CN114341148A - 抗衰老和抗炎前药及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了抗衰老和抗炎前药，其由细胞毒性剂设计，通过化学修饰细胞毒性剂以在体内递送前药后掺入可被SA‑β‑gal切割的位点，以释放活性母体药物。前药包括优选被乙酰化的半乳糖基部分、苄氧基羧基和细胞毒性剂部分。通过向受试者施用治疗有效量的抗衰老前药，抗衰老前药用于在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞和/或减少急性或慢性炎症反应。所公开的组合物可用于减轻受试者中与衰老相关疾病或病症或炎性病症例如病毒介导的炎症相关的一种或多种症状。

Description

抗衰老和抗炎前药及其使用方法

发明领域

本发明涉及能够选择性杀死衰老细胞而不是非衰老细胞的化合物，即抗衰老化合物，及其使用方法。

发明背景

衰老是生理退化、慢性发病率增加和年龄特异性死亡率的主要危险因素(Lopez-Otin,等人,Cell 153,1194-1217(2013))。在衰老过程中，衰老细胞在多个组织中积累并导致组织功能障碍(van Deursen,等人,Nature 509,439-446(2014)；McHugh,等人,J CellBiol 217,65-77(2018))。衰老细胞还会分泌多种促炎因子，称为衰老相关分泌表型(SASP)，其导致与年龄相关的身体衰退(Coppe,等人,PLoS Biol 6,2853-2868(2008)；Coppe,等人,Annu Rev Pathol 5,99-118(2010))。消除衰老细胞已成为改善年龄相关疾病和改善健康的有吸引力的潜在方法(Xu等人,Nat Med 24,1246-1256(2018)；Baker等人,Nature 479,232-236(2011)；Baker等人,Nature 530,184-189(2016).)。选择性杀死衰老细胞的化合物，称为‘抗衰老药物(senolytics)’，已经引起了相当大的兴趣，并揭示了抗凋亡途径(Zhu等人,Aging Cell 14,644-658(2015),Chang等人,Nat Med 22,78-83(2016))、HSP90(Fuhrmann-Stroissnigg等人,Nat Commun 8,422(2017))，和FOXO4-p53复合体(Baar等人,Cell 169,132-147e116(2017))可以定向实现这一目标。然而，由于衰老细胞的复杂性和异质性，多种衰老细胞类型的特异性和有效清除仍然具有挑战性(Kirkland,等人J AmGeriatr Soc 65,2297-2301(2017)；Lozano-Torres等人,Nature Reviews Chemistry 3,426-441(2019))。细胞衰老损害组织再生的能力并驱动慢性低度炎症，其加剧老化过程。仍然需要开发新策略，其允许选择性删除广谱细胞类型或组织中的衰老细胞，用于抗衰老干预。

本发明的一个目的是提供用于选择性靶向衰老细胞的组合物。

本发明的另一个目的是提供用于减轻有需要的受试者中的炎症的组合物。

本发明的另一个目的是提供在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞的方法。

本发明的又一个目的是提供在有需要的受试者中改善与衰老相关病症相关的一种或多种症状的方法。

本发明的另一个目的是提供用于改善与病毒诱导的炎症相关的一种或多种症状的方法。

发明概述

提供了具有抗衰老作用和抗炎作用的前药。前药由细胞毒性剂(母体细胞毒性剂)设计，通过化学修饰细胞毒性剂以掺入可被SA-β-gal切割的位点(以释放活性母体细胞毒药物)，然后在体内递送前药，以便优先杀死衰老细胞。前药包括优选通过乙酰化修饰的半乳糖基部分(本文中，修饰的半乳糖部分)、苄氧羰基和细胞毒性部分(由母体细胞毒性剂提供)。在优选的实施方案中，用于制备前药的细胞毒性母体细胞毒性药物缺少苯酚基团。缺少酚基的特别优选的细胞毒性剂是例如吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)和5'-脱氧-5-氟胞苷。在实施方案中，前药可以是晶体形式。

优选的乙酰化半乳糖部分是D-半乳糖四乙酸酯部分，如下所示。

在另一个实施方案中，可以从半乳糖基部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)乙酰基(Ac)基团。

特别优选的苄氧羰基如下所示。

3-硝基-4-氧-苄基羧基

在另一个实施方案中，可以从上述苄氧羰基中去除NO₂。

还公开了在有需要的受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的一种或多种所公开的抗衰老前药。在一些实施方案中，活性剂选择性地杀死经历癌基因诱导的衰老的细胞；经历药物诱导的衰老的细胞；经历年龄诱导的衰老的细胞；疾病相关衰老的细胞(cells disease-associated senescence)和/或经历放射诱导的衰老的细胞。

还提供了在有需要的受试者中减轻炎症的方法。所公开的组合物可用于改善与促炎相关的症状，例如过度激活的巨噬细胞积累(和相关细胞因子的减少)。在特别优选的实施方案中，所公开的组合物可以施用于有需要的受试者，以减少与病毒感染，例如冠状病毒(CoV)感染，更具体地，SARS-CoV或SARS-CoV2感染相关的炎症反应。在该实施方案中，以有效量施用组合物以减少受试者中的一种或多种巨噬细胞，优选SA-β-gal阳性巨噬细胞。

所公开的组合物可用于减少受试者中与衰老相关疾病或病症相关的一种或多种症状和/或受试者中一种或多种炎症相关病症，其包含一长串其他病理学，包括神经病学(例如脑动脉瘤、阿尔茨海默氏病和帕金森病)、肺(例如特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化)、眼科(例如白内障、青光眼、黄斑变性)、肌肉骨骼(例如少肌症、椎间盘退变、骨关节炎)、心血管(例如动脉粥样硬化、心脏纤维化、主动脉瘤)、肾(例如慢性肾病、移植并发症)、膝的骨关节炎和其他疾病，如糖尿病、粘膜炎、高血压、肝纤维化和骨髓纤维化(OMF)。

附图简述

图1A-B是显示验证其选择性杀死衰老细胞的能力的图。图1A在SSK1处理(0.5μM)、复制诱导的衰老小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)及其非衰老对应物中SSK1代谢为吉西他滨。图1B与增加剂量的SSK1温育的衰老、非衰老和静止的新生成纤维细胞(NBF)中活细胞的定量(n＝2-4)；用于(图1B)的单因素方差检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图1C和D显示了吉西他滨对衰老和非衰老细胞的影响(图1C)。与增加剂量的吉西他滨温育的不同代的MEF中活细胞的定量(n＝3)。(图1D)与增加剂量的吉西他滨温育的非衰老HEF和由不同应激源诱导的衰老HEF中活细胞的定量(n＝3)。图1E显示了用于测量shControl和shGLB1-1和-2敲减(knockdown)处理中GLB1表达的RT-qPCR(n＝3)，****P<0.0001，未配对t检验。图1F显示了用运载体或SSK1(0.5μM)处理的GLB1敲减(shGLB1-1和-2，n＝4)或shControl(n＝2)衰老细胞的细胞活力。

图2A显示了SSK1对由诱导细胞凋亡驱动的衰老细胞的影响。(图2A上图)通过膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色测量运载体或SSK1处理的衰老细胞中细胞凋亡的代表性流式细胞术图。(图2A，底部条形图)运载体或SSK1处理的衰老细胞群体中活细胞(Q4：PI-膜联蛋白V-)和凋亡(门2和3：PI+膜联蛋白V+和PI-膜联蛋白V+)细胞百分比的定量(n＝2)，*P<0.05，未配对t检验。图2B和2C显示了SSK1 p38 MAPK活化在衰老细胞中的影响。(图2B)phos-p38MAPK和γH2AX在吉西他滨或SSK1处理的衰老细胞中的蛋白质印迹。(图2C)用运载体、SSK1(0.5μM)或SSK1和p38抑制剂的组合处理的活细胞的定量(n＝3)。图2D用增加剂量的SSK1处理的活力非衰老和致癌基因诱导的(Kras GV12)、小分子诱导的(依托泊苷，5μM)和放射诱导的(10Gy)衰老MEF的定量(n＝3)。图2E来自2月龄小鼠的活力非衰老小鼠肺成纤维细胞和增加剂量的SSK1处理的23月龄小鼠的衰老肺成纤维细胞的定量(n＝4)。图2F SSK1处理后活力非衰老人类胚胎成纤维细胞(HEF)和由复制、小分子(依托泊苷，10μM)或放射(10Gy)诱导的衰老人类胚胎成纤维细胞(HEF)的定量(n＝3)。图2G与增加剂量的SSK1温育的非衰老和复制诱导的衰老人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的活力定量(n＝4)。数据是均值±s.e.m，未配对t检验用于(图2E)和(图2G)，单因素方差检验用于(图2D)和(图2F)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。图2H-L显示了SSK1对博来霉素诱导的肺损伤模型中SA-β-gal阳性衰老细胞和肺纤维化的影响的研究。(图2H)博来霉素诱导的肺损伤模型的实验设计。(图2I)从用运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理的博来霉素损伤小鼠肺的SA-β-gal染色的代表性图像获得的SA-β-gal阳性细胞的定量(运载体处理的，n＝6；SSK1处理的，n＝5)。(图2J)通过RT-qPCR，在用运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理的博来霉素损伤小鼠的肺中衰老和纤维化相关基因的表达(运载体处理的，n＝11；SSK1处理的，n＝12)。(图2K)运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理后，来自博来霉素损伤小鼠的肺石蜡切片的纤维化比例的定量(运载体处理的，n＝12；SSK1处理的，n＝12)。(图2L)在假手术(n＝18)和用运载体(n＝16)或SSK1(0.5mg/kg)(n＝18)处理的博来霉素损伤小鼠中通过跑步机测试测量的耗尽距离(exhaustion distance)(m)。每个数据点代表一只单独的小鼠。数据为均值±s.e.m.**P<0.01，****P<0.0001，未配对t检验。

图3A-J显示了年老小鼠中SSK1对衰老细胞和SASP的影响的研究。(图3A)SSK1处理年老小鼠的实验设计。(图3B至图3D)肾(图3B)、肝(图3C)和肺(图3D)中SA-β-gal阳性细胞的定量(运载体和SSK1处理的，n＝8)。比例尺，200μm，每个数据点代表一只单独的小鼠。(图3E和图3F)通过RT-qPCR分析的p16、p21、IL1α、TNFα和其他SASP因子在肝(图3E)(运载体处理的，n＝6；SSK1处理的，n＝8)和肾(图3F)中的表达(运载体处理的，n＝8；SSK1处理的，n＝7)。(图3G-J)来自SSK1(0.5mg/kg)或运载体处理的年老小鼠的血清中的IL1α(图3G)、IL6(图3H)、CXCL1(图3I)和TNFα(图3J)蛋白质水平，如通过ELISA测量。对于(图3G至图3H)：运载体处理的，n＝5，SSK1处理的，n＝6；对于(图3J)：运载体处理的，n＝7，SSK1处理的，n＝8，每个数据点代表一只单独的小鼠。数据是均值±s.e.m，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001，未配对t检验。

图4A-J显示了关于SSK1对年老小鼠身体机能的影响的研究。图4A至E.用运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理的年老雌性小鼠的最大转棒时间(图4A)、跑步机距离(图4B)、抓握力(图4C)、越过平衡木的时间(图4D)和饲养探索时间(图4E)的量化)。数据为均值±s.e.m，n＝每组6-13只小鼠，每个数据点代表一只单独的小鼠*P<0.05，**P<0.01，未配对t检验。(图4F)左图，在用运载体或SSK1处理之前和之后对年老小鼠的最大转棒时间的定量。右图，处理后的最大转棒时间减去运载体(n＝10)或SSK1(0.5mg/kg，n＝5)处理前的最大转棒时间。(图4G)左图，在运载体或SSK1处理之前和之后对年老小鼠的跑步机距离的定量。右图，处理后的跑步机距离减去运载体(n＝10)或SSK1(0.5mg/kg，n＝5)处理前的跑步机距离。数据为均值±s.e.m，每个数据点代表一只单独的小鼠，*P<0.05，**P<0.01，未配对t检验。

图4H运载体或SSK1注射期间年老雌性小鼠的体重。(图4I)用运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理的年老雄性小鼠的最大转棒时间(左图)、跑步机距离(中图)和抓握力(右图)的定量。数据为均值±s.e.m。运载体处理的，n＝16；SSK1处理的，n＝17，每个数据点代表一只单独的小鼠。*P<0.05，***P<0.001，未配对的双向t检验。(图4J)与其他抗衰老化合物相比，SSK1处理改善了转棒、跑步机和抓握力功能。

图5A显示了与运载体处理相比，SSK1(0.5mg/kg)处理对来自年老小鼠的肝和肾中衰老相关GSEA基因组(Fridman衰老升高)的影响。图5B显示了SSK1处理对年老肝和肾中年龄相关特征的影响。数据显示了统计学上显著的基因组的GSEA：与运载体相比，用SSK1处理的年老小鼠中肝的Kyng Werner Syndyom和Normal Aging Up下调；和统计学上显著的基因组的GSEA：与运载体相比，用SSK1处理的年老小鼠肾的Rodwell Aging Kidney Up下调。图5C和5D显示肝(图5C)和肾(图5D)中统计学上显著的基因组的GSEA：Hallmark炎症反应。图5E显示肝中统计学上显著的基因组的GSEA：与年轻小鼠相比，通过NF-κB的Hallmark炎症TNFα信号转导、Hallmark IL6 Jak Stat3信号转导和Hallmark补体在来自年老小鼠的肝中富集，并且与运载体相比，在用SSK1处理的年老小鼠中下调。图5F显示肾中统计学上显著的基因组的GSEA。与年轻小鼠相比，通过NF-κB的Hallmark炎症TNFα信号转导、Hallmark IL6Jak Stat3信号转导和Hallmark补体在来自年老小鼠的肝中富集，并且与运载体相比，在用SSK1处理的年老小鼠中下调。

图6A显示了在运载体或SSK1(0.5mg/kg)处理后，年轻小鼠和年老小鼠的肝F4/80染色的定量(年轻，n＝5；运载体处理的，n＝6；SSK1-处理的，n＝8)。比例尺，200μm。图6B显示了RNA-seq数据的xCell分析以预测肝年轻(4mouth)和年老小鼠(19mouth)中巨噬细胞浸润的变化(年轻，n＝5；年老，n＝5)(左图)和RNA-seq数据的xCell分析以预测用SSK1处理后年老小鼠(22mouth)的巨噬细胞浸润的变化(运载体处理的，n＝6；SSK1处理的，n＝8)(右图)。图6C显示了RNA-seq数据的xCell分析以预测假手术(Sham)的肺和用运载体、SSK1(0.5mg/kg)处理的博来霉素诱导的损伤肺中巨噬细胞浸润的变化(假手术，n＝6；运载体处理的，n＝6；SSK1处理的，n＝6)。图6D-G与年轻小鼠相比，年老小鼠的肝(图D)和肾(图F)中上调基因的GO Terms；SSK1处理的年老小鼠相对于运载体处理的年老小鼠的肝(图E)和肾(图G)中下调基因的GO Terms。图6H和6I与年轻小鼠相比，年老小鼠的肝中下调基因的GOTerms(图H)和SSK1处理的年老小鼠相对于运载体处理的年老小鼠的上调基因的GO Terms(图I)。D和E中的Terms(F和G；H和I)都为深灰色。图6J来自用运载体或SSK1处理的年老小鼠的肝石蜡切片的纤维化比例的定量(运载体处理的，n＝5；SSK1处理的，n＝7)。

图7A是血清生化测试，其显示了在运载体、SSK1(0.5mg/kg)或吉西他滨(Gem，0.5mg/kg)处理8周后年老小鼠中的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(CREA)和尿酸(UA)的水平。图7B显示血液的常规分析，其显示了运载体、SSK1(0.5mg/kg)或吉西他滨(Gem，0.5mg/kg)处理8周后年老小鼠的粒细胞、白细胞、单核细胞和红细胞的数量。(运载体处理的，n＝10；SSK1处理的，n＝9；吉西他滨处理的，n＝11)。图7C显示了用增加剂量的SSK1处理的小鼠的血清生化测试。运载体和SSK1(3、10、30、60、100mg/kg)处理5周，每周注射3次后年老小鼠中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐(CREA)和尿酸(UA)的水平。(每组分别为n＝5、5、5、4、4、4)。图7D显示了用增加剂量的SSK1处理的小鼠的血液的常规分析。用运载体和SSK1(3、10、30、60、100mg/kg)处理5周，每周注射3次后年老小鼠的粒细胞、白细胞、单核细胞和红细胞的数量。每组分别为n＝5、5、5、4、4、4。所有数据为均值±s.e.m。每个数据点代表一只单独的小鼠，使用未配对的双尾t检验计算统计学显著性。

图8.SSK1在SARS-CoV-2感染的晚期有效修复COVID-19肺炎(A)晚期SSK1干预的实验设计方案。黑点，在指定时间点临床征兆和血液样品的测量。红点，处理。棕色三角形，安乐死后的样品收集。(B)感染SARS-CoV-2的猴子在22和32dpi之间用运载体、低剂量(0.5mg/kg)或高剂量(2.0mg/kg)SSK1的体重变化。(C)肺的尸检图像显示SSK1处理减少了感染SARS-CoV-2的猴子的肺部病变。左图，运载体处理的；中间图，0.5mg/kg；右图，SSK1处理，2.0mg/kg。白色圆圈，肺部病变。(D)H&E染色图像显示SSK1处理改善了感染SARS-CoV-2的猴子的肺炎。顶部，从左到右，用运载体、0.5mg/kg或2.0mg/kg SSK1处理的猴子的肺的代表性H&E图像；底部，顶部一行中加框区域的高倍放大图像。箭头，出血。星号，水肿。比例尺，顶部：200μm；底部：50μm。另请参见图12。

图9.SSK1在肺恢复过程中减少巨噬细胞浸润并减少炎症。(A)从用运载体、0.5mg/kg或2.0mg/kg SSK1处理的SARS-CoV-2感染的猴子收集的肺组织中CD68的免疫组织化学(IHC)分析。顶部，低倍放大图像；底部，顶部一行中加框区域的高倍放大图像。比例尺，顶部：100μm；底部：25μm。(B)处理后肺组织中CD68阳性细胞的免疫组织化学染色的定量。每只动物在20个随机视野(0.75mm2)中进行分析，每组3只动物。每个数据点代表IHC载玻片中的一个独立视野。数据利用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，所有误差条代表SEM，**P<0.01，****P<0.0001。(C)21至28dpi之间来自年老猴子的血清样品中炎性细胞因子的浓度变化。(D)SSK1处理(2.0mg/kg)之前和之后感染SARS-CoV-2的猴子的血清样品中IL-18的浓度测量。箭头，施用的起点。

图10.SSK1在早期施用后减轻感染SARS-COV-2的恒河猴(Rhesus Macaques)的临床症状(A)早期SSK1干预的实验设计方案。黑点，在指定时间点临床征兆、血液样品和X射线的测量。红点，处理天数。棕色三角形，安乐死后的样品收集。在0dpi进行病毒接种。(B)感染后和处理期间的体温监测。(C)在0、3和6dpi时动物胸部的背腹X光片图像。红色圆圈标记代表肺间质浸润的磨玻璃影。R，动物的右侧。(D)在感染后的不同时间点通过RT-qPCR检测鼻子、喉咙、肛门拭子和血液样品中的病毒RNA。L.O.D.：检测限。另请参见图13。

图11.早期SSK1干预减少肺部炎症损伤

恒河猴尸体肺组织的组织病理学检查(A)左列，H&E染色表明SSK1处理恢复了由SARS-CoV-2引起的增厚的肺泡隔。右列，左列中加框区域的高倍放大图像。比例尺，左：200μm；右：50μm。(B)AB-PAS染色显示SSK1处理恢复细支气管中的粘液分泌物。比例尺，100μm。(C)恒河猴的肺中炎性细胞因子的浓度。从半尸肺组织的上、中和下叶收集肺匀浆，并定量测试23种炎症相关细胞因子和趋化因子的水平。所测试的其他细胞因子和趋化因子的浓度没有显著差异(数据未显示)。未配对的双尾斯氏t检验，ns，不显著，**P<0.01。(D)SSK1处理期间对血清样品中IL-18的浓度测量。另请参见图14。

图12.(与图8相关)H&E染色的低倍放大图像显示SSK1处理改善了感染SARS-CoV-2的猴子的肺炎。圆圈显示间质性肺炎的区域。比例尺，500μm。

图13.(与图10相关)(A)用运载体或SSK1处理的感染SARS-CoV-2的猴子在0到7dpi之间的体重变化。(B)感染SARS-CoV-2的恒河猴的血液学变化。M1显示血液中白细胞(WBC)、淋巴细胞和单核细胞计数异常高的水平。(C)尸检时收集的感染SARS-CoV-2的恒河猴的组织中的病毒载量。L.O.D.：检测限。(D)在从感染SARS-CoV-2的恒河猴收集的BALF中确定病毒载量(顶部)和病毒滴度(底部)。

