KR20190094671A - Udca를 포함하는 신규한 고분자 화합물 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체내 과산화수소에 반응하여 이를 제거하고 UDCA를 방출하는 고분자 화합물에 관한 것이다. 상기 고분자 화합물을 과산화수소를 제거하므로 항산화효과를 가져 항산화제로 사용될 수 있으며, 방출되는 UDCA는 간 질환 치료 효과를 가져 간 질환 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 또한 상기 고분자 화합물은 세포 증식 효과, 골 분화 및 골 재생 촉진 효과를 가지므로 세포 증식제, 골 분화제 및 골 재생제로 사용될 수 있다.

Description

UDCA를 포함하는 신규한 고분자 화합물 및 그 용도{novel macromolecular compound comprising UDCA and use thereof}

본 발명은 UDCA를 포함하는 신규한 고분자 화합물 및 그 용도에 관한 것이다.

UDCA(Ursodeoxycholic acid)는 웅담의 주요 활성 성분으로, 인간의 담즙에서도 미량 검출된다. 예로부터 웅담은 중국에서 간기능, 간질환, 소화기계 및 피부질환의 치료와 예방에 사용된 약재로 최근 연구를 통해 그 주 성분인 UDCA가 간세포 해독, 진정, 이담, 항염, 항산화 및 항세포자멸사 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 UDCA는 담관과 관련된 질병인 원발 쓸개관 간경화(primary biliary cirrhosis)의 치료제로 미국 식약처(FDA)의 승인을 받은 물질이기도 하다.

활성 산소종(reactive oxygen species)은 호기성 생물에 있어서 생명 유지의 필수요소인 산소가 전자운반과정 혹은 에너지대사 과정 중에 불완전 하게 환원될 때 형성되는 물질이다. 이러한 활성 산소종은 정상적인 세포 내 활성작용 과정에서 생성되며, 세포분화, 유전자 발현, 사이토카인(cytokine)에 대한 반응 정도를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있으며, 세포 내의 필수적인 전달자로서 특정 사이토카인이나 성장인자의 신호 전달에 중요한 역할을 한다. 하지만 활성 산소종의 생성과 이를 제거하는 항산화 반응간의 불균형으로 세포 내의 활성 산소종이 증가하게 되면 노화, 심혈관질환, 염증질환, 암과 관련된 질병들의 핵심 원인들로 알려진 산화 스트레스가 발생된다.

종래에 UDCA를 이용한 약물은 많이 존재하였으나, UDCA를 고분자 단량체로 이용하여 과산화수소에 감응하여 UDCA를 방출할 수 있게끔 하는 약물은 존재하지 않았다.

이에 본 발명의 목적은 과산화수소에 감응하여 위치 선택적으로 UDCA를 방출할 수 있는 신규 화합물 및 이를 포함한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 화합물은 세포 증식 효과, 골 분화 및 골 재생 촉진 효과를 가지는 바, 본 발명의 목적은 상기 화합물을 포함한 세포 증식제, 골 분화제 및 골 재생제를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 연구한 결과, 본 발명의 발명자는 과산화수소에 감응하여 UDCA를 방출할 수 있는 신규 화합물을 합성하여 본 발명을 완성하였으며, 본 발명의 과제 해결 수단은 다음과 같다.

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:

[화학식 1]

식 중에서, 상기 R은 C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_6-10 아릴 및 C_{1- 6}알킬렌-C_{6- 10}아릴 중 선택되며, 상기 n은 10 내지 2000이다.

2. 상기 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항산화제 조성물.

3. 상기 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 간 질환 치료용 약학적 조성물.

4. 상기 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 세포 증식제.

5. 상기 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 분화제.

6. 상기 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 재생제.

