TW201818962A

TW201818962A - 包含類ｂ肝病毒顆粒作為佐劑的疫苗組成物

Info

Publication number: TW201818962A
Application number: TW106140290A
Authority: TW
Inventors: 黃立民; 黃任民
Original assignee: 國立臺灣大學
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2018-06-01
Also published as: US20210322544A1; EP3545973A4; CN110099693A; JP6902804B2; JP2020506875A; AU2017366407A1; KR20190084274A; CA3044582C; US11116837B2; AU2017366407B2; WO2018095327A1; US20190290754A1; EP3545973A1; TWI634899B; CA3044582A1; KR102276200B1

Abstract

本揭露提供疫苗組成物以及誘導系統性免疫反應和黏膜免疫反應的方法，其中，該疫苗組成物包含抗原和作為佐劑的類B肝核心病毒顆粒(HBc VLP)。該疫苗組成物適用於給藥至受試者的黏膜表面，且在引起對抗感染的保護性免疫反應中有效。

Description

包含類B肝病毒顆粒作為佐劑的疫苗組成物

相關申請的交叉引用

本申請主張在2016年11月22日提交的美國專利臨時申請案第62/425,079號的優先權，該臨時申請案通過引用而以其整體併入本文。

本發明涉及疫苗組成物，及提升免疫原性和改善對抗原的免疫反應的方法。

到2021，疫苗佐劑的全球市場預計從2016年的4.670億美元上升至7.694億美元。驅動這一市場成長的主要因素是感染性疾病和動物傳染病的大流行、許多政府機構對免疫計劃的關注提高，以及對抗現有疾病和新興疾病的改善且長效的免疫作用的關注度日益增長。

近年來，因為黏膜表面是大多數感染性物質進入的關口，且對於動物在進入的關口處即發展出強效保護性抗體和細胞介導的免疫反應非常重要，對於通過黏膜表面傳送的疫苗存在普遍的關心。黏膜疫苗可使用佐劑和傳送系統完成，該佐劑和傳送系統會將疫苗抗原吸附至口腔、腸、鼻、直腸、或陰道的黏膜表面上，且在吸附之後，將疫苗抗原帶至與黏膜相關淋巴組織接觸。因此，黏膜疫苗在提供有效誘導系統性免疫(IgG抗體的產生)和黏膜免疫(分泌性IgA抗體的產生)的益處方面有優勢，並且它們還廉價、容易給藥且適用於大規模的疫苗接種。

作為一種免疫學常用的佐劑，自1930年代以來，鋁鹽已經被用於疫苗中。然而，即使在全世界廣泛使用，鋁鹽仍然相對疲弱且僅對某些疾病生效。

因此，對於具有能穿透黏膜上皮細胞且誘導保護性和長效性免疫反應的佐劑的黏膜疫苗存在需求。

有鑒於前述，本揭露提供一種包含抗原和佐劑的疫苗組成物，其中，該佐劑是重組類B肝核心病毒顆粒(HBc VLP)，本文中也簡稱為“HBc”。

該重組HBc VLP可包含胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1的胺基酸序列一致程度為至少80%且具有與SEQ ID NO：1相同的功能。本揭露的一具體實施例中，該佐劑是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成的HBc VLP。

本揭露的一具體實施例中，該抗原是源自感染性疾病的抗原。本揭露的另一具體實施例中，該抗原源自下列所組成的群組中的一種：人類免疫缺陷病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、1型單純性皰疹病毒、2型單純性皰疹病毒、人類巨細胞病毒、登革病毒、A肝病毒、B肝病毒、C肝病毒、E肝病毒、呼吸道融合病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)、嚴重急性呼吸道融合病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)Virus)、人乳頭狀瘤病毒、流感病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌、奈瑟氏菌(Neisseria)、包柔氏螺旋體(Borrelia)、衣原體(Chlamydia)、博戴氏桿菌(Bordetella)、腸毒素大腸桿菌、彎麴菌(Campylobacter)、鏈球菌、莫拉克斯氏菌(Moraxella)、支原體(Mycoplasma)、分枝桿菌(Mycobacteria)、嗜血桿菌(Haemophilus)、瘧原蟲或弓漿蟲(Toxoplasma)、Stanworth十肽(Stanworth decapeptide)。

根據本揭露的又一態樣，本揭露提供一種對受試者接種疫苗的方法，包含將上述的疫苗組成物給藥至該受試者的黏膜表面。

本揭露的另一具體實施例中，該黏膜表面可選自呼吸道黏膜、胃腸黏膜、陰道黏膜、鼻黏膜、直腸黏膜和口腔黏膜所組成的群組。

本揭露提供一種重組HBc VLP。另外，本揭露提供一種疫苗組成物，其包含來自感染性物質的抗原和作為佐劑的佐劑有效量的重組HBc VLP。本揭露的疫苗組成物可在受試者體內誘導對該抗原為特異性的抗體反應，並保護受試者免於該感染性物質的感染且不造成副作用。如此，本揭露的佐劑、疫苗組成物及實現免疫的方法容易實現大規模的生產，且更有助於增加抗體鑒別的特異性並避免不必要的反應如過敏。

