ES2893927T3 - Combinaciones de lisobactina y aminoglucósidos contra enfermedades causadas por bacterias Gram positivas y Gram negativas en animales no humanos - Google Patents

Abstract

Combinación de lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en un tratamiento de un animal mamífero no humano contra una enfermedad provocada por bacterias Gram negativas y/o Gram positivas.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones de lisobactina y aminoglucósidos contra enfermedades causadas por bacterias Gram positivas y Gram negativas en animales no humanos

La presente invención se refiere a la combinación de lisobactina con un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias gram positivas y Gram negativas en animales no humanos. Se ha comprobado que la invención es particularmente útil con relación al tratamiento de mastitis en animales no humanos. Particularmente la presente invención puede tratar la mastitis bovina.

La mastitis es a la inflamación de tejido de las ubres y continúa siendo la enfermedad más frecuente y costosa del ganado lechero. Las pérdidas financieras debidas a la mastitis ocurren en etapas subclínicas y clínicas de la enfermedad. Las pérdidas causadas por mastitis subclínicas están bien documentadas. Cada duplicado del conteo celular somático (SCC) por encima de 50.000 células/ml resulta en una pérdida de 0,4 kg y 0,6 kg de leche por día en vacas en la primera lactancia y mayores, respectivamente (Hortet P, H. Seegers. 1998. Calculated milk production losses associated with elevated somatic cell counts in dairy cows: review and critical discussion. Vet Res.

29(6):497-510). Las pérdidas causadas por mastitis clínica incluyen leche descartada, reducciones transitorias de rendimiento de leche y eliminación prematura. El tratamiento de mastitis debería dirigirse a las bacterias que la causan cuando sea posible.

Pyorala S en Irish Veterinary Journal, Volumen 62 Suplemento 40-442009 tiene las siguientes sugerencias para el tratamiento antimicrobiano de mastitis clínica debido a diferentes patógenos:

Una composición farmacéutica reciente para el tratamiento de mastitis en vacas lecheras es Ubrolexin®, un antibiótico de amplio espectro contra bacterias Gram positivas y Gram negativas que provocan mastitis. Ubrolexin® es una combinación de cefalexina y kanamicina y se indica para el tratamiento de mastitis clínica debido a Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalacticae, Streptococcus uberis y Escherichia coli. El modo de acción para cefalexina, que es un antibiótico del grupo de sustancias cefalosporinas, es una unión irreversible con D-alanina transpeptidasa que altera la síntesis de la pared celular bacteriana. La kanamicina, que es un antibiótico aminoglucósido, actúa uniéndose a la subunidad 30S de ribosomas asociados con la membrana e inhibe o interfiere con las síntesis de proteínas bacterianas.

Por lo tanto, se conoce por sí misma la combinación de antibióticos y en particular los aminoglucósidos con otras sustancias antibióticas.

Un problema recurrente con los antibióticos en la técnica previa es que los patógenos pueden desarrollar resistencia hacia los fármacos usados en el tratamiento de las enfermedades que provocan. Entonces, se busca constantemente nuevos principios farmacéuticos activos. El problema de desarrollar resistencias se empeora aun más cuando el uso combinado se realiza con sustancias antibióticas que no se sinergizan, sino que solo se dirigen a diferentes patógenos. En esos casos los patógenos que no son el objetivo principal del primer antibiótico pueden desarrollar de forma sucesiva una resistencia completa contra dicho primer antibiótico.

La lisobactina se aisló primero del caldo de fermentación de Lysobacter sp. SC-14076 (ATCC 53042). Independientemente, los científicos descubrieron que katanosina A y B de una bacteria del suelo con relación al género Cytophaga (cepa productora PBJ-5356). La Katanosina B resultó ser idéntica a la lisobactina. La biosíntesis de pared celular bacteriana es el objetivo primario de estos antibióticos; sin embargo, el mecanismo de acción es diferente del de vancomicina. Las lisobactinas son depsipéptidos cíclicos que contienen varios D y L aminoácidos no proteinogénicos.

La lisobactina producto natural y algunos derivados se describen con actividad antibacteriana en US 4.754.018. La actividad antibacteriana y el aislamiento de lisobactina también se describen en EP 196042 A1 y JP 01-132600. La actividad antibacteriana de lisobactina y katanosina A se describe adicionalmente en O'Sullivan, J. y col., J. Antibiot. (1988) 41 :1740-1744, Bonner, D. P. y col., J. Antibiot. (1988) 41:1745-1751, Shoji, J. y col., J. Antibiot. (1988) 41:713-718 y Tymiak, A. A. y col., J. Org. Chem. (1989) 54:1149-1157.

Por el contrario, a los modos de acción para cefalexina y kanamicina, se sugiere que la lisobactina interactúa directamente con el lípido precursor II de la pared celular bacteriana (Lee, W. y col., Am. Chem. Soc. (2016) 138(1):100-113 y Breukink E. y de Kruijff B., Nat. Rev. Drug Disc. (2006) 5:321-323). Derivados de lisobactina son el sujeto de las solicitudes de patente WO 2004/099239 A1, WO 2006/042653 A1, WO 2006/042654 A1, WO 2006/042655 A1, WO 2006/048139 A1, WO 2006/048140 A1, WO 2006/048156 A1, WO 2007/085456 A1, WO 2007/118691 A1 y WO 2007/118693 A1.

J.P. Ganiére y col., Journal of Applied Microbiology 107 (2009), 117-125 describen el efecto sinérgico de cefalexina y kanamicina sobre la actividad bactericida in vitro contra cepas de Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus y Escherichia coli aisladas de casos de campo de mastitis bovina.

Ninguna de las técnicas previas enumeradas se refiere al tratamiento de mastitis bovina usando lisobactina. Particularmente, no hay técnica previa acerca del uso combinado de lisobactina con otras sustancias antibióticas para el tratamiento de mastitis. Particularmente dado que el tratamiento de mastitis bovina que es una causa principal de las pérdidas agrícolas comerciales carece de opciones adecuadas en la técnica.

Mientras que se ha descubierto recientemente en la solicitud de patente internacional número PCT/EP2016/069380 que el luso de lisobactina sola es sorprendentemente muy beneficioso en el tratamiento de mastitis bovina que es provocada principalmente por patógenos Gram positivos, particularmente bacterias de Staphylococcus, bacterias de Streptococcus, bacterias de Trueperella y/o bacterias de Corynebacterium, dado sus propiedades de ruptura de resistencia, permanece una incertidumbre acerca de la eficacia de lisobactina como agente potencial contra patógenos Gram negativos y una sinergia potencial con otras sustancias antibióticas.

