KR20190084274A - 애쥬번트로서 b형 간염 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

애쥬번트로서 b형 간염 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 개시는 전신 면역 반응 및 점막 면역 반응을 유도하기 위한 백신 조성물 및 방법을 제공하고, 여기서 상기 백신 조성물은 항원 및 애쥬번트로서 B형 간염 코어 바이러스-유사 입자(HBc VLP)를 포함한다. 상기 백신 조성물은 대상체의 점막 표면에의 투여에 적합하고, 감염에 대한 보호 면역 반응을 유발하는데 효과적이다.

Description

애쥬번트로서 B형 간염 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 11월 22일자로 출원된 미국 가출원 제62/425,079호의 우선권을 주장하고, 이는 이의 전체가 본원에서 참조로서 원용된다.
본 개시는 면역원성을 증강시키고 항원의 면역 반응을 개선시키는 백신 조성물 및 방법에 관한 것이다.
백신 애쥬번트(adjuvant)의 글로벌 시장은 2016년의 USD 467.0백만으로부터 2021년의 USD 769.4백만에 도달할 것으로 예상된다. 이러한 시장의 성장을 견인하는 주요 요인은, 다양한 정부 당국에 의한 면역화 프로그램에 대한 초점을 증가시키고 기존 및 신흥 질환에 대한 개선된 및 장기-지속하는 면역화에 대한 초점을 성장시키는 감염증 및 동물매개 감염 질환의 높은 유병률이다.
최근에, 점막 표면은 감염 인자의 대부분의 유입구이기 때문에 점막 표면을 통해 전달되는 백신에 대한 관심이 확산되어 왔고, 강력한 보호 항체 및 세포-매개된 면역 반응을 상기 유입구에서 개발하는 것이 동물의 건강에 중요하다. 점막 백신은, 백신 항원을 구강, 장, 비강, 직장 또는 질의 점막 표면에 흡수한 다음, 흡수 후에, 점막-연관된 림프 조직과 접촉시키는 애쥬번트 및 전달 시스템으로 수행할 수 있다. 따라서, 점막 백신은 전신성 면역(IgG 항체의 생성) 및 점막 면역(분비 IgA 항체의 생성)을 효과적으로 유도하는 이점을 제공하는 것이 유리하고, 이들은 또한 저렴하고 용이하게 투여되고 집단 백신접종에 적합하다.
면역학에서 통상 사용되는 애쥬번트의 하나로서, 알루미늄 염이 1930년대 이래 백신에 사용되어 왔다. 그러나, 세계적으로 광범위하게 사용되어도, 알루미늄 염은 비교적 약하고 특정 질환에 작용할 뿐이다. 따라서, 점막 상피를 관통할 수 있고 보호 및 장기-지속하는 면역 반응을 유도할 수 있는 애쥬번트를 갖는 점막 백신에 대한 필요성이 있다.
상기에 비추어, 본 개시는 항원 및 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물을 제공하고, 상기 애쥬번트는, 이하 간단히 "HBc"로도 불리우는 재조합 B형 간염 코어 바이러스-유사 입자(HBc VLP)이다.
재조합 HBc VLP는 서열번호 1의 아미노산 서열(MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTV)과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 1과 동일한 기능을 가질 수 있다. 본 개시의 한 가지 실시형태에서, 상기 애쥬번트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 HBc VLP이다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 상기 항원은 감염성 질환으로부터 유래된 항원일 수 있다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 상기 항원은 인간 면역결핍 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 1, 단순 포진 바이러스 유형 2, 인간 사이토메갈로 바이러스, 뎅기 바이러스, 간염 A, B, C 또는 E 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS 바이러스), 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 유형 b(Hib), 수막염 바이러스, 살모넬라(Salmonella), 네이쎄리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 장내독소 이. 콜라이(E. coli), 캄필로박터(Campylobacter), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 모라셀라(Moraxella), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 마이코박테리아(Mycobacteria), 헤모필루스(Haemophilus), 플라스모디움(Plasmodium) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma) 및 스탄워쓰(Stanworth) 데카펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것으로부터 유래된다.
본 개시의 추가의 양태에 따르면, 본 개시는, 상기 기재된 백신 조성물을 대상체의 점막 표면에 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 백신접종하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 실시형태에서, 상기 점막 표면은 호흡기, 위장, 질(vaginal), 비강, 직장 및 경구 점막으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 개시는 재조합 HBc VLP를 제공한다. 또한, 본 개시는, 감염 인자 유래의 항원 및 애쥬번트로서 애쥬번트-유효량의 재조합 HBc VLP를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 개시의 백신 조성물은 대상체에서 항원에 특이적인 항체 반응을 유도할 수 있고, 부작용을 유발하지 않고서 감염 인자로부터 대상체를 보호할 수 있다. 따라서, 본 개시의 면역성을 달성하는 애쥬번트, 백신 조성물 및 방법은 대량 생산이 비교적 용이하고, 항체 동정의 특이성을 증가시키고 알러지 등의 불필요한 반응을 회피하는데 보다 유용하다.
본 개시는, 첨부 도면을 참조하여, 하기 실시형태의 상세한 설명을 읽음으로써 보다 완전하게 이해될 수 있다.
도 1a-1i는 HRØ24, HRØ, HRØ-3Ø 재조합 단백질 및 HBc의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 도 1a, 1c, 1e 및 1g는 각각 정제된 HRØ24, HRØ, HRØ-3Ø 재조합 단백질 및 HBc의 쿠마시에 블루 염색을 나타내고; 도 1b, 1d 및 1f는 각각 항-His 항체를 사용한 정제된 HRØ24, HRØ 및 HRØ-3Ø 재조합 단백질의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 1h는 래빗 폴리클로날 항-HBc 항체를 사용한 정제된 HBc의 웨스턴 블롯을 나타내고; 도 1i는 각각 마우스 모노클로날 항-RSV 항체를 사용한 정제된 HBc 및 HRØ24 재조합 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 2는 정제된 HBc의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 비강내(IN) 면역화 스케쥴을 나타낸다. 도 3a는 각 그룹의 마우스를 0주, 3주, 6주 및 9주에 백신 후보물질로 4회 면역화시키고 12주에 RSV 공격을 제공받은 것을 나타내고, 도 3b는 각 그룹의 마우스를 0주, 3주, 6주 및 9주에 백신 후보물질로 3회 면역화시키고 9주에 RSV 공격을 제공받은 것을 나타낸다. RSV 공격 전에 포르말린-고정된 RSV(FIRSV)로 근육내(i.m) 면역화시킨 그룹이 또한 포함되어 있다. 마우스 혈청, BALF 및 비장은 RSV 공격 2일 전에 동일한 투여 섭생으로 별개의 그룹으로부터 수집한다.
