KR20190025941A - 부인과 신생물 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 마커 유전자의 과메틸화에 기반하여 부인과 신생물의 존재 또는 상기 부인과 신생물의 악성 종양을 평가하기 위한 다양한 방법을 개시한다.
Description
본 개시내용은 암 진단에 관한 것이다. 보다 특히, 개시된 방법은 선택된 마커의 메틸화 상태에 기초한 암 진단 방법에 관한 것이다.
부인과 암은 여성의 생식 기관으로부터 기인하는 비정상적인 세포의 억제되지 않은 성장이다. 부인과 암의 주요 유형은 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암/자궁암(이하, 자궁내막암), 질암, 및 외음부암을 포함하며, 일부 희귀한 부인과 암은 임신 융모성 질환(GTD) 및 원발성 복막 암을 포함한다.
자궁내막 암(EC)은 국가의 부인과 암의 주요 원인이며 전세계에서 여섯번째로 진단받은 여성 암을 차지한다. 세계 보건기구의 GLOBOCAN 프로젝트에 따르면 2012년에 EC의 발병률과 사망률은 각각 약 310,000과 76,000이었으며, 2020년에는 EC로부터 380,000건의 신규 사례와 93,000건의 사망이 예상되는 것으로 추정된다
대부분의 자궁내막 암은 폐경이 진행되고 있거나 폐경을 경험한 여성에서 발견된다. 그러나, 어떠한 징후 또는 증상도 없는 사람들의 경우, 자궁암 검사를 위한 간단하고 신뢰할 만한 방법이 없다. 증상을 나타내거나 자궁내막 암에 대한 위험이 높은 환자의 경우, 자궁내막 생검 또는 경질 초음파를 수행하여 자궁 암을 진단하거나 배제하는 것을 도울 수 있다.
EC는 크게 조직병리학적 평가에 의해 두 가지 유형으로 분류될 수 있다. I형 EC는 잘 분화된(등급 1 내지 2) 자궁내막양 선암을 포함한다. 유형 II EC는 혈청 유형, 투명 세포 및 불량하게 분화된(등급 3) 자궁내막양-유형 형태를 포함한다. 대부분의 I형 EC는 초기 단계(I 단계 또는 II 단계)에서 진단되며 유리한 결과는 얻는 반면, II형 EC는 전형적으로 진행 단계에서 진단되며 비교적 불량한 예후를 갖는다. 자궁내막양-유형 EC를 가진 대부분의 환자가 초기 단계에서 진단되지만, 말기 자궁내막양 EC를 갖는 환자의 15%는 50 % 미만의 불량한 5년 생존율을 갖는다(III 단계에 대해서는 40-50%, IV 단계에 대해서는 15-20%). 조기 발견은 결과를 향상시키는 가장 좋은 방법이다. 그러나, 현재 EC 스크리닝에는 만족할 만한 방법이 없다.
비정상적인 자궁 출혈은 EC의 가장 빈번한 증상이지만, 많은 다른 장애가 동일한 증상을 일으킨다. 폐경기 여성에서 출혈이 일어나더라도 단지 10 %의 경우가 EC에 의해 유발된다. 이상적인 검출 전략의 선택은 민감도, 특이성, 정확성 확률 및 비용에 달려 좌우된다. 경질 초음파(TVU)는 EC를 배제하기 위해 사용된다. 그러나, 증상이 있는 폐경전 여성과 호르몬 대체 요법을 받는 여성에서 TVU의 컷오프 값(cutoff value)은 순환하는 여성 스테로이드 호르몬의 영향 하에 자궁내막의 두께가 변하기 때문에 더 낮다. 외래 환자 세팅에서 흡입 소파술로 얻은 자궁내막 샘플은 TVU에 비해 민감도와 특이도가 더 높을 수 있다. 그러나, 이러한 침습적 절차의 실패율은 최대 54 %일 수 있다. 임상 지침은 자궁 내막 샘플링이 진단을 위해 불충분하거나 포괄적인 경우 마취하에 분지 확장 및 소파술(D & C)을 권한다. 따라서, 많은 환자들은 자궁내막 샘플링 또는 D & C에 의해 반복적으로 침습적인 평가를 받는데, 이는 불편하고 스트레스가 많으며 비용이 많이 든다.
한편, 자궁경검사의 진단 정확도는 폐경기 전후 여성 모두에서 86.4 %의 전체 민감도와 99.2 %의 특이도를 달성할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 자궁내막 샘플링 또는 자궁경검사를 받아야 하는 TVU로 진단된 자궁내막 두께에 대한 최상의 컷오프 값에 대한 논란이 있다. EC의 존재 또는 부재를 검출하는 비침습적인 방법은 암 항원 125(CA-125)의 혈청 및 자궁경부질 농도를 측정하는 것이다. 인디케이터로서 CA-125를 사용하는 정확성은 자궁선근증 또는 자궁근종 및 자궁내막증과 같은 양성 병태로 인해 쉽게 혼란스럽게 된다. 자궁경부 도말로부터의 세포학은 또한 EC 검출에 사용되었지만 비정상적인 결과의 비율은 I형 EC의 경우 32.3 %로부터 86.0 % 까지 이며 II형 EC의 경우 57.1 %로부터 100 %까지 다양하다.
전술한 관점으로부터, 부인과 종양, 특히 자궁내막 암의 진단에 사용하기 위한 방법을 제공하기 위한 관련 기술이 필요하다.
다음은 독자들에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 개시내용의 단순화된 요약을 제공한다. 이 요약은 본 개시내용의 광범위한 개요는 아니며, 본 발명의 주요/결정적인 요소를 식별하거나 본 발명의 범위를 기술하지 않는다. 본 발명의 유일한 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 후술되는 보다 상세한 설명의 서두로서 간단한 형태로 제시하는 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체가 자궁내막 암(EC)을 갖는지 여부를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 상기 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 샘플 중의 적어도 하나의 표적 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22(서열번호 1) 또는 THY1(서열번호 2) 또는 둘 다인, 단계;
(c) 상기 적어도 하나의 표적 유전자가 과메틸화되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과에 기반하여 상기 대상체가 EC를 갖는지 여부를 평가하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화가, 상기 대상체가 EC를 갖는지를 나타내는 단계.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 샘플은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로부터 수득되거나, 또는 대상체, 바람직하게는 인간 대상체 내에 존재하는 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 대상체의 자궁내막 조직 또는 세포 샘플(예를 들어, 자궁경부 도말 세포)로부터 수득된다.
본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 하기 추가 유전자 중 적어도 하나를 추가로 포함한다: ADARB2(서열번호 3), CDO1(서열번호 4), CELF4(서열번호 5), CLVS2(서열번호 6), GATA4(서열번호 7), HOXA9(서열번호 8), MTMR7(서열번호 9), NTM(서열번호 10), PRKCDBP(서열번호 11), TBX5(서열번호 12), 및 ZNF662(서열번호 13). 이들 구현예에서, BHLHE22 및/또는 THY1의 메틸화 상태, 및 추가의 유전자 중 적어도 하나의 메틸화 상태가 결정되며, 단계 (d)에서 상기 선택된 유전자의 과메틸화 상태에 기반하여 평가한다.
다른 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP, 및 TBX5를 포함한다.
특정 구현예예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 및 CDO1을 포함한다. 다른 경우에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 및 CELF4를 포함한다. 대안적으로, 적어도 하나의 유전자는 BHLHE22, CDO1, 및 CELF를 포함한다. 이들 경우에서, 단계 (b)에서, BHLHE22, 및 CDO1 및 CELF4 중 하나 또는 둘 다의 메틸화 상태가 결정되며, 단계 (d)에서, BHLHE22, 및 CDO1 및 CELF4 중 하나 또는 둘 다의 과메틸화 상태에 기반하여 평가한다. 본 개시내용의 임의의 구현예에서, 샘플은 대상체의 자궁경부 도말 세포로부터 수득된다.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 자궁내막 암은 I형 자궁내막 암인 반면, 다른 구현예에서, 자궁내막 암은 II형 자궁내막 암이다.