Por lo tanto, existe todavía una necesidad en la técnica de un tratamiento para mastitis, particularmente bovina, que no sufra la desventaja de resistencia bacteriana hacia los principios activos y que puede dirigirse desde el punto de vista sinérgico a patógenos Gram positivos y Gram negativos. La presente invención tiene el objeto de proporcionar una solución para ello. Por lo tanto, la presente invención se dirige particularmente a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis. Especialmente el tratamiento de mastitis bovina como la enfermedad más comercialmente relevante de este tipo es tratado por la presente invención. Se ha descubierto sorprendentemente que lisobactina combinada con antibióticos aminoglucósidos se sinergiza para dar como resultado propiedades antibacterianas prolongadas tanto en patógenos Gram positivos como Gram negativos asociados con enfermedades causadas por esos patógenos en animales no humanos. El efecto de dicha sinergia es particularmente evidente en animales hembra que padecen mastitis provocada por esos patógenos, mientras que la mastitis bovina resultó ser la aplicación más comercialmente relevante de la invención aquí descrita.

En el contexto de la presente invención, el término "lisobactina" se refiere a la sustancia con número CAS 118374­ 47-3 y sus sales fisiológicamente aceptables. La lisobactina tiene la siguiente estructura:

La mastitis bovina a ser tratada es en particular la mastitis de ganado lechero.

Las sales fisiológicamente aceptables de lisobactina incluyen sales de adición de ácidos de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo sales de ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido naftalenodisulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico y ácido benzoico. Las sales fisiológicamente aceptables de lisobactina también incluyen sales de bases convencionales, tales como, a modo de ejemplo y preferentemente, sales de metal alcalino (por ejemplo, sales de sodio y potasio), sales de metal alcalinotérreo (por ejemplo, sales de calcio y magnesio), y sales de amonio derivadas de amoníaco o aminas orgánicas que tienen 1 a 16 átomos de C, tales como, a modo de ejemplo y preferentemente, etilamina, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibencilamina, N-metilmorfolina, arginina, lisina, etilendiamina y N-metilpiperidina. En el contexto de la presente invención, la expresión "antibiótico aminoglucósido" o "aminoglucósido", se refiere a sustancias de oligosacáridos que están compuestos por grupos ciclohexano-azúcar y grupos amino-azúcar y que funcionalmente comparten el rasgo de unirse a la subunidad 30S de ribosomas asociados con la membrana para así interferir con la biosíntesis de proteínas de (particularmente) células bacterianas. Miembros no taxativos y no exhaustivos del grupo de aminoglucósidos conforme a la presente invención son los seleccionados de la lista que consiste en Amikacina, Apramicina, Framicetina, Geneticina (G418), Gentamicina, Kanamicina, Netilmicina, Neomicina, Paromomicina, Sisomicina, espectinomicina, estreptomicina y Tobramicina.

Como en lisobactina, el "antibiótico aminoglucósido" o "aminoglucósido" también comprende sales fisiológicamente aceptables de este. Entonces las sales fisiológicamente aceptables de aminoglucósidos incluyen sales de adición de ácido de ácidos minerales, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, así como sales de bases convencionales como se enumera con lisobactina en el contexto de la presente invención.

La lisobactina y aminoglucósidos pueden actuar de forma sistémica y/o local. Con este fin, se puede administrar de forma adecuada tal como, por ejemplo, por la vía oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, intraauricular, dérmica o transdérmica, o como implante o stent.

La lisobactina y aminoglucósidos se pueden administrar en formas de administración adecuadas para estas vías de administración.

Son adecuadas para administración oral las formas de administración que funcionan de acuerdo con la técnica precia y administran lisobactina y aminoglucósidos rápidamente y/o de forma modificada, y que contienen lisobactina y aminoglucósidos en forma cristalina y/o amorfa y/o disuelta, tales como por ejemplo comprimidos (comprimidos no recubiertos o recubiertos, por ejemplo que tienen recubrimientos entéricos o recubrimientos que son insolubles o se disuelven con un retraso y controlar la liberación de lisobactina), comprimidos que se pueden desintegrar rápidamente en la boca, o películas/obleas, películas/liofilizados, cápsulas (por ejemplo cápsulas de gelatina dura o blanda), comprimidos recubiertos con azúcar, gránulos, píldoras, polvos, emulsiones, suspensiones, aerosoles o soluciones.

La administración parenteral puede tener lugar evitando un paso de absorción (por ejemplo, intramamaria, intravenosa, intraarterial, intracardiaca, intraespinal o intralumbar) o incluyendo una absorción (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, percutánea o intraperitoneal). Las formas de administración adecuadas para administración parenteral son, entre otras, preparaciones para inyección e infusión en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, liofilizados o polvos estériles.

Son adecuados para las otras vías de administración, por ejemplo, formas farmacéuticas para suspensiones acuosas (lociones, mezclas de agitación), suspensiones lipofílicas, ungüentos, cremas, sistemas terapéuticos transdérmicos (tales como, por ejemplo, parches), leche, pastas, espumas, polvos, implantes o stents.

La lisobactina y aminoglucósidos se pueden convertir en las formas de administración declaradas. Esto puede tener lugar de forma conocida en sí misma mezclando con excipientes inertes, no tóxicos, farmacéuticamente aceptables. Estos excipientes incluyen entre otros portadores (por ejemplo celulosa microcristalina, lactosa, manitol), solventes (por ejemplo polietilenglicoles líquidos), emulsionantes y dispersantes o agentes de humectación (por ejemplo dodecil sulfato de sodio, polioxisorbitán oleato), aglutinantes (por ejemplo polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo albúmina), estabilizantes (por ejemplo antioxidantes tales como por ejemplo ácido ascórbico), colores (por ejemplo pigmentos inorgánicos tales como, por ejemplo óxidos de hierro) y sabores y/u olores de enmascaramiento.

La presente invención se describe adicionalmente mediante referencia a los siguientes aspectos y realizaciones. Pueden combinarse libremente salvo que el contexto diga lo contrario.

