KR20190028468A - 마이크로유체 장치에서의 버블 제거 - Google Patents

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KR20190028468A
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Abstract

유동이 중지되지 않는 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하는 방법이 기술된다. 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하기 위하여 압력과 유량을 조합하는 방법이 기술된다. 장치가 거의 기체 비투과성인 중합체로 구성되는 경우에도 버블이 제거될 수 있다.

Description

마이크로유체 장치에서의 버블 제거
유동이 중지되지 않는 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하는 방법이 기술된다. 실제로는, 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하기 위하여 압력과 유량을 조합하는 방법이 기술된다. 장치가 거의 기체 비투과성인 중합체로 구성되는 경우에도 버블이 제거될 수 있다.
부주의로 마이크로유체 시스템에 도입된 버블은 장치 가동에 상당히 부정적인 영향을 줄 수 있다. 이러한 장치를 무-버블(bubble-free) 조건하에서 가동 및 충전하는 것은 거의 불가능하다. 이는, 통상적으로 세포 접종 전에 표면의 멸균 및 사전-컨디셔닝을 필요로 하는 마이크로유체 관류 배양 시스템에서 특히 그러하다.
버블이 성장 영역으로 진입하는 경우, 저조한 세포 생존력이 초래될 수 있다. 버블은 통상적으로 세포에 대하여 세포독성이며, 그의 세포막을 파열시킬 것이다. 또한, 버블은 혼합 및 유동을 방해할 수 있다. 이에 따라, 마이크로유체 시스템은 세포 배양 동안의 임의의 시점에 장치로 도입되는 작은 버블에도 극히 민감하다.
버블-기반 문제를 저감하기 위한 한 가지 해결책은 마이크로유체 특징부들을 통합하여 버블이 장치의 중요한 영역에 진입하는 것을 방지하는 것이다. 일반적으로, 하기의 두 가지 서로 다른 접근법이 존재한다: 포획(trapping) 대 탈포(debubbling). 버블 트랩(trap)은 장치를 통한 버블의 더 이상의 진행을 중지시키는 유동 시스템에 통합된 구조이다. 포획 접근법은 장치 가동이 유지되면서도 버블이 포획된다는 장점을 가진다. 그러나, 버블 트랩은 시스템으로부터 버블을 제거하지는 않기 때문에, 그것이 완전히 버블로 충전될 수 있다. 이와 같은 시점에서는, 모든 추가적인 버블들이 시스템을 통하여 전송됨으로써 문제를 초래한다. 또한, 트랩이 시스템 내의 모든 버블을 포획할 수는 없다.
트랩의 대안은 문헌 [Kang et al. Lab Chip 8: 176-178 (2008)]에 의해 입증되어 있는 탈포이다. 그것은 능동적으로 시스템으로부터 버블을 제거하였다. 이와 같은 방법은 PDMS의 기체 투과도에 의존하는데, 양의 압력을 사용하여 채널로부터 중합체로 버블을 밀어낸다. 여기에서 장점은 버블이 시스템으로부터 제거된다는 것이다. 그러나, 이를 달성하기 위해서는, 장치가 밀봉되어야 하며, 유동이 중지되어야 하고, 장치가 중합체를 통하여 밖으로 버블을 밀어내도록 가압되어야 한다. 마이크로유체 관류 시스템의 경우, 이는 세포로의 배지 공급이 중지되고, 환경 세포를 변경하며, 영양 결핍으로 이어질 가능성이 있다는 것을 의미한다.
필요한 것은 유동이 중지되지 않는 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하는 방법이다.
마이크로유체 장치의 마이크로채널 내에 하나 이상의 버블을 포함하는, 유동이 중지되지 않는 마이크로유체 장치로부터 기체 또는 공기 버블을 제거하는 방법이 기술된다. 실제로는, 압력과 유량을 조합하여 마이크로유체 장치로부터 버블을 제거하는 방법 실시양태가 기술된다. 장치가 거의 기체 비투과성인 중합체로 구성되는 경우에도 버블이 제거될 수 있는데, 방법 실시양태가 중합체를 통하여 밖으로 버블을 밀어내는 것을 포함하지 않기 때문이다. 일 실시양태에서는, 마이크로채널의 적어도 일부가 그것이 친수성이 되도록 (또는 적어도 더 친수성이 되도록) 처리된다.
일 실시양태에서, 본 발명은, a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 버블을 포함하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 b) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법을 고려한다. 개체 투과성 중합체 이외에, 바람직한 실시양태에서 상기 마이크로채널은 실질적으로 기체 비투과성인 중합체로 구성된다. 어떠한 특정 기체 비투과도 측정치로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니나; 일 실시양태에서, 그것은 산소 투과 속도에 의해 평가된다 (예컨대 0.2 cc/100 in2/일 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 cc/100 in2/일 미만, 더욱 더 바람직하게는 0.01 cc/100 in2/일 미만 수준의 산소 투과 속도 특성).
실질적으로 기체 비투과성인 어떠한 특정 중합체로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 일 실시양태에서, 상기 중합체는 시클릭 올레핀 중합체이다.
일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통한다.
일 실시양태에서, 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 관류 매니폴드(perfusion manifold) 내에 존재한다 (그리고 상기 용기들도 관류 매니폴드 내에 존재함). 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 마이크로유체 칩(chip)과 맞물려 있으며 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 스커트(skirt)를 포함하며, 상기 스커트가 상기 마이크로유체 칩과 맞물리게 하는 측면 트랙(track)을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로유체 칩은 하나 이상의 포트(port)를 포함하며, 상기 관류 매니폴드는 상기 하나 이상의 포트를 통하여 상기 마이크로유체 칩과 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 상기 하나 이상의 포트를 통하여 일정 유량으로 상기 마이크로유체 칩에 유체를 전달한다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로유체 장치는 상기 마이크로채널 내에 생존 세포를 포함하며, 상기 유체는 상기 생존 세포에 공급되는 (예컨대 도 1a 및 1b에 나타낸 유형의 관류 매니폴드를 통함) 배지를 포함한다. 일 실시양태에서, 단계 b) 전의 상기 배지는 탈기된 것이다. 일 실시양태에서, 단계 b)의 상기 배지는 불포화이다. 일 실시양태에서, 단계 b) 전의 상기 배지는 탈기되지 않은 것이다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 적어도 1시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 2시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 c) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 실질적으로 기체 비투과성인 중합체로 구성되고, 상기 마이크로채널이 버블을 포함하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 b) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법을 고려한다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 1 내지 2시간 사이 동안 수행된다.
일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 (예컨대 용기를 포함하는) 관류 매니폴드 내에 존재한다. 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 마이크로유체 칩과 맞물려 있으며 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 스커트를 포함하며, 상기 스커트가 상기 마이크로유체 칩과 맞물리게 하는 측면 트랙을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로유체 칩은 하나 이상의 포트를 포함하며, 상기 관류 매니폴드는 상기 하나 이상의 포트를 통하여 상기 마이크로유체 칩과 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 유체의 상기 유동은 유량 40 μL/시간에서의 것이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로유체 장치는 상기 마이크로채널 내에 생존 세포를 포함하며, 상기 유체는 상기 생존 세포에 공급되는 배지를 포함한다. 일 실시양태에서, 단계 b) 전의 상기 배지는 탈기된 것이다. 일 실시양태에서, 단계 b)의 상기 배지는 불포화이다. 일 실시양태에서, 단계 b) 전의 상기 배지는 탈기되지 않은 것이다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 1시간 미만 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 적어도 1시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 단계 b)는 2시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 c) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 것인 단계; b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 유량으로 유체를 유동시키는 단계; c) 버블을 검출하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 d) 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않으면서, 압력을 사용하여 상기 버블 부피를 감소시키는 단계를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법을 고려한다.