본 발명의 신규 화합물은 옥살레이트기가 과산화수소와 반응할 수 있으므로, 생체 내에서 과다 생성된 활성산소를 일차적으로 제거하여 산화 환원 균형 회복을 도울 수 있으며, 동시에 UDCA를 방출하여 세포내에서 항염, 항산화 및 항세포자멸사 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 화합물은 세포의 증식을 증가시키며, 골 분화 및 골 재생을 촉진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 제조된 UDCA 유도체의 구조를 ¹³C-NMR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 화합물(PUOX)의 구조를 ¹³C-NMR 로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 질량분석기를 사용하여 PUOX의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 PUOX 나노입자를 주사전자현미경으로 관측한 것이다.
도 5는 본 발명의 PUOX 나노입자의 크기를 입자 크기 분석기로 분석한 것이다.
도 6은 본 발명의 PUOX 나노입자의 과산화수소 환경에서의 크기 변화를 입자 크기 분석기로 분석한 것이다.
도 7은 본 발명의 PUOX 나노입자의 과산화수소 소거 능력을 측정한 것이다.
도 8은 본 발명의 PUOX 나노입자의 세포 독성을 측정한 것이다.
도 9는 본 발명의 PUOX 나노입자에 형광물질을 포접하여 세포 내 이입을 평가한 것이다.
도 10은 본 발명의 PUOX 나노입자 및 대조군의 활성산소 억제 능력을 공초점 현미경을 이용하여 형광 발현 정도로 측정한 것이다.
도 11은 도 10의 형광 발현 정도를 정량화한 도이다.
도 12는 본 발명의 PUOX 나노입자 및 대조군의 활성산소 억제 능력을 세포생존능력으로 측정한 것이다.
도 13은 본 발명의 PUOX 나노입자 및 대조군의 종양 괴사 인자 알파를 효소결합면역흡착 측정법으로 측정한 것이다.
도 14는 본 발명의 PUOX 나노입자 및 대조군의 아세트아미노펜에 의해 유도된 급성간부전 생쥐 모델에 대한 효과를 확인한 것이다.
도 15는 본 발명의 PUOX 나노입자 및 대조군의 간 조직에 대한 영향을 조직학적으로 분석한 것이다.
도 16은 도 15의 단위 면적당 형광세기를 정량화한 것이다.
도 17은 본 발명의 PUOX 나노입자의 생물학적 분포를 각 장기 별 형광분포도를 통해 확인한 것이다.
도 18은 도 17의 형광 세기 수치를 정량화한 것이다.
도 19는 본 발명의 PUOX 나노입자의 생체 안정성을 조직학적 분석을 통해 확인한 것이다.
도 20은 본 발명의 PUOX 나노입자의 생체 안정성을 ALT 수치를 통해 확인한 것이다.
도 21은 본 발명의 PUOX 나노입자를 인간 지방유래 줄기세포에 처리하였을 때의 세포 증식(1) 및 생존 능력(2) 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 PUOX 나노입자를 인간 지방유래 줄기세포에 처리하였을 때의 골 분화 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명의 PUOX 나노입자를 골 손상 모델에 처리하였을 때의 골 재생 능력을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명의 PUOX 나노입자를 골 손상 모델에 처리하였을 때의 골 재생 능력을 조직학적으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

식 중에서, 상기 R은 C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_6-10 아릴, C_3-7 사이클로알킬 및 C_{1- 6}알킬렌-C_6-10아릴 중 선택되며, 상기 n은 10 내지 2000이다.

본 발명의 명세서에서 ‘알킬’은 C_nH_{2n +1}의 일반식을 갖는 1가 치환기를 의미하며, 직쇄형과 분쇄형을 모두 포함한다. 본 발명의 명세서에서 C_{x - y}알킬은 탄소수 x 내지 y개의 알킬을 의미한다. 예컨대 C_{1- 6}알킬은 탄소수 1개 내지 6개의 알킬을 의미하며, 더욱 구체적으로는 직쇄형 또는 분쇄형의 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실을 모두 포함한다.