Una realización se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis, en la que la lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido se administran por vía intramamaria. Preferentemente el antibiótico aminoglucósido es neomicina o kanamicina. Más preferentemente la mastitis es mastitis bovina.

Otra realización se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis, en la que la mastitis es una mastitis manifestada clínicamente. Preferentemente el antibiótico aminoglucósido es neomicina o kanamicina. Más preferentemente la mastitis es mastitis bovina.

Otra realización se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis, en la que la mastitis es una mastitis bovina subclínica. Preferentemente el antibiótico aminoglucósido es neomicina o kanamicina. Más preferentemente la mastitis es mastitis bovina.

Otra realización se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis, en la que la lisobactina se proporciona con una dosis de 25 a 1000 mg por cuarto de ubre, preferentemente con una dosis de 50 a 500 mg por cuarto de ubre y más preferentemente con una dosis de 100 a 300 mg por cuarto de ubre. Más preferentemente la mastitis es mastitis bovina.

En la realización preferida de esta realización la combinación de lisobactina se realiza con neomicina o kanamicina con una preferencia por neomicina.

También puede ser necesario cuando fuera apropiado desviarse de las cantidades declaradas; en particular en función del peso corporal, la vía de administración, respuesta individual al principio activo, naturaleza de la preparación y tiempo o intervalo durante el cual ocurre la administración. Entonces, puede ser suficiente en algunos casos hacerlo con menos de la cantidad mínima antes mencionada, mientras que en otros casos se debe superar el límite superior declarado. Puede ser que en caso de administración de mayores cantidades sea conveniente dividirlas en una pluralidad de dosis individuales durante el día.

Dependiendo del antibiótico aminoglucósido real usado ahora conforme a la presente invención, las dosis antes mencionadas de este pueden variar y por tanto la relación de lisobactina en la relación con esta.

Resultados muy positivos de patógenos Gram negativos y Gram positivos se logran y por lo tanto se prefiere que la relación de lisobactina a antibiótico aminoglucósido sea al menos 0,1. La relación de al menos 0,2 proporciona aun mejores resultados, mientras se prefiere más tener una relación de al menos 1:1 y se prefiere aun más una relación de al menos 2:1. Se prefiere más una relación de al menos 4:1.

Otra realización se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis, en la que la mastitis es provocada por bacterias Gram positivas y Gram negativas. Preferentemente la mastitis es mastitis bovina.

Más preferentemente, se refiere a la combinación de lisobactina con al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en el tratamiento de mastitis bovina, en la que la mastitis bovina es provocada por bacterias de Staphylococcus, bacterias de Streptococcus, bacterias de Trueperella, bacterias de Corynebacterium y/o bacterias de Escherichia. En particular, la mastitis bovina puede ser provocada por Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalacticae, Streptococcus agalacticae y/o bacterias de E. coli.

Además, la mastitis bovina puede ser provocada por Trueperella pyogenes y/o E. coli. También, la mastitis bovina puede ser provocada por Corynebacterium bovis y/o E. coli.

Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalacticae Streptococcus agalacticae, Trueperella pyogenes, y Corynebacterium bovis son los patógenos más comunes que se encuentran en casos de mastitis bovina, mientras que la superinfección con Escherichia es igual de común y se sabe que conjuntamente son particularmente susceptibles a un tratamiento con una combinación de lisobactina con al menos antibiótico aminoglucósido de acuerdo con la presente invención. Una mastitis también puede tornarse clínicamente relevante solamente por la presencia de bacterias de Escherichia. Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica formulada para administración intramamaria en mamíferos, en la que la composición comprende lisobactina al menos un antibiótico aminoglucósido. Preferentemente la composición se formula para ser administrada en mamíferos bovinos. Más preferentemente, la composición además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y en particular un portador farmacéuticamente aceptable.

Estos excipientes incluyen entre otros portadores (por ejemplo celulosa microcristalina, lactosa, manitol), solventes (por ejemplo polietilenglicoles líquidos), emulsionantes y dispersantes o agentes de humectación (por ejemplo dodecil sulfato de sodio, polioxisorbitán oleato), aglutinantes (por ejemplo polivinilpirrolidona), polímeros sintéticos y naturales (por ejemplo albúmina), estabilizantes (por ejemplo antioxidantes tales como por ejemplo ácido ascórbico), colores (por ejemplo pigmentos inorgánicos tales como, por ejemplo óxidos de hierro) y sabores y/u olores de enmascaramiento.

En el presente documento también se describe el uso de lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido para la preparación de productos farmacéuticos para el tratamiento de mastitis. El uso para la preparación de productos farmacéuticos para el tratamiento de mastitis bovina también se describe en el presente documento.

En el uso descrito en el presente documento la mastitis bovina es una mastitis bovina manifestada clínicamente. En el uso descrito en el presente documento la mastitis bovina es una mastitis bovina subclínica.

En el uso descrito en el presente documento la mastitis bovina es provocada por bacterias de Staphylococcus, bacterias de Streptococcus, bacterias de Trueperella, bacterias de Corynebacterium y/o bacterias de Escherichia. En particular, la mastitis bovina puede ser provocada por Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalacticae, Streptococcus agalacticae y/o bacterias de E. coli.

Además, la mastitis bovina puede ser provocada por Trueperella pyogenes y/o E. coli. También, la mastitis bovina puede ser provocada por Corynebacterium bovis y/o E. coli.

También se describe en el presente documento un procedimiento para tratar mastitis, el procedimiento comprende el paso de administrarle a un animal no humano hembra con una ubre y que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido. Como se describe en el presente documento, el animal hembra no humano con una ubre es una vaca.

Finalmente, aunque la mayoría de los aspectos de la presente invención se refieren al tratamiento de mastitis, particularmente bovina, por razones de aplicabilidad comercial, la sinergia que se encuentra sorprendentemente aquí no se entiende limitativa de ese tratamiento específico de una ubre, particularmente bovina. Los datos experimentales proporcionados en la presente muestran que lo anterior referido a sinergia se aplica a cualquier tratamiento de animales no humanos que padecen de cualquier enfermedad provocada por bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Entonces la realización global de la presente invención se refiere generalmente a la combinación de lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en un tratamiento de un animal mamífero no humano contra una enfermedad provocada por bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Ejemplos:

La presente invención se describe adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos y figuras de forma no taxativa.