임의로, 상기 언급된 본 개시내용의 구현예에서 기술된 바와 같이, 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는, 메틸화-특이적 폴리머라제 연쇄 반응(MSP), 정량적 메틸화-특이적 폴리머라제 연쇄 반응(qMSP), 바이설파이트 서열분석(BS), 바이설파이트 파이로서열분석, 마이크로어레이, 질량 분석법, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC), 파이로서열분석, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응과 결합된 메틸화 DNA 면역침전(MeDIP 또는 mDIP), 메틸화 DNA 면역침전 서열분석(MeDIP-seq), 또는 나노포어 서열분석을 수행함으로써 달성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상기 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 샘플 중의 적어도 하나의 표적 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 ADARB2(서열번호 3), CLVS2(서열번호 6), HOXA9(서열번호 8), MTMR7(서열번호 9), 및 NTM(서열번호 10)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단계;
(c) 상기 적어도 하나의 표적 유전자가 과메틸화되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과에 기반하여 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 여부를 평가하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화가 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지를 나타내는, 단계.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 샘플은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로부터 수득되거나 대상체, 바람직하게는 인간 대상체 내에 존재하는 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 대상체의 자궁내막 조직 또는 세포 샘플(예를 들어, 자궁경부 도말 세포)로부터 수득된다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 부인과 암종은 I형 자궁내막 암종, II형 자궁내막 암종, 난소 암종, 질 암종, 외음부 암종, 임신 융모성 질환(GTD) 및 원발성 복막 암종이다.
임의로, 상기 언급된 본 개시내용의 구현예에서 기술된 바와 같이, 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는, 메틸화-특이적 폴리머라제 연쇄 반응(MSP), 정량적 메틸화-특이적 폴리머라제 연쇄 반응(qMSP), 바이설파이트 서열분석(BS), 바이설파이트 파이로서열분석, 마이크로어레이, 질량 분석법, 변성 고성능 액체 크로마토그래피(DHPLC), 파이로서열분석, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응과 결합된 메틸화 DNA 면역침전(MeDIP 또는 mDIP), 메틸화 DNA 면역침전 서열분석(MeDIP-seq), 또는 나노포어 서열분석을 수행함으로써 달성될 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 확인된 바이오마커(들)의 용도에 관한 것이다. 특히, 바이오마커(들)은 대상체가 이들 바이오마커 중 하나 이상과 관련된 암종을 갖고 있는지를 평가하기 위한 진단 키트를 제조하는데 사용될 수 있다.
인식할 수 있는 바와 같이, 상기 바이오마커(들)의 메틸화 상태를 측정하기에 적합한 물질을 포함하는 진단 키트는 또한 본 개시내용의 범위에 포함된다.
본 개시내용의 다수의 부수적인 특징 및 장점은 첨부된 도면과 관련하여 고려되는 이하의 상세한 설명을 참조하면 더 잘 이해 될 것이다.
본 개시내용은 첨부한 도면을 고려한 하기 상세한 설명으로부터 더 잘 이해 될 것이다:
도 1은 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 본 발명의 MBDcap-Seq 및 암 게놈아틀라스(TCGA)로부터의 공개 데이터 조직의 후보 유전자의 메틸화 시그니처를 나타내는 상관 매트릭스(패널 A) 및 히트맵(패널 B)을 나타낸다;
도 2는 본 개시내용의 일 실시예에 따라 BHLHE22, CDO1, CELF4 및 ZNF662 (패널 A)에 대한 메틸화 상태의 분포 및 상기 4가지 유전자(패널 B)의 성능을 나타내는 점 플롯(dot plot)을 제공한다;
도 3은 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 자궁내막 암 검출을 위해 개별 자궁내막 조직을 사용하여 15가지 유전자의 DNA 메틸화 수준을 요약한 것이다;
도 4는 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 자궁내막 암 검출을 위한 개별적인 자궁경부 모달을 사용하여 1 유전자의 DNA 메틸화 수준을 요약한 것이다;
도 5는 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 트레이닝 세트(패널 A) 및 시험 세트(패널 B)로부터의 샘플을 사용하여 후보 유전자의 성능을 나타내는 플롯을 제공한다;
도 6은 본 개시내용의 일 실시예에 따라. 다른 결장, 자궁경부 또는 난소 암종에서 6가지 후보 유전자의 교차-시험 결과를 요약한 것이다.
도 1은 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 본 발명의 MBDcap-Seq 및 암 게놈아틀라스(TCGA)로부터의 공개 데이터 조직의 후보 유전자의 메틸화 시그니처를 나타내는 상관 매트릭스(패널 A) 및 히트맵(패널 B)을 나타낸다;
도 2는 본 개시내용의 일 실시예에 따라 BHLHE22, CDO1, CELF4 및 ZNF662 (패널 A)에 대한 메틸화 상태의 분포 및 상기 4가지 유전자(패널 B)의 성능을 나타내는 점 플롯(dot plot)을 제공한다;
도 3은 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 자궁내막 암 검출을 위해 개별 자궁내막 조직을 사용하여 15가지 유전자의 DNA 메틸화 수준을 요약한 것이다;
도 4는 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 자궁내막 암 검출을 위한 개별적인 자궁경부 모달을 사용하여 1 유전자의 DNA 메틸화 수준을 요약한 것이다;
도 5는 본 개시내용의 일 실시예에 따라, 트레이닝 세트(패널 A) 및 시험 세트(패널 B)로부터의 샘플을 사용하여 후보 유전자의 성능을 나타내는 플롯을 제공한다;
도 6은 본 개시내용의 일 실시예에 따라. 다른 결장, 자궁경부 또는 난소 암종에서 6가지 후보 유전자의 교차-시험 결과를 요약한 것이다.
첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공된 상세한 설명은 본 발명의 실시예에 대한 설명으로 의도되었으며, 본 발명의 실시예가 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내는 것은 아니다. 설명은 실시예의 기능 및 실시예를 구성하고 작동하기 위한 단계의 순서를 설명한다. 그러나, 동일한 또는 동등한 기능 및 순서는 상이한 실시예에 의해 달성될 수 있다.
편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어들이 여기에 수집된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 이의 복수 형태를 포함하고 복수의 용어는 단수를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a" 및 "an"는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 또한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며 하나, 둘, 셋 또는 그 이상을 포함한다. 또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 것으로서 "A, B, 및 C 중 적어도 하나", "A, B, 또는 C 중 적어도 하나" 및 "A, B 및/또는 C 중 적어도 하나"라는 문구는 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B는 함께, B와 C는 함께, A와 C는 함께 뿐만 아니라 A, B, 및 C는 함께를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 넓은 범위를 기술하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치 임에도 불구하고, 특정 실시예에 기술된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 임의의 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로 부터 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1%, 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자에 의해 고려될 때 평균의 허용가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작업 실시예 이외에, 또는 달리 명확히 명시되지 않는 한, 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 본원에 기재된 재료의 양, 시간의 지속기간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등에 대한 것들은 모든 경우에 "약"이라는 용어로 수정된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 본 개시내용 및 첨부된 청구범위에 기술된 수치 파라미터는 원하는 만큼 변할 수 있는 근사치이다. 매우 최소한으로, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수를 고려하고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 범위는 여기에서 하나의 종점으로부터 또 다른 종점 또는 두 종점 사이에서 표현될 수 있다. 본원에 개시된 모든 범위는 달리 명시되지 않는 한 종점을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "진단"은 병리학적 상태, 질환 또는 병태, 예컨대, 자궁 경부, 난소, 자궁 내막/자궁, 질, 외음부, 자궁, 및 자궁 내막 복막을 포함한 다양한 부인과 조직 기원의 신생물의 확인을 지칭한다. 일부 경우에, 진단이라는 용어는 또한 악성 및 양성 신생물을 구별하는 것을 지칭한다. 일부 다른 경우에, 진단이라는 용어는 악성 신생물과 정상 조직을 구별하는 것을 지칭한다.