通過閱讀下述具體實施例的詳細說明並參照附圖，可更完整地理解本揭露，其中：

第1A至1I圖是HRØ24、HRØ、HRØ-3Ø重組蛋白和HBc的SDS-PAGE分析結果。第1A、1C、1E、和1G圖分別顯示對經純化的HRØ24、HRØ、HRØ-3Ø重組蛋白以及HBc的考馬斯亮藍染色；第1B、1D、和1F圖分別顯示使用抗His抗體對經純化的HRØ24、HRØ、和HRØ-3Ø重組蛋白的西方墨點轉漬；第1H圖顯示使用兔多株抗HBc抗體對經純化的HBc的西方墨點轉漬；以及，第1I圖顯示使用鼠單株抗RSV抗體對經純化的HBc和HRØ24重組蛋白的西方墨點轉漬。

第2圖顯示經純化的HBc的TEM圖像。

第3A和3B圖顯示鼻內(IN)免疫接種程序表。第3A圖顯示，使用候選疫苗在第0、3、6、和9周對各組小鼠免疫接種4次，並令小鼠在第12周接受RSV激發；而第3B圖顯示，使用候選疫苗在第0、3、和6周對各組小鼠免疫接種3次，並令小鼠在第9周接受RSV激發。另包括一組為在RSV激發前使用經福馬林固定的RSV(FIRSV)進行肌肉內(i.m)免疫接種。在RSV激發前2天，從使用相同投藥方案的各組別收集小鼠血清、BALF和脾臟。

第4A至4F圖顯示接受4劑與HBc VLP混合或不混合的HRØ24的鼻內給藥的小鼠體內的HRØ24和FIRSV特異性抗體反應。在進行RSV激發前2天，從各組收集小鼠血清。第4A至4C圖分別顯示從血清測量的HRØ24特異性總IgG、IgG1、和IgG2a反應；以及，第4D至4F圖分別顯示從血清測量的FIRSV特異性總IgG、IgG1、和IgG2a反應。

第5A至5K圖顯示接受4劑與CpG混合或不混合的HRØ24與HBc VLP混合物的鼻內給藥的小鼠體內的HRØ24和FIRSV特異性抗體反應和脾細胞再刺激。在進行RSV激發前2天，收集小鼠血清、BALF、和脾臟。第5A至5D圖分別顯示從血清測量的HRØ24特異性總IgG、IgG1、IgG2a反應和IgG2a/IgG1比；第5E至5H圖分別顯示從血清測量的FIRSV特異性總IgG、IgG1、IgG2a反應和IgG2a/IgG1比；第5I和5J圖分別顯示從BALF檢測的HRØ24和FIRSV特異性分泌性IgA(sIgA)反應；以及，第5K圖顯示在抗原再刺激實驗中檢測的IFN-γ的水平。

第6A至6H圖顯示接受4劑與CpG混合或不混合的HRØ24與HBc VLP混合物的鼻內給藥的小鼠體內的RSV F蛋白位點Ø和位點II特異性抗體反應。在進行RSV前2天，收集各組的小鼠血清。第6A至6D圖分別顯示從血清測量的位點Ø特異性總IgG、IgG1、IgG2a反應和IgG2a/IgG1比；以及，第6E至6H圖分別顯示從血清測量的位點II特異性總IgG、IgG1、IgG2a反應和IgG2a/IgG1比。

第7A至7E圖顯示接受3劑與HBc VLP或CpG混合或不混合的HRØ24、HRØ、或HRØ-3Ø的鼻內給藥的小鼠體內的HRØ24特異性抗體反應。在進行RSV激發前2天，收集血清和BALF。第7A、7B、7C、和7E圖分別顯示從血清測量的HRØ24特異性總IgG、IgG1、IgG2a和IgA反應；以及，第7D圖顯示從BALF檢測的HRØ24特異性sIgA反應。

第8圖顯示血清中和效價。在進行RSV激發前2天，收集對照組或接受4劑鼻內給藥的接種疫苗的小鼠的血清，並測試對於RSV溶菌斑形成的抑制。

第9圖顯示小鼠體重在激發後的改變。在進行RSV激發後，監控對照組或接受4劑鼻內給藥的接種疫苗的小鼠的體重改變5天。體重改變以相對於第0天體重減輕的百分比表示。

第10圖顯示肺組織病理學。在進行RSV激發5天後，收集對照組或接受4劑鼻內給藥的接種疫苗的小鼠的肺組織，進行組織學分析。

使用下述具體實施例來例示性說明本揭露。基於本揭露內容和說明，該領域技術人員可設想本揭露的其它優點。本揭露也可如不同的具體實施例中所揭示的予以實施或應用。可對上述實施例作成修飾及/或變更，以在不同態樣和應用中實施本揭露，而不抵觸本揭露的精神和範疇。

本文中，除非語境中明確排除，單數形式“一”和 “該”包括複數個對象。因此，例如，所提及的“一抗原”包括抗原的混合物；所提及的“一醫藥學上可接受的載劑”包括兩種或多種此類載劑的混合物等等。如此，術語“一”、“一個或多個”、以及“至少一個”可在本文中互換地使用。

此外，本文中使用的“及/或”被用於對兩種特定特徵或成分中的一或二者的詳細說明。因此，本文中，在語句“A及/或B”中使用的術語“及/或”意圖包括“A及B”、“A或B”、“(僅有)A”和“(僅有)B”。

