KR20190015900A

KR20190015900A - 섬유근육통 진단용 조성물, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트

Info

Publication number: KR20190015900A
Application number: KR1020170099669A
Authority: KR
Inventors: 김재일; 김학재; 이화영
Original assignee: 김재일; 이화영; 김학재
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2017-08-07
Publication date: 2019-02-15
Also published as: KR101972333B1

Abstract

본 발명은 섬유근육통과 유의적 상관관계를 갖는 엔도세린-1(endothelin 1, EDN1) 유전자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 선별하고, 이를 마커로 이용하여 섬유근육통 발병 위험성을 예측하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 엔도세린-1 유전자의 일부를 구성하는 rs1800541의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 502번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 섬유근육통 진단용 SNP 및 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 포함하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이 및 이를 포함한 키트에 관한 것이다.

Description

섬유근육통 진단용 SNP, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트{SNP for diagnosing fibromyalgia, microarray and kit comprising the same}

본 발명은 섬유근육통과 유의적 상관관계를 갖는 엔도세린-1(endothelin 1, EDN1) 유전자의 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 선별하고, 이를 마커로 이용하여 섬유근육통 발병 위험성을 예측하기 위한 것으로서, 보다 상세하게는 엔도세린-1 유전자의 일부를 구성하는 rs1800541의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 502번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 섬유근육통 진단용 SNP 및 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 포함하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이 및 이를 포함한 키트에 관한 것이다.

인간 유전체 염기서열 중에 99.9%가 동일하지만, 일부분 0.1%의 차이에 의해 개인간의 모습이나, 행동, 그리고 질환감수성에 차이가 생긴다. 30억개 인간 유전체 염기서열 중에서 대략 1,000bp 마다 1회의 빈도로 서로 다른 염기가 올 수 있고, 이는 총 3백만개가 되며, 이를 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)이라고 부른다. 즉, 인간 유전체의 전체 염기서열 중에서 다형성을 보이는 3백만개 정도의 염기를 분석한다면, 개인간이나 집단 간의 차이, 또는 질환군과 정상인의 차이를 알 수 있을 것이다.

SNP는 세대를 통한 새로운 돌연변이율이 작고, 적은 비용으로 빠르고 정확한 분석이 가능하기 때문에 인구집단의 유전학적 통계분석에 유리하고, 다른 유전학적 지표에 비해서 더욱 중요하게 사용되고 있다. 또한 SNP는 그 빈도가 높고, 안정하며 유전체 전체에 골고루 잘 분포되어 있어 자동화로 대단위 발굴이 가능하다. SNP는 DNA 칩 기술, 초고속 염기서열 분석 기술 등과 접목되어 개인의 질병 예측 및 의약품에 대한 개인 차이를 규명하는 등의 새로운 분야에 크게 기여할 것이다.

SNP는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP가 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수 있다. SNP가 비코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 이들 중 일부는 RNA 스플라이싱에 영향을 주어 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다. 이들 SNP가 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 SNP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용할 수 있다.

현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능분석에 관한 연구를 수행하고 있고, 이렇게 찾아낸 SNP의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개함으로써 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고있다. 그러나 이러한 SNP는 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 SNP가 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.

섬유근육통(fibromyalgia)는 전신통증, 여러 곳의 압통, 오전 중의 경직, 피로 및 수면장애를 일으키는 병으로, 전신 근육통과 피로감을 흔히 나타내는 질환으로 그 병명은 근육과 인대, 건 등의 섬유성 교원 조직의 통증을 의미한다. 어느 연령층이나 발생할 수 있지만 30대에서 50대 사이의 중년층에 흔하며, 특히 여자에서 남자보다 9배 정도 호발한다.