FIG. 1 muestra la cinética de eliminación de lisobactina contra Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis (ejemplo 2)

FIG. 2 muestra los cambios de MIC de lisobactina contra Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis durante el pasaje de serie (ejemplo 4)

FIG. 3 muestra la eficacia de lisobactina en un modelo de mastitis de ratón agudo con Staphylococcus aureus (ejemplo 5)

FIG. 4 muestra la eficacia de lisobactina en un modelo de mastitis de ratón expuesto con Streptococcus uberis (ejemplo 6)

FIG. 5 muestra el perfil de concentración-tiempo de lisobactina en leche después de la aplicación intramamaria (IMAM) a vacas lactantes Holstein (ejemplo 7)

FIG. 6 muestra la cinética de eliminación en leche de lisobactina y neomicina, sola o en combinación con relaciones de dosis 1:1 y 2:1, contra Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis (ejemplo 10)

FIG. 7 muestra la cinética de eliminación en leche de lisobactina y neomicina, sola o en combinación con relaciones de dosis 1:5 y 1:10, contra Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis (ejemplo 10)

FIG. 8 muestra la cinética de eliminación en leche de lisobactina y neomicina, sola o en combinación, contra E. coli (ejemplo 10)

FIG. 9 muestra la cinética de eliminación de combinaciones de lisobactina, con neomicina o kanamicina contra Staphylococcus aureus (ejemplo 11)

FIG. 10 muestra la cinética de eliminación de combinaciones de lisobactina con florfenicol contra Staphylococcus aureus y Streptococcus uberis (ejemplo 12)

FIG. 11 muestra la eficacia de lisobactina y neomicina, en combinación o solas, en un modelo de mastitis de ratón agudo con Staphylococcus aureus (ejemplo 13)

FIG. 12 muestra la eficacia de lisobactina y neomicina, en combinación o solas, en un modelo de mastitis de ratón agudo con Streptococcus uberis (ejemplo 14)

Ejemplo 1: Actividad antimicrobiana in vitro de lisobactina sola contra patógenos de mastitis

La actividad antibacteriana in vitro de lisobactina contra patógenos de mastitis comunes tales como Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Trueperella pyogenes, Escherichia coli, o Klebsiella pneumoniae se evaluó por metodología MIC de dilución de microcaldo como se describe en Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para obtener la concentración inhibidora mínima (MIC, forma siglada de Minimal Inhibitory Concentration), que se define como la menor concentración de una sustancia que evita el crecimiento de una bacteria. Los resultados expresados como MIC⁹⁰ se resumen en la siguiente tabla en que la MIC⁹⁰ se define como la concentración a la cual se inhibe el crecimiento de al menos 90 % de las cepas de una especie dada.

continuación

Ejemplo 2: Cinética de eliminación in vitro de lisobactina sola para patógenos de mastitis

Para evaluar la capacidad de la lisobactina de eliminar bacterias en leche, se inocularon matraces con diferentes concentraciones de lisobactina en leche entera comprada en almacenes con 1-2 x 106 unidades formadoras de colonias/ml de una cepa representativa de Staphyloccus aureus o Streptococcus uberis. Los matraces se incubaron durante 24-48 horas en un baño de agua agitada a 35 /- 2 °C, y los conteos bacterianos viables en cada matraz se determinaron en varios momentos diluyendo y colocando en placas de agar las muestras. Una reducción de la cantidad de bacterias viables en el inóculo inicial de al menos 99,9 % se define como la actividad bactericida.

La cinética de eliminación de lisobactina contra Staphylococcus aureus ATCC 29740 y Streptococcus uberis ATCC 27958 en leche se determina para concentraciones de lisobactina de 4, 8, 16, 32 y 64 pg/ml. Los resultados se muestran en la Figura 1 (CFU, forma siglada de colony-forming unit, unidades formadoras de colonias). Una capacidad de eliminación a las 24 h y 48 h, respectivamente, se puede postular para S. aureus y S. uberis.

Ejemplo 3: Evaluación in vitro de desarrollo de resistencia espontánea contra lisobactina sola:

La frecuencia del desarrollo a la resistencia espontánea se evaluó colocando al menos 1x109 unidades formadoras de colonias de la cepa bacteriana correspondiente en placas de agar que contienen lisobactina a 4x o 8x la MIC e incubando las placas a 35 /- 2 °C. Después de 48 h, la cantidad de colonias que crecieron en las placas a una concentración de lisobactina por encima de la MIC se dividió por la cantidad de bacterias que se colocó inicialmente en placas. La cantidad resultante se define como la frecuencia a la resistencia espontánea, y es una indicación de la probabilidad de que aparezcan aislados resistentes durante una infección.

Como conclusión, la lisobactina a 4- y 8- veces la MIC muestra un perfil de resistencia muy bueno: no se pudieron detectar aislados resistentes. Los resultados se resumen en las siguientes tablas:

Staphylococcus aureus ATCC 29740:

Streptococcus uberis ATCC 27958:

Ejemplo 4: Evaluación in vitro de desarrollo a la resistencia contra lisobactina sola durante pasaje de serie La apariencia de la MIC cambia durante la exposición constante de bacterias a concentraciones por debajo de MIC de lisobactina se evaluó por experimentos de pasaje de serie. El primer día la MIC de S. aureus y S. uberis se evaluó por metodología MIC de dilución de microcaldo como se describe en Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Cada día durante los siguientes 33 días consecutivos, las bacterias del pocillo que contienen las mayores concentraciones que permiten el crecimiento total se recogieron y usaron para inocular 96 nuevos pocillos y evaluar la MIC durante la exposición constante a lisobactina. La MIC obtenida en cada día se graficó en función del tiempo. Los resultados se muestran en la FIG. 2. Rifampicina, que se sabe da como resultado rápidos cambios en la MIC, se usó como control positivo.

Los resultados indican un muy buen perfil de lisobactina para el desarrollo de resistencia durante la constante exposición, ya que las MIC para S. aureus y S. uberis permanecen constantes durante el período de 33 días.