본 개시내용 전반을 통해, 용어 "신생물"은 세포의 새롭고 비정상적인 성장 또는 정상보다 더 빨리 재생하는 비정상적인 세포의 성장을 말한다. 신생물은 양성 또는 악성일 수 있는 비구조적 매쓰(종양)를 만든다. 용어 "양성"은 종양이 아닌 신생물 또는 종양을 지칭하는 것으로, 예를 들어, 세포가 주변 조직을 침범하거나 멀리 떨어진 부위로 전이하지 않는다; 반면, 용어 "악성"은 전이성이거나, 인접한 조직을 침범하거나, 정상적인 세포 성장 조절하에 있지 않은 신생물 또는 종양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 또는 악성 신생물 또는 종양을 지칭한다. 본 개시내용의 다양한 구현예에 따른 방법은 부인과 기원의 하나 이상의 암종을 진단하는 것에 관한 것이다. 용어 "암종"은 상피 세포로부터 기원하는 악성 종양을 지칭한다. 본 개시내용의 구현예의 예시적인 부인과 암종은 난소 암, 자궁내막 암, 질 암, 외음부 암, 및 원발성 복막 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메틸화"는 유전자의 핵심 프로모터 영역의 CpG 디뉴클레오타이드 내의 시토신의 C5-위치에서 메틸 그룹의 공유 부착을 지칭한다. 용어 "메틸화 상태"는 관심 유전자 또는 핵산 서열 내의 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클레오타이드에서 5-메틸-시토신(5-mCyt)의 존재 또는 부재를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메틸화 수준"은 관심 유전자 또는 핵산 서역의 하나 이상의 카피물에서 메틸화의 양을 지칭한다. 메틸화 수준은 관심 유전자 또는 핵산 서열 내 메틸화의 절대 척도로서 계산될 수 있다. 또한, "상대적 메틸화 수준"은 존재하는 총 DNA 양에 상대적으로 메틸화된 DNA의 양으로서 또는 관심있는 유전자 또는 핵산 서열의 메틸화된 카피의 수로서 결정될 수 있다. 또한, "메틸화 수준"은 관심있는 DNA 스트레치 내의 메틸화된 CpG 부위의 백분율로 결정될 수있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메틸화 프로파일"은 관심있는 샘플에서 하나 이상의 표적 유전자의 메틸화 수준을 나타내는 데이터 세트를 지칭한다. 일부 구현예에서, 메틸화 프로파일은 공지된 유형의 샘플(예를 들어, 암성 또는 비암성 샘플 또는 암의 상이한 단계로부터의 샘플)로부터 유도된 기준 메틸화 프로파일과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "차등 메틸화"는 또 다른 샘플 또는 그룹에서의 상기 하나 이상의 표적 유전자의 메틸화 수준과 비교하여 하나의 샘플 또는 그룹에서 하나 이상의 표적 유전자의 메틸화 수준에서의 차이를 지칭한다. 차등 메틸화는 증가된 메틸화("과메틸화") 또는 감소된 메틸화("저메틸화")로 분류될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 시험 샘플에서 표적 유전자의 "과메틸화"라는 용어는 기준 샘플에서 표적 유전자의 평균 메틸화 수준에 비해 적어도 10%의 증가된 메틸화 수준을 나타낸다. 본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 증가된 메틸화 수준은 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50%일 수 있다.
인식할 수 있는 바와 같이, 본원에 기재된 모든 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 각각 명명된 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 75%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 이들의 변이체를 포함한다. 또한, 표적 유전자 서열은 또한 이의 바이설파이트 전환 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 모든 경우에 "그리고 이의 바이설파이트 전환 뉴클레오타이드 서열, 및 상기 유전자 또는 상기 바이설파이트 전환 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도 75%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열"이라는 문구에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 확인된 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 "백분율(%) 뉴클레오타이드 서열 동일성"은, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 필요에 따라 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 간격을 도입한 후에 기준 폴리뉴클레오타이드 서열에서 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드 잔기의 백분율로서 정의된다. 백분율 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 기준 폴리뉴클레오타이드 서열 B에 대한 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열 A의 백분율 뉴클레오타이드 서열 동일성(기준 폴리뉴클레오타이드 서열 B에 대한 특정 % 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열 A로 선택적으로 표현될 수 있음)은 하기 식으로 계산된다:
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 BLAST에 의해 동일한 일치로서 점수 매겨진 뉴클레오타이드 잔기의 수이고, Y는 어느 것이 든 더 짧은 A 또는 B의 뉴클레오타이드 잔기의 총 수이다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 본 발명의 진단 방법에 적용될 수 있는 인간 종을 포함하는 동물을 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 개시내용의 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. 용어 "포유동물"은 인간, 영장류, 가축 및 농장 동물, 예컨대 토끼, 돼지, 양 및 소 뿐만 아니라 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 설치류, 예컨대 마우스 및 래트를 포함한 포유류의 모든 구성원을 지칭한다. 용어 "비인간 포유동물"은 인간을 제외한 포유동물의 모든 구성원을 의미한다. 하나의 일 구현예에서, 환자는 인간이다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 환자로부터 수득된 임의의 샘플을 포함한다. 본 개시내용의 구현예예에 따르면, 샘플은 DNA 분자를 함유하고, 이의 메틸화 수준이 결정될 수 있다. 이러한 신체 샘플의 예로는 혈액, 얼룩, 객담, 소변, 대변, 체액, 담즙, 위장 분비물, 림프액, 골육종 골수, 기관 흡인 및 장기 또는 조직 생검을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 신체 샘플은 당업자에게 공지된 통상적인 측정에 의해 환자로부터 수득될 수 있다. 또한, 당업자는 또한 샘플로부터의 DNA 분리, 예를 들어, 페놀/클로로포름을 사용한 또는 상업적 키트에 의한 추출을 위한 방법 및 시약에 대해서도 잘 알고 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 하기에 밝혀진 바와 같이 하나 이상의 표적 유전자의 차등 메틸화(특히, 과메틸화)가 대상체에서 종양 진행 또는 이의 부재에 관한 것이라는 발견에 기반한다. 따라서, 이들 표적 유전자는 단독으로 또는 조합하여, 신생물을 발생시키는 대상체의 위험 또는 감수성 예측, 신생물의 악성 종양의 결정을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 환자의 관련 유전자의 메틸화 프로파일은 적합한 치료 용법을 개별적으로 조정하기 위한 지침으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 열거된 하나 이상의 과메틸화 표적 유전자를 가진 환자의 경우, 탈메틸화제 또는 다른 후성 약물이 신생물을 치료하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.
상기 내용을 고려하여, 본 개시내용은 이하에서 개별적으로 다루어지는 다양한 진단 방법을 제공한다. 예를 들어, 모든 방법은 적어도 하나의 표적 유전자의 메틸화 상태 또는 메틸화 수준의 결정을 포함한다. 따라서, 대부분이 아닌 모든 주장된 방법에 공통적인 단계는 다음 단락에서 먼저 설명된다.
본 개시내용의 다양한 양태 및/또는 구현예에 따르면, 본 개시내용의 방법을 위한 공통 단계는 적어도, (a) 샘플 검색 단계, (b) 적어도 하나의 메틸화 상태 결정 단계; 및 (c) 적어도 하나의 과메틸화 결정 단계를 포함한다.
샘플 결정 단계에서, 살아있는 대상체를 포함하는 방법의 경우, 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득한다. 본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 샘플은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체로부터 수득되거나, 조직, 조직 샘플, 또는 세포 샘플(예를 들어, 조직 생검, 예를 들어, 흡인 생검, 브러쉬 생검, 표면 생검, 침 생검, 펀치 생검, 절제 생검, 개방 생검, 절개 생검, 내시경 생검, 자궁경부 도말 세포, 자궁 도말 세포 또는 질 세척), 종양, 종양 샘플, 또는 생물학적 유체(예를 들어, 복막액, 혈액(혈장 포함), 혈청, 림프액, 척수액)을 포함한 대상체, 바람직하게는 인간 대상체 내에 존재하는 샘플이다. 본 개시내용의 특정 작업 실시예 따르면, 샘플은 대상체의 난소 조직, 세포 샘플(예를 들어, 자궁경부 도말 세포) 및 체액(예를 들어, 혈청 및 혈장)으로부터 수득된다. 조직 생검 샘플, 자궁경부 도말 세포, 및 체액 샘플(예를 들어, 혈액 또는 소변)과 같은 기존의 생물학적 샘플에서 직접적으로 실행되는 방법에 대해서, 상기 언급된 샘플링 단계가 생략되며 후속 분석을 위해 기존 샘플이 검색된다.
단계 (b)와 관련하여, 하기 제공된 작업 실시예에 따르면 메틸화 상태는 qMSP 또는 바이설파이트 파이로서열분석을 사용하여 결정된다. 그러나, 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 상기 기재된 방법으로 제한되지 않으며, 오히려 청구된 발명의 범위는 특정 유전자의 메틸화 상태 또는 수준을 정량적으로 결정하기 위한 다른 동등한 방법의 사용을 포함한다. 인식할 수 있는 바와 같이, 상기 언급된 방법 및 그 등가물은 또한 하기 기술된 구현예에 적용 가능하며 따라서, 유전자의 메틸화 상태 또는 메틸화 수준을 결정하기에 적합한 방법은 간략함을 위해 다음의 양태/구현예에서 반복하지 않는다.
과메틸화 결정 단계에서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화의 유무가 결정된다.
제1 양태에서, 본 개시내용은 대상체가 자궁내막 암(EC)을 갖는지 평가하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플 결정 단계, 메틸화 결정 단계; 및 상기 기재된 평가 단계, 및 대상체에서 EC의 존재 또는 부재가 단계 (c)의 결과에 기초하여 결정되는 평가 단계 (d)를 포함한다. 구체적으로, 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화는 대상체가 EC를 갖는 것을 나타낸다. 본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화의 부재는 대상체가 EC를 갖지 않음을 나타낸다. 본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화의 부재는 자궁내막 신생물을 갖지 않거나 자궁내막 신생물이 양성임을 나타낸다; 예를 들어, 근종은 흔한 양성 자궁내막 신생물이다.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 또는 THY1 또는 둘 다이다.