도 4a-4f는, HBc VLP와 혼합하거나 혼합하지 않은 HRØ24의 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 마우스에서 HRØ24- 및 FIRSV-특이적 항체 반응을 나타낸다. 각 그룹의 마우스 혈청은 RSV 공격 2일 전에 수집한다. 도 4a-4c는 각각 혈청으로부터 측정한 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응을 나타내고; 도 4d-4f는 각각 혈청으로부터 측정한 FIRSV-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응을 나타낸다.
도 5a-5k는, CpG의 존재 또는 부재하에 HRØ24 및 HBc VLP 혼합물의 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 마우스에서 HRØ24- 및 FIRSV-특이적 항체 반응 및 비장세포 재자극을 나타낸다. 각 그룹의 마우스 혈청, BALF 및 비장은 RSV 공격 2일 전에 수집한다. 도 5a-5d는 각각 혈청으로부터 측정한 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응 및 IgG2a/IgG1의 비를 나타내고; 도 5e-5h는 각각 혈청으로부터 측정한 FIRSV-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응 및 IgG2a/IgG1의 비를 나타내고; 도 5i 및 5j는 각각 BALF로부터 검출된 HRØ24- 및 FIRSV-특이적 분비 IgA(sIgA) 반응을 나타내고; 도 5k는 항원 재자극 실험에서 검출된 IFN-γ의 수준을 나타낸다.
도 6a-6h는 CpG의 존재 또는 부재하에 HRØ24 및 HBc VLP 혼합물의 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 마우스에서 RSV F 단백질 부위 Ø- 및 부위 II-특이적 항체 반응을 나타낸다. 각 그룹의 마우스 혈청은 RSV 공격 2일 전에 수집한다. 도 6a-6d는 각각 혈청으로부터 측정한 부위 Ø-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응 및 IgG2a/IgG1의 비를 나타내고; 도 6e-6h는 각각 혈청으로부터 측정한 부위 II-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응 및 IgG2a/IgG1의 비를 나타낸다.
도 7a-7e는 HBc VLP 또는 CpG와 혼합하거나 혼합하지 않은 HRØ24, HRØ 또는 HRØ-3Ø의 3개 용량의 비강내 투여를 제공받은 마우스에서 HRØ24-특이적 항체 반응을 나타낸다. 혈청 및 BALF는 RSV 공격 2일 전에 마우스로부터 수집한다. 도 7a, 7b, 7c 및 7e는 각각 혈청으로부터 측정한 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1, IgG2a 및 IgA 반응을 나타내고; 도 7d는 BALF로부터 검출된 HRØ24-특이적 sIgA 반응을 나타낸다.
도 8은 혈청 중화 역가를 나타낸다. 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 천연 또는 백신접종 마우스의 혈청은 RSV 공격 2일 전에 수집하고, RSV 플라크 형성의 억제에 대해 시험한다.
도 9는 공격후 마우스 체중 변화를 나타낸다. 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 천연 또는 백신접종된 마우스의 체중을 RSV 공격후 5일 동안 모니터링한다. 체중 변화는 0일과 비교하여 체중 감소율로서 나타낸다.
도 10은 폐 조직병리학을 나타낸다. 폐 조직은 조직학적 분석을 위해 RSV 공격 5일 후에 4개 용량의 비강내 투여를 제공받은 천연 또는 백신접종된 마우스로부터 수집한다.
하기 실시예는 본 개시를 예시하기 위해 사용된다. 당업자는, 본 개시의 명세서에 기초하여, 본 개시의 기타 이점을 생각할 수 있다. 본 개시는 또한, 상이한 특정 예에서 설명된 바와 같이 실시 또는 적용할 수 있다. 상이한 양태 및 적용에 대하여, 이의 정신 및 범위에 반하지 않고도, 본 개시를 실시하기 위해 상기 예를 변형 및/또는 변경할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "항원"에 대한 언급은 항원의 혼합물을 포함하고; "약제학적으로 허용되는 담체"에 대한 언급은 2개 이상의 이러한 담체의 혼합물 등을 포함한다. 이와 같이, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
추가로, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 특징 또는 성분을 갖거나 갖지 않는 2개의 특정된 특징 또는 성분의 각각의 구체적 개시로서 해석되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B" 등의 문구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A(단독)" 및 "B(단독)"을 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시는 항원 및 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물을 제공하고, 여기서 애쥬번트는 재조합 HBc VLP이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스-유사 입자"(VLP)는 바이러스와 유사하지만 바이러스 게놈을 결여하기 때문에 비-감염성인 구조를 지칭한다. 용어 "비-감염성"은, 본원에 사용된 바와 같이, 숙주 세포에 들어갈 수 없는 것을 지칭한다. 전형적으로, 바이러스-유사 입자는, 이들이 바이러스 게놈의 전부 또는 일부, 특히 바이러스 게놈의 복제 또는 감염성 성분을 결여하기 때문에, 복제할 수 없고 병원성을 가질 수 없다. 바이러스-유사 입자는, 바이러스 엔벨로프로서 공지된 지질 막으로 코팅된 상응하는 바이러스의 바이러스 캡시드 등의 바이러스 캡시드일 수 있다. 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 바이러스 단백질 아단위로 이루어진 거대분자 조립체를 지칭한다. 또한, 바이러스-유사 입자는 종종 이종 발현에 의해 대량으로 생산할 수 있고, 용이하게 정제할 수 있다.