图14.(与图11相关)(A和B)用SSK1处理的感染SARS-CoV-2的恒河猴的肺和肝的总病理学。箭头和圆圈代表尸体剖检的肺或肝中的总损伤。(C)H&E染色显示SSK1处理改善了感染SARS-CoV-2的猴子的肺炎。圆圈显示间质性肺炎的区域。比例尺，500μm。(D)H&E染色显示M1有局部肺出血。比例尺，200μm。

图15.SSK2在处理72小时后以剂量依赖性方式选择性清除人胚胎成纤维细胞中的衰老细胞。A)非衰老和依托泊苷诱导的衰老HEF的β-半乳糖苷酶染色。B)与增加剂量的SSK2温育的依托泊苷诱导的衰老HEF中活细胞的定量；数据显示为均值±SD。每组N＝3。*P<0.05，**P<0.01。

图16.SSK1或SSK2对从骨关节炎患者中分离的原代人软骨细胞的活力的影响。A)用10μM SSK1、SSK2或运载体处理72小时后，通过流式细胞术对来自人OA组织的软骨细胞进行的细胞凋亡分析。B-C)膜联蛋白V阳性B)和活C)人OA软骨细胞在用10μM SSK1、SSK2或运载体处理72小时后的定量。

图17.SSK2处理48小时后，从人OA组织中分离的OA软骨细胞中衰老细胞的剂量依赖性消除。用增加浓度的SSK2处理72小时后对活的人OA软骨细胞进行的定量。数据显示为均值±SD。

发明详述

SA-β-gal是衰老的主要特征和广泛使用的衰老标志物(Dimri,等人,PNAS,92:9363-9367(1995)；Lee等人,Aging Cell 5,187-195(2006))，本文利用其活性来选择性代谢衰老细胞中的小分子(Lozano-Torres等人,J Am Chem Soc 139,8808-8811(2017))。本文公开的组合物和方法基于基于SA-β-ga的前药策略的开发，以释放活性母体药物以优先杀死衰老细胞。所公开的组合物可用于改善与促炎相关的症状，例如，响应于感染，例如病毒感染的活化巨噬细胞的过度积累。

I.定义

如本文所用，“细胞毒性部分”是指由母体细胞毒性剂提供的抗衰老前药的部分。

如本文所用，“细胞毒性剂”是指用于杀死细胞的化学品或药物。

如本文所用，“肠胃外施用”表示通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。

如本文所用，待处理的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。

如本文所用，“肠胃外施用”是指通过除通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。

如本文所用，待处理的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。

如本文所用，“抗衰老药物”相比于非衰老细胞选择性地杀死一种或多种衰老细胞。

如本文所用，“治疗有效的”或“有效量”表示所用组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状的量。这种改善只需要减少或改变，而不一定是消除。如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药物有效量”是同义词。本领域技术人员可以容易地确定合适的治疗量。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转疾病或病症的进展，基本上改善疾病或病症的临床症状或基本上预防疾病或病症的临床症状的出现。

如本文所用，“取代的”是指本文所述的化合物或官能团的所有允许的取代基。在最广泛的意义上，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。示例性的取代基包括但不限于卤素、羟基或含有任何数量碳原子，优选1-14个碳原子的任何其他有机基团，并且任选地包括线性、支链或环状结构形式的一个或多个杂原子，例如氧、硫或氮基团。代表性的取代基包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C₃-C₂₀环状、取代的C₃-C₂₀环状、杂环、取代的杂环、氨基酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、肽和多肽组。这样的烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰氨基、取代的酰氨基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C₃-C₂₀环状、取代的C₃-C₂₀环状、杂环、取代的杂环、氨基酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、肽和多肽基团可以进一步被取代。

杂原子例如氮可具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所述的有机化合物的任何允许的取代基。应理解，“取代”或“取代的”包括这样的隐含条件，即此类取代符合被取代原子和取代基的允许价数，并且该取代产生稳定的化合物，即不会自发经历转化如通过重排、环化、消除等转化的化合物。

除非另有专门和明确规定，术语“取代的”是指结构，例如化合物或更大的化合物上的部分，而不管该结构是如何形成的。该结构不限于通过任何特定方法制成的结构。

如本文所用，“芳基”是指C₅-C₂₆元芳族、稠合芳族、稠合杂环或双芳族环系统。如本文所用，广义定义的“芳基”包括5-、6-、7-、8-、9-、10-、14-、18-和24-元单环芳族基团，其可包括从零到四个杂原子，例如苯(benzene)、萘(naphthalene)、蒽(anthracene)、菲(phenanthrene)、chrysene、芘(pyrene)、心环烯(corannulene)、晕苯(coronene)等。

“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环(即“稠合环”)共有的，其中至少一个环是芳族的，例如其他环状环或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。

术语“取代芳基”是指芳基，其中一个或多个芳环上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、羰基(例如酮、醛、羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、亚氨基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基(例如CF₃、-CH₂-CF₃、-CCl₃)、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

“杂环”、“杂环”和“杂环基”可互换使用，并且是指通过含有3-10个环原子，优选5-6个环原子的单环或双环的环碳或氮原子连接的环状基团，由碳和一到四个杂原子组成，每个杂原子选自非过氧化物氧、硫和N(Y)，其中Y不存在或为H、O、C₁-C₁₀烷基、苯基或苄基，并且任选地含有1-3个双键并且任选地被一个或多个取代基取代。根据定义，杂环基不同于杂芳基。杂环的实例包括但不限于哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、二氢呋喃[2,3-b]四氢呋喃、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、吡喃基、2H-吡咯基、4H-喹啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、6H-1,2,5-噻二嗪基。杂环基团可以任选地被如上对烷基和芳基定义的一个或多个取代基取代。

术语“杂芳基”是指C₅-C₂₆元芳族、稠合芳族、双芳族环系统或其组合，其中一个或多个芳环结构上的一个或多个碳原子已被杂原子取代。合适的杂原子包括但不限于氧、硫和氮。如本文所用，广义定义的“杂芳基”包括5-、6-、7-、8-、9-、10-、14-、18-和24-元单环芳族基团，其可以包括一至四个杂原子，例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。杂芳基团也可称为“芳基杂环”或“杂芳族化合物”。“杂芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环(即“稠合环”)共有的，其中至少一个环是杂芳族的，例如其他环或多个环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂环或其组合。杂芳环的实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、肉啉基(cinnolinyl)、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、呋喃基、呋咱基(furazanyl)、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、二氢吲哚基、吲哚啉嗪基(indolizinyl)、吲哚基(indolyl)、3H-吲哚基、isatinoyl、异苯并呋喃基、isochromanyl、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲二氧基苯基、萘啶基、八氢异喹啉基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、酚黄素基(phenoxathinyl)、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、苯硫基和呫吨基。一个或多个环可以被取代，如下文对“取代的杂芳基”所定义。

术语“取代的杂芳基”是指其中一个或多个杂芳基环上的一个或多个氢原子被一个或多个取代基取代的杂芳基，所述取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、羰基(例如酮、醛、羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、亚氨基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基(例如CF₃、-CH₂-CF₃、-CCl₃)、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

如本文所用，“烷基”是指饱和脂肪族基团的基团，包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，C₁-C₃₀用于直链，C₃-C₃₀用于支链)，优选20个或更少，更优选15个或更少，最优选10个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳原子。在整个说明书、实施例和权利要求中使用的术语“烷基”(或“低级烷基”)旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指具有一个或多个取代基的烷基部分替换烃主链的一个或多个碳上的氢。此类取代基包括但不限于卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。

除非另外指定碳原子数，否则本文所用的“低级烷基”是指如上定义的烷基，但在其主链结构中具有1至10个碳原子，更优选1至6个碳原子。同样，“低级烯基”和“低级炔基”具有相似的链长。在整个申请中，优选的烷基是低级烷基。在优选的实施方案中，本文指定为烷基的取代基是低级烷基。

“烷基”包括在烃基以及杂烷基的一个或多个碳原子处的一个或多个取代。合适的取代基包括但不限于卤素，例如氟、氯、溴或碘；羟基；-NRR’，其中R和R’独立地为氢、烷基或芳基，并且其中氮原子任选地被季铵化；-SR，其中R是氢、烷基或芳基；-CN；-NO₂；-COOH；羧酸盐；-COR、-COOR或CON(R)₂，其中R是氢、烷基或芳基；叠氮化物、芳烷基、烷氧基、亚氨基、膦酸酯、次膦酸酯、甲硅烷基、醚、磺酰基、磺酰氨基、杂环基、芳族或杂芳族部分、卤代烷基(例如-CF₃、-CH₂-CF₃、-CCl₃)；CN；-NCOCOCH₂CH₂；NCOCOCH；-NCS；及其组合。

本领域技术人员将理解，如果合适，烃链上被取代的部分本身可以被取代。例如，取代烷基的取代基可包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰氨基、磷酰基(包括膦酸酯和次膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、磺酰氨基、氨磺酰基、亚砜和磺酸酯)，和甲硅烷基，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸盐和酯)、卤代烷基、-CN等。环烷基可以以相同方式被取代。

术语“烯基”和“炔基”是指长度和可能的取代与上述烷基相似但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂族基团。

术语“取代的烯基”是指具有取代烃主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烯基部分。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“取代的炔基”是指具有替换烃主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的炔基部分。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

如本文所用，“氨基”和“胺”是本领域公认的并且指取代和未取代的胺，例如，可以由以下通式表示的部分：

其中，R、R’和R”各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、-(CH₂)_m-R”’或R和R’连同它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中仅一个可以是羰基，例如，R和R’一起与氮不形成二酰亚胺。在优选的实施方案中，R和R’(和任选的R”)各自独立地代表氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基或-(CH₂)_m-R”’。因此，本文使用的术语“烷基胺”是指具有连接其上的取代或未取代的烷基的如上定义的胺基团(即R、R’或R”中的至少一个是烷基)。

如本文所用，“羰基”是本领域公认的并且包括可由以下通式表示的部分：

其中X是键，或代表氧或硫，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”或药学上可接受的盐，R’代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基或(CH₂)_m-R”；R”代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。其中X为氧且R如上定义，该部分也称为羧基。当X为氧且R为氢时，该式代表“羧酸”。其中X为氧且R’为氢时，该式代表“甲酸”。其中X为氧且R或R’不是氢时，该式代表“酯”。通常，其中上式的氧原子被硫原子替换时，该式代表‘硫代羰基’基团。其中X是硫且R或R’不是氢时，该式代表‘硫酯’。其中X是硫且R是氢，该式代表‘硫代羧酸’。其中X是硫且R’是氢时，该式代表‘硫代甲酸酯’。其中X是键且R不是氢时，上式代表‘酮’。其中X是键且R是氢时，上式代表‘醛’。

术语“取代的羰基”是指如上所定义的羰基，其中R、R’或部分

与其连接的基团中的一个或多个氢原子被独立取代。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“羧基”如上对下式所定义

并且更具体地由式-R^ivCOOH定义，其中R^iv是烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、烷芳基、芳烷基、芳基或杂芳基。在优选的实施方案中，直链或支链烷基、烯基和炔基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，C₁-C₃₀用于直链烷基，C₃-C₃₀用于支链烷基，C₂-C₃₀用于直链烯基和炔基，C₃-C₃₀用于支链烯基和炔基)，优选20或更少，更优选15或更少，最优选10或更少。同样，优选的环烷基、杂环基、芳基和杂芳基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳原子。

术语“取代的羧基”是指如上所定义的羧基，其中R^iv中的一个或多个氢原子被取代。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

如本文所用，“杂烷基”是指含有至少一个杂原子的直链或支链、或环状含碳基团、或其组合。合适的杂原子包括但不限于O、N、Si、P和S，其中氮、磷和硫原子任选地被氧化，并且氮杂原子任选地被季铵化。

饱和烃基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基以及其同系物和异构体，例如，正戊基、正己基、正庚基、正辛基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基和3-丁炔基。

术语“烷氧基(alkoxyl)”或“烷氧基(alkoxy)”、“芳氧基(aroxy)”或“芳氧基(aryloxy)”一般描述由式-OR^v代表的化合物，其中R^v包括但不限于取代或未取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、环烯基、杂环烯基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂烷基、烷芳基、烷基杂芳基。

如本文所用，术语“烷氧基”或“烷氧基”是指其上连接有氧基的如上定义的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。“醚”是由氧共价连接的两种烃。因此，使烷基成为醚的烷基的取代基是或类似于烷氧基，例如可以由-O-烷基、-O-烯基和-O-炔基之一代表。如果化合价允许，术语烷氧基还包括环烷基、杂环基、环烯基、杂环烯基和芳烷基，其具有连接到至少一个碳原子上的氧基。

术语“取代的烷氧基”是指具有替换烷氧基主链的一个或多个碳上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烷氧基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“烷硫基”是指连接有硫基的如上定义的烷基。“烷硫基”部分由-S-烷基代表。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基等。术语“烷硫基”还包括其上连接有硫基团的环烷基。

术语“取代的烷硫基”是指具有替换烷硫基主链的一个或多个碳原子上的一个或多个氢原子的一个或多个取代基的烷硫基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

“芳硫基”是指-S-芳基或-S-杂芳基，其中芳基和杂芳基如本文所定义。

术语“取代的芳硫基”代表-S-芳基或-S-杂芳基，其具有替换本文定义的芳基和杂芳基环的一个或多个环原子上的氢原子的一个或多个取代基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

如本文所用，“芳烷基”是指被取代或未取代的芳基或杂芳基取代的烷基。

如本文所用，“烷芳基”是指被取代或未取代的烷基取代的芳基(例如，芳族或杂芳族基团)。

术语“酰胺”或“酰氨基”可互换使用，指“未取代的酰氨基”和“取代的酰氨基”并由通式代表：

其中，E不存在，或E为取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环基，其中独立于E，R和R’各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代的或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’或R和R’连同它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m是0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中只有一个可以是羰基，例如，R和R’与氮一起不形成二酰亚胺。在优选的实施方案中，R和R’各自独立地代表氢原子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基或-(CH₂)_m-R”’。当E为氧时，形成氨基甲酸酯。如本领域普通技术人员所理解的，氨基甲酸酯不能与另一种化学物质连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。

术语“磺酰基”由下式代表

其中E不存在，或E为烷基、烯基、炔基、芳烷基、烷芳基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，其中独立于E，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’，或E和R与它们所连接的S原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。在优选的实施方案中，E和R中仅一个可以是取代或未取代的胺，以形成“磺酰胺(sulfonamide)”或“磺酰氨基”。取代或未取代的胺如上所定义。

术语“取代的磺酰基”代表其中E和R独立地被取代的磺酰基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“磺酸”是指如上定义的磺酰基，其中R为羟基，且E不存在，或E为取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳基。

术语“硫酸酯”是指如上定义的磺酰基，其中E为不存在，氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义，并且R独立地为羟基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义。如本领域普通技术人员所理解的，当E是氧时，硫酸酯不能与另一种化学种类连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。

术语“磺酸酯”是指如上定义的磺酰基，其中E为如上定义的氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，并且R独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’，R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；m为0或1至8的整数。如本领域普通技术人员所理解的，当E为氧时，磺酸酯不能与另一种化学种类连接，例如形成氧-氧键或其他不稳定键。

术语“氨磺酰基”是指磺酰胺或由下式代表的磺酰胺

其中E不存在，或E是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环基，其中E、R和R’各自独立地代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’，或R和R’与它们所连接的N原子一起构成在环结构中具有3到14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m是0或1至8的整数。在优选的实施方案中，R和R’中只有一个可以是羰基，例如，R和R’与氮一起不形成二酰亚胺。

术语“亚砜”由下式表示

其中E不存在，或E为烷基、烯基、炔基、芳烷基、烷芳基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基，其中独立于E，R代表氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的胺、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’，或E和R与它们所连接的S原子一起构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。

术语“膦酰基”由下式表示

其中E不存在，或E是取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代的或未取代的杂环基，其中，独立于E，R^vi和R^vii独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的羰基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环、取代或未取代的烷芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的芳基、或取代或未取代的杂芳基、-(CH₂)_m-R”’，或R和R’连同它们所连接的P原子构成在环结构中具有3至14个原子的杂环；R”’代表羟基、取代或未取代的羰基、芳基、环烷基环、环烯基环、杂环或多环；并且m为0或1至8的整数。

术语“取代的膦酰基”代表其中E、R^vi和R^vii独立地被取代的膦酰基。此类取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“磷酰基”定义这样的磷酰基，其中E不存在，是如上所定义的氧、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，并且独立于E，R^vi和R^vii独立地为羟基、烷氧基、芳氧基、取代的烷氧基或取代的芳氧基，如上定义。当E是氧时，磷酰基不能连接另一种化学种类，例如形成氧-氧键或其他不稳定键，如本领域普通技术人员所理解的。当E、R^vi和R^vii被取代时，取代基包括但不限于卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、甲硅烷基、醚、酯、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基(或季铵化氨基)、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亚砜、磺酰氨基、磺酰基、杂环基、烷芳基、卤代烷基、-CN、芳基、杂芳基及其组合。

术语“C₃-C₂₀环状”是指在几何限制允许的情况下，具有3至20个碳原子的取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环烯基、取代或未取代的环炔基、取代或未取代的杂环基。环状结构由单环或稠环系统形成。取代的环烷基、环烯基、环炔基和杂环基分别如上文对烷基、烯基、炔基和杂环基所定义进行取代。

II.组合物

A.抗衰老前药化合物

本文公开的抗衰老前药基于细胞毒性剂的选择性设计，以在体内递送前药后引入可由SA-β-gal切割的位点，以释放活性母体细胞毒性剂用于优先杀死衰老细胞。

在优选的实施方案中，细胞毒性剂缺少苯酚基团。特别优选的细胞毒性剂是吉西他滨。

因此，其中公开的前药化合物包括细胞毒性剂，在本文中以经修饰以被SA-β-gal切割的吉西他滨为例。细胞毒性剂被修饰以包括优选被乙酰化的基于半乳糖的部分，和苄氧羰基，如下面对于SSK1的示例。因此，在优选的实施方案中，前药在基于半乳糖的部分上不包括游离羟基(-OH)。在一些实施方案中，前药可包括修饰(例如，去除苄氧羰基部分的芳基或杂芳基(例如，苯基)上的硝基(例如-NO₂)或在其上添加其他官能团)以降低其潜在的免疫原性。在一些实施方案中，前药可包括在苄氧羰基部分的芳基或杂芳基(例如，苯基)上的硝基(例如-NO₂)，其可例如影响前药在β-半乳糖苷酶激活后产生细胞毒性剂的效率。在一些实施方案中，前药可以包括进一步的修饰(例如，从基于半乳糖的部分去除一个或多个保护基团(例如乙酰基(Ac)基团))以增加其水溶性，这可以，例如，促进稳定结晶形式的形成，简化体内代谢途径，和/或获得更好的类药物特性。

在一些形式中，苄氧羰基部分具有如下所示的结构：

其中：

X是芳基或杂芳基，优选C₆芳基，例如苯基，

V是O、S或NR₁’，其中R₁’为氢、取代的C₁-C₅烷基、未取代的C₁-C₅烷基、取代的C₆-C₁₀芳基，或未取代的C₆-C₁₀芳基，其中优选地，V为O，

Y是取代的C₁-C₅亚烷基、未取代的C₁-C₅亚烷基、未取代的C₁亚烷基、取代的C₁亚烷基、未取代的C₂亚烷基、取代的C₂亚烷基、未取代的C₃亚烷基、取代的C₃亚烷基、未取代的C₄亚烷基、取代的C₄亚烷基、未取代的C₁亚烷基、取代的C₅亚烷基，其中优选地，Y是亚甲基，

Z是O、S或NR₂’，其中R₂’为氢、取代的C₁-C₅烷基、未取代的C₁-C₅烷基、取代的C₆-C₁₀芳基或未取代的C₆-C₁₀芳基，其中优选地，Z是O，

W是O、S或NR₃’，其中R₃’为氢、取代的C₁-C₅烷基、未取代的C₁-C₅烷基、取代的C₆-C₁₀芳基或未取代的C₆-C₁₀芳基，其中优选地，W是O，

每个U独立地是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，U是-NO₂或氢，和

m是0和10之间的整数，包括例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，如果化合价允许的话。

在式I的一些形式中，X是C₆芳基。在一些形式中，U是-NO₂。在一些形式中，U是氢。在一些形式中，V是O。在式I的一些形式中，W是O。在一些形式中，Y是取代的C₁亚烷基。在式I的一些形式中，Y是取代的C₁亚烷基。在一些形式中，Z是O。

