KR20190003833A - 성체 간 전구 세포의 제조 방법 - Google Patents

성체 간 전구 세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

신규 성체 간 전구 세포 (H2스템 세포로 지칭됨)는 일련의 생물학적 활성 및 마커에 기초하여 특징화되어 왔다. H2스템 세포 제조 방법을 통해 강력한 간-특이적 활성을 갖는 세포로 분화될 수 있고/거나, 간 질환을 치료하는데, 또는 화합물의 효능, 대사, 및/또는 독성을 평가하는데 사용될 수 있는, 부착성 세포 및 현탁액 중 3차원 세포 클러스터의 형태의 이러한 세포가 제공된다.

Description

성체 간 전구 세포의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING ADULT LIVER PROGENITOR CELLS}
본 발명은 1차 간 세포를 사용하여 생성된 성체 간 전구 세포, 및 간 질환의 의학적 관리를 위한, 또는 의학적 관심 화합물의 스크리닝을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
간은 신체 항상성 조절에 중요한 기관이며, 생명 유지와 관련된 다수의 대사 경로 부위이다. 복잡한 대사 경로 내에서 오직 하나의 단백질이 손상되어도 고도로 해로울 수 있다. 중요한 간 효소가 다수 존재함에 따라 실질적으로는 다양한 간 질환의 발생 위험도 증가하게 된다. 전체적으로 보면, 간 대사에 있어 200가지의 상이한 선천성 이상이 존재하며, 정상 출산된 2,500명당 1명의 소아가 이환된다. 현재 치료법, 및 장기간의 관리는 충분히 효율적이지 못하다. 동소 간 이식 (OLT)은 고도로 침입성이고, 비가역적이고, 공여자 이식편의 부족 및 최신 기술의 수술 요구로 인해 제한된다. 간 세포 이식 (LCT)은 간세포 제제의 품질로 인해 단지 단기간 내지 중간 기간 정도의 효능만을 발휘할 수 있다. 동결보존에 대한 허용, 영구 이식, 및 주입된 세포의 높은 기능성에서의 추가 개선이 주된 돌파구가 될 것이다 (Sokal EM, 2011; Russo FP and Parola M, 2012; Allameh A and Kazemnejad S, 2012; Parveen N et al., 2011).
이러한 개선은 줄기 또는 전구 세포, 특히, 문헌상에서 상이한 유기체로부터의 간 조직 뿐만 아니라, 태아 또는 성체 간 조직을 사용하여 확인된 간 전구 세포를 사용함으로써 이루어질 수 있다 (Schmelzer E et al., 2007; Sahin MB et al., 2008; Azuma H et al., 2003; Herrera MB et al., 2006; Najimi M et al., 2007; Darwiche H and Petersen BE, 2010; Shiojiri N and Nitou M, 2012; Tanaka M and Miyajima A, 2012). 이러한 세포는 시험관내 및/또는 생체내 투여 이후 간형성 자극에의 노출 이후에 세포에 전형적으로 간 분화와 관련된 형태학적 및 기능적 특징, 예컨대 I/II상 효소 활성을 제공할 수 있다.
그로부터 생성되는 이들 간 전구 세포 또는 간세포-유사 세포는 세포 이식에서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 이들이 약물 대사 및 약리학적 또는 독성학적 시험관내 스크리닝에서 1차 인간 간세포에 대한 대용물을 나타내기 때문에 신규 약물 개발에서의 약물 검사를 위해 사용될 수 있다 (Dan YY, 2012; Hook LA, 2012). 그러나, 현재까지 확인된 간 전구 세포 중 어느 것이 주어진 질환의 요법 또는 용도를 위해 최적인지를 결정하는 것은 현재 불가능하다. 그 이유는 주로 세포 및 그의 분화 능력을 특징화하는데 사용되는 방법의 큰 변동성, 이식 모델의 변동성 및 생체내 세포 이식의 효과를 측정하는데 일관성이 없는 방법 때문이다.
직경이 50 μm 초과인, 간세포로 이루어진 구형 다세포 응집체인 간세포 스페로이드(spheroid) 또는 간 오르가노이드(organoid)는 세포 이식 및 생체인공 간을 위한 유용한 3차원 조직 구축물을 제공할 수 있다. 포유동물 간세포로부터 스페로이드를 형성하는데 스피너 플라스크를 통해 자기-조립 및 회전식 배양을 하기 위하여 비-부착성 플라스틱 표면 상에서 간세포를 배양하는 것과 같은 여러 방법이 사용되어 왔다 (Lu Y et al., 2012; Saito R et al., 2011; Soto-Gutierrez A et al., 2010; Mitaka T and Ooe H, 2010; Tostoes RM et al., 2012). 상기 구조물은 세포의 3차원 성장에 적절히 지원을 제공함으로써, 특히, 간 미세환경과, 및 특히 세포외 매트릭스 (ECM)와 그의 상호작용을 모방함으로써 생성될 수 있다.
매트릭스 단백질이 성체 간 전구 세포의 활성화, 확장, 이동 및 분화에 영향을 준다는 것을 입증하는 증거가 생체내 연구에 입각하여 상당수 존재하지만, 특이적 ECM 단백질이 생체내 및 시험관내 활성에서 맡은 역할에 관한 정보는 여전히 한정되어 있다 (Zhu C et al., 2013). 간 전구 세포에서의 ECM-단백질의 발현 (Najimi M et al., 2007; Miyazaki M et al., 2007) 또는 중간엽 줄기 세포, 및 특히 간 전구 세포에서의 그의 면역학적 프로파일 (Busser H et al., 2015; Najar M et al., 2012; Najar M et al., 2013; Raicevic G et al., 2015)에 관한 일부 증거가 공개된 바 있다.
그러나, 배아 또는 다능성 줄기 세포, 재조합 DNA 기술, 또는 화학물질을 비롯한 부적절한 및/또는 복잡한 기술적 해결 방안을 이용하지 않으면서, 간 마커, 중간엽 마커 및 간-특이적 대사 활성의 특정 조합을 보이는 간 전구 세포 또는 간 기원의 다른 잘 분화되지 않은 세포가 세포 배양물에서 어떻게 생산될 수 있는지, 및 3차원 세포 클러스터를 어떻게 형성할 수 있는지를 입증하는 증거는 없다. 추가적으로, 임상 용도를 위한 간 전구 세포의 산업적 제조는 그의 제조 방법, 제제화, 및/또는 환자의 선택 전반에 걸친 그의 품질, 및 결과적으로 그의 효율적인 제약 제제 및 용도의 특징화를 허용하는 추가의 신뢰할만한 기준을 확인하는 것이 요구된다.
본 발명은 특정 세포 배양 조건을 통해 특정 발현 프로파일을 갖고, 생물학적 특징이 개선된 신규 성체 간 전구 세포로서, 간 질환의 치료를 위해 투여될 수 있는 세포 기반 제약 조성물, 또는 화합물의 효능, 대사, 및/또는 독성을 특징화하는데 사용될 수 있는 대사적으로 간-활성인 세포를 제조하는데 사용될 수 있는 것인, 상기 신규 성체 간 전구 세포를 수득할 수 있다는 관찰 결과를 기반으로 한다.
H2스템(H2Stem) 세포로 명명된 이들 세포는 특히 (예를 들어, 비멘틴, CD90, CD73, CD29, CD44, 알파 평활근 액틴으로부터 선택되는) 적어도 1종의 중간엽 마커 및 (예를 들어, 알부민, HNF-3b, HNF-4로부터 선택되는) 적어도 1종의 간 마커와 조합하여 간-특이적 대사 활성 (예를 들어, CYP3A4 활성)을 제공하는 단백질의 고수준의 발현과 관련하여 인간 공여자로부터 단리되거나, 또는 다르게는 그로부터 제조된 것으로서, 이전에 기재된 성체 간 전구 세포에서 확인된 것과는 별개의 형태학적 및 기능적 특징을 갖는 세포 집단을 나타낸다. 추가로, 일부 실시양태에서, 시토케라틴 19를 발현하는 세포가 상당수 존재하는 것과 같은 추가의 세포내 마커가 H2스템 세포를 특징화하기 위한 관련 기준을 제공할 수 있다.
일부 추가 실시양태에서, 1종 이상의 표면 마커는 간 전구 세포 (특히 H2스템 세포 뿐만 아니라 문헌에서 확인된 다른 세포, 예컨대 ADHLSC 세포; 문헌 [Najimi M et al., 2007, Khuu DN et al., 2011; Scheers I et al., 2012] 참조)를 그의 제조 동안 특징화하기 위한 적절한 기준을 제공할 수 있으며, 이는 개선된 생존가능성, 증식, 저장 및/또는 기능적 특징을 갖는 이러한 세포의 제약 제제의 제조를 가능하게 한다. 이들 1종 이상의 세포 표면 마커는, 그의 결정이 이러한 세포를 특징화하는 마커의 결정과 조합된 경우에, 제조, 제제화, 및/또는 특정 제약 제제 및 용도를 위한 의학적 상태에서의 개선을 이끄는 것을 도울 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득되거나, 또는 수득될 수 있는 H2스템 세포가 (임의적으로 ASMA, 비멘틴, CD90, CD73, CD44, 및 CD29로부터 선택되는) 적어도 1종의 중간엽 마커에 대하여 양성이고, (임의적으로 HNF-4, HNF-3B, 및 알부민으로부터 선택되는) 적어도 1종의 간 마커에 대하여 양성이고, (임의적으로 요소 분비, 빌리루빈 접합, 및 CYP3A4 활성으로부터 선택되는) 적어도 1종의 간-특이적 대사 활성에 대하여 양성인 세포 집단으로 정의된다. 추가로, H2스템 세포는 하기 추가 특성: (유동 세포측정법에 의해 측정되었을 때) 적어도 20%, 20% 내지 90%, 또는 20% 내지 40%의 시토케라틴 19-양성 세포를 포함하는 특징, 스시(Sushi) 도메인 2 함유 단백질에 대한 마커에 대하여 양성인 특징, 입방 중-상피 형태 (즉, 중배엽으로부터 유래된 상피 세포와 유사한 형태)를 보이는 특징, (CD49b, CD51, 및 표 2 또는 표 4에 열거된 것으로부터 선택되는) 적어도 추가의 마커에 대하여 양성인 특징, 및/또는 간-특이적 대사 활성을 보이는 3차원 세포 클러스터를 형성할 수 있는 특징 중 하나 이상의 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 주요 실시양태는 하기:
(a) 알부민, HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 및 CYP3A4로부터 선택되는 적어도 1종의 간 마커;
(b) 비멘틴, CD90, CD73, CD44, 및 CD29로부터 선택되는 적어도 1종의 중간엽 마커;
(c) 요소 분비, 빌리루빈 접합, 알파-1-항트립신 분비, 및 CYP3A4 활성으로부터 선택되는 적어도 1종의 간-특이적 활성;
(d) 스시 도메인 함유 단백질 2 (SUSD2);
(e) CD49b 및 CD51로부터 선택되는 적어도 추가의 마커; 및
(f) 시토케라틴-19 (CK-19)를 비롯한, 그의 표면 상에서, 세포내에서, 및/또는 분비된 형태에서 확인될 수 있는 마커 및 생물학적 활성의 조합에 대하여 양성인 것으로 측정되는 성체 간 전구 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 성체 간 전구 세포는 추가로 일련의 음성 마커에 의해 특징화될 할 수 있고, 특히, H2스템 세포는 CD140b, CD45, CD117, CD31, CD133, CD271, 및 CD326 중 1종 이상의 것에 대하여 음성인 것으로 측정될 수 있다. 다른 후보 음성 마커는 표 3 및 표 5에 열거된 것이다. 추가의 실시양태에서, H2스템 세포는 또한 하기 활성 및 마커: 시토케라틴-18 (CK-18); 알파 평활근 액틴 (ASMA); 1종 이상의 응고-관련 분비된 단백질 (예컨대, 피브리노겐 알파, 피브리노겐 베타, 피브리노겐 감마, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XI, 및 인자 XIII); 1종 이상의 추가의 간-특이적 활성 (예컨대, 술포트랜스퍼라제 활성, 트립토판-2,3-디옥시게나제 활성, 간 카르복실라제 활성, 암모니아 대사, 및 글리코겐 저장) 중 1종 이상에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있다.
