증은 최초 젖분비 및 나이든 암소에서 각각 1일 당 0.4 kg 및 0.6 kg의 우유 손실을 초래한다 (Hortet P, H. Seegers. 1998. Calculated milk production losses associated with elevated somatic cell counts in dairy cows: review and critical discussion. Vet Res. 29(6):497-510). 임상적 유방염으로 인한 손실은 우유 폐기, 우유 수율에서의 일시적 감소 및 조기 도태를 포함한다. 유방염의 치료는 가능하면 원인이 되는 세균에 대하여 표적화되어야 한다.
[Pyoeraelae S in Irish Veterinary Journal, Volume 62 Supplement 40-44 2009]는 상이한 병원균으로 인한 임상적 유방염의 항균제 치료에 대해 하기와 같은 제안을 한다:
Figure pct00001
젖소에서의 유방염 치료를 위한 최근의 약학 조성물은 그람 양성 및 그람 음성 유방염 초래 세균 모두에 대한 광범위 항생제인 Ubrolexin®이다. Ubrolexin®은 세팔렉신과 카나마이신의 조합이며 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 디스갈락티카에 (Streptococcus dysgalacticae), 스트렙토코쿠스 우베리스 (Streptococcus uberis) 및 대장균 (Escherichia coli)으로 인한 임상적 유방염의 치료를 위해 처방된다. 세팔로스포린 그룹 물질의 항생제인 세팔렉신의 작용 방식은 세균 세포벽 합성을 방해하는 D-알라닌 트랜스펩티다아제에 대한 비가역적 결합이다. 아미노글리코시드 항생제인 카나마이신은 막 결합 리보솜의 30S 서브유닛에 부착함으로써 작용하며 세균 단백질 합성을 저해하거나 방해한다.
따라서, 항생제, 특히 아미노글리코시드와 다른 항생 물질의 조합은 자체로 공지되어 있다.
선행 기술에서 항생제로의 반복되는 문제는 병원균이 이들이 일으키는 질환의 치료에 이용되는 약물에 대해 내성이 발생할 수 있다는 것이다. 따라서, 새로운 활성 약학 성분이 끊임없이 추구되고 있다. 상승 효과가 없고 다른 병원균만을 대상으로 하는 항생 물질을 병용으로 사용하는 경우 내성 발생 문제가 더욱 악화된다. 그 경우, 제1 항생제의 주된 표적이 아닌 병원균은 상기 제1 항생제에 대해 완전한 내성을 연속적으로 발생시킬 수 있다.
리소박틴은 리소박터 종 (Lysobacter sp .) SC-14076 (ATCC 53042)의 발효 브로쓰로부터 최초로 단리되었다. 독립적으로, 과학자들은 사이토파가 속 (genus Cytophaga) (생산 균주 PBJ-5356)에 관련된 토양 세균으로부터 카타노신 (katanosin) A 및 B를 발견하였다. 카타노신 B는 리소박틴과 동일한 것으로 판명되었다. 세균 세포벽 생합성이 이러한 항생제의 주요 표적이지만; 작용 메커니즘은 반코마이신의 경우와 상이하다. 리소박틴은 여러 비단백질생성 D- 및 L-아미노산을 함유하는 시클릭 뎁시펩티드이다.
천연 산물 리소박틴 및 일부 유도체가 US 4,754,018에 항세균 활성을 갖는 것으로 기재되어 있다. 리소박틴의 단리 및 항세균 활성이 또한 EP 196 042 A1 및 JP 01-132600에 기재되어 있다.
또한, 리소박틴 및 카타노신 A의 항세균 활성이 O'Sullivan, J. et al., J. Antibiot. (1988) 41 :1740-1744, Bonner, D. P. et al., J. Antibiot. (1988) 41:1745-1751, Shoji, J. et al., J. Antibiot. (1988) 41:713-718 및 Tymiak, A. A. et al., J. Org. Chem. (1989) 54:1149-1157에 기재되어 있다.
세팔렉신 및 카나마이신에 대한 작용 방식과 달리, 리소박틴은 세균 세포벽 전구체 지질 II와 직접 상호작용하는 것으로 제안되어 있다 (Lee, W. et al, Am. Chem. Soc. (2016) 138(1):100-113 및 Breukink E. and de Kruijff B., Nat. Rev. Drug Disc. (2006) 5:321-323). 리소박틴의 유도체는 특허 출원 WO 2004/099239 A1, WO 2006/042653 A1, WO 2006/042654 A1, WO 2006/042655 A1, WO 2006/048139 A1, WO 2006/048140 A1, WO 2006/048156 A1, WO 2007/085456 A1, WO 2007/118691 A1 및 WO 2007/118693 A1의 대상이다.
선행 기술 중 어느 것도 리소박틴을 사용하는 소 유방염 치료와 관련이 없다. 특히, 유방염 치료를 위한 리소박틴과 다른 항생 물질의 병용에 관한 선행 기술은 없다. 특히, 상업적 영농 손실의 주된 원인인 소 유방염의 치료는 당해 기술 분야에서 적절한 옵션이 부족하다.
최근 국제 특허 출원 PCT/EP2016/069380에서 리소박틴의 단독 사용이 내성 파괴 특성 때문에 그람 양성균, 특히 포도상구균 (Staphylococcus) 세균, 연쇄상구균 (Streptococcus) 세균, 트루에페렐라 (Trueperella) 세균 및/또는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 세균에 의해 주로 야기되는 소의 유방염 치료에 놀라우리만치 매우 유익하다는 것이 밝혀졌지만, 그람 음성 병원균에 대한 잠재적인 작용제로서의 리소박틴의 효능 및 다른 항생제와의 잠재적 상승 작용에 대한 불확실성이 남아 있다.
따라서, 활성 성분에 대한 세균 내성의 결점이 없고, 그람 양성균 및 그람 음성균을 상승적으로 처리할 수 있는, 특히 소의 유방염 치료가 당 업계에서 요구된다. 본 발명은 이를 위한 해결책을 제공하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명은 특히 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합물에 관한 것이다. 특히, 이러한 유형의 상업적으로 가장 관련이 있는 질환으로서의 소의 유방염의 치료가 본 발명의 목표이다. 놀랍게도, 아미노글리코시드 항생제와 결합된 리소박틴은 인간 이외 동물에서 병원균에 의해 유발된 질병과 관련된 그람 양성균 및 그람 음성균 모두에서 항균성을 연장시키는 효과가 있음이 밝혀졌다. 이같은 상승 효과는 그러한 병원균에 의해 유발된 유방염을 앓고 있는 암컷 동물에서 특히 명백한데, 소 유방염은 본원에 기술된 발명의 상업적으로 가장 관련된 응용분야인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "리소박틴"은 CAS 번호 118374-47-3의 물질 및 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 나타낸다. 리소박틴은 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00002
다루어야 할 소 유방염은 특히 젖소의 유방염이다.
