KR20190061836A - 동백 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물 - Google Patents

동백 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물이 개시된다.
본 발명에 의한 조성물을 이용함으로써, 미세먼지에 의해 변화되는 유전자 발현량을 정상 수준으로 되돌려 피부 세포의 손상을 케어할 수 있다.

Description

동백 유래 유산균을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상 케어용 조성물{Composition comprising lactic acid bacteria derived from camellia japonica for caring damages of skin cells by microdust}
본 명세서에는 미세먼지에 의한 피부 세포 손상을 케어하는 조성물이 개시된다. 보다 상세하게, 정상 상태의 피부 세포와 비교하여 미세먼지에 의해 발현 정도가 변화되는 피부 세포 유전자인 바이오마커 등을 유의미하게 변화시켜서 피부 세포 손상을 케어하는, 동백 유래 유산균을 포함하는 조성물이 개시된다.
최근 환경적인 이슈로 미세먼지에 대한 관심이 높아지고 폴루션 시장이 확대되고 있다. 미세먼지는 일반적인 황사 등에 비하여 더 작은 크기의 입자를 갖기 때문에 인체에 더 잘 침투되며, 중금속, 질산염, 암모늄, 황산염 등의 유해물질을 더 많이 포함하고 있어서 인체에 유해하다. 미세먼지가 우리 몸 속으로 들어오면 인체의 면역을 담당하는 세포가 먼지를 제거하는 작용을 한다. 이 때의 부작용으로 염증을 수반하며, 이에 더하여 세계보건기구에서는 미세먼지를 암과 직접적인 관계가 있는 발암물질 1군으로 분류하고 있는 실정이다.
미세먼지는 호흡기뿐만 아니라 피부나 모낭으로도 침투되어서 피부트러블이나 탈모를 일으키는 것으로 예상되나, 어떻게 피부와 모발에 부정적 영향을 끼치는지에 대한 기전 및 타겟 연구는 미비한 수준에 그치고 있으며, 이에 따라 문제점을 해결하기 위한 안티폴루션 소재에 대한 연구 또한 진행되고 있지 않다.
비특허문헌 1은 과립층 장벽인 밀착연접(tight junction)의 주요 구성성분인 클라우딘 1(CLDN 1)의 발현량이 PM 2.5의 미세먼지 자극으로 인하여 감소하였음을 개시하고 있다.
유산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 락트산(lactic acid)을 생성하는 세균을 가리키며, 젖산균이라고도 한다. 유산균의 락트산 발효에 의해 생성되는 락트산은 병원균과 유해 세균의 생육을 저지할 수 있으며, 이러한 성질은 유제품, 김치류, 양조 식품 등의 식품 제조에 이용되고 있다. 또한 유산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상 발효를 방지하므로 정장제(整腸劑)로도 이용되는 중요한 세균이다.
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 주로 치즈와 같은 유제품에서 발견되는 균주로 현재까지는 정장작용 및 과민성 대장증후군에 대한 개선효과, 항균물질인 박테리오신(bacteriocin)의 생성 여부만이 알려져 있지만, 피부 장벽을 강화시키는 효능, 피부 세포의 손상을 복구하는 효능 등의 안티폴루션 소재로는 알려져 있지 않다.
이에 본 발명자는 미세먼지가 피부에 유해한 영향을 미치며, 이러한 영향에 의하여 피부 세포 유전자의 발현에도 영향을 미침으로써 피부 세포 손상 등과 같은 증상이 나타나며, 동백 유래 유산균이 유전자의 발현을 복구시키는 효과가 있다는 것을 확인 하였다.
따라서, 일 측면에서 본 발명은 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 포함하는 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상 케어용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 일 측면에서, 본 발명은 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자인 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현량을 정상 수준으로 조절하는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물을 이용함으로써, 미세먼지에 의해 변화되는 유전자 발현량을 정상 수준으로 되돌려 피부 세포의 손상을 케어할 수 있다.
