KR20190006056A

KR20190006056A - 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 생물학적 방법

Info

Publication number: KR20190006056A
Application number: KR1020190002779A
Authority: KR
Inventors: 윤성준; 표정인; 황순혜; 전수연; 강상현
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2017-01-03
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2019-01-16
Also published as: KR102429286B1

Abstract

본 발명은 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 생물학적 제조공정을 통하여 제조하는 방법과 이의 염 제조방법, 및 이렇게 제조한 염을 유효성분으로 포함하는 철분제에 관한 것이다.

Description

돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 생물학적 방법{The biological production method of heme-iron which is not derived from porcine blood}

본 발명은 동물유래 성분을 함유하지 않은 헴철 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동물유래 성분을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 생물학적 공정을 통하여 제조하는 방법과 이의 염 제조방법, 및 이렇게 제조한 염을 유효성분으로 포함하는 철분제에 관한 것이다.

철 (Fe, iron)은 체내에서 산소 운반에 필수적인 역할을 하는 미량 원소로 헤모글로빈, 미오글로빈, 시트크롬, 철/황 단백질 및 생체 분자적 구조물에 중요한 요소이다. 인체 내 철의 총량은 3~4 g 정도이며 이 중 60~65%는 순환하는 적혈구 세포 내의 헤모글로빈으로 결합한 형태로 있으며, 나머지 30~35%는 저장철 (페리틴)로 존재한다. 그 외 조직철, 혈청철 (트랜스페린) 형태로도 존재하며, 근육 중 미오글로빈에도 소량의 철이 존재한다.

철은 체내에서 합성되지 않기 때문에 전적으로 섭취를 통해 흡수되어야 하고, 헴철 (heme iron)과 비헴철 (non-heme iron)의 2가지 형태로 존재한다. 헴철은 체내 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분이 있는 철복합체를 지칭하고, 비헴철은 헤모글로빈의 헴과 동일 구조의 성분이 없는 철복합체를 지칭한다. 둘 다 철분제 (철분공급제)로 활용될 수 있는데, 헴철의 생체이용율이 비헴철에 비하여 월등히 높다고 알려져 있다. 또한 헴철의 체내흡수는 다른 식사요인에 의하여 영향을 받지 않는다는 장점도 있다. 이에 더하여 헴철은 비헴철에서 보고되는 다양한 부작용 (변비, 위장장애 등)을 초래하지 않는다는 장점도 가지고 있다.

일반적으로 헴철은 돼지 피와 같은 도축 혈액으로부터 제조되고 있다. 일차로 도축된 혈액으로부터 헤모글로빈을 분리하고, 분리한 헤모글로빈으로부터 헴철을 분리하는 방식으로 도축 혈액으로부터 헴철을 제조한다. 헤모글로빈으로부터 헴철을 분리할 때는 알코올과 이미다졸 유도체를 사용하는 방법 (Lindroos, US Patent 4,431,581), 아미노산 첨가하는 방법 (Ingberg, et. al., US Patent 5,008,388), 고농도의 유기산을 이용하여 고온 분해하는 방법 (Liu, et. al., J. Agric . Food Chem ., 44, 2957, 1996), 단백질 분해효소를 이용하는 방법 등을 사용한다.

이러한 방식으로 제조된 헴철은 동물 유래의 감염원에 의한 감염 위험 문제, 가축 성장호르몬 오염 문제, 잔류 항생제 문제 등의 비헴철에서는 없는 또 다른 여러 문제점들을 가지게 된다. 이에 더하여 이러한 방식의 헴철 제조는 이슬람교에서 금기시하는 돼지와 같은 동물의 도축 혈액으로부터 헴철을 제조하기 때문에 이렇게 제조된 헴철은 할랄 (halal)에 부합하지 않아 이슬람교도들이 철분제로 사용하는 데에 문제가 있었다.