만성통증은 침범부위에 따라 만성국소통증(chronic regional pain)과 만성전신통증(chronic widespread pain)으로 분류되는데 만성전신통증은 신체의 좌우측 부위와 허리를 기준으로 상하 부위의 3개월 이상 지속되는 통증을 말한다. 1990년 미국류마티스학회에서는 만성전신통증이 있으면서 18개의 가능한 압통점에서 이중 11부위 이상에서 통증을 호소하게 되면 섬유근육통이라고 분류하였다. 서구에서는 전체 인구의 1-2%가 섬유근육통에 해당된다고 보고되어있고, 국내의 조사에서도 서구와 비슷한 빈도의 섬유근육통 환자가 있는 것으로 보고된 바 있다.

발병원인은 정확하게 밝혀지지 않았지만 정신적 충격, 신체의 호르몬 변화, 감기 같은 다른 질환, 근육 이상, 신경 전도 물질 등이 단독 또는 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 원인에 대해 유전적, 생물학적 및 사회 심리학적 연구 모두 필요하다. 유전문제에서 보면 가족 중에 편두통이 있는 경우, 특히 어머니, 여동생 등 여자 가족의 유전적 성향이 뚜렷한 경우 등에서 연관이 큰 것으로 보아 유전적인 문제를 무시할 수는 없다.

섬유근육통과 관련하여 상피세포와 혈관 평활근세포에 의해 생산 되는 강력한 혈관수축인자인 엔도세린-1의 감소현상이 보고되었으며, 임상적으로 엔도세린-1의 중요성이 강조되어 왔다. 섬유근육통 환자의 유전학적인 연구는 다방면에서 진행되고 있고, 임상적으로 중요성을 가진 엔도세린-1에 대한 연구도 진행되고 있지만, 이전의 연구들은 분석대상의 숫자가 적고, 한국인이 아닌 점에서 한계점이 있었고, 한국인의 섬유근육통 환자와의 연관성을 찾아 구분할 수 있는 유전학적 특징을 찾고 실제 단백질과의 관련성에 대한 연구는 미미한 상태이다.

대한민국 공개특허공보 10-2007-0010569 (2007.01.24.) 대한민국 공개특허공보 10-2012-0083518 (2012.06.07)

이에, 발명자들은 섬유근육통의 발병 및 그 확률을 조기에 진단할 수 있는 SNP를 발굴하기 위하여 섬유근육통과 연관성이 있는 유전자를 탐색하여 선별하고, 각 유전자의 특이적 염기서열을 탐색한 결과, 섬유근육통에 특이적인 특정 SNP를 이용하여 섬유근육통의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기섬유근육통에 특이적인 특정 SNP를 이용하여 섬유근육통의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있는 섬유근육통 진단용 SNP, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명은 엔도세린-1 유전자의 일부를 구성하는 rs1800541의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 502번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 섬유근육통 진단용 SNP을 제공한다.

또한, 본 발명은 엔도세린-1의 혈중 분비형 펩타이드를 포함하는 섬유근육통 진단용 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이 및 상기 마이크로어레이를 포함하는 섬유근육통 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 섬유근육통과 유의적 상관관계를 갖는 엔도세린-1(endothelin 1, EDN1) 유전자의 SNP 및 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트를 이용하여, 섬유근육통의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 효소결합면역흡착검사법으로 측정한 섬유 근육통 환자군과 정상인군의 혈장 내 엔도세린-1 의 그래프.
도 2는 HRM염기서열분석법을 통해 분석된 엔도세린-1 SNP의 단일염기다형성의 결과 그래프.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

