KR20190036546A - 파킨 효소 기능의 소분자 활성화제 - Google Patents

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파비엔느 씨 피셀
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Abstract

본 개시내용은 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 화합물 및 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

Description

파킨 효소 기능의 소분자 활성화제
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 7월 28일에 제출된 미국 가특허 출원 제62/367,870호에 대한 우선권을 청구하고, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 화합물 및 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
폭넓은 보호용 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성 및 미토콘드리아 품질 제어(mitochondrial quality control)는 특정한 질환 또는 질병, 예를 들면, 파킨슨병을 겪고 있는 환자에서 종종 손실되거나 감소되고, 노화 동안, 그리고 많은 다른 노화 관련 인간 질병에서 약화된다. 그 결과, 기능이상 미토콘드리아가 축적되고, 결국 세포 사멸을 야기한다.
미토콘드리아 키나제 PINK1 및 사이토졸 E3 유비퀴틴 리가아제 파킨(Parkin)은 함께 자가소화작용(미토파지(mitophagy))에 의해 손상된 미토콘드리아의 선택적 분해를 매개한다(Narendra et al.(2008) J. Cell Biol. 183:795-803; Geisler et al.(2010) Nat. Cell Biol. 12: 119-131). 이러한 중요한 미토콘드리아 품질 제어 경로는 해로운 손상된 미토콘드리아의 축적으로부터 세포를 보호한다. 모든 세포가 미토콘드리아 손상에 의해 영향을 받고, 신경 및 근육 세포와 같이 에너지를 요구하는 세포는 미토콘드리아 품질 제어의 실패에 특히 취약하다. PINK1 및 파킨의 기능소실돌연변이는 미토콘드리아 품질 제어를 파기하고, 조기 발병 열성 파킨슨병(PD)과 연관된다(Kitada et al.(1998) Nature 392:605-608; Valente et al.(2004) Science 304:1158-1160). 추가로, 파킨의 불활성화는 또한 산발성, 후기 발병 PD에서도 보고되었다(Dawson et al.(2014) Neurodegener. Dis. 13:69-71; LaVoie et al.(2005) Nat. Med. 11:1214-1221; LaVoie et al.(2007) J. Neurochem. 103:2354-2368; Wong et al.(2007) J. Biol. Chem. 282:12310-12318). 그러나, PINK1 및 파킨은 모든 다세포 진핵생물 중에서 보존되고, 모든 조직/세포에 걸쳐 널리 발현된다. 모든 세포에서 미토콘드리아의 존재 및 이러한 스트레스 유도 품질 제어 경로에 대한 필요를 고려할 때, 미토파지를 통한 선택적 제거는 PD를 넘어서는 광범위한 영향을 갖는 근본적인 세포보호 메커니즘인 것으로 보인다. 따라서 파킨의 활성화는 광범위한 인간 질환 및 노화에 대한 잠재적으로 유리하고 널리 적용 가능한 신규한 치료법으로 인식되어 왔다.
개시내용의 상기 및 다른 측면 및 실시양태는 하기 상세한 설명 및 청구항을 참조하여 더 완전하게 이해될 수 있다.
본 출원은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서,
A는 CH 또는 O이고;
B는 CH 또는 N이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
W는 C 또는 N이고;
X는 C 또는 N이고;
Y는 C 또는 N이고;
Z는 C 또는 N이고;
R1은 H, C1-4 알킬, 페닐, 또는 hetAr1이고;
R2는 H이고;
R3은 H이거나;
R2 및 R3은, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R7은 H이거나;
임의로, n이 0인 경우, R1 및 R7은, 이들이 결합된 원자와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4는 H, C1-4 알킬, 할로겐, CF3, 또는 페닐이고;
R5는 H, C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 할로겐으로 임의로 치환된 페닐, (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), S(C1-4 알킬), S(C4-6 사이클로알킬), (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1), hetAr1, 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이고;
R6은 H 또는 C1-4 알킬이고;
hetAr1은 C1-4 알킬로 임의로 치환된 1-3개의 고리 질소 원자를 갖는 6원 헤테로아릴 고리이고;
hetCyc1은 질소인 하나 이상의 고리 헤테로원자를 갖는 6-10원 이환식 고리이고, 하나 이상의 고리는 방향족이고;
m은 0 또는 1이고;
n은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
일부 실시양태에서, A는 CH이다.
일부 실시양태에서, B는 CH이다. 일부 실시양태에서, B는 N이다.
일부 실시양태에서, A는 O이고, B는 N이다.
일부 실시양태에서, D는 C이다. 일부 실시양태에서, D는 N이다.
일부 실시양태에서, E는 CH이다. 일부 실시양태에서, E는 N이다.
일부 실시양태에서, W는 N이다. 일부 실시양태에서, W는 C이다.
일부 실시양태에서, X는 C이다.
일부 실시양태에서, Y는 C이다. 일부 실시양태에서, Y는 N이다.
일부 실시양태에서, Z는 N이다. 일부 실시양태에서, Z는 C이다.
일부 실시양태에서, R1은 H이다. 일부 실시양태에서, R1은 C1-4 알킬 또는 hetAr1이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸, 이소프로필, 또는 피리딘이다.
일부 실시양태에서, R4는 H이다. 일부 실시양태에서, R4는 Cl, CF3, 메틸 또는 페닐이다.
일부 실시양태에서, R5는 H 또는 할로겐으로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R5는 (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이다. 일부 실시양태에서, C4-6 사이클로알킬은 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 일부 실시양태에서, R5는 (C1-3 알킬)O(사이클로펜틸) 또는 O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로헥실)이다. 일부 실시양태에서, R5는 C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 또는 (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1)이다. 일부 실시양태에서, hetCyc1은 하나 이상의 질소 원자를 갖는 9원 이환식 고리이다. 일부 실시양태에서, hetCyc1은 이소인돌린이다. 일부 실시양태에서, R5는 S(C1-4 알킬) 또는 S(C4-6 사이클로알킬)이다. 일부 실시양태에서, C4-6 사이클로알킬은 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 일부 실시양태에서, R5는 F로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R5는 hetAr1이다. 일부 실시양태에서, hetAr1은 C1-4 알킬로 임의로 치환된 피리딘 또는 피리미딘이다.
일부 실시양태에서, R6은 H이다.
일부 실시양태에서, m은 1이다.
일부 실시양태에서, n은 0이다.
일부 실시양태에서, p는 0이다. 일부 실시양태에서, p는 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
및
Figure pct00007
본 출원은 또한 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00008
상기 식에서,
A는 CH, N, 또는 S이고;
B는 CH, N, O, 또는 S이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
W는 CH, CH2, N, 또는 NRa이고;
X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
Y는 CH, CH2 또는 O이고;
Z는 N 또는 CR2'이고;
R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
R2는 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌이고;
R2'는 H 또는 C1-6 알킬이거나;
Z가 CR2', R2 및 R2'인 경우, C와 함께, C1-6 헤테로사이클릭 고리를 함께 형성할 수 있고;
R3은 H, 할로겐, C1-3 알킬, C3-6 사이클로알킬, 또는 C1-3 알콕시이고;
R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Rb는 C1-3 알킬이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0, 1 또는 2이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있고;
단, n이 2이고, R1이 메틸이고, D가 C이고, R3이 H이고, A, B, 및 E가 모두 CH인 경우, W, X, 및 Y 중 하나 이상은 CH2가 아니다.
일부 실시양태에서, A는 CH이다. 일부 실시양태에서, A는 N이다. 일부 실시양태에서, A는 S이다.
일부 실시양태에서, B는 CH이다. 일부 실시양태에서, B는 N, O, 또는 S이다.
일부 실시양태에서, D는 C이다.
일부 실시양태에서, E는 CH이다. 일부 실시양태에서, E는 N이다.
일부 실시양태에서, L은 C1-3 알킬렌이다. 일부 실시양태에서, L은 메틸렌이다.
일부 실시양태에서, W는 CH2이다. 일부 실시양태에서, W는 N이다.
일부 실시양태에서, X는 CH2이다. 일부 실시양태에서, X는 CH이다. 일부 실시양태에서, X는 NRb이다. 일부 실시양태에서, Rb는 메틸이다.
일부 실시양태에서, Y는 CH2이다. 일부 실시양태에서, Y는 CH이다.
일부 실시양태에서, Z는 N이다.
일부 실시양태에서, R2는 존재하지 않는다.
일부 실시양태에서, Z는 CR2'이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R2'는, C와 함께, 1개의 질소 원자를 갖는 5원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
일부 실시양태에서, R1은 H이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸이다.
일부 실시양태에서, Ra는 H 또는 메틸이다.
일부 실시양태에서, Rb는 메틸이다.
일부 실시양태에서, R3은 H, 할로겐, 또는 C3-6 사이클로알킬이다. 일부 실시양태에서, R3은 염소이다. 일부 실시양태에서, R3은 사이클로프로필이다.
일부 실시양태에서, R4 및 R4'는 각각 H이다. 일부 실시양태에서, R4 및 R4'는 각각 메틸이다.
일부 실시양태에서, n은 2이다. 일부 실시양태에서, n은 1이다.
일부 실시양태에서, m은 1 또는 2이다.
일부 실시양태에서, p는 0이다. 일부 실시양태에서, p는 1이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00009
Figure pct00010
및
Figure pct00011
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 화학식 IIa의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00012
상기 식에서,
A는 CH 또는 N이고;
B는 N, O, 또는 S이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
W는 CH2, NRa이고;
X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
Y는 CH, CH2 또는 O이고;
L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
R3은 C1-3 알킬 또는 C1-3 알콕시이고;
R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Rb는 C1-3 알킬이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0, 1 또는 2이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 화학식 IIb의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00013
상기 식에서,
R1은 C1-3 알킬이고;
R5는 (C1-3 알킬)페닐이다.
본 출원은 추가로 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 출원은 추가로 대상체에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 방법으로서, 대상체에게 본원에 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가아제는 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 효소 활성은 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화되거나 강화된다.
일부 실시양태에서, 화합물은 미토콘드리아 품질 제어를 자극한다.
일부 실시양태에서, 화합물은 리가아제의 자가억제(auto-inhibition)를 방해한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 질환, 노화, 또는 노화 관련 질병으로 인하여 약화된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병, 파킨슨증(parkinsonism), 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 조로증(progeroid disorder), 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 출원은 추가로 대상체에서 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가아제는 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 조로증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 출원은 추가로 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
(a) 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가아제는 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 출원은 추가로 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법으로서,
(a) 대상체에서 파킨슨병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 출원은 추가로 대상체에서 노화 관련 질병을 치료하는 방법으로서,
(a) 대상체에서 노화 관련 질병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 출원은 추가로 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
(a) 대상체에서 암을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 암은 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 출원은 추가로 세포에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 방법으로서, 세포를 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가아제는 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 효소 활성은 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화된다.
일부 실시양태에서, 화합물은 미토콘드리아 품질 제어를 자극한다.
일부 실시양태에서, 화합물은 리가아제의 자가억제를 방해한다.
일부 실시양태에서, 세포는 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 접촉은 시험관내이다.
도 1A-1B는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)-파킨 전좌의 고함량 영상(HCI)과 함께 일차 스크리닝 검정의 결과를 보여준다. 도 1A는 GFP-파킨을 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 사용하는 HCI 검정의 결과를 보여준다. GFP-파킨은 스트레스 받지 않은 세포의 도처에 편재되지만, 미토콘드리아 막 전위가 절충되고 파킨이 활성화되는 경우 미토콘드리아로 전좌된다. 고정된 세포의 자동화된 이미지 획득 후, 각각의 세포의 흥미 있는 영역을 분석 소프트웨어에 의해 정의하였다. 검정은 "RING-2 출력(RING-two output)" 알고리즘을 사용하였고, 이는 핵 염료 훽스트(Hoechst)의 도움으로 생성된 핵 마스크 및 세포질 마스크를 야기하였다. GFP-파킨의 미토콘드리아로의 재편재화를 정량하기 위하여, 세포질과 핵에서의 GFP 강도의 비를 계산하였다. 스트레스 받지 않은 조건하에, 이러한 비는 약 1이다. 도 1B는 0.5-0.8의 Z 인자(Z')와 함꼐 검정의 결과를 보여주는 막대 그래프이고, 이는 스크리닝 검정으로서 이의 견고성 및 유용성을 나타낸다. 검정의 확인은 PINK1 siRNA를 사용하여 수행하였다.
도 2A-2C는 CCCP 적정과 함께 일차 HCI 검정을 보여준다. 도 2A는 EGFP-파킨 전좌의 일차 HCI 검정의 그래프적 설명이다. GFP-파킨을 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 웰당 1350개 세포로 384웰 플레이트에 접종하였다(웰당 25 ㎕). 세포를 밤새 부착되도록 한 다음, 약물을 3중으로 25 ㎕의 부피로 2x 농축하여 가하였다. 2시간 후, 2x 저용량 CCCP 50 ㎕(3.5 μM CCCP의 최종 농도 수득)를 시험 화합물을 함유하고 음성 대조군을 위한 모든 웰에 가하였다. 양성 대조군 웰에 있어서, CCCP를 10 μM의 최종 농도로 가하였다. CCCP와 함께 2시간 배양 후, 세포를 고정하고, 세포를 이미징하기 적어도 1시간 전에 훽스트로 표지화하였다. 도 2B는 CCCP 적정의 예를 보여준다. 도 2C는 전형적인 약물 스크린 플레이트의 결과를 보여준다. 값을 음성 및 양성 대조군 값으로 정규화시키고, % 활성으로서 플롯팅하였다. Z'를 품질 제어에 대하여 계산하였다. 양성 대조군은 녹색으로 나타내고, 음성 대조군 웰은 적색으로 나타냈다. 50% 초과의 활성을 야기하는 약물은 양성으로 간주한다(청색).
도 3A-3E는 화합물 1(도 3B), 2(도 3C), 3(도 3D), 4(도 3E), 및 31(도 3A)의 용량 반응 곡선(DRC)을 보여주고, 이는 1 μM에서의 활성을 보여주었다. 그래프는 손상된 미토콘드리아로의 EGFP-파킨 전좌의 DRC를 보여준다. 세포를 384웰 플레이트에서 3중으로 12개의 상이한 농도의 약물로 처리하였다. % 활성을 로그 척도로 농도[M]에 대하여 플롯팅한다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어로 곡선 적합 및 EC50 값 계산을 수행하였다. 모든 EC50는 상한 나노몰 범위 내에 있다.
도 4A-4E는 pS65-Ub 항체와 함께 화합물 1(도 4B), 2(도 4C), 3(도 4D), 4(도 4E), 및 31(도 4A)의 정규화된 DRC를 보여준다(EGFP-파킨 전좌 대 pS65-UB 수준 대 세포 사멸). 세포의 수는 정사각형으로 나타낸다. pS65-Ub의 곡선 적합은 원형으로 나타낸다. 전좌의 곡선 적합은 삼각형으로 나타낸다. 세포 사멸은 웰당 세포의 수를 계산하여 조절하였다. 추가로, 동일한 플레이트를 pS65-Ub 항체로 염색하였다. 파킨 전좌의 정규화된 DRC 및 pS65-Ub 신호의 오버레이는 모든 시험된 화합물에 대하여 유사한 값을 제공하였다.
도 5는 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31에 의한 전처리에 의한 FLAG-파킨 C431S(WB)의 강화된 Ub-충전을 보여준다. 파킨 활성화의 또 다른 척도는 파킨의 Ub 충전이다. 파킨은 E2 효소로부터 Ub를 제공받아 이를 기질 단백질로 수송한다. Ub는 파킨 C431에 의해 불안정한 티오에스테르 결합으로 결합된다. 이러한 아미노산(C431S)의 세린 치환은 안정한 옥시에스테르 결합을 야기한다. 결합된 Ub는 그 후 웨스턴 블롯 실험에서 밴드 이동으로서 가시화될 수 있다. HeLa 3xFLAG-파킨 C431S 세포를 12웰 플레이트에 접종하고, 밤새 부착되도록 하였다. 세포를 5 μM(상부 패널) 또는 1 μM(하부 패널)의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 CCCP 첨가 2시간 전에 추가 2시간 동안 처리하였다. 10 μM CCCP를 양성 대조군(PC) 웰에 가한 반면, 모든 다른 샘플은 3.5 μM의 저용량 농도를 제공받았다. 세포를 끓는 뜨거운 SDS 용해 버퍼 중에 수집하고, 단백질 농도를 BCA로 결정하였다. 샘플을 나누고, 처리하지 않은 채로 두거나 지시된 바와 같이 NaOH로 처리하였다. 샘플을 8-16% 트리스-글리신 겔 위에서 두고, 막 위에 블롯팅하고, Flag 및 pS65-Ub에 대항하는 항체로 프로빙하였다. GAPDH는 로딩 제어로서 역할을 하였다. 밴드 이동은 유비퀴틴에 대한 파킨 결합을 나타내고, 이는 NaOH에 의해 절단될 수 있다.
도 6은 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31에 의한 전처리에 의한 FLAG-파킨 C431S의 강화된 Ub-충전(MSD 검정)을 보여준다. 파킨의 유비퀴틴 충전은 전기화학발광을 사용하는 ELISA형 메소스케일 디스커버리(MesoScale Discovery) 검정에 의해 모니터링하였다. 플레이트를 Flag 항체로 코팅하고, 이들을 저용량(3.5 μM) CCCP와 함께(+) 또는 없이(-) 추가 2시간 동안 배양하기 전에 5 μM의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31 또는 DMSO(좌, -)로 2시간 동안 전처리된 3xFLAG-파킨 C431S 세포로부터의 용해물과 함께 배양하였다. 양성 대조군(PC) 세포를 10 μM CCCP로 처리하였다. 세척 후, pS65-Ub 항체를 설포 태그된 항-토끼 항체와 함께 가하였다. 값을 PC(10 μM CCCP) 및 음성 대조군(-)으로 정규화시켰다. 통계 분석은 터키의 사후 시험(Tukey's post-hoc test)으로 일방향 ANOVA에 의해 수행하였다. ****, p<0.0001.
도 7은 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31에 의한 전처리에 의한 강화된 유비퀴틴화 및 파킨 기질의 분해를 보여준다. 태그되지 않은 파킨을 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 처리되지 않은 채로 두거나, 5 μM의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 2시간 동안 처리하고, 저용량 CCCP(3.5 μM CCCP) 없이(-) 또는 이와 함께(+) 처리하였다. 양성 대조군(PC)으로서, 일부 세포를 10 μM CCCP로 처리하였다. 용해물을 8-16% 트리스-글리신 겔 위에 로딩하고, 막 위에 블롯팅하고, 파킨 기질에 대항하는 항체로 프로빙하였다. 저용량 CCCP 처리 단독이 기질 분해를 야기하지 않는 반면, 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 전처리된 세포는 양성 대조군 세포와 유사한 감소된 기질 수준을 보여주었다.
도 8은 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31에 의한 전처리에 의한 pS65-Ub 신호의 강화된 증폭을 보여준다. 태그되지 않은 파킨을 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 처리하지 않은 채로 두거나, 5 μM의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 2시간 동안 전처리하고, 저용량 CCCP(3.5 μM CCCP) 없이(-) 또는 이와 함께(+) 처리하였다. 양성 대조군(PC)을 10 μM CCCP로 2시간 동안 처리하였다. 용해물을 8-16% 트리스-글리신 겔 위에 로딩하고, 막 위에 블롯팅하고, pS65-Ub에 대항하는 항체로 프로빙하였다. 저용량 CCCP 처리 단독이 pS65-Ub 축적을 야기하지 않는 반면, 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 처리된 세포는 양성 대조군으로의 pS65-Ub의 강한 유도를 보여주었다.
도 9는 미토콘드리아 손상의 존재하에 화합물 4에 의한 전처리하에 강화된 미토파지 플럭스를 보여준다. 384웰 플레이트에서 HCI를 사용하여 산성 대 중성 mtKeima의 비를 계산하였다. 10 μM CCCP로 처리하에, mtKeima 비의 유의미한 상승이 있었다. 화합물 4에 의한 전처리(점선, 여기서 5 μM의 화합물 4를 보여줌)는 저용량 CCCP 농도에서 이를 또한 유도하였고, 저용량 CCCP 단독(실선)은 산성 대 중성 mtKeima의 비에 아주 적은 영향을 가졌다.
도 10은 미토파지 검정에서 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31의 DRC를 보여준다. HeLa mtKeima 세포를 2시간 동안 12개의 상이한 용량의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 전처리한 다음, 저용량 CCCP를 가하였다(3 μM 최종 농도). 10 μM CCCP를 양성 대조군 웰에 가하였다. 세포는 CCCP의 4시간 및 8시간 후 살아 있는 것으로 이미징되었다. 값을 각각의 시간점에 대하여 양성 및 음성(3 μM CCCP) 대조군 값으로 정규화시켰다. 곡선 적합을 사용하여 EC50 값을 계산하였다.