本揭露提供一種包含抗原和佐劑的疫苗組成物，其中，該佐劑是重組HBc VLP。

本文中，術語“類病毒顆粒”(VLP)是指像是病毒的結構，但因為其缺乏病毒基因組而是非感染性的。本文中，術語“非感染性的”是指不能進入宿主細胞內。典型地，由於類病毒顆粒缺少全部或部分的病毒基因組，特別是該病毒基因組的複製性和感染性組分，它們不能複製且缺乏致病性。該類病毒顆粒可以是病毒衣殼，如包覆有被認為是病毒包膜的脂質膜的相應病毒的病毒衣殼。術語“病毒衣殼”或“衣殼”是指，由病毒蛋白次單元構成的大分子組件。另外，類病毒顆粒通常可通過異源表達而大量生產且可輕易地純化。

一旦在適宜的表達系統內進行該蛋白的重組表達，則VLP可自發形成。生產特定VLP的方法是該領域已知的。VLP的存在可使用該領域已知的傳統技術檢測，如通過電子顯微鏡、X射線晶體學等檢測。

本揭露的一具體實施例中，該佐劑可以是重組B肝核心抗原(HBcAg)。本揭露的另一具體實施例中，該佐劑可以是具有一胺基酸序列的重組HBcAg，其中，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1的胺基酸序列的一致程度為至少80%且具有與SEQ ID NO：1相同的功能。本揭露的又一具體實施例中，該重組HBcAg包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1的胺基酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。

本文中，術語“序列一致性”或，例如，包含“80%的序列一致”是指，在整個比較窗口中，序列以一個核苷酸對一個核苷酸或一個胺基酸對一個胺基酸為基準的一致性程度。因此，可通過下述計算“序列一致性的百分比”：比較在比較窗口內兩個最適宜地對準的序列，確定兩個序列中出現一致的核酸鹼基(如，A、T、C、G、I)或一致的胺基酸殘基(如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數，得到匹配位置數，該匹配位置數除以比較窗口內位置的總數(即，窗口尺寸)，結果再乘以100，得到序列一致性的百分比。所包括的是與本文中揭示的任何參考序列(參見如序列表)具有至少約80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性的核苷酸和多肽，典型地，該多肽變體保持該參考多肽的至少一種生物學活性或功能。

本揭露的一具體實施例中，該佐劑是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成的重組HBcAg，本文中也稱為“HBcAg148”，已經證實其形成類病毒顆粒。

本揭露提供包含HBcAg148類病毒顆粒的佐劑組成物，其中，該HBcAg148類病毒顆粒是由來自B肝病毒(HBV)的衣殼蛋白自組裝而形成的惰性空衣殼。HBV是具有環狀的、部分雙鏈的DNA基因組的小包膜病毒。它是全世界感染性肝病的主要肇因。HBV感染影響全世界大約20億人，且成年人的HBV感染一般是短暫的。HBcAg是可在核衣殼即HBV最內層的表面上發現的抗原。因為HBcAg148 VLP的組裝不併入遺傳物質，所以它們是非感染性的。

本揭露的一具體實施例中，該抗原源自感染性疾病，包括但不限於，人類免疫缺陷病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、1型單純性皰疹病毒、2型單純性皰疹病毒、人類巨細胞病毒、登革病毒、A肝病毒、B肝病毒、C肝病毒、E肝病毒、RSV、SARS病毒、人乳頭狀瘤病毒、流感病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋體、衣原體、博戴氏桿菌、腸毒素大腸桿菌、彎麴菌、鏈球菌、莫拉克斯氏菌、支原體、分枝桿菌、嗜血桿菌、瘧原蟲或弓漿蟲、Stanworth十肽。

上述源自感染性疾病的抗原是指，被測試生物體內發展出的免疫反應作為靶標的任何物質。上述源自感染性疾病的抗原也可以是當與免疫活性細胞接觸時的免疫反應(如，免疫活性細胞的成熟、細胞因子的產生、和抗體的產生)的靶標。

本揭露的一具體實施例中，該抗原可源自RSV。如本文中所述，RSV已經被識別為嬰幼兒下呼吸道感染的最常見肇因。RSV具有由三個連續基因(SH-G-F)編碼的三種表面糖蛋白：小疏水性糖蛋白(SH)、依附糖蛋白(G)和融合糖蛋白(F)。RSV疫苗研發的主要靶標抗原是RSV F和G，因為這些抗原各自能生成中和抗體以及T細胞反應。由於其在RSV隔離群中可觀的保守性，F尤其引人注目。歷史上，存在兩種已知的發現於RSV F的融合前和融合後兩種構型上與中和(NT)活性相關聯的主要抗原性位點。它們最初通過結合至鼠科動物單株抗體(mAb)的1129(位點II)而被界定(Beeler,J.A.et al.,1989；Arbiza,J.,et al.,1992)和101F(位點IV)(Wu,S.J.,et al.,2007)。位點II作為帕利珠單抗(palivizumab)的靶標而為人所知，帕利珠單抗可減少高風險嬰兒群體的重度RSV疾病。McLellan等人(McLellan,J.S.,et al.,2013)分離了鼠抗體，5C4，它有效中和RSV但顯示不結合至融合後的F蛋白。5C4與從經免疫接種的PBMCs、D25和AM22分離的其它兩種抗體分享這些性質，該抗體在中和RSV方面已經顯示了比帕利珠單抗大100倍的效力(McLellan,J.S.,et al.,2013)。D25和AM22以位點Ø為靶標，該位點是位於融合前RSV F三聚體表面上的亞穩態抗原性位點(Spits,H.,et al.,2010；Beaumont,T.,et al.,2012)。F蛋白的融合前晶體結構和融合後晶體結構暗示，雖然在兩種結構上都發現了位點II和位點IV，位點Ø似乎是對融合前形式有特異性(McLellan,J.S.,et al.,2013)。