일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 단계 c)의 상기 버블은 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치된다. 일 실시양태에서, 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다. 일 실시양태에서, 상기 유체는 상기 살아있는 세포에 공급되는 배양 배지를 포함하며, 상기 세포는 단계 d) 후에도 여전히 살아있다. 일 실시양태에서, 단계 d) 전의 상기 배지는 탈기된 것이다. 일 실시양태에서, 단계 d)의 상기 배지는 불포화이다. 일 실시양태에서, 단계 d) 전의 상기 배지는 탈기되지 않은 것이다. 일 실시양태에서, 단계 d)는 적어도 1시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 단계 d)는 2시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 e) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) 제1 유체 포트를 포함하는 제1 기재(substrate), 제2 유체 포트를 포함하는 제2 기재를 제공하는 것; b) 제1 및 제2 유체 포트 세트를 정렬하는 단계; c) 버블이 형성되는 조건하에서 제1 및 제2 유체 포트를 접촉시켜 유체 연결을 설정하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 d) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 제1 또는 제2 포트를 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계를 포함하는, 유체 연결을 설정하는 방법을 고려한다. 일 실시양태에서, 상기 제1 기재는 제2 기재를 안내하도록 적합화된 안내 메카니즘을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 단계 b) 전에 제2 기재를 안내 메카니즘과 맞물리게 하는 것을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 단계 b)의 상기 정렬은 안내 메카니즘을 사용하여 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 안내 메카니즘은 상기 제1 기재상에 위치되는 안내 트랙을 포함하며, 상기 안내 트랙이 상기 제2 기재의 일부와 맞물리게 하도록 구성된다. 일 실시양태에서, 단계 c)의 상기 버블은 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치된다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 유체의 유동은 유량 30-40 μL/시간에서의 것이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 기재는 상기 포트와 유체 소통하는 채널을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 채널은 마이크로채널이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 기재는 관류 매니폴드 (예컨대 도 1a 및 1b에 나타낸 유형의 것)이다. 일 실시양태에서, 상기 제2 기재는 마이크로유체 장치이다. 일 실시양태에서, 상기 관류 매니폴드는 단계 c)에서 상기 마이크로유체 장치와 맞물리게 한다 (예컨대 도 1a, 1b, 2c-d, 또는 2e-1, e-2, e-3에 도시되어 있는 바와 같음). 일 실시양태에서, 상기 마이크로유체 장치는 마이크로채널을 포함하며, 상기 마이크로채널이 살아있는 세포를 포함하고, 상기 유체는 상기 세포에 공급되는 배지를 포함한다. 일 실시양태에서, 단계 d) 전의 상기 배지는 탈기된 것이다. 일 실시양태에서, 단계 d)의 상기 배지는 불포화이다. 일 실시양태에서, 단계 d) 전의 상기 배지는 탈기되지 않은 것이다. 일 실시양태에서, 단계 d)는 적어도 1시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 단계 d)는 2시간 동안 수행된다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 e) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 것인 단계; b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 유량으로 유체를 유동시키는 단계로서, 상기 유체가 상기 유동 전에 유체가 불포화가 되도록 처리된 것인 단계; c) 버블을 검출하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 d) 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않으면서, 일정 시간 기간 동안 압력을 사용하여 상기 버블 부피를 감소시키는 단계로서, 살아있는 세포가 상기 시간 기간 후 상기 마이크로채널 내에 존재하는 것인 단계를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법을 고려한다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 단계 c)의 상기 버블은 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치된다. 일 실시양태에서, 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 제1 압력은 적어도 0.5 kPa만큼 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 31 kPa이고, 상기 제2 압력은 30 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 33 kPa이고, 상기 제2 압력은 32 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 유체의 상기 유동은 유량 30-40 μL/시간에서의 것이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) i) 비-평형화 배양 배지 및 ii) 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계; 및 b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 시간 기간 동안 압력하에 일정 유량으로 상기 비-평형화 배양 배지를 유동시키며, 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않는 단계로서, 살아있는 세포가 상기 시간 기간 후 상기 마이크로채널 내에 존재하고, 상기 마이크로채널 내에서 버블이 보이지 않는 것인 단계를 포함하는, 비-평형화 배양 배지를 사용하는 방법을 고려한다. 일 실시양태에서, 상기 마이크로채널은 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통한다. 일 실시양태에서, 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 제1 압력은 적어도 0.5 kPa만큼 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 2 kPa 미만만큼 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 31 kPa이고, 상기 제2 압력은 30 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 33 kPa이고, 상기 제2 압력은 32 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 34 kPa이고, 상기 제2 압력은 33 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 기체 버블이다. 일 실시양태에서, 상기 기체는 산소, 질소 또는 이들의 혼합물이다. 일 실시양태에서, 상기 버블은 공기 버블이다. 일 실시양태에서, 비-평형화 배양 배지의 상기 유동은 유량 30-40 μL/시간에서의 것이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 40 μL/시간을 초과한다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 μL/시간이다. 일 실시양태에서, 상기 유량은 50 내지 75 μL/시간 사이이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은, a) 변형가능한 멤브레인에 의해 분리된 제1 및 제2 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 버블이 상기 제1 또는 제2 마이크로채널 또는 모두 내에 존재하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및 b) 상기 버블 부피가 감소되고 상기 변형가능 멤브레인이 변형되지 않도록 하는 (또는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만으로 변형되도록 하는) 조건하에서 상기 제1 및 제2 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계를 포함하는, 2개의 마이크로채널이 구비된 마이크로유체 장치에서 버블 부피를 감소시키는 방법을 고려한다. 일 실시양태에서, i) 상기 제1 마이크로채널은 상기 제1 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 제1 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하며, ii) 상기 제2 마이크로채널은 상기 제2 마이크로채널 제1 단부의 제3 용기 및 상기 제2 마이크로채널 제2 단부의 제4 용기와 유체 소통한다. 일 실시양태에서, i) 상기 제1 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제2 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크고, ii) 상기 제3 용기는 제1 압력하에 유체를 포함하며, 상기 제4 용기는 제2 압력하에 유체를 포함하는데, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 21 kPa이고, 상기 제2 압력은 20 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 31 kPa이고, 상기 제2 압력은 30 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 33 kPa이고, 상기 제2 압력은 32 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제1 압력은 34 kPa이고, 상기 제2 압력은 33 kPa이다. 일 실시양태에서, 상기 제2 용기와 상기 제4 용기는 (2개의 마이크로채널 내에서 동일하거나 거의 동일한 압력을 유지하기 위하여) 압력 조절기를 공유한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 마이크로유체 장치와 함께 비-평형화 및 비-탈기 배양 배지를 이용하는 것을 고려한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 제1 압력/유량 주기 전에 탈기하는 과정을 통하여 (용액으로부터 용해된 기체를 물리적으로 제거함) 배지를 평형화하는 것 - 그러나 그 후, 즉 장-기 배양 동안 배지를 교체할 때에는 비-평형화 및 비-탈기 배지를 사용하는 것을 고려한다. 다시 말하자면, 배양 배지는 예를 들면 실험 개시시에 한번 평형화 및/또는 배-기되며, 이후에는 일정 시간 기간 동안 압력/유량 처리가 이용된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (더 높은 압력을 사용하기는 하지만) 제1 압력/유량 주기에서도 배양 배지가 관류 매니폴드 또는 "포드(pod)" 용기(들)에 위치될 때에는 언제나 비-평형화 및 비-탈기 배지를 사용하는 것을 고려한다. 이와 같은 실시양태에서, 배양 배지는 평형화되지 않으며 (즉 그것이 비-평형화 배양 배지임), 탈기를 통한 용해 기체의 물리적 제거에 적용되지 않는다.
경험적으로, 1) 세포 (운동 뉴런과 같이 전단력에 민감한 세포 포함)가 생존력의 상실 또는 발달의 억제 없이 (예를 들면 축삭 성장의 억제 없이) 상승된 유량, 즉 버블 제거를 촉진하는 것을 돕는 유량을 감당할 수 있다는 것, 2) 적용 압력 20 kPa에서 다수의 압력/유량 주기를 감당할 수 있다는 것, 및 3) 정상적인 배지 재보급/첨가 단계 동안의 유입구 용기를 재충전하기 위한 저온 배지의 사용이 시스템 버블을 제거하기 위한 최초 압력/유량 단계 후 버블의 형성을 야기하지 않는다는 것이 발견되었다.
일 실시양태에서, 본 발명은 비제한적으로 마이크로유체 장치를 관류 매니폴드 조립체와 유체 소통하도록 위치시키는 것을 포함하여, 마이크로유체 장치를 또 다른 마이크로유체 장치와 유체 소통하도록 위치시키는 것을 고려한다. 불행히도, 도 3a 및 3b에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 서로 유체 소통하도록 장치들을 위치시키는 것은 버블(40)의 형성을 초래할 수 있다. 그것은 최초로 기체/공기 충전된 칩을 유체로 충전할 때 포획될 수도 있다. 공기 버블은 마이크로유체 기하구조에서, 표면에 고정됨으로써 유체 유동만으로는 씻어내기가 어렵기 때문에 특히 문제가 된다. 그것은 세포 배양 장치에서는 다양한 수단을 통하여 세포를 손상시킬 수 있기 때문에 추가로 문제가 된다.
또한, 버블이 성장할 수 있다. 예를 들어, 그것은 5% CO2 및 습한 환경과의 평형으로 인하여 성장할 수 있다. 그것은 소수성 표면으로부터의 모세관력으로 인하여 성장할 수도 있다. 다른 한편으로, 그것은 관류 일회용품(perfusion disposable) ("PD") 내에서의 압력 강하로 인하여 과포화된 배지때문에 성장할 수도 있다.
상기에서 주지된 바와 같이, 버블을 제거하는 한 가지 접근법은 문헌 [Kang et al. Lab Chip 8: 176-178 (2008)]에 의해 입증되어 있는 탈포이다. 그것은 PDMS의 기체 투과성을 이용하여 시스템으로부터 버블을 능동적으로 제거하였는데; 양의 압력을 사용하여 채널 밖 및 중합체 내로 버블을 밀어내었다. 여기에서 장점은 버블이 시스템으로부터 제거된다는 것이다. 그러나, 이를 달성하기 위해서는, 장치가 밀봉되어야 하며, 유동이 중지되어야 하고, 장치가 버블을 밖으로 밀어내도록 가압되어야 한다. 마이크로유체 관류 시스템의 경우, 이는 세포로의 배지 공급이 중지되고, 환경 세포를 변경하며, 영양 결핍으로 이어질 가능성이 있다는 것을 의미한다.