도 11은 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31에 의한 처리하에 미토콘드리아 막 전위(JC-10 검정)의 품질 제어를 보여준다. 미토콘드리아 막 전위를 약화시키는 화합물을 배제하기 위하여, JC-10 검정을 사용하였다. HeLa 세포를 384웰 플레이트에 플레이팅하고, 상이한 용량의 CCCP 또는 5 μM의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 지시된 바와 같이 2시간 동안 처리하였다. JC-10 염료를 살아 있는 세포에 가하고, 세포를 45분 동안 염색하였다. 그 다음, 플레이트를 형광 플레이트 리더로 측정하였다. JC-10은 미토콘드리아 막 전위의 존재하에 적색 형광을 방출하는 미토콘드리아 염료이다. 형광은 미토콘드리아 막 전위의 부재하에 녹색으로 변할 것이다. 화합물 1, 2, 3, 및 4는 JC-10에 대한 영향을 보여주지 않은 반면, 화합물 31은 DMSO 대조군과 비교하여 미토콘드리아의 탈분극을 유의미하게 증가시켰다. 3개의 독립적인 실험의 평균 값을 나타낸다. 통계 분석은 터키의 사후 시험으로 일방향 ANOVA에 의해 수행하였다. ***, p< 0.0005.
도 12는 화합물 1-6, 8, 20, 및 31의 파라미터의 요약이다. 이러한 표는 화학정보학적 성질 및 20 PAC의 시험관내 독성 파라미터를 일차 검정 스크린(미토콘드리아로의 파킨 전좌)에서 평가된 바와 같은 이들의 분자량 및 이들의 EC50 값과 함께 요약한다. 화합물은 리핀스키의 5 법칙(Lipinski's Rule of Five)의 위반 0개를 보여주고, 이는 CNS 계량에서 중성이거나 심지어 실리코 독성 우려가 낮은 우수한 CNS 침투율 뿐만 아니라 개선된 CNS 기능에 대한 우수한 MW, PSA, logP, 및 Caco-2가 예상된다.
도 13은 상이한 CCCP 용량에 대한 반응에서 정규화된 EGFP-파킨 전좌[%]를 보여준다.
도 14는 384웰 플레이트에 접종되고 음성 대조군으로서 3.5 μM CCCP로 처리되고 양성 대조군에 대하여 10 μM CCCP로 처리된 HeLa EGFP-파킨 세포를 보여준다. 저용량 CCCP를 가하거나 화합물 및 CCCP를 동시에 가하기 전에, 세포를 2시간 동안 화합물 1, 2, 3, 4, 또는 31로 전처리하였다. 세포를 고정하고, HCI로 파킨 전좌에 대하여 분석하였다. 두 실험 계획 모두 모든 5개의 화합물에 대하여 유사한 EC50 값을 야기하였다.
도 15A-15H는 일차 섬유아세포, 신경 세포 및 시험관내에서의 파킨 활성화를 보여준다. 양성 대조군(PC) 세포를 DMSO 및 10 μM의 CCCP로 처리하였다. 음성 대조군(NC) 세포를 3.5 μM CCCP로 처리하고, 일부 세포를 미처리(-)로 두었다. 도 15A: 상이한 농도의 CCCP 전에 5 μM의 화합물 4로 2시간 동안 처리된 인간 섬유아세포의 웨스턴 블롯은 미토푸신의 증가된 유비퀴틴화/분해 및 pSer65-Ub 신호의 증폭을 보여준다. 빈쿨린을 로딩 제어로서 사용하였다. 도 15B: 저용량 CCCP(3.5 μM) 전에 5 μM의 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31로 전처리된 섬유아세포의 웨스턴 블롯은 기질 MFN1/2의 강화된 분해 및 pSer65-Ub 수준의 증가를 보여준다. 도 15C: 인간 섬유아세포를 뉴런으로 직접적으로 전환시키고, 도 15B에서와 같이 처리하였다. 웨스턴 블롯은 PC와 유사하지만, NC 세포와는 유사하지 않은, 화합물 처리시 변형된 MFN1 및 pSer65-Ub의 유도를 보여준다. 베타 III 튜불린은 섬유아세포의 i뉴런(iNeuron)으로의 성공적인 전환을 확인해주었다. 도 15D: 래트 PC12 세포를 도 15A에서와 같이 처리하였다. 웨스턴 블롯은 MFN2 및 TOM70의 강화된 유비퀴틴화, 및 PC와 유사하지만 NC 세포와는 유사하지 않은 강력한 pSer65-Ub 유도를 보여준다. 도 15E: 시험관내 E2 배출 검정. 재조합 파킨을 화합물 4 또는 대조군으로서 DMSO와 함께 전배양하고, Ub-로딩된 UbcH7로 혼합하였다. FLAG-유비퀴틴 및 UbcH7 웨스턴 블롯은 둘 다 화합물 4의 존재하에 약간 더 많은 E2 배출을 보여준다. 대조군 반응은 PINK1 또는 파킨 없이 수행하였다. 도 15F: 미처리 또는 CCCP 처리된 HeLa 세포 부족 파킨으로부터의 단리된 미토콘드리아의 시험관내 검정. 미토콘드리아 제조물을 재조합 파킨, E1, UbcH7, ATP 및 화합물 4 또는 대조군으로서 DMSO와 함께 혼합하고, 지시된 시간 동안 배양하였다. MFN1 웨스턴 블롯은 화합물 4가 존재할 때 증가된 유비퀴틴화를 보여준다. 대조군 샘플을 파킨 없이 반응 혼합물 중에서 배양하였다. 도 15G: SYPRO 오렌지 및 대조군으로서 DMSO 또는 500 nM 화합물 4와 함께 혼합된 정제된 파킨 50 ng과 함께 수행하였다. 3중 반응의 분석은 3℃ 온도 이동을 나타냈다. 도 15H: 도 15G에서 수행된 바와 같은 3개의 독립적인 실험의 통계 분석. 평균 값 +/- SD(비쌍체, 양측 t-시험; *** p<0.0005)로 나타낸다.
도 16A-16D는 일차 및 신경 세포에서의 효과를 보여준다. 도 16A: 도 15A에 기재된 바와 같이 처리된 인간 섬유아세포에서 수행된 6개의 독립된 실험으로부터 샌드위치 ELISA를 사용하는 pSer65-Ub 신호의 정량. 평균 -/+ SD로 나타냈다. 터키 사후 시험과 함께 일방향 ANOVA(*** p< 0.0005). 도 16B: 인간 일차 섬유아세포를 상이한 농도의 모든 5개의 화합물(1, 2, 3, 4, 및 31)로 2시간 동안 처리하였다. 화합물 처리 단독(즉, CCCP의 부재하에)은 MFN1 유비퀴틴화 또는 pSer65-Ub 신호를 유도하지 않았다. 상이한 CCCP 농도를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 16C: 래트 PC12 세포를 5 μM의 화합물로 2시간 동안 전처리한 다음, 저용량의 CCCP(3.5 μM)로 처리하였다. 대조군 세포를 DMSO 및 10 μM CCCP(PC) 또는 3.5 μM(NC)로 처리하였다. 일부 세포는 CCCP를 제공받지 않았다(-). 웨스턴 블롯은 유비퀴틴화(회색 화살표) 및 변형되지 않은(흑색 화살표) MFN1/2 및 TOM70의 감소를 보여준다. PINK1/파킨 생성물 pSer65-Ub는 저용량 처리시 모든 5개의 화합물에 의해, 그리고 양성 대조군에서 유도되었다. 도 16D: PC12 세포는 NGF에 의한 처리에 의해 분화되었다(NGF+). 일부 세포를 분화되지 않은 채로 남아 있었다(NGF-). 세포를 지시된 바와 같이 5 μM의 화합물 또는 DMSO로 처리하였다. 2시간 후, 저용량 CCCP(3.5 μM)를 시험 화합물로 처리된 세포에 가하였다. DMSO 대조군을 3.5 μM CCCP(NC) 또는 10 μM CCCP(PC)로 처리하였다. 일부 세포는 CCCP로 처리하지 않았다(-). MFN1에 대항하는 항체로 브로빙된 웨스턴 블롯은 화합물로 처리된 세포 및 양성 대조군에서 분해를 보여준다. 또한 음성 대조군에서 일부 분해를 관찰할 수 있었다. PINK1/파킨 생성물 pSer65는 음성 대조군과 비교하여 화합물로 처리된 세포에서 증가된 유도를 보여준다. 베타 III 튜불린을 사용하여 성공적인 분화를 확인하였다. 빈쿨린을 로딩 제어로서 사용하였다.
도 17A-17L은 파킨 활성화 화합물 1-6, 8-12, 14-20, 및 29-31의 상세한 화학정보학적 성질이다. 표는 각각의 열이 도킹 점수, 용량 반응으로부터의 실험적 활성(nM), 화학정보학적 성질, 및 리간드 효율을 함유하는 화합물을 열을 지어 열거한다. 도 17A-17C는 화합물 1-4 및 6에 대한 성질을 보여준다. 도 17D-17F는 화합물 8-12에 대한 성질을 보여준다. 도 17G-17I는 화합물 14-18에 대한 성질을 보여준다. 도 17J-17L은 화합물 19, 20, 및 29-31에 대한 성질을 보여준다.
도 18은 화합물 1-4 및 31에 대하여 시험관내 hERG 형광 편광 검정으로부터의 트레이서 결합 억제를 보여주는 막대 그래프이다.
도 19A-19D는 마우스 간 마이크로솜에서 화합물 1-4 및 31 및 참조 화합물(이미프라민 및 프로프라놀롤)에 대한 마이크로솜 안정성 데이터를 보여준다.
도 20A-20E는 화합물 1-4 및 31에 대한 CYP 억제 프로파일이다. 도 20A는 화합물 31에 대한 CYP 억제 프로파일이다. 도 20B는 화합물 1에 대한 CYP 억제 프로파일이다. 도 20C는 화합물 2에 대한 CYP 억제 프로파일이다. 도 20D는 화합물 3에 대한 CYP 억제 프로파일이다. 도 20E는 화합물 4에 대한 CYP 억제 프로파일이다.
도 21은 화합물 5, 21-28, 32, 33, 및 43-46에 의한 전처리에 의한 FLAG-파킨 C431S(WB)의 강화된 Ub-충전을 보여준다. 밴드 이동은 유비퀴틴에 대한 파킨 결합을 나타내고, 이는 NaOH에 의해 절단될 수 있다.
파킨은 사이토졸 E3 유비퀴틴(Ub) 리가아제이고, 미토콘드리아 키나제 PINK1의 다운스트림에서 작용한다. 미토콘드리아 스트레스에서, PINK1은 외부 미토콘드리아 막 위에서 안정화되고, 보존 잔기 세린 65에서 Ub의 인산화에 의해 파킨을 동원한다(Kane et al.(2014) J. Cell Biol. 205:143-153; Kazlauskaite et al.(2014) Biochem. J. 460:127-139; Koyano et al.(2014) Nature 510:162-166). 인산화된 Ub(pS65-Ub)는 파킨을 활성화시킬 수 있고, 또한 미토콘드리아 표면 위에서 파킨에 대한 수용체로서 작용한다(Okatsu et al.(2015) J. Cell Biol. 109:111-128). 파킨의 재편재화는 이의 효소적 활성화 및 미토콘드리아 기질 단백질 위의 Ub 분자의 결찰과 연관되고(Kazlauskaite et al.(2014) Open Biol. 4:130213), 이는 결국 PINK1 및 파킨에 대한 추가의 기질로서 역할을 한다(Fiesel et al.(2015) J. Cell Sci. 127:3488-3504). 형성된 pS65-Ub 신호는 미토파지 태그로서 작용하고, 리소좀에서 전체 세포소기관의 최종 분해에 대한 자가소화작용 어댑터에 의해 인지된다(Ordureau et al.(2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112:6637-6642; Richter et al.(2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113:4039-4044).
스트레스하에, PINK1/파킨 경로는 미토콘드리아의 턴오버(turnover)를 촉진하고, 세포성 분해를 야기할 수 있는 기능이상 미토콘드리아의 축적을 방지한다. 기초 조건하에, PINK1 및 파킨은 둘 다 상이한 메커니즘을 통해 억제된다. PINK1은 미토콘드리아 프로테아제 PARL에 의해 구성적으로 절단되고, 후속적으로 프로테아솜에 의해 분해된다(Yamano et al.(2013) Autophagy 9:1758-1769). 파킨은 기초 조건하에 존재하지만 활성을 억제하는 몇몇 자가상호작용과 함께 구조적으로 매우 압축되어 있다(Caulfield et al.(2015) Biochem. Soc. Trans. 43:269-274; Caulfield et al.(2014) PLoS Comput. Biol. 10:e1003935). 이들 자가상호작용은 방출되어야 하고, 파킨은 활성이 되기 위하여 '개방'될 필요가 있다. 파킨은 E3 유비퀴틴 리가아제의 최근 기재된 신규한 패밀리인 RING-사이-RING(RBR: RING-in-between-RING) 리가아제이다(Wenzel et al.(2011) Nature 474:105-108). 통상적인 RING형 리가아제의 멤버와 마찬가지로, 이는 E2 유비퀴틴 접합 공동인자에 결합하는 몇몇 RING 도메인을 함유한다. 그러나 기계적으로, 파킨은 기질로 수송되기 전에 E2로부터 이의 활성 시스테인(C431)과 함께 Ub 모이어티를 물리적으로 제공받기 때문에 HECT E3 리가아제와 같은 작용을 한다. 파킨의 Ub 충전(즉, 활성화)는 이의 미토콘드리아 동원에 밀접하게 연결된다(Iguchi et al.(2013) J. Biol. Chem. 288:22019-22032; Zheng et al.(2013) Cell Res. 23:886-897). 파킨은 보존 Ser65 잔기를 갖는 N-말단 유비퀴틴-유사(UBL) 도메인을 함유한다. S65에서 변형제 단백질 Ub의 인산화와 함께, UBL 내의 파킨 S65의 PINK1 의존성 인산화(Kazlauskaite et al.(2014) Biochem. J. 460:127-139; Iguchi et al.(2013) J. Biol. Chem. 288:22019-22032; Shiba-Fukushima et al.(2014) PLoS Genet. 10:e1004391)는 파킨 활성화를 야기하는 주요 사건이다(Kazlauskaite et al.(2014) Open Biol. 4:130213; Caulfield et al.(2014) PLoS Comput. Biol. 10:e1003935).
따라서, 본 출원은 파킨의 활성화에 유용한 화합물을 제공한다. 이들 파킨 활성화 화합물(PAC)은 낮은 마이크로몰/높은 나노몰 범위에서 활성이고, 인간 세포 배양에서 광범위하게 시험되었다. 이들 화합물의 목적은 PINK1/파킨 미토콘드리아 품질 제어를 개선시키는 것이다. 이러한 경로는 가족성 및 산발성 PD의 상이한 형태로 손상된다. 추가로, 미토콘드리아 품질 제어의 활성화는 다양한 신경성, 근육성 및 다른 노화 관련 질환에 이득이 될 수 있다.
흔히 90% 초과의 활성(즉, 억제)을 요구하는 효소/경로의 억제제와 대조적으로, 주어진 효소/경로의 활성화제/강화제는 오직 10% 활성(즉, 활성화)을 요구할 수 있고, 이는 심지어 작은 양의 활성 표적이 추가로 경로를 따라 추가로 증폭될 수 있기 때문이다. 이는 유효성에 필요한 더 낮은 약물 농도로 인하여 부작용을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 PAC는 PINK1에 의해 매개된 초기 미토콘드리아 스트레스 유도된 인산화하에 파킨 활성화를 강화시킬 수 있고, 이는 파킨의 형태적 변화를 야기하고 약물 결합 부위에 대한 접근을 허용한다. 임의의 이론과 결부되지 않지만, 이는 파킨의 효소 기능의 활성화를 필요한 때와 장소로만 제한할 수 있다고 생각된다.
1. 정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된"은 지정된 원자, 일반적으로 탄소, 산소, 또는 질소 원자 위의 임의의 하나 이상의 수소가 지시된 기로부터 선택된 것으로 교체되는 것을 의미하고, 단, 지정된 원자의 정상 원자가가 초과되지 않고, 치환이 안정한 화합물을 야기한다. 치환체가 케토 또는 옥소(즉, =O)인 경우, 원자 위의 2개의 수소가 교체된다. 고리 이중 결합은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 인접한 고리 원자 사이에 형성된 이중 결합이다(예를 들면, C=C, C=N, N=N 등).
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 명시된 수의 탄소 원자를 갖는 측쇄 및 직쇄 포화 지방족 탄화수소기를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, C1-4 알킬은 C1, C2, C3, 및 C4를 포함하는 것으로 의도된다. C1-6 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5, 및 C6 알킬기를 포함하는 것으로 의도되고, C1-8 알킬은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 및 C8을 포함하는 것으로 의도된다. 알킬의 일부 예는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, s-펜틸, n-헥실, n-헵틸, 및 n-옥틸을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 직쇄 또는 측쇄 구성의 탄화수소 쇄 및 에테닐 및 프로페닐과 같이 쇄를 따라 임의의 안정한 지점에서 발생할 수 있는 하나 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, C2-6 알케닐은 C2, C3, C4, C5, 및 C6 알케닐기를 포함하는 것으로 의도되고, C2-8 알케닐은 C2, C3, C4, C5, C6, C7, 및 C8 알케닐기를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬렌"은 디라디칼이고, 즉, 2개의 부착점을 갖는 모이어티를 포함하는 것으로 의도된다. 디라디칼인 이러한 알킬렌 모이어티의 비제한적인 예는 -CH2CH2-, 즉, 각각의 말단 탄소 원자가 분자의 나머지에 공유 결합된 C2 알킬기이다. 알킬렌 디라디칼은 또한 "알킬렌일" 라디칼로도 알려져 있다. 알킬렌기는 하나 또는 몇몇 위치에서 포화 또는 불포화(예를 들면, -CH=CH- 또는 -C≡C- 서브유닛 함유)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 알킬렌기는 1 내지 9개의 탄소 원자(예를 들면, 1 내지 6개의 탄소 원자, 1 내지 4개의 탄소 원자, 또는 1 내지 2개의 탄소 원자)를 포함한다. 알킬렌기의 일부 예는 메틸렌, 에틸렌, n-프로필렌, iso-프로필렌, n-부틸렌, iso-부틸렌, sec-부틸렌, tert-부틸렌, n-펜틸렌, iso-펜틸렌, sec-펜틸렌 및 neo-펜틸렌을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 포화 또는 불포화 비방향족 고리 기, 예를 들면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 또는 사이클로헥실을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 용어 "C3-8 사이클로알킬"은 C3, C4, C5, C6, C7, 및 C8 사이클로알킬기를 포함하는 것으로 의도된다. 사이클로알킬은 다중 스피로- 또는 융합 또는 브릿지드 고리를 포함할 수 있다. 예를 들면, 사이클로알킬은 스피로 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 또는 데실 기, 비사이클로 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 또는 데실 기, 아다만틸 기, 및 노르보닐 기를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "헤테로사이클로알킬"은 달리 명시되지 않는 한, 하나 이상의 헤테로원자(예를 들면, O, N, S, 또는 Se)를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 3-8원 단환식, 7-12원 이환식(융합, 브릿지드, 또는 스피로 고리), 또는 11-14원 삼환식 고리 시스템(융합, 브릿지드, 또는 스피로 고리)을 지칭한다. 융합 방향족 고리를 함유하는 헤테로사이클로알킬 기는 융합 방향족 고리의 고리 형성 원자를 포함하는 임의의 고리 형성 원자를 통해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클로알킬은 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖고 하나 이상의 산화된 고리 멤버를 갖는 단환식 4-6원 헤테로사이클로알킬이다. 일부 실시양태에서, 헤테로사이클로알킬은 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 또는 4개의 헤테로원자를 갖고 하나 이상의 산화된 고리 멤버를 갖는 단환식 또는 이환식 4-10원 헤테로사이클로알킬이다. 헤테로사이클로알킬기의 예는 피페리디닐, 피페라지닐, 피롤리디닐, 디옥사닐, 테트라하이드로푸라닐, 이소인돌리닐, 인돌리닐, 이미다졸리디닐, 피라졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 트리아졸리디닐, 테트라하이드로푸라닐, 옥시라닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 1,2,3,6-테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피라닐, 디하이드로피라닐, 피라닐, 모르폴리닐, 1,4-디아제파닐, 1,4-옥사제파닐, 2-옥사-5-아자비사이클로[2.2.1]헵타닐, 2,5-디아자비사이클로[2.2.1]헵타닐, 2-옥사-6-아자스피로[3.3]헵타닐, 2,6-디아자스피로[3.3]헵타닐, 1,4-디옥사-8-아자스피로[4.5]데카닐 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아민" 또는 "아미노"는 달리 명시되지 않는 한, 치환되지 않은 -NH2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도 치환체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐으로 치환된, 명시된 수의 탄소 원자를 갖는 측쇄 및 직쇄 포화 지방족 탄화수소기 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다(예를 들면, -CvFwH2v-w+1, 여기서 v = 1 내지 3이고, w = 1 내지 (2v+1)이다). 할로알킬의 예는 트리플루오로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 및 펜타클로로에틸을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "할로알콕시"는 본원에서 사용되는 바와 같이 하나 이상의 할로겐으로 치환되는 본원에서 정의된 바와 같은 알콕시기를 지칭한다. 할로알콕시기의 예는 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 펜타플루오로에톡시, 트리클로로메톡시 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알콕실" 또는 "알콕시"는 산소 브릿지를 통해 결합된 지시된 수의 탄소 원자를 갖는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 지칭한다. C1-6 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, 및 C6 알콕시기를 포함하는 것으로 의도된다. C1-8 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 및 C8 알콕시기를 포함하는 것으로 의도된다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시, n-헵톡시, 및 n-옥톡시를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아릴"은 "컨쥬게이트된" 것을 포함하여 방향족성을 갖는 기, 또는 고리 구조에 임의의 헤테로원자를 함유하지 않는 하나 이상의 방향족 고리를 갖는 다환식 시스템을 포함한다. 아릴은 단확식 또는 다환식(예를 들면, 2, 3 또는 4개의 융합 고리를 갖음)일 수 있다. 용어 "Cn-m 아릴"은 n 내지 m개의 고리 탄소 원자를 갖는 아릴기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아릴기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 실시양태에서, 아릴 기는 페닐 또는 나프틸이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방향족 헤테로사이클", "방향족 헤테로사이클릭" 또는 "헤테로아릴" 고리는 탄소 원자, 및 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자, 예를 들면, 1 또는 1-2 또는 1-3 또는 1-4 또는 1-5 또는 1-6개의 헤테로원자로 구성되는 안정한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12원 단환식 또는 이환식 방향족 고리를 의미하는 것으로 의도된다. 이환식 방향족 헤테로사이클릭 또는 헤테로사이클 또는 헤테로아릴 고리의 경우, 2개의 고리 중 오직 하나만 방향족일 필요가 있지만(예를 들면, 2,3-디하이드로인돌), 둘 다 방향족일 수 있다(예를 들면, 퀴놀린). 제2 고리는 또한 헤테로사이클에 대하여 상기 정의된 바와 같이 융합 또는 브릿지드될 수 있다. 질소 원자는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다(즉, N 또는 NR, 여기서 R은 정의된 바와 같이 H 또는 또 다른 치환체이다). 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있다(즉, N→O 및 S(O)p, 여기서 p = 1 또는 2). 특정한 화합물에서, 방향족 헤테로사이클에서 S 및 O 원자의 총 개수는 1 이하이다.
방향족 헤테로사이클, 방향족 헤테로사이클릭 또는 헤테로아릴의 예는 아크리디닐, 아조시닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조티오푸라닐, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 벤족사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사디아졸릴, 카바졸릴, 4aH-카바졸릴, 카볼리닐, 신놀리닐, 푸라자닐, 이미다졸릴, 이미다졸로닐, 1H-인다졸릴, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이소벤조푸라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 메틸벤즈트리아졸릴, 메틸푸라닐, 메틸이미다졸릴, 메틸티아졸릴, 나프티리디닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸릴, 피리도이미다졸릴, 피리도티아졸릴, 피리디닐, 피리디노닐, 피리디닐, 피리미디닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 트리아지닐, 트리아졸로피리미디닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,5-트리아졸릴, 및 1,3,4-트리아졸릴을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "하이드록시알킬"은 알킬기가 하나 이상의 OH 기로 치환되는 상기 정의된 바와 같은 알킬기를 의미한다. 하이드록시알킬 기의 예는 HO-CH2-, HO-CH2-CH2- 및 CH3-CH(OH)-를 포함한다.
