CN109069670B - 妇科肿瘤的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

在此揭示多种方法，其可基于一或更多种标记基因的高度甲基化以决定是否有妇科肿瘤或妇科肿瘤的恶性程度。

Description

妇科肿瘤的诊断方法
技术领域
本揭示内容是关于癌症的诊断。具体来说，本揭示内容是基于特定基因标记的甲基化状况来进行癌症诊断的方法。
背景技术
妇科癌是指起源于女性生殖器官的异常细胞不受控制的生长。妇科癌的主要类型包括子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌/子宫癌(以下简称子宫内膜癌)、阴道癌与阴门癌；另外，妊娠性滋养层细胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD)与原发性腹膜癌则属于较罕见的妇科癌。
子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是全美好发的妇科癌之一，也是全球妇女癌症确诊数第六高的疾病。根据世界卫生组织的GLOBOCAN计划统计，在2012年，子宫内膜癌的罹病人数与死亡人数分别是大约31万人与7万6千人，而预估在2020年，每年会有38万笔新确诊病例以及9万3千人死亡。
大多数的子宫内膜癌患者为停经妇女。然而，对于尚未显示症状的患者，目前仍没有方便、可靠的检测方法。对于出现症状或患病风险较高的女性，则可以采集子宫内膜检体或进行阴道超声波，以诊断或排除子宫内膜癌。
透过组织病理学的评估，可将子宫内膜癌分为两大类。第一型子宫内膜癌包含高度至中度分化(第1至2级)的子宫内膜样腺癌(endometrioid adenocarcinomas)。第二型子宫内膜癌包含浆液性(serous type)、亮细胞(clear cell)与分化不良(第3级)的子宫内膜样腺癌。大多数的第一型EC可在早期(第I或II期)诊断出来，且其预后通常较佳；但第二型EC一般都是在较晚期才被确诊，预后也相对较差。虽然大多数的子宫内膜样类型的EC患者可在早期被确诊，但仍有15％的患者在晚期才被发现，且5年存活率低于50％(第III期约40–50％；第IV期约15–20％)。因此，早期诊断仍然是改善患者预后的最佳方案。然而，目前没有理想的方法能用于EC筛检。
EC最常见的症状是异常的子宫出血，但还有很多其它疾病也会导致相同的症状。即使当停经后妇女的子宫出现流血症状时，只有10％的案例是由EC引起的。如何选择理想的检查方案取决于敏感性、特异性、概率准确度与成本。可利用阴道超声波(Transvaginalultrasound，TVU)来排除EC。然而，出现症状的停经后妇女以及采用荷尔蒙替代疗法的妇女的TVU门坎值较低，因为血液循环中的女性类固醇荷尔蒙会导致子宫内膜厚度变异。相较于TUV，在门诊透过抽吸刮除法取得的子宫内膜样本在诊断上的敏感性与特异性可能较高。不过，这种侵入性程序的失败率可能高达54％。当妇女不适合进行子宫内膜采样，或无法得到确定诊断结果时，临床指引推荐在麻醉下进行分段扩刮术(dilatation and curettage，D&C)。因此，许多患者会经历重复的侵入性诊断程序，包括子宫内膜采样或D&C，不但造成患者不便，也增加患者心理与经济上的负担。
另一方面，子宫镜手术的诊断准确度较高，在停经前与停经后的妇女中，其整体敏感度与特异性分别高达86.4％与99.2％。即便如此，对于经TVU诊断出子宫内膜厚度之后，子宫内膜厚度高于多少门坎值才应进一步进行子宫内膜采样或子宫镜手术，目前仍有争议。另一种非侵入式的EC诊断是测量血清与子宫颈阴道的血清癌抗原(CA)–125浓度。但CA-125检测的准确度很容易受到一些良性状况的影响，譬如子宫肌腺症或子宫肌瘤以及子宫内膜异位等。亦可利用子宫颈口细胞进行细胞学分析来诊断EC，但异常结果的比例在第一型EC中约有32.3％至86.0％，而第二型EC则是约57.1％至100％。
有鉴于此，相关领域亟需提出一种用以诊断妇科肿瘤(特别是子宫内膜癌)的方法。
发明内容
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。
本发明的一方面是关于用以评估一个体是否患有子宫内膜癌(EC)的方法。
根据本揭示内容一实施方式，此方法包含以下步骤：
(a)由该个体取得一样本；
(b)决定该样本中至少一目标基因的甲基化状况，其中上述至少一目标基因是BHLHE22(序列编号：1)或THY1(序列编号：2)或两者；
(c)决定该至少一目标基因是否高度甲基化；以及
(d)基于步骤(c)的结果评估该个体是否罹患EC，其中至少
一目标基因的高度甲基化代表该个体罹患EC。
根据本揭示内容多种不同的实施方式，所述样本是取自一个体(较佳为人体)的样本或原存在于个体(较佳为人体)内的样本。举例来说，所述样本是取自于个体的子宫内膜组织或细胞样本(如，子宫颈抹片细胞)。
根据本揭示内容某些实施方式，所述至少一目标基因还包含下列额外基因其中至少一种：ADARB2(序列编号：3)、CDO1(序列编号：4)、CELF4(序列编号：5)、CLVS2(序列编号：6)、GATA4(序列编号：7)、HOXA9(序列编号：8)、MTMR7(序列编号：9)、NTM(序列编号：10)、PRKCDBP(序列编号：11)、TBX5(序列编号：12)以及ZNF662(序列编号：13)。在这些实施方式中，决定BHLHE22及/或THY1的甲基化状况，并决定至少一种额外基因的甲基化状况，而后在步骤(d)中，基于上述所选基因的高度甲基化状况来进行评估。