일부 구현예에서, BHLHE22 및/또는 THY1 이외에, 표적 유전자는 적어도 하나의 ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 ZNF662를 추가로 포함한다.
특정 임의의 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 및 CDO1을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22, CDO1, 및 TBX5를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22, THY1, CDO1, 및 CLVS2를 포함한다. 추가의 일부 다른 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22, CDO1, 및 CELF4를 포함한다. 또 다른 예로서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 및 CELF4를 포함한다. 대안적으로, 적어도 하나의 표적 유전자는 THY1 및 CDO1을 포함한다. 추가의 대안적으로, 적어도 하나의 표적 유전자는 THY1 및 CDO1 뿐만 아니라 CLVS2 및 GATA4 중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP, 및 TBX5를 포함한다.
하나 이상의 표적 유전자의 메틸화 상태가 결정되는 구현예에서, 상기 표적 유전자의 과메틸화의 존재 또는 부재에 기초하여 평가가 이루어질 수 있다.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 샘플은 대상체의 자궁경부 도말 세포 또는 자궁내막 샘플로부터 유래된 것이다.
본 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 대상체가 초기 단계(국제 부인과 및 산부인과 협회 지침에 따른 I 단계 또는 II 단계)의 자궁내막 암종을 갖는지 평가하기 위해 사용된다. 일부 임의의 구현예에서, 샘플은 대상체의 자궁경부 도말 세포로부터 유래한 것이며, BHLHE22 및 적어도 하나의 CDO1 및 CELF4의 과메틸화는 대상체가 자궁내막 암종을 갖는다는 표시이다. 본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 자궁내막 암종은 I형 또는 II형 자궁내막 암종일 수 있다. II형 자궁내막 암종이 종종 암 발병의 후기 단계(예를 들어, 3 단계 또는 4 단계)에서 진단되는 종래의 진단 도구와 비교하여, 본 발명의 방법은 보다 악성 단계로 진행하기 전에 진단을 제공하는데 특별한 장점이 있다.
인식될 수 있는 바와 같이, 본 개시내용에 확인된 바이오마커는 대상체가 자궁내막 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 진단 도구를 제조하기 위해 사용될 수 있다
예를 들어, 키트는 BHLHE22, THY1, ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 ZNF662와 같은 하나 이상의 상기 확인된 바이오마커의 메틸화 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
제2 양태에 있어서, 본 개시내용은 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 평하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 상기한 바와 같은 공통 단계 (a), (b) 및 (c), 및 대상체에서 부인과 암종 또는 결장 암종의 존재가 단계 (c)의 결과에 기초하여 결정되는 평가 단계 (d)를 포함한다. 특히, 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화는 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지를 나타낸다. 본 개시내용의 일부 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화의 부재는 대상체가 부인과 신생물 또는 결장 신생물을 갖지 않거나 부인과 신생물 또는 결장 신생물이 양성임을 나타낸다.
본 개시내용의 다양한 구현예에 따르면, 적어도 하나의 표적 유전자는 ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, 및 NTM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 개시내용의 특정 구현예에 따르면, 부인과 암종은 I형 자궁내막 암종, II형 자궁내막 암종, 난소 암종, 질 암종, 외음부 암종, 임신 융모성 질환(GTD) 및 원발성 복막 암종이다.
유사하게는, 본 개시내용에서 확인된 바이오마커는 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지를 평가하기 위한 진단 도구를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 키트는 ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, 및 NTM과 같은 하나 이상의 상기 확인된 바이오마커의 메틸화 수준을 결정하기 위해 사용될 수 이쓴 물질을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 밝히고 본 발명을 실시할 때 당업자를 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 임의의 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 추가의 상세한 설명 없이, 당업자는 본 명세서에 기초하여 본 발명을 완전히 이용할 수 있다고 간주된다. 본원에 인용된 모든 공보는 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
재료 및 방법
1. 조직 표본
모든 조직 표본은 2014년 10월부터 2016년 5월 사이에 타이완 뉴 타이페이 소재의 의과 대학(University-Shuang Ho Hospital)에서 수집되었다. 포함 기준은 연구 참여자가 30 내지 80세 여성이어야 한다고 규정되어 있다. 연령, 종양의 조기학적 유형, 국제 부인과 및 산부인과 협회 단계 및 조직학적 등급을 각 참가자의 병원 기록으로부터 검토했다. 연구는 2000년 헬싱키 선언에 따라 타이베이 병원(Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital)의 기관 검토 위원회로부터 승인을 받아 수행되었다. 이 연구의 모든 참가자들로부터 사전 동의를 얻었다.
수술 동안 자궁내막 표본을 채취하여 액체 질소에서 즉시 동결시키고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 각 샘플의 병리학적 진단은 부인과 병리학자의 조직학적 검사로 확인하였다. 정상 상피 조직은 근종 환자로부터 수집하였다.
근종 또는 자궁내막 암종으로 진단받은 환자로부터 자궁경부 도말 세포를 수집하였으며, 샘플링시에 여성 환자는 난소 및 자궁경부 질환이 없었다. 자궁경관내 도말 세포는 다음과 같이 수집하였다. 자궁경관내 도관에 새로운 자궁경관내 브러쉬를 삽입하고 적절한 샘플링을 보장하기 위해 브러쉬를 3 내지 5회 부드럽게 회전시킨다. 이어서 브러쉬를 2 ml RNAlater®(Ambion, Life technologies, USA)를 함유하는 원심 튜브(15 ml)에 넣고 원심분리 관의 캡을 닫았다. 자궁경관내 도말 세포 표본을 4℃에서 보관했다. 10초 동안 볼텍싱한 후에, 표본 세포-함유 샘플을 3개의 미세원심분리 튜브(튜브당 1 ml)에 나누어서 추가 분석때 까지 -80 ℃에서 보관하였다.
2. 발견 및 검증
발견 코호트에서, TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터(270개의 악성 자궁내막 종양 조직 및 28개의 정상 자궁내막 조직 사용을 포함함), Em-MethylCap-seq(78개의 악성 자궁내막 종양 조직 및 11개의 정상 자궁내막 조직을 포함함), 및 HCL-데이터(근종 내 10개의 악성 자궁내막 종양 조직 및 10개의 정상 자궁내막 조직을 포함함)의 공개 데이터를 사용하여 메틸화 바이오마커를 확인하였다. 메틸화 바이오마커를 확인하기 위해 사용된 샘플은 자궁내막 악성 종양 조직, 근종 및 정상 자궁내막 각각을 갖는 대상체로부터 수집된 25개의 자궁내막 악성 종양 조직, 근종의 5개의 정상 자궁내막, 및 15, 10, 및 15개의 자궁경부 도말을 포함한다.
검증 코호트에서 사용된 트레이닝 세트에 대해, 자궁내막 암, 근종을 가진 대상체, 및 건강 대상체로부터 수집된, 각각 크기가 28인 자궁경부 도말 샘플을 사용하였다. 실시예 1에서 검증 코호트에 대한 시험 세트에 관해, 동일 크기의 샘플이 사용되었다. 실시예 2에서 검증 코흐트에서 사용된 시험 세트에 대해, 자궁내막 악성 종양 조직, 근종 및 정상 자궁내막을 가진 대상체로부터 각각 수집된 자궁경부 도말 세포 샘플 50, 40 및 56을 사용하였다.
3. 게놈-야생형 DNA 메틸로믹스 분석
3.1. 450K 메틸화 비드 검정
298 자궁내막 조직(자궁내막양-타입 EC 및 28 인접한 정상 조직)의 제1 메틸로믹스 분석은 EC의 차등 메틸화 프로파일을 확인하도록 메틸화 450K BeadChip 어레이(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하였다 TCGA 데이터 포털로부터 레벨 3 데이터가 사용되었다. 각 CpG에 대한 메틸화스코어는 β-값으로 표시되며 정상화하였다. 암 암종 샘플은 40% 이상의 신생물 세포질을 나타냈다. 본 발명자들은 성 염색체에 매핑된 프로브를 제거하고 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 다루었으며 이 연구에서 나머지 379,054개의 CpG 부위에 집중했다. 암 암종 샘플은 40% 이상의 신생물 세포질을 나타냈다. 유의하게 상이한 메틸화된 CpG 부위는 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험을 사용하여 분석하였고 P ≤ 0.001이었다. 본 발명자들은 암호화 유전자의 전사 개시 부위(TSS)에 가장 가까운(± 1000 bp) CpG 부위에 더 초점을 맞추었다. 마지막으로, 본 발명자들은 암호화 유전자에서 CpG 부위가 5개 이상 남아 있는 과메틸화된 후보 물질을 선택했다. 또한, EC 값의 중간 판독치로부터 정상 값을 뺀 상위 5 % 메틸화된 차이를 선택하였다.