도 1는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 케라틴 1(KRT 1) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 동백 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
도 2는 ERM-CZ120 미세먼지에 의해 자극된 피부 세포 내에서 클라우딘 4(CLDN 4) 유전자의 mRNA 발현량이 감소 하였고, 동백 유래 유산균 처리에 의해 정상 수준으로 되돌아감을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 미세먼지에 의한 피부손상 케어용 조성물은 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 "동백 유래 유산균"이란, 동백나무 잎, 동백꽃, 동백나무 줄기, 동백나무 뿌리, 또는 동백나무 인근 토양 등으로부터 분리된 유산균을 의미할 수 있다. 예컨대, 동백꽃으로부터 배양, 분리된 유산균을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "균주 파쇄물"이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "배양물"이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.
본 명세서에서, "추출물"이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 그 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출용매를 이용하여 추출한 산물을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 동백꽃 유산균은 상기와 같은 동백나무의 꽃에 함유된 여러 성분 중 유산균을 분리한 것으로서, 미세먼지에 의하여 손상된 피부에, 구체적으로 피부장벽의 밀착연접(tight junction)에 적용시 손상된 피부를 복구하는 효능이 매우 우수하다.
일 측면에서, 상기 동백 유래 유산균은 락토코커스 속(Lactococcus sp .) 유산균일 수 있다. 구체적으로, 상기 동백 유래 유산균은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 동백 유래 유산균은 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia) KCCM12006P 일 수 있다. 상기 동백 유래 유산균은 피부장벽의 밀착연접(tight junction)을 강화시킬 수 있으며, 특히 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia) KCCM12006P 은 미세먼지에 의하여 손상된 피부 장벽을 복구하는 효과를 가질 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물의 유효성분은 동백 유래 유산균 사멸체일 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 조성물에 있어서, 상기 조성물은 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을, 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 30중량%로 포함할 수 있다. 그 함량이 0.0001 내지 10중량%인 경우, 동백 유래 유산균에 의한 미세먼지에 의한 피부 손상 케어 효과가 우수하였다.
구체적으로, 0.0001 중량% 이상, 0.0002 중량% 이상, 0.0003 중량% 이상, 0.0004 중량% 이상, 0.0005 중량% 이상, 0.0006 중량% 이상, 0.0007 중량% 이상, 0.0008 중량% 이상, 0.0009 중량% 이상, 0.001 중량% 이상, 0.005 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 0.05 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상일 수 있고, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.1 중량% 이하, 0.05 중량% 이하, 0.09 중량% 이하, 0.04 중량% 이하, 0.01 중량% 이하, 0.008 중량% 이하, 0.006 중량% 이하, 0.003 중량% 이하, 0.001 중량% 이하, 0.0009 중량% 이하, 0.0008 중량% 이하, 0.0007 중량% 이하, 0.0006 중량% 이하, 0.0005 중량% 이하, 0.0004 중량% 이하, 0.0003 중량% 이하, 0.0002 중량% 이하, 0.0001 중량% 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 조성물의 유효 성분은 피부 장벽의 밀착연접(tight junction)에 작용하는 것일 수 있다.
밀착연접(tight junction)은 세포연접의 한 종류로 occluding, claudin, tricellulin, junctional adhesion molecule(JAM), zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있다. Occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. Occludin은 밀착연접에서 처음으로 발견된 막관통 단백질로 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. Occludin은 밀착연접의 구성 성분일 뿐만 아니라 밀착연접의 기능을 조절하는 것으로 알려졌다. Occludin과 함께 밀착연접 구성 단백질인 claudin도 4개의 막관통 영역을 가지고 있다. 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 기능을 하며, 세포와 세포 간의 물질투과를 조절하고 세포의 극성을 유지하는 역할도 담당한다. 최근, 연구결과를 통해 밀착연접이 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다고 보고되었다. 밀착연접(tight junction)은 세포간 결합양식의 일종이다. 주로 상피세포와 내피세포에서 나타나는 세포간 연접으로서, 끈모양 구조를 갖는 복잡한 네트워크(network)를 형성한다. 밀착연접은 이러한 구조로부터 크게 두가지 기능을 갖는다. 첫째는 격벽(barrier)기능으로, 상피세포나 내피세포를 구성하는 세포 사이로 물질의 누출을 방지한다. 주로 혈관이나 소화관에서 중요하게 다루어진다. 둘째는 울타리기능으로, 세포막 지질에서 끈모양 울타리를 둘러 세포막을 구획하는 기능이다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물의 유효 성분은 피부 장벽의 밀착연접에 작용하여 피부 세포의 격벽 기능 및 울타리 기능을 강화시켜 미세먼지 자극에 의하여 손상된 피부를 케어할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 조성물의 미세먼지에 의한 피부 손상 케어 용도를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "미세먼지"라 함은, 우리 눈에 보이지 않는 아주 작은 물질로 대기 중에 오랫동안 떠다니거나 흩날리는 입자상의 물질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 미세먼지의 입자 크기는 입경 10μm 이하(PM 10), 구체적으로 입경 2.5μm 이하(PM 2.5)일 수 있다. 특히 입경이 2.5μm(PM 2.5) 이하인 입자상의 물질은 "초미세먼지"라 하는데, 본 명세서에서 "미세먼지"는 "초미세먼지"도 포함하는 것으로 의도된다.