H2스템 세포에 상기 열거된 생물학적 활성, 마커, 및 형태학적/기능적 특징이 다양한 상이한 조합으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, H2스템 세포는
(a) 알부민, 비멘틴, CD90, CD73, 요소 분비, 빌리루빈 접합, 알파-1-항트립신 분비, CYP3A4 활성, 스시 도메인 함유 단백질 2, 시토케라틴-19, 및 간 카르복실라제 활성에 대하여 양성인 것으로 측정되고; 또한
(b) CD140b 및 CD271에 대하여 음성인 것으로 측정된다.
또한, 추가 기준은 임의의 기능적 및 기술적 조합으로
예를 들어,
- HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 및 CYP3A4로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 간 마커
- CD44 및 CD29로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 중간엽 마커;
- 술포트랜스퍼라제 활성, 트립토판-2,3-디옥시게나제 활성, 암모니아 대사, 및 글리코겐 저장으로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 간-특이적 활성;
- 시토케라틴-18 (CK-18) 및 알파 평활근 액틴 (ASMA) 중 적어도 1종;
- ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46, 및 CD81 중 적어도 1종;
- HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM, 및 APOC1 중 적어도 1종; 및/또는
- 피브리노겐 알파, 피브리노겐 베타, 피브리노겐 감마, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XI, 및 인자 XIII로부터 선택되는 적어도 1종의 응고-관련 분비된 단백질에 대하여 양성인지 여부를 측정함으로써 상기 실시양태의 H2스템 세포에 대하여 결정될 수 있다.
상기 실시양태 중 일부에서, H2스템 세포는 또한 표 6 및 표 7에 열거된 효소 활성 중 1종 이상에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, H2스템 세포는 CD45, CD117, CD31, CD133, CD271, 및 CD326으로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 마커에 대하여 음성인 것으로 측정될 수 있다. H2스템 세포는 하기 마커: ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5, 및 NCAM1 중 1종 이상에 대하여 또한 음성인 것으로 측정될 수 있다. 추가적으로, H2스템 세포는 하기 마커: MMP1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2, 및 HMCN1 중 1종 이상에 대하여 또한 음성인 것으로 측정될 수 있다.
추가의 다른 실시양태에서, H2스템 세포는 특정 형태 및/또는 기능적 특징을 나타낸다. 특히, 상기 실시양태의 H2스템 세포는 부착성일 수 있고, 입방 중-상피 형태를 나타낼 수 있다. 게다가, 상기 실시양태의 H2스템 세포는 추가로 현탁액 중 3차원 세포 클러스터 (H3스템(H3Stem) 세포로 명명됨)를 형성할 수 있다. 도 1에 요약되어 있는 바와 같이, H2스템 세포 및 H3스템 둘 모두는 부착성 세포 (H2스크린(H2Screen) 세포로 명명됨) 및 현탁액 중 3차원 세포 클러스터 (H3스크린(H3Screen) 세포로 명명됨)인 강력한 간-특이적 활성을 보이는 세포로 분화될 수 있다.
실제로, 임의의 상기 실시양태의 H2스템 세포는, 세포 배양 조건에서 그를 계대배양함으로써 수득되는 상기 정의된 바와 같은 H2스템 세포를 포함하는, H2스템 자손(H2Stem Progeny)이라는 명칭하에 집합적으로 군으로 분류된 추가의 단리된 세포 집단을 제공하는데 사용될 수 있다. 특히, H2스템 자손은 목적하는 용도를 위해 요구되는 바와 같이, 및 특히, 3차원 세포 클러스터 (3차원 H2스템 자손)로서, 세포 배양 조건에서 (또는 동물 모델에서의 이식 후에) H2스템 세포의 유지, 증식, 및/또는 분화로부터 생성된다. 이러한 3차원 구조물은 개선된 간-특이적 대사 활성을 보이고, 특정 세포 마커의 조합을 유지할 뿐만 아니라, 특히 치료학적 용도의 제제를 확립하는데, 및 고처리량 스크리닝에 적절한 포맷으로 H2스템 자손을 제공한다.
따라서, 상기 세포 집단 실시양태는 상기 열거된 생물학적 활성, 마커, 형태학적 및/또는 기능적 특징을 보이는 세포를 대다수로 (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%) 포함하는 단리된 H2스템 자손을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, H2스템 세포 집단은
(a) 알부민, 비멘틴, CD90, CD73, 요소 분비, 빌리루빈 접합, 알파-1-항트립신 분비, CYP3A4 활성, 스시 도메인 함유 단백질 2, 시토케라틴-19, CD49b, CD51, 및 간 카르복실라제 활성에 대하여 양성인 것으로 측정되고;
(b) CD140b 및 CD271에 대하여 음성인 것으로 측정되는 세포를 적어도 60%, 또는 60% 내지 99% 또는 70% 내지 90% 포함한다.
추가로, H2스템 자손은 부착성 세포로서 제공될 수 있거나, 또는 현탁액 중 3차원 세포 클러스터를 형성할 수 있고, 이들은 부착성 세포로서 또는 3차원 세포 클러스터로서 배양물에서 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 또는 5회 이하 계대배양된다. 이러한 H2스템 자손은 바람직하게는 또한 유도성 I상 CYP-의존성 활성 및 타우로콜레이트, 에스트론-3-술페이트, 또는 1-메틸-4-페닐피리디늄의 흡수를 보일 수 있다. 게다가, 이러한 세포 집단은 시험관내에서 및 생체내에서 간-특이적 활성을 보이는 세포로 추가로 분화될 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손은 또한 이러한 세포의 임의의 특성을 적절하게 부가하거나, 또는 제거하는 것을 필요로 하는 임의의 생체내 또는 시험관내 용도를 위해 1종 이상의 화학적 작용제, 세포 배양 배지, 성장 인자, 및/또는 핵산 벡터에 의해 변형될 수 있다.
추가의 주요 실시양태에서, 본 발명을 통해
(a) 성체 간 또는 그의 일부를 해리시켜 1차 간 세포 집단을 형성하는 단계;
(b) (a)의 1차 간 세포의 제제를 생성하는 단계;
(c) (b)의 제제에 포함된 세포를, 세포의 그에의 부착 및 성장, 및 입방 중-상피 형태를 갖는 세포 집단의 출현을 허용하는 지지체 상에서 배양하는 단계;
(d) (c)의 세포를 적어도 1회 계대배양하는 단계; 및
(e) (d)의 계대배양 이후에 수득되는 것으로서, 적어도 1종의 간 마커 및 적어도 1종의 중간엽 마커에 대하여 양성이고, 적어도 1종의 간-특이적 대사 활성을 갖고, 입방 중-상피 형태를 유지하는, 세포 집단을 단리시키는 단계
를 포함하는, 성체 간 전구 세포를 수득하는 방법에 의해 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은
(a) 성체 간 또는 그의 일부를 해리시켜 1차 간 세포 집단을 형성하는 단계;
(b) (a)의 1차 간 세포의 제제를 생성하는 단계;
(c) (b)의 제제에 포함된 세포를, 세포의 그에의 부착 및 성장, 및 입방 중-상피 형태를 갖는 세포 집단의 출현을 허용하는 지지체 상에서 배양하는 단계;
(d) (c)의 세포를 적어도 1회 계대배양하는 단계; 및
(e) 단계 (d)의 계대배양 이후에 수득되는 것으로서, 입방 중-상피 형태를 유지하고, 적어도 1종의 간 마커, 적어도 1종의 중간엽 마커에 대하여 양성이고, 적어도 1종의 간-특이적 활성을 갖는, 세포 집단을 단리시키는 단계
를 포함하며, 여기서 단계 (e)의 전체 세포 집단의 적어도 20%, 또는 20 내지 40% 범위일 수 있는 단계 (e)의 세포 집단의 적어도 한 분획은 유동 세포측정법에 의하면 시토케라틴-19에 대하여 양성인 것인, 성체 간 전구 세포를 수득하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 적절한 세포 배양 조건에서 유지시킨 이후에 H2스템 세포를 제공할 수 있는 (및 결과적으로는 또한 H2스템 자손을 제공하기 위해) 간 세포를 단리시키는 것에 관한 것이다. 본 방법은 인간 기원의 새로운 1차 간 세포로부터 및/또는 1차 간 세포의 동결보존된 제제로부터 출발하는 것에 적용가능하다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 본 방법은 또한 단계 (e)에서 및/또는 단계 (c)에서 1종 이상의 마커에 대한 양성성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은 시토케라틴 19, 알부민, 알파-1-항트립신 분비, 스시 도메인 함유 단백질 2, 및 CYP3A4로부터 선택되는 적어도 1종의 마커 또는 활성에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은
(i) 비멘틴, CD90, CD73, CD44, 및 CD29로부터 선택되는 적어도 1종의 중간엽 마커;
(ii) 알파-1-항트립신, HNF-3B, HNF-4, 알부민, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1로부터 선택되는 적어도 1종의 간 마커;
(iii) 요소 분비, 빌리루빈 접합, 알파-1-항트립신 분비, 및 CYP3A4 활성으로부터 선택되는 적어도 1종의 간-특이적 대사 활성;
(iv) 스시 도메인 함유 단백질 2;
(v) ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46, 및 CD81 중 적어도 1종;
(vi) HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM, 및 APOC1 중 적어도 1종; 및
(vii) 시토케라틴-19 (CK-19)에 대하여 양성인 것으로 측정된다.
단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은 추가로 시토케라틴-18 (CK-18) 및/또는 알파 평활근 액틴 (ASMA)에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있고, CD140b 및 CD271에 대하여 음성인 것으로 측정될 수 있다. 상기 실시양태 중 일부에서, H2스템 세포는 또한 표 6 또는 표 7에 열거된 효소 활성 중 1종 이상에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있다.
본 방법의 실시양태 중 일부에서, 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은, 집단 중 세포의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 60% 내지 99%, 또는 70% 내지 90%가 마커에 대하여 양성인 것으로 결정된다면, 그 마커에 대하여 양성인 것으로 측정된다. 상기 실시양태 중 일부에서, 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은, 집단 중 세포의 20% 미만 또는 10% 미만이 마커에 대하여 음성인 것으로 결정된다면, 상기 마커에 대하여 음성인 것으로 측정된다. 상기 실시양태 중 일부에서, 단계 (e)의 세포 집단은 부착성 세포를 포함하거나, 또는 현탁액 중 3차원 세포 클러스터를 형성하는 반면, 다른 상기 실시양태에서, 단계 (e)의 세포 집단은 유도성 1상 CYP-의존성 활성 및 타우로콜레이트, 에스트론-3-술페이트, 및 1-메틸-4-페닐피리디늄 중 적어도 1종의 흡수를 보인다. 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단은 또한 임의의 적절한 추후의 생체내 또는 시험관내 용도를 위해, 또한 표 6 및 7에서의 발견에 따라, 화학적 작용제, 세포 배양 배지, 성장 인자, 및/또는 핵산 벡터에 의해 변형될 수 있다.