본 발명의 명세서에서 ‘알케닐’은 C=C의 이중 결합이 1개 이상 존재하는 1가 치환기를 의미하며, 직쇄형과 분쇄형을 모두 포함한다. 본 발명의 명세서에서 C_{x -y} 알케닐은 탄소수 x 내지 y개의 알케닐을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 ‘알키닐’은 C≡C의 삼중 결합이 1개 이상 존재하는 1가 치환기를 의미하며, 직쇄형과 분쇄형을 모두 포함한다. 본 발명의 명세서에서 C_{x -y} 알키닐은 탄소수 x 내지 y개의 알키닐을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 ‘아릴’은 방향족 고리를 포함하는 1가의 치환기를 의미한다. 상기 방향족 고리는 단일 고리 또는 다중 고리일 수 있으며, C_x-y 아릴은 탄소수 x 내지 y개의 아릴을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 ‘사이클로알킬’은 C_nH_{2n -1}의 일반식 및 고리 구조를 갖는 1가 치환기를 의미한다. C_x-y 사이클로알킬은 탄소수 x 내지 y개의 사이클로알킬을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 ‘알킬렌’은 C_nH_2n의 일반식을 갖는 직쇄 또는 분쇄의 2가 치환기를 의미한다. C_{x -y} 알킬렌은 탄소수 x 내지 y개의 알킬렌을 의미하며, ‘알킬렌-아릴’은 알킬렌의 양 끝 중 어느 하나에 아릴기가 결합되어 있는 치환기를 의미한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 나노입자를 제공한다.

상기 화학식 1의 화합물을 나노입자의 형태로 제조할 경우 체내 주입이 용이하다는 장점이 있다.

상기 나노입자의 직경은 200 내지 600nm인 것이 바람직하다. 이보다 작을 경우 제대로 된 입자의 형태를 갖추기 어려우며, 이보다 클 경우 체내 분해가 용이하지 않다는 단점이 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항산화제 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1의 화합물은 과산화수소에 감응하여 UDCA를 방출하도록 분해되며, 이 과정에서 과산화수소를 제거할 수 있다. 즉 상기 화합물은 생체 내 과다 생성된 활성산소를 일차적으로 제거하여 산화 환원 균형을 회복시킬 수 있으며, 방출된 UDCA 또한 항산화효과를 가지므로, 상기 화합물은 항산화제 조성물로 사용되기에 적합하다.

상기 항산화제 조성물은 항산화 효과를 갖는 것으로 알려진 다른 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 간 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1의 화합물은 체내에서 간 질환 치료 효과를 갖는 UDCA를 방출하므로 간 질환 치료용 약학적 조성물로 사용되기에 적합하다.

상기 간 질환은 간염, 간독성, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변, 담즙울체, 간허혈, 간 농양, 간성 혼수 및 간 위축증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 “치료”는 질환의 완치뿐만 아니라, 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.

상기 약학적 조성물은 일반적으로 약물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있고, 사용될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐리롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학적 조성물을 제제화하는 경우 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 웨텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명의 명세서에서 “약학적으로 유효한 양”은 질환을 치료하기에 충분하고, 위험은 충분히 낮은 양을 의미하며, 구체적인 값은 투여 대상의 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 간 질환의 치료에 사용되는 종래의 다른 약물과 병용하여 사용할 수 있다. 종래의 다른 약물과 병용하는 경우, 순차적으로 혹은 동시에 투여될 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 세포 증식제를 제공한다. 본 발명의 화합물은 세포의 수를 증가시키는 효과를 가지며, 이에 따라 세포 증식제로 사용되기에 적합하다. 상기 세포는 줄기세포인 것이 바람직하며, 인간 지방유래 줄기세포인 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 분화제를 제공한다. 발명자는 본 발명의 화합물을 처리한 경우 골 분화의 효율이 증가한다는 점을 확인하였으며, 이에 본 발명의 화합물은 골 분화제로 사용되기에 적합하다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 재생제를 제공한다.

실시예

이하에서 본 발명의 이해를 돕기 위한 바람직한 실시예를 제시한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 화합물(PUOX)의 제조

하기 반응식 1에 나타난 과정을 통하여 본 발명의 화합물을 제조하였다.

[반응식 1]

우선 UDCA와 벤질 브로마이드를 아세톤과 THF의 혼합 용액 및 85℃에서 12시간 반응시켜 UDCA 유도체를 합성하였다. 그 후 0℃ 상태에서 정제된 THF에 상기 합성된 UDCA 유도체 및 옥살릴 클로라이드를 넣어 녹인 후 피리딘을 주사기를 사용하여 천천히 투입한 뒤 질소 퍼지 상태에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응 결과물을 염 제거를 위해 에탄올에 세척한 후 차가운 헥산에 침전시키고, 진공펌프를 이용하여 건조시켜 딱딱한 흰색의 고분자를 수득하였다.