根据其它实施方式，所述至少一目标基因包含BHLHE22、CDO1、THY1、CELF4、CLVS2、GATA4、NTM、PRKCDBP与TBX5。
根据某些实施方式，所述至少一目标基因包含BHLHE22与CDO1。在其它情形中，所述至少一目标基因包含BHLHE22与CELF4。或者是，上述至少一基因包含BHLHE22、CDO1与CELF。在这些情形中，于步骤(b)决定BHLHE22还有CDO1和CELF4其中之一或两者的甲基化状况，并且在步骤(d)中，基于BHLHE22还有CDO1和CELF4其中之一或两者的高度甲基化状况来进行评估。在视需要而采用的实施方式中，所述样本是取自于个体的子宫颈抹片细胞。
根据本揭示内容多种实施方式，所述子宫内膜癌是第一型子宫内膜癌；在其它实施方式中，所述子宫内膜癌是第二型子宫内膜癌。
在视需要而实施的实施方式中，可利用以下技术进行本揭示内容上述实施方式中所述的测定基因甲基化状况的步骤：甲基化特异度聚合酶连锁反应(methylation-specific polymerase chain reaction；MSP)、定量甲基化特异度聚合酶连锁反应(quantitative methylation-specific polymerase chain reaction；qMSP)、亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing；BS)、亚硫酸盐焦磷酸测序(bisulfite pyrosequencing)、微数组(microarrays)、质谱分析(mass spectrometry)、变性高液相层析法(denaturing high-performance liquid chromatography；DHPLC)、焦磷酸测序法(pyrosequencing)、甲基化DNA免疫沉淀法与定量聚合酶连锁反应(methylated DNA immunoprecipitation(MeDIP或mDIP)coupled with quantitative polymerase chain reaction)、甲基化DNA免疫沉淀测序法(methylated DNA immunoprecipitation sequencing；MeDIP-seq)或纳米孔测序法(nanopore sequencing)。
本发明的另一方面是关于用以评估一个体是否患有妇科癌或结肠癌的方法。
根据本揭示内容一实施方式，此方法包含以下步骤：
(a)由该个体取得一样本；
(b)决定该样本中至少一目标基因的甲基化状况，其中上述至少一目标基因是选自由以下所组成的群组：ADARB2(序列编号：3)、CLVS2(序列编号：6)、HOXA9(序列编号：8)、MTMR7(序列编号：9)以及NTM(序列编号：10)；
(c)决定该至少一目标基因是否高度甲基化；以及
(d)基于步骤(c)的结果评估该个体是否罹患妇科癌或结肠癌，其中至少一目标基因的高度甲基化代表该个体罹患妇科癌或结肠癌。
根据本揭示内容多种不同的实施方式，所述样本是取自一个体(较佳为人体)的样本或原存在于个体(较佳为人体)内的样本。举例来说，所述样本是取自于个体的子宫内膜组织或细胞样本(如，子宫颈抹片细胞)。
在本发某些实施方式中，所述妇科癌为第一型子宫内膜癌、第二型子宫内膜癌、卵巢癌、阴道癌、阴门癌、妊娠性滋养层细胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD)以及原发性腹膜癌(primary peritoneal carcinoma)。
在视需要而实施的实施方式中，可利用以下技术进行本揭示内容上述实施方式中所述的测定基因甲基化状况的步骤：甲基化特异度聚合酶连锁反应(MSP)、定量甲基化特异度聚合酶连锁反应(qMSP)、亚硫酸盐测序(BS)、亚硫酸盐焦磷酸测序、微数组、质谱分析、变性高液相层析法(DHPLC)、焦磷酸测序法、甲基化DNA免疫沉淀法与定量聚合酶连锁反应、甲基化DNA免疫沉淀测序法(MeDIP-seq)或纳米孔测序法。
本揭示内容的又另一方面是关于本案所述的生物标记的用途。具体来说，所述一或多生物标记可用制备一诊断试剂盒，以用于评估个体是否患有与上述一或多个标记相关的癌症。
当可想见，本揭示内容的范围亦涵盖各种诊断试剂盒，这些试剂盒可用以测量上述生物标记的甲基化程度。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
附图说明
为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
第1图为根据本揭示内容一实验例的相关矩阵(图框A)与热图(图框B)，其绘示来自MBDcap-Seq以及癌症基因组图谱(TCGA)的组织公开数据的候选基因的甲基化特征；
第2图摘要整理了根据本揭示内容一实施方式，BHLHE22、CDO1、CELF4以及ZNF662等基因的甲基化程度分布图(图框A)以及上述四种基因的分析效力(图框B)；