3.2. 메틸캡 서열분석
제조사의 지시에 따라 MethylMiner 메틸화된 DNA 풍부 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 2 μg의 게놈 DNA로부터 메틸화된 DNA를 농축시켰다. 간략하게, 게놈 DNA를 약 200-bp로 초음파 처리하고, MBD 단백질로 포획하고, 1M 염 완충액을 사용하여 침전시켰다. 강화된 메틸화 DNA를 사용하여 Illumina(San Diego, CA)로부터 표준 프로토콜에 따라 서열분석을 위한 라이브러리를 생성하였다. Illumina의 게놈 분석기 IIx 시스템을 사용하여 메틸캡-서열 라이브러리를 서열분석하였다. 이미지 분석 및 기본 호출은 표준 Illumina 파이프라인을 사용하여 수행되었다. 고유 판독치(최대 36-bp 판독치)는 ELAND 알고리즘을 사용하여 인간 표준 게놈(hg18)에 매핑되었으며 최대 2개의 염기쌍이 불일치하였다.
고유하게 매핑된 판독치는 추가 선형 정규화 및 차동 메틸화 분석에 사용했다. 메틸화 수준은 하기 식 1 및 2를 사용하여 판독 횟수를 누적함으로써 계산하였다.
N_(Read,i)은 i번째 bin에서의 정규화 판독치의 수이며; U_(Read,i)는 i번째 bin에서 고유하게 매핑된 판독치의 수이며, N_U는 고유하게 매핑된 판독치의 수이다. "INT"는 요소를 음의 무한대를 향한 가장 가까운 정수로 반올림하며 "^"는 동력 연산자를 의미한다. 메틸화 수준의 영역은 정규화된 고유 판독치의 평균으로 표시된다. 그룹 A와 B(G = A 또는 B)의 비교에서 평균 메틸화 수준(AVGR,G)은 주어진 영역 R(m bin 크기를 포함하며 s번째 bin에서 시작됨)에서 2개의 그룹에서 각각 계산되었다. 샘플의 수는 그룹 A의 경우 S_A이며, 그룹 B의 경우 S_B이다.
AVG R,G 는 R 영역에서 그룹 G의 평균 메틸화 수준을 의미한다. MR,G은 R 영역에서 그룹 G의 각 샘플의 메틸화 수준이다. R 영역에서 상이한 메틸화의 통계적 유의성은 양방향(two-tailed) 및 만-휘트니 U 시험(P ≤ 0.001)을 사용하여 확인되었다. 차등적으로 메틸화된 유전자좌를 케이스와 대조군 샘플 사이에 분석하였다. 암호화 유전자의 TSS의 1000 bp 상류 및 하류에 걸쳐 있는 2000 bp 영역에 대한 메틸화 수준을 분석하였다. 본 발명자들은 성 염색체에서 TSS 영역을 배제하였으며 나머지 23,215개의 TSS 영역을 본 연구에서 분석하였으며 EC 값의 중간 판독치로부터 정상 값을 뺀 상위 5% 과메틸화 차이를 선택하였다.
TCGA 데이터 포털은 조직 샘플을 분석하기 위해 450K 메틸화 칩 어레이를 사용하였으며, 데이터 포털에는 417개 자궁내막 조직으로부터 데이터세트가 포함되었다. 이 중, 40% 이상의 신생물 세포질이 있는 371건의 암 사례가 이 연구를 위해 선택되었다. 비-파라미터 시험을 사용하여 케이스와 대조군 사이의 차등 메틸화된 CpG 부위를 조사하였다. P ≤ 0.001 및 높은 β-값의 상위 5% 차등 메틸화를 갖는 프로브가 처음에 선택되었다. 이어서, 암호화 유전자의 전사 개시 부위에 대하여 -1000 내지 +1000에 걸친 영역 내에 위치하는 유의적 프로브가 확인되었다. 확인된 프로브 중 적어도 5개를 갖는 과메틸화된 유전자가 선택 기준에 따라 선택되었다.
3.3. DNA 메틸화 프로파일의 클러스터링 분석 및 후보 선택
DNA 메틸화 프로파일은 MeV4 버젼 4.9의 기능에서 맨하턴 거리(Manhattan distance) 하에서 응집체 계층적 클러스터링의 완전한-결합 방법을 사용하여 수득되었다. 각 그룹에서, 암의 메틸화 변화에서 덜 보고된 1개 내지 2개의 후보와 비-EC 참가자에서 정상 자궁내막에서 낮은 신호가 선택되었다.
4. 정량적 DNA 메틸화 폴리머라제 연쇄 반응
4.1. 게놈 DNA의 제조 및 바이설파이트 전환
게놈 DNA는 QIAmp DNA 미니 키트(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 표본으로부터 추출하였다. 게놈 DNA(1 μg)는 제조업자의 권고에 따라 EZ DNA 메틸화 키트(ZYMO RESEARCH, CA, USA)를 사용하여 바이성파이트를 변형시키고 70 μl의 뉴클레아제-비함유 물에 용해시켰다. 바이설파이트 DNA는 DNA 메틸화 분석을 위한 주형으로서 사용되었다.
4.2. qMSP
특정 프로브 및 프라이머를 사용하여 정량적 메틸화-특이적 PCR(qMSP)을 수행하여 비-메틸화된(COL2A1) 총 입력 DNA를 참조함으로써 상대적인 DNA 메틸화 수준을 확인하였다.
PCR 생성물을 LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche, Indianapolis, IN, USA)로 증폭시키고 LightCycler 480을 사용하여 수행하였다. 20 ㎕ 반응 혼합물은 2 ㎕ 바이설파이트-전환된 DNA, 250 nM의 각 프라이머, 및 10 ㎕ 마스터 믹스를 함유하였다. 반응은 하기 열 프로파일 하에 LightCycler 480 상에서 수행되었다: 95℃에서 5분 동안, 95℃에서 10초 동안 50 사이클, 60℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 5분 동안 최종 연장. 모든 표본에서 각 유전자에 대해 중복 검사를 수행하였다. DNA 메틸화 수준은 다음 식을 사용하여 ΔCp를 추정할 것이다: (유전자의 Cp - (COL2A의 Cp)). Cp-값이 COL2A >36인 시험 결과를 검출 실패로 정의되었다. 프라이머는 Oligo 7.0 프라이머 분석 소프트웨어에 의해 설계되었다.
5. 통계
만-휘트니 비모수 U 시험을 사용하여 2개의 카테고리 사이에서 메틸화 수준의 차이를 확인하였으며, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 시험을 사용하여 2개 이상의 카테고리 사이에서 메틸화 수준의 차이를 확인하였다.
독립 코호트에서, 수신기 작동 특성(ROC) 곡선을 얻기 위해 진양성률(즉, 민감도)을 위양성률(즉, 1-특이도)에 대해 플롯팅하였다. 최상의 정확도를 평가하기 위해 ROC의 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하여 두 그룹의 샘플을 구별하기 위한 최적의 컷오프 값을 확인하였다. 최적 임계값은 R의 pROC 패키지에서 "closest.topleft" 방법과 200번의 부트스트래핑 반복으로 계산되었다. 식을 수행하는 방법은 [(1- 민감도)2 + (1- 특이도)2]의 최소 합이다. 각 후보 유전자와 유전자 조합의 메틸화 상태와 관련된 EC 위험을 기술하기 위해 로지스틱 회귀분석을 사용하여 OR 및 95% CI를 측정하였다. 모든 유의한 차이는 양측 꼬리 P <0.05를 사용하여 평가 하였다. 상기 분석 및 플롯은 R(버전 3.1.2) 및 MedCalc(버전 14.12.0)의 통계 패키지를 사용하여 수행 하였다. 모든 유의한 차이는 양방향 검정 P <0.05를 사용하여 평가하였다. 상기 분석 및 플롯은 R(버전 3.1.2) 및 MedCalc(버전 14.12.0)의 통계 패키지를 사용하여 수행하였다. 페어와이즈 피셔 이그젝트 포스트 혹 시험(Pairwise Fisher's exact post hoc test) 및 추정된 알파 오류 비율 0.01을 사용하여 G*Power 버젼 3.1.9.2의 통계량을 평가하였다.
실시예 1
자궁내막 암의 진단과 연관된 과메틸화된 유전자의 확인
발견 코호트에서, 자궁내막 암에서 새로운 과메틸화된 유전자는 메틸캡 서열분석 및 메틸화 비드 칩으로부터의 데이터를 사용하여 각 유전자의 TSS로부터 ± 1 kb 떨어져 위치하는 DMR을 확인하여 확인되었다. 제1 분석 단계에서, 자궁내막 암종과 상이한 데이터세트로부터의 정상 샘플 간의 유전자의 메틸화 수준을 비교하여, 메틸화 패턴의 합의 클러스터링을 통해 180개의 유전자를 확인하였다. 임상적 관련성과 기능적 농축을 위한 선택 기준으로 필터링한 후, 23개의 유전자가 선택된다(패널 A, 도 1 참조).