따라서, 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적은 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 생물학적 제조공정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에 이용될 수 있는 헴철의 생산균주 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD (수탁번호 KCTC 13173BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정을 통하여 제조한 헴철의 염을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정을 통하여 제조한 헴철의 염을 주요성분으로 하는 철 결핍성 빈혈의 예방 목적으로 활용될 수 있는 동물성 성분이 포함되지 않은 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정을 통하여 제조한 헴철의 염을 주요성분으로 하는 철 결핍성 빈혈의 치료 목적으로 활용될 수 있는 동물성 성분이 포함되지 않은 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 노력을 한 결과로 돼지 피로부터 유래되지 않은 것을 특징으로 하는 헴철의 생물학적 제조공정과 이렇게 제조한 헴철의 염을 제조하는 방법, 이에 더하여 이렇게 제조한 헴철의 염을 활용하여 동물성 성분을 함유하지 않은 약학적 조성물을 개발하고, 이 조성물이 철 결핍성 빈혈의 치료에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에서는 생산균주로 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD (수탁번호 KCTC 13173BP)를 사용한다. Escherichia coli DH5α pLEX_HMD는 2016년 12월 21일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13173BP).

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에서는 일반적 대장균 배양 공정에서 채택되는 배양온도에 비교하여 조금 더 높은 배양온도를 채택한다는 특징이 있다. 본 발명의 구현에 적합한 배양온도로는 바람직하게는 39-44℃를 적용할 수 있고, 보다 바람직하게는 41-43℃의 배양온도를 적용할 수 있고, 가장 바람직하게는 42℃의 배양온도를 적용할 수 있다. 이러한 다소 높은 배양온도를 적용하는 것이 본 발명의 생산균주를 이용하여 최대의 헴철 생산을 가능하게 해 준다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에서는 동물유래 성분의 무첨가 배지 사용이라는 특징을 가진다. 이를 위하여 본 발명에서는 배지성분으로 식물유래의 펩톤과 식물유래 배지조건에서 배양한 효모로부터 제조된 효모 추출물을 사용한다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에서는 배양공정의 pH를 7-9 사이로 유지하는데, 바람직하게는 배양 pH를 8-9로 유지한다. 이때 pH 조절은 숙신산을 사용하여 실시한다. pH 조절에 숙신산을 사용하면 숙신산이 헴철의 생합성에 있어 기질로 사용되는 물질이라는 장점을 제공할 수 있어 고효율의 헴철 생산에 유리하다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정에서의 배양 세포체로부터의 생산된 헴철의 추출은 1차 추출공정 및 2차 추출공정의 실시를 통하여 달성되는데, 본 발명에서는 1차 추출공정으로 유기용매를 사용한 셀라이트 여과법 (celite filtration)을 사용한다는 특징이 있다. 이러한 방법의 적용은 헴철의 회수를 용이하게 하며, 또한 헴철의 수율도 높게 해 준다. 그리고 2차 추출공정으로는 용매추출법을 사용하였는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 1,2-다이클로로에탄, 클로로포름, 사염화탄소, 메틸에틸케톤 등이 사용될 수 있으나, 메틸렌클로라이드 또는 클로로포름의 사용이 가장 바람직하다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정을 통하여 제조한 헴철의 염을 제조하는 방법에 있어, 제조하는 헴철의 염은 하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 물질이다.

상기 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철의 생물학적 제조공정을 통하여 제조한 헴철의 염을 제조하는 방법에 있어, 염을 제조하기 위한 염화 반응은 NaOH 수용액이나 KOH 수용액 등을 첨가해 주어 상온에서 반응시키는 방식으로 달성될 수 있는데, NaOH 수용액을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 “헴철”이라는 것은 체내 헤모글로빈의 헴과 동일한 구조를 갖는 부분이 있는 철복합체를 지칭하고, “비헴철”은 헤모글로빈의 헴과 동일 구조의 성분이 없는 철복합체를 지칭한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명은 돼지 피로부터 유래되지 않은 헴철을 제조할 수 있는 생물학적 제조공정을 제공한다. 이렇게 제조되는 헴철은 비헴철에 비교하여 헴철의 여러 가지 특징적 장점들을 그대로 제공할 수 있으며, 이에 더하여 돼지 피로부터 제조되던 기존 헴철의 여러 문제점들을 해결해 줄 수도 있다. 특히 돼지 피의 사용을 원천적으로 없앴기 때문에 이렇게 제조된 헴철은 할랄 철분제 제조에도 활용될 수 있다. 한편, 본 발명의 헴철 제조공정은 생물학적 제조공정에 기반을 두고 있기 때문에 제조공정이 온화하다는 장점도 제공한다.