리소박틴의 생리학적으로 허용가능한 염은 무기산, 카복실산 및 설폰산의 산 부가 염, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 나프탈렌디설폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 락트산, 타르타르산, 말산, 시트르산, 푸마르산, 말레산 및 벤조산의 염을 포함한다.
리소박틴의 생리학적으로 허용가능한 염은 또한, 예로서 바람직하게는 알칼리 금속 염 (예를 들어 나트륨 및 칼륨 염), 알칼리 토금속 염 (예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염)과 같은 통상적인 염기의 염 및 예로서 바람직하게는 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디시클로헥실아민, 디메틸아미노에탄올, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸모르폴린, 아르기닌, 리신, 에틸렌디아민 및 N-메틸피페리딘과 같은 1 내지 16개의 C 원자를 갖는 유기 아민 또는 암모니아에서 유래하는 암모늄 염을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, "아미노글리코시드 항생제" 또는 "아미노글리코시드"라는 용어는 시클로헥산-당 그룹 및 아미노-당 그룹으로 구성되고 리보솜과 관련된 막의 30S 서브 유닛에 부착하는 특징을 기능적으로 공유하여 (특히) 세균 세포의 단백질 생합성을 방해할 수 있는 올리고사카라이드 물질을 지칭한다. 본 발명에 따른 아미노글리코시드 군의 제한적이지 않고 포괄적이지 않은 구성원은 아미카신, 아프라마이신, 프라마이세틴, 제네티신 (G418), 겐타마이신, 카나마이신, 네틸마이신, 네오마이신, 파로모마이신, 시소마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신 및 토브라마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
리소박틴과 마찬가지로, "아미노글리코시드 항생제" 또는 "아미노글리코시드" 또한 그의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 따라서, 아미노글리코시드의 생리학적으로 허용가능한 염은 본 발명과 관련하여 리소박틴에 대해 기술된 통상적인 염기의 염뿐만 아니라 무기산, 카복실산 및 설폰산의 산 부가염을 포함한다.
리소박틴 및 아미노글리코시드는 전신으로 및/또는 국소적으로 작용할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 이는 예를 들어 경구, 비경구, 폐, 비강, 설하, 설측, 구강, 직장, 관절내, 피부 또는 경피 경로에 의해, 또는 임플란트 또는 스텐트로서 적합한 방식으로 투여될 수 있다.
리소박틴 및 아미노글리코시드는 이러한 투여 경로에 적합한 투여 형태로 투여될 수 있다.
경구 투여에 적합한 것은, 선행 기술에 따라 기능하며 리소박틴 및 아미노글리코시드를 신속하게 및/또는 변형된 방식으로 전달하고 리소박틴 및 아미노글리코시드를 결정질 및/또는 비정질 및/또는 용해된 형태로 함유하는 투여 형태, 예를 들어 정제 (예를 들어 리소박틴의 방출을 지연시키고 제어하면서 용해되거나 불용성인 코팅 또는 장용 코팅을 갖는 코팅정 또는 비코팅정), 입에서 신속하게 붕해하는 정제, 또는 필름/웨이퍼, 필름/동결건조물, 캡슐 (예를 들어 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐), 당의정, 과립, 펠렛, 분말, 유액, 현탁액, 에어로졸 또는 용액이다.
비경구 투여는 흡수 단계를 피하여 (예를 들어 유방내, 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수내 또는 요추내) 또는 흡수를 포함시켜 (예를 들어 근육내, 피하, 피부내, 경피 또는 복강내) 일어날 수 있다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 그 중에서도, 용액, 현탁액, 유액, 동결건조물 또는 멸균 분말 형태로의 주시 및 주입용 제제이다.
다른 투여 경로에 대해 적합한 것은, 예를 들어 수성 현탁액 (로션, 진탕 혼합물), 친유성 현탁액, 연고, 크림, 피부경유 치료 시스템 (예를 들어 패치), 밀크, 페이스트, 거품, 산포제, 임플란트 또는 스텐트에 대한 약학 형태이다.
리소박틴 및 아미노글리코시드는 언급된 투여 형태로 전환될 수 있다. 이는 불활성, 비독성, 약학적으로 적합한 부형제와 혼합함으로써 자체적으로 공지된 방식으로 일어날 수 있다. 이들 부형제는 그 중에서도, 담체 (예를 들어 미세결정질 셀룰로오스, 락토오스, 만니톨), 용매 (예를 들어 액체 폴리에틸렌 글리콜), 유화제 및 분산제 또는 습윤제 (예를 들어 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시소르비탄 올레에이트), 결합제 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈), 합성 및 천연 중합체 (예를 들어 알부민), 안정화제 (예를 들어 아스코르브산과 같은 산화방지제), 색소 (예를 들어 산화철과 같은 무기 안료) 및 맛 및/또는 냄새 차폐제를 포함한다.
본 발명은 하기 양태 및 구체예를 참조로 하여 추가로 기재될 것이다. 이들은 맥락에서 명백히 다르게 나타내지 않는 한, 자유로이 조합될 수 있다.
일 구체예는 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이며, 여기서 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제는 유방내로 투여된다. 아미노글리코시드 항생제는 바람직하게는 네오마이신 또는 카나마이신이다. 보다 바람직하게 유방염은 소의 유방염이다.
또 다른 구체예는 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이며, 여기서 유방염은 임상적으로 명백한 유방염이다. 아미노글리코시드 항생제는 바람직하게는 네오마이신 또는 카나마이신이다. 보다 바람직하게 유방염은 소의 유방염이다.
또 다른 구체예는 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제와의 조합에 관한 것이며, 여기서 유방염은 준임상적 소 유방염이다. 아미노글리코시드 항생제는 바람직하게는 네오마이신 또는 카나마이신이다. 보다 바람직하게 유방염은 소의 유방염이다.
또 다른 구체예는 리소박틴이 유방 분방 (udder quarter) 당 25 내지 1000 mg의 용량, 바람직하게는 유방 분방 당 50 내지 500 mg의 용량, 보다 바람직하게는 유방 분방 당 100 내지 300 mg의 용량으로 제공되는, 소 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제와의 조합에 관한 것이다. 가장 바람직하게는 유방염은 소의 유방염이다.
