KR20190071935A

KR20190071935A - 봉독 추출물을 함유하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.

Info

Publication number: KR20190071935A
Application number: KR1020170172862A
Authority: KR
Inventors: 백승배; 정혜진; 임햇님
Original assignee: 백승배
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-06-25

Abstract

본 발명은 봉독 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서 봉독 펩타이드인 멜리틴을 85 중량% 이상 다량 함유함으로써 악성흑색종의 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

Description

봉독 추출물을 함유하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.{A Composition for Preventing and Treating Melanoma Comprising Bee Venom Extracts}

본 발명은 봉독 추출물을 함유하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 정제봉독의 추출을 통해 봉독 펩타이드인 멜리틴(melittin)을 다량 함유하여 악성흑색종의 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

야외활동 증가와 같은 최근 생활 패턴 및 환경오염에 따른 오존층의 파괴로 인한 자외선의 유입량 증가로 인해 각종 유해물질이나 자외선의 노출 기회가 빈번해지고, 인간의 평균수명이 늘어나면서 자외선 축적량이 많은 고령 인구수가 늘어남에 따라 피부암과 관련한 환자수가 전 세계적으로 지속해서 증가하고 있다. 피부암은 피부 악성 종양으로 대표적인 종류로는 기저세포암, 편평상피세포암, 흑색종이 있다. 그 중 흑색종은 피부, 눈알, 뇌척수 연막 등 멜라닌 세포가 존재하는 어느 부위에서나 발생할 수 있으며, 다른 피부암과 달리 성장 속도가 매우 빨라 발생 초기에 다른 장기로 전이율이 높고 재발하기 쉬워 악성도가 높은 종양으로 알려져 있다.

흑색종의 주요 전이 부위는 원발병소 이외의 피부이지만 그 밖에도 림프절, 뼈, 폐, 간, 비장 등 어떤 기관들도 침범될 수 있다. 특히 흑색종은 종래의 화학요법제 및 방사선에의 높은 저항성을 가지기 때문에 초기 이상 진행되거나 재발한 경우에는 현재까지 특별한 치료방법이 없는 난치성 질환이다.

방사선 치료의 경우 방사선을 조사한 부위의 피부가 건조해지거나 붉게 변하며 모발이 빠질 수 있고 피부염이 생길 수 있다는 부작용이 있고, 항암화학요법에서 사용되는 치료제들은 다카르바진 (DTIC), 카르무스틴 (BCUN), 로무스틴 (CCNU), 시스플라틴 (cisplatin) 등이 있으며 이들을 단일요법으로 사용하기도 하고 복합요법으로 사용하기도 하는데 이들은 대부분은 인공으로 합성된 물질로, 그 효과는 미약할 뿐만 아니라 오심, 구토, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 몸살 증상, 설사 등과 같은 부작용이 매우 심각하다.

따라서 최근에는 새로운 항암제의 후보 물질로서 동물이나 식물로부터 얻어낸 천연 화합물을 사용하여 부작용은 줄이고 항암 효과를 높이는 조성물들이 연구되고 있다.

예를 들어, 대한민국 공개특허공보 10-2017-0127964호에서는 옥수수수염으로부터 유래된 메이신을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통해 흑색종의 예방 또는 치료의 약리효과를 나타내고 있다.

또한, 대한민국 공개특허공보 10-2017-0068029호에서는 칡 추출물을 함유하는 조성물을 통해 B16F10 세포에 대한 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy) 유발 효능을 나타내어 악성흑색종의 치료 효과를 나타내는 조성물이 개시되어 있다.

한편, 최근 봉독(蜂毒)을 이용한 화장품이나 약학적 조성물이 개발되고 있는데, 이는 봉독의 항염증 작용, 피부 미백 작용, 주름 개선 작용 등의 알려진 효능을 이용한 것이다.

예를 들어, 대한민국 등록특허공보 10-1165510호에서는 봉독을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있는데, 상기 조성물을 적용함으로써 아토피 염증, 아토피 알러지와 관련된 약리효과를 확인하고 있으나, 악성흑색종과 같은 피부암 관련된 약리효과에 대해서는 확인하고 있지 않다.