Ejemplo 5: Eficacia de lisobactina sola en un modelo de mastitis de ratón agudo con S. aureus

La eficacia de lisobactina (formulada en un hidrogel a pH 4,7) se evaluó en un modelo de mastitis de ratón agudo con Staphylococcus aureus establecido en la University of Sherbrooke, Canadá (Brouillette y col., Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262). Ambas glándulas mamarias abdominales (L4 y R4) de ratones CD-1 lactantes se infectaron por vía intramamaria con 100 CFU (unidades formadoras de colonias) de S. aureus. Los ratones se trataron por vía intramamaria con lisobactina cuatro horas después de la infección. Cada grupo de tratamiento contenía al menos 3 ratones (6 cuartos), 14 horas después (18 horas después de la inoculación) se sacrificaron los ratones, las glándulas mamarias se cosecharon y el contenido de CFU se evaluó por diluciones en serie de 10 veces de homogenados de glándulas mamarias. El contenido de CFU se expresó como conteo logm El límite de detección fue 200 CFU/g de glándula. Las glándulas con menos de 200 CFU/g se consideraron despejadas. Los resultados se muestran en la FIG. 3.

La instilación intramamaria de 50 |jg de lisobactina reduce el contenido promedio de CFU en aproximadamente 4 logi0, 400 jg de lisobactina elimina la infección de todas las glándulas infectadas.

Ejemplo 6: Eficacia de lisobactina sola en un modelo de mastitis de ratón agudo con S. uberis

La eficacia de lisobactina (formulada en un hidrogel a pH 4,7) se analizó en un modelo de mastitis de ratón expuesto con Streptococcus uberis. Los resultados se muestran en la FIG. 4.

Veinte ratones lactantes se infectaron de forma experimental en el cuarto par de glándulas mamarias con S. uberis alrededor de 12-15 días después del nacimiento de su descendencia. Cuatro horas después de la inoculación, los grupos de cuatro ratones se trataron en las mismas glándulas con lisobactina a 100, 200, 400, o 800 jg / glándula formulada como hidrogel. El quinto grupo se trató solamente con el vehículo de hidrogel como control negativo. Dieciocho horas después de la infección los animales se sometieron a eutanasia, las glándulas se removieron, homogeneizaron y se determinaron las unidades formadoras de colonias (CFU) con procedimientos microbiológicos establecidos. Posteriormente se calcularon la CFU/ml del homogenado, así como la CFU/g de la glándula. El límite de detección fue aproximadamente 100 CFU/g de glándula. La actividad antimicrobiana de lisobactina contra Strep uberis se determinó por comparación de las CFU/glándula promedio de los diferentes grupos de dosificación y el grupo de control negativo.

Las glándulas de todos los animales del grupo de control mostraron una relación de infección óptima (>107 CFU/g de glándula) 18 horas después de la infección. Con una excepción en el mayor grupo de dosificación todas las glándulas en los grupos tratados con lisobactina tuvieron conteos bacterianos por debajo del límite de detección (102 CFU/g). Se puede concluir que lisobactina formulada como hidrogel tiene eficacia antimicrobiana destacada contra S. uberis con dosis intramamarias entre 100 y 800 pg/glándula.

Ejemplo 7: Datos de ganado con lisobactina sola in vivo - estudio farmacocinético de leche en vacas lactantes Holstein

El estudio se diseñó como un estudio no central adecuado para investigar la farmacocinética de la leche de la sustancia activa de lisobactina después de la sola aplicación intracisternal a vacas lecheras lactantes.

La sustancia activa se proporcionó en una formulación a base de parafina adecuada para aplicación intracisternal que contiene 150 mg de lisobactina en 10 g de suspensión oleosa.

El artículo de prueba se administró como tratamiento intracisternal simple con una relación de dosis de 150 mg de lisobactina a un cuarto posterior simple de cuatro vacas lecheras lactantes cada una.

Las vacas lecheras bajo estudio (vacas Holstein) representan la población diana en edad, número de lactancia, etapa de lactancia, rendimiento de la leche y raza. Los animales se encerraron en un granero y se alimentaron con alimento estándar para vacas lecheras que consiste en trigo y ensilaje de pasto y alimento de rendimiento de leche. El ordeño se realizó dos veces al día con intervalos de 12 horas usando un dispositivo de ordeño de tipo cubeta. Las muestras de leche normalmente se realizaron a partir de los cuartos de control tratados y correspondientes antes de (0 h) y durante un período de 168 h después del tratamiento (0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 120, 144, y 168 h) por remoción manual de los correspondientes cuartos de ubres. Las muestras de leche en los momentos de ordeño habituales se tomaron antes del ordeño.

Las concentraciones de la sustancia activa lisobactina en leche se analizaron por HPLC con detección por espectrometría de masas en tándem. El límite de cuantificación fue 0,05 mg/l.

La evaluación farmacocinética de datos de concentración de leche se basó en procedimientos no compartimentados y comprendía parámetros de PK para describir de forma adecuada los perfiles de absorción, distribución y eliminación de la sustancia activa en leche.

Los resultados resumidos derivados de los cuartos de ubres tratados se presentan en la siguiente tabla. No se detectó lisobactina en las muestras de control (cuartos de ubres no tratados).

Resultados farmacocinéticos promedio de lisobactina después del tratamiento simple

Matriz C^máx1 mg/ml T^máx2 h t ^{. ,} 1 ^, h A ^.1

^-1/2 U ¹C ^{^ i}

^infi mg ^**h ^{i -}/ ^/l ^{i AUC0.W} AUC^ü-24hi mg*h/l _mg*h/l

leche 342 4 11,6 2321 1870 2213

La dosis aplicada a 1 cuarto por vaca fue 150 mg de lisobactina;

Los promedios se proporcionan como 1) media geométrica, 2) mediana

La curva de tiempo de concentración de lisobactina se representa en la FIG. 5.