본 구체예의 바람직한 구체예에서, 리소박틴의 조합물은 네오마이신 또는 카나마이신, 바람직하게는 네오마이신으로 제조된다.
필요에 따라, 특히 체중, 투여 경로, 활성 성분에 대한 개별 반응, 제제의 성질 및 투여가 일어나는 시간 또는 간격에 따라 언급된 양으로부터 벗어나는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 일부 경우에는 전술한 최소량 미만으로도 충분할 수 있지만, 다른 경우에는 언급된 상한을 초과하여야만 한다. 더 많은 양을 투여하는 경우에 하루에 걸쳐 여러 개별 용량으로 나누는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따라 실제로 사용되는 실질적인 아미노글리코시드 항생제에 따라, 상기 용량은 달라질 수 있으며, 그에 따라 리소박틴의 비율이 달라질 수 있다.
그람 양성 병원균뿐만 아니라 그람 음성 병원균 모두에서 매우 긍정적인 결과가 얻어지며, 따라서 리소박틴과 아미노글리코시드 항생제의 비율이 적어도 0.1인 것이 바람직하다. 적어도 0.2의 비율이 훨씬 양호한 결과를 제공하며, 적어도 1:1의 비율이 더욱 바람직하고, 적어도 2:1의 비율이 보다 더 바람직하다. 가장 바람직한 비율은 적어도 4:1이다.
또 다른 구체예는 그람 양성 및 그람 음성 세균에 기인한 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이다. 바람직하게 유방염은 소 유방염이다.
보다 바람직하게는, 본 발명은 포도상구균 (Staphylococcus) 세균, 연쇄상구균 (Streptococcus) 세균, 트루에페렐라 (Trueperella), 코리네박테리움 (Corynebacterium) 세균 및/또는 에스케리키아 (Escherichia) 세균에 기인한 소의 유방염의 치료에 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이다.
특히, 유방염은 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 응고 효소 음성 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 우베리스 (Streptococcus uberis), 스트렙토코쿠스 디스갈락티카에 (Streptococcus dysgalacticae), 스트렙토코쿠스 아갈락티카에 (Streptococcus agalacticae) 및/또는 대장균 (E. coli) 세균에 기인할 수 있다.
또한, 소 유방염은 트루에페렐라 피오게네스 (Trueperella pyogenes) 및/또는 대장균에 기인할 수 있다. 또한, 유방염은 코리네박테리움 보비스 (Corynebacterium bovis) 및/또는 대장균 (E. coli)에 기인할 수 있다.
스타필로코쿠스 아우레우스, 응고 효소 음성 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 우베리스, 스트렙토코쿠스 디스갈락티카에, 스트렙토코쿠스 아갈락티카에, 트루에페렐라 피오게네스 및 코리네박테리움 보비스는 소의 유방염에서 발견되는 가장 일반적인 병원균이며 대장균과의 중복감염이 흔하고, 집단적으로 특히 본 발명에 따른 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합 치료에 감수성이 있는 것으로 밝혀졌다. 유방염은 또한 에스케리키아 (Escherichia) 세균의 존재에 의해서만 임상적으로 관련이 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 조성물이 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제를 포함하는, 유방으로 유방 내 투여하기 위해 제형화된 약학 조성물이다. 바람직하게는, 조성물은 소 유방 내로 투여되도록 제형화된다. 보다 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 및 특히 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 이들 부형제는 그 중에서도, 담체 (예를 들어 미세결정질 셀룰로오스, 락토오스, 만니톨), 용매 (예를 들어 액체 폴리에틸렌 글리콜), 유화제 및 분산제 또는 습윤제 (예를 들어 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시소르비탄 올레에이트), 결합제 (예를 들어 폴리비닐피롤리돈), 합성 및 천연 중합체 (예를 들어 알부민), 안정화제 (예를 들어 아스코르브산과 같은 산화방지제), 색소 (예를 들어 산화철과 같은 무기 안료) 및 맛 및/또는 냄새 차폐제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 유방염 치료용 약제의 제조를 위한 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 용도이다. 소의 유방염 치료용 약제의 제조에 대한 용도가 바람직하다.
본 발명에 따른 용도의 일 구체예에서, 소 유방염은 임상적으로 명확한 소 유방염이다.
본 발명에 따른 용도의 또 다른 구체예에서, 소 유방염은 준임상적 소 유방염이다.
본 발명에 따른 용도의 또 다른 구체예에서, 소 유방염은 포도상구균 세균, 연쇄상구균 세균, 트루에페렐라 세균, 코리네박테리움 세균 및/또는 에스케리키아에 기인한다.
특히, 유방염은 스타필로코쿠스 아우레우스, 응고 효소 음성 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 우베리스, 스트렙토코쿠스 디스갈락티카에, 스트렙토코쿠스 아갈락티카에 및/또는 대장균 (E. coli) 세균에 기인할 수 있다.
또한, 소 유방염은 트루에페렐라 피오게네스 및/또는 대장균에 기인할 수 있다. 또한, 유방염은 코리네박테리움 보비스 및/또는 대장균에 기인할 수 있다.
본 발명은 또한 유방염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 유방을 갖고 있고 치료를 필요로 하는 인간 이외의 암컷 동물에 치료적 유효량의 리소바틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 유방을 갖는 인간 이외의 암컷 동물은 젖소이다.
마지막으로, 본 발명의 주요 양태는 상업적으로 적용 가능한 이유로 특히 소의 유방염의 치료에 관한 것이지만, 놀랍게도 본원에서 발견된 상승효과는 특히 소의 유방에 대한 특정 치료에 국한되지 않을 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 제공된 실험 데이터는 상기 언급된 상승효과가 그람 음성 및 그람 양성 세균에 의해 기인한 임의의 질병을 앓고 있는 인간 이외의 동물에서 임의의 치료에 적용될 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명의 가장 중요한 구체예는 일반적으로 그람 음성 및 그람 양성 세균에 기인한 질병에 대해 인간 이외의 동물을 치료하는데 사용하기 위한 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합에 관한 것이다.
본 발명을 하기 실시예 및 도면을 참조로 하여, 제한 없이 추가로 설명할 것이다.
도 1은 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴의 사멸 속도를 나타낸다 (실시예 2).