용어 "시아노"는 본원에서 사용되는 바와 같이 삼중 결합에 의해 질소 원자에 결합된 탄소 원자를 갖는 치환체, 즉, C≡N을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "옥소"는 "=O"기를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는"이라는 구는 적절한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이득/위험 비에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합한 이들 화합물 또는 이의 토오토머, 또는 이의 염, 물질, 조성물, 및/또는 제형을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용되는 염"은 개시된 화합물 또는 이의 토오토머의 유도체를 지칭하고, 여기서 모 화합물 또는 이의 토오토머는 모 화합물 또는 이의 토오토머의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 변형된다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 미네랄 또는 유기 산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들면, 비독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된, 모 화합물, 또는 이의 토오토머의 통상적인 비독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들면, 이러한 통상적인 비독성 염은 2-아세톡시벤조산, 2-하이드록시에탄 설폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠 설폰산, 벤조산, 중탄산, 탄산, 시트르산, 에데트산, 에탄 디설폰산, 에탄 설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 글리콜리아르사닐산, 헥실레조르신산, 하이드라밤산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프토산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우릴설폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄 설폰산, 나프실산, 질산, 옥살산, 팜산, 판토텐산, 페닐아세트산, 인산, 폴리칼락투론산, 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 수바세트산, 석신산, 설팜산, 설파닐산, 황산, 탄닌산, 타르타르산, 및 톨루엔 설폰산으로부터 선택된 무기 및 유기 산으로부터 유도된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 개시내용의 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 화학 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물 또는 이의 토오토머로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 약학적으로 허용되는 염은 이들 화합물 또는 이의 토오토머의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물 중에 적절한 염기 또는 산의 화학량론적 양과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 안정한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, p. 1445(1990)]에서 확인된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로의 단리 및 유효한 치료제로의 제제화에서 살아남을 정도로 충분히 강력한 화합물을 지시하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 본원에서 제공되는 바와 같은 화합물 또는 약학 조성물을 치료적 목적으로 투여하는 것을 지칭한다. 용어 "치료적 치료"는 질환을 이미 겪고 있는 환자에게 치료를 투여하여 치료적으로 유리한 효과를 유발하는 것, 예를 들면, 기존의 증상을 개선시키는 것, 증상의 근본적인 대사적 원인을 개선시키는 것, 질병의 추가의 발달을 지연시키거나 방지하는 것, 및/또는 발달할 것이거나 발달할 것이 예상되는 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "불포화"는 1 이상의 불포화도(예를 들면, 하나 이상의 다중 결합)을 갖는 화합물을 지칭하고, 부분적 및 완전한 불포화 화합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 단독으로 또는 항미생물제와 조합으로 투여시 효과적인, 본 개시내용의 화합물, 또는 화합물 또는 토오토머의 약학적으로 허용되는 염(화합물 및/또는 이의 토오토머, 및/또는 상기 화합물 또는 토오토머의 약학적으로 허용되는 염의 조합을 포함)의 양을 지칭한다. 예를 들면, 유효량은 수용 환자 또는 대상체에게 제공된 제제가 생물학적 활성을 이끌어내는데 충분한, 조성물 중에 존재하는 화합물 또는 이의 토오토머, 또는 상기 화합물 또는 토오토머의 약학적으로 허용되는 염의 양을 지칭한다.
명세서에서, 단수형은 또한 달리 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 숙련가에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 본 명세서가 제어할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포유동물"은 인간 및 비인간 환자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개시내용의 화학식" 또는 "본원에 개시된 화학식"은 화학식 (I), (Ia), (Ia-1), (Ia-2), (Ib-a), (Ib), (Ia-3), (Ic), (Ic-1), (Id), (Ie), (If), (Ig).(Ie-1), (Ih), (Ii), (Ij), 및 (Ik) 중 하나 이상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개시내용의 화합물" 또는 "본원에 개시된 화합물"은 개시내용의 화학식의 하나 이상의 화합물 또는 본원에 명백하게 개시된 화합물을 포함한다.
본원에서 사용된 모든 퍼센트 및 비는 달리 지시되지 않는 한, 중량을 기준으로 한다.
조성물이 특정한 성분을 갖거나 포함하거나 함유하는 것으로 기재되거나 방법이 특정한 공정 단계를 갖거나 포함하거나 함유하는 것으로 기재된 설명 전체에서, 본 개시내용의 조성물은 또한 기재된 성분으로 본질적으로 구성되거나, 구성되고, 본 개시내용의 방법은 또한 기재된 공정 단계로 본질적으으로 구성되거나, 구성되는 것으로 생각된다. 추가로, 단계의 순서 또는 특정한 작용을 수행하기 위한 순서는 본 발명이 작동할 수 있게 남는 한, 중요하지 않은 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 2개 이상의 단계 또는 작용은 동시에 수행될 수 있다.
2. 개시내용의 화합물
본 출원은 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00014
상기 식에서,
A는 CH 또는 O이고;
B는 CH 또는 N이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
W는 C 또는 N이고;
X는 C 또는 N이고;
Y는 C 또는 N이고;
Z는 C 또는 N이고;
R1은 H, C1-4 알킬, 페닐, 또는 hetAr1이고;
R2는 H이고;
R3은 H이거나;
R2 및 R3은, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R7은 H이거나;
임의로, n이 0인 경우, R1 및 R7은, 이들이 결합된 원자와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4는 H, C1-4 알킬, 할로겐, CF3, 또는 페닐이고;
R5는 H, C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 할로겐으로 임의로 치환된 페닐, (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), S(C1-4 알킬), S(C4-6 사이클로알킬), (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1), hetAr1, 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이고;
R6은 H 또는 C1-4 알킬이고;
hetAr1은 C1-4 알킬로 임의로 치환된 1-3개의 고리 질소 원자를 갖는 6원 헤테로아릴 고리이고;
hetCyc1은 질소인 하나 이상의 고리 헤테로원자를 갖는 6-10원 이환식 고리이고, 하나 이상의 고리는 방향족이고;
n은 0 또는 1이고;
m은 0 또는 1이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
일부 실시양태에서, A는 CH이다. 일부 실시양태에서, A는 O이다.
일부 실시양태에서, B는 CH이다. 일부 실시양태에서, B는 N이다.
일부 실시양태에서, A는 O이고, B는 N이다.
일부 실시양태에서, D는 C이다. 일부 실시양태에서, D는 N이다.
일부 실시양태에서, E는 CH이다. 일부 실시양태에서, E는 N이다.
일부 실시양태에서, W는 N이다. 일부 실시양태에서, W는 C이다.
일부 실시양태에서, X는 C이다.
일부 실시양태에서, Y는 C이다. 일부 실시양태에서, Y는 N이다.
일부 실시양태에서, Z는 N이다. 일부 실시양태에서, Z는 C이다.
일부 실시양태에서, R1은 H이다. 일부 실시양태에서, R1은 C1-4 알킬 또는 hetAr1이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸, 이소프로필, 페닐, 또는 피리딘이다.
일부 실시양태에서, R4는 H이다. 일부 실시양태에서, R4는 Cl, CF3, 메틸 또는 페닐이다.
일부 실시양태에서, R5는 H 또는 할로겐으로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R5는 F로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, R5는 (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이다. 일부 실시양태에서, C4-6 사이클로알킬은 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 일부 실시양태에서, R5는 (C1-3 알킬)O(사이클로펜틸) 또는 O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로헥실)이다. 일부 실시양태에서, R5는 C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 또는 (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1)이다. 일부 실시양태에서, hetCyc1은 하나 이상의 질소 원자를 갖는 9원 이환식 고리이다. 일부 실시양태에서, hetCyc1은 이소인돌린이다. 일부 실시양태에서, R5는 S(C1-4 알킬) 또는 S(C4-6 사이클로알킬)이다. 일부 실시양태에서, C4-6 사이클로알킬은 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 일부 실시양태에서, R5는 hetAr1이다. 일부 실시양태에서, hetAr1은 C1-4 알킬로 임의로 치환된 피리딘 또는 피리미딘이다.
일부 실시양태에서, R6은 H이다.
일부 실시양태에서, n은 0이다.
일부 실시양태에서, m은 1이다.
일부 실시양태에서, p는 0이다. 일부 실시양태에서, p는 1이다.
일부 실시양태에서,
A이 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H, 메틸, 이소프로필, 페닐, 또는 1개의 고리 질소 원자를 갖는 6원 헤테로아릴 고리이고;
R4가 H, 할로겐, 메틸, 또는 CF3이고;
R5가 H 또는 페닐이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R4가 H이고;
R5가 (C1-3 알킬)O(사이클로펜틸), O(C1-4 알킬)(사이클로헥실), C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1), S(C1-4 알킬) S(C4-6 사이클로펜틸), 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 C이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R4가 H이고;
R5가 페닐이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 1이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 O이고;
B가 N이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R4가 페닐이고;
R5가 H이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 0이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 N이고;
Y가 N이고;
Z가 N이고;
R1이 C1-4 알킬이고;
R4가 H이고;
R5가 페닐이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 C1-4 알킬이고;
R2 및 R3이, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4가 H이고;
R5가 페닐이고;
R6이 H이고;
R7가 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2 및 R3이, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4가 H 또는 메틸이고;
R5가 C1-4 알킬(예를 들면, 메틸)로 치환된 피리딘 또는 피리미딘이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 C이고;
X가 C이고;
Y가 N이고;
Z가 C이고;
R3이 H이고;
R1 및 R7이, 이들이 결합된 원자와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4가 H이고;
R5가 페닐이고;
R6이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 0인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 N이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2 및 R3이, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R4가 H이고;
R5가 페닐이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH 또는 N이고;
D가 N이고;
E가 CH 또는 N이고;
W가 N이고;
X가 C이고;
Y가 C이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2 및 R3이, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
R5가 할로겐(예를 들면, 플루오로)으로 임의로 치환된 페닐이고;
R6이 H이고;
R7이 H이고;
m이 1이고;
n이 0이고;
p가 1인
화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
및
Figure pct00019
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 표 1에 열거된 화합물 중 임의의 한 화합물, 또는 화합물의 약학적으로 허용되는 염이다.
표 1
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
본 출원은 또한 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00025
상기 식에서,
A는 CH, N, 또는 S이고;
B는 CH, N, O, 또는 S이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
W는 CH, CH2, N, 또는 NRa이고;
X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
Y는 CH, CH2 또는 O이고;
Z는 N 또는 CR2'이고;
R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
R2는 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌이고;
R2'는 H 또는 C1-6 알킬이거나;
Z가 CR2'인 경우, R2 및 R2'는, C와 함께, C1-6 헤테로사이클릭 고리를 함께 형성할 수 있고;
R3은 H, 할로겐, C1-3 알킬, C3-6 사이클로알킬, 또는 C1-3 알콕시이고;
R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Rb는 C1-3 알킬이고;
m은 0, 1, 또는 2이고;
n은 1 또는 2이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있고;
단, n이 2이고, R1이 메틸이고, D가 C이고, R3이 H이고, A, B, 및 E가 모두 CH인 경우, W, X, 및 Y 중 하나 이상은 CH2가 아니다.
일부 실시양태에서, A는 CH이다. 일부 실시양태에서, A는 N이다. 일부 실시양태에서, A는 S이다.
일부 실시양태에서, B는 CH이다. 일부 실시양태에서, B는 N, O, 또는 S이다.
일부 실시양태에서, D는 C이다.
일부 실시양태에서, E는 CH이다. 일부 실시양태에서, E는 N이다.
일부 실시양태에서, L은 C1-3 알킬렌이다. 일부 실시양태에서, L은 메틸렌이다.
일부 실시양태에서, W는 CH2이다. 일부 실시양태에서, W는 N이다.
일부 실시양태에서, X는 CH이다. 일부 실시양태에서, X는 CH2이다. 일부 실시양태에서, X는 NRb이다.
일부 실시양태에서, Rb는 메틸이다.
일부 실시양태에서, Y는 CH이다. 일부 실시양태에서, Y는 CH2이다.
일부 실시양태에서, Z는 N이다. 일부 실시양태에서, Z는 CR2이다'.
일부 실시양태에서, R2는 존재하지 않는다. 일부 실시양태에서, R2 및 R2'는, C와 함께, 1개의 질소 원자를 갖는 5원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
일부 실시양태에서, R1은 H이다. 일부 실시양태에서, R1은 메틸이다.
일부 실시양태에서, Ra는 H 또는 메틸이다.
일부 실시양태에서, Rb는 메틸이다.
일부 실시양태에서, R3은 H, 할로겐, 또는 C3-6 사이클로알킬이다. 일부 실시양태에서, R3은 할로겐이다. 일부 실시양태에서, R3은 염소이다. 일부 실시양태에서, R3은 사이클로프로필이다.
일부 실시양태에서, R4 및 R4'는 각각 H이다. 일부 실시양태에서, R4 및 R4'는 각각 메틸이다.
일부 실시양태에서, m은 1 또는 2이다.
일부 실시양태에서, n은 1이다. 일부 실시양태에서, n은 2이다.
일부 실시양태에서, p는 0이다. 일부 실시양태에서, p는 1이다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 N, O, 또는 S이고;
D가 C 또는 N이고;
E가 CH 또는 N이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 CH2 또는 NRb이고;
Y가 CH2이고;
Z가 N이고;
R1이 H 또는 C1-3 알킬이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 C1-3 알킬이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
Rb가 C1-3 알킬이고;
n이 2이고;
m이 1이고;
p가 0인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 NRb이고;
Y가 CH2이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 C1-3 알콕시이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
Rb가 C1-3 알킬이고;
n이 2이고;
m이 1이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 NRa이고;
X가 N이고;
Y가 CH이고;
Z가 N이고;
R1이 H 또는 C1-3 알킬이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 H이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
Ra가 C1-3 알킬이고;
n이 2이고;
m이 0이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 NRa이고;
X가 CH2이고;
Y가 O이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 H이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
Ra가 H이고;
n이 2이고;
m이 1이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C(=O) 또는 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 CH2이고;
Y가 CH2이고;
Z가 N이고;
R1이 C1-3 알킬이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 H이고;
R4가 H 또는 C1-3 알킬이고;
R4'가 H 또는 C1-3 알킬이고;
n이 1이고;
m이 1이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 CH2이고;
Y가 CH2이고;
Z가 CR2'이고, R2 및 R2'는, C와 함께, C5-6 헤테로사이클릭 고리를 함께 형성하고;
R1이 C1-3 알킬이고;
R3이 H이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
n이 1이고;
m이 1이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH 또는 S이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 CH2이고;
Y가 CH2이고;
Z가 N이고;
R1이 메틸이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 H 또는 할로겐(예를 들면, 클로로)이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
m이 1이고;
n이 2이고;
p가 0 또는 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 N이고;
B가 O이고;
D가 C이고;
E가 N이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 CH2이고;
X가 CH2이고;
Y가 CH2이고;
Z가 N이고;
R1이 메틸이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 C3-6 사이클로알킬이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
m이 1이고;
n이 2이고;
p가 0인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서,
A가 CH이고;
B가 CH이고;
D가 C이고;
E가 CH이고;
L이 C1-3 알킬렌이고;
W가 N이고;
X가 CH이고;
Y가 CH이고;
Z가 N이고;
R1이 H이고;
R2가 존재하지 않고;
R3이 H이고;
R4가 H이고;
R4'가 H이고;
m이 1이고;
n이 2이고;
p가 1인
화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
및
Figure pct00029
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 화학식 IIa의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00030
상기 식에서,
A는 CH 또는 N이고;
B는 N, O, 또는 S이고;
D는 C 또는 N이고;
E는 CH 또는 N이고;
W는 CH2 또는 NRa이고;
X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
Y는 CH, CH2 또는 O이고;
L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
R3은 C1-3 알킬 또는 C1-3 알콕시이고;
R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
Rb는 C1-3 알킬이고;
n은 1 또는 2이고;
m은 0, 1 또는 2이고;
p는 0 또는 1이고;
점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 화학식 IIb의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다:
Figure pct00031
상기 식에서,
R1은 C1-3 알킬이고;
R5는 (C1-3 알킬)페닐이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 표 2에 열거된 화합물 중 임의의 한 화합물, 또는 화합물의 약학적으로 허용되는 염이다.
표 2
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
3. 개시내용의 화합물의 합성
인식될 것인 바와 같이, 이의 염을 포함하여 본원에 제공된 화합물은 공지된 유기 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 임의의 다수의 가능한 합성 경로에 따라 합성될 수 있다. 따라서 수득된 화합물은, 예를 들면, 플래시 컬럼 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 결정화, 또는 임의의 공지된 정제 방법에 의해 추가로 정제될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물, 예를 들면, 화학식 I 및 화학식 II의 화합물은 하기 합성 반응식 1-4에 도시된 절차에 따라 합성될 수 있다.
이미다조피리딘 구조를 갖는 화학식 I의 화합물은, 예를 들면, 반응식 1 및 2에 도시된 일반화된 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 제안된 합성 경로는 3개의 주요 단계를 갖는다 - 치환된 이미다조[1,2-a]피리딘-2-카브알데히드의 형성(단계 A), 아닐린의 아실화(단계 B), 및 최종 화합물의 합성(단계 C). 단계 A는 문헌에 잘 기록되어 있고(예를 들면, 문헌[Chavignon et al.(1992) J. Heterocycl. Chem. 29(4):691] 참조), 2개의 단계로 구성된다: 1) 가열하에 1,2-디메톡시에탄 중에서 치환된 2-아미노피리딘과 1,1,3-트리클로로아세톤의 축합에 의한 상응하는 2-(di클로로메틸)이미다조[1,2-a]피리딘의 형성; 2) 상응하는 이미다조[1,2-a]피리딘-2-카브알데히드에서 탄산칼슘에 의한 이들의 처리하에 2-(디클로로메틸)이미다조[1,2-a]피리딘의 변형. 단계 B도 2개의 단계를 갖는다 - 부산물의 형성을 피하기 위한 boc-보호된 아미노아세트산의 아미드(R3 = H)의 합성 및 산성 조건하에 보호 boc기의 제거. 최종 단계 C는 이미다조[1,2-a]피리딘-2-카브알데히드와 상응하는 아민의 반응에서 시프 염기의 형성 후, 나트륨 보로하이드라이드에 의한 이들의 환원을 암시한다.