Ejemplo 8: Datos de ganado con lisobactina solo in vivo-modelo de infección en ubre de vaca lechera con S. aureus

Se infectaron de forma experimental quince vacas lecheras lactantes sanas con el patógeno de la mastitis Staphylococcus aureus en todos los cuatro cuartos de las ubres. Apenas un cuarto de ubre muestra síntomas clínicos de mastitis, tales como hinchazón, dolor, consistencia anormal de la leche, se trató con ungüento a basa de parafina lisobactina con dos concentraciones diferentes, o Ubrolexin® (Cefalexina Kanamicina, Boehringer Ingelheim), o solución salina como control negativo. Los tratamientos se asignar de forma aleatoria a 42 cuartos de ubres en total, ya sea 50 mg lisobactina por cuarto (en 11 cuartos), o 150 mg Lisobactina (en 11 cuartos), o Ubrolexin® (en 9 cuartos), o solución salina (en 11 cuartos). Solo los cuartos de ubre que fueron positivos desde el punto de vista bacteriológico para el organismo expuesto inmediatamente antes del tratamiento (n=42) fueron elegibles para evaluar la cura clínica y microbiológica. Los cuartos enfermos se trataron con estas formulaciones intramamarias dos veces con un intervalo de 24 horas entre medio. Las ubres se examinaron clínicamente y las muestras de leche se tomaron antes del tratamiento y varias veces después de este hasta tres semanas después de la segunda administración. La leche se inspeccionó visualmente para determinar desviación en su consistencia y las muestras se evaluaron para determinar la presencia del organismo expuesto y conteo celular somático para confirmar el diagnóstico de mastitis. Los cuartos de ubres enfermas se consideraron curados desde el punto de vista microbiológico cuando el Staphylococcus aureus encontrado en las muestras de leche inmediatamente antes del tratamiento no se puedo aislar de ninguna muestra de leche tomando en el período de tiempo entre el tercer y el vigésimo primer día después del segundo tratamiento. La cura clínica se alcanzó cuando los síntomas locales de mastitis desaparecieron por completo, y la recuperación de conteos celulares somáticos (SCC) como parámetro de inflamación de ubres se logró cuando todos los conteos permanecieron por debajo de 500,000 células por ml de leche en el período mencionado anteriormente.

La relación de cura microbiológica el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 73 % y 27 % para lisobactina 50 mg, 73 % y 45 % para lisobactina 150 mg, 78 % y 44 % para Ubrolexin®, y 0 % y 0 % para solución salina, respectivamente. La relación de cura clínica local el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 45 % y 73 % para lisobactina 50 mg, 37 % y 82 % para lisobactina 150 mg, 33 % y 67 % para Ubrolexin®, y 55 % y 73 % para solución salina, respectivamente. La relación de recuperación SCC el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 36% y 45% para lisobactina 50 mg, 36% y 91 % para lisobactina 150 mg, 56% y 67% para Ubrolexin®, y 36 % y 27 % para solución salina, respectivamente.

Se puede concluir que Lisobactina 150 mg muestra una eficacia similar o hasta mejor en comparación con el producto de control positivo Ubrolexin® y superioridad de lisobactina 50 mg y solución salina en los parámetros de cura microbiológica y clínica, y recuperación SCC.

Ejemplo 9: Datos de ganado con lisobactina solo in vivo-modelo de infección en ubre de vaca lechera con S. uberis

Setenta y dos vacas lecheras sanas se infectaron de forma experimental con el patógeno de mastitis Streptococcus uberis en dos cuartos de ubre por vaca. Apenas un cuarto de ubre muestra síntomas clínicos de mastitis, (por ejemplo, calor, hinchazón, dolor, consistencia anormal de la leche, se trató con ungüento a basa de parafina lisobactina con dos concentraciones diferentes, o Ubrolexin® (Cefalexina Kanamicina, Boehringer Ingelheim). Los tratamientos se asignar de forma aleatoria a 41 (clínicos) o 37 (microbiológicos) cuartos de ubres en total, ya sea 50 mg lisobactina por cuarto (en 15/13 cuartos), o 150 mg Lisobactina (en 15/14 cuartos), o Ubrolexin® (en 11/10 cuartos), como control positivo. Los cuartos enfermos se trataron con estas formulaciones intramamarias dos veces con un intervalo de 24 horas entre medio. Las ubres se examinaron clínicamente y las muestras de leche se tomaron antes del tratamiento y varias veces después de este hasta tres semanas después de la segunda administración. La leche se inspeccionó visualmente para determinar desviación en su consistencia y las muestras se evaluaron para determinar la presencia del organismo expuesto para confirmar el diagnóstico de mastitis. Los cuartos de ubres enfermas se consideraron curados desde el punto de vista microbiológico cuando el Streptococcus uberis encontrado en las muestras de leche inmediatamente antes del tratamiento no se puedo aislar de ninguna muestra de leche tomando en el período de tiempo entre el séptimo y el vigésimo primer día después del segundo tratamiento. La cura clínica se alcanzó cuando los síntomas locales de mastitis desaparecieron por completo o a lo sumo de naturaleza muy leve.

La relación de cura microbiológica el día 7 y día 21 después del segundo tratamiento fue 84,6 % y 92,31 % para lisobactina 50 mg, 71,4 % y 85,71 % para lisobactina 150 mg, y 30 % y 30 % para Ubrolexin®, respectivamente. La relación de cura clínica local el día 7 después del segundo tratamiento fue 86,7 % tanto para lisobactina 50 mg como para lisobactina 150 mg, y 36,4 % para Ubrolexin®, respectivamente.

Se puede concluir que lisobactina 50 y 150 mg fueron claramente más eficaces en comparación con el producto de control positivo Ubrolexin® en los parámetros centrales de cura clínica y microbiológica.

Ejemplo 10: Cinética de eliminación in vitro de combinaciones de lisobactina con neomicina para patógenos de mastitis

Para evaluar la actividad sinérgica de lisobactina y neomicina en leche entera comprada en almacenes in vitro, los matraces que contienen diferentes concentraciones de lisobactina y neomicina, ya sea solos o en combinación, se inocularon con 1-2 x 106 unidades formadoras de colonias/ml de una cepa representativa de Staphyloccus aureus, Streptococcus uberis o E. coli.

Los matraces se incubaron durante 24-48 horas en un baño de agua agitada a 35 /- 2 °C, y los conteos bacterianos viables en cada matraz se determinaron en varios momentos diluyendo y colocando en placas de agar las muestras. Una reducción de la cantidad de bacterias viables lograda por la combinación en comparación con el compuesto simple más activo en al menos 99 % después de 24 h se define como actividad sinérgica (NCCLS/CLSI M26-A Vol.19, N.° 18).

La cinética de eliminación de lisobactina y neomicina, solas o en combinación, contra Staphylococcus aureus ATCC 29740 en leche se determinó para relaciones de concentración de lisobactina:neomicina de 1:1 (2 pg/ml cada una) y 2:1 (2 pg/ml de lisobactina y 1 pg/ml neomicina).

Los resultados se muestran en la Figura 6.