在式I的一些形式中，X是C₆芳基，Y是取代的C₁亚烷基或取代的C₁亚烷基。在式I的一些形式中，X是C₆芳基，Y是取代的C₁亚烷基或取代的C₁亚烷基，V和W是O。

在式I的一些形式中，X是C₆芳基，Y是取代的C₁亚烷基或取代的C₁亚烷基，V、Z和W是O。

在式I的一些形式中，苄氧羰基是式II，如下所示：

其中：

每个R₄’独立地是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，R₄’是-NO₂或氢,

R₅’为氢、硝基-(如-NO₂)、氰基(如-CN)、异氰基(如)、氨基(如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，R₅’是氢，并且

n是0和4之间的整数，包括如0、1、2、3和4，如果化合价允许的话。

在式II的一些形式中，至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基或膦酰基。在式II的一些形式中，至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、氢或卤素(例如F、Cl、I、Br)。在式II的一些形式中，至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)。在式II的一些形式中，至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)，其可以例如提高效率以在活化后产生细胞毒性剂。在式II的一些形式中，至少一个R₄’是氢(而不是硝基(例如-NO₂))，其可以例如降低潜在的免疫原性。

在式II的一些形式中，R5’是氢、烷基或取代的烷基。在式II的一些形式中，R5’是氢。

在一些形式中，该化合物包括以下所示结构的基于半乳糖的部分。

R₁、R₂、R₃和R₄可以各自/独立地是H或可以在细胞内水解的任何取代基。优选地，在一些形式中，R₁、R₂、R₃和R₄各自是氢或取代基，使得-OR₁、-OR₂、-OR₃和/或-OR₄可以在细胞内水解。在一些形式中，R₁、R₂、R₃和R₄独立地为H、R₅C(O)-、R₆OC(O)-、R₇R₈NC(O)-或R₉PO₃ ^--，使得-OR_x独立地分别为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或磷酸二酯基团，其中x为1、2、3或4。在一些形式中，R₁、R₂、R₃和R₄独立地为R₅C(O)-、R₆OC(O)-、R₇R₈NC(O)-。在这些形式中，R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的C₃-C₁₀环基、未取代的C₃-C₁₀环基、取代的C₃-C₁₀杂环基，未取代的C₃-C₁₀杂环基。在这些形式中，R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的C₁-C₅烷基、未取代的C₁-C₅烷基、取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的C₆-C₁₀芳基、取代的C₆-C₁₀杂芳基、未取代的C₆-C₁₀杂芳基、取代的C₃-C₁₀环基、未取代的C₃-C₁₀环基或取代的C₃-C₁₀杂环基、未取代的C₃-C₁₀杂环基。在这些形式中，R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的C₁-C₃烷基、未取代的C₁-C₃烷基、取代的C₆芳基、未取代的C₆芳基、取代的C₆杂芳基、未取代的C₆杂芳基、取代的C₆环基、未取代的C₆环基，或取代的C₆杂环基，未取代的C₆杂环基。在一些形式中，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个(或全部)可以是H，其可以例如增加水溶性、促进稳定结晶形式的形成、简化体内代谢途径，和/或获得更好的类药物特性。在一些形式中，例如，当前药为晶体形式时，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个(或全部)是H。

在一些形式中，R₁、R₂、R₃和R₄是R₅C(O)-。在这些形式中，R₅独立地是取代的C₁-C₃烷基或未取代的C₁-C₃烷基。在这些形式中，R₅优选地是甲基。

优选的基于半乳糖的部分是D-半乳糖四乙酸酯部分，如下所示。

在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些实施方案中，去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团可以增加水溶性、促进稳定结晶形式的形成、简化体内代谢途径和/或获得更好的类药物特性。在一些实施方案中，前药可以是晶体形式，其可以例如不包含保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)或在基于半乳糖的部分上包含减少数量的保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些形式中，例如，当前药为晶体形式时，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个(或全部)是H。

在一些形式中，活性剂由

式IV代表；

其中D包括细胞毒性剂。在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。在一些形式中，例如，当前药为晶体形式时，R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个(或全部)是H。在一些形式中，R₄’可以是硝基-(例如-NO₂)。在一些形式中，R₄’可以是氢(而不是例如硝基(例如-NO₂))。优选的细胞毒性剂是本领域已知的化学治疗剂/药物。化学治疗剂的实例包括但不限于吉西他滨、阿糖胞苷、5'-脱氧-5-氟胞苷、巯基嘌呤、沙帕他滨、奈拉滨、氯法拉滨、地西他滨和阿扎胞苷、氨甲蝶呤、长春花碱、多柔比星、异环磷酰胺、培美曲塞、顺铂、卡铂，和紫杉醇。优选具有短血浆循环时间的化学治疗剂，例如吉西他滨。因此，已被修饰以延长其血浆循环时间的母体药物的衍生物不是优选的，例如聚乙二醇化衍生物。特别优选的是缺乏酚基的化学治疗剂。可用于制备本文公开的抗衰老前药的细胞毒性剂的实例包括但不限于吉西他滨、阿糖胞苷和5'-脱氧-5-氟胞苷、巯基嘌呤、沙帕他滨、奈拉滨、氯法拉滨、地西他滨和阿扎胞苷。在一些优选的实施方案中，细胞毒性剂不是槲皮素或帕比司他。

R₁、R₂、R₃和R₄如上文对于式III所述，并且

R₄’和R₅’如上文对式II所述。

特别优选的苄氧羰基如下所示。

3-硝基-4-氧-苄基羧基。

在一些形式中，可以从上述基团中去除NO₂。

特别优选的化合物如下所示。

在一些形式中，可以从基于半乳糖的部分去除一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)。因此，另一种优选的化合物如下所示。

在一些形式中，NO₂可以被去除并且另一种优选的化合物如下所示。

在一些形式中，NO₂和一个或多个(例如，两个、三个或四个)保护基团(例如乙酰基(Ac)基团)都可以被去除并且另一种优选的化合物如下所示。

与半乳糖修饰的倍癌霉素(duorcarmycin)(其具有用于将半乳糖部分直接缀合到倍癌霉素化合物上的酚或羟基)不同，缺乏酚或羟基官能团的细胞毒性剂如吉西他滨、阿糖胞苷和5'-脱氧-5-氟胞苷不适合用半乳糖修饰的直接修饰，至少因为半乳糖部分与胺基的直接附着例如可能产生不稳定的化合物或SA-β-gal不会切割或切割效果不佳的前药。因此，在一个优选的实施方案中，本文公开的前药不包括半乳糖部分与细胞毒性剂上的任何基团的直接缀合。

因此，所公开的前药化合物基于优选非酚类细胞毒性剂的选择性和特异性设计，其用于(i)增加细胞渗透性和(ii)改善SA-β-gal的切割。一个提议的方案是从前药中释放活性剂，下面为SSK1进行了举例说明。

B.制剂

可以配制本文所述的化合物用于肠内、肠胃外、局部或肺部施用。化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂组合，所述载体和/或赋形剂被认为是安全和有效的并且可以施用于个体而不会引起不希望的生物学副作用或不想要的相互作用。载体是药物制剂中除一种或多种活性成分以外的所有组分。

化合物以治疗有效量包含在制剂中。可以从细胞培养测定中初步估计治疗有效量。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到循环浓度范围，其包括在细胞培养中确定的IC50或IC100。此类信息可用于更准确地确定人体的有用剂量。也可以从体内数据估计初始剂量。使用这些初始指南，本领域普通技术人员可以确定人体的有效剂量。

1.肠胃外制剂

可以配制本文所述的化合物用于肠胃外施用。

例如，肠胃外施用可以包括通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、瘤内、肌内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐内注射和输注向患者施用。

可以使用本领域已知的技术将肠胃外制剂制备为水性组合物。通常，此类组合物可制备为可注射制剂，例如溶液或悬浮液；适合在注射前加入重构介质后用于制备溶液或悬浮液的固体形式；乳剂，例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳剂。

载体可以是包含例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油，例如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用涂层如卵磷脂、在分散的情况下通过维持所需的颗粒大小和/或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

可以在水或另一种溶剂或与一种或多种药学上可接受的赋形剂适当混合的分散介质中制备活性化合物作为游离酸或碱或其药学上可接受的盐的溶液和分散体，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸的钠、钾、铵盐和烷基芳基磺酸盐，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如十二烷基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺。非离子表面活性剂的实例包括乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇肉豆蔻酸酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚(polyoxyethyleneoctylphenylether)、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁醚、

401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸盐(myristoamphoacetate)、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可含有抗氧化剂以防止活性剂的降解。

制剂通常被缓冲至3-8的pH值，用于重构后的肠胃外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。

水溶性聚合物通常用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

可以通过将所需量的活性化合物与上面列出的一种或多种赋形剂(根据需要)掺入到合适的溶剂或分散介质中，然后过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散剂是通过将多种已灭菌的活性成分掺入到含有基本分散介质和来自上面列出的那些所需的其他成分的无菌运载体中来制备的。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉剂。可以以颗粒本质上是多孔的这样的方式制备粉剂，其可以增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域公知的。

(a).控制释放的制剂

可将本文所述的肠胃外制剂配制用于控制释放，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。

1.纳米和微颗粒

对于肠胃外施用，可将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外活性剂掺入提供化合物和/或一种或多种额外活性剂的控制释放的微颗粒、纳米颗粒或其组合中。在其中制剂含有两种或多种药物的实施方案中，可以将药物配制用于相同类型的控制释放(例如，延迟、延长、立即或脉冲式)，或者可以将药物独立地配制用于不同类型的释放(例如，立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。

例如，可以将化合物和/或一种或多种额外的活性剂掺入聚合物微颗粒中，其提供药物的控制释放。通过药物从微颗粒中的扩散和/或聚合物颗粒通过水解和/或酶促降解的降解来控制药物的释放。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。

在水性环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，例如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可适合作为含药物微颗粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酐、聚(酯酐)、多羟基酸，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物，聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物，聚己内酯及其共聚物，以及它们的组合。

或者，可将药物掺入由在水溶液中不溶或水溶液中缓慢溶解但能够在胃肠道内通过包括酶促降解、胆汁酸的表面活性作用和/或机械侵蚀而被降解的材料制备的微颗粒中。如本文所用，术语“水溶液中缓慢溶解的”是指在30分钟内不溶于水的材料。优选的实例包括脂肪、脂肪物质、蜡、蜡状材料及其混合物。合适的脂肪和脂肪物质包括脂肪醇(例如月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)、脂肪酸和衍生物，包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和氢化脂肪。具体实例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、以商品名

可获得的氢化油、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。合适的蜡和蜡状材料包括天然或合成蜡、烃和普通蜡。蜡的具体实例包括蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡状材料被定义为在室温下通常为固体并且具有约30至300℃的熔点的任何材料。

在一些情况下，可能需要改变水渗透到微颗粒中的速度。为此，可以将速率控制(芯吸)剂与上面列出的脂肪或蜡一起配制。速率控制材料的实例包括某些淀粉衍生物(例如，蜡质麦芽糊精和滚筒干燥的玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、藻酸、乳糖和滑石粉。此外，可加入药学上可接受的表面活性剂(例如卵磷脂)以促进此类微颗粒的降解。

水不溶的蛋白质，例如玉米醇溶蛋白，也可用作用于形成含药物微颗粒的材料。此外，水溶性的蛋白质、多糖及其组合可以与药物一起配制成微颗粒，然后交联形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个药物分子络合并随后交联。

2.制备纳米和微颗粒的方法

将药物封装或掺入载体材料中以产生含药物的微颗粒可通过已知的药物制剂技术来实现。在脂肪、蜡或蜡状材料配制的情况下，通常将载体材料加热至其熔化温度以上，并且加入药物以形成混合物，其包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物、或其混合物。随后可以通过几种方法配制微颗粒，包括但不限于凝结、挤出、喷雾冷却或水分散的方法。在优选的方法中，将蜡加热至高于其熔化温度，加入药物，并且随着混合物冷却，在持续搅拌下使熔化的蜡-药物混合物凝结。或者，可将熔化的蜡-药物混合物挤出并滚圆以形成丸剂或珠剂。这些方法是本领域已知的。

对于一些载体材料，可能需要使用溶剂蒸发技术来生产含药物的微颗粒。在这种情况下，药物和载体材料共溶解在互溶剂中，随后可以通过几种技术产生微颗粒，包括但不限于在水或其他合适的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过从本体溶液中蒸发掉溶剂和研磨所得材料。

在一些实施方案中，颗粒形式的药物均匀地分散在水不溶性或缓慢水溶的材料中。为了将组合物中药物颗粒的大小最小化，可以在配制之前研磨药物粉末本身以产生细颗粒。制药领域已知的喷射研磨方法可用于该目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡状物质加热至其熔点以上并在搅拌混合物的同时加入药物颗粒，将颗粒形式的药物均匀分散在蜡或蜡样物质中。在这种情况下，可将药学上可接受的表面活性剂加入混合物中以促进药物颗粒的分散。

颗粒也可以包衣有一种或多种释放涂层。被脂肪酶水解的固体脂肪酸酯可以喷涂到微颗粒或药物颗粒上。玉米醇溶蛋白是天然水不溶性蛋白质的实例。它可以通过喷涂或湿法制粒技术包衣到含药物的微颗粒或药物颗粒上。除了天然的水不溶性材料外，可以利用交联程序处理消化酶的一些底物，导致不溶性网络的形成。已经报道了通过化学和物理方式起始的许多蛋白质交联方法。获得交联的最常见方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的实例包括醛类(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平(genipin)。除了这些交联剂外，氧化糖和天然糖也已用于交联明胶。也可以使用酶促方法完成交联；例如，转谷氨酰胺酶已被批准为用于交联海产品的GRAS物质。最后，可以通过物理方法，例如热处理、紫外线放射和伽马放射起始交联。

为了产生包围含有药物的微颗粒或药物颗粒的交联蛋白的涂层，可以将水溶性蛋白质喷涂到微颗粒上，然后通过上述方法之一进行交联。或者，可以通过凝聚相分离(例如，通过添加盐)将含有药物的微颗粒在蛋白质内微囊化，然后交联。用于此目的的一些合适的蛋白质包括明胶、白蛋白、酪蛋白和谷蛋白。

也可以交联多糖以形成水不溶性网络。对于许多多糖，这可以通过与钙盐或多价阳离子反应来实现，这些阳离子使聚合物主链交联。果胶、藻酸盐、葡聚糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子存在下进行交联。也可以形成带相反电荷的多糖之间的复合体；例如，果胶和壳聚糖可以通过静电相互作用复合。

(b).可注射/可植入制剂

可将本文所述的化合物掺入可注射/可植入的固体或半固体植入物，例如聚合物植入物。在一个实施方案中，将化合物掺入聚合物中，所述聚合物在室温下为液体或糊剂，但在与水性介质例如生理流体接触时，表现出粘度增加以形成半固体或固体材料。示例性聚合物包括但不限于衍生自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚反应的羟基链烷酸聚酯。聚合物可以熔化、与活性物质混合并浇铸或注塑到装置中。这种熔体制造需要聚合物具有这样的熔点，其低于物质待递送和聚合物降解或变得有反应性的温度。也可以通过溶剂浇铸来制备所述装置，其中聚合物溶解在溶剂中，药物溶解或分散在聚合物溶液中，然后蒸发溶剂。溶剂法要求聚合物可溶于有机溶剂。另一种方法是将聚合物和载有活性剂的药物或聚合物颗粒的混合粉末压缩成型。

或者，可将化合物掺入聚合物基质中并模塑、压缩或挤进在室温下为固体的装置中。例如，可将化合物掺入可生物降解的聚合物中，例如聚酐、聚羟基链烷酸(PHA)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白质和多糖，例如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶，以及它们的组合并压缩成固体装置，例如盘，或挤进装置，例如棒。

可以通过聚合物的选择、聚合物的分子量和/或聚合物的修饰来改变一种或多种化合物从植入物的释放以增加降解，例如孔的形成和/或可水解键的掺入。用于修饰可生物降解聚合物的性质以改变化合物从植入物中的释放曲线的方法是本领域公知的。

2.肠内制剂

合适的口服剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和锭剂。可以使用本领域公知的压缩或模塑技术制备片剂。明胶或非明胶胶囊可制备为硬或软胶囊壳，其可使用本领域公知的技术包封液体、固体和半固体填充材料。

可以使用药学上可接受的载体制备制剂。如本文中通常使用的，“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。

载体还包括包衣组合物的所有组分，其可包括增塑剂、色素、着色剂、稳定剂和助流剂。

合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，例如邻苯二甲酸醋酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名

(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)商购的甲基丙烯酸树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。

此外，包衣材料可包含常规载体，例如增塑剂、色素、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

“稀释剂”，也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压缩或珠子和颗粒的形成提供实际大小。合适的稀释剂包括但不限于磷酸二钙二水合物、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

“粘合剂”用于赋予固体剂型内聚特性，从而确保片剂或珠子或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、纤维素，包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸铝镁，以及合成聚合物，例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

“润滑剂”用于促进片剂制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。

“崩解剂”用于在施用后促进剂型崩解或“破碎”，通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、海藻素、树胶或交联聚合物，例如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的

XL)。

“稳定剂”用于抑制或延缓药物分解反应，例如其包括氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁基化羟基甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐类和酯类；维生素E、生育酚及其盐类；亚硫酸盐例如焦亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯和丁基化羟基苯甲醚(BHA)。

(a)控制释放的肠内制剂

口服剂型，例如胶囊剂、片剂、溶液剂和悬浮剂，可以配制用于控制释放。例如，可将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外活性剂配制成纳米颗粒、微颗粒及其组合，并封装在软或硬明胶或非明胶胶囊中或分散在分散介质中以形成口服悬浮剂或糖浆剂。颗粒剂可由药物和控制释放聚合物或基质形成。或者，药物颗粒可以在掺入最终剂型之前用一种或多种控制释放涂层包衣。

在另一个实施方案中，将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外的活性剂分散在基质材料中，所述基质材料在与水性介质，例如生理流体接触后凝胶化或乳化。在凝胶的情况下，基质溶胀，夹带活性剂，所述活性剂随着时间通过基质材料的扩散和/或降解缓慢释放。此类基质可配制成片剂或硬胶囊和软胶囊的填充材料。

在又一个实施方案中，将一种或多种化合物和任选的一种或多种额外的活性剂配制成出售的口服剂型，例如片剂或胶囊剂，并且固体剂型用一种或多种控制释放涂层包衣，例如延迟释放涂层或延长释放涂层。一个或多个涂层还可以含有化合物和/或额外的活性剂。

(i)延长释放剂型

通常将延长释放制剂制备为本领域已知的扩散或渗透系统。扩散系统通常由两种类型的装置组成，即储存器和基质，并且为本领域所公知和描述。通常通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体一起压缩成片剂形式来制备基质装置。用于制备基质装置的三种主要类型的材料是不溶性塑料、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于纤维素聚合物例如甲基和乙基纤维素、羟烷基纤维素例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和

934、聚环氧乙烷及其混合物。脂肪化合物包括但不限于多种蜡，例如巴西棕榈蜡和三硬脂酸甘油酯以及蜡类物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油，或其混合物。

在某些优选实施方案中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。

在某些优选实施方案中，丙烯酸类聚合物包含一种或多种甲基丙烯酸铵共聚物。甲基丙烯酸铵共聚物为本领域众所公知，并且在NF XVII中被描述为具有低季铵基团含量的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一个优选的实施方案中，丙烯酸类聚合物是丙烯酸类树脂漆，例如可从RohmPharma以商品名

商购的那些。在进一步优选的实施方案中，丙烯酸类聚合物包含可分别以商品名

RL30D和

RS30D从Rohm Pharma商购的两种丙烯酸类树脂漆的混合物。

RL30D和

RS30D是具有低含量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，在

RL30D中铵基团与其余中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:20，在

RS30D中为1:40。平均分子量约为150,000。还优选

S-100和

L-100。代码名称RL(高渗透性)和RS(低渗透性)是指这些活性剂的渗透性特性。

RL/RS混合物在水和消化液中不溶。然而，形成以包含它们的多颗粒系统在水溶液和消化液中是可溶胀和可渗透的。

上述聚合物，例如

RL/RS可以以任何期望的比例混合在一起，以最终获得具有期望溶解曲线的持续释放制剂。可从例如100％

RL、50％

RL和50％

RS，和10％

RL和90％

RS获得期望的持续释放多颗粒系统。本领域技术人员会认识到也可以使用其他丙烯酸聚合物，例如

L。

或者，可以使用渗透系统或通过对剂型应用半透性涂层来制备延长释放制剂。在后一种情况下，可以通过以合适的比例组合低渗透性和高渗透性包衣材料来实现期望的药物释放曲线。

可以在包含单个或多个单元的最终剂型中组合具有上述不同药物释放机制的装置。多个单元的实例包括但不限于多层片剂和包含片剂、珠子或颗粒的胶囊。可以通过使用涂层或压缩过程或在多单元系统例如含有延长和立即释放珠子的胶囊中将立即释放层应用到延长释放核心的顶部来将立即释放部分添加到延长释放系统中。