도 2는 연속 계대 동안 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴의 MIC 변화를 나타낸다 (실시예 4)
도 3은 스타필로코쿠스 아우레우스 급성 마우스 유방염 모델에서의 리소박틴의 효능을 나타낸다 (실시예 5)
도 4는 스트렙토코쿠스 우베리스 챌린지 마우스 유방염 모델에서의 리소박틴의 효능을 나타낸다 (실시예 6)
도 5는 젖분비 홀스타인 소 (Holstein cow)에게 유방내 (IMAM) 적용 후 우유에서의 리소박틴의 농도-시간 프로필을 나타낸다 (실시예 7).
도 6은 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴 및 네오마이신 단독 또는 1:1 및 2:1 용량 비율로의 조합의 우유에서의 사멸 속도를 나타낸다 (실시예 10)
도 7은 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴 및 네오마이신 단독 또는 1:5 및 1:10 용량 비율로의 조합의 우유에서의 사멸 속도를 나타낸다 (실시예 10)
도 8은 대장균에 대한 리소박틴 및 네오마이신 단독 또는 조합의 우유에서의 사멸 속도를 나타낸다 (실시예 10).
도 9는 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 리소박틴과 네오마이신 또는 카나마이신의 조합물의 사멸 속도를 나타낸다 (실시예 11)
도 10은 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴과 플로르페니콜 (florfenicol)의 조합물의 사멸 속도학을 나타낸다 (실시예 12)
도 11은 스타필로코쿠스 아우레우스 급성 마우스 유방 모델에서 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합의 효능을 나타낸다 (실시예 13).
도 12는 스트렙토코쿠스 우베리스 급성 마우스 유방 모델에서 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합의 효능을 나타낸다 (실시예 14).
실시예
실시예 1: 유방염 병원균에 대한 리소박틴의 시험관 내 항세균 활성
스타필로코쿠스 아우레우스, 응고 효소 음성 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 우베리스, 스트렙토코쿠스 디스갈락티아에, 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 트루에페렐라 피오게네스, 대장균 또는 크렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae)와 같은 흔한 유방염 병원균에 대한 리소박틴의 시험관 내 항세균 활성을 미국임상검사표준연구소 (Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI)에 의해 기재된 바와 같이 마이크로브로쓰 희석 MIC 방법학에 의해 평가하여, 세균의 가시적인 증식을 방지하는 물질의 최저 농도로서 정의되는 최소 저해 농도 (MIC)를 얻었다. MIC90으로서 표현되는 결과를 하기 표에 요약하였으며, 여기서 MIC90은 주어진 종의 균주의 적어도 90%의 증식이 저해되는 농도로서 정의된다.
Figure pct00003
실시예 2: 유방염 병원균에 대한 리소박틴 단독의 시험관 내 사멸 속도
우유에서의 세균를 사멸시키는 리소박틴의 능력을 평가하기 위해, 상점에서 구매한 전유에 상이한 농도의 리소박틴을 함유하는 플라스크에, 1-2 × 106 콜로니 형성 단위/㎖ 의, 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 스트렙토코쿠스 우베리스의 대표 균주를 접종하였다. 플라스크를 35 +/- 2℃ 진탕 수조에서 24-48 시간 동안 인큐베이션하고, 샘플을 희석하고 한천 플레이트에 플레이팅하여 여러 시점에서 각 플라스크 내에서의 생균수를 측정하였다. 초기 접종물에서의 생균수의 적어도 99.9% 감소가 살균 활성으로서 정의된다.
우유에서의 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740 및 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC 27958에 대한 리소박틴의 사멸 속도를 4, 8, 16, 32 및 64 ㎍/㎖의 리소박틴 농도에 대해 측정하였다. 결과를 도 1에 나타내었다 (CFU: 콜로니 형성 단위). 각각 24 시간 및 48 시간에서의 사멸력을 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대해 상정할 수 있다.
실시예 3: 리소박틴 단독에 대한 자연적 내성 발생의 시험관 내 평가
자연적 내성 발생의 빈도를, 적어도 1×109 콜로니 형성 단위의 각 세균 균주를 4× 또는 8× MIC에서 리소박틴을 함유하는 한천 플레이트에 플레이팅하고 플레이트를 35 +/- 2℃에서 인큐베이션하여 평가하였다. 48 시간 후, MIC 초과의 리소박틴 농도에서 플레이트에 증식한 콜로니 수를 초기 플레이팅한 세균 수로 나누었다. 결과로 발생한 수는 자연적 내성 빈도로서 정의되고, 감염 동안 나타나는 내성 단리물의 가능성 지표이다.
결과로서, 4- 및 8-배 MIC에서의 리소박틴은 매우 양호한 내성 프로필을 나타내며: 내성 단리물은 검출할 수 없었다. 결과를 하기 표에 요약하였다:
Figure pct00004
실시예 4: 연속 계대 동안 리소박틴 단독에 대한 내성 발생의 시험관 내 평가
리소박틴의 하위-MIC 농도에 세균의 지속적인 노출 동안 MIC 변화 모습을 연속 계대 실험에 의해 평가하였다. 제1 일에 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스의 MIC를 미국임상검사표준연구원 (CLSI)에 의해 기재된 바와 같이 마이크로브로쓰 희석 MIC 방법론에 의해 평가하였다. 계속되는 33 일 동안 매일, 완전한 증식을 허용하는 최고 농도를 함유하는 웰로부터의 세균을 수집하고, 새로운 96-웰 플레이트에 접종하고 리소박틴에 대한 지속적인 노출 동안 MIC를 평가하는데 사용하였다. 매일 수득한 MIC를 시간의 흐름에 따라 플롯팅하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. MIC의 빠른 변화를 초래하는 것으로 알려진 리팜피신을 양성 대조군으로서 사용하였다.
결과는, 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 MIC가 33 일 기간에 걸쳐 일정하게 남아 있음에 따라, 지속적인 노출 동안 내성 발생에 대한 리소박틴의 매우 양호한 프로필을 나타낸다.