RSV F的融合肽區域位於F1亞基的胺基端(Collins,P.L.,et al.,1996)，而該跨膜段含有兩個區域：4,3-疏水性七元重複序列(HR)、令人聯想到捲曲螺旋結構的序列基序(Chambers,P.,et al.,1990；Singh,M.,et al.,1999)。這些區域分別指示為HRN和HRC，且通過約270個胺基酸的中介結構域分隔。HRN和HRC形成三聚體的髮夾樣結構，且該HRC區域以與由HRN區域形成的捲曲螺旋反平行的方式封裝(Baker,K.A.,et al.,1999)。

本揭露的一具體實施例中，該抗原是重組RSV F蛋白，其包含HRN區域、HRC區域、以及選自由位點Ø、位點II和位點IV所組成群組的至少一個抗原性位點。本揭露的另一具體實施例中，該抗原可由SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中之一表示。

一具體實施例中，該疫苗組成物可用來誘導受試者體內對感染性物質如RSV的免疫反應。因此，若干具體實施例中，可將該包含治療有效量的重組RSV F蛋白作為抗原的疫苗組成物給藥至受試者，以引起對RSV的免疫反應。

本揭露的另一具體實施例中，在足以預防或緩解有需要的受試者體內的RSV感染的條件下，將包含治療有效量的重組RSV F蛋白作為抗原的疫苗組成物給藥至該受試者。該疫苗組成物以足以引起該受試者體內的對抗RSV抗原如RSV F蛋白的免疫反應的量給藥。本揭露的一具體實施例中，該疫苗組成物適用於黏膜疫苗接種，且可口服、鼻內、經直腸或經陰道給藥至該受試者。

本揭露的一具體實施例中，該佐劑以0.1μg至1,000μg的佐劑有效量存在於該疫苗組成物中。本揭露的另一具體實施例中，該疫苗組成物包含重量比為10：1至1：10的抗原與佐劑的混合物。本揭露的又一具體實施例中，該疫苗組成物中包含的抗原與佐劑的重量比為5：1至1：5。

本揭露的一具體實施例中，疫苗組成物中的HBc VLP用作為有效增強對抗原的免疫反應及/或調節其朝向所希望的免疫反應發展的唯一佐劑。本揭露的另一具體實施例中，該疫苗組成物可包含額外的佐劑。可用於本揭露的額外的佐劑可包括，但不限於，CpG寡核苷酸。

本揭露的一具體實施例中，該疫苗組成物可進一步包含醫藥學上可接受的載劑。本文中，“醫藥學上可接受的載劑”包括可適用於本揭露疫苗組成物的給藥的任何和全部溶劑、分散介質、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。可用於本揭露的醫藥學上可接受的載劑可包括，但不限於，防腐劑、懸浮劑、增粘劑、等滲劑、緩衝劑、和濕潤劑。

本揭露進一步提供一種製備疫苗組成物的方法，該方法包含提供包含HBcAg148 VLP和醫藥學上可接受的載劑的佐劑組成物，以及將該佐劑組成物與作為抗原的重組RSV F蛋白合併。本揭露的一具體實施例中，該HBcAg148 VLP由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。

根據本揭露的又一態樣，本揭露提供一種編碼上述 HBcAg148 VLP的核酸分子。本揭露的一具體實施例中，該核酸分子是經密碼子優化以用於在原核細胞內表達。另一具體實施例中，該原核細胞是大腸桿菌細胞。再一具體實施例中，該核酸分子包含核酸序列，該核酸序列其與SEQ ID NO：5的核酸序列的一致程度為至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。

本揭露的一具體實施例中，該核酸分子是經密碼子優化以用於在真核細胞內表達。另一具體實施例中，真核細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。又一具體實施例中，該哺乳動物細胞是人細胞。

本揭露進一步提供一種通過上文揭示的疫苗組成物誘導黏膜免疫反應和系統性免疫反應的方法。將該疫苗組成物給藥至有此需要的受試者，從而誘導該受試者體內的黏膜免疫反應和系統性免疫反應，其中，該黏膜免疫反應是抗原特異性IgA抗體的產生，而該系統性免疫反應是抗原特異性IgG抗體的產生和抗原特異性細胞介導免疫的產生。

根據本揭露的又一態樣，本揭露提供一種對受試者接種疫苗的方法，該方法包括將上文揭示的疫苗組成物給藥至該受試者。疫苗接種方法包含通過疫苗領域中已知的任何傳統途徑給藥該疫苗組成物，該途徑為，例如，經由黏膜(如，眼部、鼻內、肺部、口腔、胃部、小腸、直腸、陰道、或泌尿道)表面、經由腸胃外(如，皮下、皮內、肌肉內、靜脈內、或腹膜內)途徑、或外用給藥(如，經由透皮傳送系統如貼劑)。

本揭露的一具體實施例中，將該疫苗組成物給藥至該受試者的黏膜表面。本揭露的另一具體實施例中，該黏膜表面可選自呼吸道黏膜、胃腸道黏膜、陰道黏膜、鼻黏膜、直腸黏膜和口腔黏膜所組成的群組。

已經使用多個實施例來例示性說明本揭露。下述實施例不應視為限制本揭露的範疇。

[實施例]