通过本领域公知的技术，例如直接压缩、湿法制粒或干法制粒制备含有亲水性聚合物的延长释放片剂。它们的制剂通常掺入聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。通常的稀释剂包括惰性粉状物质例如淀粉、粉状纤维素，尤其是结晶和微晶纤维素，糖类例如果糖、甘露醇和蔗糖、谷物粉和类似的可食用粉剂。典型的稀释剂包括例如多种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐例如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是重要的。典型的片剂粘合剂包括物质例如淀粉、明胶和糖类例如乳糖、果糖和葡萄糖：也可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯树胶、藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡也可用作粘合剂。片剂制剂中需要润滑剂以防止片剂和冲头粘在模具中。润滑剂选自此类光滑固体，如滑石、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。

通常使用本领域已知的方法，例如直接混合法、凝固法和水分散法制备含蜡材料的延长释放片剂。在凝固法中，药物与蜡材料混合并喷雾凝固或凝固并筛选和加工。

(ii)延迟释放剂型

可以通过用聚合物薄膜包衣固体剂型来产生延迟释放制剂，所述薄膜在胃的酸性环境中不溶，而在小肠的中性环境中可溶。

可以例如通过用选定的包衣材料包衣药物或含药物的组合物来制备延迟释放剂量单位。含药组合物可以是例如用于掺入胶囊的片剂、用作“包衣芯”剂型中的内核的片剂，或用于掺入片剂或胶囊中的多个含药物珠子、颗粒(particle)或颗粒(granule)。优选的包衣材料包括可生物侵蚀的、逐渐水解的、逐渐水溶性的和/或酶促降解的聚合物，并且可以是常规的“肠道”聚合物。如本领域技术人员所理解的，肠道聚合物在下胃肠道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过胃肠道而缓慢侵蚀，而酶促降解聚合物被存在于下胃肠道，尤其是结肠中的细菌酶降解。用于实现延迟释放的合适包衣材料包括但不限于纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素、醋酸纤维素偏苯三甲酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯，以及以商品名

(Rohm Pharma；Westerstadt,Germany)商购的其他甲基丙烯酸树脂，包括

L30D-55和L100-55(在pH 5.5及以上可溶)、

L-100(在pH 6.0及以上可溶)、

S(在pH 7.0及以上可溶，由于更高程度的酯化)，和

NE、RL和RS(具有不同程度渗透性和可膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯聚合物和共聚物，例如聚乙烯吡咯烷酮、醋酸乙烯酯、邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、醋酸乙烯巴豆酸共聚物，和乙烯-醋酸乙烯酯共聚物；可酶促降解的聚合物，例如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层包衣。

可由本领域技术人员通过评估用不同量的多种包衣材料制备的片剂、珠子和颗粒的单独释放曲线而容易地确定特定包衣材料的优选包衣重量。产生所期望的释放特性的材料、方法和应用形式的组合，其只能从临床研究中确定。

包衣组合物可包括常规添加剂，例如增塑剂、色素、着色剂、稳定剂、助流剂等。增塑剂通常存在以降低包衣的脆性，并且相对于聚合物的干重通常占约10wt.％至50wt.％。典型的增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三醋精、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化甘油单酯。优选使用稳定剂来稳定分散液中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂，例如山梨醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐助流剂以减少成膜和干燥过程中的粘附效应，并且通常占包衣溶液中聚合物重量的约25wt.％至100wt.％。一种有效的助流剂是滑石。也可以使用其他助流剂，例如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。也可以使用色素例如二氧化钛。少量的消泡剂，例如硅酮(例如，二甲基硅油)，也可以添加到包衣组合物中。

3.局部制剂

用于局部施用的合适剂型包括乳膏、软膏、油膏、喷雾剂、凝胶剂、洗剂、乳剂和透皮贴剂。可以配制所述制剂用于经粘膜、经上皮、经内皮或经皮施用。也可以配制化合物用于鼻内递送、肺部递送或吸入。组合物可进一步包含一种或多种化学渗透增强剂、膜渗透剂、膜转运剂、润肤剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂及其组合。

在某些实施方案中，可能期望向有需要的患者提供一种或多种化合物的连续递送。对于局部应用，可以进行重复应用，或者可以使用贴剂在延长时间内提供化合物的连续施用

“缓冲剂”用于控制组合物的pH值。优选地，缓冲剂将组合物从约4的pH缓冲至约7.5的pH，更优选地从约4的pH缓冲至约7的pH，最优选地从约5的pH缓冲至约7的pH。在优选的实施方案中，缓冲剂是三乙醇胺。

“润肤剂”是软化或舒缓皮肤的外用剂，并且一般为本领域所知并列在药典中，例如“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版，Pharmaceutical Press，2003。这些包括但不限于，杏仁油、蓖麻油、长角豆提取物、鲸蜡硬脂醇(cetostearoyl alcohol)、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲硅油、乙二醇棕榈硬脂酸酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷脂、轻矿物油、中链甘油三酯、矿物油和羊毛脂醇、凡士林油、凡士林油和羊毛脂醇、大豆油、淀粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇及其组合。在一个实施方案中，润肤剂是硬脂酸乙基己酯和棕榈酸乙基己酯。

“乳化剂”是表面活性物质，其促进一种液体在另一种液体中的悬浮并促进油和水的稳定混合物或乳液的形成。常见的乳化剂是：金属皂、某些动植物油和多种极性化合物。合适的乳化剂包括阿拉伯胶、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、乙二醇棕榈硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羊毛脂、水合、羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、丙二醇海藻酸酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱水柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花籽油、黄蓍胶、三乙醇胺、黄原胶及其组合。在一个实施方案中，乳化剂是硬脂酸甘油酯。

“渗透促进剂”是本领域已知的并且包括但不限于脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸、脂肪醇醚、氨基酸、磷脂、卵磷脂、胆酸盐、酶、胺和酰胺、络合剂(脂质体、环糊精、改性纤维素和二酰亚胺)、大环化合物，例如大环内酯、酮和酸酐和环脲、表面活性剂、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、DMSO和相关化合物、离子化合物、氮酮(azone)和相关化合物，和溶剂，例如醇、酮、酰胺、多元醇(例如二醇)。这些类别的实例是本领域已知的。

“防腐剂”可用于防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇，和硫柳汞。

“表面活性剂”是表面活性剂，其降低表面张力，从而增加产品的乳化、发泡、分散、铺展和润湿性能。合适的非离子表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮及其组合。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是硬脂醇。

(a)乳剂

乳剂是一种液体的制剂，所述液体以小球状分布在整个第二种液体的主体中。在特定的实施方案中，乳剂的不可混溶组分包括亲脂组分和水性组分。分散液为不连续相，而分散介质为连续相。当油是分散液，水溶液是连续相时，它被称为水包油乳剂，而当水或水溶液为分散相，油或油性物质为连续相时，它被称为油包水乳剂。油相和水相中的一者或两者可含有一种或多种表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、缓冲液和其他赋形剂。优选的赋形剂包括表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂；乳化剂，尤其是乳化蜡；和液体非挥发性非水材料，特别是二醇，例如丙二醇。油相可包含其他油性药学上批准的赋形剂。例如，可以在油相中使用诸如羟基化蓖麻油或芝麻油之类的材料作为表面活性剂或乳化剂。

油相可至少部分由推进剂，例如HFA推进剂组成。油相和水相中的一者或两者可含有一种或多种表面活性剂、乳化剂、乳液稳定剂、缓冲剂和其他赋形剂。优选的赋形剂包括表面活性剂，尤其是非离子表面活性剂；乳化剂，尤其是乳化蜡；和液体非挥发性非水材料，特别是二醇，例如丙二醇。油相可包含其他油性药学上批准的赋形剂。例如，可以在油相中使用诸如羟化蓖麻油或芝麻油之类的材料作为表面活性剂或乳化剂。

乳液的一个子集是自乳化系统。这些药物递送系统通常是胶囊(硬壳或软壳)，由分散或溶解在表面活性剂和亲脂性液体(例如油或其他与水不混溶的液体)的混合物中的药物组成。当胶囊暴露在水性环境中并且外层明胶壳溶解时，水性介质与胶囊内容物之间的接触会立即产生非常小的乳液液滴。这些通常在胶束或纳米颗粒的大小范围内。不需要混合力来产生乳液，这是乳液配制过程中的典型情况。

(b).洗剂

通过使用悬浮剂和分散剂，洗剂可以包含在分散介质中不溶的细粉状物质。或者，洗剂可以具有作为分散相的液体物质，所述液体物质与运载体不混溶并且通常通过乳化剂或其他合适的稳定剂分散。在一个实施方案中，洗剂是粘度在100到1000厘沲之间的乳液形式。洗剂的流动性允许在广泛的表面积上快速均匀应用。洗剂通常旨在在皮肤上干燥，在皮肤表面留下一层薄薄的其药物组分。

(c).乳膏

乳膏可能含有乳化剂和/或其他稳定剂。在一个实施方案中，制剂是具有大于1000厘沲，通常在20,000-50,000厘沲的范围内的粘度的乳膏形式。乳膏经常比软膏更优选，因为它们通常更容易涂抹和去除。

乳膏和洗剂之间的区别在于粘度，这取决于多种油的量/用途以及用于制备制剂的水的百分比。乳膏通常比洗剂更稠，可能有多种用途，并且通常一种使用更多不同的油/黄油，这取决于对皮肤的期望效果。在乳膏制剂中，水基百分比约为总体的约60-75％，油基百分比约为20-30％，其他百分比为乳化剂、防腐剂和添加剂，合计为100％。

(d).软膏

合适的软膏基质的实例包括烃基质(例如凡士林、白凡士林、黄色软膏和矿物油)；吸收基质(亲水性凡士林、无水羊毛脂、羊毛脂和冷霜)；水溶性基质(例如亲水性软膏)和水溶性基质(例如聚乙二醇软膏)。糊剂通常与软膏不同，因为它们含有较大百分比的固体。与使用相同组分制备的软膏相比，糊剂通常更具吸收性且更不油腻。

(e).凝胶剂

凝胶剂是含有小分子或大分子在液体运载体中的分散体的半固体系统，通过增稠剂或溶解或悬浮在液体运载体中的聚合物材料的作用使所述液体运载体变成半固体。液体可包括亲脂性组分、水性组分或两者。一些乳液可以是凝胶剂或以其他方式包括凝胶剂组分。然而，一些凝胶剂不是乳剂，因为它们不包含不混溶组分的均质混合物。合适的胶凝剂包括但不限于改性纤维素，例如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素；Carbopol均聚物和共聚物；及其组合。液体运载体中合适的溶剂包括，但不限于，二甘醇单乙醚；亚烷基二醇，例如丙二醇；二甲基异山梨醇；醇类，例如异丙醇和乙醇。通常根据其溶解药物的能力来选择溶剂。也可以掺入改善制剂的皮肤感觉和/或润肤性的其他添加剂。此类添加剂的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、苯甲酸C₁₂-C₁₅烷基酯、矿物油、角鲨烷、环甲基硅油、癸酸/辛酸甘油三酯及其组合。

(f).泡沫剂

泡沫剂由乳液和气态推进剂组合组成。气态推进剂主要由氢氟烷烃(HFA)组成。合适的推进剂包括HFA，例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227)。推进剂优选不是烃类推进剂气体，其在喷雾过程中会产生易燃或易爆的蒸气。此外，该组合物优选不含挥发性醇，其在使用过程中会产生易燃或易爆的蒸气。

II.制备和使用方法

因此，所公开的组合物可用于在有需要的受试者中治疗衰老相关病症和与异常炎症相关的病症。优选地，受试者是哺乳动物，更优选地是人。如本文所用，衰老相关病症或疾病包括与细胞衰老相关或由细胞衰老引起的病症或疾病，包括年龄相关疾病和病症。衰老相关疾病或病症也可称为衰老细胞相关疾病或病症。

衰老是细胞反应，其特征是稳定的生长停滞和其他表型改变，包括促炎分泌组。衰老在正常发育、维持组织稳态和限制肿瘤发展中发挥作用。然而，衰老也被表明是导致年龄相关疾病的主要原因。衰老细胞随着年龄的增长而积累，并与许多疾病有关，包括癌症、纤维化和许多与年龄相关的病理。最近的证据表明，衰老细胞在多种病理中是有害的，它们的消除具有许多优势，改善多种病理并延长健康跨度和寿命。

衰老细胞存在于许多肿瘤前病变、纤维化组织(例如肝、肾、心脏、胰腺)和旧组织中。

虽然SA-β-gal被广泛用作细胞衰老的标志物(Childs等人,Nat Med,21(12),1424-1435(2015)；Hernandez-Segura等人,Trends Cell Biol,28(6),436-453(2018)；Sharpless&Sherr,Nat Rev Cancer,15(7),397-408(2015))，在一些非衰老细胞中发现其活性升高，例如活化的巨噬细胞(Bursuker,Rhodes,&Goldman,J Cell Physiol 112,385-390(1982)；Frescas等人,Cell Cycle 16,1526-1533(2017))。这些SA-β-gal阳性巨噬细胞可能是有害的，并且已被发现会在受伤和年老的组织中积聚，导致慢性炎症(Hall等人,Aging(Albany NY)8,1294-1315(2016)；Oishi&Manabe,NPJ Aging Mech Dis 2,16018(2016))。重要的是，本申请中的数据表明，SSK1减少了受伤肺部和年老肝中SA-β-gal阳性巨噬细胞的数量，这与观察到的慢性炎症相关细胞因子分泌减少的现象一致。因此，通过调节SSK1消除巨噬细胞积累可能会减少慢性炎症并有益于年老生物。此外，活化的巨噬细胞在急性炎症和细胞因子风暴中起着至关重要的作用(Hamidzadeh等人，Annu Rev Physiol79,567-592(2017))，尤其是那些由病毒感染诱导的巨噬细胞。在病毒诱导的急性炎症期间，巨噬细胞产生促炎因子并引发起始细胞因子风暴(Hamidzadeh等人，Annu Rev Physiol79,567-592(2017))。巨噬细胞的消除可以保护小鼠免受冠状病毒引起的致命感染(Channappanavar等人，Cell Host Microbe 19,181-193(2016))。因此，可以使用本文公开的化合物和制剂靶向活化的巨噬细胞，以通过SSK1处理急性炎症和细胞因子风暴。在这些实施方案中，组合物以有效减少受试者中巨噬细胞，特别是SA-β-gal阳性巨噬细胞的量的方式施用。

病毒性病症

所公开的组合物可用于缓解由病毒诱导的炎症引起的与异常细胞因子产生相关的症状。在此期间受试者可以受益于有效量的本文公开的制剂的施用的示例性病毒感染包括冠状病毒，例如冠状病毒，例如严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒(CoV)、SARS-CoV-2(其导致COVID-19(冠状病毒病2019))和中东呼吸综合征(MERS)-CoV。SARS-CoV-2病毒是β冠状病毒，与MERS-CoV和SARS-CoV一样。这些高致病性人类呼吸道冠状病毒引起以炎症反应和肺损伤为特征的急性致死性疾病。伴随着延迟的I型干扰素(IFN-I)信号传导的SARS-CoV的稳健复制可协调炎症反应和肺免疫病理学，存活率降低。在病毒滴度达到峰值之前，IFN-I仍可检测到，但早期IFN-I施用缓解免疫病理学。这种延迟的IFN-I信号传导促进了致病性炎性单核细胞-巨噬细胞(IMM)的积累，导致肺细胞因子/趋化因子水平升高、血管渗漏和病毒特异性T细胞反应受损。越来越多的证据表明，患有严重的冠状病毒病2019(COVID-19)的患者的一个亚组可能患有细胞因子风暴综合征(Mehta等人，DOI：https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30628-0)。

组合物以有效量施用以降低受试者体内一种或多种巨噬细胞的水平。在特别优选的实施方案中，将公开的组合物施用于感染冠状病毒的受试者，优选地，SARS-CoV或SARS冠状病毒2(Sars-CoV-2)。

癌症和癌症治疗应用

研究已经显示通过SASP(衰老相关分泌表型)，年老组织为癌症提供了支持性微环境。衰老细胞可以通过增强癌细胞的增殖潜力或促进上皮向间充质转化来促进肿瘤发展。因此，随着年龄的增长，年老组织中衰老细胞数量的增加可能导致癌症发病率的增加。支持这一点，当衰老细胞被消除时，观察到肿瘤形成的延迟发作。抗衰老药物治疗还降低了转移的发生率，转移是癌症相关死亡的主要原因。(概述于McHugh等人，J.Cell Biol.,217(1):65-77(2018)中。

在一些实施方案中，本文公开的组合物可与癌症治疗剂组合使用。因此，在一些优选的实施方案中，接受治疗的受试者已被诊断患有癌症。可根据本发明的该方面治疗的癌症的非限制性实例包括：腺癌、肾上腺肿瘤、成釉细胞瘤、间变性、甲状腺间变性癌、血管纤维瘤、血管瘤、血管肉瘤、脓肿、银质瘤、肾母细胞瘤、腹水肿瘤细胞、腹水瘤、星形母细胞瘤、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张症、心房粘液瘤、基底细胞癌细胞、骨癌、脑干胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、伯基特淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、宫颈癌、樱桃血管瘤、胆管癌、胆管瘤、软骨母细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、绒毛膜母细胞瘤、绒毛膜癌、结肠癌、常见急性淋巴细胞白血病、颅咽管瘤、囊性癌、囊性纤维瘤、囊瘤、导管原位癌、导管乳头状瘤、无性细胞瘤、脑瘤、子宫内膜癌、内皮瘤、室管膜瘤、上皮瘤、红白血病、尤因氏肉瘤、结外淋巴瘤、猫肉瘤、纤维腺瘤、纤维肉瘤、甲状腺滤泡癌、神经节神经胶质瘤、胃泌素瘤细胞(gastrinoma cell)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、性腺母细胞瘤、血管母细胞瘤、成血管内皮细胞瘤、血管内皮瘤、血管外皮细胞瘤、成血细胞瘤、血细胞瘤、毛细胞白血病、错构瘤、肝癌、肝细胞癌、肝细胞瘤、组织瘤、何杰金氏病、肾上腺瘤、浸润性癌、浸润性导管细胞癌、胰岛瘤、青少年型血管瘤(angioforoma)、卡波西肉瘤、肾肿瘤、大细胞淋巴瘤、白血病、白血病、急性白血病、脂肪瘤、肝癌、肝转移、吕克癌、淋巴腺瘤、淋巴管瘤、淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴细胞瘤、淋巴水肿、淋巴瘤、肺癌、恶性间皮瘤、恶性畸胎瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、莫顿神经瘤、多发性骨髓瘤、成髓细胞瘤、骨髓性白血病、髓脂肪瘤、骨髓瘤、成肌细胞瘤、粘液瘤、鼻咽癌、肿瘤、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经纤维瘤病、神经胶质瘤、神经瘤、非霍奇金淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、骨软骨瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头佩吉特氏病、肺上沟瘤、胰腺癌、亲铬细胞瘤(phaeochromocytoma)、嗜铬细胞瘤(pheoehromocytoma)、浆细胞瘤、原发性脑肿瘤、前驱瘤(progonoma)、泌乳素瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdo sarcoma)、实体瘤、肉瘤、继发性肿瘤、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞癌、鳞状细胞癌、草莓状血管瘤、T细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睾丸癌、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、威尔姆氏瘤。

在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药与诱导衰老的其他癌症的治疗方法，例如放射治疗或化学治疗(例如，使用帕博西尼(Palbociclib)、ribociclib或abemaciclib或其他化学治疗剂的治疗)组合使用。因此，通过同时处理或在其他处理之后进行处理，所述活性剂可以：(a)消除已被推至衰老的癌细胞；和/或消除或减少衰老细胞产生的某些副作用，例如炎症、促进癌症生长、促进转移和化学治疗或放射治疗的其他副作用；和/或(b)减少或消除癌前病变；和/或(c)通过用CDK4/6抑制剂处理消除或减少经历衰老的细胞。所公开的活性剂可以减少或消除癌前(或癌前)病变。衰老细胞存在于癌前肿瘤中。在这方面，应理解，癌前肿瘤中的大量细胞经历了癌基因诱导的衰老。因此，所公开的活性剂可用于减少或消除癌前(或肿瘤前)病变。

在另一个优选的实施方案中，例如在用化学治疗剂治疗之前、期间或之后，施用公开的抗衰老前药以消除或减少化学治疗诱导的衰老。因此，在一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以用于与化学治疗剂组合治疗，其中该治疗剂与化学治疗剂分开、相继或同时施用。示例性化学治疗剂包括但不限于蒽环类、多柔比星、依托泊苷、柔红霉素、紫杉醇(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨、泊麦度胺和来那度胺。所公开的抗衰老前药可以消除或减少由CDK抑制剂，例如CDK4或CDK6抑制剂治疗诱导的衰老。因此，在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可以用于与CDK4或CDK6抑制剂组合治疗，其中所述治疗剂与CDK4或CDK6抑制剂分开、相继或同时施用。所公开的抗衰老前药可以消除或减少帕博西尼诱导的衰老。在消除或减少帕博西尼诱导的衰老的背景下，当细胞重新进入细胞周期时，施用所述治疗剂可能会潜在地阻止癌症缓解。在另一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以消除已被推向衰老的癌细胞。在一个优选的实施方案中，该治疗剂延迟肿瘤发生。