일 측면에서, 본 발명에서 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 등의 중금속 성분은 미세먼지에 함께 포함되어 피부 세포를 공격해 피부 알러지, 색소 침착, 염증 등을 일으켜 피부노화를 유발시킬 수 있다. 일 실시예에서, 상기 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어"케어"라 함은, 자극으로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하고, 상기 자극에 의하여 특정 유전자의 발현량이 변화하는 것을 억제, 방지, 복구(복원)시키는 것을 의미한다. 여기서, "복구"는 자극이 없는 경우의 유전자 발현량을 기준으로 할 때, 발현량을 상기 기준에 가깝게 변화시키는 것 외에도 상기 기준 이상으로 발현량을 향상시키는 것을 또한 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 미세먼지에 의해 손상된 피부 세포에서 특정 유전자의 발현량을 정상 수준으로 조절함으로써, 미세먼지에 의한 피부 세포의 손상을 억제하는 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 미세먼지에 의해 발현량이 영향을 받는 피부 세포 내 유전자로는 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN)은 미세먼지에 의해 발현량이 감소하는 유전자이므로, 이들 유전자의 발현량을 증가시켜 정상 수준으로 조절함으로써 피부 세포의 손상을 억제할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명에 따른 조성물은 피부 장벽 강화 효능 또는 피부 장벽 복구 효능을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는, 미세먼지에 의해 발현량이 변화하는 유전자가 아래 [표 1]에 제시되어 있다. [표 1]은 미세먼지에 의해 발현량이 감소되는 유전자를 나타내는 것이며, 이들 표에서 Gene Symbol은 공식 유전자 심볼을 의미하며, Gene title은 각 유전자의 이름을 의미한다. 이러한 내용은 비특허문헌 1에 기재를 통하여 확인할 수 있다.
감소 유전자
Gene
Symbol		 Gene title
KRT 1 Keratin 1
CLDN 1 Claudin 1
CLDN 4 Claudin 4
OCLN Occludin
상기 유전자 또는 단백질의 발현량 분석은 마이크로어레이, PCR, NGS(Nest Generation Sequencing; 차세대 염기서열분석), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 등 당업계에 공지된 다양한 분석 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
미세먼지에 의해 피부 세포의 손상이 일어나며, 이 때 염증이 유도되어 다시 피부 세포의 손상이 추가로 일어나게 된다. 이렇게 피부 세포 손상의 악순환을 동백 유래 유산균이 케어함으로써 피부 상태를 개선시킬 수 있게 된다.
본 발명의 일 관점인, 상기 조성물은, 화장료 조성물일 수 있고, 약학적 조성물일 수 있으며, 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은, 예컨대, 각종 크림, 로션 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.
일 측면에서, 본 발명의 상기 동백 유래 유산균을 함유하는 조성물이 첨가된 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
즉, 일 측면에서 본 발명의 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 염모제, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.
각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 동백 유래 유산균 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 일 측면에서 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.
일 측면에서, 본 발명의 동백 유래 유산균을 포함하는 약학적 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
그 제형으로는, 상기 동백 유래 유산균을 포함하는 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 정제, 캡슐, 산제 또는 시럽 등의 경구제, 또는 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제 등의 외용제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.