第3图摘要整理了根据本揭示内容一实施方式，子宫内膜组织样本中15个候选基因的甲基化状况，其可用于侦测子宫内膜癌；
第4图摘要整理了根据本揭示内容一实施方式，子宫颈抹片样本中12个候选基因的甲基化程度，其可用于侦测子宫内膜癌；
第5图摘要整理了根据本揭示内容一实施方式，某些候选基因针对训练集(图框A)与测试集(图框B)样本的分析效力；以及
第6图摘要整理了根据本揭示内容一实施方式，在结肠癌或卵巢癌中交互测试候选基因的结果。
具体实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体来说，除非上下文另有明确的说明，否则在本说明书与申请专利范围中，单数型式的“一”包含“复数个”。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与申请专利范围中，“A、B及C其中至少一者”、“A、B或C其中至少一者”以及“A、B和/或C其中至少一者”系指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、A与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
在此所述“诊断(diagnosis)”一词是指鉴别病理状态、疾病或症状，例如不同妇科组织来源的肿瘤，包含子宫颈、卵巢、子宫内膜/子宫、阴道、阴门、子宫与衬接子宫的腹膜。在某些实例中，所述“诊断”一词是指鉴别恶性和良性瘤。在另一些实例中，诊断一词系指鉴别恶性肿瘤与正常组织。
在本揭示内容中，所述“肿瘤(neoplasm)”一词是指异常新生的细胞或生长速度较正常细胞快的异常生长细胞。肿瘤会产生良性或恶性的无结构团块(肿块)。所谓“良性(benign)”是指非癌性的瘤或肿瘤，如，其细胞不会侵袭周边组织或转移至远处；而“恶性”则是指转移性瘤或肿瘤，其可侵袭周边组织且不受正常细胞生长控制。
在本文中，“癌(cancer)”一词是指动物中所有类型的癌症或恶性瘤或肿瘤。依据本揭示内容多种不同的实施方式，此处揭示的方法是关于一或多种源自妇科器官/组织的恶性肿瘤的诊断和/或预后。“癌症(carcinoma)”一词是指源自于上皮细胞的恶性肿瘤或癌。举例而言，本揭示内容多种实施方式所示的妇科癌症包含，但不限于，卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴门癌以及原发性腹膜癌。
当位于基因的核心启动子区域的CpG双核苷酸内的胞嘧啶的C5位置和甲基团共价键结时，称为“甲基化”。所述“甲基化状况(methylation state)”是指基因或一感兴趣的核酸序列内一或多个CpG双核苷酸上是否存在5-甲基-胞嘧啶(5-mCyt)。在此，所述“甲基化程度(methylation level)”是指基因或核酸序列的一或多个复本中甲基化的量。可将所述感兴趣的基因或核酸序列的甲基化程度表示成绝对数值。再者，也可采用“相对甲基化程度(relative methylation level)”的概念，以甲基化DNA的量相对于DNA总量来表示，或者是表示成甲基化的基因或核酸序列的复本数目相对于该基因或核酸序列的复本总数。此外，“甲基化程度(methylation level)”则是指在感兴趣的DNA片段中，甲基化的CpG部位所占的百分比。
在此所述“甲基化图谱(methylation profile)”是指样本中一或多个目标基因的甲基化程度的一组数据。在某些实施方式中，所述甲基化图谱是相较于从未知类型的样本所取得的一甲基化参照图谱的图谱，所述样本例如癌化样本或非癌化样本或不同癌症阶段的样本。
在此处，“差异性甲基化(differential methylation)”是指样本或族群中一或多个目标基因甲基化程度和其它样本或族群中一或多个目标基因甲基化程度两者间有所差异。差异性甲基化可区分为甲基化程度提升(高度甲基化(hypermethylation))或甲基化程度减少(低度甲基化(hypomethylation))。在此处，“高度甲基化”是指测试样本中目标基因的甲基化程度比参照样本中目标基因的平均甲基化程度增加至少10％。依据本揭示内容多种不同的实施方式，所述甲基化程度增加是指增加至少15、20、25、30、35、40、45或50％。
当可想见，在本揭示内容中所述的所有基因或多核苷酸序列各包含其变异体，这些变异体和所述基因或多核苷酸序列有至少75％的核苷酸序列相似度。再者，除非另有指明，在任情况下，本揭示内容的基因或多核苷酸序列可以“有至少75％核苷酸序列相似度之多核苷酸”一词取代。因此，除非另有相反的说明，此处所述的基因或多核苷酸序列在皆可理解为涵盖“其亚硫酸盐转化序列以及与该基因或该亚硫酸盐转化序列有至少75％核苷酸序列相似度的多核苷酸序列”。
此处针对核苷酸序列所述的“序列相似度百分比”(Percent(％)sequenceidentity)系指一候选序列的核苷酸残基与一参考多核苷酸序列的核苷酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将所述的候选序列与所述参考多核苷酸序列并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在计算相似度时，不会将保守性置换视为相同核苷酸。相关领域已有多种方法可供进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。一候选多核苷酸序列A相较于一参考多核苷酸序列B的核苷酸序列相似度(在本说明书中亦称之为序列A与序列B具有特定百分比(％)的核苷酸序列相似度)的计算方式如下：