본 발명을 달성하기 위하여 본 발명자들은 엔도세린-1(endothelin 1, EDN1)에서 나타나는 특이한 염기서열을 문헌 및 웹사이트(ensembl human SNPView; http://www.ensembl.org) 검색을 통해 엔도세린-1 유전자내의 여러 가지 유전적 다형 현상 중 다른 인종에서 유전적 다형성이 분석되어 있는 단일염기다형성들을 골라서 이를 바탕으로 소규모 그룹의 샘플을 통해 예비 분석한 결과 rs1800541(SNP의 NCBI GenBank 등록번호) SNP에서 환자와 정상인간의 유전적 다형성 차이가 통계적으로 유의한 것으로 사료되었다. 또한, 본 발명자들은 문헌 검색을 통해 사람의 혈액에서 엔도세린-1의 농도가 정상인과 임상의학적으로 섬유근육통 판정을 받은 환자에서 차이가 있다는 것이 한국인이 아닌 인종의 연구결과를 통해 이를 바탕으로 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 을 시행한 결과, 한국인에서도 임상의학적으로 섬유근육통 판정을 받은 환자에서 엔도세린-1 단백질의 농도가 상대적으로 높은 것으로 나타났고 이는 통계적으로 유의한 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 섬유근육통 진단용 SNP에 관한 것으로, 엔도세린-1 유전자의 일부를 구성하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 502번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 있어서 상기 SNP는 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태(약 1개/ 1kb)를 말한다.

상기 서열번호 1은 상기 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 존재하는 각 SNP의 특성에 관하여는 하기 표 1에 기재되어 있다. 서열번호 1은 rs1800541의 상보적인 염기서열(Reverse strand)을 나타낸다.

SNP의 NCBI 젠뱅크등록번호	SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드	유전자	SNP 역할	대립 유전자
rs1800541	서열번호1	endothelin 1	promoter	T/G

상기 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에서는 섬유근육통과의 관련성이 매우 큰 SNP를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳐 선택된 SNP에 대한 환자군과 정상인군 간의 단일 염기 다형성 분석을 실시하였다. 즉, 섬유근육통 환자들 및 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, SNP 부위의 염기 서열을 분석하였다. 본 발명의 하기 실시예 1에서 확인된 SNP의 유전자형 분포 결과를 표 3에 나타내었고, 상기 SNP은 섬유근육통 진단에 유용한 바이오 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 섬유근육통 진단용 SNP는 각 SNP 위치(501번째) 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나의 폴리뉴클레오티드로 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어짐으로써, 섬유근육통의 존재 또는 위험의 유무를 더 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명에 따른 섬유근육통 진단용 SNP를 구성하는 상기 폴리뉴클레오티드는 8개 이상의 연속 뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 8 내지 70개의 연속 뉴클레오티드인 것이 보다 바람직하다.

하기 실시예 2에서는 섬유근육통과의 관련성이 매우 높은 바이오 마커를 개발하기 위하여, 일련의 선별 과정을 거쳐 선택된 환자군과 정상인군 간의 엔도세린-1 단백질에 대해 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 실시하였다. 즉, 섬유근육통 환자들 및 정상인들의 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 단백질의 농도를 분석하였다. 본 발명의 실시예 2에서 확인된 단백질 농도의 분석결과를 도 1에 나타내었고, 상기 단백질은 섬유근육통 진단에 유용한 바이오 마커가 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또한, 섬유근육통 진단에 유용한 바이오 마커로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적이다.

상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1의 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 여기서, 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서보통 수행된다. 예를 들면, 5?SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25~30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 그 3'말단이 서열번호 1의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction : LCR)에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위(즉, 15 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 7번 위치가, 16 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 8 또는 9번 위치)가 상기 서열의다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

또 다른 본 발명은 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 기술분야의 당업자에 게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

또 다른 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 섬유근육통 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명에 따른 SNP의 유전자형 분석

본 실시예에서는 한국인 중 섬유근육통 환자로 판명된 환자군과 섬유근육통 증상이 없는 정상인의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 특정한 SNP의 출현 빈도를 분석하였다. 본 실시예에서는 문헌 분석 등을 통해 미리 선별한 엔도세린-1 유전자의 특정 SNP의 유전자형을 분석하였다. 상기 SNP에 관한 자료는 표 1에 나타내었다. 또한 상기 SNP의 염기서열을 서열목록에 나타내었다.