VLP는 적절한 발현 시스템에서 단백질의 재조합 발현시에 자연적으로 형성될 수 있다. 특정 VLP를 생성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. VLP의 존재는 전자 현미경법, X-선 결정학 등의 당해 기술분야에 공지된 종래의 기술을 사용하여 검출할 수 있다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 애쥬번트는 재조합 B형 간염 코어 항원(HBcAg)일 수 있다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 애쥬번트는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열번호 1과 동일한 기능을 갖는 재조합 HBcAg일 수 있다. 본 개시의 여전히 또 다른 실시형태에서, 재조합 HBcAg는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는, 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같은 "와 80% 동일한 서열"의 포함은 서열이 비교 원도우에 걸쳐 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 기초 또는 아미노산-대-아미노산 기초로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 퍼센트"는, 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적 정렬된 서열을 비교하고 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예: Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 정합된 위치의 수를 수득하고, 정합된 위치의 수를 비교 윈도우(즉, 윈도우 크기)에서 전체 위치의 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 수득함으로써 계산할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 참조 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 포함되고(예를 들면, 서열 목록 참조), 전형적으로 폴리펩티드 변이체는 참조 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성 또는 기능을 유지한다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 애쥬번트는, 이하에서 "HBcAg148"로도 불리우는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 HBcAg이고, 이는 바이러스-유사 입자를 형성하는 것으로 확인되었다.
본 개시는 HBcAg148 바이러스-유사 입자를 포함하는 애쥬번트 조성물을 제공하고, 여기서 상기 HBcAg148 바이러스-유사 입자는 공 캡시드를 갖는 불활성이고, B형 간염 바이러스(HBV)로부터 캡시드 단백질의 자가-조립체에 의해 형성된다. HBV는 원형, 부분적으로 이중-나선 DNA 게놈을 갖는 소형 엔벨로프 바이러스이다. 이는 전 세계적으로 감염성 간 질환의 주요 원인이다. HBV 감염은 세계적으로 대략 20억명에게 영향을 미치고, 성인의 HBV 감염은 통상 일과성이다. HBcAg는, 뉴클레오캡시드 코어의 표면, 즉 HBV의 가장 내측 층에서 발견될 수 있는 항원이다. HBcAg148 VLP는, 이들이 유전 물질을 도입시키는 것 없이 조립되기 때문에 비-감염성이다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 항원은, 인간 면역결핍 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 1, 단순 포진 바이러스 유형 2, 인간 사이토메갈로 바이러스, 뎅기 바이러스, 간염 A, B, C 또는 E 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS 바이러스), 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 유형 b(Hib), 수막염 바이러스, 살모넬라(Salmonella), 네이쎄리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 장내독소 이. 콜라이(E. coli), 캄필로박터(Campylobacter), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 모라셀라(Moraxella), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 마이코박테리아(Mycobacteria), 헤모필루스(Haemophilus), 플라스모디움(Plasmodium) 또는 톡소플라즈마(Toxoplasma) 및 스탄워쓰(Stanworth) 데카펩티드를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 감염성 질환으로부터 유래된다.
감염성 질환으로부터 유래된 상기 항원은, 시험 생물에서 발달한 면역 반응에 의해 표적화된 임의의 물질을 지칭한다. 감염성 질환으로부터 유래된 상기 항원은 또한 면역감응 세포와 접촉할 때에 면역 반응(예: 면역감응 세포의 노화, 사이토킨 생성, 및 항체 생성)의 표적일 수 있다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 항원은 RSV로부터 유래할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, RSV는 유아 및 영아에서 하부 기도 감염의 가장 일반적 원인으로 인식되어 있다. RSV는 3개의 연속 유전자(SH-G-F)에 의해 코딩된, 3개 표면 글리코단백질, 즉 소형 소수성(SH), 부착(G) 및 융합(F)를 갖는다. RSV 백신 개발의 주요 표적 항원은 RSV F 및 G인데, 이들은 각각 중화 항체 및 T 세포 반응을 생성할 수 있기 때문이다. F는 RSV 단리체 중에서 이의 상당한 보존 때문에 특히 매력적이다. 역사적으로, 중화(NT) 활성과 연관된 RSV F의 융합전 및 융합후 입체배좌 둘 다로 발견된 2개의 공지된 주요 항원 부위가 있었다. 이들은 초기에 뮤린 모노클로날 항체(mAbs) 1129(부위 II)(Beeler, J.A. et al., 1989; Arbiza, J., et al., 1992) 및 101F(부위 IV) (Wu, S.J., et al., 2007)에 대한 결합으로 정의되었다. 부위 II는 고위험 유아에서 중증 RSV 질환을 경감시킬 수 있는 팔리비주맵의 표적으로 공지되어 있다. 맥렐란 등(McLellan et al.)(McLellan, J.S., et al., 2013)은 마우스 항체, 5C4를 단리했고, 이는 RSV를 강력하게 중화시켰지만 융합후 F 단백질에 대한 결합은 나타내지 않았다. 5C4는 불멸 PBMC, D25 및 AM22로부터 단리된 다른 2개의 항체와 이들 특성을 공유하고, 이는 팔리비주맵보다 100배 더 큰 효력으로 RSV를 중화시키는 것으로 나타났다[참조: McLellan, J.S., et al., 2013]. D25 및 AM22 표적 부위 Ø, 준안정 항원성 부위는 융합전 RSV F 삼량체의 표면 상에 위치한다[참조: Spits, H., et al., 2010; Beaumont, T., et al., 2012]. F 단백질의 융합전 및 융합후 결정 구조는, 부위 II 및 IV가 양 구조 상에서 발견되지만, 부위 Ø가 융합전 형태에 특이적인 것으로 생각되는 것을 시사한다[참조: McLellan, J.S., et al., 2013].
RSV F의 융합 펩티드 영역은 F1 아단위의 N 말단에 위치되지만[참조: Collins, P.L., et al., 1996], 막관통 세그먼트는 4,3-소수성 헵타드 반복체(HR), 코일드-코일 구조를 시사하는 서열 모티브의 2개 영역을 함유한다[참조: Chambers, P., et al., 1990; Singh, M., et al., 1999]. 이들 영역은 각각 HRN 및 HRC로서 표시되고, 약 270 아미노산의 개재 도메인에 의해 분리되어 있다. HRN 및 HRC는 삼량체 헤어핀-유사 구조를 형성하고, HRC 영역은 HRN 영역에 의해 형성된 내부 코일드-코일에 대해 역평행 방식으로 팩키징된다[참조: Baker, K.A., et al., 1999].