또한, 문헌 [Kang et al.]의 접근법은 PDMS의 기체 투과성에 의존한다. PDMS가 마이크로유체에서 흔하게 사용되기는 하지만, 그와 같은 기체 투과성 재료를 사용하지 않는 충분한 이유, 즉 실질적으로 기체 투과성이 아닌 재료를 칩에 사용하는 충분한 이유가 존재한다. 먼저, 둘러싸고 있는 재료가 기체 투과성인 경우 칩에 존재하는 액체의 기체 함량을 조절하는 것이 어려울 수 있는데, 기체 투과성 재료를 통하여 액체가 기체 함량을 얻거나 상실할 수 있기 때문이다. 이는 예를 들면 누군가 저산소 조건, 예컨대 장관로(intestinal tract)의 일 부분에 존재하는 저산소 조건 (소위 칩-상-창자(gut-on-chip)로 모방됨)을 모방하고자 하는 경우에 상당할 수 있다. 두 번째로, 기체 투과성 재료를 통하여 버블이 기체를 얻을 수 있기 때문에, 기체 투과성은 버블을 악화시킬 수 있다. 세 번째로, 기체 투과성 재료는 종종 더 높은 기체-보유 능력도 보유하는데, 이는 대류성 기체 수송의 부재하에서도 버블을 촉진할 수 있다. 네 번째로, 산소와 같은 기체에 투과성인 재료는 종종 또한 수증기에 대해서는 더 투과성이다. 따라서, 둘러싸고 있는 재료의 기체 투과성은 마이크로유체 장치로부터의 증발로 이어질 수 있다.
PDMS와 같은 재료를 사용하지 않는 충분한 이유가 존재하기는 하지만, 고려사항은 더 많이 존재한다. 다른 이유로는, 어쩌면 실질적으로 기체 비투과성일 수 있는 재료가 선호될 수 있다. 예를 들면, 사출 성형과의 그의 상용성, 광학적 투명성, 강도 또는 다양한 기타 파라미터들로 인하여, COP (고리형 폴리올레핀), 폴리카르보네이트, 아크릴 또는 폴리스티렌 재료가 선택될 수도 있다. 이러한 재료들은 (적어도 통상적인 두께에서, 그리고 PDMS의 기체 투과도와 비교하여) 실질적으로 기체 비투과성인 경향이 있기는 하지만, 그 선택은 다른 인자들을 기준으로 한다.
어떠한 경우에도, 어쩌면 실질적으로 기체 비투과성일 수 있는 재료의 사용은 문헌 [Kang et al.]의 탈포 접근법은 실행불가능하게 한다. 버블이 중합체로 추진되지 않게 되는 것이다.
물론, 한 가지 접근법은 버블을 발생시킬 가능성이 적게 조건을 형성하는 것이다. 예를 들면, 한 가지 접근법은 유체 층을 친수성 또는 더 친수성이 되도록 하는 것이다. 이는 프라이밍(priming) 동안 포획된 버블의 기회를 감소시킨다. 또한, 배지가 평형상태에 있는 경우, 버블은 정상적으로는 반드시 감소되려 한다.
그러나, 일단 버블이 존재하고 나면, 본 발명은 압력과 유량의 조합을 사용한 능동적인 감소 및/또는 제거를 고려한다. 일 실시양태에서는, 2개의 용기가 사용된다. 이에 따라, 푸시(push) 기반의 유동 방법 (도 6) 또는 풀(pull) 기반의 유동 방법 (도 7) 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 풀 기반 유동 방법에서, 과포화된 배지는 시스템의 중요한 영역에 도달하지 않게 된다. 이는 양압 조절기를 진공 조절기로 교체할 것을 필요로 한다.
그러나, 바람직한 방법에서는, 압력 차이 및 유동을 이용한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 작은 압력 차이 (P1 대 P2)도 비현실적인 유량을 필요로 하지 않으면서 (버블을 감소시키기에 충분한) 충분한 압력을 초래한다. 이와 같은 방법에서, 소정 적용 압력 미만으로 가는 것은 버블 부피를 감소시키는 데에 있어서의 매우 긴 (비실용적인) 시간 기간으로 이어진다. 또한, 그와 같은 낮은 압력을 이용하는 것은 시스템이 작은 변화 및 불일치에 민감하게 되도록 한다.
이것이 매우 높은 압력이 사용될 필요가 있음을 의미하는 것은 아니다. 실제로는, 소정 압력을 상회할 경우, 이익의 감소만이 존재하는데, 다시 말하자면 버블 부피를 감소시키는 데에 대략 동일한 양의 시간 (단기간)이 걸린다.
본 발명을 특정 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니나, a) 배지 중 용해 기체와의 평형으로 인하여 버블이 감소되고, b) 약간의 모세관 압력이 존재함으로써 버블이 감소되도록 하고, c) 버블이 성장하도록 하기에는 미미한 증기압이 존재하고, d) 칩 또는 관류 일회용품 중 어느 하나를 통한 기체 투과는 존재하지 않는 것으로 여겨진다. 또 다른 방식으로 말하자면, 버블이 지나가는 배지가 불포화 또는 저포화인 경우, 그것은 버블로부터 기체를 흡수/용해시키는 능력을 보유한다. 용해된 기체를 능동적으로 제거하는 것 (탈기) 또는 유체 압력을 증가시키는 것 중 어느 하나에 의해 배지가 소비할 수 있는 (용해시킬 수 있는) 기체의 양 또는 부피를 증가시킬 수 있다. 일 실시양태에서는, 이들 양자가 함께/동시에 수행됨으로써, 증가된 압력이 실제로 배지의 용해 기체 보유 능력을 증가시킨다. 적용 압력이 클수록, 배지 기체 보유 능력의 증가가 더 커짐으로써, 더 크게/빠르게 버블이 분쇄될 수 있다. 그러나, 여기에는 실제적안 한계가 존재한다.
배지가 정적으로 유지될 (버블을 지나 유동되지 않을) 경우, 효과적으로 버블을 분쇄하는 것이 어렵게 된다는 것이 발견되었다. 그 이유는 마이크로채널의 상대적으로 길고 좁은 기하구조이다. 배지가 버블을 용해시키면서, 그것은 점점 더 평형/포화에 가까워지게 됨으로써, 더 이상은 기체를 용해시킬 수 없게 된다. "합리적인(reasonable)" 적용 압력에서는, 버블을 완전히 용해시키기에 충분한 부피의 배지가 마이크로채널에 존재하지 않는다 (충분하지 않은 기체 보유 능력). 그러나, 새로운 (신규) 저포화 배지를 버블을 지나 유동시키는 것에 의하면, 이와 같은 새로운 배지는 계속 버블을 용해시킬 수 있다.
또 다른 방식을 살펴보면, 마이크로채널의 작은 기하구조는 버블의 크기에 한계를 부과한다. 마이크로채널 내 공간이 작기 때문에, 버블은 소형이다. 예컨대, 버블을 용해시키는 능력/시간은 적용 압력, 유량 및 버블의 최초 부피 (버블이 더 클수록 완전히 용해시키는 데에 더 오래 걸림)에 따라 달라진다. 상당한 절대 압력을 발생시키는 작은 압력 차이를 사용하면, 버블은 매우 빠르고도 (거의 즉시) 완전하게 배지와 평형에 도달한다. 바람직한 실시양태에서는, 하기의 조건이 사용된다:
유입 압력 = 21 kPa
유출 압력 = 20 kPa
버블 분쇄 시간 = 2시간.
이러한 조건은 실제로 우수하게 작용한다 (즉 세포를 사멸시키지 않으면서 버블을 분쇄/용해시킴). 이러한 조건하에서는, 틀림없이 1시간 이내에 모든 버블을 완전히 제거할 수 있지만, 충분히 조심하기 위하여, 2시간 동안 버블 분쇄 주기를 전개할 수 있다.
도 1a는, 용기의 벗겨진 덮개, 백플레인(backplane) 위의 상기 용기, 스커트와 유체 소통하는 상기 백플레인, 하나 이상의 유입구, 유출구 및 진공 포트를 보유하는 대표적인 마이크로유체 장치 또는 "칩"을 맞물리게 하기 위한 측면 트랙이 구비된 스커트, 칩 캐리어의 일 실시양태에 이어서 (그 내부가 아님) 나타낸 칩을 보여주는 관류 매니폴드 조립체의 일 실시양태의 분해도이며, 상기 캐리어는 칩을 지지 및 운반하도록 구성된다. 도 1b는 덮개가 용기 위에 덮여 있고, 칩 캐리어 내부의 칩이 관류 매니폴드 조립체의 스커트에 완전히 연결되어 있으며, 그에 따라 용기와 유체 소통하는 동일한 관류 매니폴드 조립체 실시양태를 나타낸다. 도 1c는 압력 덮개 또는 압력 뚜껑, 및 그 아래의 관련 가스켓을 포함하는 덮개 조립체의 일 실시양태의 분해도를 나타낸다.