Figure BDA0001788614950000121
其中X是利用Blastp或Blastn分析数据库对序列A、B进行排列后所得到的相同核苷酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的核苷酸残基总数。
在本说明书中，“个体”(个体)或“患者”(patient)等词可替换使用，其系指可利用本发明方法诊断和/或预后的动物，包含人类。因此，“个体”或“患者”包含任何可因本揭示内容的处置而获益的哺乳类动物。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。在一实例中，所述患者为人类。
所述“样本”一词在此包含任何从个体或患者上取得的样本。依据本揭示内容的方法，所述样本包含可供测定甲基化程度的DNA分子。举例而言，所述从个体或患者上取得的样本包含，但不限于：血液、抹片、痰、尿液、粪便、体液、胆汁、肠胃道分泌物、淋巴液、骨肉瘤骨髓、器官抽出物和或组织切片。可利用所属技术领域中具有通常知识者习知的技术测定这些从个体或患者身上所取得的样本。再者，所属技术领域中具有通常知识者皆知可利用已知的方法与试剂从所述样本中分离出DNA，如，利用酚/氯仿或是以商用试剂盒萃取DNA。
本揭示内容至少一部分是基于发现个体内一或多个目标基因的差异性甲基化程度(特别是高度甲基化)与肿瘤进程及罹患肿瘤的相关性。因此，可以单独或组合使用这些目标基因作为生物标记，以用于预测个体患有肿瘤或瘤的风险或易感性，决定肿瘤的恶性程度。再者，可基于患者体内相关基因的甲基化程度，来量身打造个人化治疗方针。举例而言，对于带有一或多个高度甲基化目标基因的患者，可以施用去甲基化药剂或其它表基因药物(epigenetic drug)以治疗肿瘤。
有鉴于此，本揭示内容提供各种不同的诊断方法，分别列示如下。举例而言，在此所有的方法皆涵盖测定至少一目标基因的甲基化状况或甲基化程度。因此，下文先说明在多数(或所有)所请方法中，共通的步骤。
依据本揭示内容各种不同的方面和/或实施方式，本揭示内容所提出的方法至少包含以下共通步骤：(a)采样步骤；(b)至少一甲基化测定步骤；以及(c)至少一过甲基化决定步骤。
在采样步骤中，若所述方法涉及一活体，则自该个体取得一生物性样本。根据本揭示内容多种不同的实施方式，所述样本是取自一个体(较佳为人体)的样本或原存在于个体内的样本；所述样本包括组织、组织样本或细胞样本(如，组织切片，例如，针吸式切片、刷式切片、表面切片、针切片、穿刺样本、切除性切片、开放性切片、切开性切片、内视镜切片、子宫颈抹片细胞、子宫刮取细胞或阴道灌洗样本)、肿瘤、肿瘤样本或生物性液体(如，腹腔液、血液(含血浆)、血清、淋巴液、脊髓液)。依据本揭示内容特定的实施例，所述样本是取自于个体的卵巢组织、细胞样本(如，子宫颈抹片细胞)和体液(如，血清和血浆)。根据本发明某些实施例的方法直接使用生物性样本，譬如，组织切片样本、子宫颈抹片细胞和体液样本(如，血液或尿液)；此时，可省略采样步骤，并取得既有样本以供后续分析。
关于步骤(b)，在下文提出的实验例中，利用qMSP或亚硫酸盐焦磷酸测序来测定甲基化，但当可想见，本发明所述方法不限于此：反之，所请发明的范围涵盖能够定量地决定一特定基因的甲基化状况或程度的均等方法。此外，上述方法与其均等技术亦适用于下文所述的实施方式；因此，为求简洁，在下文所述方面/实施方式中不会重复适用于决定甲基化状况或程度的方法。
在过甲基化决定步骤(c)中，判定至少一目标基因是否发生高度甲基化。
在本揭示内容中，本揭示内容提出用以评估一个体是否患有子宫内膜癌妇科(endometrial cancer；EC)的方法，本方法包含上述共通步骤(a)、(b)与(c)，以及一评估步骤(d)；在此步骤中，基于步骤(c)的结果来决定该个体是否患有EC。具体来说，上述至少一目标基因的高度甲基化代表所述个体患有EC。根据本揭示内容某些实施方式，上述至少一目标基因未出现高度甲基化代表所述个体并未罹患子宫内膜瘤(endometrial neoplasm)或其子宫内膜瘤为良性；举例来说，子宫肌腺瘤(myoma)就是一种常见的良性子宫内膜瘤。
根据本揭示内容多种实施方式，所述至少一目标基因为BHLHE22或THY1或两者。
在某些实施方式中，除了BHLHE22及/或THY1之外，所述目标基因还包含至少一种以下基因：ADARB2、CDO1、CELF4、CLVS2、GATA4、HOXA9、MTMR7、NTM、PRKCDBP、TBX5以及ZNF662。
根据某些视需要而采用的实施方式，所述至少一目标基因包含BHLHE22与CDO1。在某些实施方式中，所述至少一目标基因包含BHLHE22、CDO1与TBX5。在另一些实施方式中，所述至少一目标基因包含BHLHE22、THY1、CDO1与CLVS2。在又另一些实施方式中，所述至少一目标基因包含BHLHE22、CDO1与CELF4。在另一例子中，所述至少一目标基因包含BHLHE22与CELF4。或者是，所述至少一目标基因包含THY1与CDO1。又或者是，所述至少一目标基因包含THY1与CDO1，还有CLVS2与GATA4其中任一者或两者。在某些实施方式中，所述至少一目标基因包含BHLHE22、CDO1、THY1、CELF4、CLVS2、GATA4、NTM、PRKCDBP与TBX5。