실시예 5: 스타필로코쿠스 아우레우스 로의 급성 마우스 유방염 모델에서의 리소박틴 단독 효능
리소박틴 (pH 4.7에서 히드로겔에서 제형화)의 효능을 캐나다 쉐부르크 대학 (University of Sherbrooke, Canada)에서 확립된 스타필로코쿠스 아우레우스 급성 마우스 유방염 모델에서 시험하였다 (본원에 참조로 포함되는 Broui-llette et al, Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262). 젖분비 CD-1 마우스의 복부 유선 (L4 및 R4)을 100 CFU (콜로니 형성 단위)의 스타필로코쿠스 아우레우스로 유방내 감염시켰다. 마우스를 감염 후 4 시간 리소박틴으로 유방내 처리하였다. 각각의 처리군은 적어도 3 마리 마우스 (6 개 분방 (quarter))를 포함하였고 14 시간 후 (접종 18 시간 후) 마우스를 희생시키고, 유선을 수확하고, 유선 균질물의 10-배 연속 희석물을 플레이팅하여 CFU 함량을 평가하였다. CFU 함량을 log10 수로서 표현하였다. 검출 한계는 유선 1 g 당 200 CFU였다. 1 g 당 200 CFU 미만을 갖는 유선을 깨끗한 것으로 간주하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
50 ㎍ 리소박틴의 유방내 점적 주입은 중간 CFU 함량을 약 4 log10으로 감소시키며, 400 ㎍ 리소박틴은 모든 감염된 유선으로부터 감염을 제거한다.
실시예 6: 스트렙토코쿠스 우베리스 로의 급성 마우스 유방염 모델에서의 리소박틴 단독 효능
리소박틴 (pH 4.7에서 히드로겔에서 제형화)의 효능을 스트렙토코쿠스 우베리스 챌린지 마우스 유방염 모델에서 시험하였다. 결과를 도 4에 나타낸다.
20 마리의 젖분비 마우스를 새끼 출산 후 약 12-15 일에 스트렙토코쿠스 우베리스로 네 번째 쌍의 유선에 실험적으로 감염시켰다. 접종 4 시간 후, 4 개 마우스 군을 유선 당 100, 200, 400 또는 800 ㎍에서, 히드로겔로서 제형화된 리소박틴으로 동일한 유선에 처리하였다. 다섯 번째 군을 음성 대조군으로서 히드로겔 비히클로 단독 처리하였다. 감염 18 시간 후 동물을 안락사시키고, 유선을 제거하고, 균질화시킨 후, 확립된 미생물학적 방법에 의해 세균 콜로니 형성 단위 (CFU)를 측정하였다. 이후 균질물 1 ㎖ 당 CFU 뿐 아니라 유선 1 g 당 CFU를 계산하였다. 검출 한계는 유선 1 g 당 대략 100 CFU였다. 상이한 투여군 및 음성 대조군의 유선 당 평균 CFU의 비교에 의해 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴의 항균 활성을 측정하였다.
대조군의 모든 동물의 유선은 감염 18 시간 후 최적 감염률 (≥ 유선 1 g 당 107 CFU)을 나타내었다. 최고 투여군에서의 하나를 제외하고 리소박틴 처리군에서의 모든 유선은 검출 한계 미만의 세균 수를 가졌다 (102 CFU/g). 히드로겔로서 제형화된 리소박틴이 100 내지 800 ㎍/유선의 유방내 용량에서 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 뛰어난 항세균 효능을 갖는다고 결론내릴 수 있다.
실시예 7: 리소박틴 단독의 생체내 소 데이터 - 젖분비 홀스타인 소에서의 우유 약물동태 연구
연구를, 젖분비 젖소에게 단일 낭내 (intracisternal) 적용 후 활성 물질 리소박틴의 우유 약물동태를 조사하기에 적합한 비탐색 연구 (non-pivotal study)로서 설계하였다.
활성 물질을 10 g 오일성 현탁액에 150 mg 리소박틴을 함유하는 낭내 적용에 적합한 파라핀계 서비스 제형 (service formulation)으로 제공하였다.
시험 제품을 150 mg 리소박틴의 용량률에서 단일 낭내 처리로서 각 4 마리 젖분비 젖소의 단일 후구 (hind quarter)에 투여하였다.
연구중인 젖소 (홀스타인 소)는 연령, 젖분비 수, 젖분비 단계, 착유량 및 품종에 있어서 표적 집단을 나타내었다. 동물을 타이반 (tie-barn)에 두고, 옥수수 및 목초 사일리지 및 우유 성능 사료로 이루어지는 젖소용 표준 사료를 공급하였다. 양동이형 착유 장치를 사용하여 12 시간 간격으로 1 일 2 회 착유하였다.
각 유방 분방의 수동 후착유에 의해, 처리 전 (0 시간) 및 처리 후 168 시간의 기간에 걸쳐 (0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120, 144 및 168 시간) 처리 및 각 대조군 분방으로부터 빈번한 우유 샘플 채취를 수행하였다. 정례적 착유 시간에서의 우유 샘플을 착유 전에 모았다.
우유에서의 활성 물질 리소박틴의 농도를, 텐덤 질량분석법에 의해 검출하면서 HPLC에 의해 분석하였다. 정량 한계는 0.05 mg/ℓ였다.
우유 농도 데이터의 약물동태 평가는 비-구획 방법을 기반으로 하였으며 우유에서의 활성 물질의 흡수, 분포 및 제거 프로필을 적절히 기재하기 위한 PK-매개변수를 포함하였다.
처리한 유방 분방으로부터 유래한 요약 결과를 하기 표에 나타낸다. 리소박틴은 대조군 샘플 (미처리된 유방 분방)에서 검출되지 않았다.
Figure pct00005
소 1 마리 당 1 분방에 적용된 용량은 150 mg 리소박틴이었고 ;
평균은 1) 기하 평균, 2) 중간값으로서 제공됨.
리소박틴의 농도 시간 곡선을 도 5에 나타낸다.