따라서, 상기 방법을 통해 상기 실시양태의 H2스템 세포 및 H2스템 자손이 수득된다. 본 방법의 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 세포 및/또는 단계 (e)의 세포 집단을 콜라겐 또는 다른 적절한 펩티드 또는 세포외 매트릭스 단백질로 코팅될 수 있는 지지체 상에서 배양할 수 있고, 적어도 간 마커, 중간엽 마커, 및 간-특이적 대사 활성의 특정 조합에 대한 양성성을 측정함으로써 단리시킬 수 있다. 이어서, H2스템 세포 및 H2스템 자손의 목적하는 용도에 따라, 본 방법에 의해 수득되거나, 또는 수득될 수 있는 세포를 그를 부착성 세포, 세포 현탁액으로서 증식시킬 수 있는 세포 배양 조건에서, 또는 그를 간세포-유사 또는 간-활성 세포로서 유지시키기 위한 특정 조건을 적용함으로써 유지시킬 수 있다. 특히, 3차원 세포 클러스터 (3차원 H2스템 자손)는 (플레이트 또는 U자형 웰 형태의) 상업적으로 이용가능한 저부착 용기를 사용하여 또는 생물반응기에서 특히 효율적인 방식으로 형성될 수 있고, 그의 기능적, 차원적, 형태학적, 및/또는 항원성 특징에 따라 특징화될 수 있다. 본 발명의 방법은 단계 (e)의 세포 집단을 세포 배양 조건에서 유지시켜 그를 간-특이적 활성을 보이는 세포로 분화시키는 단계 (f)를 추가로 포함할 수 있다.
H2스템 자손은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있고, 상기 열거된 생물학적 활성, 마커, 형태 및/또는 기능적 특징을 보이는 세포를 대다수로 (예컨대, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%) 포함하는 세포 집단이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 H2스템 세포의 집단은 단계 (e)와 관련하여 상기 열거된 특징을 보이는 세포를 60% 내지 99% 또는 70% 또는 90% 사이로 포함한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 또한 유도성 I상 CYP-의존성 활성 및 타우로콜레이트, 에스트론-3-술페이트, 및 1-메틸-4-페닐피리디늄 중 적어도 1종의 흡수를 보이는 부착성 세포로서의, 또는 현탁액 중 3차원 세포 클러스터를 형성하는 H2스템 자손을 또한 제공한다. 게다가, 이러한 세포 집단은 간-특이적 활성을 보이는 세포로 추가로 분화될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 H2스템 세포의 집단은 또한 임의의 적절한 생체내 또는 시험관내 용도를 위해 화학적 작용제, 세포 배양 배지, 성장 인자, 및/또는 핵산 벡터에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 생성할 때 수득되는 생물학적 물질은 추가로 특정 용도, 특히 특유한 의학적 적용을 가질 수 있는 생물학적 실재물을 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 물질은 특정한 특징 (예를 들어, 단백질- 또는 핵산-기반 마커, 생물학적 활성, 및/또는 형태)을 보이는 H2스템 세포 및 H2스템 자손 (또는 그의 하위집단, 세포주, 및 분획) 뿐만 아니라, 1차 간 세포의 배양물로부터 H2스템 세포 또는 H2스템 자손의 제제를 제조할 때 수득되는 임의의 다른 실재물을 포함한다. 본 발명의 생물학적 물질은 예를 들어, 세포 그 자체를 특징화하는 다른 특징 (예컨대, 세포 표면 항원 또는 효소 활성)과 함께, 또는 그러한 특징 없이 관심 의학적 세포를 검출하기 위한 마커로서, 또는 특히 간 질환과 관련하여 관심 의학적 활성 또는 분포를 보이는 화합물로서 확인되고 사용될 수 있는 단백질, 대사물, 막 소포체, 항원, 및/또는 핵산을 함유할 수 있는 조건화된 세포 배양 배지 (예를 들어, 세포 배양물 상청액의 형태) 및 이들 배지의 분획을 포함한다. 실제로, H2스템 세포로부터 수득된 단백질 추출물의 비교 분석을 통해 H2스템 세포가 그에 대하여 양성인 추가의 마커로서, 및 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 특징화하는데 사용될 수 있는 스시 도메인 함유 단백질 2를 확인할 수 있었다.
H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 생성할 때 수득되는 H2스템 세포, H2스템 자손, 생물학적 물질, 및 이러한 세포 또는 생물학적 물질을 포함하는 조성물 (통칭하여 ("H2스템 생성물(H2Stem Product)")은 다수의 생체내 또는 시험관내 방법 및 적용에 유용할 수 있다. 특히, H2스템 생성물은 일단 생체내 또는 시험관내에서 분화되면, 질환 (예컨대, 간 질환)을 치료하는데, 및 목적하는 기간 동안 1차 간세포에 대하여 관찰된 것과 가능한 한 유사한 생물학적 특징 (예컨대, 대사 또는 효소 활성, 또는 항원성 프로파일)을 보이는 세포를 필요로 하는 방법 및 생물학적 검정을 확립하는데 사용될 수 있다. 바람직한 H2스템 생성물은 H2스템 자손, H2스템 자손을 생성할 때 수득되는 생물학적 물질, 및 H2스템 자손 또는 이러한 생물학적 물질을 포함하는 조성물이다. 보다 바람직하게는, H2스템 생성물은 H2스템 자손 또는 H2스템 자손을 포함하는 조성물이다.
특히, H2스템 생성물은 간 질환 (예컨대, 선천성 간 대사 이상, 유전성 혈액 응고 장애, 진행성 가족성 간내 담즙정체 1/2/3형, 알파 1-항트립신 결핍, 간 세포 수송체의 결함, 포르피린증, 지방간 또는 다른 섬유증 간 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 경화성 담관염, 퇴행성 간 질환, 및 급성 또는 만성 간 부전)을 치료하기 위해, 예를 들어 이러한 세포를 포함하는 제약 조성물의 형태로 (인간에서 또는 동물에서, 예컨대 동물 모델에서) 생체내 투여하는데 사용될 수 있다. H2스템 세포는 또한 표 6 또는 표 7에 열거된 임의의 효소 활성의 결여 또는 불활성화에 관련된 질환을 치료하기 위한, 이러한 세포를 포함하는 제약 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 이들 제약 조성물은 목적하는 치료, 투여, 및/또는 저장 방법에 적절한 지지체 (예를 들어, 매트릭스, 캡슐, 스캐폴드, 또는 장치) 및/또는 용액 (예를 들어, 세포 배양 배지 또는 완충제)과 H2스템 세포 (또는 주어진 H2스템 자손)를 조합한 H2스템 생성물로서 뿐만 아니라, 이러한 제약 조성물을 제공하는데 바람직한 수단 중에서 (예를 들어, 키트 내에서) 제공될 수 있다. 임의의 다른 유용한 효과를 제공할 수 있는 생물학적 (예를 들어, 항체 또는 성장 인자) 또는 화학적 기원의 (예를 들어, 약물, 보존 또는 표지 화합물) 다른 작용제가 또한 이러한 조성물로 조합될 수 있다.
질환을 예방 및/또는 치료하는 방법은 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 H2스템 생성물, 예컨대 H2스템 세포 또는 주어진 H2스템 자손을, 및 바람직하게는 조성물 내에서 그를 투여하는 단계를 포함한다. 특히, 질환 (예를 들어, 간 질환)의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법은 상기 환자에게 유효량의 H2스템 생성물을 투여하는 단계를 포함한다.
H2스템 생성물의 투여 또는 치료 용도는 또 다른 생성물 (예를 들어 약물, 치료제, 또 다른 세포 유형, 또는 다른 생물학적 물질일 수 있음)의 투여 또는 투여 용도를 포함할 수 있다. H2스템 생성물은 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 사용될 수 있거나 (또는 여기서 사용하기 위한 것이고), 여기서 환자에게 또한 방법의 일부로서 이러한 또 다른 생성물이 투여된다. 다른 생성물은 H2스템 생성물과 조합되어, 예를 들어 동일한 조성물의 일부로서, 또는 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다. 다른 생성물은 H2스템 생성물, 이러한 H2스템 자손 또는 H2스템 자손으로부터 수득한 조건화된 세포 배양 배지의 효과 (특히 치료 효과)와 상용적, 또는 심지어는 상승작용적인 효과를 가질 수 있다.
H2스템 생성물은 또한 시험관내 연구를 위해, 특히 1종 이상의 외인성 성분, 예컨대 생물학적 생성물 (예컨대, 단백질, 핵산, 지질, 또는 당) 또는 화학적 화합물 (염 또는 금속을 비롯한, 유기 또는 무기 화합물)의 효능, 대사, 안정성 및/또는 독성을 평가하기 위한 약리학적 연구를 위해 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 다른 세포 (예컨대, 박테리아 또는 다른 세포, 바람직하게는, 인간 기원의 것)가 H2스템 생성물에 미치는 효과를 연구하는데 뿐만 아니라, 추후에 정제되거나 또는 다르게는 검출될 수 있는 간-특이적 바이러스 (예를 들어, 간염 바이러스) 또는 기생충 (예컨대 플라스모디움(Plasmodium) 종, 말라리아 및 항말라리아 약물의 연구 관련)의 감염 및/또는 복제를 평가하는 데에도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한
(a) H2스템 생성물을 제공하는 단계;
(b) 상기 H2스템 생성물을 화학적 화합물, 단백질, 핵산, 지질, 당, 금속, 염, 바이러스, 박테리아, 및 세포로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 성분에 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 H2스템 생성물에의 노출 이후, 상기 1종 이상의 외인성 성분이 상기 H2스템 생성물에 미치는 효과를 검출하고/거나, 상기 1종 이상의 외인성 성분의 존재, 국재화, 또는 변형을 검출하는 단계
를 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서 1종 이상의 외인성 성분의 효능, 대사, 안정성, 및/또는 독성을 평가하는 방법을 제공한다.
이러한 일반적 방법은 일부 실시양태에서, 특정 용도 및 기술에 적용되는 추가의 단계 및 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 단계 (c)는 세포 형태에 대한, 세포 생존가능성에 대한, 간-특이적 또는 비-특이적 단백질의 상향- 또는 하향-조절에 대한, 및/또는 H2스템 생성물 내의 단백질의 분해, 응집, 활성화, 또는 억제에 대한 효과를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 정의된 바와 같은 단계 (c)는 이러한 1종 이상의 외인성 성분의 H2스템 생성물 내로의 내재화, 또는 그와의 물리적 회합을 검출하는 것을 포함할 수 있다. H2스템 생성물은 또한 단계 (a)에서 동물에게 제공될 수 있고, 이어서 1종 이상의 외인성 성분이 단계 (b)에서 상기 동물에게 투여된다. 최종적으로, 단계 (c)는 동물에서 상기 H2스템 생성물에의 노출 이후 상기 1종 이상의 외인성 성분이 상기 H2스템 생성물에, 또는 상기 동물에 미치는 효과를 검출하고/거나, 상기 1종 이상의 외인성 성분의 존재, 국재화, 또는 변형을 검출하는 것을 포함한다.