1-1. DNA 시료의 준비

섬유근육통 환자로 판명된 한국인 환자군(88 명)과 섬유근육통 증상이 없는 한국인 정상인군(87 명)의 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. 염색체 DNA 추출은 공지의 추출 방법(Molecular cloning : ALaboratory Manual, p 392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)과 상업용 키트 (Gentra system, D-50K)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도 기준이 UV 측정비율(260/280nm)로 최소 1.7 이상 되는 것만을 선별하여 사용하였다.

1-2. 표적 DNA의 증폭 및 SNP 부위 서열의 분석

분석하고자 하는 SNP가 포함된 일정한 DNA 영역인 표적 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR 방법은 통상적인 방법으로 진행하였으며, 그 조건은 다음과 같았다. 먼저, 표적 게놈 DNA를 2.5 ng/ml로 준비하였다. 이 후 다음의 PCR 반응액을 준비하였다.

물(HPLC 급) 3.14㎕

10x 버퍼 0.5㎕

MgCl2 25 mM 0.2㎕

dNTP 믹스(GIBCO)(25 mM/각) 0.04㎕

Taq pol(HotStart)(5U/㎕) 0.02㎕

전위/후위 프라이머 믹스 (10?M) 0.1㎕

DNA 1.00㎕

총 반응 부피 5.00㎕

여기서, 상기 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머는 SNP의 상류와 하류로부터, 적당한 위치에서 선택하였다.

PCR의 열 순환은, 95℃에서 15분 동안 유지하고, 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분을 45회 반복하고, 72℃에서 3분 동안 유지한 후, 4℃에 보관하였다. 그 결과, 200개 뉴클레오티드 이하의 길이를 가진표적 DNA 단편을 하기 표 2와 같이 얻었다. 표적 DNA 단편은 high resolution melting(HRM) 염기서열분석기를 이용하여 단일 염기 다형성을 분석하였다.

SNP	Position	Forward primer sequence	Reverse primer sequence	PCR product sizw(bp)	Alleles
T-1370G (rs1800541)	12228986	5'-CAG AAT GAC CCC GTG ACA C-3'	5'-CAT TGG CTT TTT CCG CTA GC-3'	120	G/T

<유전자형 분석을 위한 프라이머 서열>

1-3. SNP 유전자형 분포 분석 결과

도 2는 SNP의 유전자형(단일염기다형성)의 분석 결과의 예이며, 표 3의 상단 내용은 SNP의 유전자형 분포에 대한 유전모델 분석 결과를 나타낸다. 칼럼 'P-value'는 SNP의 유전자형의 2-by-3 분할표에 대한 유전모델 분석의 결과인 확률수준을 의미한다. 상기 P-value가 0.05보다 작은 경우 표본집단은 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있음을 의미한다(김동욱외, [통계학 계론], (서울: 박영사, 2004)). co-dominant 모델은 하나 그리고 두 개의 소수 대립형질을 가진 사람에서 상대적인 질환 위험이 다르다는 가정, dominant 모델은 하나 또는 두 개의 소수 대립형질을 가진 사람들이 같은 상대적인 위험을 갖는다는 가정, recessive 모델은 2개의 소수 대립형질을 가진 사람들이 상대적으로 높은 위험을 갖는다는 가정 하에 로지스틱 회기 분석을 사용하여 분석하였다.

유전형/대립유전자	정상군 (n=87)		섬유근육통 (n=88)		모델	OR (95% CI)	P
유전형/대립유전자	Freq.	%	Freq.	%	모델	OR (95% CI)	P
TT	55	63.20	35	39.80	Co-dominant	3.14(1.59-6.23)	0.004
TG	20	23.00	40	45.50		1.70(0.70-4.15)	0.004
GG	12	13.80	13	14.80	Dominant	2.60(1.41-4.79)	0.002
					Recessive	1.08(0.46-2.53)	0.850
T	130	0.75	110	0.62
G	44	0.25	66	0.38		0.56(0.36-0.89)	0.014
FMS, fibromyalgia syndrome; Freq., frequency; OR, odds ratio; CI, confidence intervals; P, p-value.