도 2a는, 관류 매니폴드 조립체의 일 실시양태의 스커트 측면 트랙에 접근하는 (그러나 아직 맞물리지는 않음) 칩 캐리어 (내부에 칩이 구비됨)의 일 실시양태의 측면도를 나타내며, 상기 캐리어는측면 트랙의 단부 부분으로부터 경사 정합되는 각도로 정렬되어 있고, 상기 캐리어는 상향 돌출된 클립(clip)으로 구성되는 보유 메카니즘을 포함한다. 도 2b는 관류 매니폴드 조립체의 일 실시양태 (그러나 아직 연결되지는 않음)의 스커트 측면 트랙과 맞물리는 칩 캐리어 (내부에 칩이 구비됨)의 일 실시양태의 측면도를 나타낸다. 도 2c는 관류 매니폴드 조립체의 일 실시양태 (그러나 아직 연결되지는 않음)의 스커트 측면 트랙과 완전히 맞물리는 칩 캐리어 (내부에 칩이 구비됨)의 일 실시양태의 측면도를 나타낸다 (화살표는 체류 메카니즘이 맞물려 움직임을 방지하게 되는 걸쇠 정합을 얻는 데에 필요한 움직임 방향을 나타냄). 도 2d는 관류 매니폴드 조립체에 탈착가능하게 연결된 칩 캐리어 (내부에 칩이 구비됨)의 일 실시양태의 측면도를 나타내는 것으로써, 보유 메카니즘이 맞물려 움직임을 방지하고 있다. 도 2e는 단일 작용으로서의 미끄럼 작용 (2e-1), 축회전(pivoting) (2e-2) 및 걸쇠 정합 (2e-3)을 포함하는 매니폴드에의 연결 접근법의 일 실시양태를 개략적으로 보여주는 요약 슬라이드이다.
도 3은 2개의 마이크로유체 장치를 연결하여 마이크로채널에의 공기 또는 기체 버블의 도입을 초래하는 일 실시양태를 보여주는 개략도이다. 도 3a는 아직 연결되지 않은 마이크로채널이 구비된 2개의 유체 프라이밍된 장치들을 나타낸다. 도 3b는 마이크로채널에의 공기 버블의 도입을 초래하는 방식으로 접촉하는 도 3a의 장치를 나타낸다.
도 4a는 관류 매니폴드 조립체 (관류 일회용품 또는 POD로도 지칭됨)에 의해 칩이 맞물려 있는 경우의 버블의 위치를 보여주는 개략도이다. 도 4b는 도 4a에서 원으로 나타낸 위치에서의 (칩이 아니라) 관류 일회용품에 포획된 버블 (화살표 참조) 사진 유래의 도면이다. 관류 일회용품은 SEBS (스티렌 에틸렌 부틸렌 스티렌) 캡핑(capping) 층이 구비된 COP (고리형 폴리올레핀)로 구성된다. COP 및 SEBS는 모두 PDMS에 비해 실질적으로 덜 기체 투과성이다.
도 5는 결합 표면(mating surface) (21)이 구비된 예시적인 마이크로유체 장치 또는 "칩-상-기관(organ-on-chip)" 장치 (PDMS와 같은 플라스틱으로부터 제조될 수 있음)의 개략도이다. 도 5a의 조립된 장치는 다수의 포트를 포함한다. 도 5b는 세포 거동 및/또는 기체, 화학물질, 분자, 미립자 및 세포의 통과가 모니터링되는, 멤브레인을 포함하는 조직-조직 경계면 모사 영역 (SR)을 보여주는 도 5a 장치의 분해도를 나타낸다.
도 6은 고압하에 유체가 위치되는, 유체가 용기 (우측)로부터 유동하는 "푸시" 기반 유동 접근법의 개략도이다. 유체는 용기 (우측)로부터 유출되어, 저항기(resistor) (지그재그)를 통해 칩 방향으로 (유동 방향을 보여주는 화살표 참조) 유동한다. 다른 용기 (좌측)에는 압력이 적용되지 않는다.
도 7은 유체가 압력하에 있지는 않으나 다른 용기 (우측)가 낮은 압력 (예컨대 진공에 기인)을 가지는, 유체가 용기 (좌측)로부터 유동하는 "풀" 기반 유동 접근법의 개략도이다. 유체는 용기 (좌측)로부터 유출되어, 칩 방향으로 (유동 방향을 보여주는 화살표 참조) 유동한다.
도 8은 양 용기 중 유체가 압력하에 있는 (P2는 0은 아니나 P1 미만임) 압력 차이 ("델타 P") 기반 유동 접근법의 개략도이다. 유체는 용기 (우측)로부터 유출되어, 저항기 (지그재그)를 통해 칩 방향으로 (유동 방향을 보여주는 화살표 참조) 유동한다.
도 9는 도 8의 압력 차이 기반 유동 접근법을 사용한 버블 부피 감소의 실험 결과를 나타낸다. 도 9의 유량은 압력 차이 (델타) 관점에서 제시된 것으로써 - 1 kPa는 40μL/시간에 상응하며, 1.5 kPa는 60μL/시간이고, 3 kPa는 120μL/시간이며, 8 kPa는 320 μL/시간이고, 28.3 kPa는 1.13 mL/시간이다. 유출구에 적용되는 압력, 및 그에 따른 버블에 의한 "펠트(felt)"는 "펠트" 압력 (단위 kPa) 관점에서 제시된 것이다.
도 10은 다수의 마이크로유체 장치 또는 "칩"을 사용하여 어떻게 대형인 다-주 실험이 수행되는지를 보여주는 차트로써, 배지를 재보급하는 작업 (예컨대 격일로, 또는 핵심 시점에)이 부담이 될 수 있다는 것을 강조한다.
도 11은 버블을 검출하기 위한 해독치로서 유량을 사용하는, 칩-상-기관을 맞물리게 하는 19개의 포드에서의 비-평형화 배지의 사용을 포함하는 실험의 결과를 나타낸다. 도 11a는 8개의 포드에서의 결과를 나타내며, 도 11b는 11개의 포드에서의 결과를 나타낸다 (점선은 하단 평균 및 상단 평균으로부터의 20% 편차를 나타냄).
도 12는 더 높은 압력이 버블 처리에 사용되는 경우의 뚜껑 고장에 대하여 시험하기 위한 압력 대 시간의 플롯을 나타낸다. 도 12a는 압력이 상승하여 25-30 kPa에 접근할 때, 얇은 가스켓이 구비된 관류 시스템은 뚜껑 고장을 나타낸다는 것을 보여준다. 도 12b는 압력이 상승하여 33 kPa에 접근할 때, 더 두꺼운 가스켓 (얇은 가스켓에 비해 2-3배 더 두꺼움)이 구비된 관류 시스템은 뚜껑 고장을 나타내지 않는다는 것을 보여준다.
도 13은 50 μL/시간 대조 조건 대 75 μL/시간 시험 조건을 사용한 시간 경과에 따른 (예컨대 제0일, 제1일, 제4일 및 제5일) 마이크로유체 장치에서의 축삭 성장을 나타내는 막대 그래프이다.
정의
"채널"은 액체 및 기체의 이동을 가능케 하는 매체 (예컨대 규소, 유리, 중합체 등)를 통한 통로이다 (직선형인지, 곡선형인지, 단일인지, 다수인지, 네트워트인지 등에 관계 없음). 따라서, 채널은 다른 구성요소들을 연결할 수 있는데, 다시 말하자면 구성요소들을 "통하도록", 더 구체적으로는 "유체 소통하도록", 더욱 더 구체적으로는 "액체 소통하도록" 유지할 수 있다. 그와 같은 구성요소들에는 액체-흡수 포트 및 기체 배출구가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 마이크로채널은 1 밀리미터 미만 내지 1 마이크로미터 초과의 치수를 가지는 채널이다. 본 발명을 특정 마이크로채널 기하구조로만 제한하고자 하는 것은 아니다. 일 실시양태에서는, 4-측 마이크로채널이 고려된다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로채널은 굴곡진 벽을 가지는 (튜브 방식의) 원형이다. 또 다른 실시양태에서는, 원형 또는 직선형 벽의 조합이 사용된다.
본 발명을 마이크로유체 장치 내 채널의 수 또는 특성으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 표면은 고체 기재에 배치되는 유체-유동 도관 또는 통로의 표면일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면은 고체 표면일 수 있다. 예를 들어, 일 실시양태에서, 상기 고체 표면은 유체 채널, 예컨대 마이크로유체 채널의 벽 표면일 수 있다. 그러나, 방법이 마이크로채널로 제한될 필요는 없는데, 유체가 유동하는 어떠한 제한된 공간에서도 그것이 작용할 것이기 때문이다.
또한, 본원에서 사용될 때의 "마이크로유체"이라는 용어는 움직이는 유체가 하나 이상의 치수가 1 mm 이하 (마이크로규모)인 하나 이상의 채널을 통하여 제약되거나 안내되는 구성요소와 관련된다. 마이크로유체 채널은 하나 이상의 방향에서 마이크로규모를 초과할 수 있지만, 적어도 하나의 방향에서는 채널(들)이 마이크로규모로 존재하게 된다. 일부 경우에서, 마이크로유체 채널의 기하구조는 채널을 통한 유체 유량을 조절하도록 구성될 수 있다 (예컨대 전단 또는 저항을 감소시키기 위하여 채널 높이를 증가시킴). 마이크로유체 채널은 채널을 통한 광범위한 유량을 촉진하는 다양한 기하구조로 형성될 수 있다.