在某些实施方式中，当决定了一个以上目标基因的甲基化状况时，所述的评估步骤可基于这些基因是出现过甲基化而决定。
根据本揭示内容多种实施方式，所述样本来自该个体的子宫颈抹片细胞或子宫内膜样本。
根据本揭示内容某些实施方式，此处提出的方法可用以在早期(如，根据国际妇产科联合会原则判定的第I或II期)评估个体是否罹患子宫内膜癌。在某些视需要而采用的实施方式中，所述样本来自个体的子宫颈抹片细胞，且BHLHE22还有CDO1和CELF4两者中至少一个的过甲基化表示所述个体患有子宫内膜癌。根据本揭示内容多种实施方式，所述子宫内膜癌可以是第一型或第二型子宫内膜癌。相较于传统的诊断方法，通常都是在癌症发生的较后期(如，第III或IV期)才诊断出第二型子宫内膜癌，此处提出的方法能在癌症进展到较为恶性的阶段前及早诊断，这也是本案的优点之一。
当可理解，亦可运用本揭示内容所确认的生物标记来制备用以评估个体是否患有子宫内膜癌的诊断工具。
举例来说，所述试剂盒所包含的材料可用以决定一或更多种所述生物标记的甲基化程度，所述生物标记如：BHLHE22、THY1、ADARB2、CDO1、CELF4、CLVS2、GATA4、HOXA9、MTMR7、NTM、PRKCDBP、TBX5与ZNF662。
本揭示内容的第二个方面揭示用以评估个体是否罹患妇科癌或结肠癌的方法。所述方法亦包含上述共通步骤(a)、(b)与(c)，且包含一评估步骤(d)，在此步骤中基于步骤(c)的结果决定所述个体是否罹患妇科癌或结肠癌。具体来说，所述至少一目标基因的过甲基化代表所述个体患有妇科癌或结肠癌。根据本揭示内容某些实施方式，所述至少一目标基因未出现过甲基化代表该个体并未罹患妇科肿瘤或结肠肿瘤，或所述妇科肿瘤或结肠肿瘤是良性的。
根据本揭示内容多种实施方式，所述至少一目标基因是选自以下所组成的群组：ADARB2、CLVS2、HOXA9、MTMR7与NTM。
根据本揭示内容某些实施方式，所述妇科癌是第一型子宫内膜癌、第二型子宫内膜癌、卵巢癌、阴道癌、阴门癌、妊娠性滋养层细胞疾病(GTD)或原发性腹膜癌。
相似地，亦可运用本揭示内容所确认的生物标记来制备用以评估个体是否患有妇科癌或结肠癌的诊断工具。
举例来说，所述试剂盒所包含的材料可用以决定一或更多种所述生物标记的甲基化程度，所述生物标记如：ADARB2、CLVS2、HOXA9、MTMR7与NTM。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信习知技艺者在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。
材料与方法
1.组织样本
所有组织样本都是在2014年10月至2015年5月间，于台北医学大学附设双和医院取得。所纳入的个体为30至80岁的女性。从每一参与者的医院病例收集以下信息：年纪、肿瘤的组织分类、国际妇产科联合会癌症期别与组织分类。本试验经台北医学大学附设双和医院人体试验委员会同意，并遵循赫尔辛基2000宣言。本试验取得所有参与者的知情同意。
从手术取得子宫内膜样本后立刻以液态氮冷冻并储存于-80℃，以供后续使用。由妇产科病理医师进行组织检验，以对每一样本进行病理学诊断。刮取子宫肌瘤患者卵巢上皮细胞，以得到正常上皮卵巢组织样本。
从经诊断患有子宫肌瘤或恶性子宫内膜肿瘤的患者以及在取样时并未罹患卵巢与子宫颈疾病的女性患者身上取得子宫颈抹片细胞。内子宫颈(endocervical)抹片细胞的采集步骤如下。将新的内子宫颈采样刷伸入内子宫颈管，接着，轻轻的旋转采样刷三至五次，以确保采样确实。其后，将采样刷浸入含2毫升
Figure BDA0001788614950000181
(Ambion；Lifetechnologies；USA)的离心管(15毫升)中，接着将离心管封盖。将内子宫颈抹片细胞样本存放于4℃。以震荡器混合10秒后，将含抹片细胞的样本平均分配至三个离心管中(每管1毫升)，并将其存放在-80℃备用。
2.发现及验证
在发现组中，使用来自以下数据库的公开数据来识别甲基化生物标记：癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)，包括270个恶性子宫内膜肿瘤组织和28个正常子宫内膜组织；Em-MethylCap-seq，包括78个恶性子宫内膜肿瘤组织和11个正常子宫内膜组织；以及HCL数据，包括10个恶性子宫内膜肿瘤组织和10个子宫肌瘤中的正常子宫内膜组织。用来验证甲基化生物标记的样本包括：25个子宫内膜恶性肿瘤组织、5个子宫肌瘤的正常子宫内膜组织，以及15、10与15个分别来自子宫内膜恶性肿瘤组织、子宫肌瘤以及正常子宫内膜组织的子宫颈抹片细胞。
对于验证组中的训练集，使用来自患有子宫内膜癌、子宫肌瘤患者与健康患者的子宫颈抹片细胞，每组样本数为28个。实验例1验证组中的测试集使用了相同的样本数目。实验例2中的验证组的测试集分别使用了50、40以及56个来自患有子宫内膜恶性肿瘤组织、子宫肌瘤的患者以及正常子宫内膜的患者的子宫颈抹片细胞。