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 항원은, HRN 영역, HRC 영역, 및 부위 Ø, 부위 II 및 부위 IV로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 항원성 부위를 포함하는 재조합 RSV F 단백질이다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 항원은 서열번호 2 내지 4 중의 하나로 나타낼 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 백신 조성물은 대상체에서 RSV 등의 감염 인자에 대해 면역 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 재조합 RSV F 단백질을 항원으로서 치료학적 유효량으로 포함하는 백신 조성물은 RSV에 대한 면역 반응을 유발하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시의 또 다른 실시형태에서, 재조합 RSV F 단백질을 항원으로서 치료학적 유효량으로 포함하는 백신 조성물은 대상체에서 RSV 감염을 예방하거나 개선하기에 충분한 조건하에 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 백신 조성물은 대상체에서 RSV F 단백질 등의 RSV 항원에 대해 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 투여된다. 본 개시의 한 가지 실시형태에서, 백신 조성물은 점막 백신접종에 적합하고, 대상체에게 경구, 비강내, 직장내 또는 질내 투여될 수 있다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 백신 조성물 중의 애쥬번트는 0.1㎍ 내지 1000㎍의 애쥬번트-유효량으로 존재한다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 백신 조성물은 10:1 내지 1:10 중량비의 항원 및 애쥬번트의 혼합물을 포함한다. 본 개시의 여전히 또 다른 실시형태에서, 백신 조성물에 포함되는 항원 및 애쥬번트는 5:1 내지 1:5의 중량비로 존재한다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 백신 조성물 중의 HBc VLP는, 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 강화시키고/시키거나 목적하는 면역 반응을 향해 이를 조절하는 단독 애쥬번트로서 사용된다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 백신 조성물은 추가의 애쥬번트를 포함할 수 있다. 본 개시에 유용한 추가의 애쥬번트는 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는, 본 개시의 백신 조성물의 투여에 적절할 수 있는, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 본 개시에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체는 방부제, 현탁제, 점착부여제, 등장제, 완충제 및 습윤제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 개시는, HBcAg148 VLP 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 애쥬번트 조성물을 제공하고, 상기 애쥬번트 조성물을 항원으로서 재조합 RSV F 단백질과 조합하는 것을 포함하는, 백신 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 개시의 한 가지 실시형태에서, HBcAg148 VLP는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 개시의 추가의 양태에 따르면, 본 개시는 상기 기재된 HBcAg148 VLP를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시의 한 가지 실시형태에서, 핵산 분자는 원핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 또 다른 실시형태에서, 원핵 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호 5의 핵산 서열(ATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTTCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTT)과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 핵산 분자는 진핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 또 다른 실시형태에서, 진핵 세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포이다. 여전히 또 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
본 개시는 상기 기재된 백신 조성물에 의한 점막 면역 반응 및 전신 면역 반응을 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 백신 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 이에 의해 대상체에서 점막 면역 반응 및 전신 면역 반응을 유도하며, 여기서 점막 면역 반응은 항원-특이적 IgA 항체의 생성이고, 전신 면역 반응은 항원-특이적 IgG 항체 및 항원-특이적 세포-매개된 면역의 생성이다.
본 개시의 추가의 양태에 따르면, 본 개시는, 상기 기재된 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 백신접종하는 방법을 제공한다. 백신접종 방법은 백신 분야에 공지된 종래의 경로, 예를 들면, 점막(예: 안구, 비강내, 폐, 경구, 위, 장, 직장, 질 또는 요로) 표면을 통해, 비경구(예: 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내) 경로를 통해, 또는 국소 투여(예: 패치 등의 경피 전달 시스템을 통해)에 의해 투여되는 백신 조성물의 사용을 포함한다.
본 개시의 한 가지 실시형태에서, 백신 조성물은 대상체의 점막 표면에 투여된다. 본 개시의 또 다른 실시형태에서, 점막 표면은 호흡기, 위장, 질, 비강, 직장 및 경구 점막으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 개시를 설명하기 위해 다수의 예가 사용되었다. 하기 실시예는 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 않된다.
실시예
실시예 1: 재조합 HBc VLP 발현 벡터의 작제
에스케리키아 콜라이(E. coli) 발현을 위해 최적화된 코돈을 갖는 HBc 단백질의 전장 cDNA 서열을 합성했다(Genomics BioSci & Tech). 이 서열을 PCR 주형으로 사용하여, 뉴클레오티드 1-444의 HBc(서열번호 5)를 증폭시킨 다음, C-말단에서 6-His로 태그된 pET28a의 NcoI-XhoI 제한 부위에 삽입하여 재조합 HBc VLP 플라스미드를 수득했다. 수득된 플라스미드는 단백질 발현을 위해 이. 콜라이 BL21(DE3) 감응 세포에 형질전환시켰다.
실시예 2: 재조합 RSV 키메라 F 단백질 발현 벡터의 작제
에스케리키아 콜라이(E. coli) 발현을 위해 최적화된 코돈을 갖는 RSV F 단백질의 전장 cDNA 서열을 합성했다(Genomics BioSci & Tech). 이 서열을 PCR 주형으로 사용하여, HRN 및 부위 Ø(서열번호 6)을 함유하는 뉴클레오티드 457-633, 부위 II(서열번호 7)을 함유하는 뉴클레오티드 760-849, 부위 IV(서열번호 8)을 함유하는 뉴클레오티드 1264-1314 및 C-말단 α-헬릭스(HRC)(서열번호 9)를 함유하는 뉴클레오티드 1426-1560을 포함하는, RSV F 단백질의 4개 유전자 단편을 증폭시켰다.
이들 4개 PCR 앰플리콘을 중첩 PCR에 의해 연결시키고, 글리신-풍부 링커, 예를 들면, GSGS, GGGS, GGSG, SGSG 및 GG에 의해 연결시켜 작제된 유전자(HRØ24로 명명)를 형성한 다음, C-말단에서 6-His로 태그된 pET28b의 NcoI-XhoI 제한 부위에 삽입하여 HRØ24 플라스미드를 수득했다.
HRØ, HRØ-3Ø 및 HBc 플라스미드의 작제 프로세스는, 하기 차이를 제외하고는, HRØ24 플라스미드의 것과 유사했다.