일반적으로 상기 약학적 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 3000mg/kg/일, 예를 들어 10 mg/kg/일 내지 500mg/kg/일 일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 건강 기능식품 조성물에서, 건강식품은, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분(기능성원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강식품은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 법률에 따라 어떤 형태로든지 제조, 가공될 수 있다.
구체적으로, 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드 폴리사카라이드, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
일반적으로 상기 건강 기능식품 조성물에 의해 투여되는 유효성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 일반적으로 유효성분의 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 1000mg/kg/일, 예를 들어 0.02 mg/kg/일 내지 6mg/kg/일 일 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[제조예 1] 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia)
1. 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia)의 배양 및 분리
제주도 지역에서 채집한 동백꽃을 멸균 증류수에 1회 세척하여 이물질을 제거하고 중량 대비 10배의 phosphate buffered saline(PBS)에 침지 시킨 후 250 rpm의 속도로 1시간 동안 반응 시켰다. 반응시킨 용액을 BCP 아가(plate count agar with bromcresol purple)에 적정량 분주하여 배양하고 주변이 노란색으로 변하는 콜로니(colony)를 취하여 이를 MRS agar에서 단독배양을 하였다.
위와 같은 방법으로 락토코커스 락티스R-Camellia(Lactococcus lactis subsp. Lactis R-Camellia)를 동백꽃으로부터 분리하였다. 상기 락토코커스 락티스R-Camellia(Lactococcus lactis subsp . Lactis R-Camellia)은 2017년 4월 4일 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 미생물 기탁번호 KCCM12006P으로 기탁하였다.
2. 락토코커스 락티스R-Camellia(Lactococcus lactis subsp . Lactis R-Camellia)의 동정
(1) 균주의 배양
'1. 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia)의 배양 및 분리'에서 분리한 락토코커스 락티스R-Camellia를 MRS 아가 플레이트에 도말(streaking)하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 얻은 단일 콜로니(single colony)를 MRS 브로쓰(broth) 10mL에 접종하고 다시 37℃에서 밤새 배양하여 락토코커스 락티스R-Camellia 배양액을 제조하였다.
(2) 락토코커스 락티스R-Camellia 의 당 발효 패턴 분석
상기 (1)과 같이 제조한 락토코커스 락티스R-Camellia 균주 배양액을 MRS 브로쓰 10mL에 0.5% 접종하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양액을 8,000 rpm에서 5분간 원심 분리하고 상등액을 제거하여 균체만 모은 후, 0.85% 완충 식염수(saline buffer)를 2mL 첨가하여 현탁 하였다. 이후 API 50CHL 키트(Biomerieux)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 진행하였다. 그 구체적인 내용은 아래와 같다.
먼저 API 현탁 미디움(medium) 5mL에 균주의 현탁액을 조금씩 넣으면서 맥파랜드 기준 2(McFarland Standard 2)(Biomerieux) 정도의 탁도가 되는데 필요한 현탁액 량을 측정하였다. 측정된 현탁액 량의 2배를 API 50CHL 미디움 10mL에 넣은 후 흔들어 섞어주었다. 각기 다른 기질이 들어있는 쿠풀(cupule)에 상기 혼합물을 넣은 후, 미네랄 오일을 한방울씩 떨어뜨리고 37℃에서 2일간 배양한 다음, 당 발효 패턴을 분석하였다.
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) KCTC3769 균주를 표준 균주로 하여 비교한 락토코커스 락티스R-Camellia 의 당 발효 패턴 결과 및 그 결과를 이용한 락토코커스 락티스R-Camellia 의 동정 결과는 아래 표와 같다.