해당 조립체와 탈착가능하게 연결됨으로써 조절가능한 유량으로 배관 없이 유체 용기로부터 마이크로유체 장치의 포트로 유체가 진입하는, 신체 기관의 세포를 모방한 세포를 포함하는 칩상 기관 마이크로유체 장치와 같은 마이크로유체 장치의 관류를 가능케 하는 "관류 매니폴드 조립체"가 고려된다. 일 실시양태 (도 1a 및 1b 참조)에서, 관류 매니폴드 조립체는 ii) 하나 이상 유체 용기의 i) 상부로 작용하도록 구성되는 덮개 또는 뚜껑, iii) 상기 유체 용기(들) 아래의 캡핑 층(capping layer), iv) 저항기를 포함하는, 상기 유체 용기(들) 아래에서 그와 유체 소통하는 유체 백플레인, 및 v) 스커트 (마이크로유체 장치와 맞물리게 하기 위한 것)를 포함한다. 일 실시양태에서, 압력과 유량의 조합은 관류 매니폴드 조립체에서 버블 부피를 감소시킨다. 일 실시양태에서, 관류 매니폴드 조립체는 PDMS에 비해 덜 기체 투과성인 중합체로 구성된다.
일 실시양태에서, 관류 매니폴드는 (예컨대 그와 유체 소통하는) 마이크로유체 장치에 연결된다. 살아있는 세포를 포함하는 마이크로유체 장치 (또는 "칩")는 생리학적 조직-조직 경계면을 재현하며, 유체 유동을 가능케 한다. 의거 참조로써 개재되는 미국 특허 제8647861호를 참조하라. 그와 같은 장치는 세포를 전단 응력에 적용한다. 정적인 2D 배양과 달리, 마이크로채널은 시험관내 연구 동안 세포 배양 전체에 걸친 세포 배양 배지의 관류를 가능케 하며, 그에 따라 더욱 생체내-유사인 물리적 환경을 제공한다. 간단한 말로 하면, 유입구 포트는 마이크로유체 채널 또는 챔버 (세포가 있거나 없는 것)로의 혈액, 혈청, 혈장, 세포 배양 배지 (등)와 같은 유체의 주입을 가능케 한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 세포-적재 마이크로유체 채널 또는 챔버를 고려한다. 이후, 유출구 포트는 나머지 유체는 물론 유해 대사 부산물의 유출을 가능케 한다. 일 실시양태에서는, 미리 저포화된 배지와 함께 유량만이 사용된다.
일부 실시양태에서, 버블은 COP와 같이 (이것으로 제한되는 것은 아님) 거의 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 마이크로유체 장치에 포획된다. 시클릭 올레핀 공중합체 (COC) 및 시클릭 올레핀 중합체 (COP)는 현저한 투명도, 우수한 내열성, 낮은 수분 흡수, 우수한 화학물질 내성 및 낮은 이중 굴절과 같은 잠재적으로 강화된 특성들을 가지는 매우 매력적인 열가소성 수지이다. COC는 시클로올레핀의 에틸렌 또는 α-올레핀과의 공중합을 통하여 수득되며, 미츠이(Mitsui) 사에 의해 아펠(APEL)®이라는 상표명으로, 그리고 토파스 어드밴스드 폴리머스(TOPAS advanced polymers) 사 (TAP: 구 티코나 앤드 훽스트(Ticona and Hoechst) 사)에 의해 토파스(TOPAS)®라는 상표명으로 상업화되어 있다. COP는 시클로올레핀의 개환 복분해 중합 (ROMP) 후 이어지는 수소화를 통하여 제조되며, 제온(Zeon) [25] 사에 의해 제오넥스(Zeonex)® 및 제오노르(Zeonor)®이라는 상표명으로, 그리고 재팬 신테틱 러버(Japan Synthetic Rubber) 사 (JSR)에 의해 아르톤(Arton)®이라는 상표명으로 상업화되어 있다.
바람직한 실시양태의 설명
마이크로유체 장치의 마이크로채널 내에 하나 이상의 버블을 포함하는 마이크로유체 장치로부터 기체 또는 공기 버블을 제거하는 방법을 기술한다. 문제를 야기하는 것은 배지에서의 공기 또는 기체의 존재가 아니다. 문제를 야기하는 것은 이러한 기체로부터의 버블의 형성이다. 논점은 이러한 버블이 왜 어떻게 형성되는지이다. 버블 형성의 원천이 확립되고 이후 제거되는 경우에만, 이와 같은 문제가 해소될 수 있다.
버블 형성의 한 가지 원천은 하기와 같이 설명될 수 있다: 37℃에서 유지되는 배양 배지로부터 세포에 영양소가 제공되는 것. 그러나, 사용되는 배양 배지는 일반적으로 37℃ 미만인 실온 (이하)에서 저장된다. 배지가 저장소로부터 이전되어 37℃까지 가열되는 경우, 용해된 기체의 용해도에 변화가 발생한다. 더 높은 온도에서의 기체 용해도의 감소는 용해된 기체가 미소 버블의 형태로 배지로부터 나오게 하는데, 그것은 채널 표면 (특히 채널 표면의 마이크로결함)을 포함하여, 세포를 수용하는 마이크로유체 장치의 표면에 점착되는 경향이 있다. 어떠한 방식으로도 본 발명을 임의의 특정 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 이와 같은 "버블 성장" 과정은 용액 중 기체가 용해된 기체로부터 비-용해 기체 주머니 또는 버블로 확산되어 전이되는 데에 때로는 핵화점 또는 "시드 버블"로 지칭되는 최초 버블을 필요로 하는 것으로 여겨진다. 그러나, 일단 배지가 37℃에서 평형화되고 나면, 버블의 형성은 느려진다. 따라서, 왜 어떻게 버블이 형성되는지의 질문에 대한 한 가지 부분적인 답은 배양 배지 가열 과정 동안의 일시적인 단계 때문이라는 것이다.
지금까지, 이와 같은 문제를 회피하는 간단한 해결책은 온도 구배 효과를 제거하는 것, 즉 저온 배지를 직접 마이크로유체 장치로 전달하는 것을 회피하는 것으로 여겨져 왔다. 다른 말로 하면, 마이크로유체 장치 외부에서 37℃로 배지를 가온하고/거나 배지가 용기 또는 저장소에서 37℃로 평형화되기에 충분한 시간을 주어야 했다 (필요에 따라 중간 정도의 교반 동반). 물론, 여기에는 시간이 걸리며, 배양 배지가 멸균될 필요가 있다.
이와 같은 버블 형성 문제를 해소하기 위하여 탈-기 또는 "배-기"의 실시가 도입되어 있기는 하지만, 실제적인 한계를 가지는 것이 사실이다. 가열/진공 단계를 기반으로 하는 통상적으로 제안되는 탈-기 절차는 종종 측정가능한 종말점이 없으며, 절차를 수행하는 데에 사용되는 장비에 고도로 의존성이다. 따라서, 탈-기 단계는 사용되는 바로 그 공정 파라미터 및 장비에 기인하는 고도의 가변성으로 인하여 예측할 수 없게 된다. 또한, "배-기"는 산소 (세포 호흡) 및 CO2 (pH 완충)와 같이 배양을 유지하는 데에 필요한 기체를 용액으로부터 제거하는 결과를 가져올 수 있다. 또한, 탈-기 단계에서 재현가능하도록 얼마나 노력하든 간에, 탈-기 후 배지는 빠르게 그 자신을 주변 기체와 평형화하기 시작하게 된다. 따라서, 이와 같은 평형이 정확하게 도달될 때까지, 시스템은 불안정하고 신뢰성 없게 유지되게 된다.
많은 마이크로유체 장치 또는 "칩"을 사용하여 대규모의 다-주 실험이 수행되는 경우, (예컨대 격일 또는 핵심 시점에) 배지를 재보급하는 작업은 부담이 될 수 있다. 이는 칩-상-기관을 포함하는 2주 실험에 대하여 도 10에 도시되어 있다.
물론, 마이크로유체 장치에서의 세포의 생리학적 환경은 탈-기 배지를 필요로 하지 않는다. 탈기는 버블 문제를 해소하기 위해서만 수행된다.
이는 비-평형화 및 비-탈기 배양 배지가 마이크로유체 장치와 함께 사용될 수 있는지 여부 (그리고 어느 정도까지인지)에 대한 질문을 야기한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 제1 압력/유량 주기 전에 배지를 탈기하는 (용액으로부터 용해된 기체를 물리적으로 제거하는) 과정을 통하여 평형화하는 것 - 그러나 그 이후 배지를 교체할 때, 즉 장-기 배양 동안에는 비-평형화 및 비-탈기 배지를 사용하는 것을 고려한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (더 높은 압력을 사용하기는 하지만) 제1 압력/유량 주기에서도 배양 배지가 관류 매니폴드 또는 "포드" 용기(들)에 위치될 때에는 언제나 비-평형화 및 비-탈기 배지를 사용하는 것을 고려한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 저온/비-평형화 배지를 하나 이상의 포드 용기에 첨가하는 것을 고려한다.