HRØ 플라스미드를 작제하기 위해, 서열번호 6 및 9에 의해 나타낸 RSV F 단백질의 2개 유전자 단편을 증폭시켰다. 이어서, 이들 2개 PCR 앰플리콘은 C-말단에서 6-His로 태그된 pET28a의 NcoI/BamHI 및 EcoRI/XhoI 제한 부위에 삽입하고, 글리신-풍부 링커에 의해 연결시켜 HRØ 플라스미드를 수득했다.
HRØ-3Ø 플라스미드를 작제하기 위해, 서열번호 6 및 9에 의해 나타낸 RSV F 단백질의 2개 유전자 단편을 증폭시켰다. 추가로, NheI/BamHI, BamHI/EcoRI 또는 EcoRI/HindIII 제한 부위를 함유하는 3개 부위 Ø 단편을 PCR에 의해 생성했다. 이어서, 이들 5개 PCR 앰플리콘을 C-말단에서 6-His로 태그된 pET28a의 NcoI NheI/BamHI/EcoRI/HindIII/XhoI 제한 부위에 삽입하고, 글리신-풍부 링커에 의해 연결시켜 HRØ-3Ø 플라스미드를 수득했다.
상기 수득된 플라스미드를 단백질 발현을 위해 이. 콜라이 BL21(DE3) 감응 세포에 형질전환시켰다.
실시예 1 및 2에서 PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 제시된 서열번호 10 내지 29로 나타낸다.
프라이머 서열
프라이머 서열
HRN-NcoI-F 5'- CCG CCA TGG CCG TGT CTA AGG TGC TGC -3'
(서열번호 10)
HRC-XhoI-R 5'- CAT GCT CGA GCT TGC CGG CGT TCA CAT TG -3'(서열번호 11)
HRN-A1-F 5'- CAT CGT GAA CAA GCA GAG CGG TTC TGG TTC TAA CAG CGA GCT GCT GAG -3'(서열번호 12)
HRN-A1-R 5'- CTC AGC AGC TCG CTG TTA GAA CCA GAA CCG CTC TGC TTG TTC ACG ATG -3'(서열번호 13)
A1-A2-F 5'- GCA GAT CGT GCG GCA GGG TGG TGG TTC TTG CAC CGC CAG CAA C -3'(서열번호 14)
A1-A2-R 5'- GTT GCT GGC GGT GCA AGA ACC ACC ACC CTG CCG CAC GAT CTG C -3'(서열번호 15)
A2-HRC-F 5'- AGA CCT TCA GCA ACG GCG GTG GTT CTG GTA ACT TCT ACG ACC CCC TGG -3'(서열번호 16)
A2-HRC-R 5'- CCA GGG GGT CGT AGA AGT TAC CAG AAC CAC CGC CGT TGC TGA AGG TCT -3'(서열번호 17)
부위 Ø-N-F 5'- GCC GGA TCC AGC AAC ATC AAG GAG AAC AAG TGC AAC GCC GCC AAG AAC TAC ATC GAC AA -3'(서열번호 18)
부위 Ø-C-R 5'- GCC AAG CTT CTT GTT CAC GAT GGG CAG CAG CTG CTT GTC GAT GTA GTT CTT GGC GGC GTT -3'(서열번호 19)
HRN-BamHI-R 5'- GCC GGA TCC AGA ACC AGA ACC GCT CTG CTT G -3'(서열번호 20)
HRC-EcoRI-F 5'- CGG AAT TCG GTG GTT CTG GTA ACT TCT ACG AC -3'(서열번호 21)
부위 Ø-NheI-F 5'- CTA GCT AGC AGC AAC ATC AAG GAG AAC -3'(서열번호 22)
부위 Ø-BamHI-R 5'- GCC GGA TCC GCC TCC CTT GTT CAC GAT GGG CAG C -3'(서열번호 23)
부위 Ø-BamHI-F 5'- GCC GGA TCC AGC AAC ATC AAG GAG AAC -3'(서열번호 24)
부위 Ø-EcoRI-R 5'- CGG AAT TCG CCT CCC TTG TTC ACG ATG GGC AGC -3'(서열번호 25)
부위 Ø-EcoRI-F 5'- CGG AAT TCA GCA ACA TCA AGG AGA AC -3'(서열번호 26)
부위 Ø-HindIII-R 5'- CCC AAG CTT CTT GTT CAC GAT GGG CAG C -3'(서열번호 27)
HBc148-NcoI-F 5'- CCG CCA TGG ACA TTG ACC CTT ATA AAG -3'(서열번호 28)
HBc148-XhoI-R 5'- CAT GCT CGA GAA CAG TAG TTT CCG GAA GTG -3'(서열번호 29)
실시예 3: 재조합 단백질 발현 및 정제
재조합 RSV F 단백질-6His 및 HBc-6His를 실시예 1 및 2로부터 수득된 형질전환된 이. 콜라이 BL21(DE3)에서 발현시키고, 각각 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 용출된(500mM 이미다졸, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH 8.0를 사용) 단백질을 각 단계에서 12시간 동안 200용적의 투석 완충제(1×PBS 중의 350mM로부터, 150mM, 0mM까지의 이미다졸)에 대해 1용적의 샘플을 구배 투석함으로써 완충제 교환했다. 투석된 단백질-6His는 원심분리 농축기(10,000 MWCO, Sartorius)를 사용하여 농축시켜 농도 약 1mg/mL에 도달시켰다. 단백질의 분자 크기 및 순도는 SDS-PAGE에 의해 측정했다.
His 태그에 대해 지시된 항체를 사용하여 면역블롯팅함으로써 동일한 이동도의 밴드를 검출하고, 결과는 도 1b, 1d 및 1f에 제시되어 있다. HBc 및 RSV에 대해 지시된 항체를 사용하여 면역블롯팅함으로써 동일한 이동도의 밴드를 검출하고, 결과는 각각 도 1h 및 1i에 제시되어 있다. 쿠마시에 블루 염색된 겔의 농도계 스캐닝은, 정제된 단백질 HRØ24, HRØ, HRØ-3Ø 및 HBc가 전체 단백질의 90% 이상의 양에 도달했고(도 1a, 1c, 1e 및 1g), 이는 면역화를 위해 충분히 순수한 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 재조합 Hbc VLP의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지
PBS 중의 8㎍의 정제된 HBc VLP을 실온에서 3분 동안 구리 그리드(300 메쉬)에 흡착시켰다. 이어서, 그리드는 여과지를 사용하여 온화하게 건조시켰다. 30초(s) 동안 1% 우라닐 아세테이트 수용액으로 염색시킨 후, 과량의 액체를 제거했다. 그리드는 80kV에서 JEM-1400 전자 현미경으로 검사했다.