실시예 8: 리소박틴 단독의 생체내 소 데이터 - 스타필로코쿠스 아우레우스 로의 젖소 유방 감염 모델
15 마리의 건강한 젖분비 젖소를 모든 4 개 유방 분방에 유방염 병원균 스타필로코쿠스 아우레우스로 실험적으로 감염시켰다. 유방 분방에 팽윤, 통증, 비정상적 우유 농도와 같은 유방염의 임상적 증상이 나타나는 대로, 이를 두 상이한 농도에서의 리소박틴 파라핀계 연고, 또는 Ubrolexin® (세팔렉신 + 카나마이신, Boehringer Ingelheim), 또는 음성 대조군으로서 식염수로 처리하였다. 처리를 총 42 개 유방 분방에, 분방 당 50 mg 리소박틴 (11 개 분방), 또는 150 mg 리소박틴 (11 개 분방), 또는 Ubrolexin® (9 개 분방), 또는 식염수 (11 개 분방)로 무작위로 배정하였다. 처리 직전 챌린지 유기체에 대해 세균학적으로 양성인 유방 분방만 (n=42)이 미생물 및 임상적 치유의 평가 자격이 있었다. 병에 걸린 분방을 중간에 24 시간의 간격으로 2 회 이들 유방내 제형으로 처리하였다. 유방을 임상적으로 검사하고, 우유 샘플을 처리 전, 그리고 이차 투여 후 3 주까지 수 회 채취하였다. 우유를 그의 농도에 있어서의 편차에 대해 육안으로 검사하고, 샘플을 유방염 진단을 확인하기 위해 체세포수 및 챌린지 유기체의 존재에 대해 평가하였다. 병에 걸린 유방 분방은, 처리 직전 우유 샘플에서 발견된 스타필로코쿠스 아우레우스가, 이차 처리 후 제 3 일과 제 21 일 사이의 시기 내에 채취된 어떤 우유 샘플로부터도 단리될 수 없으면 미생물학적으로 치유된 것으로 간주하였다. 유방염의 국소적 증상이 완전히 사라졌을 때 임상적 치유가 성취되었고, 모든 수치가 상기 언급된 기간 내 우유 1 ㎖ 당 500,000 개 세포 미만으로 유지되면 유방 염증의 매개변수로서 체세포수 (SCC)의 회복에 도달되었다.
이차 처리 후 제 3 일 및 제 21 일에 미생물학적 치유율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 73% 및 27%, 리소박틴 150 mg에 대해 73% 및 45%, Ubrolexin®에 대해 78% 및 44%, 식염수에 대해 0% 및 0%였다. 이차 처리 후 제 3 일 및 제 21 일에 국소 임상적 치유율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 45% 및 73%, 리소박틴 150 mg에 대해 37% 및 82%, Ubrolexin®에 대해 33% 및 67%, 식염수에 대해 55% 및 73%였다. 이차 처리 후 제 3 일 및 제 21 일에 SCC 회복률은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 36% 및 45%, 리소박틴 150 mg에 대해 36% 및 91%, Ubrolexin®에 대해 56% 및 67%, 식염수에 대해 36% 및 27%였다.
매개변수인 미생물학적 및 임상적 치유, 및 SCC 회복에 있어서, 리소박틴 150 mg이 양성 대조군 제품 Ubrolexin®과 비교하여 유사하거나 더 양호한 효능을 나타내고 리소박틴 50 mg 및 식염수보다 우월한 효능을 나타낸다고 결론내릴 수 있다.
실시예 9: 리소박틴 단독의 생체내 소 데이터 - 스트렙토코쿠스 우베리스 로의 젖소 유방 감염 모델
72 마리의 건강한 젖분비 젖소를 소 1 마리 당 2 개 유방 분방에 유방염 병원균 스트렙토코쿠스 우베리스로 실험적으로 감염시켰다. 유방 분방에 유방염의 임상적 증상 (예를 들어 열, 팽윤, 발적, 통증, 비정상적 우유 농도)이 나타나는 대로, 이를 두 상이한 농도에서의 리소박틴 파라핀계 연고, 또는 Ubrolexin® (세팔렉신 + 카나마이신, Boehringer Ingelheim)으로 처리하였다.
처리를 총, 41 개 (임상적) 또는 37 개 (미생물학적) 유방 분방에, 분방 당 50 mg 리소박틴 (15/13 개 분방), 또는 150 mg 리소박틴 (15/14 개 분방), 또는 양성 대조군으로서 Ubrolexin® (11/10 개 분방)으로 무작위로 배정하였다. 병에 걸린 분방을 중간에 24 시간의 간격으로 2 회 이들 유방내 제형으로 처리하였다. 유방을 임상적으로 검사하고, 우유 샘플을 처리 전, 그리고 이차 투여 후 3 주까지 수 회 채취하였다. 우유를 그의 농도에 있어서의 편차에 대해 육안으로 검사하고, 샘플을 유방염 진단을 확인하기 위해 챌린지 유기체의 존재에 대해 평가하였다. 병에 걸린 유방 분방은, 처리 직전 우유 샘플에서 발견된 스트렙토코쿠스 우베리스가, 이차 처리 후 제 7 일과 제 21 일 사이의 시기 내에 채취된 어떤 우유 샘플로부터도 단리될 수 없는 경우, 미생물학적으로 치유된 것으로 간주하였다. 유방염의 국소적 증상이 완전히 사라졌거나 매우 경미한 특성만이 있는 경우 임상적 치유가 성취되었다.
이차 처리 후 제 7 일 및 제 21 일에 미생물학적 치유율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 84.6% 및 92.31%, 리소박틴 150 mg에 대해 71.4% 및 85.71%, Ubrolexin®에 대해 30% 및 30%였다. 이차 처리 후 제 7 일에 국소 임상적 치유율은 리소박틴 50 mg 및 리소박틴 150 mg 모두에 대해 86.7%, Ubrolexin®에 대해 36.4%였다.
탐색 매개변수인 미생물학적 및 임상적 치유에 있어서, 리소박틴 50 및 150 mg이 양성 대조군 제품 Ubrolexin®과 비교하여 명백하게 더 효과적이었다고 결론내릴 수 있다.
실시예 10: 유방염 병원균에 대한 리소박틴과 네오마이신 조합물의 시험관 내 사멸 속도
상점에서 구매한 전유에서 리소박틴과 네오마이신의 상승 활성을 평가하기 위해, 상이한 농도의 리소박틴 및 네오마이신을 단독으로 또는 조합하여 함유하는 플라스크에, 1-2×106 콜로니 형성 단위/㎖ 의, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 우베리스 또는 대장균의 대표 균주를 접종하였다.
플라스크를 35 +/- 2℃ 진탕 수조에서 24-48 시간 동안 인큐베이션하고, 샘플을 희석하고 한천 플레이트에 플레이팅하여 여러 시점에서 각 플라스크 내에서의 생균수를 측정하였다.
24 시간 후 가장 활성적인 단독 화합물과 비교한 조합물로 달성된 생균수의 적어도 99.9% 감소가 상승 활성으로서 정의된다 (NCCLS/CLSI M26-A Vol.19, No.18).
우유에서의 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740에 대한 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신의 1:1 (각각 2 μg/ml) 및 2:1 (각각 2 μg/ml의 리소박틴과 1 μg/ml의 네오마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
24 시간 후, 리소박틴:네오마이신 조합물의 양 비 모두에서 상승 효과를 관찰할 수 있었다. 상승 효과는 적어도 2:1의 비율, 특히 1:1의 비율에서 매우 현저하다.