Después de 24 h se pudo observar una actividad sinérgica de las combinaciones de lisobactina:neomicina. La sinergia es extremadamente visible a relaciones de al menos 2:1, particularmente a una relación de 1:1.

La cinética de eliminación de lisobactina y neomicina, solas o en combinación, contra Streptococcus uberis ATCC 27958 en leche se determinó para relaciones de concentración de lisobactina:neomicina de 1:1 (16 pg/ml cada una) y 2:1 (16 pg/ml de lisobactina y 8 pg/ml neomicina).

Los resultados se muestran también en la Figura 6.

Después de 24 h se pudo observar una actividad sinérgica de las combinaciones de lisobactina:neomicina con ambas relaciones.

La cinética de eliminación de lisobactina y neomicina, solas o en combinación, contra Staphylococcus aureus ATCC 29740 en leche se determinó para relaciones de concentración de lisobactina:neomicina de 1:5 (1 pg/ml de lisobactina más 5 pg/ml de neomicina y 1,5 pg/ml de lisobactina más 7,5 pg/ml de neomicina respectivamente). Los resultados se muestran en la Figura 7.

Después de 24 h se pudo observar una actividad sinérgica. La sinergia es extremadamente visible ya con relaciones de lisobactina:neomicina de al menos 1:5 (es decir 0.2). Dicha sinergia no depende de la cantidad absoluta de la lisobactina y neomicina usadas según se muestra en la figura 7.

La cinética de eliminación de lisobactina y neomicina, solas o en combinación, contra Streptococcus uberis ATCC 27958 en leche se determinó para relaciones de concentración de lisobactina:neomicina de 1:10 (1 pg/ml de lisobactina más 10 pg/ml de neomicina y 2 pg/ml de lisobactina más 20 pg/ml de neomicina respectivamente).

Los resultados se muestran también en la Figura 7.

Después de 24 h se pudo observar una actividad sinérgica. A una relación de lisobactina:neomicina de 1:10 (0.1) la sinergia es altamente visible sin perjuicio de la cantidad absoluta de lisobactina y neomicina.

Tomadas juntas, se puede mostrar una actividad sinérgica de las combinaciones de lisobactina:neomicina. Dicha actividad sinérgica es muy visible con relaciones que varían de 2:1 a 1:5 (0.2) y 2:1 a 1:10 (0.1) para Staphylococcus aureus ATCC 29740 y Streptococcus uberis ATCC 27958, respectivamente.

La cinética de eliminación de lisobactina y neomicina, solas o en combinación, contra E. coli P4:O32 en leche se determinó para relaciones de concentración de lisobactina:neomicina de 4:1 (256 pg/ml de lisobactina y 32 pg/ml neomicina).

Los resultados se muestran en la Figura 8.

Aunque la neomicina y la combinación de lisobactina:neomicina fueron capaces de reducir el conteo celular bacteriano por debajo del límite de detección después de 8 h, la combinación mostró un comienzo más rápido de eliminación.

Además, la combinación previno sustancialmente el nuevo crecimiento de las bacterias después de 24 h que no se puede ser alcanzado por el ingrediente activo correspondiente.

Por lo tanto, se observó una actividad sinérgica aquí, así como con relación a las bacterias de E. coli Gram negativas.

Ejemplo 11: Cinética de eliminación in vivo de combinaciones de lisobactina. con neomicina o kanamicina contra Staphylococcus aureus ATCC 29740

Para investigar si lo antes referido a sinergia se aplica a más antibióticos aminoglucósidos más allá de la neomicina combinada con lisobactina, también se analizó la cinética de eliminación de kanamicina como compañero de combinación.

La cinética de eliminación se realizó como se describe en el Ejemplo 10.

La cinética de eliminación de lisobactina ya sea con neomicina o kanamicina contra Staphylococcus aureus ATCC 29740 en leche se determinó para una relación de concentración de lisobactina:neomicina o de lisobactina:kanamicina de 1:4 (0,5 pg/ml de lisobactina más 2 pg/ml de neomicina o kanamicina; 1 pg/ml de lisobactina más 4 pg/ml de neomicina o kanamicina y 2 pg/ml de lisobactina más 8 pg/ml de neomicina o kanamicina, respectivamente).

Los resultados se muestran en la Figura 9.

Para todas las concentraciones evaluadas la combinación de lisobactina:kanamicina mostró actividad similar en comparación con la combinación de lisobactina:neomicina.

A partir de esto se puede concluir que la combinación de lisobactina con antibióticos aminoglucósidos de por sí transmite una sinergia inesperada.

Ejemplo comparativo 12: Cinética de eliminación in vitro de lisobactina con florfenicol para Staphylococcus aureus ATCC 29740 y Streptococcus uberis ATCC 27958

Los aditivos sinérgicos de dos agentes antibióticos diferentes no se pueden predecir de forma confiable como se muestra a continuación.

Por ejemplo, la combinación de lisobactina con florfenicol no reveló actividad sinérgica ni para Staphylococcus aureus ATCC 29740 ni para Streptococcus uberis ATCC 27958 en leche bajo condiciones de prueba que se muestran en la Figura 10.

Ejemplo 13: Eficacia de una combinación de lisobactina con trisulfato de neomicina en un modelo de mastitis de ratón agudo con S. aureus

La eficacia de lisobactina y trisulfato de neomicina, solos o en combinación, se evaluó en un modelo de mastitis de ratón agudo con Staphylococcus aureus establecido en la University of Sherbrooke, Canadá (Brouillette y col., Vet. Microbiol. (2004) 4:253-262), como se describe en el ejemplo 5. Las muestras se formularon en parafina.

Los resultados se muestran en la FIG. 11.

La instilación intramamaria de 50 pg lisobactina, 1600 pg trisulfato de neomicina y combinación de 50 pg lisobactina más 1600 pg trisulfato de neomicina reduce el contenido de CFU mediano en aproximadamente 2,7, 2,5 y 5,9 log-10, respectivamente.

Ejemplo 14: Eficacia de una combinación de lisobactina con trisulfato de neomicina en un modelo de mastitis de ratón agudo con S. uberis

Se infectaron de forma experimental veintitrés ratones lactantes CD-1 10-15 días después del nacimiento de la descendencia con el patógeno de mastitis Streptococcus uberis (ATCC 27958) en la cuarta glándula mamaria izquierda y derecha.