실시예 2. PUOX 나노입자의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 PUOX 100mg을 1ml의 DCM에 용해시킨 후 초음파 분쇄기로 교반 후 5%(w/v)의 폴리비닐알코올 희석용액 20ml에 1분 동안 분산시켰다. 그 후 균질기를 이용하여 1분 30초 동안 균질화하였으며, 이 유화액에 추가로 0.5%(w/v)의 폴리비닐알코올 20ml을 첨가한 후 1분 30초 동안 더 균질화하였다. 용매를 회전 진공 농축기로 제거한 후에 원심분리기를 이용하여 4℃에서 10,000xg로 5분 동안 원심분리하였다. 총 3번의 세척 후에 동결 건조하여 백색가루 형태의 나노입자를 수득하였다.

실시예 3. 또 다른 UDCA 유도체의 제조

UDCA 3g을 에탄올 50ml에 녹인 후, 환류 상태에서 80℃에서 6시간 반응시켰다. 회전증발기를 이용하여 에탄올을 휘발시킨 후 생성물을 얻었으며, 디클로로메탄과 물을 이용하여 에틸이 결합된 UDCA 유도체를 분리하였다.

실험예 1. UDCA 유도체 및 PUOX의 ¹³C-NMR 분석

UDCA 유도체 및 PUOX를 CDCl₃ 750μl에 녹여 400MHz 13C-NMR 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2로 도시하였다.

실험예 2. 질량분석기를 이용한 PUOX의 분자량 측정

PUOX 1mg을 고순도 THF 1ml에 녹인 후 포어 크기가 0.4μm인 PTFE 시린지 필터를 이용하여 상층액을 500μl 분리한 후, GPC에 주사하여 PUOX의 분자량을 측정하였다. 그 결과 PUOX의 평균 분자량이 약 93,000Da임을 확인하였으며, 이를 도 3으로 도시하였다.

실험예 3. PUOX 나노입자의 형태 및 크기 분석

상기 실시예 2에서 제조한 나노입자를 주사전자 현미경을 이용해 관측하였으며, 이를 도 4로 도시하였다.

또한 상기 나노입자를 입자크기 분석기를 이용하여 분석하였으며, 그 결과 직경이 200 내지 500nm 사이에서 균일한 나노입자가 제조되었음을 확인하였다. 이를 도 5로 도시하였다.

실험예 4. 과산화수소 환경에서의 PUOX 나노입자 크기 변화 측정

상기 나노입자 1mg을 1mM 과산화수소 1ml에 분산시킨 후 0, 24, 48, 72시간 별로 입자 크기 분석기를 통해 크기 변화를 측정하였다. 나노입자가 과산화수소와 반응하여 분해되면서 발생되는 입자 크기의 변화를 측정하였으며 그 결과를 도 6으로 도시하였다.

실험예 5. PUOX 나노입자의 과산화수소 소거 능력 평가

제조된 나노입자를 1mg/ml의 농도로 총 15mg의 나노입자를 1mM 과산화수소 15ml에 분산시킨 후, 각 시간대 별로 1ml을 EP 튜브에 옮긴 후 4℃에서 10,000xg로 1분 동안 원심분리하여 상층액 700μl를 분리하였다. 과산화수소가 존재하는 분리된 용액 200μl에 THF 15ml에 녹은 다이페닐 옥살레이트 15mg과 다이페닐 옥살레이트 2mg의 혼합용액 20μl를 혼합하였따. 그 후 화학적 발광원리에 의한 발광강도를 이용하여 과산화수소의 농도를 측정하였다. 그 결과 5일 정도의 시간이 흐르면 총 과산화수소의 약 50%가 소거된다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 도 7로 도시하였다.