H2스템 생성물를 사용하는 방법은 또한 단계 (b)의 세포 집단, 조성물, 또는 생물학적 물질을
(i) 세포 형태, 세포 생존가능성, 간-특이적 또는 비-특이적 단백질의 상향- 또는 하향-조절에 영향을 미치고/거나, H2스템 생성물 내의 단백질을 분해, 응집, 활성화 또는 억제시키는 1종 이상의 외인성 성분; 및
(ii) H2스템 생성물 내의 이러한 효과를 차단 또는 회피하기 위한 것으로 의도되는 1종 이상의 외인성 성분
에 동시에, 또는 임의의 순서로 순차적으로 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 병원체인 외인성 성분에 노출되었을 때, 병원체 및/또는 그의 효과를 특이적으로 표적화하는 후보 약물인 추가의 외인성 성분이 병원체의 임의의 바람직하지 못한 효과 (예를 들어, 바이러스 감염, 아포프토시스, 종양형성 형질전환, 간-특이적 활성 감소 등)를 방지 또는 차단하기 때문에 치료적 특성을 갖는지 여부를 결정하기 위한 간 세포의 모델로서 임의의 H2스템 생성물, 및 특히 H2스템 자손을 사용하기 위한 것으로 의도된다. 특히, 병원체인 상기 (i)의 외인성 성분은 감염성, 종양발생성, 세포독성, 또는 유전자독성 작용제를 포함하고, 병원체 및/또는 그의 효과를 특이적으로 표적화하는 후보 약물인 상기 (ii)의 추가의 외인성 성분은 단백질, 핵산, 세포, 바이러스, 또는 화학적 화합물을 포함한다.
H2스템 생성물은 또한 예를 들어 H2스템 생성물을 임상 기관에 전달하기 위한 것, 및 그를 환자에게 투여하기 위한 수단을 제공하기 위한 것을 비롯한, 상기 기재된 바와 같은 용도 및 적용 방법을 위한 키트로 제공될 수 있다. 본 키트는 H2스템 생성물, 및 임의적으로 H2스템 생성물 및 그의 활성의 사용 및/또는 검출을 허용할 뿐만 아니라, 임의의 관련 추가 화합물의 사용 및/또는 검출을 허용하는 추가의 요소를 포함할 수 있다. 본 키트는 H2스템 생성물 (예를 들어, H2스템 자손 또는 H2스템 자손을 포함하는 조성물)를 함유하는 하나 이상의 바이알, 및 특정 용도에 따라 선택되는 하기 요소: 장치, 1회용 물질, 용액, 화학적 생성물, 생물학적 생성물, 및/또는 상기 키트 요소의 사용에 대한 지침 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 세포 집단으로서 뿐만 아니라 그를 포함하는 세포 제제 및 제약 조성물로서 (특히 제약 제조 방법에 의해) 제공될 수 있는 성체 간 전구 세포 (HHALPC로 명명될 수 있음)를 포함한다. 이들 세포 및 세포 집단은 그의 표면 상에서, 세포내에서 및/또는 분비된 형태에서 확인될 수 있는 생물학적 활성 및 마커의 조합을 보이며, 상기 세포는:
(a) α-평활근 액틴 (ASMA), 알부민 (ALB), 및 CD140b에 대하여 양성이고;
(b) 시토케라틴-19 (CK-19) 및 SUSD2에 대하여 음성이다.
이들 세포는 추가로:
(a) 알부민, HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 및 CYP3A4로부터 선택되는 적어도 1종의 간 마커;
(b) 비멘틴, CD90, CD73, CD44, 및 CD29로부터 선택되는 적어도 1종의 중간엽 마커;
(c) 요소 분비, 빌리루빈 응고, 알파-1-항트립신 분비, 및 CYP3A4 활성으로부터 선택되는 적어도 1종의 간-특이적 활성;
(d) ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46, 및 CD81로부터 선택되는 적어도 1종의 마커; 및
(e) MMP1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2, 및 HMCN1로부터 선택되는 적어도 1종의 마커
에 대하여 또한 양성일 수 있다.
HHALPC는 또한 표 6에 열거된 효소 활성 중 1종 이상에 대하여 양성인 것으로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 유형의 성체 간 전구 세포는 일련의 음성 마커에 의해, 특히 ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5, 및 NCAM1로 이루어진 군 중 1종 이상에 대하여 추가로 특징화될 수 있다. 추가적으로, HHALPC는 또한 HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM, 및 APOC1로 이루어진 군 중 1종 이상에 대하여 음성인 것으로 측정될 수 있다.
상기 열거된 생물학적 활성, 마커, 및 형태학적/기능적 특징은 상이한 마커 조합에서, 예컨대:
(a) α-평활근 액틴, 알부민, 비멘틴, CD90, CD73, CD44, CD29, CD140b, 및 CYP3A4 활성에 대하여 양성; 및
(b) 스시 도메인 함유 단백질 2, 시토케라틴-19, 및 CD271에 대하여 음성인
HHALPC에서 보일 수 있다.
임의의 기능적 및 기술적 조합에서의 상기 실시양태의 HHALPC에 대한 추가의 기준이 또한, 예를 들어 ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46, 및 CD81로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 마커에 대한 양성성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 실시양태 중 일부에서, HHALPC는 ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5, 및 NCAM1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 추가의 마커에 대해 음성인 것으로 측정될 수 있다. 이러한 실시양태 중 일부에서, HHALPC는 HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM, 및 APOC1 중 적어도 1종에 대하여 음성인 것으로 측정될 수 있다.
HHALPC는 WO2007071339 및 ADHLSC 세포에 관한 다른 문헌의 개시내용 뿐만 아니라 상기 H2스템 세포에 관한 다른 개시내용에 따라 사용될 수 있다 (단리된 간-활성 세포의 현탁액으로서 확립되고 3차원 다세포 구조물로서는 확립되지 않은 HHALPC에 대한 방법, 용도, 키트, 생물학적 물질, 또는 세포 조성 관련). HHALPC는 또한 표 6에 열거된 임의의 효소 활성의 결여 또는 불활성화에 관련된 질환을 치료하기 위한, 이러한 세포를 포함하는 제약 조성물의 형태로 사용될 수 있다.
본 상세한 설명 및 실시예는 세포, 세포 집단, 방법, 본 방법에 의해 수득될 수 있는 세포에 관한, 및 상기 방법, H2스템 생성물, 및 HHALPC와 관련된 본 발명의 추가 실시양태에 관한 추가 설명을 제공한다.
도 1: ADHLSC 세포 및 H2스템 세포를 수득하고 사용하는 과정을 비교한 흐름도. ADHLSC 세포 및 H2스템 세포 둘 모두는 직접 사용될 수 있거나, 또는 특히 인간 성체 간으로부터의 장기간 저장을 위해 동결보존된 인간 1차 간 세포의 제제를 제조함으로써 사용될 수 있는 인간 간으로부터 단리된 1차 세포로부터 출발하여 제조될 수 있다. 간-특이적 특징이 개선되고, 입방 중-상피 형태를 갖는 H2스템 세포는 2차원 (2D) 또는 3차원 (3D) 세포 배양 조건에서 (즉, H2스템 세포 및 H2스템 자손을 각각 부착성 세포로서, 또는 세포 부착성 특성이 낮은 플라스크 및 다른 용기 중에 유지시킴으로써) 적절한 생체내 또는 시험관내 적용을 위해 H2스템 자손을 생성하는데 사용될 수 있다. 3차원 H2스템 자손은 특정 마커 및/또는 생물학적 활성을 특징으로 하는 세포의 클러스터에 의해 형성된다. 먼저, H2스템 세포는 (예를 들어, 기재, 예컨대 콜라겐 상에서) 부착성 세포로서 중간 확장을 거쳐, 또는 그러한 과정 없이 분화된 부착성 간세포-유사 세포 (H2스크린 세포)로서, 또는 간 전구 세포를 포함하는 3차원 클러스터 (H3스템 세포)로서 특징화되는 H2스템 자손을 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 2가지 유형의 H2스템 자손은 각각 H3스크린-1 세포 및 H3스크린-2 세포를 생성하는 2가지 대안적 프로토콜에 따라 각각 H3스크린-1 세포 및 H3스크린-2 세포로서 정의되는 고도로 대사적으로 활성인 세포를 포함하는 3차원 H2스템 자손을 생성하는데 추가로 사용될 수 있다. H3스크린-2 세포는 또한 시험관내, 간-특이적 분화를 제공하는 세포 배양 배지 중에서 및 3차원 조건에서 H2스템 자손을 배양함으로써 H2스템 자손으로부터 직접 (즉, H3스템 세포를 수득하는 단계 없이) 생성될 수 있다. H3스크린 세포가 유지되는 세포 배양 조건에 따라, 이들 세포는 현탁액 중 3차원 세포 클러스터 (H3스크린-2a 세포 및 H3스크린-1 세포)의 또는 부착성 세포 (H3스크린-2b 세포 및 H3스크린-2c 세포)로서의 대안적 포맷을 형성할 수 있다. 동결보존에 의한 장기간 저장은 필요할 경우, ADHLSC 세포 및 H2스템 세포 둘 모두에 (즉, 3차원 H2스템 자손의 확장, 분화 및/또는 배양이 즉시 이루어지지 않고, 추후에 과정에서 적용되는 경우) 뿐만 아니라, 주어진 구조적 또는 분화 상태에서 특정 H2스템 자손에 적용될 수 있다.
도 2: 기재, 예컨대, 콜라겐 상에서 배양하였을 때, 부착성 미분화 ADHLSC 세포 또는 1차 인간 간세포를 부착성 미분화 H2스템 세포 및 H2스템 자손으로부터 구별하는 특징. 형태학상 미분화 ADHLSC 세포는 신장된 세포의 동종 집단으로 보이는 반면, H2스템 세포는 입방, 중-상피 세포의 동종 집단으로 보인다 (A). 항-CK-19 항체를 사용하여 면역세포화학에 의해 분석하였을 때, 1차 인간 간세포는 (ADHLSC 세포와 같이) CK-19를 잘 발현하지 않는 것으로 보이는 한편, H2스템 세포는 CK-19에 대하여 고도로 양성인 것으로 보이고, 핵 주변에는 강력한 CK-19 양성인 더 진한 필라멘트가 존재한다 (B). (A)의 경우 10X, 또는 (B)의 경우 40x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다.
도 3: 적절한 세포 배양 조건에서 1차 간 세포를 배양하여 수득된 H2스템 세포의 형태. 제1일부터 제8일까지 플레이트 중 동일한 위치에서 매 시간마다 셀-IQ(Cell-IQ) 장치를 이용하여 영상을 촬영하고, 1차 간 세포의 부착성 증식성 H2스템 세포의 클러스터로의 형태학적 전이를 보여주기 위해 명시된 시간에 영상을 선별하였다. 20x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다.
도 4: 기재, 예컨대, 콜라겐 상에서 배양하였을 때, 부착성 분화된 ADHLSC 세포를 부착성 미분화 H2스크린 세포로부터 구별하는 특징. 형태학적으로 부착성 세포로서 분화 이후에 ADHLSC 세포는 비-과립형의 다각형 세포의 동종 집단을 보이는 반면 (A, 좌측 패널, 초기 단계), H2스크린 세포를 포함하는 H2스템 자손은 기질 지지체를 갖는 과립형, 입방/다각형 세포의 동종 집단으로서 보여지고, 이는 세포 배양 및 분화가 보다 진행된 단계에서는 큰 기질 구조물 내에 분포된 세포 클러스터를 형성할 수 있다 (A, 우측 패널, 후기 단계). 이들 후자의 영상에서, 흰색 박스 1은 형태가 간세포와 유사하고, 담세관이 출현하기 시작하는 세포 영역을 표시하는 것이고; 흰색 박스 2는 이핵 세포 및 세포외 매트릭스를 갖는 영역을 표시하는 것이다. 20x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다. 분화된 ADHLSC 세포 및 H2스크린 세포를 그의 CYP3A4 활성 (B) 및 요소 분비 (C)에 따라 특징화하였다. 활성의 기준선 수준은 각각 10-9 pmol/세포/4h 및 5 pg/세포/24h이다. 보다 짧은 기간 동안 (2-6시간 동안) 검정을 수행함으로써, ADHLSC 세포와 비교하였을 때, H2스크린 세포의 경우, 요소 분비 수준이 더 높은 것으로 또한 측정되었다. 음성 대조군 (1차 항체 없음)과 비교하였을 때, H2스크린이 세포내 알부민 및 CK-19 뿐만 아니라, 유출 수송체 MRP2 (세포 사이의 경계면에서; 화살표 참조)를 강력하게 발현한다는 것이 면역조직화학 (D)을 통해 추가로 확인된다.