Cuatro horas después de la infección los animales se trataron de forma intramamaria con los artículos de prueba. El estudio comprendía cuatro grupos de tratamiento con cuatro ratones cada uno y un grupo de control con siete ratones.

Los ratones de los grupos de tratamiento recibieron formulaciones de parafina de lisobactina a 15 pg/glándula o trisulfato de neomicina a 1600 pg/glándula, o dos combinaciones de ambos con lisobactina a 15 pg más trisulfato de neomicina a 800 |jg o 1600 |jg por glándula.

Dieciocho horas después de la infección los ratones se eliminaron y las glándulas mamarias se removieron y la CFU bacteriana se evaluó desde el punto de vista microbiológico.

Los resultados se muestran en la FIG. 12.

El grupo de control que recibe parafina como placebo estaba en el intervalo esperado con CFU alrededor de 7 logiü/g de tejido. La instilación intramamaria de 15 jg lisobactina, 1600 jg trisulfato de neomicina y combinación de 15 jg lisobactina más 1600 jg trisulfato de neomicina reduce el contenido promedio de CFU en aproximadamente 2,6, 1,5 y 3,8 log™, respectivamente.

Se puede concluir que la combinación de lisobactina/trisulfato de neomicina dosificada a 15/1600 jg/glándula fue superior en su eficacia contra S. uberis ATCC27958 en comparación con sus componentes solos con la misma dosificación.

Ejemplo 15: Datos de ganado con lisobactina y trisulfato de neomicina in vivo-modelo de infección en ubre de vaca lechera con S. aureus

Se infectaron de forma experimental quince vacas lecheras lactantes sanas con el patógeno de la mastitis Staphylococcus aureus en todos los cuatro cuartos de las ubres. Apenas un cuarto de ubre mostró síntomas clínicos de mastitis, tales como hinchazón, dolor, consistencia anormal de la leche, se trató con suspensión a base de lisobactina migliol con una dosis de 50 mg o con suspensión a base de trisulfato de neomicina migliol con una dosis de 400 mg o con una combinación de ambos, es decir, 50 mg de lisobactina y 400 mg de trisulfato de neomicina. Además, un cuarto grupo de cuartos de ubre recibió migliol como control negativo. Los tratamientos se asignaron de forma aleatoria a 60 cuartos de ubres en total. Solo los cuartos de ubre que fueron positivos desde el punto de vista bacteriológico para el organismo expuesto inmediatamente antes del tratamiento (n=49) fueron elegibles para evaluar la cura clínica y microbiológica. Los cuartos enfermos se trataron con estas formulaciones intramamarias dos veces con un intervalo de 24 horas entre medio. Las ubres se examinaron clínicamente y las muestras de leche se tomaron antes del tratamiento y varias veces después de este hasta tres semanas después de la segunda administración con persona del estudio cegados al tratamiento.

La leche se inspeccionó visualmente para determinar desviación en su consistencia y las muestras se evaluaron para determinar la presencia del organismo expuesto y conteo celular somático para confirmar el diagnóstico de mastitis. Los cuartos de ubres enfermas se consideraron curados desde el punto de vista microbiológico cuando el Staphylococcus aureus encontrado en las muestras de leche inmediatamente antes del tratamiento no se puedo aislar de ninguna muestra de leche tomando en el período de tiempo entre el tercer y el vigésimo primer día después del segundo tratamiento. La cura clínica se alcanzó cuando los síntomas locales de mastitis desaparecieron por completo, y la recuperación de conteos celulares somáticos (SCC) como parámetro de inflamación de ubres se logró cuando todos los conteos permanecieron por debajo de 200,000 células por ml de leche en el período mencionado anteriormente.

La relación de cura microbiológica el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 71 % y 14% para lisobactina 50 mg, 100% y 42% para trisulfato de neomicina 400 mg, 69% y 54% para la combinación de lisobactina 50 mg más trisulfato de neomicina 400 mg, y 10 % y 30 % para el control negativo migliol, respectivamente.

La relación de cura clínica local el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 71 % y 71 % para lisobactina 50 mg, 67 % y 100 % para trisulfato de neomicina 400 mg, 77 % y 85 % para la combinación de lisobactina 50 mg más trisulfato de neomicina 400 mg, y 80 % y 70 % para el control negativo migliol, respectivamente.

La relación de recuperación SCC el día 3 y día 21 después del segundo tratamiento fue 35 % y 36 % para lisobactina 50 mg, 17 % y 50 % para trisulfato de neomicina 400 mg, 46 % y 69 % para la combinación de lisobactina 50 mg más trisulfato de neomicina 400 mg, y 30 % y 30 % para el control negativo migliol, respectivamente.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Combinación de lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido para su uso en un tratamiento de un animal mamífero no humano contra una enfermedad provocada por bacterias Gram negativas y/o Gram positivas.

2. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el animal no humano mamífero es un animal hembra que tiene una ubre.

3. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el animal no humano mamífero hembra que tiene una ubre es una vaca y la enfermedad es mastitis bovina.

4. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en la que la combinación se administra por vía intramamaria.

5. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en la que la mastitis bovina es una mastitis bovina clínicamente manifiesta.

6. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en la que la mastitis bovina es una mastitis bovina subclínica.

7. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la lisobactina se proporciona a una dosis de 25 a 1000 mg por cuarto de ubre.

8. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el al menos un antibiótico aminoglucósido es kanamicina o neomicina, preferentemente el al menos un antibiótico aminoglucósido es neomicina.

9. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, en la que la mastitis bovina está provocada por bacterias de Staphylococcus, bacterias de Streptococcus, bacterias de Trueperella, bacterias de Corynebacterium y/o bacterias de Escherichia.

10. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la mastitis bovina está provocada por bacterias de Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negativos, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalacticae, Streptococcus agalacticae y/o E. coli.

11. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la mastitis bovina está provocada por bacterias de Trueperella pyogenes y/o E. coli.

12. Combinación para su uso en un tratamiento de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la mastitis bovina está provocada por bacterias de Corynebacterium bovis y/o E. coli.

13. Composición farmacéutica formulada para la administración intramamaria en mamíferos bovinos, caracterizada porque la composición comprende lisobactina y al menos un antibiótico aminoglucósido, mientras que el al menos un antibiótico aminoglucósido es preferentemente kanamicina o neomicina.