在另一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可以减少衰老细胞产生的某些副作用，例如炎症、促进癌症生长、促进转移以及化学治疗或放射治疗的其他副作用。

化学治疗诱发的副作用或放射治疗诱发的副作用包括但不限于体重减轻、内分泌变化、激素失衡、激素信号传导变化、心脏毒性变化、身体组成、身体活动能力降低、胃肠道毒性、恶心、呕吐、便秘、厌食、腹泻、周围神经病变、疲劳、不适、体力活动不足、血液学毒性、贫血、肝毒性、脱发、疼痛、感染、粘膜炎、体液潴留、皮肤病学毒性、皮疹、皮炎、色素沉着过多、荨麻疹、光敏性、指甲变化、口腔、牙龈或喉咙问题，以及化学治疗或放射治疗引起的任何毒副作用。因此，在一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以用于与化学治疗剂的组合治疗，其中该治疗剂与化学治疗剂分开、相继或同时施用。同样，所述治疗剂可以用于与放射治疗的组合治疗，其中该治疗剂在放射治疗之前、期间或之后施用。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的治疗剂，其用于减少或减轻一种或多种化学治疗诱发或放射治疗诱发的副作用。

在一些实施方案中，提供了用于处理或降低转移可能性的方法，其包括在非化学治疗或非放射治疗时间间隔期间或在化学治疗或放射治疗处理方案已经完成之后施用本文所述的治疗剂。本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的治疗剂，其用于处理转移或降低转移可能性。

在一个优选的实施方案中，所公开的抗衰老前药可用于处理慢性或长期化学治疗诱发或放射治疗诱发的副作用。某些毒性作用可能会在处理后很长时间内出现，并且可能是由于治疗对器官或系统造成的损害。在儿童时期接受癌症治疗的受试者中可以观察到器官功能障碍，例如神经、肺、心血管和内分泌功能障碍。在接受化学治疗或放射治疗的受试者中发生的慢性或晚期毒副作用包括，例如，心肌病、充血性心脏病、炎症、更年期提前、骨质疏松症、不孕症、认知功能受损、周围神经病变、继发性癌症、白内障和其他视力问题、听力损失、慢性疲劳、肺容量减退和肺部疾病。

非癌症/癌症治疗应用

在其他优选的实施方案中，受试者没有被诊断出患有癌症并且没有接受癌症治疗。在这些实施方案中，所公开的组合物被施用以减少有需要的受试者中的衰老细胞群。

衰老细胞与一长串其他病理相关，包括神经系统(例如脑动脉瘤、阿尔茨海默氏症和帕金森病)、肺部(例如特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化)、眼科(例如白内障、青光眼、黄斑变性)、肌肉骨骼(例如少肌症、椎间盘退变、骨关节炎)、心血管(例如动脉粥样硬化、心脏纤维化、主动脉瘤)、肾(例如慢性肾病、移植并发症)、膝关节骨关节炎和其他例如糖尿病、粘膜炎、高血压、肝纤维化和骨髓纤维化(OMF)。

衰老的一个显著特征是功能逐渐丧失，或发生在分子、细胞、组织和生物体水平上的退化。与年龄相关的退化引起公认的病理，例如少肌症、动脉粥样硬化和心力衰竭、骨质疏松症、肺功能不全、肾衰竭、神经变性(包括黄斑变性、阿尔茨海默氏病和帕金森病)等等。衰老相关疾病和病症包括但不限于心血管疾病和病症、炎症性疾病和病症、自身免疫性疾病和病症、肺部疾病和病症、眼部疾病和病症、代谢疾病和病症、神经系统疾病和病症(例如，神经退行性疾病和病症)；衰老引起的与年龄有关的疾病和病症；皮肤状况；与年龄有关的疾病；皮肤病和病症；和移植相关的疾病和病症。

与β-半乳糖苷酶活性升高相关的疾病

在另一个实施方案中，所述治疗剂可用于治疗与升高的β-半乳糖苷酶活性相关联或相关的疾病或病症。在优选的实施方案中，升高的β-半乳糖苷酶活性是β-半乳糖苷酶表达升高或β-半乳糖苷酶活性相对于基线水平过度表达的结果，这可以通过标准方法确定。在细胞中可以通过组织化学或免疫组织化学方法检测β-半乳糖苷酶的表达。例如，可以通过已知方法检测衰老标志物SA-β半乳糖苷酶(SAβ-Gal)(Dimri等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9363-9367(1995))。

在本发明的更优选的实施方案中，所述疾病选自新生儿早衰症的Wiedemann-Rautenstrauch综合征、成人早衰症的Werner综合征、Hutchinson-Gilford综合征、Rothmund Thompson综合征、Mulviii-Smith综合征、Cockayne综合征、先天性角化不良、特发性肺纤维化、再生障碍性贫血、肺气肿、2型糖尿病和软骨退化。

Hutchinson-Gilford早衰综合症(“早衰症”或“HGPS”)是一种罕见的致命遗传病，其特征是儿童出现加速衰老。尽管他们出生时看起来很健康，但早衰症儿童在生命的头两年内开始表现出许多加速衰老的特征。早衰迹象包括生长障碍、身体脂肪和头发减少、皮肤老化、关节僵硬、髋关节脱位、全身动脉粥样硬化、心血管(心脏)疾病和中风。其他早衰综合征包括WerneR’s综合征，也称为“成人早衰”，其直到青少年晚期才发病。早衰症无法治愈，但如果孩子的关节僵硬，职业和物理治疗可以帮助他们保持活动。所公开的组合物和方法可以缓解与早衰综合症相关的加速老化症状。下面的实例表明，使用反义寡核苷酸(AON)从HGPS小鼠模型(LAKI)获得的细胞中L1 RNA的消除恢复了表观遗传标志物的水平并降低了衰老相关基因的表达，延长了寿命。

心血管疾病

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是心血管疾病。实例包括但不限于动脉粥样硬化、心绞痛、心律失常、心肌病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、颈动脉疾病、心内膜炎、冠状动脉血栓形成、心肌梗塞、高血压、主动脉瘤、心脏舒张功能障碍、高胆固醇血症、高血脂、二尖瓣脱垂、外周血管疾病、心脏应激抵抗、心脏纤维化、脑动脉瘤和中风。在一个优选的实施方案中，衰老相关疾病或病症与动脉粥样硬化(即动脉的硬化)有关或由其引起。

动脉粥样硬化的特征是斑片状的内膜斑块(粥样斑块)，其侵入中型和大动脉的管腔上。施用根据本发明的治疗剂可以降低受试者血管中动脉粥样硬化斑块的脂质含量和/或增加纤维帽厚度。

炎症和自身免疫性疾病和病症

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是炎性或自身免疫性疾病或病症。自身免疫疾病的非限制性实例包括骨质疏松症、骨关节炎、银屑病、口腔粘膜炎、类风湿性关节炎、炎性肠病、湿疹、脊柱后凸(脊柱弯曲)、椎间盘突出和肺部疾病、COPD和特发性肺纤维化。在一个优选的实施方案中，衰老相关疾病或病症是慢性炎症。

慢性炎症被认为是与骨关节炎相关的主要年龄相关因素。与衰老、关节过度使用和肥胖相结合，似乎会促进骨关节炎。通过选择性杀死衰老细胞，本发明的治疗剂可以减少或抑制关节中蛋白多糖层的损失或侵蚀，减少受影响关节的炎症，并促进胶原蛋白的产生。去除衰老细胞会导致关节中产生的炎性细胞因子(如IL-6)的数量减少，并减少炎症。

因此，在一些实施方案中，衰老相关疾病或病症可以是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是慢性炎症性病症，其通常会影响手和脚的关节。

在其他实施方案中，衰老相关疾病或病症是骨质疏松症。骨质疏松症是进行性骨病，其特征是骨量和密度下降，这可能导致骨折风险增加。骨矿物质密度(BMD)降低，骨微结构恶化，骨中蛋白质的数量和种类发生改变。在本发明的其他实施方案中，所公开的治疗剂用于处理突出的椎间盘。椎间盘突出的受试者在血液和血管壁中表现出细胞衰老的升高存在(Roberts等人(2006)Eur.Spine J.15Suppl 3:S312-316)。

神经系统疾病或病症

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是选自阿尔茨海默氏病(和其他痴呆)、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、轻度认知障碍(MCI)、黄斑变性和运动神经元功能障碍(MND)的神经系统疾病或病症，以及眼睛的疾病和病症，例如与年龄相关的黄斑变性。

帕金森病(PD)是以运动缓慢(运动迟缓)、颤抖、僵硬、姿势不稳定和失去平衡为特征的大脑致残病状。许多这些症状是由于大脑中某些神经的丧失，其导致多巴胺缺乏。产生多巴胺的神经元的衰老被认为是通过产生活性氧导致观察到的PD中细胞死亡。

阿尔茨海默氏病(AD)是神经退行性疾病，其表现为缓慢进行性的智力衰退，伴有记忆力减退、定向障碍和意识模糊，导致严重的痴呆症。随着疾病的发展，会出现判断力受损、意识模糊、行为改变、定向障碍以及行走和吞咽困难。年龄是发生AD的单一最大诱发风险因素，其是年老人痴呆的主要原因(Hebert等人，Arch.Neurol.60:1 19-1122(2003))。早期临床症状显示与轻度认知障碍显著的相似性。

轻度认知障碍(MCI)是脑功能综合征，其涉及认知障碍的发生和发展，超出基于个人年龄和教育的预期，但不足以干扰个人的日常活动。MCI是认知老化的一个方面，其被认为是正常老化与其可能转化为痴呆之间的过渡状态(Pepeu，Dialogues in ClinicalNeuroscience,6:369-377,2004)。主要影响记忆的MCI被称为“遗忘型MCI”，通常被视为阿尔茨海默氏病的前驱期。影响除记忆以外的思维技能的MCI被称为“非遗忘型MCI”。

MND是一组进行性神经系统病症，其破坏运动神经元，所述运动神经元是控制自主肌肉活动，例如说话、行走、呼吸和吞咽的细胞。MND的实例包括肌萎缩侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig病、进行性延髓麻痹、假性延髓麻痹、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩、下运动神经元疾病和脊髓性肌萎缩(SMA)(例如，SMA1(也称为Werdnig-Hoffmann病)、Kugelberg-Welander综合征和肯尼迪病、脊髓灰质炎后综合征和遗传性痉挛性截瘫。

眼科疾病和病症

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是眼部疾病、病症或病状。实例包括但不限于老花眼、黄斑变性、白内障和青光眼。黄斑变性是神经退行性疾病，其引起视网膜中央部分(称为黄斑)的感光细胞丢失。

代谢疾病

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是选自糖尿病、糖尿病性溃疡、代谢综合征和肥胖症的代谢疾病。

衰老细胞被理解为在代谢疾病中发挥作用，例如肥胖症和2型糖尿病。研究已经显示，肥胖小鼠的脂肪组织显示衰老标志物SA-p-Gal、p53和p21的诱导(Tchkonia等人，AgingCell 9：667-684(2010)；Minamino等人，Nat.Med.15:1082-087(2009))。肥胖中衰老细胞的诱导具有潜在的临床意义，因为促炎性SASP组分也被认为促进2型糖尿病。衰老标志物和SASP组分上调的类似模式与小鼠和人类的糖尿病有关。因此，本文所述的治疗剂在处理或预防2型糖尿病、肥胖症和代谢综合征方面具有潜在的应用。

肺部疾病或病症

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是肺病。实例包括但不限于肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和与年龄相关的肺功能丧失。

COPD是肺部疾病，其定义为由肺组织破裂(肺气肿)和小气道功能障碍(阻塞性细支气管炎)导致的持续不良气流。肺纤维化是慢性进行性肺部疾病，其特征是肺硬化和瘢痕形成，可能导致呼吸衰竭、肺癌和心力衰竭。本发明的治疗剂还可用于治疗老化且肺功能丧失(或退化)(即，与年轻受试者相比肺功能下降或受损)和/或肺组织退化的受试者。

其他与年龄有关的病症

在一些实施方案中，所治疗的衰老相关疾病或病症是选自肾病、肾衰竭、虚弱、听力损失、肌肉疲劳、皮肤状况、皮肤伤口愈合、肝纤维化、胰腺纤维化、口腔粘膜下纤维化和少肌症的年龄相关病症。

皮肤科疾病或病症

在本发明的一个优选实施方案中，衰老相关疾病或病症是皮肤病学疾病或病症，实例包括但不限于湿疹、银屑病、色素沉着过多、痣、皮疹、特应性皮炎(湿疹和炎症相关的一种形式)、荨麻疹、与光敏性或光老化有关的疾病和病症、皱纹(因老化而产生的皱纹)；瘙痒症(与糖尿病和老化有关)；感觉迟钝(与糖尿病和多发性硬化症相关的化学治疗副作用)；湿疹性药物疹(经常在年老患者中观察到，并与某些药物的副作用有关)；嗜酸性皮肤病(与某些类型的血液学癌症有关)；反应性中性粒细胞皮肤病(与诸如炎症性肠综合征等的潜在疾病相关)；天疱疮；类天疱疮；免疫大疱性皮肤病(皮肤自身免疫性水疱)；皮肤纤维组织细胞增生；皮肤淋巴瘤；和皮肤狼疮。迟发性狼疮可能与老化相关的T细胞和B细胞以及细胞因子(免疫衰老)的功能降低(即减少)有关联。

寿命和与年龄有关的疾病或病症

在一个优选的实施方案中，本文所述的治疗剂可用于通过选择性杀死衰老细胞而不是非衰老细胞来延长受试者的寿命。在一些实施方案中，延长受试者的寿命包括延迟与年龄相关的疾病或病症的发作或发展。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症选自动脉粥样硬化、心血管疾病、癌症、关节炎、痴呆、白内障、骨质疏松症、糖尿病、高血压、与年龄相关的脂肪减少、脂肪营养不良和肾病。在一些实施方案中，年龄相关疾病或病症是年老焦虑症。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是与年龄相关的不活动性。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是自发活动的减少。在一些实施方案中，与年龄相关的疾病或病症是探索行为的减少。

实施例

实施例1

材料和方法

SSK1和SSK2的合成

除非另有说明，所有反应均在氮气环境下用干燥溶剂在无水条件下进行。除非另有说明，否则试剂均以最高商业质量购买，无需进一步纯化。产率通过色谱法测量。

通过薄层色谱在Yantai Chemicals(China)提供的平板(GF254)上，使用UV光作为显色剂，磷钼酸和硫酸铈的乙醇溶液和热作为显影剂来监测反应。除非另有说明，快速柱色谱均使用Tsingtao Haiyang Chemicals(China)提供的硅胶(200-300目)。

在Brüker Advance 600(¹³C 150MHz,¹⁹F 565MHz)和Brüker Advance 400(¹H400MHz)光谱仪上记录NMR光谱，所述光谱仪使用残留的未氘化溶剂(在3.31ppm ¹H NMR处的CD₃OD，49.0ppm ¹³C NMR)校准。以下缩写用于解释多重性：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，dd＝双峰的双峰，m＝多重峰。

使用Brüker Apex IV FTMS使用ESI(电喷雾电离)获得质谱数据。

1.吉西他滨

将吉西他滨(2.0当量，0.340mmol，89.5mg)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(2.5当量，0.424mmol，70μL)溶解在4mL DMF(二甲基甲酰胺)中。将混合物在微波反应容器中搅拌20分钟，然后加入1((2R,3S,4S,5R,6S)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(2-硝基-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(1当量，0.170mmol，113mg)(21)。将反应置于CEM Discover微波反应器(100℃)并照射45分钟，然后真空除去DMF，残留物通过快速柱色谱纯化，以得到作为白色固体的所需产物SSK1(39.5mg，29％产率)。

R_f＝0.3(二氯甲烷：丙酮＝2:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ8.31(d,J＝7.6Hz,1H),7.90(s,1H),7.69(d,J＝8.6Hz,1H),7.47(d,J＝8.6Hz,1H),7.31(d,J＝7.6Hz,1H),6.24(t,J＝7.2Hz,1H),5.47(d,J＝3.4Hz,1H),5.39(d,J＝3.3Hz,1H),5.38(s,1H),5.27-5.24(m,3H),4.35(t,J＝6.5Hz,1H),4.32-4.26(m,1H),4.21(d,J＝6.4Hz,2H),3.99-3.94(m,2H),3.81(dd,J＝12.9,3.2Hz,1H),2.18(s,3H),2.08(s,3H),2.04(s,3H),1.97(s,3H)；¹³CNMR(150MHz,CD₃OD)δ172.01,171.93,171.41,171.26,165.22,157.29,154.18,150.26,145.72,142.22,134.66,132.87,125.72,123.89(t,J＝258.9Hz),119.81,101.03,97.02,86.34(t,J＝32.0Hz),82.76(t,J＝3.8Hz),72.58,71.96,70.14(t,J＝23.0Hz),69.50,68.56,66.90,62.60,60.25,20.69,20.65,20.50,20.49；¹⁹F NMR(565MHz,CD₃OD)δ-119.06(dd,J＝239.7,9.8Hz,1F),-119.91(d,J＝241.7Hz,1F)；HRMS-ESI(m/z):C₃₁H₃₅F₂N₄O₁₈[M+H⁺]理论值789.1909，实际值789.1907。

在0℃下，向MeOH(4mL)中的2(1.0eq.，22.8μmol，18.0mg)的溶液中加入K₂CO₃(1.0eq.,22.8μmol,3.2mg)。所得溶液在0℃下搅拌。在起始材料2完全消耗后(约2小时，通过TLC监测)，将溶液用HCl(1M)中和至pH 7，过滤并浓缩。通过快速柱色谱纯化残余物以得到呈白色固体的所需产物3(SSK2，7.0mg，49％产率)。

R_f＝0.3(乙酸乙酯：甲醇＝3:1)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD):δ8.31(d,J＝7.7Hz,1H),7.90(d,J＝2.2Hz,1H),7.66(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.47(d,J＝8.8Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,1H),6.24(t,J＝7.3Hz,1H),5.22(s,2H),5.05(d,J＝7.7Hz,1H),4.33-4.25(m,1H),3.98-3.93(m,2H),3.89(d,J＝3.4Hz,1H),3.85-3.71(m,5H),3.58(dd,J＝9.7,3.4Hz,1H)；HRMS-ESI(m/z):C₂₃H₂₇F₂N₄O₁₄[M+H⁺]的理论值621.1486，实际值621.1475。

细胞培养和处理

小鼠原代细胞分离

如前所述(Zhao等人，Cell Stem Cell 23,31-45e37(2008))，从E13.5胚胎分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。从第1-3天新生小鼠的皮肤中分离新生小鼠皮肤成纤维细胞(NBF)。从2个月大和23个月大的小鼠中分离成年小鼠肺成纤维细胞。简而言之，小鼠胚胎组织、皮肤和肺是从所描述的供体小鼠中获得的。然后，将这些组织用镊子切碎并在2mg/ml胶原酶IV(Gibco)中在37℃下温育2-4小时。酶处理后，通过离心收集细胞并重悬于补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素(Gibco)的高葡萄糖DMEM(Gibco)中。三种类型的小鼠原代细胞均在37℃和5％CO₂的加湿培养箱中培养。

人类原代细胞分离

本研究获得北京大学审查委员会研究所(Institute of Review Board inPeking University)(IRB 00001052-15087)的批准，并按照批准的方案进行。根据中日友好医院(China–Japanese Friendship Hospital)的伦理批准程序，从知情同意的捐赠者收集样本。

如前所述获得人胚胎皮肤成纤维细胞(HEF)。简而言之，在获得患者知情同意的情况下从流产组织中获得的人胚胎皮肤组织用镊子切碎并在1mg/ml胶原酶IV中在37℃下温育1-2小时。酶处理后，通过离心收集细胞并重悬于含有10％胎牛血清(FBS，Ausbian)、1％GlutaMAX(Gibco)、1％非必需氨基酸(NEAA,Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的HEF培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Gibco)中。将细胞铺在10cm组织培养皿上并在10％FBS DMEM中生长。

细胞静止和衰老诱导

为了避免复制诱导的衰老细胞，低代增殖NBF(<3代)、MEF(<3代)、小鼠肺成纤维细胞(<3代)、HEF(<10代)和HUVEC(<6代)用作正常对照。为了诱导细胞静止，MEF在不含FBS的DMEM中培养2天。

对于复制诱导的衰老，传代细胞，直到它们失去增殖能力并开始衰老。NBFs在大约8-9次传代或12次群体倍增后用作衰老细胞。在大约35次传代或50次群体倍增后使用HEF。HUVEC在大约18次传代或24次群体倍增后衰老。