實施例1：重組HBc VLP表達載體的構建

合成了具有用於大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))表達的最佳密碼子的HBc蛋白的全長度cDNA序列(Genomics BioSci & Tech)。使用這一序列作為PCR模板，擴增了HBc的核苷酸1至444(SEQ ID NO：5)，隨後將其插入以6-His在C端標記的pET28a的NcoI-XhoI限制位點，以獲得重組HBc VLP質體。將所得質體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞內用於蛋白質表達。

實施例2：重組RSV嵌合體F蛋白表達載體的構建

合成了具有用於大腸桿菌表達的最佳密碼子的RSV F蛋白的全長度cDNA序列(Genomics BioSci & Tech)。使用這一序列作為PCR模板，擴增了RSV F蛋白的4種基因片段，包括含有HRN和位點Ø的核苷酸457至633(SEQ ID NO：6)、含有位點II的核苷酸760至849(SEQ ID NO：7)、含有位點IV的核苷酸1264至1314(SEQ ID NO：8)、以及含有該C端α-螺旋(HRC)的核苷酸1426至1560(SEQ ID NO：9)。

通過部分重疊PCR鏈接這4種PCR擴增子，並通過富甘胺酸鏈接基(linker)，如GSGS、GGGS、GGSG、SGSG和GG連接，以形成所構建的基因(命名為HRØ24)，隨後，該將該基因插入以6-His在C端標記的pET28b的NcoI-XhoI限制位點內，以獲得HRØ24質體。

HRØ、HRØ-3Ø和HBc質體的構建過程與HRØ24質體類似，但區別如下。

對於HRØ質體的構建，擴增了RSV F蛋白的以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9表示的基因片段。隨後，將這兩種PCR擴增子插入以6-His在C端標記且通過富甘胺酸鏈接基而連接的pET28a的NcoI/BamHI和EcoRI/XhoI限制位點內，以獲得HRØ質體。

對於HRØ-3Ø質體的構建，擴增了RSV F蛋白的以SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9表示的基因片段。再者，通過PCR創建分別含有NheI/BamHI、BamHI/EcoRI、或EcoRI/HindIII限制位點的三種位點Ø片段。隨後，將這5種PCR擴增子插入以6-His在C端標記且通過富甘胺酸鏈接而連接的pET28a的NcoI NheI/BamHI/EcoRI/HindIII/XhoI限制位點內，以獲得HRØ-3Ø質體。

將上述所得質體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)勝任細胞內進行蛋白質表達。

實施例1和2的PCR中使用的引子以SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：29表示，顯示於表1中。

實施例3：重組蛋白表達和純化

分別在從實施例1和2中獲得的經轉形的大腸桿菌 BL21(DE3)中表達重組RSV F蛋白-6His和HBc-6His，並使用鎳親和色譜純化。通過1體積的樣品對200體積的透析緩衝液(從350mM、150mM至0mM咪唑，1×PBS中)的梯度透析，對經洗脫(使用500mM咪唑、50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl pH 8.0)的蛋白進行緩衝液交換，每一步驟進行12小時。使用離心濃縮機(10,000 MWCO,Sartorius)將經透析的蛋白-6His濃縮至約1mg/mL的濃度。通過SDS-PAGE測定該蛋白的分子大小和純度。

通過使用指向為抗His標記的抗體的免疫墨點法，檢測了同一移動性的條帶，結果顯示於第1B、1D、和1E圖中。通過使用指向為抗HBc和RSV的抗體的免疫墨點法，檢測了同一移動性的條帶，結果分別顯示於第1H和1I圖中。對考馬斯藍染色的凝膠的光密度掃描顯示，純化的蛋白HRØ24、HRØ、HRØ-3Ø和HBc相當於總蛋白的90%以上(第1A、1C、1E、和1G圖)，其純度足以進行免疫接種。

實施例4：重組HBc VLP的穿透式電子顯微鏡(TEM)圖像

在室溫下，令PBS中的8μg的純化HBc VLP在銅網格(300目)上吸附3分鐘。隨後，使用濾紙輕柔地吸乾網格。以1%乙酸雙氧鈾水溶液染色30秒後，移除過量的液體。使用JEM-1400電子顯微鏡在80kV檢查網格。

已經通過TEM證實，HBc VLP形成類病毒顆粒(第2圖)。

實施例5：動物免疫分析

1.RSV A2株原液的製備

從ATCC獲得RSV A2株。在HEp-2細胞ATCC中實施病毒的繁殖。使用RSV A2以0.2的m.o.i(感染複數)接種在100mm有蓋培養皿(Thermo Scientific)中生長的高達80%融合度的細胞。在37℃的CO₂培養箱內，在不含血清的達爾博克改良伊戈爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM))中進行病毒的吸附。2小時後，將培養基替換為以2%胎牛血清補充的DMEM，將給培養皿再培養48至72小時。通過以3,000rpm離心10min，從細胞碎片分離出含有該病毒的上清液。隨後通過離心濃縮機(100,000MWCO,Sartorius)濃縮病毒。

2.RSV溶菌斑試驗

通過溶菌斑試驗測定RSV病毒效價(titer)。以1×PBS洗滌12孔板中的HEp-2細胞融合單層，隨後以多種稀釋度(10^-3至10^-7)的RSV A2病毒感染該細胞。進行2小時的病毒吸附後，移除上清液，以1×PBS洗滌細胞的單層，之後以DMEM+2%胎牛血清+0.3%瓊脂糖覆蓋。於37℃在CO₂培養箱中培養5天後，細胞以10%福馬林固定，並使用0.05%結晶紫染色進行溶菌斑定量。