봉독을 이용한 피부암과 관련한 효과에 대해서는 대한민국 공개특허공보 10-2015-0117469호에서 바나듐 함유 미네랄 조성물과 봉독의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 멜라노마사이트인 B16F10에 처리한 결과 멜라닌 생성 억제 활성과 인간 유래의 섬유아세포주(CCD-986SK 세포)를 이용해 콜라겐 생성 촉진 활성이 현저한 것을 확인하고 있다. 상기 멜라노마사이트는 악성흑색종과 관련한 세포주의 일종으로서, 이에 대한 효과가 있다면, 이로부터 악성흑색종에도 유효한 효과를 얻을 수 있을 것이라는 추측을 가능하게 해 준다.

그러나 현재까지 이러한 봉독의 성분들에 관한 연구를 통해 악성흑색종에 유효한 약리효과를 나타내는 조성물은 아직 개발되고 있지 못한 상태이다.

대한민국 공개특허공보 10-2017-0127964호 대한민국 공개특허공보 10-2017-0068029호 대한민국 등록특허공보 10-1165510호 대한민국 공개특허공보 10-2015-0117469호

본 발명은 상기와 같은 종래기술을 감안하여 안출된 것으로, 봉독의 성분들 중 봉독 펩타이드를 다량 함유하는 봉독 추출물을 함유하는 조성물을 통하여 악성흑색종의 예방 또는 치료의 효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물은 봉독 추출물로 이루어지며, 특히, 상기 봉독 추출물에서 봉독 펩타이드를 85 중량% 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 봉독 펩타이드는 멜리틴(melittin)인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 조성물은 포스포리파아제 A2를 2 내지 5 중량%을 포함할 수 있으며, 경구투여용에 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 봉독의 성분들 중 봉독 펩타이드를 다량 함유하는 봉독 추출물을 함유하는 조성물을 통하여 악성흑색종의 예방 또는 치료의 효과를 나타낸다.

도 1은 악성흑색종 세포의 증식능력에 대한 저해 효과와 관련하여 B16F10(a), A375SM(b), SK-MEL-28(c)에 대한 실험결과이다. 그래프에서 ●는 종래의 봉독 조성물에 대한 결과이며, ■는 본 발명의 조성물에 대한 결과이다.
도 2는 본 발명의 조성물에 대한 악성흑색종 세포의 억제활성을 시험한 결과로서 B16F10(a), A375SM(b), SK-MEL-28(c)에 대한 실험결과이다.
도 3은 본 발명의 조성물에 대한 악성흑색종 세포의 이동능력에 대한 저해 효과를 시험한 결과로서 B16F10(a), A375SM(b), SK-MEL-28(c)에 대한 실험결과이다.
도 4는 본 발명의 조성물에 대한 악성흑색종 세포의 침윤능력에 대한 저해 효과를 시험한 결과로서, A375SM(a), SK-MEL-28(b)에 대한 실험결과이다.
도 5는 본 발명의 조성물에 대한 악성흑색종 세포 B16F10의 멜라닌 형성에 대한 저해 효과를 시험한 결과이다.

이하 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따른 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물은 봉독 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

정제봉독의 경우, 일반적인 성분은 건조 중량으로 멜리틴(melittin) 40 내지 50 중량%, 포스포리파아제 A2(PLA₂) 10 내지 13 중량%, 아파민(apamin) 2 내지 3 중량%, MCD 펩타이드 2 내지 3 중량%, 히알루로니다아제(hyaluronidase) 1.5 내지 2 중량%, 아돌라핀(Adolapin) 0.5 내지 1 중량%, 프로테아제 억제인자(Protease inhibitor) 0.1 내지 0.8 중량%, 세카핀(Secapine) 0.5 내지 2 중량%, 프로카민(Procamine A, B) 1 내지 2 중량%, 히스타민(Histamine) 0.5 내지 2 중량%, 도파민(Dopamine) 0.2 내지 1 중량%으로 구성되어 있다. 이러한 정제봉독의 주성분은 멜리틴인데 항균, 항염증, 항바이러스의 효과가 있으며 정제과정에 따라 최대 65 중량%까지 함유되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 조성물은 상기 멜리틴을 주성분으로 하되 포스포리파아제 A2를 2 내지 5 중량% 함유하는 것을 특징으로 한다. 특히, 주성분인 멜리틴은 85 중량% 이상, 바람직하게는 85 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 90 내지 99 중량%의 범위의 고농도로 함유되는 것이 바람직하다. 이러한 멜리틴을 고농도로 함유함으로써 실험적으로 악성흑색종에 대한 현저한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