도 5: 3차원 세포 클러스터로 이루어진 별개의 형태의 H2스템 자손의 형태. H3스템 세포는 먼저, 추후에 더 큰 구조물을 형성할 수 있고 (최대 1,000 μm 이상), 100,000개 이상의 이러한 세포를 포함하는 세포의 보다 조밀한 코어를 갖는 약 50-100 μm의 클러스터를 형성한다 (A). H2스크린 세포로부터 수득된 H3스크린-1 세포는 지지 기질로 둘러싸인, 과립형 입방/다각형, 간세포-유사 세포의 클러스터로서 보여진다 (B). H3스크린-2a 세포는 또한 저결합 플레이트 (C)를 사용하여, 또는 보다 균일한 3차원 H3스크린-2a 세포가 수득되는 U자형 저결합 웰 (D; 또한 H3스템 세포는 그를 배양하는데 동일한 접근법을 사용하였을 때, 유사한 구조물을 형성함)에서 시험관내 분화를 수행함으로써 수득될 수 있는 지지 기질로 둘러싸인, 과립형 입방/다각형, 간세포-유사 세포의 3차원 클러스터로 이루어진다. 마지막으로, H3스크린 세포를 콜라겐과 같은 기재 상에서 배양하였을 때, 생성된 H3스크린-2b 세포는 간세포와 유사하고, 지지 기질 내에 분포되고, 광범위한 세포내 과립형 구조물인 세포의 부착성 클러스터로서 보여진다 (E; 패널 1의 흰색 박스는 패널 2에서 확대됨). 10x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다 (E의 패널 1).
도 6: 별개의 유형의 H2스템 자손은 상이한 접근법에 따라 크기가 균일한 3차원 H2스템 자손을 제공할 수 있다. 흐름도에는 이러한 세포 제제를 수득하기 위한 단계가 요약되어 있다 (A). 특정 H2스템 자손은 동일한 빈도로 5 ml의 새로운 세포 배양 배지를 첨가하면서, 각각의 초-저부착 세포 배양 플라스크에서 주어진 부피 및 농도로 세포를 시딩하는데 사용된다. 다르게는, 96 웰을 함유하는 초-저부착, U자형/라운드형 세포 배양 마이크로플레이트는 각 웰마다 구체-유사 구조물을 수득하기 위해 이들 세포를 시딩하고 성장시키는데 사용될 수 있다. 생성된 3차원 H2스템 자손은 동일한 웰 내에서 (세포 배양 배지를 대체시키고/거나, 시약을 첨가함으로써), 또는 2, 5, 10개 또는 그 초과의 웰의 내용물을 적절한 용기로 옮기고, 풀링한 후에 사용될 수 있다. (A)의 흐름도 하단의 텍스트 박스 내의 사진은 풀링된 H3스크린-2a 세포의 제제를 보여주는 것이지만, 미분화 (H3스템 세포) 또는 분화된 (H3스크린-1 세포) 것이고, 동일한 접근법을 사용하여 수득된 다른 3차원 H2스템 자손을 나타내는 것이다. 초-저부착, U자형/라운드형 세포 배양 마이크로플레이트를 사용하여 생성된 H3스템 세포 또는 H3스크린-2a 세포를 포함하는 구체-유사 구조물의 형태가 제시되어 있고, 이를 비교할 수 있다 (B). 더 큰 세포를 제공하는 분화에 기인하여, H3스크린-2a 세포를 포함하는 구체-유사 구조물이 동등한 수의 H3스템 세포를 포함하는 구체-유사 구조물보다 더 크다.
도 7: 상이한 카테고리의 H2스템 자손에서의, 및 1차 인간 간세포 제제에서의 간 효소의 단백질 발현 및 활성 비교. 일정 기간 또는 4시간 동안에 걸쳐 CYP3A4 활성을 비교한 것이다 (A). 웨스턴 블롯 분석 (B)은 추출물 중 유사한 양의 단백질의 존재 하에 (대조군으로서 항-베타 액틴 항체를 사용하여 확인) H2스템 세포는, H3스템 세포에서 및 (특히, SULT1의 경우) H3스크린-2a 세포에서 더 많이 발현되는 SULT1 및 UGT1A 단백질을 적은 양으로 나타낸다. 사용된 항체가, 상이한 인간 SULT1A 이소형 (술포트랜스퍼라제 1A1, 1A2 및 1A3)에 공통적인 에피토프를 인식하고, 인간 기원의 다른 SULT 패밀리 구성원 (SULT1 항체 H-55에 대한 기재 참조; 산타 크루즈(Santa Cruz) 카탈로그 번호 sc-32928))과 부분적으로 교차 반응하는 상업적 토끼 폴리클로날 항체 제제이기 때문에, SULT1에 대해 다중 밴드가 보인다. 단백질 발현에 대한 데이터는 상응하는 효소 활성을 시험함으로써 정성적으로 확인된다 (C). H3스템 세포 및 H3스크린-2a 세포가 3가지 특정 화학적 기질 (타우로콜레이트, 에스트론-3-술페이트, 1-메틸-4-페닐피리디늄)을 그의 각각의 수송체 (소듐 타우로콜레이트 공동-수송 폴리펩티드, NTCP; 유기 음이온 수송 폴리펩티드, OATP; 유기 양이온 수송체, OCT)에 의해 흡수하는 능력을 이러한 세포에서 두 시점에서 결정하였고, 여기서 흡수의 동적 프로파일을 통해 H3스크린-2b가 어떻게 이러한 화합물에 대하여 단순하게 수동 확산 과정이 아닌, 진정으로 능동인 과정을 나타내는지가 확인된다 (D). H3스템 및 H3스크린-2a를 1차 간세포와 비교함으로써, 4시간 후 I상 효소에 의한 약물 (CYP1A2에 의한 페나세틴; CYP2B6에 의한 부프로피온; CYP2C9에 의한 디클로페낙; CYP3A4에 의한 미다졸람)의 기본 및 유도성 대사에 관하여 정성적으로 비교가능한 데이터를 수득하였다.
도 8: 다른 간-특이적 활성 및 마커가 H2스템 자손을 특징화한다. 명시된 기간 동안에 걸쳐 간 카르복실라제 활성 (CES1 활성)을 ADHLSC 세포, 참조 세포주 HepG2, 1차 간세포, H2스템 세포, 및 H3스템 세포와 비교하였다 (A). ELISA를 이용하여 ADHLSC 세포와 H2스템 세포 사이의 알파-1-항트립신 (AAT) 분비를 비교하였다 (B).
도 9: ADHLSC 세포 및 H2스템 세포의 프로테옴은 주성분 분석 (PCA)에 의해 특징화될 수 있고, 이에 의해, 서로 비교하였을 때, 이들 특정 성체 간 전구 세포 집단에서 과다/과소-나타나는 단백질 군이 확인된다. 별개의 세포 제제의 전체 프로테옴이 그래프로 나타내어져 있다 (별개의 ADHLSC 세포 제제에 대한 스폿 및 별개의 H2스템 세포 제제에 대한 별표 표시 참조). 본 접근법을 통해 상이한 ADHLSC 세포 및 H2스템 세포 제제는 여전히 세포 유형에 의해 분류될 수 있다는 결론이 내려진다 (A). 이러한 접근법에 의해 확립된 바와 같이, 특정 단백질 (또는 단백질 이소형)의 조합된 존재 (또는 부재)에 관한 이 프로테오믹스-기반 분석은 트랜스크립토믹-기반 연구, RT-PCR에 의해, 또는 항체-기반 기술 (예컨대, 유동 세포측정법, 웨스턴 블롯, 면역세포화학)에 의해 추가로 검증될 수 있다. 본 접근법은 또한 생체내 및/또는 시험관내에서 H2스템 세포 (또는 H2스템 자손 유형)를 다른 세포 집단과 구별하는 마커를 확인하기 위해, 그 뿐만 아니라, H2스템 세포 또는 H2스템 자손의 상이한 제제 중에서 간-특이적 대사 활성 또는 H2스템 세포-특이적 특징을 평가하기 위해서도 적용될 수 있다.
도 10: 세포 표면 단백질은 H2스템 세포를 ADHLSC 세포와 구별하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 항-SUSD2 항체 및 (샘플 중 전체 단백질의 양에 대한 대조군으로서) 항-베타 액틴 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 H2스템 세포 및 ADHLSC의 단백질 추출물을 비교하였을 때, 스시 도메인 함유 단백질 2 (SUSD2)로 명명되는 세포 표면 단백질이 훨씬 강력하게 발현된다 (A). SUSD2의 발현을 또 다른 세포 표면 마커, 예컨대 CD140b와 비교하기 위해 FACS에 의해 분석을 수행하고, 발현 세포와 비-발현 세포 사이의 컷-오프 점을, 3%의 세포가 이소형 음성 대조군에 대하여 양성인 강도로 설정할 때, SUSD2 발현에서의 차이는 보다 감소된 것으로 보였고, 특히 CD140b 양성성을 비교하였을 때, 저 발현 H2스템 세포와 고발현 ADHLSC 세포 사이를 뚜렷히 구별할 수 있었다 (B). 그러나, 양성 세포 (PE-pos)에서 특정 형광단에 대한 신호 강도의 분포에 대한 상세 내용은 SUSD2를 발현하는 ADHLSC 세포가 실제로 H2스템 세포보다 훨씬 더 낮은 수준으로 그를 발현한다는 것을 보여주는 반면, CD140b 데이터는 이 마커가 오직 대다수의 ADHLSC 세포에서만 뚜렷하게 강력하게 발현된다는 것을 보여준다.
도 11: 추가적인 세포 표면 단백질이 H2스템 세포 및 HHALPC의 특징화를 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다. A) 항-인간 CD49b 또는 항-CD51 항체를 사용한 양성 세포 (PE-pos)에서의 특정 형광단에 대한 유동 세포측정법 신호 강도의 분포 (이소형 음성 대조군에 대해 설정된 발현 세포와 비-발현 세포 사이의 동일한 3% 컷-오프 점 사용)에 대한 상세 내용이 HHALPC (중앙 패널) 및 H2스템 세포 (하부 패널)의 제조에 사용된 1차 인간 간 세포의 초기 제제 (주로 간세포 포함, 상부 패널)에 대하여 제시된다. B) 동일한 세포 제제가 항-인간 CD271을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 유사하게, 양성 대조군으로서의 LX-2로 지칭되는 인간 세포주와 추가로 비교하여 분석하였다 (Castilho-Fernandes A et al., 2011).