3.疫苗給藥和RSV激發(challenge)

將無病原體的C57BL/6J雌性小鼠(6至8周齡)隨機分為若干組，通過鼻內(i.n)途徑使用候選疫苗在第0、21、42和63天進行免疫接種(第3A圖)或在第0、21和42天進行免疫接種(第3B圖)，並在第84天(第3A圖)或第63天(第3B圖)令小鼠經1×10⁶ p.f.u RSV激發。候選疫苗包括：HRØ24；HBc VLP+HRØ24；HBc VLP+HRØ24+CpG(TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG，SEQ ID NO.30)(基龍米克斯生物科技公司，臺灣)；HRØ；HBc VLP+HRØ；HBc VLP+HRØ+CpG；HRØ-3Ø；HBc VLP+HRØ-3Ø；以及HBc VLPs+HRØ-3Ø+CpG。還包括對照組、僅使用HBc VLP進行免疫接種的組、和使用1×10⁵ p.f.u福馬林固定的RSV(FIRSV)進行肌肉內(i.m)免疫接種的組。

在RSV激發前的2天，從使用相同給藥方案的各組別中收集小鼠血清、氣管肺泡灌洗液(BALF)和脾臟。對於RSV激發，使用1.5%異氟烷麻醉動物，隨後通過1×10⁶ p.f.u RSV的鼻內接種令其感染。進行RSV激發後，監控小鼠的體重改變5天。最終，犧牲小鼠，收集個體的肺進行病毒負載和組織病理學實驗。

實施例6：對由候選疫苗引起的抗體反應的評估

通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測試從如實施例5中揭示的免疫接種小鼠收集的血清和BALF的抗體反應。簡而言之，在4℃，以50μL的純化HRØ24(10μg/ml)塗覆96孔板過夜。以2% BSA將該板在37℃封閉1小時，使用血清樣品在試驗稀釋劑(1% BSA、0.05% Tween 20，在1×PBS中)中的逐級稀釋液(10^-2至5.12×10^-4)或BALF的逐級稀釋液(10^-1至1.28×10^-3)在室溫培養2小時。對每一樣品做稀釋物曲線，且將終點效價計算為產生最佳濃度的稀釋物的倒數，該最佳濃度比背景值(對彙集的前免疫血清進行1/50稀釋，或對彙集的對照BALF進行1/5稀釋)高0.1U。將低於50(陰性樣品)的IgG效價或低於5的分泌性IgA(sIgA)效價任意地指定為50或5。

參考第4A至4F圖，該圖顯示候選疫苗的免疫原性評估結果，其中，各組小鼠分別使用4劑的i)HRØ24(10μg)；ii)HRØ24(50μg)；iii)HBc(10μg)+HRØ24(50μg)；或作為陰性對照的iv)HBc(10μg)經鼻內途徑進行免疫接種。使用間接ELISA分析所收集的最終血清的HRØ24特異性或FIRSV特異性IgG反應。結果表明，使用HBc/HRØ24混合物進行鼻內免疫接種會生成顯著更高的HRØ24特異性總IgG、IgG1和IgG2a(第4A至4C圖)。FIRSV特異性總IgG和IgG1也被誘導但不是顯著更高(第4D和4E圖)。這些結果證實，HBc VLP可提升HRØ24特異性體液反應。

參考第5A至5J圖，為了評估HBc VLP的劑量-反應關係，分別使用4劑的下述試劑對各組小鼠進行鼻內免疫接種：i)HRØ24(10μg)；ii)HBc VLP(50μg)+HRØ24(10μg)；iii)HRØ24(10μg)+CpG(20μg)；iv)HBc VLP(25μg)+HRØ24(10μg)+CpG(20μg)(圖中標注為HBc+ HRØ24+CpG-1)；v)HBc VLP(50μg)+HRØ24(10μg)+CpG(20μg)(圖中標注為HBc+HRØ24+CpG-2)；或vi)HBc VLP(50μg)。通過間接ELISA分析血清和BALF。第5A至5C和5I圖顯示，投予HBc VLP/HRØ24混合物可引起顯著更高的血清HRØ24特異性總IgG、IgG1、IgG2a以及肺HRØ24特異性sIgA。此外，使用CpG作為佐劑並未提升這些體液反應。

由於對抗RSV的保護性免疫需要有效的Th1偏差反應和IFN-γ的產生，我們測試了來自經免疫接種小鼠的脾細胞對於HRØ24重組蛋白體外刺激的反應能力。通過鼠IFN-γ ELISA試劑盒(BioLegend)測定來自48h HRØ24刺激培養物的T細胞擴增。分析來自這些細胞的培養物上清液的Ag特異性IFN-γ的產生。如第5K圖所示，來自使用HRØ24進行免疫接種的小鼠的脾細胞，顯示在HRØ24刺激後沒有IFN-γ分泌。相比之下，來自使用HBc/HRØ24、HBc/HRØ24/CpG和HRØ24/CpG進行免疫接種的組中小鼠的脾細胞，顯示在HRØ24刺激後顯著更高水平的IFN-γ分泌。值得注意的是，在使用HBc進行免疫接種的鼠體內或對照組中沒有IFN-γ分泌。