발견 코호트에서 확인된 23개의 후보 유전자는 정상 자궁내막 조직(n = 15), 근종 자궁내막(n = 10) 및 악성 자궁내막 암종 조직(n = 15)의 풀링된 DNA를 qMSP에 적용하여 14개의 유전자가 확인된 추가 검증을 받았다. 14개 후보 유전자는 악성 자궁내막 암종(EC, n = 56) 또는 근종(Myo, n = 40)으로 진단받은 환자와 정상 자궁내막 조직(Nor, n = 50)을 가진 대상체로부터 자궁경부 도말로부터 풀링된 DNA를 바이설파이트 파이로서열분석에 적용하여 추가 검증을 받았다. 결과(도 2 및 표 1)는 상기 언급된 9개의 유전자가 또한 자궁경부 도말 샘플을 사용하여 자궁내막 암종 및 정상 또는 근종 자궁내막 조직을 갖는 대상체와 구별할 수 있음을 나타낸다.
[표 1]
약어: Se, 민감도; Sp, 특이도; OR, 오즈비; CI, 신뢰 구간; EC, 자궁내막 암, Pos., 양성. 초기 단계는 I 단계 및 II 단계를 포함한다. a메틸화 수준의 이분법은 유덴 방법(Youden's method)을 사용하여 자궁내막 암 대 비암종성 참가자에서의 분포에 기반한다. bOR은 단변량 로지스틱 회귀법을 사용하여 계산된다. 실제 α 값 ≤0.10 및 파워(1-β)>0.99는 포스트 혹 페어와이즈 피셔 이그젝트 시험으로 계산되었다.
특히, 도 2의 패널 A에서 점 플롯은 BHLHE22, CDO1, CELF4, 및 ZNF662에 대한 메틸화 상태의 분포를 나타낸다. 개별적인 자궁경부 도말을 사용하여, 정상 자궁내막 및 근종의 샘플에서보다 EC 샘플에서 DNA 메틸화 상태가 더 높다는 것이 확인되었다. 플롯에서의 수평선은 표 1에 열겨된 컷오프 값을 나타내었다. P 값은 크루스칼-왈리스 시험에 의해 계산되었다.
게다가, 도 2의 패널 B에서 입증된 바와 같이, 4가지 유전자 모두 AUC 값이 1에 가까운(0.89-0.95) 수신기-작동 특성하에 우수한 탁월한 영역을 나타냈으며 이는 더 나은 클러스터를 나타낸다.
유전자 조합의 성능도 평가하였으며, 결과는 표 1에 제시된 바와 같이 단일 유전자와 비교하여 유전자 조합을 사용하여 보다 우수한 특이성이 달성되었음을 나타내었다. 보다 구체적으로, BHLHE22, CELF4, 및 CDO1의 조합 시험은 임의의 2개의 양성 시험에 대해 91.8 %의 민감도, 95.5 %의 특이도, 236.3배의 상승된 위험험도(95% CI, 56.4-989.6)를 나타냈다. 이들 결과는 초기 단계에서 EC 검출과 유사하였다(민감도 89.5 %; 특이도 95.5%; OR 178.5,95% CI 42.2-754.9). II형 자궁내막 암으로 진단된 일부 환자로부터 자궁경부 도말에서 후보 유전자의 메틸화 상태를 표 2에 제공하였다.
[표 2]
Mu, 점액성; CC, 투명 세포; Ser, 혈청; En, 자궁내막양; G, 등급; M-지수, 메틸화 지수. 단계는 국제 부인과 및 산부인과 협회 지침에 따른다. a컷오프 값은 자궁내막 유사유형에서 계산된 결과에 기초한다. M-지수의 컷오프 값은 BHLHE22, CELF4 및 CDO1 각각에 대해 21.9, 14.0 및 69.5이다. 굵은 이태릭체는 M-지수는 컷오프 값보다 더 높음을 나타낸다. b환자는 외부 클리릭에서 팽창 및 소파술에 의해 자궁내막 암의 혈청 유형으로 진단되었지만 자궁적출술 표본은 단지 우리 병원에서만 복잡합 비정형 과형성을 나타냈다.
실시예 2
자궁내막 암종의 진단과 관련된 과메틸화된 유전자의 확인
발견 코호트에서, 자궁내막 암에서 새로운 과메틸화된 유전자는 상기 확인된 데이터베이스를 사용하여 확인되었다. 각 유전자의 전사 개시 부위(TSS)로부터 ± 1 kb 떨어져 위치에 있는 차등적 메틸화 부위(DMR)가 확인되었다. 제1 분석 단계에서, TCGA 데이터세트로부터 종양과 정상 샘플 사이의 유전자의 메틸화 수준을 비교하여 46개 유전자를 확인하였다. 추가로, TCGA 데이터세트로부터 종양과 정상 샘플 사이의 유전자의 메틸화 수준을 비교하여 후보 유전자를 확인하였다. 지속적으로 높은 메틸화 수준을 나타내는 총 15개의 유전자가 확인된다(패널 B, 도 1 참조).
발견 코호트에서 확인된 15개의 후보 유전자는 근종의 정상 자궁 내막(EmN_Myo, n = 5) 및 악성 자궁내막 암 조직(EC, n = 25)으로부터 수집된 DNA를 qMSP에 적용하여 추가 검증하였다. 결과(도 3)는, 15개의 후보 유전자는 악성 자궁내막 암 조직에서 유의적 과메틸화를 보임을 나타낸다.
후보 유전자는 또한 대상체를 정상 자궁내막 조직(N_Em, n = 15)을 가진 대상체 또는 악성 자궁내막 종양(EC, n = 15) 또는 근종(Myo, n = 10)으로 진단받은 환자로부터 자궁경부 도말로부터 풀링된 DNA를 qMSP에 적용하여 추가 검증하였다. 결과(도 4)는 15개의 유전자 중 11개가 자궁경부 도말 샘플을 사용하여 악성 종양 및 정상 또는 자궁내막 조직을 갖는 대상체를 구별할 수 있음을 나타낸다. 상기 11개의 유전자는 ADARB2, BHLHE22, CDO1, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 THY1이다. FOXI2가 차등 메틸화를 보였음에도 불구하고, 신호는 상대적으로 약하기 때문에 추가의 연구에서 제외되었다.
이전에 확인된 유전자 CELF4 뿐만 아니라 상기 11개의 후보 유전자의 메틸화 프로파일을 추가로 조사하였다. 도 5는 트레이닝 세트(패널 A) 및 시험 세트(패널 B)에서 수신기-작동 특성 곡선 아래 면적을 사용하여 EC 및 비-EC 샘플을 구별하기위한 후보 유전자의 성능을 나타낸다. 모든 분석에 대한 P 값은 면적 0.5의 비교를 위해 <0.001이었다. 임계값은 개방형 원으로 표기하고 표 3에 열거하였다.
[표 3]
약어: Sen., 민감도; Sep., 특이도, AUC, 수신기-작동 특성 곡선 아래 면적; Cl, 신뢰 구간, ADARB2, HOXA9 및 MTMR7은 시험 세트에서 검증은 제외하고 트레이닝 세트에서 유전자 조합 분석 하에 정확성은 개선되지 않았다.
표 3의 데이터는 자궁내막 암종을 가진 환자로부터 정상 자궁내막 및 근종을 가진 대상체를 구별하는데 6개의 시험 유전자(BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4 및 THY1)가 유의한 정확도(최소 80%)를 나타냈음을 나타낸다. 또한, BHLHE22, CDO1, CELF4, CLVS2, 및 THY1의 AUC 값은 0.83 내지 0.9 범위에 있으며, 이는 양호한 클러스터를 나타낸다. 유전자 조합의 성능에 관한 후속 분석을 위해 더 나은 정확도를 갖는 유전자를 선택하였으며 결과를 표 4에 요약하였다.
[표 4]
약어: RS, 위험 스코어, Sen., 민감도, Sep., 특이도, AUC, 수신기-작동 특성 곡선 아래 면적; Cl, 신뢰 구간, 위험 스코어는 총 자궁경부 도말 및 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 계산하였다.
표 4의 데이터는 이들 유전자 조합이 총 자궁경부 도말을 사용함에 의해 임의의 단일 유전자보다 더 우수한 정확도를 갖는다는 것을 입증한다(표 4, 56 EC, 56 근종 및 56 정상).