<정상군과 섬유근육통 환자의 엔도세린-1 유전자형과 대립유전자의 빈도>

표 3의 상단 내용에서 보이는 바와 같이 P-value는 co-dominant와 dominant 모델에서 0.05보다 작은 값을 나타내어 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있었다. SNP의 유전자형은 섬유근육통 유무에 따라 통계적으로 차이가 있었다. 따라서, 상기 SNP는 섬유근육통 진단용 바이오 마커로 사용될 수 있다고 판단된다.

표 3의 하단 내용은 SNP의 대립 유전자 빈도에 대한 카이제곱 검정 결과를 나타낸다.

칼럼 'P-value'는 각 SNP의 대립유전자 빈도의 2-by-2 분할표에 대한 카이제곱 검정의 결과인 확률수준을 의미한다. 상기 P-value가 0.05보다 작은 경우 포본집단은 섬유근육통 유무에 따른 상기 SNP의 대립유전자의 빈도는 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있음을 의미한다.

칼럼 'OR?은 해당 SNP의 특정 대립유전자를 기준으로 정상인군 중에서 해당 SNP의 특정 대립유전자를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 SNP의 특정 대립유전자를 가질 확률인 오즈비(odds ratio)를 나타낸다. 오즈비의 기준이 되는 특정 대립유전자를 a로 하고, 환자군과 정상인군의 빈도가 다음과 같을 때

오즈비(odds ratio) = ad/bc

환자군 빈도 a b

정상인군 빈도 c d

상기 오즈비가 1 보다 큰 경우에는 오즈비 그 자체, 1보다 작은 경우에는 오즈비의 역수로서 해당 SNP가 섬유근육통이라는 질병의 발병과의 연관성의 크기를 의미한다. 상기 오즈비가 클수록 상기 연관성도 증가한다. 칼럼'CI(95%)'는 해당 오즈비가 어떤 구간에 존재할 확률이 95%인 95% 신뢰구간의 하한 및 상한을 의미한다. 상기오즈비의 95% 신뢰구간이 1을 포함하지 않는 경우 해당 SNP의 질병과의 연관성을 통계적으로 유의하다고 판단할수 있다(김동욱외, [통계학 계론], (서울: 박영사, 2004)).

또한 해당 SNP의 특정 대립유전자를 기준으로 환자군에서의 상기 특정 대립 유전자의 빈도가 정상인군에서의 상기 특정 대립 유전자의 빈도 보다 큰 경우, 즉 오즈비가 1보다 큰 경우에는 상기 특정 대립 유전자는 위험 대립인자로 작용함을 의미한다. 그 반대의 경우에는 상기 특정 대립유전자 이외의 대립 유전자가 위험 대립인자가 된다. 위험 대립인자를 많이 가질수록 섬유근육통 발병 가능성이 높음을 의미한다.

표 3 하단 내용에서 보이는 바와 같이 상기 SNP의 P-value는 0.05보다 작은 값을 나타내어 통계적으로 95% 이상의 신뢰수준에서 유의성이 있었다. 또한, 대립유전자 빈도는 섬유근육통 유무에 따라 통계적으로 차이가 있었다.

또한, 모두 오즈비의 95% 신뢰구간이 1을 포함하지 않으므로 해당 SNP의 질병과의 연관성은 통계적으로 유의하였다.

[실시예 2]

본 발명에 따른 엔도세린-1 단백질의 효소결합면역흡착검사

항원-항체반응을 이용하여 항원이나 항체를 정성, 정량할 수 있는 감도가 우수한 실험법으로 엔도세린-1에 대한 항체에 효소를 결합시켜 항원항체반응을 확인하는 방법으로 엔도세린-1 항원에 대한 항체를 먼저 well에 결합시키고 그 항체에 대한 항원(시료)을 결합시킨 후 엔도세린-1을 정성 및 정량적으로 분석하였다.