실험예 6. PUOX 나노입자의 세포 독성 평가

PUOX 나노입자의 세포 독성을 MTT를 이용하여 분석하였다. RAW 264.7 세포들을 24 웰-플레이트에 각 웰당 1.5 x 10⁵개로 24시간 배양하여 세포를 안정화시킨 후, PUOX 나노입자와 비교군(UDCA 및 UDCA 유도체)들을 농도 별로 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후에 각 군마다 900μl의 배양액에 100μl의 MTT 용액을 2시간 동안 처리하였다. 생성된 포마잔 결정을 상층액을 제거하고 1ml의 DMSO에 녹여 수득한 뒤, 96 웰-플레이트에 100μl씩 분주하였다. 각 군을 4배수로 빈도 수를 만든 후 마이크로플레이트 리더를 이용해 570nm 파장에서 측정하였다. 물질을 처리하지 않은 군을 기준으로 세포 생존 능력을 백분율로 나타내고, 표준편차를 정리하여 그래프로 나타내었으며, 이를 도 8로 도시하였다.

실험예 7. 형광현미경을 사용하여 형광물질을 포접한 PUOX 나노입자의 세포 내 이입 평가

RAW264.7 세포에 커큐민을 10% 포접한 PUOX 나노입자를 처리한 후 3시간 뒤 상층액을 제거하고 PBS를 이용하여 3회 세척하였다. 그 후 배양액을 다시 넣어주었으며, 형광 현미경을 사용하여 형광물질을 포접한 PUOX 나노입자의 세포 내 이입을 확인하였다. 이를 도 9로 도시하였다.

실험예 8. 공초점 현미경을 이용한 세포 내 활성산소 측정 및 PUOX 나노입자의 활성산소 억제 능력 평가

RAW264.7 세포들을 공초점 현미경 분석을 위해 전용 배양 디쉬에 1.5x10⁵개로 24시간 배양하였다. PUOX 나노입자와 비교군(UDCA 및 UDCA 유도체)을 각 농도 별로 처리한 후, 과산화수소 200μM과 함께 24시간 배양하였다. PBS로 두 번 세척 후에 DCFH-DA(2’,7’-dichloroflurescein diacetate) 2μM을 20분간 처리하였다. 다시 PBS로 두 번 세척한 후 1ml의 배양액을 넣은 상태에서 공초점 현미경으로 세포 내 활성산소에 따른 형광발현을 확인하였다. 이를 도 10으로 도시하였으며, 이를 정량화한 것을 도 11로 도시하였다.

또한, 24 웰-플레이트에 RAW264.7 세포들을 각 웰 당 1.5x10⁵개로 24시간동안 배양하여 안정화시킨 후 PUOX 나노입자와 비교군을 농도 별로 처리한 후, 200μM의 과산화수소를 넣고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 각 군마다 900μl의 배양액에 100μl의 MTT 용액을 2시간 동안 처리하였다. 생성된 포마잔 결정을 상층액을 제거하고 1ml의 DMSO로 녹여 수득한 뒤 96 웰-플레이트에 100μl씩 분주하였다. 각 군을 4배수로 빈도 수를 만든 뒤 마이크로플레이트 리더를 이용해 570nm 파장에서 측정하였다. 물질을 처리하지 않은 군을 기준으로 세포생존능력을 백분율로 나타내고 표준편차를 정리해 그래프로 나타내었으며, 이를 도 12로 도시하였다.

실험예 9. 효소결합면역흡착 측정법(ELISA)을 이용한 PUOX 나노입자의 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 억제 능력 평가

24 웰-플레이트에 RAW264.7 세포들을 각 웰당 1.5x10⁵개로 24시간 배양하여 안정화시킨 후 PUOX 나노입자와 비교군(UDCA 및 UDCA 유도체)을 농도 별로 처리한 후 200μM의 과산화수소를 넣고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양액 1ml을 EP 튜브에 수득한 후 배양액을 4℃에서 8,000xg로 10분 동안 원심분리한 후 상층액 600μl를 분리하였다. 분리한 상층액을 사용하여 종양 괴사 인자 알파 측정용 효소결합면역흡착 측정법을 이용하였으며, 그 결과 PUOX의 종양 괴사 인자 알파 억제 능력을 확인하였다. 이를 도 13으로 도시하였다.