실시예 3
다른 부인과 암종 및 결장 암종에서 교차 시험 후보 유전자
ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, NTM, 및 PRKCDBP는 비정상 부인과 질환 또는 결장 암종 구별하는데 있어 이들의 능력에 대해 추가로 조사되었으며, 결과는 도 6에 요약되었다(각 기호는 5명의 풀링된 DNA로부터의 데이터를 나타낸다). 결장 조직 샘플(Co)에서, ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7 및 NTM은 정상 결장 조직(1N)에서 메틸화 수준과 비교하여 결장암(Ca)에서 높은 메틸화를 나타냈다. 난소(Ov) 조직에서, 7개 유전자 모두는 난소암에서 높은 메틸화 수준을 나타냈다. 각각의 삼각형과 원은 5개의 등량의 DNA 샘플에 의해 풀링되었다.
상기 구현예의 설명은 단지 예시로서 주어지며, 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 구현예의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예가 특정 정도로, 또는 하나 이상의 개별 구현예를 참조하여 상기 기재되었지만, 당업자는 본 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않고 개시된 구현예에 대한 많이 변형할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Lai Hung-Cheng
<120> METHODS FOR GYNECOLOGIC NEOPLASM DIAGNOSIS
<130> P2947-PCT
<150> US62368182
<151> 2016-07-29
<160> 13
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 3199
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cgtctacgta gtatttctgt ccccggaaga ctggatctca gggaattatt atggaagata 60
ctgctgagcc cctttcatcc tttccaggtg aaaatacaga catttttgtg tcgccctcac 120
ccttccttta tgaaataagg tgcccaactg ttctgatatt accattcaaa aacaggttct 180
gtggcgaacc tcatttgtga atctattaca gagattaata gattatttct cctttttcaa 240
ctaattctca gtggggaaat ttaaccatat ggtaaggaga gaattagaat ttcatcacat 300
tagagcaaaa tgtaatgaaa agagtccaac acctggggcc aactccgaaa gccacaatta 360
aaaggttttt aatgaaacca gagaaaccaa aaattgcata gtcttcagta cttctgccat 420
ataagaaaga gttattggaa ggtgttggga aatattgttt ttacttatgt cataaggatg 480
aaaaccagct gctaaatacc atgtgtaccc agagaccgaa ctcaggagtg agatgaccgc 540
gtgtaccagt gcccatccgg agaggagcac ttgtttttac attctccctt cccgaaccct 600
ccaagaacaa ccgaggctga tccagatgtc cttaaatggc ttccgggtaa ataaatatgc 660
ataaatgcct cacttcgtgt gggagcggat ttgactcctg gtgaagttga ctcttttgaa 720
gcaatcagat tttcatctta aggaaagttt gagaaaccgg tttgtttgtt tgttttcttc 780
ctgtttagga aattgtgtac ttcacaatta ccatcactgt aacagttatt tggagaccac 840
tgcaaaatca ctgccacccc accttaaaaa aaaatgggct gcatgatcac ttgctcttca 900
ttttgctttt ttctttcttt ttttccaatc tgggtaggaa atgggcagtg gcgggtgtgg 960
aaacgaggca gagtgttcgg ggggacgact gctttgctct ctgaccagct gaaaacctag 1020
agtgaatttt gggcaagcca gctgggacac caccttctct cggaaagtcc catccccaaa 1080
tccagaccag tcatcctacg aacaggggtg gagtataatt ctcgcccgga agggtaattt 1140
agcacaagct gagacagcag tggcgaggga agggcagtgg ggggtggggt gcggtgggtg 1200
ggggcgtctg ctttccacag gactcccagg cttcgccgcc gatctacaat ttgctgaagg 1260
agcaaagaac atcctcggct ctaagtaggg cttttagtgt gctcattgat gagtgaaagt 1320
cgccacacat gtcaagctaa aggcagttgt tgggttacta acaggaccca gcgccttgca 1380
aacatatgcg ctaagctgtg tatacagatg gcaggcagaa taatggagca ggcgcctttt 1440
ataaagctct agctgctgcc tgtcttcaga cctgggaaat gaaactattc agacttgcgg 1500
ccagatagcg cctgcgattg tttgttaccg ttttaatcct attaattaaa acgttaacct 1560
gattgggtag aaagcgctgt cccaacaggc gagtcttctt cataataacc tactcagaga 1620
taatgatgta aaagactccc ccgtctgtgg cggcggctgt ttgatgggtc cggaaatctc 1680
ttgaaggtga atccaagcaa gataaacggt gcggagagga ggcgcggggc tgggctcaga 1740
gcggcggcgg cggcggctcc actccctccg cgcccaccct cccaccatgc ggggccgcgg 1800
cccatggtga gccccagcag ccagcaccat cggctggaga cgaagaagaa gaagaagagg 1860
aggcggcgag cgcgggggaa ggcgaaaaag aaaaagaaag aaggggagag ggctcccggc 1920
agcaccagga ccgacgcgcg caccagctcc ggagcccagc tcgcgcgcgt ctgtggggcc 1980
gcctgactcc ggggccgagg cggcggcggc ggcagcgggc gcggcggccc gggctgcgcg 2040
ccggcgcggg accatggagc gcgggatgca cctcggtgca gcggccgccg gcgaggacga 2100
cctcttcctg cacaagagcc tgagcgcctc cacctccaag cgcttggaag cggctttccg 2160
ctccacgccc ccgggcatgg acctgtccct ggcgccgccg cctcgggaac gcccggcgtc 2220
ctcctcctcg tcgcccctgg gctgcttcga gccggctgac cccgaggggg cagggctgct 2280
gttgccgccg cctggaggag gcggcggcgg cagcgcggga agtggcggcg gcggcggcgg 2340
cggggtgggt gtccccgggc tgctagtagg ttcagccggc gttgggggcg accctagcct 2400
aagcagcctg ccggccgggg ccgccctttg cctcaagtac ggcgaaagcg cgagccgggg 2460
ctcggtggcc gagagcagcg gcggcgagca gagccccgac gacgacagcg acggtcgctg 2520
cgagctcgtg ctgcgggccg gagtagccga cccgcgggcc tccccgggag cgggaggtgg 2580
tggcgcgaag gcagccgagg gctgctccaa tgcccacctc cacggcggcg ccagcgtccc 2640
cccggggggc ctgggcggcg gcggcggcgg gggtagcagc agcggtagca gtggcggcgg 2700
tggcggtagc ggtagcggca gcggcggcag cagcagcagc agcagcagca gcagcaagaa 2760
atccaaagag caaaaggcgc tgcggcttaa catcaatgcc cgagagcgcc ggcggatgca 2820
cgacctgaac gacgcgctgg acgagctgcg cgcggtgatc ccctacgcgc acagcccctc 2880
ggtgcgaaag ctctccaaga tcgccacgct gctgctcgcc aagaactaca tcctcatgca 2940
ggcgcaggcc ctggaggaga tgcggcgcct agtcgcctac ctcaaccagg gccaggccat 3000
ctcggctgcc tccctgccca gctcggcggc tgcagcggca gcagctgctg ccctgcaccc 3060
ggcgctcggc gcctacgagc aggcagccgg ctacccgttc agcgccggac tgcccccggc 3120
tgcctcctgc ccggagaagt gcgccctgtt taacagcgtc tcctccagcc tctgcaaaca 3180
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<211> 4000
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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tgtgtctgga atgcatcagg tagatgaatg ggaagatggc tgggatggag ttggagggag 180
gagggaagtc agcagccagg ggccaggaca ttcatggcct taaaaagtat cctacaaaca 240
agaagccagg ttagctcacc tatgaagagg gacagtctta ccagatcatg tgttagagtc 300
cccagatcct ggggagcgtg agaaaagtgc agactcagct ggctctagta ctagattaag 360
gaggtcctag gtgggcaagg ccagctgcat ttttcataaa atgccctaga aacctctgca 420
gtttaccaaa gtgaatagct cctttggact taaccatctg caaggctcat tccagttaga 480
gtgttccatc accctaaatg ctgggaaacc aagcgaatct cctcccactt gcaagcttcc 540
aacagtggct tccaacagtg ccactgcagt atcagaaact gcagggaagg tgccagggct 600
gacttccatg aagaaatagg agaacaggca ggcagacatt ggggaggccc acagaatgtc 660
gtgatcagaa ttcataaaga ggctggcagg atacaaatca atcaaataaa cgttagttca 720
aaaaaattca ctacacctgt gagtgagaga aagtcatcag cactgtctct aaaaatgagc 780
ctagggcttc tggtgacatc caatcggtgg gttatcagga gtgccccagg tgatcaggag 840
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cttctcccac taggcaggga tgagcaagag gaatggctca cccttgagag ctggggtcca 960
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taactcccca ggaggtgcta gacatcgggc gcatgttaga ggcacaaaga tgagaatgtt 1140
aaaagacata aaatacaggt ctgctctggg aatgcaaaaa ctggtaaaag gagagataaa 1200
agagcaggtg cagtctagtg aagtacccgc tacctcctat cagcaaatat ctgtccacct 1260
agggtgcagc gagctggaga ggaaggggtg gcctagagcg caggggaagg attcctcccc 1320
agccgcctgc acccctaccc cggtagcggt ccctgggatc gtccgtgtct ccaggagaac 1380