기질 KCTC3769 R-camellia 기질 KCTC3769 R-camellia
48h 48h 48h 48h
대조군 - - 에세쿨린 + +
글리세롤 - - 살리신 + +
에리스리톨 - - 셀로비오스 + +
D-아라비노스 - - 말토스 + +
L-아라비노스 - + 락토스 + +
리보스 + + 멜리비오스 - -
D-자일로스 + + D-사카로스 (수크로스) - +
L-자일로스 - - 트레할로스 + +
아도니톨 - - 이눌린 - -
β-메틸-D-자일로스 - - 멜레치토스 - -
갈락토스 + + 라피노스 - -
글루코스 + + 아미돈(전분) - -
프럭토스 + + 글리코겐 - -
만노스 + + 자일리톨 - -
소르보스 - - 겐티오비오스 - +
람노스 - - D-튜라노스 - -
덜시톨 - - D-릭소스 - -
이노시톨 - - D-타가토스 - -
만니톨 - + D-퓨코스 - -
소르비톨 - - L-퓨코스 - -
α-메틸-D-만노사이드 - - D-아라비톨 - -
α-메틸-D-글루코사이드 - - L-아라비톨 - -
N-아세틸-글루코사민 + + 글루콘산 - -
아미그달린 + + 2-케토글루코네이트 - -
알부틴 + + 5-케토글루코네이트 - -
+: 기질 분해, -: 해당 기질을 분해하지 못 함, ? : 판정 불가
균주 종속명 % 인덱스 T 인덱스
KCTC3769 락토코커스 락티스 96.0 0.92
R-camellia 락토코커스 락티스 91.3 0.95
락토바실러스 브레비스 8.4 0.87
상기에서 볼 수 있듯이, 락토코커스 락티스R-Camellia는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 대한 일치도(% index)가 90% 이상으로 나타나 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 속하는 것을 알 수 있다. 또한 락토코커스 락티스R-Camellia는 표준 균주(KCTC3769)와 L-아라비노스, 만니톨, D-사카로스(수크로스), 겐티오비오스 이용 성질이 달라 서로 다른 균주임을 확인할 수 있다.
3. 락토코커스 락티스R-Camellia(Lactococcus lactis subsp . Lactis R-Camellia) 사멸체 제조
분리 동정한 락토코커스 락티스R-Camellia(Lactococcus lactis subsp . Lactis R-Camellia)를 배지(MRS Broth)에서 37℃ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 여기서, 유산균은 탈지유(Skim milk)에 10중량%로 크라이오튜브(Cryotube)에서 보관한 것을 접종한 것이다. 액체 배지 내 균 농도가 5 X 108 ~ 1 X 109 CFU/mL가 되었을 때, 4℃에서, 4000 rpm 원심 분리를 통하여 영양세포를 수확하고 PBS(phosphate buffered saline)으로 균체를 세척하였다. 그런 뒤 세척한 균체를 PBS에 5 X 108 ~ 1 X 109 CFU/mL의 농도로 재분산(resuspension)시키고 100℃에서 10분간 가열 및 가압하여 락토코커스 락티스 사멸체를 제조하였다.
[실험예 1] 실시간 qPCR 정량을 통한 유전자 발현량 측정 실험
1. 각질형성세포주의 배양
각질형성세포주(Human normal epidermal keratinocytes)는 론자 社(Lonza, Inc. 미국 메릴랜드주 워커스빌 소재)에서 구입하여 계대배양한 후 CO2 배양기(CO2 incubator)에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 500ml의 KBM-2(KBMTM-2, CC-3103) 배지에 BPE(Bovine pituitary extract), 인간표피 성장인자(human epidermal growth factor, hEGF), 인슐린(Insulin), 하이드로코티손(Hydrocortisone), 젠타마이신 설페이트(Gentamycin Suflate), 에피네프린(Epinephrine), 트랜스페린(Transferrin)을 포함한 배양액을 사용하였다.
배양시 최대 90% 정도의 컨플루언시(confluency)를 유지하였으며, 그 이후에는 계대배양(subcultivation)하였다.
2. 각질형성세포주에 미세먼지 및 락토코커스 락티스 처리
미세먼지는 시그마-알드리치 社(Sigma-Aldrich)에서 시판하는 ERM-CZ120 미세먼지를 사용하였으며, PM 10 수준의 미세먼지와 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel)을 포함하고 있다.