제1 실시양태에서, 배양 배지는 실험 개시시에 한번 평형화 및/또는 배-기되며, 이후에는 일정 시간 기간 동안 압력/유량 처리가 이용된다. 이상적으로는, 상기 시간 기간은 짧아서 가변성에 민감하지 않아야 하며 (예컨대 1-2시간), 처리 조건은 비현실적으로 높은 압력 또는 유량 없이 가동하는 것을 가능케 해야 한다. 어떠한 방식으로도 본 발명을 작용 메카니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 그와 같은 압력/유량 처리에서는 두 가지 힘이 함께 작용하여 버블을 감소시키는 것으로 여겨진다. 첫 번째로, 압력은 배지의 기체 보유 능력을 증가시킨다. 두 번째로, 유량 (예컨대 40 μL/시간)은 버블이 용해되는 새로운 (저포화) 배지를 제공한다. 과포화 배지는 제1 위치에서 존재하지 않는 버블은 성장시킬 수 없다는 것이 경험적으로 관찰되어 있다. 이후, 배양 배지는 배지를 보충할 때에는 평형화되거나 탈기될 것을 필요로 하지 않게 된다. 또 다른 방식으로 말하자면, 단일 압력/유량 처리가 버블 (또는 핵화점/시드 버블)를 제거하며, 이후 과포화 배지의 사용은 그것이 복귀되지 않도록 하게 된다. 이와 같은 실시양태에서, 단일 압력/유량 주기가 시스템 버블을 성공적으로 제거한 후 유입구 용기를 재충전할 때에는, 비-평형화 배지가 사용될 수 있다. 이와 같은 접근법의 이점은 배양 배지가 평형화 및/또는 탈기되어야 하는 회수를 감소시키면서도 그것이 버블 문제를 해결한다는 것이다.
제2 실시양태에서, 배양 배지는 평형화되지 않으며 (즉 그것이 비-평형화 배양 배지임), 탈기를 통한 용해 기체의 물리적 제거에 적용되지 않는다. 이것이 작용하도록 하기 위하여, 압력/유량 주기 동안 (예컨대 13 kPa 이상만큼) 압력을 증가시킬 수 있다는 것 (예컨대 20 kPa로부터 33 kPa 이상으로의 증가)이 물리적 원리를 통하여 수학적으로 측정되고, 실험적으로 확인되었다. 어떠한 특정 메카니즘으로도 제한하고자 하는 것은 아니나, 이와 같이 증가된 압력은 비-평형화 배지 기체 보유 능력을 평형화된 배지 기체 보유 능력에 상당하도록 증가시킴으로써, 압력/유량 주기를 비-평형화 배지에서만큼 (이론적으로) 효과적이 되도록 하는 것으로 여겨진다. 증가된 압력은 마이크로유체 시스템에 변형을 가할 수 있다. 그러나, 더 두꺼운 관류 매니폴드용 가스켓이 증가된 압력과 연관된 누출을 회피하는 한 가지 해결책이 된다는 것이 경험적으로 확인되었다. 임의적으로, 세포가 증가된 유량을 견딜 수 있다는 것이 경험적으로 확인되었기 때문에, 증가된 유량 (50으로부터 75 μL/시간으로)이 사용될 (그리고 버블을 제거하는 강력성 면에서 약간의 이점을 제공할) 수도 있다. 증가된 압력과 관련하여, 용기들 (즉 유입구 및 유출구 용기) 사이의 압력 차이가 사용되는 실제 압력에 비해 세포의 생존력에 있어서 더 중요한 것으로 보인다. 2 kPa 이하, 더욱 바람직하게는 1.5 kPa 이하, 더욱 더 바람직하게는 1.0 kPa 이하의 압력 차이가 유용하다는 것이 경험적으로 밝혀졌다.
예시적인 마이크로유체 장치의 기술
도 1에 나타낸 바와 같은 일 실시양태에서, 관류 매니폴드 조립체 또는 POD (10)는 ii) 하나 이상 유체 용기(12)의 i) 상부로 작용하도록 구성되는 덮개 또는 뚜껑(11), iii) 상기 유체 용기(들) 아래의 캡핑 층(capping layer)(13), iv) 유체 저항기를 포함하는, 상기 유체 용기(들) 아래에서 그와 유체 소통하는 유체 백플레인(14), 및 v) 바람직하게는 캐리어(17) 내에 위치되는 마이크로유체 장치(16)와 맞물리게 하기 위한 스커트(15)를 포함한다. 일 실시양태에서, 캐리어(17)는 탭(tab) 또는 기타 파지 플랫폼(gripping platform)(18), 보유 메카니즘 예컨대 클립(19) 및 칩을 투영하기 위한 가시화 절단부(visualization cutout)(20)를 보유한다. 일 실시양태에서, 유체 저항기는 일련의 지그재그이거나 구불구불한 유체 채널 (미도시)을 포함한다.
도 1c는 압력 덮개 또는 압력 뚜껑을 포함하는 덮개 조립체(11)의 일 실시양태의 분해도를 나타낸다. 예시된 실시양태에서, 압력 뚜껑은 필터(38) 및 가스켓(37)의 상응하는 구멍(39)과 결합되는 다수의 포트 (예컨대 관통-구멍 포트)를 포함한다. 가스켓 구멍의 예시된 설계는 가스켓이 예시된 필터를 제 위치에서 유지하는 것을 돕는 것을 가능케 하고자 하는 것이다. 대안적인 실시양태에서, 가스켓 개구부는 뚜껑의 개구부와 상이한 형상을 사용할 수 있다. 예를 들면, 가스켓은 유체 또는 압력 밀봉을 형성하고자 하는 하나 이상의 용기의 윤곽을 따르도록 형상화될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 다수의 가스켓이 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, (버블을 처리하기 위하여 본원에서 기술되는 더 높은 압력하에서의 누출을 회피하기 위하여) 더 두꺼운 가스켓이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 필터 및/또는 가스켓은 접착제를 사용하여 고정되거나, 열 적층되거나, 접합되거나 (초음파, 용매-보조, 레이저 용접), 클램핑되거나, 또는 뚜껑 및/또는 추가 기재의 요소에 의해 수용될 수 있다. 예시된 압력 뚜껑이 관통-구멍 포트를 포함하기는 하지만, 대안적인 실시양태는 적어도 하나의 상부-표면 포트에서 상부-표면 포트의 바로 아래에 존재할 필요는 없는 하나 이상의 저부 표면 포트로 가는 하나 이상의 채널을 포함한다.
일 실시양태에서, 마이크로유체 장치는 칩-상-기관 장치를 포함한 마이크로유체 장치를 제자리에 일시적으로 "고정하는" 클리핑(clipping) 메카니즘에 의해 매니폴드 조립체와 탈착가능하게 연결된다 (도 2a, 2b, 2c, 2d 및 2e). 일 실시양태에서, 클리핑 또는 "걸쇠 정합"은 마이크로유체 장치가 위치될 때 보유 메카니즘으로 작용하는 캐리어상 돌출부(19)를 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 클리핑 메카니즘은 레고(Lego)™ 칩의 상호고정 플라스틱 설계와 유사하며, 스트레이트-다운(straight-down) 클립을 포함한다. 그러나, 또 다른 실시양태에서, 클리핑 메카니즘은 마이크로유체 장치, 또는 더욱 바람직하게는 마이크로유체 장치를 포함하는 캐리어가 안내 레일, 측면 슬롯, 내부 또는 외부 트랙(25), 또는 그것이 (예컨대 기계 또는 손에 의해) 위치로 운반될 때 장치에 안정한 미끄럼 경로를 제공하는 다른 메카니즘상에 관류 매니폴드 조립체 (또는 카트리지)와 맞물린 후에야 촉발된다. 상기 안내 레일, 측면 슬롯, 내부 또는 외부 트랙(25) 또는 다른 메카니즘은 반드시는 아니지만 철저히 직선일 수 있으며, 매니폴드 조립체의 주 몸체에 부착된 돌출 부재 또는 스커트에 위치될 수 있다. 일 실시양태에서, 안내 레일, 측면 슬롯, 내부 또는 외부 트랙 또는 다른 메카니즘의 시작 부분은 더 용이한 최초 위치지정을 위한 더 큰 개구부를 제공하며 직선 또는 본질적으로 선형인 부분(28)이 후속하는 경사 슬라이드(27)를 포함한다. 일 실시양태에서, 아니면 직선이었을 (또는 본질적으로 직선이었을) 안내 레일, 측면 슬롯, 내부 트랙 또는 다른 메카니즘의 (조립체의 상응하는 포트에 가까운) 단부 부분(29)은 상향으로 경사짐 (또는 굴곡짐)으로써 , 연결을 달성하기 위한 직선 움직임 (예컨대 최초의 것)과 상향 움직임의 조합이 존재한다.
POD는 버블 도입을 감소시키는 것을 돕는 하기 몇 가지의 특징들을 가진다: 1) 클립이 매우 원활한 맞물림을 가짐 - 거친 맞물림 및/또는 저킹(jerking) 동작은 버블을 도입할 수 있음, 및 2) 최초 POD 충전시 버블 포획을 감소시키도록 칩에 들어가는 POD 직경이 최소화되어 있음 - 이는 공기의 주머니가 포획될 수 있는 죽은 부피를 최소화 함.