R3이 알칸인 경우, 합성 경로는 더 짧고, 3 단계를 포함한다 - 상응하는 2-(클로로메틸)이미다조[1,2-a]피리딘에 의한 Alk-치환된 아미노아세트산 tert-부틸 에스테르의 알킬화(단계 D, 반응식 2), 가수분해(단계 E, 반응식 2), 및 최종 아미드 형성(단계 F, 반응식 2).
반응식 1
Figure pct00035
반응식 2
Figure pct00036
이미다졸 구조를 갖는 화학식 I의 화합물은, 예를 들면, 반응식 3에 도시된 일반화된 공정을 사용하여 제조될 수 있다. 공정은 상응하는 이미다졸릴-아세트산과 아닐린의 반응에 의한 아미드 결합 형성을 포함한다. R1 및 R2의 화학적 성질에 따라, 상이한 활성화제, 예를 들면, 카보디이미드(DCC, EDC), 카보닐 디이미다졸(CDI)이 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Montalbetti et al.(2005) Tetrahedron 61:10827] 참조).
반응식 3
Figure pct00037
피리미딘/호모피페라진 골격을 갖는 화학식 II의 화합물은, 예를 들면, 반응식 4에 도시된 일반화된 공정을 사용하여 제조될 수 있다.
반응식 4
Figure pct00038
당해 분야의 숙련가는 본원에 기재된 공정이 본원에서 제공된 화합물이 합성될 수 있는 독점적인 수단이 아니고, 본원에 제공된 화합물을 합성하는데 잠재적으로 이용되는 합성 유기 반응의 광범위한 목록이 이용 가능하다는 것을 인식할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 적절한 합성 경로를 선택하고 시행하는 방법을 알고 있다. 출발 물질, 중간체 및 생성물의 적합한 합성 방법은 참조 출처, 예를 들면, 문헌[Advances in Heterocyclic Chemistry, Vols. 1-107(Elsevier, 1963-2012); Journal of Heterocyclic Chemistry Vols. 1-49(Journal of Heterocyclic Chemistry, 1964-2012); Carreira, et al.(Ed.) Science of Synthesis, Vols. 1-48(2001-2010) and Knowledge Updates KU2010/1-4; 2011/1-4; 2012/1-2(Thieme, 2001-2012); Katritzky, et al.(Ed.) Comprehensive Organic Functional Group Transformations,(Pergamon Press, 1996); Katritzky et al.(Ed.); Comprehensive Organic Functional Group Transformations II(Elsevier, 2nd Edition, 2004); Katritzky et al.(Ed.), Comprehensive Heterocyclic Chemistry(Pergamon Press, 1984); Katritzky et al., Comprehensive Heterocyclic Chemistry II,(Pergamon Press, 1996); Smith et al., March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 6th Ed.(Wiley, 2007); Trost et al.(Ed.), Comprehensive Organic Synthesis(Pergamon Press, 1991)]을 포함하는 문헌을 참조하여 확인될 수 있다.
본원에 기재된 화합물의 제조를 위한 반응은 유기 합성 분야의 숙련가에게 용이하게 선택될 수 있는 적합한 용매 중에 수행될 수 있다. 적합한 용매는 반응이 수행되는 온도(예를 들면, 용매의 동결 온도 내지 용매의 비등 온도의 범위일 수 있는 온도)에서 출발 물질(반응물), 중간체, 또는 생성물과 실질적으로 비반응성일 수 있다. 주어진 반응은 1종의 용매 또는 1종 이상의 용매의 혼합물 중에서 수행될 수 있다. 특정한 반응 단계에 따라, 특정한 반응 단계에 적합한 용매는 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
본원에 기재된 화합물의 제조는 다양한 화학기의 보호 및 탈보호를 포함할 수 있다. 보호 및 탈보호에 대한 필요, 및 적절한 보호기의 선택은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 보호기의 화학은, 예를 들면, 문헌[T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., Wiley & Sons, Inc., New York(1999)]에서 확인할 수 있다.
반응은 당해 분야의 공지된 임의의 적합한 방법에 따라 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 생성물 형성은 분광학적 수단, 예를 들면, 핵 자기 공명 분광법(예를 들면, 1H 또는 13C), 적외선 분광법, 분광광도계(예를 들면, UV-가시광선), 질량 분석법, 또는 크로마토그래피 방법, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LCMS), 또는 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링될 수 있다. 화합물은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 정상 실리카 크로마토그래피를 포함하는 다양한 방법에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 정제될 수 있다.
본원에 제공된 화합물은 또한 토오토머 형태를 포함한다. 토오토머 형태는 양성자의 부수적인 이동과 함께 인접한 이중 결합과 단일 결합의 교환으로부터 야기된다. 토오토머 형태는 동일한 실험식 및 총 전하를 갖는 이성체 양성자 첨가 상태인 양성자성 토오토머를 포함한다. 양성자성 토오토머의 예는 케톤-엔올 쌍, 아미드-이미드 산 쌍, 락탐-락팀 쌍, 엔아민-이민 쌍, 및 하나의 양성자가 헤테로사이클릭의 2개 이상의 위치를 차지할 수 있는 환형 형태, 예를 들면, 1H- 및 3H-이미다졸, 1H-, 2H- 및 4H-1,2,4-트리아졸, 1H- 및 2H-이소인돌, 및 1H- 및 2H-피라졸을 포함한다. 토오토머 형태는 평형 상태일 수 있거나 적절한 치환에 의해 하나의 형태로 입체적으로 고정될 수 있다.
모든 화합물, 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 다른 성분, 예를 들면, 물 및 용매(예를 들면, 수화물 및 용매화물)과 함께 발견될 수 있거나 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물의 제조는 산 또는 염기의 첨가를 포함하여, 예를 들면, 목적하는 반응의 촉매 작용 또는 염 형태, 예를 들면, 산 부가 염의 형성에 영향을 미칠 수 있다.
산의 예는 무기 또는 유기 산을 포함할 수 있고, 강산 및 약산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 산의 일부 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, p-톨루엔설폰산, 4-니트로벤조산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 트리플루오로아세트산, 및 질산을 포함한다. 일부 약산은 아세트산, 프로피온산, 부탄산, 벤조산, 타르타르산, 파이로글루탐산, 굴론산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 및 데칸산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또한 유기 이산, 예를 들면, 말론산, 푸마르산 및 말레산이 포함된다.
염기의 예는 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 및 중탄산나트륨을 포함한다. 강염기의 일부 예는 수산화물, 알콕사이드, 금속 아미드, 금속 수소화물, 금속 디알킬아미드 및 및 아릴아민을 포함하지만 이에 한정되지 않고; 여기서 알콕사이드는 메틸, 에틸 및 t-부틸 산화물의 리튬, 나트륨 및 칼륨을 포함하고; 금속 아미드는 나트륨 아미드, 칼륨 아미드 및 리튬 아미드를 포함하고; 금속 수소화물은 수소화나트륨, 수소화칼륨 및 수소화리튬을 포함하고; 금속 디알킬아미드는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, tert-부틸, 트리메틸실릴 및 사이클로헥실 치환된 아미드의 리튬, 나트륨, 및 칼륨 염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물, 또는 이의 염은 실질적으로 단리된다. "실직적으로 단리된"은 화합물이 형성되거나 검출된 환경으로부터 적어도 부분적으로 또는 실질적으로 분리된다는 것을 의미한다. 부분적인 분리는, 예를 들면, 본원에 제공된 화합물이 풍부한 조성물을 포함할 수 있다. 실질적인 분리는 약 50 중량% 이상, 약 60 중량% 이상, 약 70 중량% 이상, 약 80 중량% 이상, 약 90 중량% 이상, 약 95 중량% 이상, 약 97 중량% 이상, 또는 약 99 중량% 이상의 본원에 제공된 화합물, 또는 이의 염을 함유하는 조성물을 포함할 수 있다. 화합물 및 이의 염을 단리하는 방법은 당해 분야에서 통상적이다.
표현 "주위 온도" 및 "실온" 또는 "rt"는 본원에서 사용되는 바와 같이 당해 분야에서 이해되고, 일반적으로 반응이 수행되는 공간의 대략적인 온도인 온도, 예를 들면, 반응 온도, 예를 들면, 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도를 지칭한다.
4. 사용 방법
이의 필요가 있는 대상체에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물을 포함하는 임의의 동물을 지칭한다. 예를 들면, 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 영장류, 및 인간. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물(예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는다. E3 유비퀴틴 리가아제의 예는 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, E3 유비퀴틴 리가아제는 파킨이다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 효소 활성은 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화되거나 강화된다. 일부 실시양태에서, 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 미토콘드리아 품질 제어를 자극한다. 일부 실시양태에서, 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 리가아제의 자가억제를 방해한다.
일부 실시양태에서, 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성은 질환, 노화, 또는 노화 관련 질병으로 인한 것이다. 질환 또는 질병의 예는 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 파킨슨병이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 질병은 암이다. 암의 예는 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 출원은 추가로 대상체에서 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은
(a) 질환 또는 질병이 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 질환이 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된다고 결정되는 경우, 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법은
(a) 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은
(a) 대상체가 파킨슨병을 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 대상체가 파킨슨병을 갖는 경우, 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법은
(a) 대상체에서 파킨슨병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
대상체에서 노화 관련 질병을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은
(a) 대상체가 노화 관련 질병을 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 대상체가 노화 관련 질병을 갖는 경우, 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 노화 관련 질병을 치료하는 방법은
(a) 대상체에서 노화 관련 질병을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 방법은
(a) 대상체가 암을 갖는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 대상체가 암을 갖는 경우, 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 암을 치료하는 방법은
(a) 대상체에서 암을 검출하는 단계; 및
(b) 대상체에게 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
를 포함한다.
암의 예는 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
세포에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포를 본원에서 제공되는 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 시험관내이다.
본원에 제공되는 방법의 일부 실시양태에서, 효소 활성은 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화되거나 강화된다. 일부 실시양태에서, 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 미토콘드리아 품질 제어를 자극한다. 일부 실시양태에서, 화합물, 예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 리가아제의 자가억제를 방해한다. 일부 실시양태에서, 세포는 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는다.
본원에 제공된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용을 위한 화합물(예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물)은 본 개시내용에서 제공되고 기재된 하나 이상의 화합물과 조합으로 사용될 수 있다.
5. 조합 요법
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 하나 이상의 화합물은 이의 필요가 있는 대상체에게 하나 이상의 추가의 약제학적 제제와 조합으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 약제학적 제제는 본원에서 제공되는 화합물(예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물)이다.
본원에서 제공된 질환 또는 질병의 치료를 위하여 본 출원의 화합물과 조합으로 사용하기에 적합한 추가의 약제학적 제제의 추가의 예는 일반적인 자가소화작용의 활성화제, 예를 들면, 라파마이신 및 레스베라트롤(예를 들면, mTOR 경로 억제) 또는 AMPK 경로 활성화(예를 들면, 메트포르민); 리소좀 기능/생체내합성의 활성화제, 예를 들면, 주요 조절자 TFEB의 자극; PINK1 키나제 활성의 활성화제, 예를 들면, 키네틴; 및 대안적인 메커니즘에 의하여 파킨을 활성화하는 분자, 예를 들면, 인광체-유비퀴틴 모사를 포함하는 인광체-유비퀴틴 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 이의 필요가 있는 대상체에게 감소되거나 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 활성과 연관된 질환 또는 질병의 치료를 위하여 하나 이상의 추가의 약제학적 제제와 조합으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소 활성은 질환, 노화, 또는 노화 관련 질병으로 인하여 약화된다.
6. 약학 조성물 및 제제
본원에서 제공되는 화합물(예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염), 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 약제로서 사용되는 경우, 본원에서 제공된 화합물은 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있고; 따라서, 본원에 기재된 방법은 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 본원 또는 다른 곳에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 국소 또는 전신 치료가 목적되는지 여부 및 치료되는 부위에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여는 폐(예를 들면, 네뷸라이저를 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입; 기관내 또는 비강내), 경구, 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내(예를 들면, 척추강내, 안구내, 또는 심실내) 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여는 단일 볼루스 용량의 형태일 수 있거나, 예를 들면, 연속 관류 펌프에 의할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 목적될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 경구 및 비경구 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 경구 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 비경구 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 정맥내 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 화합물은 경피 투여(예를 들면, 패치 또는 마이크로니들을 사용하는 투여)에 적합하다. 국소 투여를 위한 약학 조성물은 경피 패치(예를 들면, 정상 또는 전기자극형), 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 목적될 수 있다.
활성 성분으로서, 본원에서 제공되는 화합물(예를 들면, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(부형제)와 조합으로 함유하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 본원에서 제공된 조성물의 제조에서, 활성 성분은 전형적으로 부형제와 혼합되거나, 부형제에 의해 희석되거나, 예를 들면, 캡슐, 사셰, 종이, 또는 다른 용기의 형태로 이러한 담체 내에 봉입될 수 있다. 부형제가 희석제로서 역할을 하는 경우, 이는 활성 성분을 위한 비히클, 담체 또는 매질로서 작용하는 고체, 반고체, 또는 액체 물질일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제, 필, 분말, 로젠지, 사셰, 카셰, 엘릭서제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸(고체 또는 액체 매질 중으로서), 연고, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 좌제, 살균 주사용 용액, 및 살균 포장된 분말의 형태일 수 있다.
적합한 부형제의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 및 메틸 셀룰로스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 제제는 추가로 활택제, 예를 들면, 탈크, 스테아르산마그네슘, 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 보존제, 예를 들면, 메틸- 및 프로필하이드록시-벤조에이트; 감미제; 향미제, 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
활성 화합물은 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 유효할 수 있고, 일반적으로 약제학적 유효량으로 투여된다. 그러나, 실제로 투여되는 화합물의 약 및 투여 스케줄은 일반적으로 치료되는 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물, 개별적인 대상체의 연령, 체중, 및 반응, 대상체의 증상의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 따라 의사에 의해 결정될 것이라는 것이 이해될 것이다.
7. 키트
또한 본원에서 제공되는 화합물, 더 특히, 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 예를 들면, 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 위한 하나 이상의 전달 시스템, 및 키트의 사용 지침(예를 들면, 대상체의 치료를 위한 설명서)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에서 제공되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 본원에서 제공된 하나 이상의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물은 표 1에 제공된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 화합물은 표 2에 제공된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 키트는 본원에서 제공된 바와 같은 하나 이상의 화합물 또는 추가의 약제학적 제제, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 내용물이 약화되거나 감소된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 겪고 있는 대상체에게 투여된다는 것을 나타내는 표지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에서 제공된 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 내용물이 본원에서 제공되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 약제학적 제제와 함께 투여된다는 것을 나타내는 표지를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 합성 경로
하기 표 3에 열거된 화합물 1-46을 하기 기재된 일반적인 합성 반응식에 따라 합성하였다.
표 3. 화합물 1-46
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
A. 화합물 1, 3, 8-10, 12, 및 15-20의 합성
화합물 1, 3, 8-10, 12, 및 15-20은 하기 일반적인 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00046
실험:
디메틸포름아미드(7 mL) 중의 (3-{[(에틸이미노)메틸리덴]아미노}프로필)디메틸아민 하이드로클로라이드(EDCHCl)(1.2 mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(1.2 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(0.35 mL, 2 mmol), 산(1.2 mmol), 및 아닐린(1 mmol)의 혼합물을 24-48시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 물(35 mL)로 처리하고, 미정제 생성물을 여과하고, 아세토니트릴로부터의 재결정화 또는 HPLC 크로마토그래피(메탄올/물)에 의해 정제하였다. 수율: 산 및 아닐린의 구조에 따라 15-70%.
각각의 화합물 1, 3, 8-10, 12, 및 15-20에 대한 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다:
화합물 1:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 7.7(m, 6H, C Ph H), 7.4(m, 3H, C Ph H), 7.35(s, 1H, C imid H), 4.85(s, 2H, CH 2 ), 2.4(t, 4H, 2CH 2 ), 1.75(m, 4H, 2CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 332.2/332.2.
화합물 3:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.45(s, 1H, NH), 7.6(m, 3H, 2C Ph H, C imid H), 7.45(dd, 2H, C Ph H), 7.16(d, 1H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 1.2(s, 9H, 3CH 3 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 290.15/290.2.
화합물 8:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.2(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.45(dd, 2H, C Ph H), 7.15(d, 1H, C imid H), 6.9(m, 3H, 2C Ph H, C imid H), 4.85(s, 2H, CH 2 ), 3.75(d, 2H, OCH 2 ), 1.75(m, 6H, 3CH 2 ), 1.2(m, 3H, CH, CH 2 ), 1.05(m, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 314.21/314.1.