봉독과 봉독 내에 함유되는 멜리틴이 악성흑색종 세포에 대한 저해 효과를 나타내는 원인에 대해 아직 정확히 알려져 있지 않으나, 암세포의 증식 및 전이에서 중요한 신호전달경로로 알려진 MAPK signaling pathway와 PI3K/Akt/mTOR signaling pathway를 효과적으로 차단하기 때문에 이러한 약리효과가 나타나는 것으로 추측된다. 특히, 멜리틴의 함량이 일정 범위 이상에서 이러한 효과가 현저하게 발현되는 것으로 나타났다.

이러한 고농도의 멜리틴이 함유된 조성물은 봉독을 건조하여 얻어진 건조봉독을 용매 추출하여 추출물을 얻고 여기에 멜리틴을 추가적으로 부가하여 함량을 조절함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 추출 및 멜리틴의 부가 과정을 통해서 멜리틴의 함량이 85 중량% 이상이 되도록 하되, 포스포리파아제 A2 2 내지 5 중량% 및 아파민, MCD 펩타이드, 히알루로니다아제, 아돌라핀, 프로테아제 억제인자, 세카핀, 프로카민, 히스타민, 도파민 등의 기타 성분으로 이루어지게 한다.

정제봉독의 성분들 중 멜리틴은 분자량이 2.8kD인데 반하여 성분들 중 분자량이 가장 큰 포르소피라아제 A2는 19kD에 달하여 피부 흡수나 체내 흡수 효율을 떨어뜨리는 요인이 될 수 있다. 본 발명의 조성물은 정제봉독 중 분자량이 큰 포르소피라아제 A2의 최소화하고 있기 때문에 피부 외용이나 경구 투여에 모두 적용할 수 있다.

상기 용매추출에 사용될 수 있는 유기용매로는 (ⅰ) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (ⅱ) 상기 저급 알코올과 물과 의 혼합용매, (ⅲ) 아세톤, (ⅳ) 에틸 아세테이트, (ⅴ) 클로로포름, (ⅵ) 부틸아세테이트, (ⅶ) 1,3-부틸렌글리콜, (ⅷ) 헥산 및 (ⅸ) 디에틸에테르를 사용할 수 있다. 이 중 메탄올 또는 에탄올이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 추가하는 멜리틴은 봉독 정제물 중 멜리틴의 함량이 높은 것을 사용하며 멜리틴을 추가한 후 HPLC를 사용하여 함량을 분석하는 과정을 거쳐 멜리틴을 다시 추가하는 공정을 반복하게 된다.

또한, 본 발명의 조성물은 전술한 바와 같이 외용뿐만 아니라 경구투여용으로도 사용할 수 있는데, 경구투여용 조성물로 적용할 경우, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형으로 제형화하여 사용할 수 있다. 상기 조성물의 제형화를 위하여 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있는데, 구체적으로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 포함할 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 내지 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으므로 경구투여 외에도 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물에도 적용할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 포함한다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세 과립구, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제, 포말(foam) 또는 압축된 추진제를 함유한 에어로졸 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면 활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 아이 에센스, 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 콘실 스틱, 바디 로션, 바디 크림, 바디 오일, 바디 에센스, 바디 세정제, 염모제, 헤어 토닉, 모발 영양 화장수, 헤어 에센스, 헤어 세럼, 스칼프 트리트먼트, 헤어 트리트먼트, 헤어 컨디셔너, 헤어 샴푸, 헤어 로션, 치약, 구강 청정제, 정발제, 양모제, 로션, 연고, 젤, 크림, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 화장료 조성물은 마이크로 니들 패취를 통하여 피부 장벽을 투과하여 진피층에 영향을 미칠 수 있다. 상기 마이크로 니들은 국부적이면서 지속적인 유효성분 주입이 가능하고, 피부에 삽입 시 통증을 최소화할 수가 있다. 상기 화장료 조성물은 생체적합성이 우수한 생분해성 고분자와 혼합되어 마이크로 니들 패취에 탑재될 수 있으며, 혼합된 점성 용액이 건조되면 고형 상태가 되고, 체내 주입 시 체액에 의하여 다시 용해되는 원리를 이용할 수 있다. 상기 생분해성 고분자로는 히알루론산(Hyaluronic acid) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물의 악성흑색종에 대한 효능을 탐색하기 위하여 정제봉독(청진바이오텍)과 본 발명에 따른 조성물을 비교하여 실험을 하였다. 정제봉독은 멜리틴 45 내지 65 중량%, PLA₂ 11.5 내지 13 중량%, 아파민 2 내지 3 중량% 및 기타 성분으로 이루어졌다. 또한, 본 발명의 조성물은 멜리틴 90 내지 99 중량%, PLA₂ 2 내지 5 중량% 및 기타 성분으로 이루어졌다.