도 12: FRG 마우스 모델에 주사된 H2스템 세포의 활성 및 존재. A) H2스템 세포 또는 1차 인간 간세포는 간내로 또는 비장내로 주사되고, 혈청 중 인간 알부민 (hAlb)의 농도는 대조군에서 및 주사후 상이한 시점에 측정된다 (각 처리에서의 마우스 M1 및 M2에 대한 예시적인 데이터가 제시됨). B) 마우스 간 조직에서 생착, 분화 및 증식하는 인간 기원의 세포에 대한 마커로서 핵 항원 Ku80을 사용한, H2스템 세포 또는 1차 인간 간세포가 간내로 주사된 FRG 마우스로부터 수득한 간 조각의 면역조직화학 (IHC) (인간 세포의 클러스터는 백색 점선에 의해 제한된 영역 내부에 있음). 10x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다. C) 마우스 간 조직에서 생착, 분화, 증식하고 인간 아르기나제 (ARG1)를 발현하는 인간 기원의 세포의 클러스터의 존재를 보여주는, H2스템 세포가 간내로 주사된 FRG 마우스로부터 수득한 간 조직의 면역조직화학 (좌측 패널에서 박스 표시된 영역은 우측 패널에서 확대되고; 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 및 알부민 유전자에 대하여 유사한 데이터가 생성됨). 각각 1x 및 4x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다. D) 생착, 분화, 및 증식된 인간 기원의 세포의 클러스터의 존재 (백색 점선에 의해 제한된 영역 내부), 시토케라틴-19의 발현의 상실 (좌측 패널), 한편으로는 알파-1-항트립신 (AAT, 세포 클러스터 전반에 분산됨) 및 시토크롬 P450 3A4 (CYP3A4, 각 세포 클러스터의 외부 경계에 있는 영역에 주로 집중됨)의 강한 발현의 유지를 보여주는, H2스템 세포가 간내로 주사된 FRG 마우스로부터 수득한 간 조각의 면역조직화학. 세포 사이의 경계면에서의 유출 수송체 MRP2의 분포 (도 4D 참조)는 또한 이 동물 모델을 사용하여 인간 세포의 동일한 클러스터 내에서 확인되었다. 10x 배율로 세포의 사진을 촬영하였다.
본 발명의 주요 실시양태는 그의 표면 상에서, 세포내에서, 및/또는 세포 배양 배지 중에 분비된 형태에서 확인될 수 있는 생물학적 활성 및 마커의 신규한 조합을 특징으로 하는 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 포함한다. 이들 특징은 이러한 세포를 특징화하는 양성 (또는 음성) 기준을 정의하는 형태학적 및 기능적 특징과 함께 세포 배양 조건에서 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 제조하는 방법과 관련하여 결정되며, 특히 방법은
(a) 성체 간 또는 그의 일부를 해리시켜 1차 간 세포 집단을 형성하는 단계;
(b) (a)의 1차 간 세포의 제제를 생성하는 단계;
(c) (b)의 제제에 포함된 세포를, 세포의 그에의 부착 및 성장, 및 입방 중-상피 형태를 갖는 세포 집단의 출현을 허용하는 지지체 상에서 배양하는 단계;
(d) (c)의 세포를 적어도 1회 계대배양하는 단계; 및
(e) (d)의 계대배양 이후에 수득되는 것으로서, 적어도 1종의 간 마커 및 1종의 중간엽 마커에 대하여 양성이고, 적어도 간-특이적 대사 활성에 대하여 양성이고, 입방 중-상피 형태를 유지하는, 세포 집단을 단리시키는 단계를 포함한다.
본 방법의 단계 (a)와 관련하여, 해리 단계는 완전하게 분화된 간세포와 함께 H2스템 세포를 제조하는데 사용될 수 있는 양으로 1차 세포를 함유하는 성체 간 또는 그의 일부를 수득하는 것을 수반한다. 간 1차 세포는 우선적으로 성체 간으로부터 수득될 수 있는 인간 간 조직으로부터 단리된다.
"간"이라는 용어는 간 기관을 의미한다. "간의 일부"라는 용어는 일반적으로, 간 일부의 양 또는 그의 기원이 되는 간 기관의 영역에 관하여 어떤 제한도 없이, 간 기관의 임의의 일부로부터 유래된 조직 샘플을 의미한다. 바람직하게는, 간 기관에 존재하는 모든 세포 유형은 또한 상기 간의 일부에서 나타날 수 있다. 간 일부의 양은 적어도 부분적으로는 실질적인 고려 사항에서부터 본 발명의 방법을 적절하게 실시하는데 충분한 1차 간 세포를 수득해야 할 필요성을 따를 수 있다. 따라서, 간의 일부는 간 기관에 대한 백분율 (예를 들어, 적어도 1%, 10%, 20%, 50%, 70%, 90% 또는 그 초과 (전형적으로 w/w))로서 표현될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 간의 일부는 중량에 의해 정의될 수 있다 (예를 들어, 적어도 1 g, 10 g, 100 g, 250 g, 500 g 또는 그 초과). 예를 들어, 간의 일부는 간엽, 예를 들어 우간엽 또는 좌간엽, 또는 간 분리 수술 동안 또는 간 생검에서 절제된 충분한 수의 세포를 포함하는 임의의 절편 또는 조직 샘플일 수 있다.
"성체 간"이라는 용어는 출생후, 즉, 출생 이후, 바람직하게는, 만기 출생 이후 임의의 시점의 대상체의 간을 의미하고, 예를 들어 출생 이후 적어도 1일, 1주, 1개월 또는 1개월 초과인 연령, 또는 적어도 1, 5, 10세 또는 그 초과일 수 있다. 따라서, "성체 간" 또는 성숙한 간은 다르게는 "유아", "소아", "청소년", 또는 "성체"라는 통상적인 용어로 기재되는 인간 대상체에서 발견될 수 있다. 간 또는 그의 일부는, 상호교환적으로 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭하는, "대상체" 또는 "공여자"로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, 성체 간 또는 그의 일부는 비-인간 동물 대상체, 바람직하게는, 비-인간 포유동물 대상체 (예컨대, 설치류 또는 돼지)로부터의 것일 수 있다.
공여자는 임상적으로 허용되는 기준, 예컨대, (순환 및 호흡 기능의 비가역적 정지를 수반하는) "심장-폐" 기준 또는 (뇌간을 비롯한, 뇌 전체의 모든 기능의 비가역적 정지를 수반하는) "뇌사" 기준에 의해 결정시에, 살아있거나, 또는 죽은 공여자일 수 있다. 수거는 공지된 절차, 예컨대, 생검, 절제 또는 절개를 수반할 수 있다. 살아있는 인간 공여자로부터 간 조직을 수거하는 것은 공여자의 추후의 생명 유지와 양립하여야 할 필요가 있을 수 있다. 간 또는 그의 일부는 순환이 지속되는, 예를 들어 심장이 박동하는, 및 호흡 기능이 지속되는, 예를 들어 폐 호흡하거나, 또는 인공 환기가 이루어지는 공여자, 특히, 인간 공여자로부터 수득될 수 있다. 전형적으로는 오직 간의 일부만 (예를 들어 생검 또는 절제에 의해) 살아있는 인간 공여자로부터 제거될 수 있고, 이에 의해 법적 및 윤리적 규범에 의해 요구되는 바와 같이, 공여자에서 정상적인 간 기능이 적절한 수준으로 유지된다.
윤리적 및 법적 규범에 따르면, 공여자는 뇌사여야 할 필요가 있을 수도 있거나, 또는 그렇지 않을 수도 있다 (예컨대, 인간 공여자의 추후 생존과 양립하지 못하게 되는 간 전체 또는 그의 부분의 제거는 뇌사 인간에서 허용될 수 있다). 조직은 보통 허혈 (순환 정지)로부터 발생하는 실질성 산소 결핍 (산소 공급 부족)을 겪지 않기 때문에, 이러한 공여자로부터의 간 또는 그의 일부의 수거가 이롭다. 수거 시점에 조직은 인공 환기가 없다면 순환 및/또는 호흡 기능이 정지될 수 있다. 이들 공여자로부터의 간 또는 그의 일부는 적어도 어느 정도는 산소 결핍을 겪을 수 있지만, 사체 공여자로부터의 간은 세포 배양 조건에서, 예를 들어, 공여자의 순환이 정지된 후 약 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 또는 그 초과 시간 이내에 H2스템 세포를 수득하는데 사용될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이 수거된 (수술에 의해 절제된 간 샘플 또는 간 생검으로부터의) 조직은 대략 실온까지, 또는 실온보다 낮은 온도까지 냉각될 수 있지만, 보통은 조직 또는 그의 일부를 동결시키는 것은 피하며, 특히, 상기와 같은 동결로 인해 핵 생성 또는 빙정 성장이 이루어지는 경우에는 그러하다. 예를 들어, 조직을 약 1℃ 또는 약 4℃ 내지 실온 사이의 임의의 온도에서 유지시킬 수 있고, 약 4℃에서, 예를 들어 얼음 상에서 유지시키는 것이 이로울 수 있다. 조직을 허혈 시간 전체 기간 또는 그의 일부의 기간 동안, 즉, 공여자에서 순환 정지 이후의 시간 동안 냉각시킬 수 있다. 즉, 조직은 온 허혈, 냉 허혈 또는 온 및 냉 허혈의 조합의 대상이 될 수 있다. 수거된 조직을 예를 들어 처리 전 최대 48시간 동안, 바람직하게는, 24시간 미만, 예를 들어 보다 바람직하게는 12시간 미만 (예를 들어, 6, 3, 또는 1시간 미만) 동안 상기와 같이 유지시킬 수 있다. 수거된 조직을 적합한 배지 중에서 유지시키는 것, 예를 들어 완전하게 또는 적어도 부분적으로 침지시키는 것이 이로울 수 있지만, 그러해야 할 필요는 없고/거나, 조직을 추가로 처리하기 전에 적합한 배지를 관류시킬 수 있지만, 그러할 필요는 없을 수도 있다. 통상의 기술자는 처리 이전 기간 동안 조직의 세포의 생존을 지지할 수 있는 적합한 배지를 선택할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 기재된 바와 같이 성체 간 조직을 해리시켜 1차 세포 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 "해리시키는"이라는 용어는 일반적으로 조직 또는 기관의 세포 조직화를 부분적으로 또는 전체적으로 파괴, 즉, 조직 또는 기관의 세포 및 세포 성분 사이의 회합을 부분적으로 또는 전체적으로 파괴시켜 상기 조직 또는 기관으로부터 세포 현탁액 (세포 집단)을 수득하는 것을 의미한다. 현탁액은 고립 또는 단일 세포 뿐만 아니라, 물리적으로 부착되어 2개 이상의 세포의 클러스터 또는 클럼프를 형성하는 세포를 포함할 수 있다. 해리가 바람직하게는 세포 생존가능성을 감소시키지 않거나, 또는 가능한 작게 그를 감소시킨다. 간 또는 그의 일부를 해리시켜 그로부터 1차 세포 집단 (현탁액)을 수득하는데 적합한 방법은 효소 분해, 기계적 분리, 여과, 원심분리 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법일 수 있다. 특히, 간 또는 그의 일부를 해리시키는 방법은 간 조직의 효소 분해를 통해 간 세포를 방출시키고/거나, 간 조직의 기계적 파괴 또는 분리를 통해 간 세포를 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 간 생검에 의해 수득된 간 조직의 작고 얇은 절편이 효소적 또는 기계적 파괴 없이 하기 단계 (c)에 따라 세포 배양을 계속하는데 직접 사용될 수 있다.