캐리어의 장점은 매니폴드 조립체와의 탈착가능한 연결 동안 마이크로유체 장치의 표면이 접촉될 필요가 없다는 것이다. 캐리어는 마이크로유체 장치(16)의 결합 표면(21)에 접촉하지 않고도 캐리어를 잡기 위한 판, 플랫폼, 핸들 또는 다른 메카니즘(18)을 가질 수 있다. 보유 메카니즘(19)은 매니폴드 조립체의 하나 이상 부분, 더욱 바람직하게는 매니폴드 조립체의 스커트와 맞물리게 하여 "걸쇠 정합"을 제공하는 돌출부, 후크, 빗장 또는 립(lip)을 포함할 수 있다.
도 5는 예시적인 마이크로유체 장치 또는 "칩-상-기관" 장치의 개략도를 나타낸다. 도 5a의 조립된 장치는 다수의 포트를 포함한다. 도 5b는 멤브레인(100)을 포함하는 조직-조직 경계면 모사 영역 ("SR")을 보여주는 도 5a 장치의 분해도를 나타내는 것으로써, 여기에서 세포 거동 및/또는 기체, 화학물질, 분자, 미립자 및 세포의 통과가 모니터링된다.
버블은 칩이 관류 매니폴드 조립체 (관류 일회용품으로도 지칭됨)에 의해 맞물릴 때에 도입될 수 있다. 도 4a 및 4b는 이와 같은 점을 강조하고 있는데, 도 4a에 원으로 나타낸 위치에서 관류 일회용품 (칩이 아님)에 포획되어 있는 버블 (화살표 참조)을 보여준다. 압력과 유량을 조합하는 것에 대하여 상기한 방법 실시양태들 중 어떠한 것도 그와 같은 마이크로유체 장치에서 그와 같은 버블의 부피를 감소시키는 데에 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, POD는 배양 모듈상에 위치되며, 배양 모듈의 압력 표면이 아래로 움직여 관류 매니폴드 조립체(10)의 덮개 또는 뚜껑(11)이 맞물리게 한다. 배양 모듈의 실시양태에 대해서는 의거 참조로써 개재되는 미국 특허 출원 제15/248,509호에 기술되어 있다. 도 1c에 나타낸 바와 같이, 덮개 또는 뚜껑은 배양 모듈 압력 표면상의 상응하는 압력점에 의해 맞물리는 포트 예컨대 관통-구멍 포트(36)를 포함한다. 맞물리는 경우, 이러한 포트들(36)은 덮개 및 가스켓(37)을 통하여 적용된 압력을 내부로 전파함으로써, 관류 매니폴드 조립체(10) 용기(12) 내의 유체에 압력을 적용한다. 따라서, 이와 같은 실시양태에서, 압력은 뚜껑(11)을 통하여 적용되며, 용기(들)에 대치하여 뚜껑이 밀봉된다. 예를 들어 1 kPa 적용시의 경우, 이와 같은 공칭 압력은 일 실시양태에서 대략 30-40 μL/시간의 유량을 초래한다.
실험부
실시예 1
본 실험에서는, 칩-상-기관 (본 경우에서는, 마이크로채널 내 멤브레인상에서 성장하는 생존 장 세포를 보유하는 마이크로유체 장치)와 맞물리게 하는 19개의 포드를 이용하였다. 그들을 버블의 이력 없이, 미리 6일 동안 전개시켰다. 시험 군에서는, 유입구 용기에 제0일 및 제2일에는 저온 배지 (4℃)를, 그리고 제7일에는 가온 배지 (평형화되지 않음)를 충전하였다. 해독치로는 매일 유량을 측정하였으며 (버블은 유동을 붕괴시키며, 그에 따라 유량의 변화는 버블을 표시하게 되기 때문임); 또한 시각적으로 버블에 대하여 포드/칩을 검사하였다. 결과는 도 11a 및 11b에 나타내었다. 9일에 걸쳐 비-평형화 배지 (가온 또는 저온)를 사용하였을 때, 어떠한 포드/칩에서도 버블 성장/발생이 관찰 또는 검출되지 않았다.
실시예 2
본 실험에서는, 더 높은 압력을 견디는 관류 시스템의 일 실시양태의 능력을 시험하였다 (더 높은 압력에서 비-평형화 배지를 사용하여 작업하는 것이 실행가능한지를 보기 위한 것임). 뚜껑 (도 1c) 및 기타 경계면 (예컨대 가스켓, 접합된 구성요소 등)을 포함하여, 다양한 POD상 구성요소들 (도 1a 및 1b)을 조사하였다. 또한, 이러한 압력 시험에서, 배양 모듈의 구성요소들 (의거 참조로써 개재되는 미국 특허 출원 제15/248,509호에 기술되어 있는 것들)도 조사하였다 (예컨대 매니폴드, 밸브 및 연결부들). 압력이 상승되어 25-30 kPa에 접근하면, 얇은 가스켓 (도 1c, 요소 37)이 구비된 관류 시스템은 뚜껑 고장 및 누출을 나타내었다 (도 12a). 그러나, 더 두꺼운 가스켓 (얇은 가스켓에 비해 2-3배 더 두꺼운 것)의 경우, 33 kPa에서도 뚜껑 고장이나 누출이 존재하지 않았다 (도 12b). 더 두꺼운 가스켓을 사용하면, 관류 시스템은 유입구에서는 ~34 kPa, 그리고 유출구에서는 ~33 kPa를 견딜 수 있다.
실시예 3
본 실험에서는, 부정적인 세포 영향이 존재하는지를 확인하기 위하여, 더 높은 유량을 시험하였다. 더 구체적으로는, 7일 유지 후의 인간 초대 인간 운동 뉴런의 생존력 및 기능을 평가하였다 (이들이 배양 조건 및 전단력에 상대적으로 민감하기 때문임). 50 (대조) 내지 75 μL/시간 (시험)의 유량을 사용하여 POD (도 1a 및 1b)에 맞물린 마이크로유체 칩 내의 세포를 관류하였는데, 상기 POD는 배양 모듈 (의거 참조로써 개재되는 미국 특허 출원 제15/248,509호에 기술되어 있는 것)과 맞물려 있었다. 유출구 압력은 20.0 kPa +/- 0.5kPa이었다. 유입구 압력 빼기 유출구 압력 [(유입구 압력) - (유출구 압력)]은 1.5 kPa +/- 0.5 kPa이었다. 초대 운동 뉴런을 접종하고 (제0일), 7일 동안 배양하였는데, 2일마다 배지를 보충하였다. 제1일 및 제5일에 압력/유량 공정을 전개하여 버블을 처리하였다. 제3일 및 제5일에는 저온 배지를 POD 용기에 위치시켰다. 세포를 촬영하였다 (200X에서 상 대조 포착).
대조 및 실험 조건 모두에서 축삭 성장이 관찰되었다. 도 13은 제0일, 제1일, 제4일 및 제5일의 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 50 μL 조건의 경우 2개의 독립적인 POD에서의 평균±SE, 그리고 75 μL 조건의 경우 3개의 독립적인 POD에서의 평균±SE이었다.
세포 핵을 표시하는 훽스트 33342 (청색), 그리고 β-튜불린 3 - 뉴런 축삭에서의 미세소관 안정성 및 수송에 필수적인 단백질 -를 표시하는 Tuj-1 (녹색)을 사용하여 운동 뉴런을 염색하였다 (7일 후). 뉴런 염색은 대조 (50 μL/시간) 및 시험 (75 μL/시간)에서 잘 발달된 뉴런 네트워크를 나타내었다 (데이터 미도시). 종합하면, 실험은 1) 운동 뉴런이 상승된 유량, 즉 버블 제거를 촉진하는 것을 돕는 유량을 감당할 수 있다는 것, 2) 적용 압력 20 kPa에서 다수의 압력/유량 주기를 감당할 수 있다는 것, 및 3) 정상적인 배지 재보급/첨가 단계 동안의 유입구 용기를 재충전하기 위한 저온 배지의 사용이 시스템 버블을 제거하기 위한 최초 압력/유량 단계 후 버블의 형성을 야기하지 않는다는 것을 보여주었다.

Claims (103)

  1. a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 버블을 포함하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    b) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 실질적으로 기체 비투과성인 중합체로 구성되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중합체가 시클릭 올레핀 중합체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 마이크로채널이 관류 매니폴드 내에 존재하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 관류 매니폴드가 마이크로유체 칩과 맞물려 있으며 유체 소통하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 관류 매니폴드가 스커트를 포함하며, 상기 스커트가 상기 마이크로유체 칩과 맞물리게 하는 측면 트랙을 포함하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 마이크로유체 칩이 하나 이상의 포트를 포함하며, 상기 관류 매니폴드가 상기 하나 이상의 포트를 통하여 상기 마이크로유체 칩과 유체 소통하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 관류 매니폴드가 상기 하나 이상의 포트를 통하여 일정 유량으로 상기 마이크로유체 칩에 유체를 전달하는 것인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 상기 제1 압력이 21 kPa이고, 상기 제2 압력이 20 kPa인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 유량이 40 μL/시간인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 마이크로유체 장치가 상기 마이크로채널 내에 생존 세포를 포함하며, 상기 유체가 상기 생존 세포에 공급되는 배지를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계 b) 전의 상기 배지가 탈기된 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 단계 b)의 상기 배지가 불포화인 방법.