cggaccgctc tcccctccct ccccgagcga gaaaggagga ccacagagat gcggcgccct 1440
ccgccgtcct agagcaaccg gagcggcccg agccccggcc tcccggatgc tggggcctgg 1500
cgggtgtgga gcacggggag tcgggcgtgg ggcgggcagg gagtggagtc ggggtcttac 1560
tccggtggct gcagggcgca gggtagccgt gtcaggcctg cccaggtgca gagcgctctt 1620
ccgcgacccc aacagcctct ggtccggtct ggcgcgccct cgctttccca gagggcgacc 1680
tgggctatgg cggccgtggc gctggcgagc gggacacgcc tcggccttgt cctcgagctg 1740
ctcccgggac agcccgcgct gccccgggcg cgccgggtga gtgcggggcc ggagcctgga 1800
agcagtcttg gccctgccct gggttctagg cccggagacg gggtggtgcg gcggctggga 1860
aatgggggta caacccagag tgaggggcct cgagggacag gcagcacagc ggagtcgaca 1920
cccctggacc tgagcctcaa ggagagcaga cgtgcagcgg cacggggttg agccgactgc 1980
tggggcagag cgcacagagt gctgtcgggg gcgatgaatg gccagaattt cagagctgcc 2040
tttacagagc tggttatgtt tgagctgggt attaggttga aaaggaattt gcaatgcagg 2100
agcaggaagg aagaactgga tattcaggca agagtagccg caggtgcaag gacacagaac 2160
agggtgagga aagagtttgg tttcccaatg caatggtgag aggatcggag atgagagtgg 2220
tggtggctga tgatcctggc caggaaagct gggtctgtga gtagtgaatg gaattgtctg 2280
tagtgcagag gaatgtggac tctattaggc agacaaagtt gagccagcca aagccttgga 2340
gccctggagt gctggataaa tagctgtgga gactttctag tgcgcaagga ctgaagtgca 2400
gtggaccaga atgggctcct ccacagtgtg gagactgaga ccctgaagga ggcagtggct 2460
gagaattacg ggaagtccca acggctggag gtcagcagta tttgtttctt aagaggatga 2520
gagaaagaag gtgcaggagc tgagactcct agagatatag aaaatgggga catggagatt 2580
gggacgtggg taagcaagtg aggtgggatc tttgtgagag tgttgcgggt ggtgggggtg 2640
cagggagtaa agtcacaacg aggatctgcc ctgttgagta cagtgttcag agcaacctga 2700
atgttctgag gagccctagc tgcctctgtg gctggtggca gtgactgggg aggacaaagg 2760
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cataacaggc aagagccaga gtcaaacagg cctgggttct gtctcagttc tggaactttg 2880
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ctatgagaca taacaaagaa tatatgtcaa gtgcttggca caggcttaat aaatgatagt 3000
tgttatcaag ggtgggtgac ctctgaagga ggacacattg tggagagagg atgggaccta 3060
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tgccttgtct ctttgtacat aggaggcaaa aatcttctgc tgatagagtt cctgtagaca 3240
ttcagaatcc agaatcccca caggcacccc cacagtacct tttgatgccc tgtctcccct 3300
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cagtgacctt cgaggatgtg gccgtctact tctctgagaa cgaatggatc ggcctgggcc 3420
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tttctcaaag gctcaggagt tgttgataac cctcagctca atggcagctt caggctcttg 3600
gatttttaat gacctaacct cagcagccgt tggaaagtag gaagtcctgg tatcagtttg 3660
ggccttatac aggacttcct tgctccagag tgagaggtgc caaaccccta cccttgtgtt 3720
gtgggtatag tgagaagaga gcaaattcat ggtgctccac tgagccttca gttccctccc 3780
ctctcggttt gcaagatcca gcctaattcc aagcatcctc atgaggatgt ctgaacttga 3840
gagctctaag agggagagga caggtaagaa ttgaggactc aattcctcaa tgagtgaaat 3900
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tctcctggcc cctctcttgt cctttcccct ggaattcctt 4000
Claims (20)
- 대상체로부터 유래된 샘플을 사용하여 상기 대상체가 자궁내막 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 진단 키트를 제조하기 위한 바이오마커의 용도로서, 여기서, 상기 바이오마커는 BHLHE22 또는 THY1 또는 둘 다이고, 상기 바이오마커의 과메틸화는 상기 대상체가 상기 자궁내막 암종을 가지고 있다는 표시인, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이오마커는 CDO1을 추가로 포함하는, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이오마커는 ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 ZNF662 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 바이오마커는 BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP, 및 TBX5를 포함하는, 용도.
- 제 1항 내지 제 4항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체의 자궁내막 조직 또는 자궁경부 도말 세포로부터 유래되는 것인, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체의 자궁경부 도말 세포로부터 유래되며, 상기 바이오마커는 BHLHE22, 및 CDO1 및 CELF4 중 적어도 하나를 포함하는, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 자궁내막 암종은 I형 자궁내막 암종인, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 자궁내막 암종은 II형 자궁내막 암종인, 용도.
- 대상체로부터 유래된 샘플을 사용하여 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 진단 키트를 제조하기 위한 바이오 마커의 용도로서, 상기 바이오마커는 ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, 및 NTM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 바이오마커의 과메틸화는 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 가지고 있다는 표시인, 용도.
- 제 1항에 있어서, 상기 부인과 암종은 I형 자궁내막 암종, II형 자궁내막 암종, 난소 암종, 질 암종, 외음부 암종, 임신 융모성 질환(GTD: gestational trophoblastic disease) 및 원발성 복막 암종인, 용도.
- 상기 대상체가 자궁내막 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 방법으로서,
(a) 상기 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 샘플 중의 적어도 하나의 표적 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 BHLHE22 및 THY1 중 적어도 하나를 포함하는, 단계;
(c) 상기 적어도 하나의 표적 유전자가 과메틸화되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과에 기반하여 상기 대상체가 자궁내막 암종을 갖는지 여부를 평가하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화가, 상기 대상체가 자궁내막 암종을 갖는지를 나타내는 단계를 포함하는, 방법. - 제 11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 CDO1을 추가로 포함하고, 상기 단계 (b)는 CDO1의 상기 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 ZNF662 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 상기 단계 (b)는 ADARB2, CDO1, CELF4, CLVS2, GATA4, HOXA9, MTMR7, NTM, PRKCDBP, TBX5, 및 ZNF662 중 적어도 하나의 메틸화 상태를 결정함을 포함하는, 방법.
- 제 13항에 있어서, 상기 바이오마커는 BHLHE22, CDO1, THY1, CELF4, CLVS2, GATA4, NTM, PRKCDBP, 및 TBX5를 포함하는, 방법.
- 제 11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체의 자궁내막 조직 또는 자궁경부 도말 세포로부터 유래되는 것인, 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 샘플은 상기 대상체의 자궁경부 도말 세포로부터 유래된 것이며, 상기 바이오마커는 BHLHE22, 및 CDO1 및 CELF4 중 적어도 하나를 포함하며, 상기 단계 (b)는 BHLHE22, 및 CDO1 및 CELF4 중 적어도 하나의 메틸화 상태를 결정함을 포함하는, 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 자궁내막 암종은 I형 자궁내막 암종인, 방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 자궁내막 암종은 II형 자궁내막 암종인, 방법.
- 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 여부를 평가하기 위한 방법으로서,
(a) 상기 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계;
(b) 상기 샘플 중의 적어도 하나의 표적 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자는 ADARB2, CLVS2, HOXA9, MTMR7, 및 NTM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 단계;
(c) 상기 적어도 하나의 표적 유전자가 과메틸화되는지 여부를 결정하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과에 기반하여 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지 여부를 평가하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 표적 유전자의 과메틸화가 상기 대상체가 부인과 암종 또는 결장 암종을 갖는지를 나타내는, 단계를 포함하는, 방법. - 제 19항에 있어서, 상기 부인과 암종은 I형 자궁내막 암종, II형 자궁내막 암종, 난소 암종, 질 암종, 외음부 암종, 또는 원발성 복막 암종인, 방법.
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