6-웰 플레이트를 사용하였고 '1. 각질형성세포주의 배양'에서의 세포배양조건으로 3 × 105 세포수/웰(cells/well)인 조건으로 배양한 세포주에 각각 대조군으로 미처리군(대조군 1), 미세먼지를 50 ppm 처리한 군(대조군 2), 미세먼지 50 ppm 및 제조예 1의 락토코커스 락티스 1 ㎍/ml 처리한 군(실시예 1), 및 미세먼지 50 ppm 및 락토코커스 락티스 표준 균주(type strain) 1㎍/ml 처리한 군(비교예 1)으로 총 4개의 군을 물질 처리 하였다.
여기서 락토코커스 락티스 표준 균주(type strain)는 생물자원센터에서 입수한 것으로 기탁번호 KCTC3769의 기탁 균주를 사용하였다.
실험군 미세먼지
( ERM -CZ120 Fine Dust) 		R-Camellia 표준 균주
(type strain)
대조군 1
(미세먼지 미처리)		 - - -
대조군 2
(미세먼지 처리)		 50 ppm - -
실시예 1
(미세먼지+ 제조예 1의 APsulloc 331266 처리)		 50 ppm 1 ㎍/ml -
비교예 1
(미세먼지+type strain 처리)		 50 ppm - 1 ㎍/ml
3. 실시간 qPCR 정량
3-1. RNA 추출 과정
'2. 각질형성세포주에 미세먼지 및 락토코커스 락티스 처리'에서 얻은 대조군 1, 대조군 2, 실시예 1, 및 비교예 1에서 배양액을 제거하고, 2ml의 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 세포 내의 RNA를 분리하였다.
3-2. cDNA 합성 과정
분리된 RNA를 키아젠사의 RNA 키트(QIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA)로 한번 더 정제한 후, 애질런트 社의 바이오어낼라이저 2100 모델 기기(Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 RNA의 질(quality)을 확인하였다. 인비트로젠사의 역전사키트(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다.
3-3. qPCR 수행
이를 프라이머를 이용한 실시간 역전사 중합 효소 연쇄반응(Q-RT-PCR: real time-reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 정량적으로 분석하였다. 유전자의 발현 패턴 변화를 어플라이드바이오시스템사의 택맨 유전자 발현 시스템(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 세포의 유전자 변화를 실시간 PCR로 평가하였으며, 그 결과를 [도 1] 내지 [도 2]에 나타내었다. 이용한 Q-RT-PCR과 실시간 PCR은 모두 라이프테크놀로지에서 배포하는 표준 프로토콜에 따라서 실행하였으며, 구체적으로 95℃에서 20초 동안 처리한 후, 95℃에서 3초 및 60℃에서 30초를 처리하는 공정을 40주기 진행하였다.
4-1. 락토코커스 락티스의 피부 세포 손상 복구 효능 평가
[도 1] 내지 [도 2]에 나타낸 바와 같이, 본원 발명의 동백 유래 유산균은 단독 처리시 미세먼지에 의하여 손상된 피부 장벽 복구 효과를 가짐을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1는 대조군 2에 비하여 케라틴 1(Keratin 1) 및 클라우딘 4(Claudin 4) 의 mRNA 발현량이 향상된 것을 확인 하였다.
실험에서, 미세먼지 처리에 의하여 케라틴 1의 mRNA 발현량은 0.41로, 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 0.50으로 모두 감소하였으며, 제조예 1의 락토바실러스 플란타룸 처리에 의하여, 감소된 케라틴 1의 mRNA 발현량은 0.94로, 감소된 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 1.03으로 복구된 것을 확인할 수 있었다.
반면, 표준 균주의 경우는 케라틴 1의 mRNA 발현량은 0.51, 클라우딘 4의 mRNA 발현량은 0.60으로 소폭 향상된 것에 그쳐, 표준 균주의 처리에 의하여는 mRNA 변화량이 유의미한 값을 갖지 않았다. 따라서 표준 균주는 상기 마커들의 감소된 mRNA 발현량을 복구시키는 효과는 없는 것으로 확인되었다.