參考第6A至6H圖，為了檢測對抗RSV F蛋白抗原性位點的特異性反應，使用RSV F位點Ø、II和IV肽塗覆ELISA板(10μg/mL)。第6A至6H圖顯示，僅有接受HBc/HRØ24混合物的小鼠可生成顯著更高的位點Ø特異性和位點II特異性總IgG、IgG1和IgG2a。所有組中均未檢測出位點IV特異性IgG(數據未顯示)。

此外，第7A至7E圖顯示，接受3劑鼻內給藥的與HBc VLP或CpG混合或不混合的HRØ24、HRØ、或HRØ-3Ø的小鼠體內的HRØ24特異性抗體反應。各組小鼠分別使用3劑的下述試劑進行鼻內免疫接種：i)HBc VLP(25μg)；ii)HRØ24(50μg)；iii)HBc VLP(25μg)+HRØ24(25μg)；iv)HBc VLPs(25μg)+HRØ24(25μg)+CpG(20μg)；v)HBc VLP(25μg)+HRØ24(50μg)；vi)HBc VLP(25μg)+HRØ24(50μg)+CpG(20μg)；vii)HRØ(50μg)；viii)HBc VLP(25μg)+HRØ(50μg)；ix)HBc VLP(25μg)+HRØ(50μg)+CpG(20μg)；x)HRØ-3Ø(50μg)；xi)HBc VLP(25μg)+HRØ-3Ø(50μg)；或xii)HBc VLP(25μg)+HRØ-3Ø(50μg)+CpG(20μg)。通過間接ELISA分析血清和BALF。

參考第7A至7E圖，該圖顯示，通過使用HBc作為佐劑,HRØ24、HRØ和HRØ-3Ø可引起顯著更高的血清HRØ24特異性總IgG、IgG1、IgG2a、IgA以及肺HRØ24特異性sIgA，其中，在HBc/HRØ24組中觀察到了最高的終點效價。此外，通過使用HBc與CpG的混合物作為佐劑，HRØ24也可引起更高的血清HRØ24特異性總IgG、IgG1、IgG2a、IgA以及肺HRØ24特異性sIgA。

實施例7：候選疫苗在保護小鼠對抗RSV感染上的效果

為了評估投予4次該候選疫苗時的效力，使用如實施例5和第5A至6H圖中揭示的活體RSV A2株激發的經免疫接種小鼠。

1.進行RSV激發後的血清中和效價

中和抗體是由疫苗誘導的免疫反應中的重要功能性組分。第8圖顯示，來自HRØ24組的血清可減少約10%的溶菌斑形成，來自HBc/HRØ24組的血清減少約25%的溶菌斑形成，而接受CpG作為佐劑的組則可減少約17%至35%的溶菌斑。

2.進行RSV激發後的小鼠體重改變

小鼠在激發感染後的體重改變是評價疫苗保護性效力的最重要的指標。參考第9圖，接受肌肉注射FIRSV的小鼠顯示最高的體重減輕(約23%)，而使用HBc/HRØ24進行免疫接種的小鼠顯示約10%的體重減輕。使用不同劑量的HBc(0、25、50μg)進行免疫接種的小鼠，即HRØ24+CpG組、HBc+HRØ24+CpG-1組、HBc+HRØ24+CpG-2組的小鼠，分別在激發後第4天顯示約8%、4%和0%的體重減輕。

因此，本揭露提供更好的保護以預防小鼠體重減輕，並提供從活體RSV激發後的初始體重減輕快速的恢復。這些證明，由本申請案的抗原引起的抗病毒性免疫提供保護，用於對抗活體RSV A2病毒株。

3.進行RSV激發後的肺組織病理學

在進行激發5天後，從個體小鼠收集肺組織用於組織學分析。對於組織學分析，肺樣本在10%中性緩衝福馬林中固定24小時，包埋在石蠟塊中，切割為厚度為5μm的切片，且使用蘇木精和曙紅(H&E)染色。

參考第10圖，在對照組或經疫苗接種的小鼠體內觀察到了肺組織病理學的改變。經FIRSV免疫接種的小鼠顯示嚴重水平的組織病理學。

在1960年代後期，當在臨床試驗中使用Lot 100 FIRSV疫苗時，接種疫苗的兒童在感染時發展出增強的呼吸道疾病(Kim,H.W.,et al.,1969)。另外，目前的研究顯示，FIRSV在激發RSV的小鼠體內誘發了顯著的肺部肺泡炎(alveolitis)和血管周炎(perivascusculitis)。相比之下，如第10圖所示，如氣管和肺泡周邊的某種程度的浸潤所證明的，接受與CpG混合或不混合的HBc/HRØ24混合物組的小鼠，顯示了中度的肺部病理學。再者，在僅使用重組HRØ24進行免疫接種的小鼠體內，未觀察到明顯的肺部病理學改變。

本揭露提供經純化的HBcAg148蛋白、以及編碼該HBcAg148蛋白的具有用於大腸桿菌表達的優化密碼子的核酸分子。已經通過TEM證實，該經純化的HBcAg148蛋白形成類病毒顆粒。再者，通過對小鼠同時經鼻內投予RSV候選疫苗和佐劑HBcAg148，可觀察到HBcAg148在提升體內免疫反應中的效力。通過本揭露表明，HBcAg148將會提升對抗RSV的血清總IgG、IgG1和IgG2a反應，且這一佐劑效應與CpG基序類似。