도 1은 배양온도 최적화 결과를 보여주는 결과이다.
도 2는 제조된 헴철을 확인하기 위하여 적외선 분광법 (FT-IR; Fourier transform infrared spectroscopy)을 이용하여 제조한 헴철을 분석한 결과이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 헴철 생산균주 제작

본 발명자들은 미생물에서의 헴 생합성 경로를 참조하여 여러 번의 시행착오를 거쳐 헴철의 생산균주를 제작하였다. 제작한 헴철의 생산균주는 헴 생합성이 가능하게 설계된 플라스미드인 자가발현 프로모터 P_L, ALA 합성효소 유전자 (HemA), NADP 의존적 말릭 효소 유전자 (MaeB), 디카르복시산 수송 단백질 유전자 (DctA )를 갖고 있는 플라스미드로 형질전환된 DH5α 기반의 대장균 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD이며, 이 제작한 균주는 2016년 12월 21일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 13173BP).

MG1655, Top10, BL21, Rosetta gami를 사용하여 제작한 균주들과의 헴철의 생산능을 비교해 본 결과, 제작한 생산균주 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD는 동일 플라스미드를 가진 다른 대장균들에 비하여 우수한 헴철의 생산능을 가지고 있었다.

헴철의 생산능 비교는 다음과 같이 실시하였다. 50 ㎖의 코니칼 튜브에 50 ㎍/㎖ 농도로 엠피실린이 포함된 10 ㎖의 LB (Luria-Bertani) 배지 (펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L)를 첨가하고, 여기에 각각의 균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 37℃, 200 rpm 조건에서 한밤 배양을 실시하였다. 그 다음에 50 ㎍/㎖ 농도의 엠피실린이 포함된 50 ㎖의 S 배지 (펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, KH₂PO₄ 5 g/L, 숙시네이트 10 g/L, 글라이신 2 g/L, 및 FeCl₂4H₂O 10 ㎎/L)가 첨가된 250 ㎖의 엘렌마이어 플라스크 (Erlenmeyer flask) 5개에 한밤 배양한 배양액 1 ㎖씩을 각각 접종하였다. 접종 후에 37℃, 200 rpm에서 4시간 배양을 실시하였다. 4시간 배양 후에 배양액 2 ㎖을 50 ㎍/㎖ 농도의 엠피실린이 포함된 100 ㎖의 S 배지가 첨가된 250 ㎖의 엘렌마이어 플라스크에 접종하였다. 이를 다시 37℃에서 200 rpm으로 48시간 배양을 실시한 후에 세포체를 회수하고 이로부터 헴철의 생산 정도를 비교해 보는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 다음과 같았다.

헴철 생산능 비교

	생산균주	MG1655로부터 제작한 균주	Top10으로부터 제작한 균주	BL21로부터 제작한 균주	Rosetta gami로부터 제작한 균주
회수된 균체량[g/L]	13.96	13.7	10.55	13	9
회수된 헴철의 양 [㎎/L]	6.1	2.8	4.1	4.3	3.3

이상의 결과로부터 제작한 생산균주 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD가 우수한 헴철 생산능을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 헴철 생산조건의 최적화

실시예 1에서 제작한 생산균주 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD를 사용하여 배지조성 최적화 등의 생산공정의 최적화를 수행하였다. 생산공정 최적화의 하나로 배양온도 최적화 결과를 예시로 제시하면 도 1과 같다. 이와 같은 여러 번의 생산조건 최적화 과정을 통하여 최종 확립된 헴철의 생산 조건을 요약 제시하면 다음과 같다.

헴철의 최적 생산조건

항목	최적 조건
종배양 배지조성	펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, NaCl 10 g/L
종배양 기간	1차 종배양: 한밤배양 2차 종배양: 4 시간
본배양 배지조성	펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, KH₂PO₄ 5 g/L, 숙시네이트 10 g/L, 글라이신 2 g/L 및 FeCl₂4H₂O 10 ㎎/L
배양온도	종배양: 37℃ 본배양: 42℃
교반속도	200 rpm
pH	8-9 (숙신산으로 조절)
생산 기간 (본배양 기간)	72 시간

실시예 3: 헴철 정제조건의 최적화

본 실시예에서는 헴철의 정제공정을 개발하고 그 세부 조건을 최적화하였다. 최종적으로 구축한 헴철의 정제조건을 제시하면 다음과 같다.