HBc VLP는 TEM에 의해 바이러스-유사 입자를 형성하는 것으로 확인되었다(도 2).
실시예 5: 동물 면역화
1. RSV A2 균주 스톡의 제조
RSV A2 균주는 ATCC로부터 수득했다. 바이러스의 증식은, HEp-2 세포 ATCC에서 수행했다. 최대 80% 컨플루언시로 100mm 페트리 접시(Thermo Scientific)에서 성장시킨 세포를 0.2의 m.o.i(감염 중복도)에서 RSV A2에 접종시켰다. 바이러스 흡착은 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 혈청 비함유 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 수행했다. 2시간 후, 배지를 2% 태소 혈청이 보충된 DMEM으로 교환하고, 접시를 추가로 48 내지 72시간 동안 배양했다. 바이러스를 함유하는 상청액은 10분 동안 3,000rpm에서 원심분리하여 세포 파편로부터 분리했다. 이어서, 바이러스를 원심분리 농축기(100,000 MWCO, Sartorius)로 농축시켰다.
2. RSV 플라크 검정
RSV 바이러스 역가는 플라크 검정에 의해 측정했다. 12-웰 플레이트 중의 HEp-2 세포의 컨플루언트 단층을 1×PBS로 세척한 다음, 다양한 희석(10-3 내지 10-7)으로 RSV A2 바이러스로 감염시켰다. 2시간의 바이러스 흡착 후, 상청액을 제거하고, 세포 단층을 1×PBS로 세척한 다음, DMEM + 2% 태소 혈청 + 0.3% 아가로즈로 중첩시켰다. CO2 인큐베이터에서 37℃로 5일 배양한 후, 세포를 10% 포르말린으로 고정시키고, 플라크 정량화를 위해 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다.
3. 백신 투여 및 RSV 공격
병원체-비함유 C57BL/6J 암컷 마우스(6-8주령)를 몇몇 그룹으로 무작위로 나누고, 0, 21, 42 및 63일(도 3a) 또는 0, 21 및 42일(도 3b)에 백신 후보물질로 비강내(i.n) 경로에 의해 면역화시키고, 84일(도 3a) 또는 63일(도 3b)에 1×106 p.f.u. RSV로 공격했다. 백신 후보물질은 HRØ24; HBc VLP + HRØ24; HBc VLP + HRØ24+ CpG(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG, 서열번호 30)(Genomics, Taiwan); HRØ; HBc VLP + HRØ; HBc VLP + HRØ + CpG; HRØ-3Ø; HBc VLP + HRØ-3Ø; 및 HBc VLP + HRØ-3Ø + CpG를 포함한다. 천연 대조군 그룹, HBc VLP 단독으로 면역화시킨 그룹 및 1×105 p.f.u. 포르말린-고정된 RSV(FIRSV)으로 근육내(i.m) 면역화시킨 그룹이 또한 포함되었다.
마우스 혈청, 기관지폐포 세정액(BALF) 및 비장을 RSV 공격 2일 전에 동일한 투여 섭생으로 별개의 그룹으로부터 수집했다. RSV 공격을 위해, 동물을 1.5% 이소플루란으로 마취시킨 다음, 1×106 p.f.u. RSV의 비강내 접종에 의해 감염시켰다. RSV 공격 후, 마우스의 체중을 5일 동안 모니터링했다. 최후로, 마우스를 희생시키고, 바이러스 부하 및 조직병리학 실험을 위해 개개의 폐를 수집했다.
실시예 6: 백신 후보물질에 의해 유발된 항체 반응의 평가
실시예 5에 기재된 면역화시킨 마우스로부터 수집된 혈청 및 BALF를 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 항체 반응에 대해 시험했다. 요약하면, 96-웰 플레이트를 50μL의 정제된 HRØ24(10㎍/ml)로 밤새 4℃에서 코팅했다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 2% BSA로 차단시키고, 2시간 동안 실온에서 검정 희석액(1% BSA, 1×PBS 중의 0.05% 트윈 20) 중의 혈청 샘플(10-2 내지 5.12×10-4) 또는 BALF(10-1 내지 1.28×10-3)의 연속 희석물과 함께 배양했다. 희석 곡선을 각 샘플에 대해 그리고, 종점 역가는, 배경 값(풀링된 면역전 혈청의 1/50 희석 또는 풀링된 천연 BALF의 1/5 희석)보다 0.1U 큰 광학 밀도를 생성하는 희석도의 역수로서 계산했다. 50보다 낮은 IgG 역가(음성 샘플) 또는 5보다 낮은 분비 IgA(sIgA) 역가를 임의로 50 또는 5로서 할당했다.
백신 후보물질의 면역원성을 평가하는 결과를 나타내는 도 4a-4f를 참조하면, 마우스 그룹은 i) HRØ24(10㎍), ii) HRØ24(50㎍), iii) HBc(10㎍) + HRØ24(50㎍) 또는 iv) 음성 대조군으로서 HBc(10㎍)의 4개 용량으로 비강내 경로에 의해 면역화시켰다. 수집된 최종 혈청은 간접 ELISA에 의해 HRØ24-특이적 또는 FIRSV-특이적 IgG 반응에 대해 분석했다. 결과는 HBc/HRØ24 혼합물의 비강내 면역화가 현저히 높은 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a(도 4a-4c)를 생성할 수 있는 것으로 나타났다. FIRSV-특이적 전체 IgG 및 IgG1도 유도되었지만, 현저히 높지는 않았다(도 4d 및 4e). 이들 결과는 HBc VLP가 HRØ24-특이적 체액성 반응을 증강시킬 수 있음을 확인했다.