3.全基因体DNA甲基化分析
3.1. 450K甲基化珠粒数组
使用450K甲基化芯片数组(Illumina Inc.,San Diego,CA,USA)来进行298个子宫内膜组织样本(子宫内膜样腺癌以及28个邻近的正常组织)的第一甲基化分析，以便找出EC的差异化甲基化图谱。使用来自TCGA数据库的第三级数据。以β值并进行常态分布处理后，表示每一CpG的甲基化分数。癌症样本的肿瘤细胞性(neoplastic cellularity)大于等于40％。移除对应到性染色体上的探针以及所涵盖的单一核苷多型性状(single nucleotidepolymorphism；SNP)，本研究专注在剩余的379,054个CpG部位。利用曼氏-惠氏U检定分析有显著差异甲基化的CpG部位，且P≤0.001。进一步辨识出位于编码基因转录起始部位(transcriptional start sites；TSS)的最邻近位置(-1000至+1000范围内)中的CpG部位。此外，选出以EC读数中位数减去正常读数后过甲基化差异前5％者。
3.2.MethylCap测序
利用MethylMiner甲基化DNA增量试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)并依制造商的使用手册来处理2微克的基因体DNA，以得到富含甲基化的DNA。简言之，基因体DNA经超声波处理至约200-bp，以MBD蛋白质捕捉，并利用1M盐类缓冲液沉淀。依据Illumina(SanDiego,CA)所提供的标准流程，利用富含甲基化DNA产生序列库以供测序。利用IlluminaGenome Analyzer IIx System测序MethylCap-seq序列库。利用标准化Illumina pipeline进行影像分析和碱基判定。利用ELAND算法将独一的读值(读值最高36-bp)和人类参考基因体(hg18)对映，并允许最多两个碱基对的配对错误。
将独一对映的读值用于进一步的标准化与差异化甲基化分析。根据下列公式1与公式2累加读值数目，以计算甲基化程度。
Figure BDA0001788614950000201
N_(Read,i)为在第i个筐(bin)处的标准化读值数目；U_(Read,i)是在第i个筐处独一对映的读值数目；而N_U是独一对映读值的总数。“INT”是向负无限方向舍去后最接近的整数组件；而“^”是次方运算子(power operator)。利用标准化的独一读值的平均值来表示甲基化程度区域。在比较群组A与B时(G＝A或B)，分别计算一指定区域R(其框大小为m，且起始框为第s个)中两个群组的平均甲基化程度(AVGR,G)。群组A的样本数目为S_A，而群组B的样本数目为S_B。
Figure BDA0001788614950000202
AVGR,G代表群组G在R区域的平均甲基化程度。MR,G是群组G中每一样本在R区域的甲基化程度。使用双尾曼氏-惠氏U检定来确认R区域中不同甲基化的统计显著性(P≤0.001)。分析个体样本与对照样本间的差异化甲基化基因座。分析横跨编码基因TSS上游与下游各1000碱基对的共2000个碱基对的区域的甲基化程度。本研究排除位于性染色体的TSS区域，并分析剩余的23,215个TSS区域，并选出以EC读数中位数减去正常读数后过甲基化差异前5％者。
TCGA数据库使用450K甲基化芯片数组来分析组织样本，且该数据库中包括了来自417个子宫内膜组织的数据集。在这些资料集中，本研究选择肿瘤细胞比例大于等于40％的371个癌症病例。利用无母数检定(non-parametric test)来探讨个体样本与对照样本间CpG部位的差异化甲基化。一开始选择P≤0.001且有较高β值的差异化甲基化(前5％)的探针。之后，辨识出位于编码基因转录起始部位-1000至+1000范围内的显著探针。依本研究的选择标准，所选的高度甲基化基因带有至少五个利用上述方法辨识出的探针。
3.3.DNA甲基化图谱的丛集分析与候选基因的选择
使用MeV4版本4.9，运用曼哈顿距离(Manhattan distance)下的完全连锁聚合阶层丛集法来得到DNA甲基化图谱的热图。在每一组中，选择一到两个较不常被报导和癌症的甲基化改变有关的候选基因，且其在非EC患者的正常子宫内膜中信号强度较低者。
4.定量DNA甲基聚合酶连锁反应
4.1.制备基因体DNA和亚硫酸盐转化
利用QIAmp DNA Mini Kit萃取试剂盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)从样本中萃取基因体DNA。利用EZDNA Methylation Kit试剂盒(ZYMO RESEARCH,CA,USA)并依制造商建议，将基因体DNA(1微克)进行亚硫酸盐修饰，并将其溶于70μL的无核酸酶水中。以上述亚硫酸盐DNA作为模版来进行DNA甲基化分析。
4.2.定量甲基化-特异度聚合酶连锁反应(qMSP)
使用特异度探针和引子进行定量甲基化-特异度PCR，并参照总输入DNA中未甲基化的COL2A1来决定相对DNA甲基化程度。