헴철 생산균주 Escherichia coli DH5α pLEX_HMD의 배양액을 4℃에서 3,000g로 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 대해서 PBS (Phosphate Buffered Saline)에 균체를 부유시키고 이를 원심분리하는 방식으로 2회 세척을 실시해 주었다. 최종 회수한 균체를 30분 정도 자연건조 시킨 후에 무게를 측정하였다. 일반적으로 5 L의 배양액으로부터 40-50 g의 세포체를 회수할 수 있었다. 회수된 균체에 저온의 산-아세톤을 가하여 헴철의 추출을 수행하였다. 이때 사용한 저온의 산-아세톤은 -20℃의 아세톤 998 ㎖에 2 ㎖의 염산을 넣어 제조하였다. 저온의 산-아세톤 첨가는 5 L 배양액으로부터 회수한 균체 당 1 L의 저온의 산-아세톤을 첨가하는 방식으로 실시하였다. 산-아세톤을 이용한 헴철의 추출은 4℃에서 5일 동안 실시하는 방식으로 수행하였다. 5일 동안 헴철 추출을 실시하여 얻어진 액을 셀라이트가 충진된 칼럼을 통과시켜 헴철을 포함하고 있는 아세톤을 회수하였다. 이렇게 얻어진 헴철을 포함하고 있는 아세톤은 회전 증발기 (rotary evaporator)를 이용하여 농축하였다. 농축은 1 L가 30 ㎖가 될 때까지 실시하였다. 이렇게 얻어진 용액에 10배 부피의 메틸렌클로라이드를 첨가해 준 다음에 잘 혼합해 주고 층이 분리될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 아래층을 회수하고 이를 회전 증발기를 사용하여 농축시켰다. 농축은 30 ㎖이 될 때까지 실시하였다. 이렇게 얻어진 것의 일부 시료를 사용하여 적외선 분광법 (FT-IR; Fourier transform infrared spectroscopy)으로 분석하였는데, 그 분석 결과가 도 2에 제시되어 있다. 농축 후에는 농축액에 포함된 헴철의 당량 대비 2.1 당량의 NaOH 수용액을 첨가해 주었다. NaOH 수용액을 첨가한 후에 잘 혼합해 주었고 혼합 후 층이 분리될 때까지 방치하였다. 층이 분리되면 상층을 회수하고 이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 1]로 표시되는 물질인 헴철의 염을 제조하였다.

실시예 4: 제조한 헴철의 확인

제조한 헴철 및 이의 염의 확인을 위하여 여러 가지 분석을 실시하였다. 구체적으로, 분석은 적외선 분광법, 질량분석법 (Mass spectrometry), 자외선-가시광선 분광분석법 (UV-vis spectrophotometry), ICP-OES 분석법을 이용하여 실시하였다. 헴철에 대한 분석 결과를 정리하면 다음과 같았으며, 이러한 결과들은 예상치와 일치하였다. 적외선 분광법 결과는 도 2에 참조로 제시하였다.

헴철에 대한 분석 결과

분석법	분석결과
적외선 분광법	1709, 1392, 1179, 1142, 938, 915, 841, 717, 608, 551 ㎝^-1
질량분석법	(ESI) Calcd for C₃₄H₃₂FeN₄O₄: 616.2, found: m/z 616.2
자외선-가시광선 분광분석법	(DMSO, nm) λ_max 348, 386
ICP-OES 분석법	Calcd for Fe: 9.06%, found: 9.0%

한편, 헴철의 염에 대한 분석 결과를 요약 제시하면 다음과 같으며, 이 또한 예상한 결과치와 일치하였다.

헴철 염에 대한 분석 결과

분석법	분석결과
적외선 분광법	1682, 1559, 1412, 1208, 1144, 880, 834, 726, 602, 541 ㎝^-1
질량분석법	(ESI) Calcd for C₃₄H₃₀FeN₄Na₂O₄: 660.1, found: m/z 660.2

실시예 5: 철분 공급원으로서의 헴철의 유효성 확인

본 발명에 따라 제조한 헴철의 염을 생리식염수에 녹여 이를 철 결핍성 빈혈을 유도한 동물에 투여하여 빈혈 개선 여부를 조사하는 방식으로 본 발명에 따라 제조한 헴철의 염의 유효성을 조사해 보았다.