상기와 같은 간 또는 그의 일부를 해리시키는 방법은 널리 사용되는 2단계 이상의 콜라게나제 관류 기술으로서 문헌상에 기록되어 있으며, 이는 간 전체 또는 간의 절편을 사용하여 그를 수행하기 위해 다양하게 적합화되고, 변형되어 왔다. 간 조직에 양이온-킬레이트제 (예를 들어, EDTA 또는 EGTA)를 함유하고, 37℃로 예열된, 2가 양이온-무함유 완충제 용액을 관류시킨다. 완충제 용액은 염 용액 (예를 들어, HEPES, 윌리엄스 E 배지((Williams E medium)) 또는 그 중에서도 특히 염, 예컨대, NaCl 및 KCl을 또한 포함할 수 있는 임의의 다른 평형 염 용액을 포함할 수 있다. 이는 세포를 상합시키는 데스모솜 구조를 파괴시킨다. 이어서, 2가 양이온(들), 예컨대, Ca2+ 및 Mg2+, 및 조직을 소화시키는 작용을 하는 매트릭스-분해 효소를 함유하는 완충제 용액을 조직에 관류시킨다.
1차 간 세포는 보통 세포 해리 과정을 기계적으로 완성하기 위하여 약한 기계적 파괴 및/또는 필터를 통과시키는 프레싱에 의해 방출된다. 이러한 필터의 체 크기는 세포가 약 0.1 mm, 0.25 mm, 0.50 mm, 1 mm 또는 그 초과를 통과하도록 하는 크기일 수 있다. 점진적으로 조직을 해리시키고, 세포를 방출시키기 위해 체 크기가 계속해서 더 작아지는 일련의 필터가 사용될 수 있다. 콜라게나제 및 관류 과정에서 사용되는 다른 효소를 불활성화시키기 위해 프로테아제 억제제, 혈청 및/또는 혈장을 함유하는 완충제로 해리된 세포를 세정한 후, 그를 저속 원심분리 (예를 들어, 10 x g 내지 500 x g)로 펠릿화함으로써 혼합물로부터 분리시킨다. 모두가 그러한 것은 아니지만, 생존가능한 세포 대부분이 펠릿화될 수 있지만, 죽은 세포 및 세포 파편은 실질적으로 제거되고, 이어서, 이를 빙냉 완충제 용액으로 세척하여 세포 현탁액을 정제한다. 1차 간 세포의 수 및 품질은 조직의 품질, 사용되는 상이한 용액의 조성, 및 효소의 유형 및 농도에 따라 달라질 수 있다. 효소는 빈번하게는 콜라게나제이지만, 프로나제, 트립신, 히알루로니다제, 써몰리신, 및 그의 조합이 또한 사용될 수 있다. 콜라게나제는 잘 정제되지 않은 효소 블렌드로 이루어질 수 있고/거나, 프로테아제 활성을 보일 수 있으며, 이는 생존가능한 세포의 품질 및 양에 영향을 미치는 원치않는 반응을 유발할 수 있는데, 이는 결국에는 충분한 순도 및 품질을 갖는 효소 제제를 선택함으로써 방지할 수 있다. 1차 간 세포를 수거하는 다른 방법은 효소 소화 기술을 배제할 수 있고, 수크로스를 함유하는 용액을 간에 관류시킨 후에, 기계적 파괴를 수행하는 것을 수반할 수 있다.
본 방법의 단계 (b)와 관련하여, 간 조직 해리 이후에 수득되는 간 1차 세포의 제제는 전형적으로 간 실질에 및 그의 비-실질부에 존재할 수 있는, 전구 또는 줄기 세포를 비롯한, 임의의 간-구성 세포 유형에 속하는 세포를 포함하는, 1차 간 세포의 이종 집단일 수 있다. 예시적인 간-구성 세포 유형은 간 조직 샘플로 주어지거나 또는 이에 기원할 수 있는 줄기 또는 전구 세포 뿐만 아니라 간세포, 담관세포, 쿠퍼 세포, 간 성상 세포, 및 간 내피 세포를 포함한다.
"간세포"라는 용어는 크기 또는 배수성 (예컨대, 이배체, 사배체, 팔배체)이 상이한 간세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 상피, 실질 간 세포를 포괄한다.
"1차 세포"라는 용어는 이러한 외식된 조직 또는 기관에 존재하는 세포를 적절한 기술로 해리시킴으로써 대상체의 조직 또는 기관, 예를 들어 간으로부터 수득되는 세포의 현탁액 중에 존재하는 세포를 포함한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 세포 배양 조건에서 목적하는 성체 간 전구 세포를 수득하는 범주에서, 모두가 그러한 것은 아니지만, 대부분의 간 세포 유형을 나타내는 세포 집단으로부터 출발할 수 있다. H2스템 세포를 수득하는데 적합한 출발 세포 집단은 간 해리 방법 및/또는 임의의 적합한 기술을 적용하여 물리적 특성 (크기, 형태), 생존가능성, 세포 배양 조건, 또는 세포 표면 마커 발현에 기초하여 간세포 및/또는 다른 세포 유형에 대한 초기 제제를 분획화 또는 풍부화시키는 임의의 방법에 따라 상이한 비율로 (전체 세포의 0.1%, 1%, 10% 또는 그 초과로) 간 세포를 포함할 수 있다.
본원에서 정의되고 간 (또는 그의 일부)을 해리시킴으로써 수득된 바와 같은 1차 세포 집단은 새로운 1차 간 세포로서 세포 배양물을 확립하는데 즉시 사용될 수 있거나, 또는 바람직하게는, 그의 장기간 보존을 위해 통상의 기술을 사용하여 1차 간 세포의 동결보존된 제제로서 저장될 수 있다. 실제로, 동결보존된 세포 제제를 사용하는 것이 추후에 세포 배양물에서 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 제조하는데 있어 효율면에서 그에 긍정적 영향을 미치는 것으로 보인다. 이러한 샘플 중의 세포는 다른 화합물, 예컨대 성장 인자, 혈청, 완충제 용액, 글루코스, 알부민, 에틸렌 글리콜, 수크로스, 덱스트로스, DMSO 또는 임의의 다른 동결보호제로 보충되거나, 또는 보충되지 않은 세포 배양 배지 또는 세포 또는 기관 보존용 용액 (예를 들어, 비아스판(Viaspan), 크리오스토르(Cryostor), 셀시오르(Celsior)) 중에서 동결될 수 있다. 각각의 동결보존된 제제는 샘플을 적절하게 해동시키고, 필요할 경우, 잔류 세포 배양 배지 또는 세포 또는 기관 보존용 용액을 제거하기 위한 적절한 완충제 또는 세포 배양 배지로 세포를 세척한 후에 세포 배양 조건에서 더 많은 양의 H2스템 세포를 제조하고 단리시키는 범주에서 동결 바이알 또는 백당 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108개 또는 그 초과의 세포를 함유할 수 있다.
본 방법의 단계 (c)와 관련하여, 간 1차 세포 제제 (간 생검에 의해 수득된 간 조직의 세포 현탁액으로서 또는 단편으로서)를 완전 합성 지지체 (예컨대, 플라스틱 또는 임의의 중합체 물질), 또는 공급자 세포, 단백질 추출물, 또는 유사한 1차 세포의 부착 및 증식, 및 입방 중-상피 형태를 갖는 성체 간 전구 세포의 집단의 출현을 허용하는 생물학적 기원의 임의의 다른 물질로 미리-코팅된 합성 지지체 상에서 직접 배양할 수 있다. 바람직하게는, 상기 기재 상에 부착된 1차 세포 집단으로부터의 세포를 적어도 7일, 바람직하게는 적어도 10일, 또는 적어도 12일 동안 배양한다. 보다 바람직하게는, 1차 세포 집단으로부터의 세포를 7 내지 12일 이내로 배양하여 H2스템 세포를 제공할 수 있는 생존가능한 1차 세포가 충분히 풍부화된 부착성 세포 집단을 수득한다.
"배양하는"이라는 용어는 광범위하게 세포 배양물 중에서 세포, 및 특히 H2스템 및/또는 H2스템 자손을 유지 및/또는 성장시키기 위한 조건을 의미한다. 하기 상세한 설명 및 실시예에 상술되는 바와 같이, H2스템 세포 및 H2스템 자손의 배양을 위해 요소, 예컨대, 세포의 배양이 이루어지고, 세포 부착을 허용하는 (또는 필요할 경우, 현탁액 중 세포 클러스터의 성장을 허용하는) 지지체, 세포 배양 배지의 조성, 세포가 시딩 및 유지되는 밀도, O2 및 CO2 농도가 적합화될 수 있다.
"간 전구 세포"라는 용어는 간으로부터 단리되는 세포를 배양하는 것을 사용하여 제조되고, 그 또는 그의 자손이 상대적으로 보다 특수화된 적어도 1종의 세포 유형을 생성할 수 있는, 비-특수화된 증식-적격 세포를 의미한다. 간 전구 세포는 1종 이상의 계통을 따라 분화됨으로써 점점 더 특수화된 세포 (그러나, 바람직하게는 간세포 또는 간-활성 세포)를 제조할 수 있는 후손을 생성하거나 (여기서, 이러한 후손은 그 자체가 전구 세포일 수 있음), 또는 심지어는 최종적으로 분화된 간 세포 (예를 들어, 완전하게 특수화된 세포, 특히 1차 인간 간세포와 유사한 형태학적 및 기능적 특징을 보이는 세포)를 제조할 수 있는 후손을 생성할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 간 조직이 성체 간으로부터 유래된 것임을 고려해 볼 때, H2스템 세포는 크고 투명한 세포질, 돌출부가 없는 불규칙한 막, 발생 세포간 접촉 및 연접부가 있는 입방 중-상피 형태를 갖고, 성장 접촉 억제를 보이는 성체 간 전구 세포로서 정의될 수 있다. 세포의 부착성 콜로니 또는 클러스터로서의 출현 및 증식 후 (도 3 참조), H2스템 세포를 이미 이 단계에서 (즉, 단계 (d)에 명시된 바와 같이, 세포를 계대배양하기 이전에) 관련 마커 검출을 허용하고, 먼저, 하기 단계 (e)에서 기재되는 바와 같이 후속 단계에서 1종의 간 마커 및 적어도 1종의 중간엽 마커, 및 적어도 1종의 간-특이적 활성으로서 특징화시킨 기술에 의해 추가로 특징화할 수 있다.
이러한 마커를 확인하고, 그를 양성인지 또는 음성인지를 측정하기 위한 기술 중에서 세포 배양 배지의 면역세포화학 또는 분석이 바람직한데, 그 이유는 (웨스턴 블롯 또는 유동 세포측정법의 경우에서와 같이) H2스템 세포를 파괴시키지 않고, 본 단계에서 이용가능한 H2스템 세포가 적은 양인 경우에도 그를 이용하여 마커 검출을 허용하기 때문이다. 특히, 시토케라틴-19-양성 세포 (도 2B에 나타낸 바와 같음), 또는 분비된 간 단백질 (알부민 또는 효소 유사 알파-1-항트립신 포함) (도 8B 및 도 12C 참조)의 검출은 하기 기재되는 세포 표면 단백질 (예컨대, SUSD2, CD90, CD73, CD29, CD44, 및/또는 간-특이적 수송체), 세포내 단백질 (예컨대, 비멘틴 또는 ASMA), 및 간 효소 및 관련 활성 (예컨대, 간 카르복실라제, 티로신 트랜스퍼라제, 트립토판-2,3-디옥시게나제, 요소 분비, CYP3A4 또는 임의의 다른 I상 시토크롬 P450 활성)을 비롯한, 다른 관련 마커의 검출과 함께, 또는 그의 검출 없이 이 단계에서 수행될 수 있다. 추가의 양성 마커는 실시예 3에서 (FACS 및/또는 프로테오믹스 또는 트랜스크립토믹스와 같은 기술에 의해) 확인된 것 및/또는 실시예 4에서 (ELISA, 면역조직화학, 또는 다른 항체-기반 기술에 의해) 확인된 것이다. 특히, 표 2에 열거된 군의 단백질 중 1종 이상이 추가의 양성 표면 마커로서 CD49b 및 CD51에 더하여 사용될 수 있다.