对于电离放射诱导的衰老，MEF和HEF在RS 2000X-射线生物放射器(Rad SourceTechnologies,Inc.)中以1.205Gy/min的剂量率暴露于10Gy的电离辐射。辐射后的当天，MEF或HEF以1:3的稀释度进行传代，并再培养三天。然后将这些细胞铺板以进行进一步的实验。

对于通过KRas异位表达的癌基因诱导的衰老，用含有pLenti-PGK-KRAS的慢病毒或对照载体(Addgene,35633)转染细胞。病毒感染后的一天，更换培养基，将转染的细胞再培养3天，并以1:3的稀释度进行传代。再培养3天后，细胞变得衰老到足以进行进一步分析。

对于依托泊苷诱导的衰老，MEF用2μM依托泊苷处理20小时，HEF用10μM依托泊苷处理12-18小时。处理后三天，在进一步分析之前，将细胞以1:3的比例在新鲜培养基中传代培养72小时。

对于过氧化氢(H₂O₂)诱导的衰老，细胞在含有200μM H₂O₂的培养基中培养4小时或在100μM中培养12小时，然后在新鲜培养基中培养数天，直到它们失去增殖能力。

质粒构建和慢病毒产生

用于用短发夹RNA(shRNA)干扰GLB1表达的质粒获自Sigma MISSION shRNA。根据制造商的方案进行基因敲减。shRNA序列列于表1。

表1.shRNA的序列

慢病毒的产生、收集和感染如(Zhao等人,Cell Stem Cell 3,475-479(2008))所述。

SSK1代谢分析

为了检测衰老和非衰老细胞中从SSK1释放的吉西他滨，按照之前报道的进行代谢分析(Karampelas等人，Mol Pharmaceut 14,674-685(2017))。简而言之，将衰老和非衰老细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中与0.5μM SSK1温育指定的时间。然后将细胞用水稍微洗涤两次，然后进行收集。用于提取化合物和样品的冷甲醇在离心后制备。通过LC-MS/MS分析确定吉西他滨的浓度。

流式细胞术分析

通过与0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37℃下温育3-5分钟或在37℃下与accutase温育10分钟，将成纤维细胞消化成单细胞悬液。然后根据制造商的方案(FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I，BD Pharmingen^TM)用FITC膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色细胞。对于软骨细胞膜联蛋白V/7-AAD分析，收集胰蛋白酶化的活软骨细胞和漂浮细胞，离心并用PBS洗涤。根据制造商的说明，用膜联蛋白V Apoptosis Detection Kit(Biolegend，640934)对细胞进行染色。在流式细胞术分析前，加入精确计数珠(Biolegend，424902)以计算绝对活细胞数。流式细胞术在一小时内在Aria III(BD Biosciences)或FACSVerse(BD Biosciences)上进行。使用FlowJo软件(FlowJo LLC)分析数据。

蛋白质印迹

将衰老的NBF细胞铺板并在37℃下温育过夜。细胞用0.05μM吉西他滨或0.5μMSSK1前药处理指定时间。收集前，细胞用预冷的PBS缓冲液洗涤两次。用裂解缓冲液(50mMTris-HCl(pH 7.5)、137mM氯化钠、1mM EDTA、1％Nonidet P-40、10％甘油、0.1mM原钒酸钠、10mM焦磷酸钠、20mMβ-甘油磷酸酯、50mM氟化钠、1mM苯甲基磺酰氟)提取总蛋白，并且使用BCA Protein Assay Kit(Pierce)将蛋白质浓度归一化。将蛋白质样品与蛋白质加载缓冲液混合，并在95℃下温育5分钟。通过使用以下抗体进行蛋白质印迹：磷酸特异性p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(Cell Signaling Technology,CST,目录号4511)和p38(CST,目录号8690)；磷酸组蛋白H2A.X(Ser139)(CST，目录号9718)和组蛋白H2A.X(CST，目录号7631)。还通过使用β-微管蛋白抗体(CST，目录号2128)将β-微管蛋白水平确定为上样对照。表2中列出了用于蛋白质印迹的所有抗体。

表2.用于蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫荧光染色的抗体

基因	抗体	目录号
			p38	兔mAb	4511(CST)
p38	兔mAb	8690(CST)
			H2A.X	兔mAb	9718(CST)
H2A.X	兔mAb	7631(CST)
			β-微管蛋白	兔mAb	2128(CST)
F4/80	大鼠mAb	6640(Abcam)
			p21	兔mAb	188224(Abcam)

小鼠

所有动物实验均按照Animal Protection Guidelines of Peking University,China进行。C57BL/6(C57)小鼠获自Beijing Vital River Laboratory AnimalTechnology Co,Ltd.，并饲养在无特定病原体设施(SPF)条件下，12光/12暗循环，自由进食和饮水。年老雄性小鼠单独笼养，雌性小鼠和同窝雄性幼仔每笼不超过五只进行饲养。

药物处理

所有药物在90％PBS、5％Tween-80(P1754,Sigma)和5％聚乙二醇(PEG)(81172,Sigma)中混合，并通过腹膜内(i.p.)注射向小鼠施用。为了处理博来霉素损伤的年轻小鼠，每周连续两天给予SSK1(0.5mg/kg)或运载体，持续五周。对于年老的小鼠(20个月大)，每两周施用SSK1(0.5mg/kg)、吉西他滨(0.5mg/kg)或运载体，持续3天。吉西他滨购自MCE。

博来霉素诱导的肺纤维化和衰老

博来霉素购自Selleck。为了诱导肺衰老和纤维化，如先前报道的(Bivas-Benita等人，Eur J Pharm Biopharm 61,214-218(2005))，对年轻的雄性和雌性小鼠(3个月大)进行了经气管注射博来霉素(1mg/kg)。

培养细胞和冰冻切片的β-半乳糖苷酶染色

培养的细胞用PBS洗涤一次，并在β-半乳糖苷酶染色固定液中室温固定15分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，并与β-半乳糖苷酶染色溶液(Beyotime Biotechnology)在37℃下温育16-20小时。对于12孔板，向每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶染色溶液。平板用Parafilm密封以防止染色介质的蒸发。过夜温育后，用PBS洗涤细胞并在明场显微镜下观察。对于冰冻切片的β-半乳糖苷酶染色，冰冻切片在37℃下干燥20-30分钟，然后在β-半乳糖苷酶染色固定液中室温固定15分钟。冷冻切片用PBS洗涤3次，用β-半乳糖苷酶染色液在37℃温育过夜。β-半乳糖苷酶染色完成后，用曙红染色切片1-2分钟，在流水下冲洗1分钟，在1％酸性醇中分化10-20秒，再次在流水下冲洗1分钟。切片在增加浓度的醇中脱水并在二甲苯中透明化。排出多余的二甲苯并将盖玻片放在切片上。干燥后，在显微镜下观察样品。

SA-β-Gal组织染色的定量

通过ImageJ软件(NIH)定量SA-β-Gal染色的肺、肝和肾冰冻切片以测量SA-β-Gal阳性面积。用ImageJ软件(NIH)通过曙红阳性面积定量总面积。用SA-β-Gal阳性面积除以总面积计算相对阳性SA-β-Gal阳性细胞。每只小鼠测量3-5个区域。

免疫组织化学染色

为了检测肺中p21的表达，我们使用免疫组织化学染色试剂盒(SP-9000，ZSGB-BIO)对p21进行了免疫组织化学染色实验。新鲜分离的组织用10％福尔马林固定一天，然后转移到20％福尔马林中一天。然后将组织块脱水并包埋在石蜡中。将包埋的组织切割并贴在载玻片上。在免疫组织化学染色前，将载玻片脱蜡、再水化，并在Tris/EDTA pH 8.0缓冲溶液中通过高压和高温进行抗原回收。根据制造商的说明进行免疫组织化学染色。p21的一抗(Abcam,ab188224)按1:150稀释并列于表2中。

免疫荧光染色

小鼠肝组织在4％多聚甲醛(DingGuo，AR-0211)中室温下固定24小时，并用分级蔗糖溶液(分别为20％和30％，24小时)脱水，然后包埋到OCT化合物(Sakura)中用于冷冻切片。将包埋的组织切割并贴在载玻片上。在免疫组织化学染色前，切片在4％多聚甲醛(DingGuo，AR-0211)中室温下固定15分钟，用含有0.25％Triton X-100(Sigma-Aldrich，T8787)和2％正常驴血清(Jackson ImmunoResearch Laboratories,017-000-121)的PBS中室温下封闭1小时。用于免疫荧光染色的样品与一抗：抗F4/80抗体(Abcam，ab6640)在4℃下温育过夜，用PBS洗涤3次，然后与适当的二抗：Alexa

488AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories,712-545-150)在37℃下温育1.5小时。用Hoechst 33342(Sigma-Aldrich,B2261)染色细胞核。

为了定量F4/80阳性细胞，使用共聚焦激光内窥镜检查(LSM 710NLO&DuoScanSystem)在相同曝光下以20倍放大率随机拍摄图像，然后通过ImageJ进行分析。每只小鼠测量至少6-10个区域。

RT-qPCR

使用Direct-zol RNA MiniPrep Kit(Zymo Research,R2072)分离总RNA。用DNase处理RNA并使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGenBiotech,AT311-03)转化为cDNA。使用Kapa

FAST qPCR Kit Master Mix(KapaBiosystems,KM4101)在CFX Connect^TM Real-Time System或CFX96^TM Real-Time System(Bio-Rad)上进行qPCR。使用2^(-ΔΔCt)方法分析数据。Gapdh用作对照以归一化靶基因的表达。RT-qPCR的引物列于表3。

表3.用于RT-qPCR的引物

细胞活力测试

为了测试用SSK1处理的衰老和非衰老细胞的活力，用Hoechst 33342和碘化丙锭(PI)(CA1120,Solarbio)的混合物对细胞进行染色，以区分活细胞和死细胞。用小分子处理后，除去细胞培养基，用PBS洗涤细胞一次。然后，根据制造商的方案对细胞进行染色，其中Hoechst 33342和PI在PBS缓冲液中的最终浓度为5μg/ml和2μg/ml。将平板在4℃下温育30分钟，然后在荧光显微镜或自动细胞成像系统上观察。使用MD Image Xpress Micro XL(Molecular Devices)定量活细胞。

Cell Counting Kit–8(CCK-8)分析也用于评估细胞活力。将衰老和非衰老细胞或软骨细胞接种到96孔板中并培养过夜。然后用运载体(0.05％DMSO)或不同浓度的SSK2处理细胞。48小时或72小时后，将CCK-8溶液(C0041，Beyotime)以1:10的比例加入每个孔中，并温育2小时。在450nm波长处测量吸光度。

ELISA分析

收集小鼠血液样品，在室温下保温2小时或在4℃下过夜，然后离心(3000rpm，10分钟)以获得血清。使用小鼠白细胞介素1α(IL1α)ELISA试剂盒(CSB-E04621m,CUSABIO)、小鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISA试剂盒(CSB-E04741m,CUSABIO)和IL-6(Interleukin-6)小鼠ELISA试剂盒(ab100712,Abcam)根据制造商的说明测量小鼠IL1α、IL6和TNFα的分泌。

身体机能测量

在最后一剂药物施用后至少5天进行所有机能测定。

转棒测试

转棒测试用于用加速RotaRod系统(SANS Bio Instrument，China，SA102)评估运动协调和平衡性。将小鼠置于以4rpm/min的初始速度转动的棒上的不同道中。该装置设置为在300秒内从4rpm/min加速到44rpm/min。使用计时器记录每只小鼠何时跌落或粘在棒上和何时完成完整的被动转动。小鼠在第1天和第2天至少接受两次训练，并在第3、4和5天进行测试。结果是超过3次试验的平均值。

跑步机疲劳测试

跑步机疲劳测试用于评估运动能力和耐力。以5°的倾斜度，0.5mA 电刺激(SANSBio Instrument,China,SA102)使用电动跑步机。小鼠被训练三天，以5m/min的初始速度开始2分钟，然后加速到7m/min持续2分钟，然后加速到9m/min持续1分钟。经过三个训练课程和一天的休息，在第五天以5m/min的初始速度对小鼠进行测试，每2分钟增加2m/min，直到小鼠无法回到跑步机上。记录每只小鼠在筋疲力尽前行进的距离(m)。

全肢抓握力测定

小鼠被放置在网格(抓握力计，Columbus Instruments)的顶部，因此它们用所有四只爪子抓住网格。将仪表设置为峰值张力(T-PK)模式并记录超过七次试验的抓握力。将抓握力(N)平均，排除最大和最小数据点。

杠杆式天平

小鼠被放置在距离地板60cm的1-m长、6-mm宽的平衡木上。装满来自家庭笼子的筑巢材料的黑盒子被放置在平衡木装置的末端作为终点。第一天，老鼠在第一天接受了3次训练，可以毫不犹豫、不加观察地成功地穿过平衡木走向保险箱。在测试当天，通过两个运动检测器测量穿过中心80cm标记的时间(s)：一个在启动计时器的0cm处，另一个在停止计时器的80cm处

饲养行为测试

将小鼠从饲养室带到测试室，并在测试前允许其适应新环境至少30分钟。小鼠被小心地放置在一个14-cm高、11-cm直径的透明圆柱体中，并用摄像机记录5分钟。分析所得视频以测量饲养频率(当小鼠仅用后腿站立，将前肢抬离地面，并直立超过1秒时)。

RNA测序

使用Direct-zol RNA MiniPrep Kit(Zymo Research)分离总RNA。使用NEBNextUltra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB England BioLabs)构建RNA测序文库。使用Illumina HiSeq X 10对片段化和随机引物化的2×150bp配对末端文库进行测序。RNA测序和原始数据质量控制由Novogene Co.,Ltd.进行。

测序数据质量通过FastQC(版本0.11.8,http://www.bioinformatics.babraham .ac.uk/projects/fastqc/)检查。测序数据通过TopHat2(版本2.1.1，https:// ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)与mm10基因组参考比对。每百万映射片段的每千碱基片段数(FPKM)由Cufflinks(版本2.2.1)计算。对于差异基因表达分析，获得每个基因的读数计数HTSeq(版本0.11.1，https://htseq.readthedocs.io/en/ release0.11.1/)。由R包edgeR(版本0.38.0，https://bioconductor.org/packages/ release/bioc/html/edgeR.html)计算的不同条件的前导对数倍数变化用作基因集富集分析的输入。小鼠分子特征的基因组由msigdbr(版本7.0.1，https://cran.r-project.org/ web/packages/msigdbr/index.html)获得。在这个包中，Molecular Signatures Database(MSigDB v7.0,http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)的原始人类基因被转换为非人类模式生物的同源基因。基因集富集分析由clusterProfiler(版本3.14.0)(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ clusterProfiler.html)进行。R(版本3.6.0，https://cran.r-project.org/)用于基因表达分析。

使用DAVID 6.8功能注释工具进行Gene ontology(GO)术语富集分析。通过比较年老和年轻小鼠或SSK1处理和运载体处理的年老小鼠之间的基因表达，利用t-检验统计来选择基因列表：倍数变化＞2且P值<0.05。

xCell用于根据表达数据进行细胞类型富集分析(Aran等人，Genome Biol 18,220(2017))。xCell可以通过使用从多种来源的数千种纯细胞类型中学习到的基因特征，将组织表达谱分解为64种免疫和基质细胞类型的富集分数。根据MGI数据库(http://www.informatics.jax.org/downloads/reports/HOM_MouseHumanSeque nce.rpt)中的“Human and Mouse Homology Classes with Sequence information”表，将每个小鼠基因符号转换为人类同源基因符号。为重复的基因符号选择具有最高表达水平的转换基因符号。log2(FPKM+1)值用作表达水平。将同源性转换后的表达矩阵上传到xCell在线版(https://xcell.ucsf.edu/)以计算细胞类型富集分数。

血液分析

对于血常规检查，从每只小鼠收集50μl新鲜血液并立即与EDTA混合。通过CelltacAlpha MEK-6400系列血液分析仪(Nihon Kohden，MEK-6400)分析血液样品。对于血清生化分析，收集血液样品，在室温下凝固2小时或在4℃下凝固过夜，然后离心(1000g，10分钟)以获得血清。将200μl血清等分并通过化学分析仪(Mindray,BS-350E)分析丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿酸(UA)和肌酐(CREA)。

统计学分析

对于统计学分析，在Excel或GraphPad Prism 8中使用默认参数通过t检验(仅比较两组时)或单因素方差分析(比较两组以上时)计算P值。所有结果均表示为均值±sem，n表示小鼠数量。P值如下：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

结果和讨论

为了设计SA-β-gal反应性前药，对一组FDA批准的药物进行了测试，以选择对衰老细胞具有强细胞毒性的化合物。测试表明，吉西他滨(如下所示)可能是用于设计抗衰老药物的合适候选者，因为1)它有效且有力地杀死小鼠和人类衰老细胞(图1A)，由于其短的暂血浆循环时间，它展示出降低的全身毒性(Mini,等人Ann Oncol 17Suppl 5,v7-12(2006),Plunkett等人,Seminars in Oncology 22,3-10(1995).)。

此外，吉西他滨具有4-氨基，这是前药开发的合适位点((Moysan,等人MolecularPharmaceutics 10,430-444(2013))。吉西他滨通过将SA-β-gal反应性部分引入其主链而用于合成衰老特异性杀伤化合物1(SSK1，如下所示)(Ghosh等人，Tetrahedron Letters41,4871-4874(2000))，其包括乙酰基，用于改善化合物的细胞渗透性(Sarkar等人，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States ofAmerica 92,3323-3327(1995))。

通过将SSK1施用于复制诱导的衰老小鼠胚胎成纤维细胞及其非衰老对应物，并监测细胞中吉西他滨的释放作为时间的函数，进行实验以确定与非衰老细胞相比时，SSK1在衰老细胞中代谢为吉西他滨。SSK1被特异性切割以在衰老细胞而不是非衰老细胞中释放细胞毒性吉西他滨(图1A)。该结果表明SSK1对衰老细胞可能是致命的，但对非衰老细胞是安全的。

为了测试SSK1选择性杀死衰老细胞的能力，用SSK1处理原代小鼠成纤维细胞及其复制诱导的对应物。这些研究表明，SSK1选择性地且有效地消除了SA-β-gal阳性衰老细胞而不是非衰老细胞，具有广泛的治疗窗口，而吉西他滨则杀死了两种细胞类型(图2E，图1C和1D。为了解决SA-β-gal活性在SSK1清除衰老细胞中的活性，RNA干扰用于降低GLB1的表达，GLB1是编码SA-β-gal的基因(Lee等人，Aging Cell 5,187-195(2006))。GLB1的敲减降低了SA-β-gal活性(图1E)，并削弱了SSK1杀死SA-β-gal阳性衰老细胞的能力，提示其对衰老细胞的特异性取决于SA-β-gal活性(图1F)。因为吉西他滨可以通过激活p38 MAPK诱导细胞死亡(Habiro等人,Biochem Biophys Res Commun 316,71-77(2004)；Koizumi等人,Anticancer research 25,3347-3353(2005))，通过蛋白质印迹在SSK1处理的衰老细胞中检测p38 MAPK的状态。处理36小时后，SSK1通过磷酸化激活p38 MAPK并诱导衰老细胞中的凋亡(图2A和2B)。p38MAPK抑制剂SB203580、Birb796和SB202190损害了SSK1特异性杀死衰老细胞的能力(图2C)。这些结果提示SKK1被SA-β-gal激活并通过激活p38 MAPK和诱导细胞凋亡选择性地杀死衰老细胞。

进一步测试了SSK1对小鼠和人类衰老细胞的特异性。首先，用SSK1处理由电离辐射、致癌基因过表达或基因毒性应激(依托泊苷处理)诱导的衰老小鼠成纤维细胞。由多种刺激诱导的这些衰老细胞被SSK1选择性杀死，而非衰老细胞很大程度上不受影响(图2D)。其次，用SSK1处理来自23个月大小鼠的衰老肺细胞，数据显示，与来自年轻(3个月)小鼠的非衰老肺细胞相比，SSK1特异性消除了这些衰老细胞(图2E)。第三，为了解决物种之间SSK1功效的任何差异，用SSK1处理由不同刺激物诱导的人类衰老成纤维细胞(数据未显示)。与其非衰老对应物相比，由不同应激诱导的这些人类衰老细胞被SSK1清除。运载体或SSK1处理的衰老细胞群中细胞活力百分比的定量显示响应SSK1处理的衰老细胞呈剂量依赖性降低(图2F)。最后，用SSK1处理衰老的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，数据显示与非衰老的HUVEC相比，衰老的HUVEC被SSK1选择性杀死(图2G并且数据未显示)。总的来说，我们的结果证明SSK1以独立于细胞类型和衰老刺激物的方式选择性地杀死小鼠和人类衰老细胞。