구체적으로 설명하면 다음과 같다. 7 주령 Spraque-Dawley 랫트 (암컷) 30마리를 그룹당 10마리씩 3 그룹으로 나눈 다음에 하나의 그룹은 일반 사료를 1달 동안 매일 체중의 10% 방식으로 급이하였고 (그룹 1; 대조그룹), 나머지 두 그룹은 철 결핍 사료를 1달 동안 매일 체중의 10% 방식으로 급이하여 철 결핍성 빈혈을 유도하였다 (그룹 2 및 그룹 3). 상기 사료급이 1달 후에 그룹 2 및 그룹 3에 속하는 개체들에서 철 결핍성 빈혈이 유도되었음을 확인한 다음에 빈혈 유도 그룹 하나에는 생리식염수만을 1일 1회 경구투여하였고 (그룹 2), 또 하나의 빈혈 유도 그룹에는 헴철을 포함하고 있는 생리식염수 (0.1 ㎎ Fe/500 ㎕ 생리식염수)를 1일 1회 경구투여하였다 (그룹 3). 투여는 30일 동안 지속하였고, 투여 기간 동안 이상 증상 발생을 관찰하였으며, 투여 30일 후에는 채혈을 실시하여 빈혈 개선 여부를 조사하였다. 그룹 2 및 그룹 3의 투여가 실시된 30일 동안 그룹 1은 일반 사료를 그대로 급이하였으며, 그룹 2와 그룹 3은 철 결핍 사료를 급이하였다. 30일 투여 기간 동안 모든 동물들에서 특이한 증상은 없었다. 채혈 분석 결과를 제시하면 다음과 같다.

채혈 분석 결과

그룹명	처리	투여개시 후 30째 랫트의 체중 [g]	혈액검사
그룹명	처리	투여개시 후 30째 랫트의 체중 [g]	헤모글로빈함량 [g/㎗]	RBC [×10⁶/㎕]	평균 혈구용적 [fl]	전혈 중 적혈구용적 [%]
그룹 1	일반사료	273.8±3.3	14.6±0.9	8.43±0.2	49.5±1.3	36.0±2.2
그룹 2	철 결핍 사료 + 생리식염수	288.2±1.4	11.9±0.7	8.52±0.1	39.3±3.2	35.6±1.5
그룹 3	철 결핍 사료 + 헴철	265.2±1.1	14.2±0.4	8.59±0.1	48.2±2.2	35.8±1.9

이상의 결과에서 알 수 있듯이 본 발명의 헴철이 철 결핍성 빈혈의 개선에 효과적임을 확인할 수 있었고, 이로부터 철분 공급원으로 유효한 물질임을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 헴철 및 이의 염이 철 결핍성 빈혈의 치료는 물론 예방 목적으로도 활용될 수 있음을 보여준다고 할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[수탁번호]

기탁기관명: KCTC

수탁번호: KCTC 13173BP

수탁일자: 20161221

Claims

A) Escherichia coli DH5α pLEX_HMD (수탁번호 KCTC 13173BP)를 이용하여 동물성 성분이 포함되지 않은 배지에서 39-44℃, pH 7-9의 조건에서 배양하여 헴철을 생산하는 단계;
B) 상기 단계 A)에서 생산된 헴철을 정제하는 단계; 및
C) 상기 단계 B)에서 정제한 헴철의 염을 제조하는 단계를 포함하는, 돼지 피로부터 유래되지 않고 동물성 성분이 없는 화학식 1의 헴철의 염을 생물학적 제조공정으로 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배지는 식물유래의 펩톤과 식물유래 배지조건에서 배양한 효모로부터 제조된 효모 추출물을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는, 헴철의 염을 생물학적 제조공정으로 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 pH는 숙신산을 이용하여 조절하는 것을 특징으로 하는, 헴철의 염을 생물학적 제조공정으로 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 B)에 있어 규조토류를 사용한 여과공정이 적용되는 것을 특징으로 하는, 헴철의 염을 생물학적 제조공정으로 제조하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 규조토류가 celite^®545인 것을 특징으로 하는, 헴철의 염을 생물학적 제조공정으로 제조하는 방법.
제 1항에 의해 제조되는, 돼지 피로부터 유래되지 않고 동물성 성분을 함유하지 않은 화학식 1의 헴철의 염.
제 6항의 헴철의 염이 유효성분으로 포함된 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료 목적으로 활용될 수 있는, 동물성 성분을 함유하지 않은 약학적 조성물.