利用LightCycler 480SYBR Green I Master (Roche,Indianapolis,IN,USA)扩增PCR产物。20μl的反应混合物中含有2μL经亚硫酸盐转化的DNA、引子(浓度分别为250nM)以及10μl的。使用LightCycler 480，反应参数为：95℃、5分钟、50个循环的95℃、10秒，60℃、30秒，以及72℃、30秒，且最终延长为72℃、5分钟。所有样本中的每一个基因进行两次重复试验。利用以下公式计算ΔCp以得到DNA甲基化程度：(基因Cp值)-(COL2A的Cp值)]。基因Cp值减去COL2A的Cp值大于36者认定为侦测失败。利用Oligo 7.0Primer Analysis软件设计所用引子。
5.统计分析
以曼氏-惠氏U检定来比较两个群组的甲基化程度。以克氏-威氏(Kruskal–Wallis)检定来比较超过两个群组的甲基化程度。
在独立组中(independence cohort)，以真阳性率(即，敏感度)和伪阳性率(1减去特异度的差)作图，而得到受试者操作特征曲线(receiver operating characteristiccurve；ROC)。为了评估最佳准确度，利用ROC曲线下面积(area under the curve；AUC)来确认最佳化阈值，以区分来自两组的样本。进行200次的自助抽样法(bootstrapping)并利用pROC试剂盒R的cloes.left法以求出最佳阈值。所述方法使用以下公式来计算最小总和[(1-准确度)2+(1-专一性)2]。利用逻辑回归来预测OR以及95％信赖区间(CI)，以描述与每一候选基因或基因组合的甲基化状况相关的EC风险。利用双尾检定来评估显著差异，P<0.05。利用R(版本3.1.2)与MedCalc(版本14.12.0)的统计试剂盒来进行上述分析与图式。使用G*Power(版本3.1.9.2)，运用费氏精确事后检定(Fisher’s exact post hoc tests)以及0.01的假定α错误比例(assumed alpha error proportion)来评估统计检定力。
实验例1
鉴别与子宫内膜癌诊断相关的高度甲基化基因
于发现组中，利用来自MethyCap测序与甲基化珠粒芯片的数据来鉴别子宫内膜癌中的新颖高度甲基化基因。识别每一基因的转录起始部位(TSS)±1kb范围内的差异化甲基化区域(differential methylation region；DMR)。在第一分析阶段中，比较来自不同数据集的子宫内膜癌样本与正常样本间基因的甲基化程度，因而辨识出其甲基化模式有一致性分群(consensus clustering)的180个基因。经过本案提出的筛选标准，依临床相关度与功能富集(functional enrichment)分析，选出23个基因(参见第1图图框A)。
进一步验证发现组中选出的23个候选基因，将来自正常子宫内膜组织(n＝15)、子宫肌瘤组织(n＝10)与恶性子宫内膜癌组织(n＝15)的混合DNA进行qMSP，并识别出14个候选基因。再进一步验证这14个候选基因，将来自经诊断罹患恶性子宫内膜癌(EC，n＝56)或子宫肌瘤(Myo，n＝40)的患者的子宫颈抹片细胞或来自正常子宫内膜组织(Nor，n＝50)个体的子宫颈抹片细胞的混合DNA进行亚硫酸盐焦磷酸测序。分析结果(第2图与表1)显示，这9个基因亦可用在以子宫颈抹片细胞来区分个体的子宫内膜组织是否带有子宫内膜癌或是否为正常或带有子宫肌瘤。
表1
Figure BDA0001788614950000241
利用Youden′s法基于甲基化程度在子宫内膜癌相对于非恶性癌症个体中的分布进行甲基化程度的二分法。OR利用单变数逻辑回归计算。实际a≤0.10)，以及检定效力(1-β)＞0.99，利用事后成对费雪精确检定计算。
具体来说，第2图图框A显示BHLHE22、CDO1、CELF4与ZNF662的甲基化状况。利用个别的子宫颈抹片细胞，可以确认EC样本中的DNA甲基化状况高于正常子宫内膜组织与子宫肌瘤组织的甲基化状况。图中的水平线表示表1所列的阈值。P值系利用克氏-威氏检计算。
更有甚者，如第2图图框B所示，这4个基因都展现了理想的ROC曲线下面积，其AUC值接近1(0.89至0.95)，表示有较佳的分群。
亦分析了基因组合的分群功效，其结果摘要整理于表1，由表1可以看出，相较于单一基因，利用所述基因组合有较佳的专一性。更明确地说，BHLHE22、CELF4与CDO1组合检测中，任两者阳性的敏感度为91.8％、专一性为95.5％，且其风险提高率为236.3倍(95％CI，56.4-989.6)。这些结果和早期EC侦测的结果相似(敏感度89.5％、专一性95.5％、OR为178.5，95％CI，42.2-754.9)。利用来自经诊断患有第二型子宫内膜样癌患者的子宫颈抹片细胞来决定候选基因的甲基化状况，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001788614950000251
Mu黏液性：CC澄清细胞：En子宫内膜样；期别根据国际妇产科联合会原则判定。根据子宫内膜样类型所计算的结果来计算阈值。BHLHE22、cELF4与CDO1的阈值分别是21.9、14.0和69.5。粗斜体标示者的甲基化指数高于阈值。CYCA-03-2010患者在外部医疗院所经刮宫诊断罹患血清型子宫内膜癌，但本院以子宫样本诊断，显示仅罹患复杂非典型增生症。
实验例2
鉴别与子宫内膜癌诊断相关的高度甲基化基因