화합물 9:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.35(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.56(dd, 2H, C Ph H), 7.32(dd, 2H, C Ph H), 7.18(d, 1H, C imid H), 7.04(d, 1H, C Ph H), 6.98(t, 1H, C Ph H), 6.9(d, 1H, C imid H), 6.58(m, 2H, C Ph H), 4.8(s, 2H, CH 2 ), 4.2(s, 2H, NCH 2 ), 3.25(t, 2H, CH 2 ), 2.9(t, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 333.19/333.1.
화합물 10:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.25(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.45(dd, 2H, C Ph H), 7.3(dd, 2H, C Ph H), 7.1(d, 1H, C imid H), 6.85(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 2.05(m, 3H, C adam H ), 1.8(m, 12H, C adam H 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 336.24/336.1.
화합물 12:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.8(s, 1H, NH), 8.2(d, 1H, C Ph H), 7.85(m, 1H, C Ph H), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.4(m, 4H, C Ph H), 7.3(m, 2H, C Ph H), 7.2(d, 1H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 5.0(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 346.3/346.2.
화합물 15:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.35(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.56(dd, 2H, C Ph H), 7.26(dd, 2H, C Ph H), 7.16(d, 1H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 4.4(s, 2H, OCH 2 ), 3.9(m, 1H, CH), 1.65(m, 6H, CH 2 ), 1.5(m, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 300.19/300.2.
화합물 16:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.55(s, 1H, NH), 7.9(dd, 2H, C Ph H), 7.7(dd, 2H, C Ph H), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.1(m, 5H, 4C Ph H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 319.12/319.2.
화합물 17:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.2(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.45(dd, 2H, C Ph H), 7.3(d, 1H, C imid H), 7.2(dd, 2H, C Ph H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 2.4(d, 2H, CH 2 ), 1.8(m, 1H, C isoprop H), 0.9(d, 6H, 2C isoprop H 3 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 258.18/258.2.
화합물 18:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.35(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.56(dd, 2H, C Ph H), 7.34(dd, 2H, C Ph H), 7.18(d, 1H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 3.55(quint, 1H, CH), 2(m, 2H, CH 2 ), 1.7(m, 2H, CH 2 ), 1.5(m, 4H, 2CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 302.15/302.2.
화합물 19:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 7.7(m, 6H, C Ph H), 7.4(m, 3H, C Ph H), 7.1(d, 1H, C imid H), 6.75(d, 1H, C imid H), 4.85(s, 2H, CH 2 ), 2.3(s, 3H, CH 3 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 292.16/292.2.
화합물 20:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 8.55(d, 2H, C pyr H), 7.7(m, 6H, C Ph H), 7.4(m, 5H, 3C Ph H, 2C pyr H), 3.8(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 289.15/289.0.
B. 화합물 2, 4, 6, 7, 11, 및 14의 합성
화합물 2, 4, 6, 7, 11, 및 14는 하기 일반적인 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00047
실험:
디메틸포름아미드(7 mL) 중의 상응하는 2-클로로-N-페닐아세트아미드(1 mmol), 이미다졸(1.5 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(0.35 ml, 2 mmol)의 혼합물을 16시간 동안 60℃에서 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 물(35 ml)로 처리하였다. 미정제 생성물을 여과하고, 아세토니트릴로부터의 재결정화 또는 HPLC 크로마토그래피(메탄올/물)에 의해 정제하였다. 수율: 출발 물질의 구조에 따라 15-70%.
각각의 화합물 2, 4, 6, 7, 11, 및 14에 대한 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다:
화합물 2:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 7.7(m, 6H, C Ph H), 7.5(m, 2H, C Ph H), 7.35 (m, 1H, C Ph H), 7.1(d, 1H, C imid H), 6.8(d, 1H, C imid H), 4.95(s, 2H, CH 2 ), 3.0(sep, 1H, C isoprop H), 1.2(d, 6H, 2C isoprop H 3 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 320.2/320.2.
화합물 4:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 8.5(d, 1H, C pyr H), 8.15(d, 1H, C pyr H), 7.9(t, 1H, C pyr H), 7.65(m, 6H, C Ph H), 7.45(m, 2H, C Ph H), 7.4(d, 1H, C imid H), 7.35(m, 2H, C Ph H, C pyr H), 7.1(d, 1H, C imid H), 5.5(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 355.17/355.2.
화합물 6:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.55(s, 1H, NH), 7.9(t, 1H, C Ph H), 7.7(d, 1H, C Ph H), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.45(m, 6H, C Ph H), 7.2(d, 1H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 5.0(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 312.1/312.2.
화합물 7:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.45(s, 1H, NH), 7.66(m, 6H, C Ph H), 7.62(m, 2H, C Ph H), 7.46(m, 5H, C Ph H), 7.35(m, 2H, C Ph H, C imid H), 7.1(d, 1H, C imid H), 4.95(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 354.18/354.1.
화합물 11:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.5(s, 1H, NH), 8.85(d, 1H, C pyr H), 8.6(d, 1H, C pyr H), 8.05(d, 1H, C pyr H), 7.65(m, 6H, C Ph H), 7.45(m, 3H, 2C Ph H,C pyr H), 7.4(d, 1H, C imid H), 7.3(m, 1H, C Ph H), 7.1(d, 1H, C imid H), 5.05(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 355.17/355.2.
화합물 14:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.55(s, 1H, NH), 7.62(m, 2H, C Ph H, C imid H), 7.57(m, 1H, C Ph H), 7.35(t, 2H, C Ph H), 7.06(m, 2H, C Ph H, C imid H), 6.95(m, 4H, C Ph H), 6.86(d, 1H, C imid H), 4.85(s, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 294.13/294.2.
C. 화합물 30의 합성
화합물 30은 하기 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00048
실험:
디메틸포름아미드(7 mL) 중의 (3-{[(에틸이미노)메틸리덴]아미노}프로필)디메틸아민 하이드로클로라이드(EDCHCl)(1.2 mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(1.2 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(0.35 ml, 2 mmol), 2-(1H-이미다조l-1-yl)아세트산(1.2 mmol), 및 3-메틸-4-페닐아닐린(1 mmol)의 혼합물을 36시간 동안 실온에서 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 물(35 mL)로 처리하고, 미정제 생성물을 여과하고, 아세토니트릴로부터의 재결정화에 의해 정제하였다. 수율: 40%.
화합물 30에 대한 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다:
화합물 30:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.55(s, 1H, NH), 7.65(s, 1H, C imid H), 7.45(m, 4H, C Ph H), 7.37(m, 3H, C Ph H) ,7.17(m, 2H, C Ph H, C imid H), 6.9(d, 1H, C imid H), 4.9(s, 2H, CH 2 ), 2.2(s, 3H, CH 3 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 292.16.1/292.0.
D. 화합물 5의 합성
화합물 5는 하기 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00049
화합물 5로부터의 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다:
화합물 5:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 10.9(s, 1H, NH), 7.95(d, 1H, C py H), 7.65(d, 1H, C py H), 7.3-7.5(m, 6H, C Ph H; C imid H), 4.85(s, 2H, CH 2 CO), 2.4(m, 4H, 2CH 2 ; s, 3H, CH 3 ), 1.7(m, 4H, 2CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 347.21/347.2.
E. 화합물 31의 합성
디메틸아세트아미드(7 mL) 중의 4-클로로-2-메틸-5,6,7,8-테트라하이드로퀴나졸린(0.183 g, 1 mmol), 1-벤질-1,4-디아제판(0.228 g, 1.2 mmol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.35 mL, 2 mmol)의 혼합물을 16시간 동안 90℃에서 교반하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 염수(35 mL)로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(2 × 70 mL)로 추출하였다. 조합된 유기 층을 물(70 mL), 염수(70 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. HPLC 크로마토그래피(메탄올/물)에 의한 정제로 화합물 31 0.188 g(0.56 mmol, 56% 수율)을 오일로서 수득하였다. LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 337.48/337.4.
F. 화합물 32의 합성
화합물 32는 하기 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00050
화합물 32로부터의 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다.
화합물 32:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 8.3(s, 1H, C quin H), 7.3(m, 5H, C Ph H), 3.55(s, 2H, CH 2 Ph), 3.5(m, 4H, 2CH 2 ), 2.7(m, 4H, 2CH 2 ), 2.55(m, 4H, 2CH 2 ), 1.85(m, 2H, CH 2 ), 1.75(m, 2H, CH 2 ), 1.6(m, 4H, 2CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 337.28/337.2.
G. 화합물 33의 합성
화합물 33은 하기 합성 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00051
화합물 33으로부터의 스펙트럼 데이터는 하기에 열거된다.
화합물 33:
1H NMR(DMSO-d6): δ = 8.3(s, 1H, C quin H), 7.3(m, 5H, C Ph H), 3.65(m, 4H, 2CH 2 ), 3.55(s, 2H, CH 2 Ph), 2.7(m, 4H, 2CH 2 ), 2.55(m, 4H, 2CH 2 ), 1.85(m, 2H, CH 2 ), 1.75(m, 2H, CH 2 ), 1.6(m, 2H, CH 2 ) ppm.
LS-MS(m/z): [M+H]+ 계산치/실측치 323.26/323.2.
실시예 2: 화합물 1-4 및 31의 에임스 시험
박테리아 복귀 돌연변이 검정(에임스 시험)을 사용하여 시험된 화합물 1-4 및 31의 돌연변이 유발 성질을 평가하였다. 시험은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 아미노산 의존 균주를 사용하여 하나 또는 수개의 DNA 염기 쌍의 치환, 추가 또는 결손을 포함하는 점 돌연변이를 검출하였다. 점 돌연변이를 히스티딘(살모넬라 타이피뮤리움) 또는 트립토판(에스케리키아 콜라이) 오페론에서 유도하였고, 이는 시험 균주가 이들 아미노산을 제조할 수 없게 만든다. 시험은 박테리아에 존재하는 돌연변이를 복귀시키는 돌연변이를 검출하였고, 이는 히스티딘 또는 트립토판을 합성할 수 있는 기능적 능력을 회복시킨다. 복귀 돌연변이체 박테리아를 모 시험 균주에 의해 요구되는 아미노산의 부재하에 성장하는 능력에 의해 검출하였다. 시험된 화합물의 돌연변이 유발 가능성은 이들 박테리아 균주를 상이한 농도의 화합물에 노출시키고 아미노산의 부재하에(미량) 성장한 복귀 돌연변이체 콜로니의 수를 평가함으로써 평가하였다.
A. 물질 및 장비
검정에서 사용된 세포주는 살모넬라 타이피뮤리움 균주 TA 98(Xenometrix PSS-0110), TA 100(Xenometrix PSS-0111), TA 1535(Xenometrix PSS-0112), 및 TA 1537(Xenometrix PSS-0113), 및 에스케리키아 콜라이 균주 wp2 [pKM101](Xenometrix PSS-0116) 및 wp2 uvrA(Xenometrix PSS-0115)를 포함하였다.
시약 및 소모품은 DMSO(Sigma Cat# 34869), 45 mM의 시험된 화합물(들)의 DMSO 스톡 용액, 황산마그네슘 MgSO4ㆍH2O(Fluka Cat# 83266), 시트르산 일수화물(Enamine, Ukraine), 이염기성 인산칼륨 K2HPO4(Helicon Cat# Am-0348), 나트륨 암모늄 포스페이트 Na2NH2PO4(Sigma Cat# S9506), D-글루코스 일수화물(Sigma Cat# 49158), 아가(Sigma Cat# A1296), L-히스티딘(Sigma Cat# H6034), 비오틴(Sigma Cat# B4639), L-트립토판(Sigma Cat# T8941), 영양액 #2(Oxoid Cat# CV0067), 암피실린(Sigma Cat# A9393), 2-니트로플루오렌(Sigma Cat#N16754), 4-니트로퀴놀린 N-옥사이드(Sigma Cat# N8141), 9-아미노아크리딘(Enamine, Ukraine; T5111202), 나트륨 아지드(Helicon Cat# Am-0639), 염화나트륨(Sigma Cat# S3014), 염화마그네슘 MgCl2ㆍ6H2O(Sigma Cat# M2670), 35 mm 페트리 디쉬(Corning Cat# 430588), 및 1.5 mL 에펜도르프 튜브(Greiner bio-one Cat# 616201)를 포함하였다.
사용된 배지는 보겔-보너(Vogel-Bonner) E 배지(7.5 mM MgSO4, 10 mM 시트르산 일수화물, 60 mM K2HPO4, 15 mM Na2NH2PO4); GM 배지(글루코스 최소 아가 배지)(0.5% 글루코스, 1.5% 아가로 보충된 보겔-보너 E 배지); GM 액체 배지(글루코스 최소 배지)(0.5% 글루코스로 보충된 보겔-보너 E 배지); 및 탑(Top) 아가(0.6% 아가, 0.6% NaCl, 0.05 mM 히스티딘 및 0.05 mM 비오틴(살모넬라 타이피뮤리움에 대하여) 또는 0.05 mM 트립토판(에스케리키아 콜라이에 대하여)이었다.
장비는 이노바 4080 인큐베이터 셰이커(Innova 4080 Incubator Shaker)(New Brunswick Scientific, 미국 소재), 바이오메이트(BioMate) 3 UV/Vis 분광 광도계(Thermo Scientific, 미국 소재), 테르마크스 인큐베이터(Termaks Incubator), B8054(Termaks, 노르웨이 소재), 정수 시스템 나노퓨어 다이아몬드(NANOpure Diamond) D11911(Thermo Scientific Barnstead, 미국 소재), 및 피펫터 2-20 ㎕, 20-100 ㎕, 및 100-1000 ㎕(Thermo Scientific, 미국 소재)를 포함하였다.
B. 방법
시험 화합물 및 양성 및 음성 대조군과의 실험을 5개의 시험 균주(살모넬라 타이피뮤리움: TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537; 및 에스케리키아 콜라이: 1:2로 혼합된 wp2[pKM101] + wp2 uvrA)에 대하여 이중으로 수행하였다. 양성 대조군으로서, 공지된 돌연변이 유발 활성을 갖는 화합물을 사용하였다: TA 98에 대하여 2-니트로플루오렌(0.1 ㎍/플레이트), TA 100에 대하여 4-니트로퀴놀린 N-옥사이드(0.02 ㎍/플레이트), TA 1535에 대하여 NaN3(0.15 ㎍/플레이트), TA 1537에 대하여 9-아미노아크리딘(7.5 ㎍/플레이트), 및 에스케리키아 콜라이에 대하여 4-니트로퀴놀린 N-옥사이드(0.02 ㎍/플레이트). DMSO를 음성 대조군으로서 사용하였다.
각각의 실험에 있어서, 시험 균주 배양은 밤새 옥소이드(Oxoid) 영양액 #2 중에서 37℃에서 235 rpm의 교반하에 1-2x109 콜로니 형성 단위/mL(OD540~2)의 밀도로 성장하였다.
시험 균주(밤 배양 10 ㎕)를 시험 제제(DMSO 스톡 10 ㎕) 및 GM 액체 배지(30 ㎕)와 혼합하였다. 수득된 혼합물을 실온에서 5분 동안 살균 1.5 mL 튜브에서 배양하였다. 그 다음, 튜브에 44℃에서 저장된 용융된 탑 아가 200 ㎕를 가하여 응고를 방지하였다. 피펫으로 혼합한 후, 혼합물을 GM 아가 플레이트(플레이트당 GM 아가 2.0 mL)의 표면 위에 부었다. 탑 아가의 응고 후, 플레이트를 뒤집하고, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그 다음, 결과를 플레이트당 복귀 돌연변이체 콜로니의 수로서 표현하였다.
C. 결과
시험된 화합물의 최종 농도는 50 μM, 100 μM 및 200 μM인 것으로 결정되었다. 화합물 1 및 4에 대하여 200 μM의 최종 농도를 갖는 샘플에서 균주-화합물-GM 배지 혼합물 중에서 침전이 관찰되었다.
시험된 화합물 1, 2, 4 및 31은 시험 균주에 대하여 돌연변이 유발 가능성을 갖지 않았다. 200 μM의 농도에서 시험 화합물 3은 시험 균주 TA 98, TA 1537, TA 1535 및 에스케리키아 콜라이에 대하여 돌연변이 유발 활성을 드러냈다. 화합물 3은 균주 TA 100에 대하여 100 및 200 μM 둘 다에서 돌연변이 유발을 가졌다.
결과는 하기 표 4에 나타낸다.
표 4. 시험된 화합물에 대한 돌연변이 유발 검정의 결과
Figure pct00052
Figure pct00053
* 기준선 - 음성 대조군의 평균 + SD
실시예 3: 화합물 1-4 및 31에 대한 세포독성의 평가
화합물 1-4 및 31을 세포독성 검정에서 시험하였다. 검정은 살아 있는 세포 세포질의 환원 환경에서 비형광 염료 레자주린의 형광 화합물 레조루핀으로의 전환을 기초로 하였다. 샘플에 살아 있는 세포가 많을수록 더 높은 형광을 야기하고, 살아 있는 세포가 적을수록 더 낮은 형광을 야기한다.
A. 물질 및 장비
시약 및 소모품은 DMSO 크로마솔브 플러스(Chromasolv Plus), HPLC 등급, ≥99.7%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34869), L-글루타민이 없는 DMEM(4.5g/L) 액체(PAA, 영국 소재; Cat# E15-009), Ca 및 Mg이 없는 둘베코 PBS(1x)(PAA, 영국 소재; Cat# H15-002), L-글루타민(200 mM)(PAA, 영국 소재; Cat# M11-004), EU 승인된 소 태아 혈청 "GOLD"(PAA, 영국 소재; Cat# A15-151), 페니실린/스트렙토마이신(100x)(PAA, 영국 소재; Cat# P11-010), 레자주린(SynbiaS, 우크라이나 소재; Cat# 62758-13-8), 독소루비신, 주사용 용액을 위한 바륨(Arterium, 우크라이나 소재; 약제), DPBS 중의 트립신 EDTA(10x) 0.5%/0.2%(PAA, 영국 소재; Cat# L11-003), 폴리스티렌 리드를 갖는 코스타(Costar)® 96웰 세포 배양 환저 클러스터(Corning Incorporated, Cat# 3790), 일회용 피펫터 팁(Thermo Scientific, Fisherbrand, Eppendorf USA), 원심분리기 튜브, 50 mL(Santa Cruz, 미국 소재; Cat# sc-200251), 팔콘(Falcon)® 96웰 플레이트, 블랙/투명(BD, Cat# 358078) , 및 혈청 피펫 5 mL, 10 mL, 25 mL(Greiner Bio-One)를 포함하였다.
장비는 세포 배양 CO2 인큐베이터, 모델 CCL-170B-8(ESCO, 싱가포르 소재), 원심분리기 5804R(Eppendorf, 미국 소재), 에칭된 혈구계수기, 암선 계수 챔버(Hausser Scientific, 미국 소재; Cat# 3500), CyBi®-SELMA, 반자동 96배 피펫터(Analytik Jena AG), 랩컬처 바이올로지컬 세이프티 캐비넷(Labculture Safety Cabinet), 클래스 II, 유형 A2(ESCO), 도립 현미경, 모델 CK2(Olympus Optical Co., Ltd., 일본 소재), 현미경 라이카(Leica) DM LS2(Leica Microsystems Wetzlar GmbH, 독일 소재), 다중방식 마이크로플레이트 리더 폴라스타 오메가(POLARstar Omega)(BMG Labtech GMBH, 독일 소재), 티터테크 멀티드롭(Titertek Multidrop) 384 모델 832(Thermo Scientific/Titertek, 미국 소재), 스탁맥스 마이크로플레이트 핸들링 시스템(StakMax Micro플레이트 Handling System)(Molecular Devices), PIPETMAN 피펫 2-20 ㎕, 50-200 ㎕, 200-1000 ㎕(Gilson, 미국 소재), 및 다채널 전자 피펫 2-125 ㎕, 5-250 ㎕, 15-1250 ㎕, 매트릭스(Matrix)(Thermo Scientific, 미국 소재)를 포함하였다.
B. 방법
HepG2 세포를 가습된 대기에서 37℃ 및 5% CO2에서 75 cm2 플라스크에서 80-90%의 컨플루언스(confluence)까지 배양하고, 1:4의 계대배양 비로 주당 2회씩 나누었다. 세포 층을 PBS로 헹구어 모든 혈청의 흔적을 제거하였다. 그 다음, 0.25%(w/v) 트립신 및 0.53 mM EDTA를 함유하는 용액 3.0 mL를 플라스크에 가하고, 약 10분 동안 배양하였다. HepG2 세포를 스크래퍼를 사용하여 떼어내고, 10% FBS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 재현탁시켰다. 5x105 세포/mL의 최종 농도를 갖는 세포 현탁액을 이전에 기재된 바와 같이 살균 96웰 블랙 월 투명 평저 플레이트로 분배하고(McMillian et al.(2002) Cell Biol. Toxicol. 18(3):157-173; Mulvihill et al.(2009) Future Med. Chem. 1(6):1153-1171), 시험 화합물을 가하였다.