因此，這些結果表明，本揭露的包含重組HBc VLP作為佐劑的疫苗組成物可誘導對於該抗原為特異性的系統性和黏膜抗體反應。使用本揭露的疫苗組成物進行免疫接種的小鼠，顯示被保護對抗該抗原而不造成肺病。再者，與FIRSV相比，在小鼠模型中，本揭露的疫苗組成物並不過度刺激淋巴細胞，且提供了一種潛在的、安全的RSV候選疫苗。

上文中，已經使用例示性較佳具體實施例詳細揭示了本揭露。但應理解，本揭露的範疇並不限於所揭露的具體實施例。相反，本揭露意圖覆蓋多種修飾和類似的調整。因此，申請專利範圍的範疇應根據最廣泛的詮釋而定，從而涵蓋所有此類修飾和類似的調整。

<110> 國立臺灣大學

<120> 包含類B肝病毒顆粒作為佐劑的疫苗組成物

<130> 114067

<150> US 64/425,079

<151> 2016-11-22

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 148

<212> PRT

<213> B肝病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO

<400> 2

<210> 3

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO-3O

<400> 3

<210> 4

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組RSV F蛋白HRO24

<400> 4

<210> 5

<211> 444

<212> DNA

<213> B肝病毒

<400> 5

<210> 6

<211> 177

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 6

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 7

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 8

<210> 9

<211> 135

<212> DNA

<213> 呼吸道融合病毒

<400> 9

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-NcoI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRC-XhoI-R

<220>

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<222> (1)..(29)

<400> 11

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-A1-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(48)

<400> 12

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-A1-R

<220>

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<222> (1)..(48)

<400> 13

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<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A1-A2-F

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<222> (1)..(43)

<400> 14

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A1-A2-R

<220>

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<222> (1)..(43)

<400> 15

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A2-HRC-F

<220>

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<222> (1)..(48)

<400> 16

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> A2-HRC-R

<220>

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<222> (1)..(48)

<400> 17

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-N-F

<220>

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<222> (1)..(59)

<400> 18

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-C-R

<220>

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<222> (1)..(60)

<400> 19

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRN-BamHI-R

<220>

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<222> (1)..(31)

<400> 20

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRC-EcoRI-F

<220>

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<222> (1)..(32)

<400> 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-NheI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 22

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-BamHI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(34)

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-BamHI-F

<220>

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<222> (1)..(27)

<400> 24

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-EcoRI-R

<220>

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<222> (1)..(33)

<400> 25

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-EcoRI-F

<220>

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<222> (1)..(26)

<400> 26

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 位點O-HindIII-R

<220>

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<222> (1)..(28)

<400> 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBc148-NcoI-F

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<400> 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBc148-XhoI-R

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 29

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CpG

<400> 30

Claims

一種疫苗組成物，包含抗原和佐劑，其中，該佐劑是類B肝核心病毒顆粒(HBc VLP)，該顆粒具有與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少80%一致的胺基酸序列且具有與SEQ ID NO：1相同的功能。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其中，該佐劑是由SEQ ID NO：1的胺基酸序列所組成的HBc VLP。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其中，該抗原是源自感染性疾病的抗原。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其中，該抗原源自下列所組成的群組中的一種：人類免疫缺陷病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、1型單純性皰疹病毒、2型單純性皰疹病毒、人類巨細胞病毒、登革病毒、A肝病毒、B肝病毒、C肝病毒、E肝病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、嚴重急性呼吸道融合病毒(SARS病毒)、人乳頭狀瘤病毒、流感病毒、Hib、腦膜炎病毒、沙門氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋體、衣原體、博戴氏桿菌、腸毒素大腸桿菌、彎麴菌、鏈球菌、莫拉克斯氏菌、支原體、分枝桿菌、嗜血桿菌、瘧原蟲或弓漿蟲、Stanworth十肽。
如申請專利範圍第4項所述的疫苗組成物，其中，該抗原源自RSV。
如申請專利範圍第5項所述的疫苗組成物，其中，該抗原是由SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：4中之一表示的重組RSV F蛋白。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其中，該佐劑以0.1μg至1,000μg的佐劑有效量存在。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其中，該抗原和佐劑的重量比為10：1至1：10。
如申請專利範圍第8項所述的疫苗組成物，其中，該抗原和佐劑的重量比為5：1至1：5。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其適用於黏膜疫苗接種。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其適用於口服、鼻腔、直腸或陰道使用。
如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物，其誘導黏膜免疫反應和系統性免疫反應，該黏膜免疫反應是抗原特異性分泌性IgA抗體的產生，而該系統性免疫反應是抗原特異性IgG抗體的產生和抗原特異性細胞介導性免疫的產生。
一種對受試者接種疫苗的方法，包含給藥如申請專利範圍第1項所述的疫苗組成物至該受試者的黏膜表面。
如申請專利範圍第13項所述的方法，其中，該黏膜表面選自呼吸道黏膜、胃腸黏膜、陰道黏膜、鼻黏膜、直腸黏膜和口腔黏膜所組成的群組。
如申請專利範圍第13項所述的方法，其中，該受試者是人或動物。
一種多肽，由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成。
一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第16項所述的多肽。
如申請專利範圍第17項所述的核酸分子，其密碼子經優化以用於在原核細胞或真核細胞內表達。
如申請專利範圍第18項所述的核酸分子，其中，該原核細胞是大腸桿菌細胞，以及該真核細胞是酵母細胞或哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第19項所述的核酸分子，其中，該核酸分子包含與SEQ ID NO：5的核酸序列具有至少80%一致的核酸序列。