실험예 10. 아세트아미노펜(APAP)에 의해 유도된 급성간부전 마우스 모델에 대한 PUOX 나노입자의 효과 측정

대조군, PUOX 나노입자만 투여한 그룹, APAP 투여 후 아무것도 투여하지 않은 그룹, APAP 투여 후 PUOX 나노입자를 2개의 농도(2.5mg/kg, 5.0mg/kg)으로 투여한 그룹, APAP 투여 후 UDCA를 투여한 그룹, APAP 투여 후 UDCA-Bn을 투여한 그룹으로 총 7개의 실험군을 설정하였다. 각각의 군에 25mg/ml 농도의 APAP 200ml를 쥐 복강에 주사하여 급성간부전 염증을 유도하였다. 1시간 후에 꼬리 정맥을 이용하여 각각의 군에 따른 물질을 주사하였다. 주사로부터 24시간 후 각 군의 생쥐에서 혈액을 채취하여 간 손상 정도를 확인하는 척도인 ALT 수치를 검사하였다. 검사 결과 PUOX를 5.0mg/kg의 농도로 주사하였을 때 ALT 수치가 큰 폭으로 감소한 것을 확인 할 수 있었으며, 이를 도 14로 도시하였다.

실험예 11. 간 조직 절편의 조직학적 분석

간 조직을 적출한 후, 4% 포르말린 용액을 이용하여 고정시키고 조직처리기를 통해 탈수 과정을 거친 후 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 블록을 6μm 두께로 절단하여 절편을 제작 하였다. 그 후 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 위해 제작된 조직 절편의 파라핀 제거를 위해 조직 슬라이드를 자일렌에 5분씩 3번 처리하였다. 그 후 100%, 90%, 80%, 70% 알코올 순으로 각각 5분씩 처리한 후, 헤마톡실린은 1분 에오신은 40초 동안 저리하였다. 세척 후 알코올 농도를 70%, 80%, 90%, 100% 순으로 증가시키면서 각각 5초간 처리하고 자일렌을 처리하여 조직의 절편을 탈수시켰다. 말리놀을 이용하여 마운팅을 실시하고 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.

TUNEL(dUTP-digoxigenin nick-end-labeling) 염색 또한 제작된 조직의 절편의 파라핀 제거를 위해 조직 슬라이드를 자일렌에 5분씩 3번 처리하였다. 그 후 100%, 90%, 80%, 70% 알코올 순으로 각각 5분씩 처리하였다. 이 후 promega TUNEL 시스템 키트를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포자멸사가 진행중인 세포를 염색하고 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 15로 도시하였으며, 단위 면적당 형광 세기를 정량화 한 결과를 도 16으로 도시하였다. 그 결과 PUOX 나노입자가 세포자멸사를 억제시킨다는 점을 확인하였다.

실험예 12. 형광물질을 이용한 PUOX 나노입자의 생물학적 분포 확인

소수성 PUOX의 간 손상 치료를 위한 약물전달물질로의 잠재성을 추가로 평가하기 위해 생체 분포를 조사하였다. IR780을 발색단으로 사용하였으며, PUOX에 이를 포접하여 사용하였다. 꼬리 정맥주사로부터 2시간 후 IR780은 간, 신장 및 폐에 축적되었으며, 특히 주로 간에서 축적되었다는 점을 확인하였다. 이를 도 17로 도시하였으며, 형광 세기 수치를 정량화하여 도 18로 도시하였다.

실험예 13. PUOX 나노입자의 생체 안정성 평가

PUOX 나노입자를 10mg/kg의 농도로 생쥐의 꼬리 정맥에 주사하였다. 주사 한 후 일주일 뒤에 생쥐의 간, 심장, 폐, 이자 및 콩팥을 적출하여 각 장기의 절편에 대해 조직학적 분석을 수행하였으며, 이를 도 19로 도시하였다. 또한, 생쥐의 혈액을 채취하여 간 손상을 나타내는 ALT 수치를 검사하였으며, 이를 도 20으로 도시하였다. 실험 결과 어떠한 물질도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 특별한 차이가 없는 것으로 보아 PUOX 나노입자는 생체 안정성을 갖는 것으로 평가하였다.