  19. 제16항에 있어서, 단계 b) 전의 상기 배지가 탈기되지 않은 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계 b)가 적어도 1시간 동안 수행되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 단계 b)가 2시간 동안 수행되는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, c) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 실질적으로 기체 비투과성인 중합체로 구성되고, 상기 마이크로채널이 버블을 포함하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    b) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 마이크로채널이 관류 매니폴드 내에 존재하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 관류 매니폴드가 마이크로유체 칩과 맞물려 있으며 유체 소통하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 관류 매니폴드가 스커트를 포함하며, 상기 스커트가 상기 마이크로유체 칩과 맞물리게 하는 측면 트랙을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 마이크로유체 칩이 하나 이상의 포트를 포함하며, 상기 관류 매니폴드가 상기 하나 이상의 포트를 통하여 상기 마이크로유체 칩과 유체 소통하는 것인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 제1 압력이 21 kPa이고, 상기 제2 압력이 20 kPa인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  33. 제23항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  34. 제23항에 있어서, 유체의 상기 유동이 40 μL/시간의 유량을 갖는 것인 방법.
  35. 제23항에 있어서, 상기 마이크로유체 장치가 상기 마이크로채널 내에 생존 세포를 포함하며, 상기 유체가 상기 생존 세포에 공급되는 배지를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계 b) 전의 상기 배지가 탈기된 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 단계 b)의 상기 배지가 불포화인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 단계 b) 전의 상기 배지가 탈기되지 않은 것인 방법.
  39. 제23항에 있어서, 단계 b)가 적어도 1시간 동안 수행되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 단계 b)가 2시간 동안 수행되는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, c) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 것인 단계;
    b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 유량으로 유체를 유동시키는 단계;
    c) 버블을 검출하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    d) 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않으면서, 압력을 사용하여 상기 버블 부피를 감소시키는 단계
    를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 단계 c)의 상기 버블이, 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치되는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 압력이 21 kPa이고, 상기 제2 압력이 20 kPa인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  49. 제42항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  50. 제42항에 있어서, 상기 유량이 40 μL/시간인 방법.
  51. 제42항에 있어서, 상기 유체가 상기 살아있는 세포에 공급되는 배양 배지를 포함하며, 상기 세포가 단계 d) 후에도 여전히 살아있는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단계 d) 전의 상기 배지가 탈기된 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 단계 d)의 상기 배지가 불포화인 방법.
  54. 제51항에 있어서, 단계 d) 전의 상기 배지가 탈기되지 않은 것인 방법.
  55. 제42항에 있어서, 단계 d)가 적어도 1시간 동안 수행되는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 단계 d)가 2시간 동안 수행되는 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, e) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. a) 제1 유체 포트를 포함하는 제1 기재, 제2 유체 포트를 포함하는 제2 기재를 제공하는 단계;
    b) 제1 및 제2 유체 포트 세트를 정렬하는 단계;
    c) 버블이 형성되는 조건하에서 제1 및 제2 유체 포트를 접촉시켜 유체 연결을 설정하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    d) 상기 버블 부피가 감소되도록 하는 조건하에서 상기 제1 또는 제2 포트를 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 유체 연결을 설정하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제1 기재가 제2 기재를 안내하도록 적합화된 안내 메카니즘을 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 단계 b) 전에, 제2 기재를 안내 메카니즘과 맞물리게 하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제59항에 있어서, 단계 b)의 상기 정렬이 안내 메카니즘을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 안내 메카니즘이 상기 제1 기재상에 위치되는 안내 트랙을 포함하며, 상기 안내 트랙이 상기 제2 기재의 일부와 맞물리게 하도록 구성되는 것인 방법.
  63. 제58항에 있어서, 단계 c)의 상기 버블이, 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치되는 것인 방법.
  64. 제58항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  67. 제58항에 있어서, 유체의 상기 유동이 40 μL/시간의 유량을 갖는 것인 방법.
  68. 제58항에 있어서, 상기 제1 기재가 상기 포트와 유체 소통하는 채널을 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 채널이 마이크로채널인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 제1 기재가 관류 매니폴드인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 제2 기재가 마이크로유체 장치인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 단계 c)에서, 상기 관류 매니폴드가 상기 마이크로유체 장치와 맞물리게 하는 것인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 마이크로유체 장치가 마이크로채널을 포함하며, 상기 마이크로채널이 살아있는 세포를 포함하고, 상기 유체가 상기 세포에 공급되는 배지를 포함하는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 단계 d) 전의 상기 배지가 탈기된 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 단계 d)의 상기 배지가 불포화인 방법.
  76. 제73항에 있어서, 단계 d) 전의 상기 배지가 탈기되지 않은 것인 방법.
  77. 제58항에 있어서, 단계 d)가 적어도 1시간 동안 수행되는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 단계 d)가 2시간 동안 수행되는 것인 방법.
  79. 제77항에 있어서, e) 상기 마이크로채널로 유체를 도입하는 단계로서, 상기 유체가 탈기되지 않은 것인 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. a) 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 상기 마이크로채널이 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 것인 단계;
    b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 유량으로 유체를 유동시키는 단계로서, 상기 유체가 상기 유동 전에 유체가 불포화가 되도록 처리된 것인 단계;
    c) 버블을 검출하는 단계로서, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    d) 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않으면서, 일정 시간 기간 동안 압력을 사용하여 상기 버블 부피를 감소시키는 단계로서, 살아있는 세포가 상기 시간 기간 후 상기 마이크로채널 내에 존재하는 것인 단계
    를 포함하는, 버블 부피를 감소시키는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  82. 제80항에 있어서, 단계 c)의 상기 버블이, 실질적으로 기체 비투과성인 중합체에 대치하여 위치되는 것인 방법.
  83. 제81항에 있어서, 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제1 압력이 적어도 0.5 kPa만큼 더 큰 것인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 제1 압력이 21 kPa이고, 상기 제2 압력이 20 kPa인 방법.
  86. 제80항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  88. 제80항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  89. 제80항에 있어서, 유체의 상기 유동이 40 μL/시간의 유량을 갖는 것인 방법.
  90. a) i) 비-평형화 배양 배지 및 ii) 그에 부착된 살아있는 세포를 포함하는 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계; 및
    b) 상기 세포상으로 상기 마이크로채널을 통하여 일정 시간 기간 동안 압력하에 일정 유량으로 상기 비-평형화 배양 배지를 유동시키며, 상기 유체의 상기 유동을 중지하지 않는 단계로서, 살아있는 세포가 상기 시간 기간 후 상기 마이크로채널 내에 존재하고, 상기 마이크로채널 내에서 버블이 보이지 않는 것인 단계
    를 포함하는, 비-평형화 배양 배지를 사용하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 마이크로채널이, 상기 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 제1 압력이 적어도 0.5 kPa만큼 더 큰 것인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 상기 제1 압력이 2 kPa 미만만큼 더 큰 것인 방법.
  95. 제83항에 있어서, 상기 제1 압력이 34 kPa이고, 상기 제2 압력이 33 kPa인 방법.
  96. 제90항에 있어서, 상기 버블이 기체 버블인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 기체가 산소, 질소 또는 이들의 혼합물인 방법.
  98. 제90항에 있어서, 상기 버블이 공기 버블인 방법.
  99. 제80항에 있어서, 비-평형화 배양 배지의 상기 유동이 40 μL/시간의 유량을 갖는 것인 방법.
  100. a) 변형가능한 멤브레인에 의해 분리된 제1 및 제2 마이크로채널을 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계로서, 버블이 상기 제1 또는 제2 마이크로채널 또는 모두 내에 존재하고, 상기 버블이 부피를 갖는 것인 단계; 및
    b) 상기 버블 부피가 감소되고 상기 변형가능 멤브레인이 변형되지 않도록 하는 조건하에서 상기 제1 및 제2 마이크로채널을 통하여 압력하에 유체를 유동시키는 단계
    를 포함하는, 2개의 마이크로채널이 구비된 마이크로유체 장치에서 버블 부피를 감소시키는 방법.
  101. 제100항에 있어서, i) 상기 제1 마이크로채널이, 상기 제1 마이크로채널 제1 단부의 제1 용기 및 상기 제1 마이크로채널 제2 단부의 제2 용기와 유체 소통하고, ii) 상기 제2 마이크로채널이, 상기 제2 마이크로채널 제1 단부의 제3 용기 및 상기 제2 마이크로채널 제2 단부의 제4 용기와 유체 소통하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, i) 상기 제1 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제2 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 크고, ii) 상기 제3 용기가 제1 압력하에 유체를 포함하고, 상기 제4 용기가 제2 압력하에 유체를 포함하며, 여기서 상기 제1 압력은 상기 제2 압력에 비해 더 큰 것인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 제2 용기와 상기 제4 용기가 압력 조절기를 공유하는 것인 방법.
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