화합물 DMSO 스톡 용액을 PBS로 희석하여 1 mM의 중간 농도를 달성하였다. 세포 증식 평가를 0.1 μM 내지 100 μM 범위의 화합물의 상이한 농도에서 수행하였다. 20 μM의 최종 농도에서 독소루비신을 양성 대조군으로서 사용하였다. 화합물 첨가 후, 세포를 24시간 동안 가습된 대기에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다.
레자주린을 최종 농도(50 μM)로 가하고, 4시간 동안 동일한 조건하에 배양하였다. 형광을 측정함으로써 레조루핀의 존재(세포 생존능)를 정량하였다(Ex - 490 nm, Em - 540 nm; 문헌[Vega-Avila and Pugsley(2011) Proc. West Pharmacol. Soc. 54:10-14] 참조).
하기 식을 적용하여 세포 증식 억제의 퍼센트를 계산하였다:
Figure pct00054
상기 식에서,
CPI - 세포 증식 억제;
AVG 고 대조군 - 세포 현탁액 및 PBS를 함유하는 웰의 RFU의 평균;
웰 RFU - 시험 화합물을 갖는 표적 웰의 RFU; 및
AVG 저 대조군 - 세포 현탁액 및 독소루비신을 함유하는 웰의 RFU의 평균.
IC50 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
C. 결과
독소루비신을 참조 화합물로서 사용하여 세포 증식의 억제를 평가하였다. 20 μM에서 독소루비신에 의한 HepG2 세포 증식 억제의 데이터를 고 대조군으로서 사용하고, RFU의 값을 100%의 억제에 대하여 취하였다.
화합물 1-4 및 31에 의한 HepG2 세포 증식 억제(%)는 하기 표 5에 열거된다.
표 5. 화합물 1-4 및 31에 의한 HepG2 세포 증식 억제(%)
Figure pct00055
100 μM 내지 0.1 μM 범위의 상이한 농도에서 HepG2 세포의 증식 억제의 연구의 결과를 기초로, 시험된 화합물 중 어느 것도 유의미한 세포독성 효과를 나타내지 않았다.
실시예 4: 화합물 1-4 및 31에 대한 시험관내 예측변수 hERG 형광 편광 검정
화합물 1-4 및 31 형광 편광 검정에 대한 인간 에테르-아-고-고-관련 유전자(hERG: human Ether-a-go-go-Related Gene) 결합의 예비 평가를 수행하였다. 형광 편광(FP) 판독 기술은 작은 형광 분자(트레이서)가 평광된 광에 의해 여기될 때의 관찰을 기초로 하고, 방출된 광은 이의 형광 수명 동안 용액 중의 분자의 빠른 회전으로 인하여 대부분 편광 해소된다. hERG 예측변수 검정은 칼륨 채널에 대한 시험 화합물의 가능한 결합 및 초음파 심장 진단도에서 잠재적인 QT 연장에 대한 귀중한 정보를 제공한다.
A. 물질 및 장비
사용된 시약 및 소모품은 DMSO 크로마솔브 플러스, HPLC 등급, ≥99.7%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Lot# 34869), 프리딕터(Predictor)TM hERG 형광 편광 검정 키트(Invitrogen; Cat# PV5365), 코닝(Corning) 검정 플레이트, 384 웰, U-바닥, 블랙 폴리스티렌(Corning, 미국 소재; Cat# 3677), 및 화합물 1-4 및 31을 포함하였다.
장비는 TECAN ULTRA 다기능 플레이트 리더(Tecan, Austria), 마이크로피펫 0.5-5 ㎕, 2-20 ㎕, 15-200 ㎕, 100-1000 ㎕(Finntip, Eppendorf, Gilson), 다채널 피펫(30 ㎕)(Thermo Matrix, 미국 소재), 및 정수 시스템, 나노퓨어 다이아몬드D11911(Thermo Scientific Barnstead, 미국 소재)을 포함하였다.
B. 방법
모든 실험은 제조사 프로토콜 PV5365(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)에 따라 프리딕터TM hERG 형광 편광 검정을 사용하여 수행하였다.
트레이서 및 막을 hERG 채널과 함께 2-4시간 동안 용액 중에서 배양함으로써 hERG 반응을 수행하였다. 형광 편광은 어느 것도 트레이서 및 hERG 막의 반응을 방해하지 않았을 때 최대였다(최소 트레이서 회전). 그러나, 시험된 화합물이 hERG 채널의 트레이서와 경쟁했을 때, 방출된 광의 편광은 용액 중의 빠르게 회전하는 자유 미결합 트레이서의 능력으로 인하여 낮아졌다. 참조 화합물(E-4031, 제조사에 의해 제공됨)을 사용하여 검정 성능을 입증하였다. E-4031의 보정 곡선을 사용하여 수행된 검정에서의 E-4031의 IC50을 제조사의 제공된 데이터와 비교하였다. E-4031 평가를 위한 보정 곡선 형성 및 IC50의 계산을 위하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어의 "S자형 용량-반응(가변 경사)" 함수를 사용하였다. E-4031에 대한 IC50 값은 발행된 데이터에 따라 약 70 nM인 것으로 확인되었다.
화합물에 대한 모든 시험 점은 4중으로 수행하였다. 시험된 화합물의 3개의 희석을 평가하였다 - 1 μM, 5 μM 및 20 μM.
한 세트의 양성 및 음성 대조군(검정 블랭크 - 트레이서 첨가되지 않음, 검정 음성 - 100% 트레이서 배치를 나타내고 최소 검정 편광 값을 제공하는 30 μM의 E-4031)을 4회 반복으로 수행하였다.
C. 결과
화합물 1, 2, 3 및 31은 트레이서 결합의 유의미한 용량 의존성 억제를 나타냈고, 이는 hERG 책임의 존재 가능성을 제시한다. 화합물 4는 용량 의존 없이 트레이서 결합의 낮은 억제를 나타냈다. 하기 표 6 및 도 18을 참조한다.
표 6. 화합물 1-4 및 21에 대한 hERG 결합 프로파일
Figure pct00056
실시예 5: 화합물 1-4 및 31에 대한 Caco-2 A-B 투과도의 평가
Caco-2 세포주를 가로지르는 화합물의 수송 속도를 측정함으로써 장에서 약물의 생체내 흡수를 예상함으로써, Caco-2 투과도 검정을 수행하여 경구 투약에 대한 화합물 1-4 및 31의 적합성을 결정하였다.
A. 물질 및 장비
사용된 시약 및 소모품은 DPBS 중의 트립신 EDTA(10x) 0.5%/0.2%(PAA, 영국 소재; Cat# L11-003), HEPES, 고순도 등급(Helicon, Am-0485), Ca 및 Mg이 없는 둘베코 PBS(1x)(PAA, 영국 소재; Cat# H15-002), Ca 및 Mg이 없고 페놀 레드가 없는 행크 BSS(1x)(PAA, 영국 소재; Cat# H15-009), DMSO 크로마솔브 플러스, HPLC 등급, ≥99.7%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34869), L-글루타민이 없는 DMEM(4.5g/L) 액체(PAA, 영국 소재; Cat# E15-009), L-글루타민(200 mM)(PAA, 영국 소재; Cat# M11-004), EU 승인된 소 태아 혈청 "GOLD"(PAA, 영국 소재; Cat# A15-151), 페니실린/스트렙토마이신(100x)(PAA, 영국 소재; Cat# P11-010), 아세토니트릴 크로마솔브(Chromasolv), 경사 등급, HPLC용, ≥99.9%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34851), 질량 분석을 위한 포름산, ~98%(Fluka, 미국 소재; Cat# 94318), 배지 공급 트레이가 있는 팔콘® HTS 24-멀티웰 삽입 시스템(BD Biosciences, 미국 소재; Prod# 351181), 팔콘® 24웰 TC-처리된 세포 PS 투과성 지지체 지지 컴패니언 플레이트(BD, Prod# 353504), 원심분리기 튜브, 50 mL(Santa Cruz, 미국 소재; Cat# sc-200251), 혈청 피펫 5 mL, 10 mL, 25 mL(Greiner Bio-One), 일회용 피펫터 팁(Thermo Scientific, Fisherbrand, Eppendorf USA), 마이크로랙 내의 1.1 mL 마이크로튜브(Thermo Scientific, 미국 소재), 조르박스 이클립스 플러스(Zorbax Eclipse Plus) C18 컬럼 2.1Х50 mm, 3.5 ㎛(Agilent Technologies, Inc. 미국 소재), 프로프라놀롤 하이드로클로라이드 ≥99%(TLC), 분말(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# P0884), 이미프라민 하이드로클로라이드 ≥99%(TLC)(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Lot# I7379), 및 아테놀롤, 분석용 참조 물질, ≥98.5%(HPLC)(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 74827)를 포함하였다.
장비는 세포 배양 CO2 인큐베이터, 모델 CCL-170B-8(ESCO, 싱가포르 소재), 원심분리기 5804R(Eppendorf, 미국 소재), 원심분리기 4-15C(Qiagen)(Sigma, Germany), 에칭된 혈구계수기, 암선 계수 챔버(Hausser Scientific, 미국 소재; Cat# 3500), 경사 HPLC 시스템 VP(Shimadzu, Japan), 이노바 4080 인큐베이터 셰이커(New Brunswick Scientific, 미국 소재), 밀리셀-ERS(Millicell-ERS) 시스템 옴계(Millipore, Cat# MERS 000 01), 터보이온스프레이 일렉트로스프레이(TurboIonSpray Electrospray) 모듈이 있는 MS/MS 검출기 API 3000 PE(PE Sciex, 미국 소재), 다채널 수동 피펫(Thermo Labsystems Finnpipette, FA16-50R), 다채널 전자 피펫 2-125 ㎕, 5-250 ㎕, 15-1250 ㎕, 매트릭스(Thermo Scientific, 미국 소재), PIPETMAN 피펫 2-20 ㎕, 50-200 ㎕, 200-1000 ㎕(Gilson, 미국 소재), VWR 막 질소 발생기 N2-04-L1466, 질소 순도 99%+(VWR, 미국 소재), 및 정수 시스템 나노퓨어 다이아몬드 D11911(Thermo Scientific Barnstead, 미국 소재)을 포함하였다.
모든 측정은 진공 탈기기, 경사 펌프, 역상 HPLC 컬럼, 컬럼 오븐 및 오토샘플러를 포함하는 시마즈(Shimadzu) VP HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. HPLC 시스템은 탠덤 질량 분석기 API 3000(PE Sciex)와 연결되었다. 터보이온스프레이(TurboIonSpray) 이온 공급원은 음성 및 양성 이온 방식 둘 다로 사용하였다. 데이터의 획득 및 분석은 애널리스트(Analyst) 1.5.2 소프트웨어(PE Sciex)를 사용하여 수행하였다.
LC-MS 조건은 하기와 같았다. 컬럼: 애질런트(Agilent) ZORBAX 이클립스 플러스(Eclipse Plus) C18; 이동상 A: 아세토니트릴:물:포름산 = 100:1000:1; 이동상 B: 아세토니트릴:포름산 = 1000:1; 구배: 0분 25% B, 1.1분 100% B, 1.5분 100% B, 1.51분 25% B, 2.7분 정지; 용리 속도: 400 ㎕/분; 컬럼 온도: 30℃; 주입 부피: 2 ㎕; 이온 공급원: 터보 스프레이; 이온화 모델: ESI; 스캔 유형: 파지티브 Q3 멀티플 이온스(Positive Q3 Multiple Ions); 분무 기체: 15 L/분, 커튼 기체: 8 L/분; 이온스프레이 전압: 5000 V, 온도: 400℃.
B. 방법
ATCC 및 밀리포어(Millipore) 권고(밀리포어 프로토콜 노트 PC1060EN00P)에 따라 가습된 대기에서 37℃ 및 5% CO2에서 Caco-2 세포를 75 cm2 플라스크에서 80-90%의 컨플루언스까지 배양하였다. 세포를 트립신/EDTA 용액으로 떼어내고, 세포 배양 배지에 2x105 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 세포 현탁액 500 ㎕를 HTS 24-멀티웰 삽입 시스템의 각각의 웰에 가하고, 미리 따뜻하게 만든 완전 배지 35 mL를 공급 트레이에 가하였다. Caco-2 세포를 수송 실험 전에 멀티웰 삽입 시스템에서 10일 동안 배양하였다. 필터 플레이트 및 공급 트레이의 배지를 격일로 바꾸었다. 세포 성장 10일 후, 밀리셀-ERS 시스템 옴계를 사용하여 모든 웰에 대하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정함으로써 단층의 무결성을 입증하였다. 수득된 TEER 값은 검정 조건에 의해 필요한 바와 같이 1000 Ω보다 컸다(1400 내지 1500 Ω). 24웰 삽입 플레이트를 이의 공급 플레이트로부터 제거하고, 새로운 살균 24웰 수송 분석 플레이트에 놓았다. 배지를 흡입하고 삽입물을 PBS로 세척하였다.
정점(A)에서 기저측(B) 방향으로의 약물 수송의 속도를 결정하기 위하여, 완충제(HBSS, 5.6 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH=7.4) 중의 시험 화합물 용액 300 ㎕를 필터 웰에 가하고, 동일한 완충제 1000 ㎕를 수송 분석 플레이트의 웰에 가하였다. 플레이트를 90분 동안 37℃에서 50 rpm로 교반하에 배양하였다. 분취액 75 ㎕를 LC-MS/MS 분석을 위하여 정점 및 기저측 구획으로부터 분취하였다. LC-MS/MS 분석을 위한 모든 샘플을 아세토니트릴(x2 부피)로 추출한 후, 10000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 단백질 침강을 수행하였다. 탠덤 질량 분석기와 연결된 HPLC 시스템을 사용하여 상청액을 분석하였다.
이미프라민, 프로프라놀롤(고 투과도), 및 아테놀롤(저 투과도)을 참조 화합물로서 사용하였다.
겉보기 투과도(Papp)를 하기 식을 사용하여 Caco-2 투과도 검정에 대하여 계산하였다:
P app =(V A /((면적)x(시간))x([약물] acc /[약물] initial,d )
상기 식에서,
VA - 수용 웰에서 수송 완충제의 부피;
면적 - 삽입물의 표면적(삽입물의 유효 성장 면적과 동일 - 0.31 sq.cm);
시간 - 검정의 시간;
[약물] acc - 수용 웰에서 시험 화합물의 농도;
[약물] initial,d - 공여 웰에서 시험 화합물의 초기 농도; 및
Papp 는 10-6cm/sec로 표시된다.
C. 결과
화합물 1-4 및 31, 참조 화합물 이미프라민, 프로프라놀롤, 및 아테놀롤에 대한 A-B 투과도 데이터는 하기 표 7에 열거된다. 참조 화합물에 대한 A-B 투과도 값은 문헌 데이터(예를 들면, 문헌[Lau et al.(2004) Drug Metab. Dispos. 32:937-942; Fujikawa et al.(2005) Bioorg. Med. Chem. 13(15):4721-4732; Rubas et al.(1996) J. Pharm. Sci. 85(2):165-169] 참조)에 상응한다. 모든 시험 화합물의 투과도는 중간 내지 고 투과도로서 분류될 수 있다.
표 7. 화합물 1-4 및 31의 A-B 투과도 데이터
Figure pct00057
실시예 6: 화합물 1-4 및 31에 대한 마우스 간 마이크로솜에서의 대사 안정성의 평가
간 마이크로솜에서 화합물 1-4 및 31 및 2개의 참조 화합물(이미프라민 및 프로프라놀롤)의 대사 안정성을 HPLC-MS를 사용하여 40분 동안 5개의 시간점에서 결정하였다. 대사 안정성은 대사적으로 활성인 시험 시스템, 예를 들면, 설치류 간 마이크로솜 분획의 존재하에 시간에 따라 손실되는 모 화합물의 퍼센트로서 정의되었다.
A. 물질 및 장비
사용된 시약 및 소모품은 DMSO 크로마솔브 플러스, HPLC 등급, ≥99.7%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34869), 아세토니트릴 크로마솔브, 경사 등급, HPLC용, ≥99.9%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34851), 이염기성 인산칼륨 ACS 등급(Helicon, Cat# Am-O781), 이염기성 인산칼륨 ACS 등급(Helicon, Cat# Am-O705), 염화마그네슘 육수화물(Helicon, Cat# Am-O288), 풀링된, 수컷 BALB/c 마우스 간으로부터의 마이크로솜, 빵 효모(에스. 세레비시아(S. cerevisiae))로부터의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 유형 XV(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# G6378), 글루코스-6-포스페이트 나트륨 염, 시그마 그레이드(Sigma Grade), 결정질(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# G7879), NADPH 테트라나트륨 염, ≥95%(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 미국 소재; Cat# sc-202725), 질량 분석기를 위한 포름산, ~98%(Fluka, 미국 소재; Cat# 94318), 10 mM의 시험 화합물의 DMSO 스톡 용액, 프로프라놀롤 하이드로클로라이드 ≥99%(TLC), 분말(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# P0884), 이미프라민 하이드로클로라이드 ≥99%(TLC)(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Lot# I7379), 조르박스 이클립스 플러스 C18 컬럼 2.1Х50 mm, 3.5 ㎛(Agilent Technologies, Inc. 미국 소재), 및 마이크로랙 내의 1.1 mL 마이크로튜브, 피펫터 팁(Thermo Scientific, 미국 소재)을 포함하였다.
장비는 구배 HPLC 시스템 VP(Shimadzu, 일본 소재), 터보이온스프레이 일렉트로스프레이 모듈이 있는 MS/MS 검출기 API 3000 PE(PE Sciex, 미국 소재), VWR 막 질소 발생기 N2-04-L1466, 질소 순도 99%+(VWR, 미국 소재), 이노바 4080 인큐베이터 셰이커(New Brunswick Scientific, 미국 소재), 정수 시스템 나노퓨어 다이아몬드 D11911(Thermo Scientific Barnstead, 미국 소재), 원심분리기 4-15C(Qiagen)(Sigma, Germany), 및 다채널 전자 피펫 2-125 ㎕, 5-250 ㎕, 15-1250 ㎕, 매트릭스(Thermo Scientific, 미국 소재; Cat## 2001, 2002, 2004)를 포함하였다.
모든 측정은 진공 탈기기, 경사 펌프, 역상 HPLC 컬럼, 컬럼 오븐 및 오토샘플러를 포함하는 시마즈 VP HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. HPLC 시스템은 탠덤 질량 분석기 API 3000(PE Sciex)와 연결되었다. 터보이온스프레이(TurboIonSpray) 이온 공급원은 음성 및 양성 이온 방식 둘 다로 사용하였다. 데이터의 획득 및 분석은 애널리스트 1.5.2 소프트웨어(PE Sciex)를 사용하여 수행하였다.
B. 방법
마우스 간의 마이크로솜을 표준 프로토콜(Hill, J.R. in Current Protocols in Pharmacology 7.8.1-7.8.11, Wiley Interscience, 2003)에 따라 BALB/c 수컷 마우스의 풀링된(50), 관류된 간으로부터 단리하였다. 참조 화합물로서 이미프라민, 프로프라놀롤 및 베라파밀을 사용하여 마이크로솜의 배치를 품질 제어에 대하여 시험하였다. 마이크로솜 배양을 각각 40 ㎕의 5개의 분취액(각각의 시간에 대하여 1개)으로 96웰 플레이트에서 수행하였다. 간 마이크로솜 배양 배지는 PBS(100 mM, pH 7.4), MgCl2(3.3 mM), NADPH(3 mM), 글루코스-6-포스페이트(5.3 mM), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(0.67 단위/mL)를 mL당 간 마이크로솜 단백질 0.42 mg과 함께 함유하였다. 대조군 배양은 NADPH-공동인자 시스템을 PBS로 교체하여 수행하였다. 화합물 1-4 및 31(2 μM, 최종 용매 농도 1.6%)을 37℃에서 100 rpm으로 교반하에 마이크로솜과 함께 각각 배양하였다. 배양은 2중으로 수행하였다. 40 동안 5개의 시간점을 분석하였다. 90% 아세토니트릴-물의 12 부피를 배양 분취액에 가하여 반응을 중단시킨 후, 3분 동안 5500 rpm으로 원심분리하여 단백질 침강을 수행하였다. 탠덤 질량 분석기와 연결된 HPLC 시스템을 사용하여 상청액을 분석하였다. 선형 회귀 분석을 사용하여 ln(AUC) 대 시간의 플롯에서 제거 상수(kel), 반감기(t1/2) 및 고유 청소율(Clint)을 결정하였다:
Figure pct00058
선형 회귀 분석의 품질을 나타내기 위하여, R(상관 계수) 값이 제공되었다. 일부 경우에, 붕괴의 허용 가능한 로그 선형성을 보장하기 위하여 마지막 시간점을 계산으로부터 배제하였다.
C. 결과
2개의 참조 화합물(이미프라민 및 프로프라놀롤) 및 화합물 1-4 및 31에 대한 마우스 마이크로솜 안정성 데이터를 도 19A-19D에 나타낸다. 마우스 간의 마이크로솜 시험 시스템에서 화합물 4 및 31은 낮은 안정성을 보여주었고, 화합물 1 및 2는 중간 안정성을 나타냈고, 화합물 3은 높은 대사 안정성을 보여주었다. "공동인자가 없는" 대조군 데이터는 관찰된 불안정성이 CYP450 활성에 의해 주로 결정되었다는 것을 나타냈다.
실시예 7: 화합물 1-4 및 31에 대한 시험관내 CYP450 억제
단일 화합물 농도(10 μM)의 화합물 1-4 및 31에 의한 주요 CYP450 패널(1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4)의 억제의 예비 평가를 만들었다. CYP450 억제 프로파일링은 시험 화합물에 대한 임의의 가능한 약물-약물 상호작용에 관한 귀중한 정보를 제공한다.
A. 물질 및 장비
사용된 시약 및 소모품은 DMSO 크로마솔브 플러스, HPLC 등급, ≥99.7%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34869); 아세토니트릴 크로마솔브, 경사 등급, HPLC용, ≥99.9%(Sigma-Aldrich, 미국 소재; Cat# 34851); CYP 1A2(Cat# V9770), CYP 2C9(Cat# V9790), CYP 2C19(Cat# V9880), CYP 2D6(Cat# V9890), CYP 3A4(Cat# V9800), 및 루시페린-PPXE(Cat# V9910)을 포함하는 P450-GloTM 스크리닝 시스템(Promega Corp.); 코닝 검정 플레이트 384웰(Corning, 미국 소재; Cat# 3673); 및 매트릭스 96웰 검정 플레이트(Matrix, Thermo Scientific, 미국 소재; Cat# 4919)를 포함하였다.
장비는 다중방식 마이크로플레이트 리더 폴라스타 오메가(BMG Labtech GMBH, 독일 소재); 건식 서모스탯 CT50(Ukrorgsynthez, Ukraine; CT 50); 마이크로피펫 0.5-5 ㎕, 2-20 ㎕,15-200, 100-1000 ㎕(Finntip, Eppendorf, Gilson); 및 다채널 전자 피펫 1.0-30 ㎕, 매트릭스(Thermo Scientific, 미국 소재; Cat# 2060)를 포함하였다.
B. 방법
모든 실험은 제조사의 프로토콜에 따라 P450-GloTM 검정 시스템(Promega)을 사용하여 수행하였다. P450-GloTM 검정은 시토크롬 P450 활성을 측정하는 발광 판독 기반 방법을 제공한다. 시토크롬 P450 및 발광성 시토크롬 P450 기질을 배양함으로써 통상적인 시토크롬 P450 반응을 수행하였다. P450-GloTM 검정에서 기질은 딱정벌레 루시페린의 유도체이다. 유도체 그 자체는 루시페라제의 기질이 아니지만 시토크롬 P450에 의해 루시페린으로 전환되고, 이는 결국 루시페라제와 반응하여 광을 생성한다. 생성된 광의 양은 시토크롬 P450 활성에 정비례하였다. 모든 시험 점을 4중으로 수행하였다. 대조군 막(CYP가 없음)은 음성 대조군(기준선)을 나타냈다. DMSO 최종 농도는 0.25%이었다.
하기 참조 화합물을 사용하여 CYP 억제를 평가하였다:
Figure pct00059
알파-나프토플라본, 퀴니딘, 케토코나졸, 플루코나졸 및 오메프라졸의 농도는 프로메가(Promega) 프로토콜 권고의 4x 또는 문헌(예를 들면, 문헌[Li et al.(2004) Drug Metab. Dispos. 32(8):821-827; Niwa et al.(2005) Biol. Pharm. Bull. 28(9):1805-1808] 참조)에서 확인된 이들의 IC50의 4x로서 도시된다.
C. 결과
화합물 1-4 및 31에 대한 CYP 억제 프로파일은 하기 및 도 20A-20E에 도시된다. 10 μM의 농도에서, 화합물 3은 모든 5개의 시험된 CYP450의 매우 높은 억제를 보여주었다. CYP 1A2는 화합물 1 및 2에 의해 유의미하게 억제되었다. CYP 2D6은 화합물 31에 의해 유의미하게 억제되었다. 화합물 4는 임의의 CYP450 아형의 유의미한 억제를 보여주지 않았다.
1. 화합물 31에 대한 CYP 억제 프로파일
Figure pct00060
2. 화합물 1에 대한 CYP 억제 프로파일
Figure pct00061
3. 화합물 2에 대한 CYP 억제 프로파일
Figure pct00062
4. 화합물 3에 대한 CYP 억제 프로파일
Figure pct00063
5. 화합물 4에 대한 CYP 억제 프로파일
Figure pct00064
하기 실시예 8-11에 대한 실험 방법은 다음과 같다.
세포 배양 및 처리
모든 세포를 37℃에서 가습된 조건하에 유지하였다. CCCP(Sigma-Aldrich)를 배양 배지에 2x 스톡 농도로서 가하였다. 시험 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31을 엔아민(Enamine)에 의해 합성하고, 10 mM의 스톡 농도에서 DMSO(Sigma-Aldrich) 중에 용해시켰다. 분취액을 -80℃에서 저장하였다. HeLa 세포(ATCC) 및 태깅되지 않은 파킨, EGFP-파킨, 3xFLAG-파킨 C431S 또는 EGFP-파킨 및 mitoKeima를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 10% FBS(BioWest)를 함유하는 DMEM(Invitrogen) 중에서 배양하였다. 래트 부신 크롬친화성세포종 세포(PC12) 세포를 5% FBS 및 10% 말 혈청을 갖는 RPMI 중에서 성장시켰다. 분화를 위하여, 세포를 PBS 중에 세척하고, 1% 말 혈청을 함유하는 저 혈청 배지 중에 콜라겐 코팅된 플레이트 위에 플레이팅하였다. 세포는 100 ng/mL 신경 성장 인자(NGF)의 첨가에 의해 14일 동안 분화되었다.