도 5a-5j를 참조하면, HBc VLP의 용량-반응 관계를 평가하기 위해, 마우스 그룹은 i) HRØ24(10㎍), ii) HBc VLP(50㎍) + HRØ24(10㎍), iii) HRØ24(10㎍) + CpG(20㎍), iv) HBc VLP(25㎍) + HRØ24(10㎍) + CpG(20㎍)(도면에서 HBc+HRØ24+CpG-1로 표기됨), v) HBc VLP(50㎍) + HRØ24(10㎍) + CpG(20㎍)(도면에서 HBc+HRØ24+CpG-2로 표기됨) 또는 vi) HBc VLP(50㎍)의 4개 용량으로 비강내 면역화시켰다. 혈청 및 BALF는 간접 ELISA에 의해 분석했다. 도 5a-5c 및 5i는, HBc VLP/HRØ24 혼합물의 투여가 현저히 높은 혈청 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1, IgG2a 및 폐 HRØ24-특이적 sIgA를 유발할 수 있음을 나타낸다. 또한, 애쥬번트로서 CpG의 사용은 이들 체액성 반응을 증강시키지 않았다.
RSV에 대한 보호 면역은 강력한 Th1 바이어스 반응 및 IFN-γ 생성을 필요로 했기 때문에, HRØ24 재조합 단백질에 의한 시험관내 자극에 반응하는 면역화된 마우스의 비장세포의 능력을 시험했다. 48시간 HRØ24-자극된 배양물로부터의 T-세포 증식을 마우스 IFN-γ ELISA 키트(BioLegend)에 의해 측정했다. 이들 세포로부터의 배양 상청액을 Ag-특이적 IFN-γ 생성에 대해 분석했다. 도 5k에 제시된 바와 같이, HRØ24로 면역화시킨 마우스의 비장세포는 HRØ24 자극 후에 IFN-γ 분비를 나타내지 않았다. 대조적으로, HBc/HRØ24, HBc/HRØ24/CpG 및 HRØ24/CpG 그룹으로 면역화시킨 마우스의 비장세포는 HRØ24 자극 후에 현저히 높은 수준의 IFN-γ 분비를 나타냈다. 특히, HBc 또는 천연 그룹으로 면역화시킨 마우스에서는 IFN-γ 분비가 확인되지 않았다.
도 6a-6h를 참조하면, RSV F 단백질 항원성 부위에 대한 특이적 반응을 검출하기 위해, RSV F 부위 Ø, II 및 IV 펩티드를 사용하여 ELISA 플레이트(10㎍/mL)를 코팅했다. 도 6a-6h는 HBc/HRØ24 혼합물을 제공받은 마우스만이 현저히 높은 부위 Ø- 및 부위 II-특이적 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a를 생성할 수 있는 것을 나타냈다. 모든 그룹 중에서 부위 IV-특이적 IgG는 검출할 수 없었다(데이터는 제시되지 않음).
더욱이, 도 7a-7e는, HBc VLP 또는 CpG와 혼합하거나 혼합하지 않은 HRØ24, HRØ 또는 HRØ-3Ø의 3개 용량의 비강내 투여를 제공받은 마우스에서 HRØ24-특이적 항체 반응을 나타냈다. 각 그룹의 마우스는 i) HBc VLP(25㎍), ii) HRØ24(50㎍), iii) HBc VLP(25㎍) + HRØ24(25㎍), iv) HBc VLP(25㎍) + HRØ24(25㎍) + CpG(20㎍), v) HBc VLP(25㎍) + HRØ24(50㎍), vi) HBc VLP(25㎍) + HRØ24(50㎍) + CpG(20㎍), vii) HRØ(50㎍), viii) HBc VLP(25㎍) + HRØ(50㎍), ix) HBc VLP(25㎍) + HRØ(50㎍) + CpG(20㎍), x) HRØ-3Ø(50㎍), xi) HBc VLP(25㎍) + HRØ-3Ø(50㎍) 또는 xii) HBc VLP(25㎍) + HRØ-3Ø(50㎍) + CpG(20㎍)의 3개 용량으로 비강내 면역화시켰다. 혈청 및 BALF는 간접 ELISA에 의해 분석했다.
도 7a-7e를 참조하면, 애주번트로서 HBc를 사용함으로써 HRØ24, HRØ 및 HRØ-3Ø는 현저히 높은 혈청 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1, IgG2a, IgA 및 폐 HRØ24-특이적 sIgA를 유발할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 여기서 최고 종점 역가는 HBc/HRØ24 그룹에서 관찰되었다. 더욱이, 애쥬번트로서 HBc 및 CpG의 혼합물을 사용함으로써, HRØ24는 또한 높은 혈청 HRØ24-특이적 전체 IgG, IgG1, IgG2a, IgA 및 폐 HRØ24-특이적 sIgA를 유발할 수 있다.
실시예 7: RSV 감염으로부터 마우스를 보호하는 것에 대한 백신 후보물질의 효과
백신 후보물질을 4회 투여할 때의 효력을 평가하기 위해, 실시예 5 및 도 5a-6h에 기재된 바와 같은 생 RSV A2 균주로 공격한 면역화된 마우스를 사용했다.
1. RSV 공격 후의 혈청 중화 역가
중화 항체는 백신접종에 의해 유도된 면역 반응의 중요한 기능적 요소였다. 도 8은, HRØ24 그룹으로부터의 혈청이 약 10% 플라크 형성을 감소시킬 수 있고, HBc/HRØ24 그룹으로부터의 혈청이 약 25% 감소시킬 수 있고, 애쥬번트로서 CpG를 제공받은 그룹이 약 17% 내지 35% 플라크를 감소시킬 수 있음을 나타냈다.
2. RSV 공격 후의 마우스 체중 변화
공격 감염후 마우스의 체중 변화는 백신 보호 효력을 평가하는 가장 중요한 지표였다. 도 9를 참조하면, FIRSV의 근육내 주사를 제공받은 마우스는 최고 체중 감소(약 23%)를 나타냈지만, HBc/HRØ24로 면역화시킨 마우스는 약 10%의 체중 감소를 나타냈다. HRØ24+CpG, HBc+HRØ24+CpG-1 및 HBc+HRØ24+CpG-2의 그룹인, 상이한 용량의 HBc(0, 25, 50㎍)로 면역화시킨 마우스는 공격후 4일에서 각각 약 8%, 4% 및 0% 체중 감소를 나타냈다.
따라서, 본 개시는 마우스 체중 감소를 예방하는 보다 우수한 보호, 및 생 RSV 공격후 초기 체중 감소로부터 신속한 회복을 제공한다. 이들은 본 출원의 항원에 의해 유발된 항-바이러스 면역성이 생 RSV A2 균주 바이러스에 대한 보호를 제공하는 증거이다.