在体内测试了SSK1对衰老细胞的影响。采用了两种独立的体内衰老模型：应激诱导的过早衰老和年老小鼠的自然衰老。对于应激诱导的衰老，通过气管内滴注博来霉素在小鼠肺中诱导DNA链断裂和细胞衰老作为特发性肺纤维化模型(Moeller,等人International Journal ofBiochemistry&Cell Biology 40,362-382(2008))。在博来霉素诱导五天后通过腹膜内注射施用SSK1或运载体五周(图2H)。数据显示，与运载体处理的肺损伤小鼠相比，SSK1选择性地减少了衰老肺中的SA-β-gal阳性细胞，并使SA-β-gal阳性细胞减少了3.8倍(数据未显示和图2I)。免疫组织化学和RT-qPCR分析揭示，SSK1还减少了博来霉素损伤肺中p21阳性细胞和其他衰老相关标志物(数据未显示和图2J)。SSK1处理还减轻了肺纤维化和身体机能下降(图2J至L)。总之，这些结果表明SSK1在我们的博来霉素诱导的小鼠模型中消除了SA-β-gal阳性衰老细胞并缓解了肺损伤症状。

为了进一步检查SSK1对年老小鼠自然发生的衰老细胞的影响，间歇性地使用SSK1、运载体或吉西他滨处理20个月大的C57BL/6小鼠8周(图3A)。与运载体处理的年老小鼠相比，SSK1分别消除了年老肝、肾和肺组织中β-gal阳性衰老细胞5.9、3.5和2倍(图3B至D，数据未显示)。RT-qPCR分析显示，与运载体处理相比，SSK1还降低了年老小鼠中其他衰老标志物的表达，包括CDK抑制剂p16(肝中)和p21(肝和肾中)(图3E和F)。总的来说，我们的新前药可以减少小鼠中应激诱导的和自然积累的SA-β-gal阳性衰老细胞。

衰老细胞分泌一系列炎性细胞因子、趋化因子、蛋白酶和其他因子，统称为SASP(4)。SASP导致老化过程中的局部和全身性低度炎症、与年龄相关的退行性表型和身体机能受损(5)。我们测试了SSK1清除衰老细胞是否可以减轻年老小鼠中的慢性、低度炎症。我们发现SSK1减少了几种炎症因子，包括年老肝中的IL1α和IL1β以及年老肾中的IL6(图3E和F)。还测量了来自年老小鼠血清中的分泌蛋白水平，与运载体处理组相比，观察到来自SSK1处理组的血清中关键SASP因子IL1α、IL6、CXCL1和TNFα的分泌减少(图3G到J)。这些结果提示，我们的前药可以有效地消除衰老细胞并缓解自然老化小鼠的局部微环境中和全身性的SASP。为了进一步评估SSK1对衰老细胞清除和SASP减少的有益影响，我们检查了SSK1或运载体处理的年老小鼠的一系列身体机能。与运载体相比，SSK1处理8周显著增加了年老雌性小鼠的最大转棒时间(图4A)、跑步机距离(图4B)、抓握力(图4C)和饲养探索时间(图4D)以及减少平衡木穿越时间(图4E)，而对体重没有显著影响(图4H)。在年老雄性小鼠的转棒、跑步机和抓握力表现上也观察到了相同的结果(图4I)。因此，SKK1清除了衰老细胞，降低了SASP，并改善了身体机能。值得注意的是，在SSK1处理后的年老小鼠中，转棒和跑步机的表现比处理前的初始状态有所改善(图4F和G)，提示SKK1清除SA-β-gal阳性衰老细胞可能会潜在地恢复一些年龄-相关的功能障碍。

接下来在培养的衰老细胞和年老小鼠中将SSKI与其他报道的抗衰老化合物进行比较。当与增殖细胞相比时，ABT263选择性地杀死过氧化氢诱导的衰老人成纤维细胞，但不杀死复制诱导的细胞。此外，放射和依托泊苷诱导的衰老细胞对达沙替尼和槲皮素的组合更敏感，而非衰老和复制诱导的衰老细胞保持存活。然后我们用SSK1和已知的抗衰老药物：漆树黄酮、17-DMAG、ABT263以及达沙替尼和槲皮素的组合处理年老小鼠，以比较它们对衰老相关表型的影响(Zhu等人,Aging Cell 14,644-658(2015)；Chang等人,Nat Med 22,78-83(2016)；Fuhrmann-Stroissnigg等人,Nat Commun 8,422(2017))。当与其他抗衰老化合物相比时，SSK1处理改善了转棒、跑步机和抓握力功能(图4J)。这些结果表明，我们靶向SA-β-gal的前药代表了用于清除不同衰老细胞和预防衰老的改进方法。

此外，通过肝和肾中的基因集富集分析(GSEA)，年老小鼠的SSK1处理可以下调与衰老相关的基因特征(图5A)。这些结果表明SSK1减少了小鼠中自然积累的衰老细胞并减少了衰老标志物。GSEA分析还表明，SSK1下调与炎症反应、通过NF-κB的TNFα信号传导、IL6、JAK Stat3信号传导和趋向于其年轻对应物的水平的补体相关的基因(图5C到F)。通过基因本体论(GO)富集分析也显示了类似的结果(图6D到G)。

除了衰老细胞，据报道巨噬细胞还会引起与年龄相关的慢性炎症。由于积累的巨噬细胞倾向于显示衰老特征，例如高水平的SA-β-gal和p16表达，我们还研究了SSK1对巨噬细胞的影响。我们对F4/80阳性巨噬细胞进行了免疫荧光分析，发现这些细胞随着老化在肝中积累并且SSK1可以消除巨噬细胞浸润(图6A，数据未显示)，这可以部分解释年老小鼠中炎症细胞因子的减少。我们通过xCell方法分析的肝RNA-seq数据进一步证实了巨噬细胞积累的下降(图6B)。值得注意的是，这些结果与我们早期在肺损伤模型中的发现一致，其中用肺中炎症因子的减少观察到β-gal阳性巨噬细胞的减少(图6C)。总的来说，这些结果表明SSK1有效地缓解了局部和全身的SASP，其可能是由于消除了老化生物体中积累的衰老细胞和巨噬细胞。

GSEA分析还测试了SSK1对年龄相关特征的影响。SSK1的处理降低了老化肝和肾中与年龄相关的特征(图5B)，提示对老化组织中SA-β-gal阳性衰老细胞的清除具有潜在的有益影响。我们进一步进行GO分析，发现与肝功能密切相关的一些通路(氧化还原过程、代谢过程、脂肪酸β-氧化和线粒体)在SSK1处理的年老肝中上调(图6I)。相反，与年轻肝相比，这些GO途径在年老肝中下调(图6H)。此外，我们发现SSK1可以减轻由Masson纤维化染色揭示的肝纤维化(数据未显示和图6J)。这些发现提示SSK1清除衰老细胞有利于缓解年老小鼠中的衰老特征。

此外，从血清生化试验和血常规分析的结果来看，SSK处理没有显示出明显的系统毒性(图7A和B)。为了研究SSK1的体内毒理学作用，用高浓度(100mg/kg)和高频率的SSK1处理年老小鼠。血清生化试验和血常规分析显示这些小鼠中没有明显的全身毒性(图7C和D)。

这些研究证明，本文证明的靶向SA-β-gal的前药设计方法可以以独立于物种、细胞类型和衰老刺激的方式改善选择性消除衰老细胞。SSK1清除应激诱导的和自然发生的衰老细胞，降低SASP，并改善年老小鼠中的整体身体机能。这些发现表明，前药设计可以改善使用SA-β-gal作为靶标用于前药设计和在体外和体内衰老细胞的清除。SSK1有效清除SA-β-gal阳性衰老细胞提供了延缓老化的前瞻性方法。已证明的前药设计策略为产生直接靶向衰老进行抗老化治疗的新化合物奠定了基础。

了解SSK1在体内的毒理学作用对于临床应用至关重要。重要的是，本申请中的数据表明，高浓度(100mg/kg)和高频率SSK1处理没有明显的全身毒性。这为SSK1的体内安全性提供了强有力的证据。与SSK1效应物和批准的临床药物吉西他滨进行比较，进一步支持了这种安全性。首先，SSK1的有效体内剂量比吉西他滨的临床剂量(30mg/kg)低约60倍，表明SSK的体内毒性风险大大降低。其次，吉西他滨是核苷类似物，其有效影响快速分裂的细胞，并且吉西他滨的脱靶效应可在不同增殖细胞类型中显示出来(Bocci等人,Eur JPharmacol 498,9-18(2004)；Rettig等人,Int J Cancer 129,832-838(2011))。然而，SSK1仅靶向β-gal阳性细胞。值得注意的是，除了巨噬细胞，上述数据表明，大多数非衰老β-gal阳性细胞是快速分裂的上皮细胞。因此，相对于吉西他滨，具有SSK1敏感性的增殖细胞的潜在类型大大缩小。即使SSK1处理靶向少量β-gal阳性上皮细胞，但这些细胞具有强大的自我更新能力(Humphreys等人，Cell Stem Cell 2,284-291(2008))。与这种自我更新性质一致，目前的研究表明，肾中β-gal活性升高的上皮小管细胞具有高百分比的Ki67+细胞。在SSK1处理后，该管状细胞群中只有少数细胞显示出正在经历凋亡，并且在SSK1处理期间管状细胞的快速自我更新可以轻松修复这种微小的损伤。此外，SSK1处理的短持续时间可能会避免相关组织的显著损伤，并进一步减少其副作用。总之，本研究中的数据通过靶向β-gal以选择性去除多种细胞类型的衰老细胞，证明了SSK1策略的优越性和安全性。这些发现为处理老化相关疾病开辟了一条新途径，并为干预老化过程提供了临床机会。

实施例2

通过减轻炎症有效处理感染SARS-CoV-2的恒河猴

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)已引起2019年冠状病毒病(COVID-19)的大流行。SARS-CoV-2感染期间从轻微到严重危及生命的转变可能很快(Huang等人，2020；Wang等人，2020)。大约15％的患者发展为重症肺炎，导致呼吸衰竭和高住院死亡率，尤其是年老患者(Grasselli等人，2020；Yang等人，2020)。因此，这种情况导致迫切需要有效的COVID-19治疗策略。最近，有报道称FDA批准的抗病毒药物瑞德西韦可以缩短轻度症状患者中COVID-19的恢复时间。然而，它在治疗重症或危重症患者方面表现出局限性(Grein等人，2020；Wang等人，2020)。在这方面，仍然迫切需要开发有效的方法来处理重症或危重症患者中的COVID-19。

根据临床免疫病理学，过度炎症已成为COVID-19疾病严重程度的关键驱动因素。在临床上，SARS-CoV-2感染引起的急性免疫反应，包括免疫细胞强烈浸润和促炎细胞因子释放升高，与急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)有关(Tay等人,2020；Moore和June,2020)。此外，MERS或SARS的研究支持了过度炎症在冠状病毒诱导的综合征中的关键作用(de Wit等人,2016；Channappanavar and Perlman,2017)。因此，全球迫切需要开发可以有效处理COVID-19的过度炎症的药物。尽管已经使用了几种抗炎药来治疗COVID-19患者，但这些药物具有显著的局限性(Ritchie和Singanayagam，2020)。药物如具有广泛免疫抑制作用的类固醇可能会延迟病毒的清除，并且通常具有严重的副作用(AUYEUNG等，2005；Russell等，2020)。另一方面，靶向特定细胞因子通路的药物，例如抗IL-6R单克隆抗体，仅在一小部分患者中显示出有限的治疗效果(Luo等人，2020)，表明“细胞因子风暴”可能不仅仅是基于IL-6水平升高(Zhang等人，2020)。此外，干扰JAK/STAT3通路的抗炎治疗可能会失调I型干扰素介导的抗病毒先天免疫(Boor等人，2017)。因此，需要可靶向重症患者的炎症特征而不中断抗病毒活性的COVID-19的新临床治疗。

最近对SARS-CoV-2的大多数研究已经鉴定巨噬细胞对COVID-19中的过度炎症是关键的。巨噬细胞的浸润被认为对产生大量促炎细胞因子，包括IL-1β、IL-6和TNF-α是重要的(Giamarellos-Bourboulis等人，2020；Merad和Martin，2020)。尸检还在胎儿COVID-19患者的肺组织中鉴定到巨噬细胞的强烈浸润，并且在SARS-CoV-2感染的非人类灵长类动物模型中也发现了类似的观察结果(Xie等人，2020；Bao等人，2020)。此外，单细胞RNA测序(scRNA-seq)显示，在重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中存在的巨噬细胞的比例高于淋巴细胞的比例(Liao等人，2020)。与SARS-CoV-2的研究一致，在其他冠状病毒疾病和流感感染中也发现了巨噬细胞在肺部的浸润和积累(Qi等人，2019；Page等人，2012)。巨噬细胞的消除保护小鼠免受致命的SARS-CoV感染，突出了巨噬细胞在冠状病毒诱导的症状中的重要作用(Channappanavar等人，2016)。因此，靶向巨噬细胞以调节SARS-CoV-2感染中的过度炎症可能是治疗COVID-19患者的有效策略。

最近，我们开发了β-半乳糖苷酶激活的前药SSK1，其具有有效靶向巨噬细胞的能力。此外，SSK1治疗有效修复了促炎细胞因子水平降低的ALI动物模型中的肺损伤，显示出抗炎作用(Cai等人，2020)。在这项研究中，我们使用非人类灵长类动物研究了SSK1在治疗SARS-CoV-2感染中的治疗效果，有效地重述了COVID-19的关键病理变化。

在这里，我们证明SSK1(一种减少β-半乳糖苷酶阳性巨噬细胞的小分子)有效缓解非人类灵长类动物中由SARS-CoV-2感染引起的肺炎。重要的是，SSK1在SARS-CoV-2感染的早期和晚期都有效地减轻了临床症状并在病理上减缓了肺炎的发展。此外，我们发现了SSK1治疗的动物的肺中巨噬细胞浸润减少的抗炎作用，其伴随着外周血和肺中的细胞因子水平降低。我们的结果证明了SSK1治疗非人类灵长类动物对SARS-CoV-2感染的治疗益处，导致了针对COVID-19有效治疗的开发。

伦理和生物安全声明

所有动物实验均在National Kunming High-level Biosafety PrimateResearch Center,Yunnan,China的动物生物安全4级(ABSL-4)设施中进行。在整个实验过程中，每天监测恒河猴至少两次。训练有素的人员每天提供商业猴食、零食和水果。所有动物程序均经Institutional Animal Care and Use Committee of Institute of MedicalBiology,Chinese Academy of Medical Science(Ethics number:DWSP202002 001)批准。

研究设计

为了评估SSK1对SARS-CoV-2感染恢复期的治疗作用，我们使用了之前报道的三个不同年龄的九只恒河猴(Lu等人，2020)。所有动物均通过气管内(4.00ml)、鼻内(0.50ml)和结膜(0.25ml)接种了总计4.75ml的10⁶pfu/ml SARS-CoV-2。九只恒河猴根据处理分为三组，其分别包括运载体(DMSO)、低剂量(0.5mg/kg)和高剂量(2.0mg/kg)SSK1。每组随机选取一只幼猴、一只成年猴和一只老年猴。最后分组如下：运载体处理组，RM1(年轻)，RM2(成年)和RM3(年老)；0.5mg/kg SSK1处理组，RM4(年轻)，RM5(成年)和RM6(年老)；2.0mg/kg SSK1处理组，RM7(年轻)、RM8(成年)和RM9(年老)。如图8A中所示的实验计划，我们在22dpi开始处理。对于每组，从22到28dpi，每天一次静脉内(i.v.)施用运载体(DMSO)、低剂量SSK1(0.5mg/kg)和高剂量SSK1(2.0mg/kg)。动物被麻醉并且每天进行临床检查。我们在每个检查日记录体重、肛门温度，并采集血液样本用于血液学分析，以及鼻腔、喉咙和直肠的拭子用于病毒定量检测。在34、35和36dpi对猴子实施安乐死。我们用10ml PBS(Gibco,Cat#21-040-CVC)收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并记录所有器官的病理变化。进一步分析从所有器官和BALF收集的组织样本。

为了评估SSK1在SARS-CoV-2感染早期的功效，将四只成年恒河猴随机分为两组，2.0mg/kg SSK1处理组(M1和M2)和运载体处理组(M3和M4)。通过气管内(4.00ml)、鼻内(0.50ml)、口腔(1.00ml)和结膜(0.25ml)接种总共5.75ml的10⁶pfu/ml SARS-CoV-2感染这四只猴子。每天一次SARS-CoV-2接种，连续7天后，立即用2.0mg/kg SSK1(SSK1-M1、SSK1-M2)或运载体溶液(Vehicle-M3、Vehicle-M4)处理猴子。每天进行临床检查，我们记录体重和肛门温度。收集血液样本用于血液学分析和鼻子、喉咙和直肠抽取的拭子用于定量病毒检测。在指定的时间点进行胸部X射线检查。在处理后的指定时间点对动物实施安乐死和尸体剖检。我们用10ml PBS(Gibco,Cat#21-040-CVC)收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并记录所有器官的病理变化。进一步分析从所有器官和BALF收集的组织样本。

药物处理

将溶解在DMSO(Life Science,Cat#1087C114)中的100mg/ml SSK1混合在95％PBS(Gibco，Cat#21-040-CVC)、5％Tween-80(BioFroxx，Cat#1716)中并在指定时间点(注射在5-10分钟内完成)以0.5mg/kg或2.0mg/kg的剂量给猴子静脉内(i.v.)施用。将混合在95％PBS(Gibco,Cat#21-040-CVC)、5％Tween-80(BioFroxx,Cat#1716)中的DMSO作为运载体进行静脉内(i.v.)注射。

病毒扩增与鉴定

SARS-CoV-2病毒原种获自中国广东疾病控制中心(Center of DiseasesControl,Guangdong Province China)。病毒在Vero-E6细胞上扩增，并通过超滤系统通过300kDa模块(Millipore)浓缩。通过RT-PCR、测序和透射电子显微镜确认扩增的SARS-CoV-2，并通过噬菌斑测定(10⁶pfu/ml)进行滴定。

细胞培养

Vero-E6细胞在37℃和5％CO₂的加湿培养箱中补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco，Cat#10099-141C)和1％青霉素-链霉素(Solarbio，Cat#P1400)的高葡萄糖DMEM(Gibco，Cat#11995500BT)中良好培养。胰蛋白酶-EDTA(0.05％)酚红(Gibco,Cat#25200)用于细胞解离。

胸部X光片检查

在拍摄图像之前，用10mg/kg盐酸氯胺酮(Beikang，Cat#100761663)麻醉猴子。然后使用移动数字医学X射线摄影系统(MobileCooper，Browiner China)拍摄指定时间点的猴子的胸部X射线图像。为了分析X射线数据，对所述猴子的分组不知情的两名经验丰富的医生对X光片进行了评估。

血液学

使用含有柠檬酸钠抗凝剂的5ml采血管从麻醉猴后肢的隐静脉采集血样用于进一步分析。对于全血细胞计数(CBC)，使用Auto Hematology Analyzer(BC-5000Vet,Mindray,China)。分析了白细胞相关数和中性粒细胞(Neu)、淋巴细胞(Lym)、单核细胞(Mon)、嗜酸性粒细胞(Eos)、嗜碱性粒细胞(Bas)和血小板相关项目的百分比、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板比容(PCT)。对于血清生化分析，将血液在4℃下凝固30分钟，然后以3,000×rpm离心15分钟以获得血清。血清用化学分析仪(Mindray，BS-350E)分析丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、尿酸(UA)和肌酐(CRE-E)。

组织收集和匀浆上清液制备

来自每只猴子的一半肺用于BALF收集，另一半用于匀浆和组织病理学检查。此外，收集以下组织：气管、支气管、肺、下颌下腺、肠淋巴结、肺门淋巴结、脾、胃、十二指肠、结肠、直肠、肝、胰腺、肾、心脏、肌肉、睾丸、膀胱、阴茎、脊髓、脑和脑脊液。1克组织在3ml PBS中匀浆。匀浆以3,000rpm离心10分钟，收集上清液并用于分析。

支气管肺泡灌洗液(BALF)收集

解剖后，用含有2％FBS(Gibco，Cat#10099-141C)的10ml PBS(Gibco，Cat#21-040-CVC)仔细清洗猴的半肺3次。用10cm培养皿收集流体，然后转移到15ml离心管中。通过500g离心5分钟进一步收集流体中的细胞并用于RNA测序。

血清细胞因子和趋化因子分析

收集血清和BALF样品用于分析细胞因子和趋化因子。使用非人灵长类动物细胞因子MILLIPLEX map 23-plex试剂盒(Millipore，Cat#PRCYTOMAG-40K)根据制造商的说明确定粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12/23(p40)、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、单核细胞趋化蛋白(MCP))-1、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α、MIP-1β、可溶性CD40-配体(sCD40L)、转化生长因子(TGF)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。