[실시예 3]

본 발명에 따른 SNP이 고정된 마이크로어레이 제작

상기에서 선별된 SNP를 기판상에 고정하여 마이크로어레이를 제작하였다. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서 502번째 염기를 포함하는 20개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들(상기 SNP는 상기 20개 중 11번째에 위치 함)을 기판상에 고정하였다.

먼저, 상기 폴리뉴클레오티드의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem 사)에 스팟팅 하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2?SSC(pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후0.2% SDS로 2분간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH4, PBS(pH 7.4) 300 mL, EtOH 100 mL)으로15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

[실시예 4]

본 발명에 따른 마이크로어레이를 이용한 섬유근육통 진단

상기 실시예 1의 1-1 단계 및 1-2 단계에 설명되어 있는 방법을 이용하여 섬유근육통 발병 또는 발병 가능성을 진단하고자 하는 대상의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, 형광 표지 시켰다. UniHyb 혼성화 용액(TeleChem사) 하에서 상기 실시예 3에서 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2?SSC로 실온에서 5분간 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000; GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover 사)로 분석하여 상기 대상이 본 발명에 따른 SNP를 갖고 있는지를 확인함으로써, 섬유근육통의 발병 가능성 및 섬유근육통에 대한 감수성을 측정하였다.

<110> KIM, JAE IL KIM, HAK JAE <120> {SNP for diagnosing fibromyalgia, microarray and kit comprising the same <130> ipstar <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 ctaggctgag gtaagcgcac agcggaggcc aggggccccg gcagaggccc tggggatagg 60 gtggaggcat ctctgggtgt gggtgtgggt gtgggtgtgg gagggagagt tcttgcctct 120 ctctctccca tctccaactc ttgcttcagt ggctctttta gaggatgcat gtcattatgg 180 acctgtcgct gccactgtcc ctgttccccc agctgtgact tcgagggagg tctggggatc 240 tgagtctgtc caaacccacg gctttgctgt tgggataaaa actgtccttt tgattttaga 300 aggaggaggg aaaaaaggtt tcccagcatg tgtgttgtgc cagtcttgga aattcatccg 360 tgcttgaatt ccaccctcca tccccagaaa aactggagta aaacaaaaag aggagatgga 420 caaagtgtgt atttgatggc atcccctggg aagagactct aaatttatcc cataggtctt 480 actgggccac tgtgagcgct ktggtggaga acaaacaaaa attctgggtg ctcagttgtc 540 taacctgaaa aatgggacta gcggaaaaag ccaatgtgtt ccatgcacct tttgctttct 600 ttattaaggc atgatgtcac ctgtacagta actgccctgt gtgtacttca gggggggatt 660 tcaaggttag atagacagga aattgttttg aaaatgtaaa cacattatta aatgtgaagt 720 attatctgat tccttgttcg aatggcattt ccttctcagc accaccttcc ttgcatattc 780 acttaacctt gtacaagaac acctttttgc cctaaatgaa gacacccccc caaaaaaaag 840 agtcccagaa aatatgtccc tgcttgtgcg gggaataaat agaatattct gaggtgcatt 900 cctccttcct atgttaggca acattccttg accctcctcg gcccccaagc caggttgcgt 960 ttttttctgc catttagaag ggttttcctt tttgtcctag t 1001

Claims

엔도세린-1 유전자의 일부를 구성하는 rs1800541의 상보서열인 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 있어서, 502번째 염기를 포함하고 8개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 섬유근육통 진단용 SNP.
엔도세린-1의 혈중 분비형 펩타이드를 포함하는 섬유근육통 진단용 펩타이드.
제 1항의 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이.
제3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 및 알데히드로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판에 고정되는 것을 특징으로 하는 섬유근육통 진단용 마이크로어레이.
제3항 또는 제4항의 마이크로어레이를 포함하는 섬유근육통 진단용 키트.