악성흑색종 세포 배양

악성흑색종 세포주인 B16F10, A375SM, SK-MEL-28 세포는 한국 세포주 은행으로부터 분양 받았으며, 10% FBS와 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 culture dish에 70~80% 정도 채워지면 계대 배양하였다.

악성흑색종 세포 증식 억제 활성 분석

정제봉독과 본 발명의 조성물의 악성흑색종 세포에 대한 항암 활성을 평가하기 위하여, MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylterazolium bromide) assay를 이용하여 악성흑색종 세포 증식 억제 활성을 측정하였다. 악성흑색종 세포 (2×10³cells/well)를 96-well plate의 각 well에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 각 세포에 정제봉독과 본 발명의 조성물을 가장 높은 농도인 100㎍/㎖부터 serial dilution하여 처리하였다. 이를 3일간 배양한 다음, MTT 용액 (2㎎/㎖) 50㎕을 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 조심스럽게 배지를 제거한 다음, 디메틸설폭사이드(DMSO) 100㎕를 가하여 MTT 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 microplate reader를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 농도별 암세포 성장 억제 정도를 분석하였으며, 그 결과는 도 1과 같다.

실험 결과를 살펴보면, 정제봉독과 본 발명의 조성물에 의해 3가지 악성흑색종 세포의 증식이 농도 의존적으로 현저히 억제되는 효과를 확인하였다.

또한, 각 암세포에 대한 증식억제 효과를 IC₅₀ 값으로 정량적으로 분석한 결과는 표 1과 같다.

악성흑색종 세포주	본 발명(㎍/㎖)	정제봉독(㎍/㎖)
B16F10	4.461	12.67
A375SM	4.427	5.688
SK-MEL-28	3.056	3.054

IC₅₀ 값의 정량적 분석 결과 본 발명의 조성물은 정제봉독에 비해 B16F10 및 A375SM에 있어서 세포 증식 억제에 대한 더 나은 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

악성흑색종 세포 군체(colony) 형성 억제 활성 측정

악성흑색종 세포의 생존성과 증식능력을 추가로 확인하기 위해, colony forming assay를 수행하였다. 악성흑색종 세포(500 cells/well)를 6-well plate의 각 well에 분주하여 24시간 배양 후 정제봉독과 본 발명의 조성물을 농도별로 처리하였고 10일 동안 인큐베이터에 배양하였다. 군체 형성 후 배지를 조심스럽게 제거한 후 crystal violet 염색시약 500㎕로 10분 동안 처리하였다. PBS로 세척한 후 colony 형성을 확인하고 수를 측정하였으며, 그 결과는 도 2에서와 같다.

도 2를 살펴보면, 3가지 악성흑색종 세포의 colony 형성 능력에 대한 정제봉독과 본 발명의 조성물의 억제 활성에서 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 정제봉독과 본 발명의 조성물 모두 colony 형성 능력을 효과적으로 억제하였다. 특히, 본 발명의 조성물에 있어서 정제봉독에 비해 현저히 높은 colony 형성 억제 활성을 나타내었다.