일차 섬유아세포(Cell Applications)를 섬유아세포 성장 배지(FGM): 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM 중에 배양하였다. 짧은 헤어핀 RNA 표적화 폴리피리미딘-트랙-결합 단백질(shPTB)을 이용하여 뉴런으로의 직접적인 전환을 수행하였고, 이는 전뉴런성 마이크로-RNA 순환에 영향을 미친다(Xue et al., Cell(2013) 152:82-96). 세포를 40,000 세포/mL로 접종하고, 밤새 부착을 허용하였다. pLKO.1_shPTB 렌티바이러스에 의한 형질도입 후 48시간에, 양성 세포를 섬유아세포 성장 배지 중에서 2 ㎍/mL 푸로마이신과 함께 선택하였다. 제6일에 배지를 10 ng/mL 섬유아세포 성장 인자(FGF, Genscript)를 함유하는 FGM으로 바꾸었다. 제8일에, 배지를 5% FBS를 함유하는 분화 배지(DMEM:F12(Invitrogen), 25 ㎍/mL 인슐린, 50 ㎍/mL 트랜스페린, 0.1 μM 푸트레신 0.03 μM Na-셀레나이트(모두 Sigma-Aldrich), 및 15 ng/mL FGF)로 바꾸었다. 제10일 및 제12일에 배지를 감소된 혈청(2% FBS)을 함유하는 분화 배지로 교체하였다. 제14일에, 배지를 48시간 동안 2% FBS 및 0.01 ㎍/mL BDNF, GDNF, CNTF 및 NT3(모두 peprotech) 및 2%의 산화방지제 무함유 B27(Invitrogen)을 함유하는 분화 배지로 바꾸었다. 제16일에 성장 인자 및 B27을 함유하는 분화 배지에서 실험을 수행하였다.
샌드위치 ELISA 검정
ELISA 검정을 위하여, 96웰 표준 결합 플레이트(Mesoscale Discovery)를 항체(FLAG, Sigma, F3165 또는 pSer65-Ub, 둘 다 1:250)로 중탄산염 완충제(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.4) 중에서 밤새 코팅하고, 0.02% Tween-20을 함유하는 TBS(TBST) 중의 5% BSA로 블록킹하였다. 파킨 Ub-충전을 위하여, 세포 용해물을 RIPA 완충제(50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)) 중에 제조하였다. 용해물 25 ㎍을 플레이트로 가하고, 2시간 동안 배양하였다. pSer65-Ub를 정량하기 위하여, 세포 용해물을 NP-40 완충제(50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 및 0.5% NP-40) 중에 제조하고, TBST 중의 1% BSA에 의해 0.18% NP-40로 희석하였다. 용해물 6.25 ㎍을 플레이트에 밤새 가하고, 4℃에서 배양하였다. 일차 항체 배양 후, 플레이트를 세척하고, 마우스 검출 항체(Ub, CST, #3933 또는 Ub, Millipore, MAB150 둘 다 1:250)와 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 2차 설포-태그 컨쥬게이트된 항체를 1시간 동안 1% BSA/TBST 중에서 배양한 후, 플레이트를 메소스케일 디스커버리 섹터 이미저(Mesoscale Discovery Sector Imager) 2400를 사용하여 2x READ 완충제 중에서 측정하였다(둘 다 Mesoscale Discovery).
면역형광법
세포를 폴리-D-라이신 코팅된 유리 커버슬립 위에서 성장시켰다. 처리 후, 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, 각각 10분 동안, 1% 트리톤(Triton) X-100을 사용하여 투과시켰다. 세포를 10% 염소 혈청 중에 블록킹하였다. 일차 및 이차 항체를 1% BSA/PBS 중에 희석시키고, 각각 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 사용된 일차 항체: DNA(마우스, 1:250, Progen, AC-30-10), NBR1(마우스, 1:100, Abnova H00004077-M01), NDP52(토끼, 1:400, Proteintech, 12229-1-AP), OPTN(마우스, 1:200, Santa Cruz, sc-166576), p62(마우스, 1:400, BD Biosciences, 610832), pSer65-Ub(토끼, 1:500, 사내 제작(in-house)(Fiesel et al., EMBO Reports(2015) 16:1114-30; Fiesel et al., (2015) Autophagy 11:2125-2126)), TAX1BP1(토끼, 1:200, Cell Signaling, #5105), TOM20(마우스, 1:100, Santa Cruz, sc-17764), TOM20(토끼, 1:2000, Proteintech, 11802-1-AP). AlexaFluor-568 또는 -647(Invitrogen)에 컨쥬게이트된 2차 항체를 1:1000으로 희석하였다. 훽스트 33342(Invitrogen)를 1:5000로 희석하여 핵을 대비 염색하였다.
웨스턴 블롯
예열된(95℃) SDS 용해 완충제(50 mM Tris pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% SDS)가 사용되는 파킨 Ub 충전 실험을 제외하고, 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충제 또는 NP-40 용해 완충제(Complete and PhosStop, Roche Applied Science) 중에서 세포를 수확하였다. 세포 용해물의 농도를 비신코닌산(Pierce Biotechnology)으로 결정하였다. 파킨 Ub 충전 실험을 위하여, 용해물의 분취액을 0.1 M NaOH로 1시간 동안 37℃에서 처리하였다. pH는 등노르말(equinormal) HCl로 중화시켰다.
단백질에 4-20% 또는 8-16% 트리스-글리신 겔(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하고, 이를 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)(Millipore) 위로 옮겼다. 막을 밤새 4℃에서 일차 항체 후, HRP-컨쥬게이트된 이차 항체(1:10,000; Jackson ImmunoResearch Laboratories)와 배양하였다. 사용된 일차 항체: 베타 III 튜불린(토끼, 1:1000, CST, #5568, CST), FLAG(마우스, 1:250,000, Sigma, F3165), GAPDH(마우스, 1:100,000-500,000, Meridian Life science, H86504M), GST(1:10,000, Sigma, G7781), MFN1(마우스, 1:5,000, Abcam, ab57602), MFN2(마우스, 1:5,000, Abcam, ab56889), 파킨(마우스, 1:2,000, Cell Signaling, #4211), pSer65-Ub(토끼, 1:15,000, 사내 제작(Fiesel et al., EMBO Reports(2015) 16:1114-30; Fiesel et al., (2015) Autophagy 11:2125-2126)), TOM70(토끼, 1:5,000, Proteintech, 14528-1-AP), UBE2L3(토끼, 1:10,000, Proteintech, 14415-1-AP), VDAC1(마우스, 1:5,000, Abcam, ab14734), 빈쿨린(마우스, 1:100,000, Sigma, V9131).
미토콘드리아 탈분극 검정
JC10 검정 키트(Sigma, MAK159)를 사용하여 미토콘드리아 탈분극을 평가하였다. HeLa 파킨 세포를 70,000 세포/웰로 20 ㎕ 부피로 투명 바닥의 384웰 플레이트 내에 접종하였다. 다음 날 5 ㎕의 CCCP 또는 화합물을 5x 용액으로서 가하였다. 동등한 부피의 DMSO는 음성 대조군으로서 제공되었다. 세포를 4시간 동안 배양한 후, 완충제 A 중에 희석된 JC10 염료 12.5 ㎕를 웰에 가하였다. 1시간 후 반응을 완충제 B 12.5 ㎕로 중단시키고, 플레이트를 이중 형광(녹색: Ex 485 nm, Em 538 nm, 515 nm에서 컷오프(cut-off); 적색: Ex 544 nm, Em 590 nm, 570 nm에서 컷오프)을 사용하는 바닥 판독을 갖는 스펙트라맥스(Spectramax) M5 플레이트 리더(Molecular devices)에서 바로 측정하였다. 녹색 대 적색 비를 구성하여 미토콘드리아 탈분극을 평가하였다.
실시예 8: HeLa 세포에서 파킨의 효소 활성화
파킨 전좌에 대하여 확립된 일차 HCI 검정을 사용하여 화합물의 기능 시험을 수행하고, 이는 효소 활성화와 매우 관련이 있다(Fiesel et al., J. Cell Science(2014) 127:3488-3504; Fiesel et al., Human Mutation(2015) 36:774-786). 간단히 말해서, EGFP-파킨을 안정하게 발현하는 1400 HeLa 세포를 광학 384웰 플레이트(Greiner BioOne)에 배지 25 ㎕ 중에 접종하고, 40시간 동안 부착되도록 하였다. 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31을 플레이트에 2x 농축된 스톡으로서 가하였다. 대조군 웰을 배지에서 동등한 부피의 DMSO로 처리하였다. 2시간 후, 달리 기재되지 않는 한, CCCP를 2x 농축된 스톡으로서 PC 웰의 경우 10 μM 및 시험 및 NC 웰의 경우 3.5 μM의 최종 검정 농도로 가하였다. 이러한 저용량의 CCCP는 CCCP의 용량 반응 곡선에 의해 실험적으로 결정되어 파킨 전좌를 야기하지 않았다(도 13). 추가 2시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 10분 동안 고정하고, 훽스트 33342(1:5000, Invitrogen)로 염색한 후, 플레이트를 촬영하고 분석하였다.
이미지 획득은 악토비전(Attovision) V1.6 소프트웨어(BD Biosciences)와 함께 BD 패쓰웨이(Pathway) 855에서 수행하였다. 웰을 레이저 자동초점을 갖는 2x2 몽타주(montage)를 사용하여 20x 대물렌즈로 촬영하였다. EGFP 노출 시간은 0.0175초, 훽스트 0.0015초였다. 미가공 이미지를 처리하지 않고 빌드인(build-in) 'RING-2 출력' 알고리즘을 사용하여 직접 분석하였다. 값을 보내기(export)하고, JMP 11 소프트웨어를 사용하여 정규화하고, 품질 제어, 그래프화 및 4개의 파라미터를 사용하여 가변 경사로 DRC에 대한 곡선 적합을 위하여 그래프패드 프리즘 7로 옮겼다. 일차 스크리닝 검정은 전형적으로 5% 미만의 CV를 갖는 3.0-3.5의 S/B를 나타냈다. 값을 플레이트당 각각 24웰로부터 PC 및 NC 값 둘 다로 정규화하고, Z' 점수를 계산하였다. Z' < 0.5인 플레이트를 반복하였다.
고해상도 영상은 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31 및 저용량 CCCP에 의한 처리 후 미토콘드리아와 강화된 파킨 공편재화(co-localization)를 확인해주었다. 이러한 조합은 또한 항체 염색에 의해 검출되는 바와 같이 pSer65-Ub 미토파지 태그를 유도하였고(Fiesel et al., EMBO Reports(2015) 16:1114-30; Fiesel et al., Autophagy(2015) 11:2125-2126), 추가로 DRC 형식으로 HCI에 의해 정량되었다. 파킨 전좌와 비교하여, pSer65-Ub 신호 증폭에 대한 EC50 값은 유사하였다. 그러나, 더 높은 화합물 농도를 갖는 화합물 웰은 PC 웰과 비교하여 초과하는 pSer65-Ub 수준을 나타냈다(도 10). 어느 화합물에서도 심지어 고 농도에서도 세포 생존에 대한 현저한 효과는 관찰되지 않았다. 화합물 단독 또는 저용량 CCCP 처리(NC) 중 어느 것도, 심지어 연장된 시간 점 후에도, 파킨 전좌를 활성화시키거나 pSer65-Ub 신호 증폭을 유도하는데 충분하지 않았다.
이의 활성화에 대한 판독으로서, Ub-충전된 파킨을 가두는데 사용될 수 있는 촉매 부위 돌연변이가 사용될 수 있다. 3xFLAG-파킨 C431S를 안정하게 발현하는 HeLa 세포를 사용하여, 상향 이동된 밴드에 의해 지시되는 바와 같이, Ub-충전된 파킨은 일반적으로 웨스턴 블롯 또는 샌드위치 ELISA에 의해 볼 수 있듯이 화합물과 함께 증가하였다. 강화된 활성화에 대한 효과를 추가로 입증하기 위하여, 우리는 태깅되지 않은 음성 파킨을 발현하는 HeLa 세포를 사용하였다. 10 μM CCCP에 의한 PC 처리는 pSer65-Ub 신호 및 일부 기질(예를 들면, 미토푸신)의 완전한 분해를 유도하였고, 대부분의 풍부한, VDAC1은 여전히 유비퀴틴화되었다(도 8). 유사한 효과는 세포가 저용량 CCCP 전에 화합물 5 μM로 예비 배양된 경우에 볼 수 있었고, 이는 그 자체로는 효과를 갖지 않았다.
실시예 9: HeLa 세포주에서 다운스트림 미토파지 활성화
경로에서 추가의 다운스트림에서 파킨의 활성화를 입증하기 위하여, HeLa EGFP-파킨 세포에서 미토콘드리아에 대한 내인성 자가소화작용 수용체의 공동 동원(co-recruitment)을 분석하였다. 이들 이중 어댑터는 손상된 미토콘드리아 위의 pSer65-Ub 사슬을 인식하고, 이들의 LC3 단백질과의 상호작용을 통해 자가포식소체 막에 의해 이들의 흡인을 촉진한다(Lazarou et al., Nature(2015) 524:309-14; Heo et al., Mol. Cell(2015) 60:7-20).
pSer65-Ub 분석(Puschmann et al., Brain(2017) 140:98-117(2017); Fiesel et al., EMBO Reports(2015) 16:1114-30(2015); Ando et al., Mol. Neurodegen.(2017) 12:32)을 위하여, EGFP-파킨 HeLa 세포를 상기와 같이 접종하고 처리하였다. 고정 후, 세포를 PBS 중의 1% 트리톤 X-100로 10분 동안 투과시키고, 10% 염소 혈청 중에서 1시간 동안 블로킹하였다. 일차 항-pSer65-Ub 항체(PBS 중의 1% BSA 중의 1:500) 20 ㎕를 웰당 가하고, 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 염소 항-토끼 AlexaFluor-568 항체를 1시간 동안 가하였다. 핵을 훽스트 33342(PBS 중의 1:5000)로 대비 염색한 후, 적색 형광(노출 시간 0.05초)에 대한 추가 획득과 함께 상기 기재된 바와 같이 플레이트를 촬영하였다. pSer65-Ub 신호를 세포질 고리에서 신호 강도로서 상기와 같이 침강 후 분석하였다.
모든 5개의 화합물(1, 2, 3, 4, 및 31)은 손상된 미토콘드리아에서 파킨과 OPTN 및 NBR1, NDP52, p62, 및 TAX1BP1의 공편재화를 증가시켰다. 자가소화작용 어댑터의 강화된 동원과 수반하여, 면역형광 염색에서 미토콘드리아 DNA의 강력한 감소가 관찰되었다.
미토파지를 확인하기 위하여, pH-감응성, 미토콘드리아표적화 수용체 mitoKeima46을 발현하는 HeLa 세포를 사용하였다. 리소좀 융합 상의 mitoKeima의 여기 파장에서 특징적 이동을 사용하여 HCI를 사용하는 미토콘드리아 턴오버를 결정하였다. mitoKeima 실험(Kim et al., Mol. Neurodegen.(2016) 11:55)을 위하여, 세포를 웰당 20 ㎕으로 페놀 레드가 결핍된 DMEM 배지 중에 접종하였다. 훽스트 대비 염색을 5x 스톡으로서 5 ㎕ 부피로 가하였다. 세포를 상기와 같이 화합물 및 CCCP의 2x 스톡 용액으로 처리하였다. 동량의 DMSO를 대조군으로서 사용하였다. 세포를 라이브 촬영하고 각각의 시간 점에 대하여 자동초점을 사용하였다. 중성 및 산성 mitoKeima의 노출 시간은 각각 0.02 및 0.05초이었다. 세포의 침강을 상기와 같이 수행하고, 흥미있는 각각의 영역에 대하여 산성 및 중성 mitoKeima의 비를 계산하였다. 값을 양성 및 음성 대조군으로 정규화하였다.
다양한 CCCP 농도(≥1 μM)와 조합으로 화합물 4에 의한 처리는 고용량 양성 대조군과 유사한, 미토파지의 용량 및 시간 의존성 증가를 야기하였다(도 9). 피크 값은 미토콘드리아의 일부분이 이미 제거되었다는 것을 나타내는 처리 8시간 후 수득되었다. 저용량 CCCP 단독(3.5 μM 이하)으로 처리된 세포는 심지어 더 낮은 시간 점에서도 mitoKeima 산성화의 어떠한 증가도 나타내지 않았다. 미토파지 검정에 대한 EC50 값을 결정하기 위하여, 화합물 1, 2, 3, 4, 및 31을 DRC 형식으로 시험하였다. 4 및 8시간 후 데이터 점의 곡선 적합은 군 내에서 효능의 관점에서 다른 정량적 검정과 동일한 경향을 야기하였다(도 10). 화합물의 활성은 파킨 전좌 및 pSer65-Ub 증폭 검정에서의 이들의 효능과 유사한 나노몰 내지 마이크로몰 범위였다.
실시예 10: 일차 세포 및 뉴런 배양에서 파킨 활성화
일차 세포에서 파킨 활성화 약물을 입증하기 위하여, 화합물 4를 인간 피부 섬유아세포에서 상이한 저용량 CCCP 농도와 조합으로 시험하였다. HeLa 세포와 유사하게, 3.5 μM CCCP 단독은 미토파지 반응을 유도하는데 충분하지 않았다. 세포가 화합물 4 후, 저용량 CCCP로 예비 처리된 경우, 파킨 기질 MFN1/2의 강화된 유비퀴틴화가 관찰되었다(도 15A). 일관하여, 화합물 4에 의한 처리는 저용량 CCCP의 존재하에 pSer65-Ub 수준을 유의미하게 유도하였다(도 18A). 이러한 NC 농도를 사용하여 모든 5개의 화합물을 나란히 시험하였고, 모든 5개의 화합물이 어느 정도 반응을 유도하고 화합물 1 및 4는 MFN1/2 분해 및 pSer65-Ub 유도에 가장 강한 효과를 나타냈다는 것을 확인하였다(도 15B). CCCP의 부재하에, 화합물은 일차 섬유아세포에서 어떠한 mitoQC 반응도 유도하지 않았다. 추가로, 파킨 전좌에 대한 EC50보다 10배 높은 농도의 화합물은 mitoQC 반응을 유도하지 않았다(도 16B).
다음으로, 유도된 뉴런(i뉴런)을 섬유아세포 배양으로부터 생성시켰다. 뉴런 전환은 뉴런 마커 베타-III-튜불린에 의해 확인되었다. MFN1 유비퀴틴화에 대한 감지하기 힘든 효과만이 존재하였지만, 모든 5개의 화합물은 pSer65-Ub 수준을 강력하게 유도하였다(도 15C). 화합물이 또한 동물 모델에서 사용될 수 있다는 것을 보장하기 위하여, 래트 PC-12 세포에서 내인성 파킨을 활성화시키는 이의 능력을 시험하였다. 여기서 3.5 μM CCCP 단독이 pSer65-Ub를 약간 유도하였음에도 불구하고, 모든 5개의 화합물은 분화되지 않은 세포(도 15D 및 도 16C) 및 뉴런 분화된 세포(도 15D)에서 pSer65-Ub를 강력하게 유도하였다. 그럼에도 불구하고, 화합물로 예비 처리된 세포는 더욱 현저한 기질 유비퀴틴화 및 10 μM CCCP로 처리된 PC 세포와 유사한 분해를 보여주었다(도 15C 및 도 16C-16D 참조).
실시예 11: 시험관내 효소 활성 및 약물 결합
화합물의 적중한 효과를 증명하기 위하여, 재조합, 정제된 파킨 단백질에 의한 시험관내 검정을 수행하였다. 파킨 활성에 대한 제1 판독으로서, 세포에서 파킨 C431S의 Ub-충전 검정을 보완하는 E2 Ub 배출 검정을 수행하였다. UbcH7을 먼저 Ub와 함께 로딩한 다음, 화합물 4 또는 대조군으로서 DMSO와 함께 예비 배양된 파킨과 혼합하였다. 오직 PINK1의 존재하에, 화합물 4는 대조군과 비교하여 더 많은 E2 배출을 야기하였고, 이는 E3 효소로의 강화된 Ub 수송과 일치한다(도 15E). 시험관내 E2 배출 검정은 하기와 같이 수행하였다.
E2 효소의 Ub-충전은 90분 동안 30℃에서 0.1 μM GST-E1, 3.3 μM E2/UbcH7, 10 μM FLAG-Ub 및 0.188 μM PINK1(모두 R&D systems)을 함유하는 반응물 중에 수행하였다. 별개의 반응물에서 0.75 μM 파킨(Ubiquigent)을 20 μM 화합물 4(또는 동등한 부피의 DMSO)와 함께 예비 배양하였다. 두 반응물 모두 Ub 완충제(최종 농도: 20 mM HEPES pH 7.2, 10 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 500 μM TCEP 및 10% ATP 재생 시스템(20 mM HEPES pH 7.6, 10 mM ATP, 300 mM 크레아틴 인산, 10 mM MgCl2, 10% 글리세롤, 1.5 mg/mL 크레아틴 포스포키나제(모두 Sigma Aldrich))) 중에 희석하였다. 1U 아피라아제(Sigma)를 반응물 9 ㎕당 가하고, 두 반응물을 모두 조합하고, 추가 30분 동안 배양하였다. 1xLDS 완충제 100 ㎕를 반응물 10 ㎕당 가하고, 샘플을 -/+ DTT(20 mM 최종)으로 나누었다
파킨 리가아제 활성을 위한 기질을 제공하기 위하여, 세포외 유비퀴틴화 검정을 위한 미토콘드리아 분획을 제공하였다. 이들 샘플은 PINK1를 발현하지만 파킨이 결핍되고, 미처리된 채로 남아 있거나 10 μM CCCP로 2시간 동안 처리된 HeLa 세포로부터 제조하였다. 분취액을 재조합 정제된 E1, E2, Ub 및 파킨 뿐만 아니라 ATP 및 화합물 4 또는 대조군으로서 DMSO를 함유하는 반응물 중에 재현탁시켰다. MFN1의 모노-유비퀴틴화가 화합물의 부재하게 관찰되었지만, 폴리-유비퀴틴화는 화합물 4를 반응물에, 특히 더 짧은 시간 점에서, 가한 경우에 강력하에 유도되었다(도 15E). 특히, 미토콘드리아가 미처리된 채로 남아 있는 세로포부터 단리된 경우 효과가 존재하지 않았다(즉, PINK1 없음).
미토콘드리아 제조에 의한 시험관내 검정을 하기와 같이 수행하였다. HeLa 세포를 미처리된 채로 두거나 10 μM CCCP로 2시간 동안 처리하였다. 세포를 용액 B(EDTA-무함유 컴플리트(Complete) 및 포스스탑(PhosStop)을 함유하는 20 mM HEPES pH 7.6, 220 mM 만니톨, 70 mM 수크로스, 10 mM KAc) 중에서 수확하고, 23G 니들을 통한 10 스트로크 후, 27G 니들을 통한 10 스트로크로 균질화시켰다. 용해물을 5분 동안 800 g으로 원심분리하고, 상청액을 20분 동안 8000 g으로 회전시켜 미토콘드리아를 펠렛화시켰다. 미토콘드리아 펠렛을 용액 B 중에 재현탁시키고, 단백질 농도를 BCA로 결정하였다. 50 ㎍의 분취액을 제조하고, 20,000 g으로 5분 동안 회전시키고, 상청액을 제거하고, -80℃에서 저장하였다. 시험관내 반응물을 용액 B 완충제 중에 제조하였고, 이는 45 μM Ub, 0.1 μM GST-E1, 1 μM E2/UbcH7, 2 mM DTT 및 반응물 10 ㎕당 ATP 재생 시스템 1 ㎕를 함유하였다. 0.75 μM 파킨을 갖는 반응물을 화합물(20 μM) 또는 DMSO을 가하기 전에 상이한 반응물로 나뉘는 하나의 혼합물로서 제조하였다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 10 ㎕를 미토콘드리아 50 ㎍당 가하였다. 샘플을 30℃에서 지시된 시간 점 동안 배양하고, 원심분리하고, 용액 B로 1회 세척한 후, 미토콘드리아 펠렛을 100 mM DTT 및 1% 트리톤 X-100을 함유하는 LDS 완충제 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 반응물의 상청액(8 ㎕)을 구하고, 2x LDS 완충제 32 ㎕와 혼합하였다. 샘플을 겔 로딩 전에 35℃ 교반하에 30분 동안 가열하였다.
실리코 접근법으로부터 예상되는 바와 같이 파킨에 대한 활성화 화합물의 직접적인 결합을 입증하기 위하여, 써모플루오르(thermofluor) 이동 검정을 사용하였다. 재조합 정제된 파킨을 화합물 4 또는 대조군으로서 DMSO와 혼합하고, SYPRO 오렌지 염료를 사용하여 용융 온도를 모니터링하였다. 화합물 4의 첨가는 파킨의 용융 온도를 유의미하게 상승시켰고(도 15G-15H), 이는 파킨과 약물의 직접적인 회합을 제시한다. 이러한 결과는 세포 배양 데이터 및 시험관내 실험과 함께 파킨의 PINK1-의존성 프라이밍이 MDS로부터 예상되는 바와 같이 화합물의 활성에 필요하다는 것을 확증한다.
열 이동 검정을 하기와 같이 수행하였다. 샘플(5 ㎕)당, 파킨(Ubiquigent) 50 ng을 1/50 희석된 SYPRO 오렌지(Invitrogen) 0.5 ㎕, 10x 완충제(200 mM HEPES pH 7.6, 100 mM MgCl2, 20 mM DTT 및 1 mM EGTA) 0.5 ㎕ 및 0.5 μM 화합물 또는 동량의 DMSO와 혼합하였다. 샘플을 ℃당 10 획득으로 용융 곡선 분석으로 라이트사이클러(LightCycler) 480 시스템(Roche Applied Science)에서 불투명 384웰 플레이트에서 수행하였다. 데이터를 보내기하고, 단백질 용융 분석 도구(Roche Applied Science)를 사용하여 분석하였다.
실시예 12: 유비퀴틴에 대한 파킨 결합
HeLa 3xFLAG-파킨 C431S 세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 밤새 부착되도록 하였다. 세포를 1 μM의 화합물 5, 21-28, 32, 33, 또는 43-46으로 2시간 처리한 후, 추가 2시간 동안 CCCP를 첨가하였다. 10 μM CCCP를 양성 대조군(PC) 웰에 가하고, 3.5 μM CCCP를 화합물(+) 및 음성 대조군(NC) 웰에 가하였다. 일부 샘플은 CCCP를 수용하지 않았다(-). 세포를 끓을 정도로 뜨거운 SDS 용해 완충제 중에서 수확하고, 단백질 농도를 BCA로 결정하였다. 샘플을 나누고, 미처리된 채로 두거나 지시된 바와 같이 NaOH로 처리하였다. 샘플을 8-16% 트리스-글리신 겔에서 수행하고, 막 위에 블롯팅하고, Flag에 대항하는 항체로 프로빙하였다. 빈쿨린은 로딩 대조군으로서 역할을 하였다. 밴드 이동은 유비퀴틴에 대한 카핀 결합을 나타내고, 이는 NaOH에 의해 절단될 수 있다(도 21).
참조 포함
본원에서 언급된 각각의 특허 문서 및 과학 기사의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로서 포함된다.
등가물
개시내용은 이의 정신 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 상기 실시양태는 따라서 본원에 기재된 개시내용에 대한 제한보다는 모든 예시적인 측면으로 간주된다. 개시내용의 범위는 따라서 상기 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 지시되며, 청구항의 등가물의 의미 및 범위 내에 속하는 모든 변화는 그 안에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (114)