우유에서의 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC 27958에 대한 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신의 1:1 (각각 16 μg/ml) 및 2:1 (각각 16 μg/ml의 리소박틴과 8 μg/ml의 네오마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 6에 나타내었다.
24 시간 후, 양 비율 모두에서 리소박틴:네오마이신 조합물의 상승 효과를 관찰할 수 있었다.
우유에서의 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740에 대한 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신의 1:5 (각각 1 μg/ml의 리소박틴과 5 μg/ml의 네오마이신 및 1.5 μg/ml의 리소박틴과 7.5 μg/ml의 네오마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 7에 나타내었다.
24 시간 후, 상승 효과를 관찰할 수 있었다. 상승 효과는 적어도 1:5 (즉 0.2)의 비율에서 매우 현저하다. 상기 상승 효과는 도 7에 의해 입증되는 바와 같이, 사용된 리소박틴 및 네오마이신의 절대량에 좌우되지 않는다.
우유에서의 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC 29758에 대한 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신의 1:10 (각각 1 μg/ml의 리소박틴과 10 μg/ml의 네오마이신 및 2 μg/ml의 리소박틴과 20 μg/ml의 네오마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 7에 나타내었다.
24 시간 후, 상승 효과를 관찰할 수 있었다. 리소박틴 및 네오마이신의 절대량에 상관없이 1:10 (0.1)의 리소박틴:네오마이신의 비율에서 상승 효과가 매우 현저하다.
종합하면, 리소박틴:네오마이신 조합물의 상승 효과를 볼 수 있었다. 상기 상승 효과는 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740 및 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC 29758에 대해 각각 2:1 내지 1:5 (0.2) 및 2:1 내지 1:10 (0.1) 범위의 비율에서 매우 현저하다.
우유에서의 대장균 P4:O32에 대한 리소박틴 및 네오마이신의 단독 또는 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신의 4:1 (각각 256 μg/ml의 리소박틴과 32 μg/ml의 네오마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 8에 나타내었다.
리소박틴:네오마이신 조합물뿐 아니라 네오마이신도 8시간 후 세균 세포수를 검출 한계 아래로 줄일 수 있었지만 조합물이 더 빠른 사멸 살생 개시를 나타내었다.
또한 조합물은 24 시간 후에 세균의 재증식을 실질적으로 막았는데, 이는 각 단독의 활성 성분으로는 달성할 수 없었다.
따라서, 그람 음성균 대장균에 대해서도 상승 작용이 관찰되었다.
실시예 11: 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740에 대한 리소박틴과 네오마이신 또는 카나마이신 조합물의 시험관 내 사멸 속도
상기 언급된 상승 효과가 리소박틴과 조합된 네오마이신을 넘어서 더 많은 아미노글리코시드 항생제에 적용되는지의 여부를 조사하기 위해, 조합 파트너인 카나마이신의 사멸 속도도 시험하였다.
사멸 속도를 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행하였다.
우유에서의 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740에 대한 리소박틴과 네오마이신 또는 카나마이신의 조합물의 사멸 속도를 리소박틴:네오마이신 또는 리소박틴:카나마이신의 1:4 (각각 0.5 μg/ml의 리소박틴과 2 μg/ml의 네오마이신 또는 카나마이신; 1 μg/ml의 리소박틴과 4 μg/ml의 네오마이신 또는 카나마이신 및 2 μg/ml의 리소박틴과 8 μg/ml의 네오마이신 또는 카나마이신)의 농도 비율에 대해 측정하였다.
결과를 도 9에 나타내었다.
평가된 모든 농도에 대해 리소박틴:카나마이신 조합은 리소박틴:네오마이신 조합과 비교하여 유사한 활성을 보였다.
이로부터 리소박틴과 아미노글리코시드 항생제의 결합은 자체로 예기치 않은 상승 효과를 가져옴을 알 수 있다.
비교예 12: 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740 및 스트렙토코쿠스 우베 리스 ATCC 29758에 대한 리소박틴과 플로르페니콜 조합물의 시험관 내 사멸 속도
이후 나타내는 바와 같이, 두 상이한 항생제의 상승 작용은 신뢰성 있게 예측할 수 없다.
예를 들어, 리소박틴과 플로르페니콜의 조합은 도 10에 도시된 시험 조건하에 우유에서 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 29740나 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC 27958 어느 것에 대해서도 상승 작용 활성을 나타내지 않았다.
실시예 13: 급성 마우스 유방염 모델에서 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 리소박틴과 네오마이신 트리설페이트 조합물의 효능
리소박틴 및 네오마이신 트리설페이트의 단독 또는 조합으로의 효능을 캐나다 쉐부르크 대학 (University of Sherbrooke, Canada)에서 확립된 스타필로코쿠스 아우레우스 급성 마우스 유방염 모델에서 시험하였다 (본원에 참조로 포함되는 Broui-llette et al, Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262). 샘플을 파라핀에서 제형화하였다.
결과를 도 11에 나타내었다.
50 μg 리소박틴, 1600 μg 네오마이신 트리설페이트 및 50 μg 리소박틴 + 1600 μg 네오마이신 트리설페이트 조합물의 유방 내 주입은 중간 CFU 함량을 약 2.7, 2.5 및 5.9 log10으로 감소시켰다.
실시예 14: 급성 마우스 유방염 모델에서 스트렙토코쿠스 우베리스에 대한 리소박틴과 네오마이신 트리설페이트 조합물의 효능
23 마리의 젖분비 CD-1 마우스를 새끼 출산 후 10-15 일에 왼쪽 및 오른쪽 네 번째 유선에 유방염 병원균인 Streptococcus uberis (ATCC 27958)로 실험적으로 감염시켰다.
감염 4 시간 후에 동물을 시험 제품으로 유방 내로 처리하였다. 이 연구는 각각 네 마리 마우스의 네 개의 처리군 및 일곱 마리 마우스의 대조군으로 구성되었다.
처리군의 마우스는 15 μg/유선으로 리소박틴 또는 1600 μg/유선으로 네오마이신 트리설페이트의 파라핀 제형, 또는 유선 당 15 μg의 리소박틴과 800 μg 또는 1600 ㎍/g의 네오마이신 트리설페이트의 2 가지 조합으로 처치되었다.
감염 18시간 후, 마우스를 희생시키고 유선을 제거한 뒤, 세균성 CFU를 미생물학적으로 평가하였다.