이하, 본 발명에 따른 조성물의 제형예를 설명하나, 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강 기능식품 조성물은 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 정제
본 발명 실시예에 따른 락토코커스 락티스 유산균 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
배합성분 함량(mg)
락토코커스 락티스 유산균 100
락토오스 400
옥수수 전분 400
스테아린산 마그네슘 2
[제형예 2] 캡슐제
본 발명 실시예에 따른 락토코커스 락티스 유산균 100mg, 락토오스 400mg, 옥수수 전분 400mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
배합성분 함량(mg)
락토코커스 락티스 유산균 100
락토오스 400
옥수수 전분 400
스테아린산 마그네슘 2
[제형예 3] 과립제
본 발명 실시예에 따른 락토코커스 락티스 유산균 50mg, 무수결정 포도당 250mg 및 전분 550mg을 혼합하고, 유동층 과립기를 사용하여 과립으로 성형한 후 포에 충진하였다.
배합성분 함량(mg)
락토코커스 락티스 유산균 50
무수결정 포도당 250
전분 550
[제형예 4] 비누
배합성분 함량(%)
락토코커스 락티스 유산균 5.00
유지 적량
수산화나트륨 적량
염화나트륨 적량
향료 적량
정제수 잔량
[제형예 5] 로션
배합성분 함량(%)
락토코커스 락티스 유산균 5.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액) 1.00
시트르산나트륨 0.10
시트르산 0.05
감초 엑기스 0.20
1,3-부틸렌글리콜 3.00
정제수 잔량
[제형예 6] 크림
배합성분 함량(%)
락토코커스 락티스 유산균 3.00
폴리에틸렌글리콜모노스테알레이트 2.00
자기유화형모노스테아르산글리세린 5.00
세틸알코올 4.00
스쿠알렌 6.00
트리2-에틸헥산산글리세릴 6.00
스핑고당지질 1.00
1.3-부틸렌글리콜 7.00
정제수 잔량
[제형예 7] 연고
배합성분 함량(%)
락토코커스 락티스 유산균 5.00
폴리비닐알코올 13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 1.00
라우로일히드록시프롤린 1.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 3.00
에탄올 5.00
정제수 잔량
[제형예 8] 미용액 제조
배합성분 함량(%)
락토코커스 락티스 유산균 3.00
히드록시에틸렌셀룰로오스(2 % 수용액) 12.00
크산탄검(2 % 수용액) 2.00
1,3-부틸렌글리콜 6.00
진한 글리세린 4.00
히알루론산나트륨 (1 % 수용액) 2.00
정제수 잔량
[제형예 9] 건강식품
배합 성분 함량
락토코커스 락티스 유산균 2mg
비타민 A 아세테이트 70μg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2μg
비타민 C 10mg
비오틴 10μg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50μg
판토텐산 칼슘 0.5mg
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
[제형예 10] 건강음료
배합성분 함량
락토코커스 락티스 유산균 50mg
구연산 1000mg
올리고당 100 g
타우린 1g
정제수 잔량
한국미생물보존센터(국외) KCCM12006P 20170404

Claims (15)

  1. 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는, 미세먼지에 의한 피부 손상 케어용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 동백 유래 유산균은 동백꽃 유래 유산균인, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 동백 유래 유산균은 락토코커스 속(Lactococcus sp .) 유산균인, 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 락토바실러스 속 유산균은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 동백 유래 유산균은 락토코커스 락티스 R-Camellia (Lactococcus lactis subsp . lactis R-Camellia) KCCM12006P 인, 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유효성분은 동백 유래 유산균의 사멸체인, 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 동백 유래 유산균, 그 파쇄물, 그 배양물, 또는 그 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10중량%로 포함된, 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물의 유효성분은 피부 장벽의 밀착연접(tight junction)에 작용하는 것인, 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 케라틴 1(KRT 1), 클라우딘 1(CLDN 1), 클라우딘 4(CLDN 4), 및 오클루딘(OCLN) 중 하나 이상의 발현을 복구시키는, 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세먼지는 비소(arsenic), 카드뮴(cardmium), 납(lead), 및 니켈(nikel) 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세먼지는 입자크기가 PM 10 이하인, 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물의 유효성분은 10 내지 500 mg/kg/일의 투여량으로 투여되는, 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물인, 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적 조성물인, 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 건강 기능식품 조성물인, 조성물.
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