  1. 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00065

    상기 식에서,
    A는 CH 또는 O이고;
    B는 CH 또는 N이고;
    D는 C 또는 N이고;
    E는 CH 또는 N이고;
    W는 C 또는 N이고;
    X는 C 또는 N이고;
    Y는 C 또는 N이고;
    Z는 C 또는 N이고;
    R1은 H, C1-4 알킬, 페닐, 또는 hetAr1이고;
    R2는 H이고;
    R3은 H이고;
    또는 R2 및 R3은, Y 및 X와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
    R7은 H이고;
    또는 임의로, n이 0인 경우, R1 및 R7은, 이들이 결합된 원자와 함께, 6원 사이클로알킬 고리를 형성하고;
    R4는 H, C1-4 알킬, 할로겐, CF3, 또는 페닐이고;
    R5는 H, C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 할로겐으로 임의로 치환된 페닐, (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), S(C1-4 알킬), S(C4-6 사이클로알킬), (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1), het Ar1, 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)이고;
    R6은 H 또는 C1-4 알킬이고;
    hetAr1은 C1-4 알킬로 임의로 치환된 1-3개의 고리 질소 원자를 갖는 6원 헤테로아릴 고리이고;
    hetCyc1은 질소인 하나 이상의 고리 헤테로원자를 갖는 6-10원 이환식 고리이고, 고리 중 하나 이상은 방향족이고;
    m은 0 또는 1이고;
    n은 0 또는 1이고;
    p는 0 또는 1이고;
    점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, A가 CH인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 CH인 화합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, B가 N인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, A가 O이고, B가 N인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, D가 C인 화합물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, D가 N인 화합물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, E가 CH인 화합물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, E가 N인 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, W가 N인 화합물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, W가 C인 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X가 C인 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 C인 화합물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 N인 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 N인 화합물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 C인 화합물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H인 화합물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 C1-4 알킬 또는 hetAr1인 화합물.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸, 이소프로필, 페닐, 또는 피리딘인 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 H인 화합물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 Cl, CF3, 메틸 또는 페닐인 화합물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 H 또는 할로겐으로 임의로 치환된 페닐인 화합물.
  23. 제22항에 있어서, R5가 F로 치환된 페닐인 화합물.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 (C1-3 알킬)O(C4-6 사이클로알킬), O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로알킬), 또는 CN으로 임의로 치환된 O(페닐)인 화합물.
  25. 제24항에 있어서, C4-6 사이클로알킬이 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실인 화합물.
  26. 제24항에 있어서, R5가 (C1-3 알킬)O(사이클로펜틸) 또는 O(C1-4 알킬)(C4-6 사이클로헥실)인 화합물.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 C1-4 알킬, C4-10 사이클로알킬, 또는 (C1-3 알킬)(C4-9 hetCyc1)인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, hetCyc1이 하나 이상의 질소 원자를 갖는 9원 이환식 고리인 화합물.
  29. 제28항에 있어서, hetCyc1이 이소인돌린인 화합물.
  30. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 S(C1-4 알킬) 또는 S(C4-6 사이클로알킬)인 화합물.
  31. 제30항에 있어서, C4-6 사이클로알킬이 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실인 화합물.
  32. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, R5가 hetAr1인 화합물.
  33. 제32항에 있어서, hetAr1이 C1-4 알킬로 임의로 치환된 피리딘 또는 피리미딘인 화합물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, R6이 H인 화합물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, n이 0인 화합물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인 화합물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, p가 0인 화합물.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1인 화합물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure pct00066

    Figure pct00067

    Figure pct00068

    Figure pct00069

    Figure pct00070
    및
    Figure pct00071
  40. 화학식 II의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00072

    상기 식에서,
    A는 CH, N, 또는 S이고;
    B는 CH, N, O, 또는 S이고;
    D는 C 또는 N이고;
    E는 CH 또는 N이고;
    L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
    W는 CH, CH2, N, 또는 NRa이고;
    X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
    Y는 CH, CH2 또는 O이고;
    Z는 N 또는 CR2'이고;
    R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
    R2는 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌이고;
    R2'는 H 또는 C1-6 알킬이고;
    또는 Z가 CR2', R2 및 R2'인 경우, C와 함께, C1-6 헤테로사이클릭 고리를 함께 형성할 수 있고;
    R3은 H, 할로겐, C1-3 알킬, C3-6 사이클로알킬, 또는 C1-3 알콕시이고;
    R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    Rb는 C1-3 알킬이고;
    m은 0, 1 또는 2이고;
    n은 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이고;
    점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있고;
    단, n이 2이고, R1이 메틸이고, D가 C이고, R3이 H이고, A, B, 및 E가 모두 CH인 경우, W, X, 및 Y 중 하나 이상은 CH2가 아니다.
  41. 화합물 제40항에 있어서, A가 CH인 화합물.
  42. 제40항에 있어서, A가 N인 화합물.
  43. 제40항에 있어서, A가 S인 화합물.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, B가 CH인 화합물.
  45. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, B가 N, O, 또는 S인 화합물.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, D가 C인 화합물.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, E가 CH인 화합물.
  48. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, E가 N인 화합물.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, L이 C1-3 알킬렌인 화합물.
  50. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, L이 메틸렌인 화합물.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, W가 CH2인 화합물.
  52. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, W가 N인 화합물.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X가 CH2인 화합물.
  54. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X가 CH인 화합물.
  55. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, X가 NRb인 화합물.
  56. 제55항에 있어서, Rb가 메틸인 화합물.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 CH2인 화합물.
  58. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 CH인 화합물.
  59. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 N인 화합물.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 존재하지 않는 것인 화합물.
  61. 제40항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 CR2'인 화합물.
  62. 제61항에 있어서, R2 및 R2'가, C와 함께, 1개의 질소 원자를 갖는 5원 헤테로사이클릭 고리를 형성하는 것인 화합물.
  63. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H인 화합물.
  64. 제40항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 메틸인 화합물.
  65. 제40항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, Ra가 H 또는 메틸인 화합물.
  66. 제40항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, Rb가 메틸인 화합물.
  67. 제40항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 H, 할로겐, 또는 C3-6 사이클로알킬인 화합물.
  68. 제67항에 있어서, R3이 염소인 화합물.
  69. 제67항에 있어서, R3이 사이클로프로필인 화합물.
  70. 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, R4 및 R4'가 각각 H인 화합물.
  71. 제40항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, R4 및 R4'가 각각 메틸인 화합물.
  72. 제40항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, n이 1인 화합물.
  73. 제40항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, n이 2인 화합물.
  74. 제40항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, m이 1 또는 2인 화합물.
  75. 제40항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, p가 0인 화합물.
  76. 제40항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, p가 1인 화합물.
  77. 제40항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 하기 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 화합물:
    Figure pct00073

    Figure pct00074

    Figure pct00075
    및
    Figure pct00076
  78. 제40항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 화학식 IIa의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 화합물:
    Figure pct00077

    상기 식에서,
    A는 CH 또는 N이고;
    B는 N, O, 또는 S이고;
    D는 C 또는 N이고;
    E는 CH 또는 N이고;
    W는 CH2 또는 NRa이고;
    X는 CH, CH2, N, 또는 NRb이고;
    Y는 CH, CH2 또는 O이고;
    L은 C1-3 알킬렌 또는 C(=O)이고;
    R1은 H 또는 C1-3 알킬이고;
    R3은 C1-3 알킬 또는 C1-3 알콕시이고;
    R4는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    R4'는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    Ra는 H 또는 C1-3 알킬이고;
    Rb는 C1-3 알킬이고;
    n은 1 또는 2이고;
    m은 0, 1 또는 2이고;
    p는 0 또는 1이고;
    점선은 단일 또는 이중 결합일 수 있다.
  79. 제40항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 화학식 IIb의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인 화합물:
    Figure pct00078

    상기 식에서,
    R1은 C1-3 알킬이고;
    R5는 (C1-3 알킬)페닐이다.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  81. 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 방법.
  82. 제81항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가아제가 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 활성화 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 효소 활성이 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화되거나 강화되는 것인 활성화 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 미토콘드리아 품질 제어를 자극하는 것인 활성화 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 리가아제의 자가억제를 방해하는 것인 활성화 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는 것인 활성화 방법.
  87. 제86항에 있어서, 효소 활성이 질환, 노화, 또는 노화 관련 질병으로 인하여 약화되는 것인 활성화 방법.
  88. 제87항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 조로증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 활성화 방법.
  89. 제88항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병인 활성화 방법.
  90. 제88항에 있어서, 질환 또는 질병이 암인 활성화 방법.
  91. 제90항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 활성화 방법.
  92. 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가아제가 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 조로증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 질환 또는 질병이 암인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  98. 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법으로서,
    (a) 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성과 연관된 질환 또는 질병을 검출하는 단계; 및
    (b) 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 질병을 치료하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가아제가 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병, 파킨슨증, 알츠하이머병, 치매, 근위축성 측삭 경화증, 전측두엽성 치매, 자폐증, 우울증, 나병, 봉입체 근염, 진성 당뇨병, 당뇨병성 신장 질환, 간 질환, 리소좀 축적 질환, 신경 질환, 근육 질환, 미토콘드리아병, 및 암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  101. 제100항에 있어서, 질환 또는 질병이 파킨슨병인 방법.
  102. 제100항에 있어서, 질환 또는 질병이 암인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  104. 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체에서 파킨슨병을 검출하는 단계; 및
    (b) 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 파킨슨병을 치료하는 방법.
  105. 대상체에서 노화 관련 질병을 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체에서 노화 관련 질병을 검출하는 단계; 및
    (b) 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 노화 관련 질병을 치료하는 방법.
  106. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체에서 암을 검출하는 단계; 및
    (b) 대상체에게 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 상체에서 암을 치료하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 암이 간암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장암, 췌장암, 간세포암종, 신경교종, 피부 흑색종, 투명 세포 신장 세포암종, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평 세포암, 직장결장암, 췌장 선암종, 선낭 암종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 방광 요로상피암, 두경부 편평 세포 암종, 식도 선암종, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 및 자궁내막모양암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  108. 세포를 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 E3 유비퀴틴 리가아제의 효소 활성을 활성화시키는 방법.
  109. 제108항에 있어서, E3 유비퀴틴 리가아제가 파킨, ARIH1(HHARI), ARIH2(TRIAD1), RNF31(HOIP), RBCK1(HOIL-1L), MUL1(MAPL, MULAN), MARCH5(MITOL), E3A, mdm2, 후기 촉진 복합체(APC), UBR5(EDD1), SOCS, LNXp80, CBX4, CBLL1, HACE1, HECTD1, HECTD2, HECTD3, HECW1, HECW2, HERC1, HERC2, HERC3, HERC4, HUWE1, ITCH, NEDD4, NEDD4L, PPIL2, PRPF19, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, RANBP2, RNF4, RBX1, SMURF1, SMURF2, STUB1, TOPORS, TRIP12, UBE3A, UBE3B, UBE3C, UBE4A, UBE4B, UBOX5, UBR5, WWP1, 및 WWP2로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  110. 제108항 또는 제109항에 있어서, 효소 활성이 미토콘드리아 스트레스 동안 활성화되는 것인 방법.
  111. 제108항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 미토콘드리아 품질 제어를 자극하는 것인 방법.
  112. 제108항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물이 리가아제의 자가억제를 방해하는 것인 방법.
  113. 제108항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 약화된 E3 유비퀴틴 리가아제 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  114. 제108항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 시험관내인 방법.
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