결과를 도 12에 나타내었다.
파라핀을 위약으로 투여한 대조군은 CFU가 약 7 log10/조직 g으로 예상 범위 내에 있었다. 15 μg의 리소박틴, 1600 μg의 네오마이신 트리설페이트 및 15 μg의 리소박틴과 1600 μg의 네오마이신 트리설페이트의 조합물의 유방 내 주입은 평균 CFU 함량을 약 2.6, 1.5 및 3.8 log10으로 감소시켰다.
15/1600 μg/유선으로 투여된 리소박틴/네오마이신 트리설페이트 조합물은 동일한 투여량에서 이들의 단일 성분과 비교하여 스트렙토코쿠스 우베리스 ATCC27958에 대한 효능이 더 우수하다고 결론 내릴 수 있다.
실시예 15: 리소박틴 및 네오마이신 트리설페이트의 생체 내 소 데이터 - 스타필로코쿠스 아우레우스로의 젖소 유방 감염 모델
15 마리의 건강한 젖분비 젖소를 4 개의 유방 분방 모두에 유방염 병원균 스타필로코쿠스 아우레우스로 실험적으로 감염시켰다. 유방 분방에 유방염의 임상적 증상, 예를 들어 팽윤, 통증, 비정상적 우유 농도가 나타나는 대로, 이를 50 mg의 용량으로 리소박틴 미글리올 기반 현탁액 또는 400 mg의 용량으로 네오마이신 트리설페이트 미글리올 기반 현탁액, 또는 둘의 조합, 즉 50 mg의 리소박틴 및 400 mg의 네오마이신 트리설페이트로 처리하였다.
추가로, 네 번째 유방 분방 군은 대조군으로서 미글리올을 투여받았다. 처리는 무작위로 총 60 개의 유방 분방에 배정되었다. 처리 직전에 도전 유기체에 대해 세균학적으로 양성인 유방 (n=49) 만이 미생물학적 및 임상적 치료의 평가에 적격하였다. 감염된 분방을 중간에 24 시간 간격으로 2 회 이들 유방 내 제형으로 처리하였다. 유방을 임상적으로 검사하고 우유 샘플을 처리 맹검 연구원이 처리 전과 이차 투여한 후 3주까지 수회 채취하였다.
유방염 진단을 확인하기 위해 우유의 농도에 편차가 있는지 육안으로 검사하고 샘플을 도전 유기체의 존재 및 체세포 수에 대해 평가하였다. 처리 직전 우유 샘플에서 발견된 스타필로코쿠스 아우레우스가 이차 처리 후 제 3 일과 21 일 사이의 기간 내에 채취된 어떤 우유 샘플에서도 단리될 수 없으면 질병 유방 분방은 미생물학적으로 치유된 것으로 간주하였다. 유방염의 국소 증상이 완전히 사라졌을 때 임상 치유가 달성되었고, 위에서 언급한 기간 내에 모든 수치가 우유 1 mL 당 200,000 세포 미만으로 유지되면 유방 염증의 매개 변수로서의 체세포 수 (SCC) 회복에 도달되었다.
이차 처리 후 제 3 일과 21 일에 미생물 치유율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 71% 및 14%, 네오마이신 트리설페이트 400 mg에 대해 100% 및 42%, 리소박틴 50 mg + 네오마이신 트리설페이트 400 mg 조합에 대해 69% 및 54% 및 음성 대조군 미글리올에 대해 10% 및 30%였다.
이차 처리 후 제 3 일과 21 일의 국소 임상 치유율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 71% 및 71%, 네오마이신 트리설페이트 400 mg에 대해 67% 및 100%, 리소박틴 50 mg + 네오마이신 트리설페이트 400 mg 조합에 대해 77% 및 85% 및 음성 대조군 미글리올에 대해 80% 및 70%였다.
이차 처리 후 제 3 일과 21 일의 SCC 회복율은 각각 리소박틴 50 mg에 대해 35% 및 36%, 네오마이신 트리설페이트 400 mg에 대해 17% 및 50%, 리소박틴 50 mg + 네오마이신 트리설페이트 400 mg 조합에 대해 46% 및 69% 및 음성 대조군 미글리올에 대해 30% 및 30%였다.

Claims (15)

  1. 인간 이외의 포유동물에서 그람 음성균 및/또는 그람 양성균에 의해 유발된 질병의 치료에 사용하기 위한, 리소박틴과 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 인간 이외의 포유동물이 유방을 지닌 암컷 동물인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  3. 제2항에 있어서, 유방을 지닌 인간 이외의 암컷 포유동물이 소이고 질병은 소 유방염인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 유방내로 투여되는, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 소 유방염이 임상적으로 명확한 소 유방염인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 소 유방염이 준임상적 소 유방염인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리소박틴이 유방 분방 (udder quarter) 당 25 내지 1000 mg의 용량으로 제공되는, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제가 카나마이신 또는 네오마이신이고, 바람직하게는 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제가 네오마이신인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 소 유방염이 포도상구균 (Staphylococcus) 세균, 연쇄상구균 (Streptococcus) 세균, 트루에페렐라 (Trueperella) 세균, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 세균 및/또는 에스케리키아 (Escherichia) 세균에 의해 유발된 것인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  10. 제9항에 있어서, 소 유방염이 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 응고 효소 음성 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 우베리스 (Streptococcus uberis), 스트렙토코쿠스 디스갈락티카에 (Streptococcus dysgalacticae), 스트렙토코쿠스 아갈락티카에 (Streptococcus agalacticae) 및/또는 대장균 (E. coli) 세균에 의해 유발된 것인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  11. 제9항에 있어서, 소 유방염이 트루에페렐라 피오게네스 (Trueperella pyogenes) 및/또는 대장균 세균에 의해 유발된 것인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  12. 제9항에 있어서, 소 유방염이 코리네박테리움 보비스 (Corynebacterium bovis) 및/또는 대장균 세균에 의해 유발된 것인, 치료에 사용하기 위한 조합물.
  13. 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제를 포함하고, 상기 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제는 바람직하게는 카나마이신 또는 네오마이신인 것을 특징으로 하는, 소 유방으로의 유방내 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
  14. 인간 이외의 동물의 유방염 치료용 약제의 제조를 위한 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제의 용도.
  15. 치료적 유효량의 리소박틴 및 적어도 하나의 아미노글리코시드 항생제를 이를 필요로 하는 인간 이외의 암컷 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 유방염의 치료 방법.
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