定量PCR

对从受感染猴子收集的鼻/喉/肛门拭子、血液和尸体解剖组织样本进行RNA提取和定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。根据Direct-zolTM RNA MiniPrep方案(ZYMORESEARCH CORP，US)，使用Trizol LS试剂(Invitrogen，Cat#10296010)从灭活样品中提取病毒RNA。50μl无DNase/RNase的水用于洗脱RNA。使用TaqMan Fast Virus 1-Step MasterMix(ThermoFisher，Cat#4444434)和SARS-CoV-2的纯化病毒RNA，在CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,US)上使用实时RT-PCR来定量样品中的病毒基因组，作为标准曲线。如下使用用于RT-PCR的条件：25℃2分钟，50℃15分钟，95℃2分钟，然后在95℃5秒和58℃31秒下进行40个循环。根据Chinese Center for Disease Control andPrevention(CDC)报道的序列合成NP基因特异性引物和探针。

靶标-2-F:GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT(SEQ ID NO:30)，

靶标-2-R:CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG(SEQ ID NO:31)，

靶标-2-P：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'(SEQ ID NO:32)。

在每次运行中，平行运行计数的RNA标准品的标准稀释物，以计算样品中的拷贝数。

组织病理学和免疫组织化学

根据标准方案对恒河猴进行尸体解剖。解剖后，大体检查主要器官。收集肺组织，固定于10％中性缓冲福尔马林溶液中，石蜡包埋，制备2μm组织切片。对于苏木精和曙红(H&E)染色，在显微镜病理分析之前，用苏木精(Leica，Cat#3801591)和曙红(Leica，Cat#3801594)(H&E)对切片进行染色。组织切片的组织病理学分析由对动物分组不知情的病理学家进行。阿辛蓝-高碘酸-希夫(AB-PAS)染色通过AB-PAS染色试剂盒(Servicebio,Cat#G1049)进行。为了对巨噬细胞进行免疫组织化学染色，使用抗CD68一抗(abcam，Cat#ab213098)。对于巨噬细胞变化的定量统计，使用的相应二抗是HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Servicebio,Cat#GB23301)。使用Pannoramic DESK(3D HISTECH)收集完整切片图像，并使用Caseviewer C.V 2.3和Image Pro plus 6.0进行分析。

统计学分析

对于统计学分析，使用GraphPad Prism 8，以默认参数通过t检验(仅比较两组时)或单因素方差分析(比较两组以上时)计算P值。误差条代表SEM，P<0.05被认为统计学上显著(ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

关键资源

结果：

SSK1有效改善SARS-CoV-2感染晚期的COVID-19肺炎

由于已经在患者和非人类灵长类动物模型中发现SARS-CoV-2诱导的肺炎的延迟肺恢复(Wen等人，2020；Munster等人，2020)，我们首先研究了SSK1在SARS-CoV-2感染晚期的治疗效果(图8A)。我们使用我们之前建立的SARS-CoV-2感染的恒河猴模型测试了SSK1的后期干预，其中病毒在接种后14天(dpi)几乎被清除(Lu等人，2020)。九只恒河猴被分为三组：运载体(RM1-RM3)、0.5mg/kg SSK1(RM4-RM6)和2.0mg/kg SSK1(RM7-RM9)，每组包含一只年轻、一只成年和一只年老猴子(表4)。从22dpi开始处理，连续7天静脉注射，并收集临床病征数据用于进一步分析(图8A)。处理停止后5天对动物实施安乐死用于病理分析。

我们在整个实验过程中监测了临床病征，并发现SSK1处理有效地防止了体重减轻，而运载体处理的成年和年老猴子显示出高达17％的明显体重减轻(图8B)。年轻猴子的体重从22dpi开始保持增加，这可能是因为它们仍处于发育阶段(图8B)。我们进一步分析了动物的肺损伤，并在三只运载体处理的恒河猴中的两只中观察到肺部严重的鲜红色病变(图8C；表4)，提示在感染非常晚期阶段的持续性肺炎。重要的是，在所有六只SSK1处理的猴子中，我们只发现一只表现出新的肺部病变(图8C；表4)。接下来，我们在组织病理学水平上研究了SSK1的治疗效果。在运载体处理组中，肺切片的苏木精和曙红(H&E)染色显示多种程度的肺泡间隔增厚、水肿和出血。这种患病表型在SSK1处理组中得到了极大改善(图1D和S1；表4)。基于预先确定的组织学评估标准测量组织学病变的严重程度。肺组织学评估进一步显示SSK1处理动物的组织学病变减少(表4)。总的来说，这些结果提示SSK1改善了晚期SARS-CoV-2感染的肺炎的肺部恢复。

SSK1在肺恢复期间减少巨噬细胞浸润并减少炎症

接下来，我们通过巨噬细胞标志物CD68的免疫组织化学染色表征了巨噬细胞的浸润。在运载体处理的猴子的肺泡间质中发现了大量CD68阳性细胞，并在肺泡内发现了一些CD68阳性细胞，提示感染后巨噬细胞的浸润(图9A)。SSK1处理显著减少了年老组中，尤其是在高剂量时的巨噬细胞浸润(图9B)，这与我们之前的发现一致，即SSK1减少了自然老化小鼠模型中的巨噬细胞(Cai等人，2020)。

为了研究已经被认为在严重COVID-19肺炎发展中起关键作用的多种炎性细胞因子的血清水平，我们比较了SSK1处理前(21dpi)和处理后(28dpi)血液样本中细胞因子的浓度。对于SSK1处理的年老猴子，血液中的炎性细胞因子，包括IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TGF-α和MCP1，与21dpi相比，在28dpi尤其是在高剂量(2mg/kg)时降低，提示炎症减弱。相反，这些细胞因子在运载体处理的猴子中增加(图9C)。有趣的是，在所有高剂量SSK1处理的猴子中，我们发现IL-18的水平升高，IL-18是病毒感染中的保护性细胞因子并且已发现其在康复期间的COVID-19患者中上调(图9D)(Wen等人，2020；Dinarello等人，2013；Golonka等人，2020)。总的来说，我们的结果提示，SSK1在协调感染SARS-CoV-2的猴子的肺恢复中有效调节了炎症细胞因子。

SSK1减少SARS-CoV-2感染早期肺部的临床病征和炎症损伤

因为SSK1在晚期处理SARS-CoV-2感染引起的症状方面显示出有益效果，我们询问SSK1的早期干预是否会影响SARS-COV-2的消除或在病毒存在的情况下缓解感染引起的症状。为此，将四只猴子随机分配到两组，每组两只动物。所有动物都感染了SARS-CoV-2，然后从0dpi开始用2mg/kg SSK1(M1、M2)或运载体(M3、M4)进行处理。每天进行施用，连续7天，并在处理完成后对动物实施安乐死和尸检(图10A)。

为了研究早期SARS-CoV-2感染期间SSK1处理的效果，我们每天进行临床检查。在运载体处理组中观察到体温显著升高(甚至高达40.0℃)，而在SSK1处理组中相对稳定(图10B)。我们还观察到运载体处理动物的体重减轻，但SSK1处理组的体重保持恒定(图13A)。为了进一步分析肺炎的症状，进行了背腹胸部X射线(CXR)测试，其显示运载体处理的动物从3dpi到6dpi的肺部浸润发展，提示肺炎加重(图10C)。相反，与SSK1处理组中的3dpi相比，在6dpi时没有发现发展。值得注意的是，在整个实验过程中，M2在X射线上没有表现出肺炎的病征(图10C)。3dpi时M1的肺部出现毛玻璃混浊，其可能是由于异常的基础免疫状态(图13B)。总的来说，这些结果提示SSK1在改善COVID-19的临床症状方面具有有益作用。

为了探索SSK1对病毒清除的影响，我们检测了拭子(鼻子、喉咙、肛门)和血液样本中的病毒载量。我们发现SSK1处理组的病毒脱落没有延迟，却甚至减少得更快(图10D)。此外，SSK1组呼吸道组织和多个器官中的病毒载量明显低于运载体处理组(图14C)，提示早期SSK1干预没有中断抗病毒反应。

接下来，我们在处理后对所有四只动物进行了尸检。在运载体处理的猴子中有红色点状病变(图14A)。在SSK1处理的M2中未发现明显的肺部病变，其与射线照片一致。在M1的肺中观察到一些棕色点状病变(图14A)，其可能与基线时的异常炎症特征有关(图13C)。除了肺，我们还在运载体处理组的动物的肝中发现大的坏死病变，与临床观察一致(Lei等人，2020)，但在SSK1处理组中没有(图14B)。组织病理学分析显示对照动物有严重病变；肺泡腔内充满大量渗出物、碎片和炎性细胞，伴有严重水肿，其提示弥漫性间质性肺炎。相反，在SSK1处理组中，我们仅观察到最低程度增厚的肺泡间隔和局灶性水肿(图4A和S3C)，并且M1也有局部肺出血(图14D)。阿辛蓝-高碘酸-希夫(AB-PAS)染色显示SSK1处理恢复了气道狭窄和大量粘液分泌物(图11B)。

我们接下来测量了血清和肺组织中细胞因子水平的变化。炎性细胞因子，包括GM-CSF、IL-1β、IL-12、MIP-1A和TNF-α，在SSK1处理动物的肺组织中的浓度较低，提示受感染肺部的炎症减轻(图11C)。特别是，SSK1处理组中的IL-18水平显著增加(图11D)，其与我们在后期处理中的观察结果一致(图9D)。总的来说，我们的结果提示，SSK1的早期处理减少了炎症并缓解了SARS-CoV-2感染的肺部病理。

我们在体外测试了SSK2选择性杀死衰老细胞的能力，并发现SSK2可以以剂量依赖性方式有效和选择性地杀死β-半乳糖苷酶阳性衰老人胚胎成纤维细胞(HEF)(图15A、B)。

衰老细胞积累在骨关节炎(OA)的发展中起因果作用并且衰老细胞的选择性消除可能是OA患者的有效治疗策略(Jeon O,Kim C,Laberge R M,等人Local clearance ofsenescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritisand creates a pro-regenerative environment[J].Nature Medicine,2017,23(6):775-781)。因此，我们测试了SSK2杀死OA软骨细胞的能力并且发现SSK2可以有效地清除从骨关节炎患者中分离的原代人类软骨细胞(图16A、B和图17)。

讨论：

在这项研究中，我们证明了小分子SSK1通过管理巨噬细胞浸润以减轻炎症来有效治疗COVID-19肺炎。在SSK1处理的动物中观察到改善的临床症状、更稳定的体温、更少的体重减轻和更好的胸部X射线表现。与尸检期间的发现一致，SSK1处理的动物具有基本正常的肺组织，其组织病理学检查具有较少并且较不严重的肺和肝病变。此外，在SSK1处理的动物中也观察到巨噬细胞积累和促炎细胞因子释放的减少。这些结果提示SSK1在治疗SARS-CoV-2感染中的肺炎和过度炎症方面具有有希望的治疗潜力。

一项主要发现是SSK1在感染SARS-CoV-2的年老猴子中显示出有效的治疗效果。SSK1处理显著降低了年老感染组中的体重减轻、多种炎性细胞因子升高和巨噬细胞浸润(图1和2)。在我们之前的研究(Cai等人，2020)中，在年老小鼠中也观察到了SSK1处理引起的炎症因子的减少。在年老个体中SSK1的抗炎作用对于治疗COVID-19非常重要，因为这种疾病在患有基础慢性炎症的年老人群中死亡率更高(Zhou等人，2020)。先前的研究显示，生理性肺老化导致先天性和适应性免疫反应的免疫衰老，由此导致肺中细胞因子和炎性细胞浸润的基本水平更高(Cho和Stout-Delgado，2020)。因此，SSK1可能对具有COVID-19重症率较高的年老人群有更好的治疗效果。

SSK1是使用非人类灵长类动物模型研究COVID-19的第一个抗炎治疗。SSK1在不影响抗病毒作用的情况下显示出抗炎的益处(图3D和S3C)，并且SSK1治疗还导致肺中巨噬细胞浸润减少(图2A和2B)。除了其在调节炎症方面的重要作用外，巨噬细胞还显示在抗体依赖性增强(ADE)和补体介导的血栓形成中发挥关键作用(Yip等人，2014；Risitano等人，2020)。SARS-CoV-2感染后，在重症患者中发现IgG反应增加和抗体数量增加，提示ADE可能是COVID-19严重程度的潜在机制的可能性(Zhao等人，2020；Zhang等人，2020)。为支持ADE在冠状病毒诱导的疾病中的重要性，在SARS-CoV感染中也发现ADE(Jaume等人，2011；Liu等人，2019)，抗体和SARS-CoV的复合体通过其可以通过Fcγ受体(FcγR)进入巨噬细胞，导致强烈的促炎反应和肺炎的加重。因此，我们的策略表明在开发基于抗体的疗法和疫苗方面具有应用潜力。另一方面，已经发现补体系统在肺损伤加重的COVID-19患者的肺部过度激活(Magro等人，2020)，并且之前的研究指出冠状病毒感染，如SARS-CoV，可以激活补体C3，通过巨噬细胞和中性粒细胞导致过度激活的免疫反应，并促进血栓性微血管病(Gralinski等人，2018)。因此，SSK1瞬时靶向巨噬细胞也可能在减少SARS-CoV-2感染期间补体相关炎症和血栓形成方面具有有益作用。

总之，我们的工作证明通过靶向COVID-19中的巨噬细胞来控制炎症的新策略。重要的是，我们在我们处理的猴子中没有观察到任何不良反应，并且我们之前的工作也证明了它在体内的安全性，其共同表明了SSK1在临床转化中的实用价值。将我们的抗炎小分子化合物与抗病毒药物相结合，有望在COVID-19患者中获得最佳临床结果。

表4.感染SARS-CoV-2并且在晚期用SSK1或运载体治疗的恒河猴中的临床和病理学观察结果

表5.在早期用SSK1治疗的感染SARS-CoV-2的成年恒河猴中的临床和病理学观察结果

表6.在早期用SSK1治疗的感染SARS-CoV-2的成年恒河猴中的临床和病理学观察结果

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除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用它们的材料通过引用特别并入。

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在包含在以下权利要求中。

Claims (29)

1.用于选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的活性剂，任选地所述活性剂为晶体形式，

该活性剂包含：

(i)

(ii)

和

(iii)细胞毒性部分，

(a)其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地为H、R₅C(O)-、R₆OC(O)-、R₇R₈NC(O)-或R₉PO₃ ^--，使得-OR_x分别独立地为酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或磷酸二酯基团，其中x为1、2、3或4，其中R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基，取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的C₃-C₁₀环基、未取代的C₃-C₁₀环基、取代的C₃-C₁₀杂环基、未取代的C₃-C₁₀杂环基；

(b)其中每个R₄’独立地为硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，R₄’是-NO₂或氢；

(c)其中R₅’是氢、硝基-(如-NO₂)、氰基(如-CN)、异氰基(如)、氨基(如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH))、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、膦酰基、氢、烷基、取代的烷基，其中优选地，R₅’是氢，并且

n是0到4之间的整数，包括0和4。

2.权利要求1的活性剂，其具有结构(式III)-(式II)-D：

其中D包含细胞毒性剂。

3.权利要求1或2所述的活性剂，其中所述细胞毒性剂不包含酚基。

4.权利要求1-3中任一项所述的活性剂，其中至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、卤素(例如F、Cl、I、Br)、烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、取代的烷氧基、羧基、羰基、取代的羰基、酰氨基、磺酰基、磺酸、磷酰基、膦酰基、氢或膦酰基。

5.权利要求1-4中任一项所述的活性剂，其中至少一个R₄’是硝基-(例如-NO₂)、氰基(例如-CN)、异氰基(例如)、氨基(例如-NH₂)、羟基(-OH)、硫醇(-SH)、氢或卤素(例如F、Cl、I、Br)。

6.权利要求1-5中任一项所述的活性剂，其中R₄’是硝基-(例如-NO₂)或氢。

7.权利要求1-6中任一项所述的活性剂，其中式II具有结构：

8.权利要求1-7中任一项所述的活性剂，其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地为H、R₅C(O)-、R₆OC(O)-、R₇R₈NC(O)-，例如，R₁、R₂、R₃和R₄的一个或多个(例如，两个、三个或四个)是H。

9.权利要求1-8中任一项所述的活性剂，其中R₁、R₂、R₃和R₄独立地为R₅C(O)-。

10.权利要求1-9中任一项所述的活性剂，其中R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的C₁-C₅烷基、未取代的C₁-C₅烷基、取代的C₆-C₁₀芳基、未取代的C₆-C₁₀芳基、取代的C₆-C₁₀杂芳基、未取代的C₆-C₁₀杂芳基、取代的C₃-C₁₀环基、未取代的C₃-C₁₀环基或取代的C₃-C₁₀杂环基、未取代的C₃-C₁₀杂环基。

11.权利要求1-10中任一项所述的活性剂，其中R₅、R₆、R₇、R₈和R₉独立地为氢、取代的C₁-C₃烷基、未取代的C₁-C₃烷基、取代的C₆芳基、未取代的C₆芳基、取代的C₆杂芳基、未取代的C₆杂芳基、取代的C₆环基、未取代的C₆环基或取代的C₆杂环基、未取代的C₆杂环基。

12.权利要求1-11中任一项所述的活性剂，其中R₅独立地为取代的C₁-C₃烷基或未取代的C₁-C₃烷基。

13.权利要求1-12中任一项所述的活性剂，其中式III具有结构：

14.权利要求2-13中任一项所述的活性剂，其中D包含缺乏酚基团的细胞毒性剂，所述细胞毒性剂选自吉西他滨、阿糖胞苷或5'-脱氧-5氟胞苷。

15.权利要求1-14中任一项所述的活性剂，其中所述活性剂包含以下结构中的任一种：

16.组合物，其包含杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的有效量的权利要求1-15中任一项的活性剂。

17.权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中如在细胞培养测定中所确定的，所述活性剂选择性地杀死一种或多种衰老细胞而不是非衰老细胞。

18.权利要求1-15任一项所述的活性剂，或权利要求16或17的组合物，其在药学上可接受的载体中。

19.在受试者中选择性杀死一种或多种衰老细胞或缓解与炎性病症相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求16或17的组合物。

20.权利要求19所述的方法，其中所述受试者患有衰老相关疾病或病症或炎症疾病或病症。

21.权利要求19或20所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症是代谢疾病、炎性疾病或病症、肺部疾病或病症、神经疾病或病症、增殖性病症、肾病症或疾病、眼部疾病或病症，或皮肤病学病症或疾病。

22.权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述衰老相关疾病或病症选自：

(i)选自骨关节炎、骨质疏松症、口腔粘膜炎、炎性肠病、脊柱后凸和椎间盘突出症的炎症或自身免疫性疾病或病症；

(ii)选自阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病、痴呆、轻度认知障碍、黄斑变性和运动神经元功能障碍的神经疾病或病症；

(iii)选自糖尿病、糖尿病性溃疡、代谢综合征和肥胖症的代谢疾病；

(iv)选自肺纤维化、慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿、支气管扩张和与年龄相关的肺功能丧失的肺部疾病；

(v)选自黄斑变性、青光眼、白内障、老花眼和视力丧失的眼部疾病或病症；

(vi)选自肾病、肾衰竭、虚弱、听力损失、肌肉疲劳、皮肤状况、皮肤伤口愈合、肝纤维化、胰腺纤维化、口腔粘膜下纤维化和少肌症的年龄相关病症；和

(vii)选自湿疹、银屑病、色素沉着过多、痣、皮疹、特应性皮炎、荨麻疹、与光敏性或光老化相关的疾病和病症、皱纹、瘙痒、感觉迟钝、湿疹性皮疹、嗜酸性皮肤病、反应性中性粒细胞皮肤病、天疱疮、类天疱疮、免疫大疱性皮肤病、皮肤纤维组织细胞增生、皮肤淋巴瘤和皮肤狼疮的皮肤疾病或病症。

23.权利要求22所述的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症并且任选地正在经历选自化学治疗和放射治疗的癌症治疗。

24.权利要求23所述的方法，其中所述活性剂

(i)减少已被推向衰老的细胞或癌细胞；

(ii)减少衰老细胞产生的一种或多种副作用，其中所述副作用包括炎症、促进癌生长和促进转移；

(iii)减少化学治疗的一种或多种副作用；或

(iv)减少放射治疗的一种或多种副作用。

25.权利要求19-24中任一项所述的方法，其中所述组合物包含具有(式III)-(式II)-D结构的活性剂：

其中D在体内递送后被切割。

26.权利要求19-25中任一项所述的方法，其中所述组合物包含以下结构中的任一种：

其中在体内施用后以杀死一种或多种衰老细胞的有效量获得结构：

27.权利要求19或20所述的方法，其中所述受试者具有病毒感染，任选地，其中所述病毒感染导致所述受试者中激活的巨噬细胞的过度产生。

28.权利要求27所述的方法，其中所述病毒感染是选自冠状病毒、严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒(CoV)、SARS-CoV-2(其引起COVID-19(冠状病毒病)2019))和中东呼吸综合征(MERS)-CoV的冠状病毒感染。

29.权利要求28所述的方法，其中所述受试者患有SARS-CoV-2感染并且已被诊断患有冠状病毒病2019。

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