于发现组中，利用上文所述数据集来鉴别子宫内膜癌中的新颖高度甲基化基因。识别每一基因的转录起始部位(TSS)±1kb范围内的差异化甲基化区域(differentialmethylation region；DMR)。在第一分析阶段中，比较来自不同TCGA数据集的子宫内膜癌样本与正常样本间基因的甲基化程度，因而辨识出46个基因。此外，比较来自TCGA数据集中肿瘤与正常样本间的基因甲基化程度，以识别候选基因。共识别出15个一致地展现出高度甲基化的候选基因(参见第1图图框B)。
进一步验证发现组中选出的15个候选基因，将来自正常子宫内膜组织(EmN_Myo，n＝5)与恶性子宫内膜癌组织(EC，n＝25)的混合DNA进行qMSP。分析结果(第3图)显示这15个候选基因在恶性子宫内膜癌组织中都发生明显的过甲基化。
进一步验证这些候选基因，将来自正常子宫内膜组织(N_Em，n＝15)个体的子宫颈抹片细胞或来自经诊断罹患恶性子宫内膜癌(EC，n＝15)或子宫肌瘤(Myo，n＝10)的患者的子宫颈抹片细胞的混合DNA进行qMSP。分析结果(第4图)显示，这15个基因中的11个基因亦可用在以子宫颈抹片细胞来区分个体的子宫内膜组织是否带有恶性子宫内膜癌或是否为正常或带有子宫肌瘤。上述11个基因是：ADARB2、BHLHE22、CDO1、CLVS2、GATA4、HOXA9、MTMR7、NTM、PRKCDBP、TBX5与THY1。应注意到，虽然FOXI2显示出差异性甲基化，但其信号较弱，故因此并未将其纳入后续分析。
后续分析涵盖了上述11个候选基因还有先前研究所找出的CELF4基因，以分析其甲基化图谱。第5图显示候选基因用于鉴别EC与非EC样本的效力，图中分别显示训练集(图框A)和测试集(图框B)数据的ROC曲线下面积。与比较面积等于0.5时，所有分析的P值小于0.001。以空心圆圈标示阈值，并整理于表3。
表3
Figure BDA0001788614950000271
在训练集中，ADARB2、HOXA9与MTMR7的组合分析未提升准确度，因此在测试集中并未进一步验证。
表3的数据显示，受测基因中的6个基因(BHLHE22、CDO1、CELF4、CLVS2、GATA4与THY1)在鉴别正常或具有子宫肌瘤的个体以及罹患子宫内膜癌的患者时，展现了显著的准确度(至少80％)。此外，BHLHE22、CDO1、CELF4、CLVS2与THY1的AUC值介于0.83至0.9之间，意味着这些基因有较佳的分群效果。选择准确度较佳的基因进行后续分析，以评估基因组合的效果，结果摘要整理于表4。
表4
Figure BDA0001788614950000281
利用所有子宫颈抹片细胞与逻辑回归模型计算风险分数。
表4的数据显示，利用全子宫颈抹片细胞时，所述基因组合的准确度优于任何单一基因(表4，56个EC样本，56个子宫肌瘤样本与56个正常样本)。
实验例3
候选基因于妇科癌与结肠癌的交互检验
进一步检验ADARB2、CLVS2、HOXA9、MTMR7、NTM以及PRKCDBP于鉴别异常妇科疾病或结肠癌的能力，其结果摘要整理于第6图(每一符号代表来自5名个体的混合DNA的资料)。在结肠组织样本(Co)中，ADARB2、CLVS2、HOXA9、MTMR7以及NTM于结肠癌患者(Ca)中的甲基化程度高于这些基因在正常结肠组织(1N)中的甲基化程度。在卵巢组织(Ov)中，所述7个基因在卵巢癌患者中都有较高的甲基化程度。每一个三角形与圆形代表来自五个等量DNA样本的混合DNA数据。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
Figure IDA0001788617060000011
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Claims (8)

1.一种检测生物标记BHLHE22、THY1或其组合甲基化程度的试剂在制备诊断子宫内膜癌试剂盒中的用途，其中该试剂盒是基于取自于一个体的样本，评估该样本中作为生物标记的BHLHE22、THY1或其组合的甲基化判断该样本是否为子宫内膜癌样本。
2.如权利要求1所述的用途，其中该生物标记还包含CDO1。
3.如权利要求1所述的用途，其中该生物标记还包含ADARB2、CDO1、CELF4、CLVS2、GATA4、HOXA9、MTMR7、NTM、PRKCDBP、TBX5和ZNF662其中至少一者。
4.如权利要求1所述的用途，其中该生物标记包含BHLHE22、CDO1、THY1、CELF4、CLVS2、GATA4、NTM、PRKCDBP和TBX5。
5.如权利要求1至4任一项所述的用途，其中该样本是来自该个体的子宫内膜组织或子宫颈抹片细胞。
6.如权利要求1所述的用途，其中该样本是来自该个体的子宫颈抹片细胞，该生物标记为BHLHE22并还包含CDO1和CELF4其中至少一者。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述的子宫内膜癌是第一型子宫内膜癌。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述的子宫内膜癌是第二型子宫内膜癌。
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