3. RSV 공격 후의 폐 조직병리학
폐 조직은 조직학적 분석을 위해 공격후 5일에서 개개 마우스로부터 수집했다. 조직학적 분석을 위해, 폐 샘플을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 파라핀 블록에 매립하고, 5㎛의 두께로 절편화하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)로 염색했다.
도 10을 참조하면, 폐 조직병리학적 변화는 천연 그룹 또는 백신접종된 마우스에서 관찰되었다. FIRSV 면역화된 마우스는 중증 수준의 조직병리학을 나타냈다.
Lot 100 FIRSV 백신이 1960년대 후반에 임상 시험에 사용되었을 때, 백신접종된 소아는 감염시 증강된 호흡기 질환을 발증했다[참조: Kim, H.W., et al., 1969]. 또한, 현재의 연구는 FIRSV가 RSV 공격된 마우스의 폐에서 현저한 폐포염 및 혈관주위염을 유도한 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 도 10에 제시된 바와 같이, CpG의 존재 또는 부재하에 HBc/HRØ24 혼합물을 제공받은 마우스 그룹은 기도 및 폐포의 주위에 어느 정도의 침윤에 의해 증명된 바와 같이 중등도 폐 병변을 나타냈다. 추가로, 현저한 폐 조직병리학적 변화는 재조합 HRØ24 단독으로 면역화시킨 마우스에서 관찰되지 않았다.
본 개시는, 정제된 HBcAg148 단백질 및, 이. 콜라이 발현을 위해 최적화 코돈을 갖는 HBcAg148 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 정제된 HBcAg148 단백질은 TEM에 의해 바이러스-유사 입자를 형성하는 것으로 확인되었다. 추가로, 면역 반응의 증강에서 HBcAg148의 효율은, 애쥬번트 HBcAg148과 함께 RSV 백신 후보물질을 마우스에게 비강내 투여함으로써 생체내에서 관찰할 수 있다. 본 개시에 의해, HBcAg148은 RSV에 대한 혈청 전체 IgG, IgG1 및 IgG2a 반응을 증강시킬 수 있고, 이러한 애쥬번트 효과는 CpG 모티프와 유사한 것이 입증된다.
따라서, 이들 결과는, 애쥬번트로서 재조합 HBc VLP를 포함하는 본 개시의 백신 조성물이 항원에 특이적인 전신 및 점막 항체 반응 둘 다를 유도할 수 있음을 입증했다. 본 개시의 백신 조성물로 면역화시킨 마우스는 폐 질환을 유발하지 않고서 항원에 대한 보호를 나타냈다. 추가로, 본 개시의 백신 조성물은 마우스 모델에서 FIRSV와 비교하여 림프구를 과-자극시키지 않았고, 잠재적 안전한 RSV 백신 후보물질로서 제공된다.
본 개시는 상기에서 예시적 실시형태를 사용하여 상세히 기재되었다. 그러나, 본 개시의 범위는 개시된 실시형태로 한정되지 않는 것을 이해해야 한다. 오히려, 이는 다양한 변형 및 유사한 재구성을 커버하는 것을 의도한다. 따라서, 특허청구범위는, 이러한 모든 변형 및 유사한 재구성을 포괄하도록 최광의 해석에 따라야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> HUANG, Limin <120> VACCINE COMPOSITION COMPRISING HEPATITIS B VIRUS-LIKE PARTICLES AS ADJUVANT <130> IPA190657-TW <150> US 64/425,079 <151> 2016-11-22 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 148 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val 145 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> 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Claims (20)

  1. 항원 및 애쥬번트(adjuvant)를 포함하는 백신 조성물로서,
    상기 애쥬번트는, 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖고 서열번호 1과 동일한 기능을 갖는 B형 간염 코어 바이러스-유사 입자(HBc VLP)인, 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 애쥬번트가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 HBc VLP인, 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원이 감염성 질환으로부터 유래된 항원인, 백신 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항원이 인간 면역결핍 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 단순 포진 바이러스 유형 1, 단순 포진 바이러스 유형 2, 인간 사이토메갈로 바이러스, 뎅기 바이러스, 간염 A, B, C 또는 E 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS 바이러스), 인간 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 유형 b(Hib), 수막염 바이러스, 살모넬라(Salmonella), 네이쎄리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 장내독소 이. 콜라이(E. coli), 캄필로박터(Campylobacter), 스트렙토콕쿠스(Streptococcus), 모라셀라(Moraxella), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 마이코박테리아(Mycobacteria), 헤모필루스(Haemophilus), 플라스모디움(Plasmodium), 톡소플라즈마(Toxoplasma) 및 스탄워쓰(Stanworth) 데카펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것으로부터 유래되는, 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항원이 RSV로부터 유래되는, 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항원이 서열번호 2 내지 4 중의 하나로 나타낸 재조합 RSV F 단백질인, 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 애쥬번트가 0.1㎍ 내지 1000㎍의 애쥬번트-유효량으로 존재하는, 백신 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 10:1 내지 1:10의 항원 대 애쥬번트의 중량비를 갖는, 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원 대 애쥬번트의 중량비가 5:1 내지 1:5인, 백신 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 점막 백신접종에 적합한, 백신 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 경구, 비강, 직장 또는 질(vaginal) 적용에 적합한, 백신 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 점막 면역 반응 및 전신 면역 반응을 유도하고,
    상기 점막 면역 반응이 항원-특이적 분비 IgA 항체 생성이고, 상기 전신 면역 반응이 항원-특이적 IgG 항체 생성 및 항원-특이적 세포-매개된 면역 생성인, 백신 조성물.
  13. 제1항의 백신 조성물을 대상체의 점막 표면에 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 백신접종하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 점막 표면이 호흡기, 위장, 질, 비강, 직장 및 경구 점막으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 대상체가 인간 또는 동물인, 방법.
  16. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  17. 제16항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있는, 핵산 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 원핵 세포가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포이고, 상기 진핵 세포가 효모 세포 또는 포유동물 세포인, 핵산 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열번호 5의 핵산 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
KR1020197016269A 2016-11-22 2017-11-22 애쥬번트로서 b형 간염 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물 KR102276200B1 (ko)

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