악성흑색종 세포 이동능력 억제 활성 측정

정제봉독과 본 발명의 조성물의 악성흑색종 세포 전이능력 억제 효능은 wound healing assay를 이용한 세포 이동능력을 측정하여 확인하였다. 24-well plate에 악성흑색종 세포가 90% 이상 confluent하도록 접종하였다(3×10⁵/well). 세포의 부착 후, pipette tip를 이용하여 plate 바닥을 긁어 wound를 만들었다. PBS로 헹궈 떨어져 나간 세포들을 제거하고, 봉독과 melittin을 처리한 배지를 넣었다. 24 시간 배양한 후 wound 부위를 현미경으로 촬영하여 암세포의 이동능력에 대한 저해효능을 관찰하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.

도 3의 결과를 살펴보면, 3가지 악성흑색종 세포의 이동(migration) 능력에 대한 억제 활성을 측정한 결과, 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 정제봉독과 본 발명의 조성물 모두 이동 능력을 농도의존적으로 현저하게 억제하였다. 특히, 본 발명의 조성물은 정제봉독보다 더욱 우수한 전이능력 억제 활성을 나타내었다.

악성흑색종 세포 침윤성 억제 활성 측정

정제봉독과 본 발명의 조성물의 악성흑색종 세포 전이능력 억제 효능은 또한 Matrigel invasion assay를 이용한 세포 침윤 능력을 측정하여 확인하였다. Invasion transwell의 membrane (8 μm pore) 바닥을 gelatin (1㎎/㎖) 10㎕으로 코팅하고 건조시킨 후 well의 안을 Matrigel (3㎎/㎖) 10㎕로 코팅하여 건조시켰다. 24-well에 S-10% DMEM 배지 600㎕와 봉독과 melittin을 농도별로 처리하고, 각 transwell 안에 악성흑색종 세포(1×10⁵ cells/well)를 분주하고 24시간 동안 배양하였다. Invasion된 세포를 고정시키기 위해 70% methanol을 사용하였다. 세포를 고정시킨 transwell membrane을 hematoxylin과 eosin을 사용하여 핵과 세포질을 염색시킨 후 ethanol을 사용하여 탈수시켰다. 각 well의 안쪽을 면봉으로 조심스럽게 닦아내고 현미경을 이용하여 세포의 침투 억제 활성 정도를 관찰하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.

도 4의 결과를 살펴보면, 2가지 악성흑색종 세포의 침윤(invasion) 능력에 대한 정제봉독과 본 발명의 조성물의 억제 활성을 측정한 결과, 약물을 처리하지 않은 대조군에 비해 정제봉독과 본 발명의 조성물 모두 침윤 능력을 농도의존적으로 억제하였다. 특히, 본 발명의 조성물은 정제봉독보다 더욱 좋은 침윤능력 억제 활성을 나타내었다.

멜라닌(melanin) 생성량 측정

악성흑색종 세포주 B16F10에서 정제봉독과 본 발명의 조성물의 멜라닌 형성 억제 효과를 보기 위하여 12-well plate에 B16F10 세포(1x10⁵ cells/well) 를 접종하고 24시간 후 멜라닌 형성을 촉진시키는 αMSH(Melanocyte Stimulating Hormone)와 함께 정제봉독과 본 발명의 조성물을 농도별로 처리하였다. 3일 동안 인큐베이터에서 배양한 후 세포를 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 회수하였다. 여기서 얻은 cell pellet에 1 N NaOH(10% DMSO) 200㎕를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도 값을 측정하였으며, 그 결과는 도 5와 같다.

도 5의 결과를 살펴보면, 악성흑색종 세포의 멜라닌 생성능력에 대한 정제봉독과 본 발명의 조성물의 억제 활성을 측정한 결과, αMSH 처리에 의해 증가된 멜라닌 생성을 정제봉독과 본 발명의 조성물 모두 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.

이상과 같이 본 발명의 조성물은 악성흑색종 세포주인 B16F10, A375SM, SK-MEL-28 세포주 모두에 대해 억제 활성을 나타내며, 특히, 악성흑색종 세포의 전이를 저해하는 효과를 나타내어 악성흑색종으로 인한 피부암의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타내는 것으로 파악되었다.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

Claims

봉독 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 봉독 추출물은 봉독 펩타이드를 85 중량% 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 봉독 펩타이드는 멜리틴(melittin)인 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 포스포리파아제 A2를 2 내지 5 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 조성물은 경구투여용인 것을 특징으로 하는 악성흑색종의 예방 또는 치료용 조성물.