실험예 14. PUOX 나노입자 처리에 따른 인간 지방유래 줄기세포의 세포 증식 및 생존 능력 평가

인간 지방유래 줄기세포에 PUOX 나노입자를 0μg/ml, 5.38μg/ml, 26.88μg/ml 및 107.52μg/ml의 농도로 21일간 2일에 1회씩 처리하였으며, CCK-8 분석 및 live/dead 분석을 통해 세포 증식 및 생존 능력을 평가하였다. 그 결과, 인간 지방유래 줄기세포에 처리되는 PUOX 나노입자의 농도가 높아짐에 따라 세포의 증식이 증가하는 것을 관찰하였으며(도 21의 (1)), 생존 세포를 초록색으로 염색하는 칼세인 AM과 사멸 세포를 붉은색으로 염색하는 에티듐-D1을 처라힌 뒤 PUOX 나노입자가 21일 동안 처리된 세포의 생존을 확인한 결과에서는 인간 지방유래 줄기세포에 처리되는 PUOX 나노입자의 농도가 높아지더라도 세포가 모두 생존하며, 세포의 수가 증가하는 것을 관찰하였다(도 21의 (2)).

실험예 15. PUOX 나노입자의 처리에 따른 인간 지방유래 줄기세포의 골 분화 능력 평가

인간 지방유래 줄기세포에 PUOX 나노입자를 0μg/ml, 5.38μg/ml, 26.88μg/ml 및 107.52μg/ml의 농도로 14일 동안 2일에 1회씩 처리하였으며, Alizarin Red S 염색법을 통해 골 분화 능력을 평가하였다. 인간 지방유래 줄기세포에 처리되는 PUOX 나노입자의 농도가 높아짐에 따라, 골 분화 효율이 증가하는 것을 확인하였다(도 22의 (1)). 염색된 Alizarin Red S를 10%의 세틸피리디늄 클로라이드를 이용하여 추출한 후, 562nm의 파장에서 흡광도를 측정한 결과 인간 지방유래 줄기세포에 처리되는 PUOX 나노입자의 농도가 높아짐에 따라서 Alizarin Red S가 많이 염색된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 107.52μg/ml의 PUOX 나노입자를 처리하였을 때, 유의미하게 대조군에 비해 골 분화 효율이 증가하였다는 점을 확인하였다(도 22의 (2)).

실험예 16. PUOX 나노입자의 골 재생 능력 평가

8주령의 암컷 SD쥐의 오른쪽 넓적다리에 2mm 지름의 드릴을 이용하여 골 손상을 유도하였다(도 23의 (1)). 골 손상된 부위에 PBS 또는 100μg의 PUOX가 담지된 콜라겐 시트를 끼우고, 8주의 회복기간 후 골 재생 능력을 평가하였으며, 조직학적 분석을 수행하였다. 마이크로 CT를 이용한 골 재생 능력 평가에서는 PBS 담지 콜라겐 시트를 처리한 군(PBS)에 비해 PUOX 나노입자가 담지된 콜라겐 시트를 처리한 군(PUOX)에서 모의 시험군(Sham)에 가깝게 골 재생이 유도된 것을 확인하였다(도 23의 (2)). 또한, 골 밀도(BMD)가 PBS 군에 비해 PUOX 군에서 Sham에 가깝게 나타났다(도 23의 (3)).

조직학적 분석에서는 파라핀침투를 통해 파라핀 블록을 만든 뒤, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 6μm 두께의 조직 절편을 얻은 후 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색법 및 메이슨 트리크롬(Masson’s trichrome) 염색법을 이용하여 조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과 마이크로 CT에서의 결과와 마찬가지로 PBS 군에 비해서 PUOX 군에서 Sham과 유사한 정도로 골 재생이 유도되었다는 점을 확인하였다(도 24).

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
   [화학식 1]
   

   

   
   식 중에서, 상기 R은 C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, C_6-10 아릴 및 C_{1- 6}알킬렌-C_{6- 10}아릴 중 선택되며, 상기 n은 10 내지 200이다.
2. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 나노입자.
3. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항산화제 조성물.
4. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 간 질환 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 간 질환은 간염, 간독성, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변, 담즙울체, 간허혈, 간 농양, 간성 혼수 및 간 위축증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 간 질환 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 세포 증식제.
7. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 분화제.
8. 제1항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 골 재생제.

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