H2스템 세포는 이러한 세포의 생존 및/또는 성장을 촉진시킬 수 있는 시험관내 환경 내에서의 세포의 부착을 허용하는 기재 상에 플레이팅된 간 세포의 1차 집단으로부터 출현한다. 이러한 환경은 (예를 들어, 실험실 환경의 오염을 방지함으로써) 상기 환경 (즉, 세포 배양 용기)과 주변 사이의 목적하지 않은 물질 교환을 방지할 수 있는 한편 (예를 들어, 배양 배지 중 일부 또는 그 모두에 대해 가끔씩 이루어지는 교환, 연속 가스 교환에 의해) 배양 용기 사이의 다른 유용한 성분의 연속적 또는 간헐적 교환을 허용할 수 있다.
배양 용기는 다양한 포맷이지만, 세포 부착과 양립하는 1종 이상의 기재 표면을 보이는 세포 배양 플라스크, 병, 웰 플레이트, 다중-트레이 셀 스택, 생물반응기 및 디쉬일 수 있으며, 이에 의해, 플레이팅된 세포는 이 기재와 접촉하여 부착성 세포 배양물로 유지될 수 있다. 일반적으로, 세포의 그에의 부착을 허용하는 기재는 일반적으로 (실시예에서 셀바인드(CellBind)의 상업적 물질을 사용함으로써 나타난 바와 같이) 친수성 기재 표면을 제공함으로써 효과적인 세포 부착의 가능성을 증진시키기 위해 형상화되고 처리된 유리 또는 합성 중합체 물질 (예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리포스페이트, 폴리에스테르, 나일론 또는 그의 혼합물)인, 실질적으로 친수성인 임의의 기재일 수 있다. 표면 처리는 표면 코팅 형태를 취할 수 있거나, 물에 대한 일반적인 친화성을 갖거나, 또는 다르게는 또 다른 극성 기에의 안정한 흡착을 허용할 정도의 충분한 극성을 보이는 화학 기를 중합체 표면 상에 생성시키는 것을 수반할 수 있다. 이들 관능기는 친수성이도록 하고/거나, 표면 산소를 증가시키고, 이는 이와 같이 변형된 기재 표면 상에서 세포 성장을 증진시키는 것으로 인식되는 특성이다. 이러한 화학 기는 특정한 파동 주파수-기반 기술로 처리하여 또한 도입될 수 있는 기, 예컨대, 아민, 아미드, 카르보닐, 카르복실레이트, 에스테르, 히드록실, 또는 술프히드릴을 포함할 수 있다.
세포 부착은 처리된 플라스틱 표면을 적합한 매트릭스 층으로 코팅함으로써 촉진될 수 있다. 코팅은 적합한 다가양이온 (예를 들어, 폴리오미틴 또는 폴리리신), 또는 바람직하게는 1종 이상의 세포외 매트릭스의 성분: 피브린, 라미닌, 비-섬유성/섬유성 콜라겐 (바람직하게는, 콜라겐 1형), 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 헤파린 또는 헤파란 술페이트) 또는 단백질, 예컨대, 피브로넥틴, 젤라틴, 비트로넥틴, 엘라스틴, 테나신, 아그레칸, 아그린, 골 시알로프로테인, 연골 매트릭스 단백질, 피브리노겐, 피불린, 뮤신, 엔탁틴, 오스테오폰틴, 플라스미노겐, 레스트릭틴, 세르글리신, 오스테오넥틴, 베르시칸, 트롬보스폰딘 1, 또는 세포 부착 분자 (카드헤린, 코넥신, 셀렉틴 포함)를 그 자체로 또는 다양한 조합으로 수반할 수 있다. 바람직한 예는 다른 세포외 매트릭스 성분을 포함하거나, 또는 포함하지 않는 콜라겐 조성물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 단편이거나, 또는 다르게는 상기 열거된 단백질로부터 유래된 합성 펩티드, 겔, 분자 스캐폴드 및 합성 및/또는 생물학적 물질로부터 형성된 다른 3차원 구조물이 본 범주에서 사용될 수 있다.
1차 세포 현탁액을 배지를 배양 시스템으로부터 폐기하고, 임의적으로 부착성 세포를 1회 또는 반복적으로 세척함으로써 임의의 비-부착성 물질 (예를 들어, 비-생존가능한 또는 죽은 세포 및 세포 파편)을 배양 시스템으로부터 제거하기 전에, 1차 간 세포 집단이 부착성 기재에 부착되도록 하는데 충분한 일정 기간 동안 (예를 들어, 적어도 2, 4, 6, 12, 24시간, 또는 그 초과) 부착성 표면과 접촉시킬 수 있다. 이어서, 배양 시스템에 임의의 적합한 배지 또는 등장성 완충제 (예를 들어, PBS)를 제공한다. 이에 의해, 표면에 부착된, 1차 간 세포 집단으로부터의 세포를 추가 배양을 위해 선별하고, 상기 표면적 cm2당 플레이팅되는 세포의 수 (예를 들어, 10 내지 105개 세포/cm2)로서 표현될 수 있는 플레이팅 밀도를 평가하기 위하여 계수할 수 있다.
세포를 플레이팅할 때 또는 세포 세척 후에 바로 1차 세포 제제를 그의 생존 및/또는 세포의 성장을 지지하는 액체 배지 중에 유지시킨다. 세포를 시스템에 도입하기 이전에, 그와 함께, 또는 그 이후에 배지를 시스템에 첨가할 수 있다. 배지는 새로운 것 (즉, 이전에 세포 배양에 사용되지 않은 것)일 수 있거나, 또는 적어도, 그 안의 간 기원의 세포 (또는 임의의 다른 기원의 세포)를 사전 배양함으로써 조건화된 분획을 포함할 수 있다. 특히, 배지는 문헌에 기재된 바와 같이 간 전구 세포를 배양하는 적합한 임의의 배양 배지일 수 있고, 이는 정기적으로 (예를 들어, 매시간마다, 3시간, 12시간, 24시간 또는 그 초과인 기간마다) 동일한 또는 상이한 특징 (예를 들어, 조성, pH, 또는 산화 상태)을 보이는 새로운 배지로 교체될 수 있다. 전체 부피의 배지가 교환될 수 있거나, 또는 대안적으로, 배지 중 오직 일부만이 교환될 수 있고, 이에 의해, 세포의 사전 배양에 의해 조건화된 배지의 분획이 유지된다. 대안적으로, 관심의 대상이 되지 않는 세포 대부분 (예를 들어, 간세포 및 간 기원의 다른 완전하게 분화된 세포)이 탈착되고 사멸되는 방식으로 세포 배양을 연장하면서, 세포가 또 다른 배양 용기로 전달될 때까지는 배지를 교체하지 않고, 새로운 배지를 간단히 정기적으로 첨가할 수 있다.
영양소 및/또는 성장 촉진인자를 제공하는 것 이외에도 또한 특정 세포 유형의 성장/부착 또는 제거/탈착을 촉진시킬 수도 있는 소, 인간 또는 다른 동물 혈청이 첨가된 제한 화학적 배지에 기반한 부착성 세포를 성장시키기 위해, 부착성 1차 세포를 액체 배양 배지의 존재하에서 배양한다.
이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium: MEM), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 알파 변형 최소 필수 배지 (알파-MEM), 필수 기초 배지 (Basal Medium Essential: BME), 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM), BGJb 배지, F-12 영양소 혼합물 (Ham), 리보비츠(Liebovitz) L-15, DMEM/F-12, 필수 변형 이글 배지(Essential Modified Eagle's Medium: EMEM), RPMI-1640, 배지 199, 웨이머스 MB 752/1 또는 윌리엄스 배지 E, 및 그의 변형물 및/또는 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC); 또는 인비트로젠(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼스배드)으로부터 이용가능한) 기초 배지 제제가 본원의 1차 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 이들 기초 배지의 조성, 및 배양되는 세포에 대한 필요에 따라 배지 및/또는 배지 보충물의 농도를 적합화시키기 위한 기준은 일반적으로 공지되어 있다. 바람직한 기초 배지 제제는 성체 간 세포의 시험관내 배양을 유지시키는 것으로 보고되고, 그의 적절한 성장, 증식, 목적하는 마커 및/또는 생물학적 활성의 유지, 또는 장기간 저장을 위한 성장 인자의 혼합물을 포함하는, 상업적으로 이용가능한 것, 예컨대, 윌리엄스 배지 E, IMDM 또는 DMEM 중 하나일 수 있다.
이러한 기초 배지 제제는, 그 자체가 공지되어 있는 것인, 포유동물 세포 발생에 필요한 성분, 예컨대, 무기 염 (특히, Na, K, Mg, Ca, Cl, P 및 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn을 함유하는 염), 생리학적 완충제 (예를 들어, HEPES, 바이카르보네이트), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 염기, 리보스, 데옥시리보스, 아미노산, 비타민, 항산화제 (예를 들어, 글루타티온) 및 탄소원 (예를 들어, 글루코스, 피루베이트)을 함유한다. 최적의 성장 및 확장을 위해 세포에 필요한 미량 원소 및 물질을 공급하기 위하여 추가의 보충물이 사용될 수 있다. 이러한 보충물은 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 염, 및 그의 조합을 포함한다. 이들 성분은 염 용액, 예컨대, 행크스 평형 염 용액(Hanks' Balanced Salt Solution: HBSS), 얼즈 염 용액(Earle's Salt Solution) 중에 포함될 수 있다. 추가의 항산화제 보충물, 예를 들어 β-메르캅토에탄올이 첨가될 수 있다. 다수의 기초 배지는 이미 아미노산을 함유하고 있지만, 용액 중에서는 덜 안정적인 것으로 공지되어 있는 일부 아미노산, 예를 들어 L-글루타민은 추후에 보충될 수 있다. 배지는 항생제 및/또는 항곰팡이제 화합물, 예컨대, 전형적으로, 페니실린 및 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 다른 화합물을 추가로 공급받을 수 있다. 가장 중요하게는, 세포 배양 배지는 세포 생존가능성 및 확장에 필요하고, 특정 조건 하에 합성 성분으로 대체될 수 있는 세포 인자 및 성분을 함유하는 포유동물 혈장 또는 혈청으로 보완될 수 있다.
통상적으로 정의되는, "혈청"이라는 용어는 먼저 샘플 중에서 응고가 일어나도록 한 후에 혈액 샘플의 이와 같이 형성된 응괴 및 세포 성분을 적절한 기술에 의해, 전형적으로는 원심분리에 의해 액체 성분 (혈청)으로부터 분리시킴으로써 전혈 샘플로부터 수득된다. 불활성 촉매, 예를 들어 유리 비드 또는 분말이 응고를 촉진시킬 수 있다. 유리하게는, 혈청은 포유동물에 대하여 불활성인 촉매를 함유하는 혈청-분리 용기 (SST)를 사용하여 제조될 수 있다.
혈청 또는 혈장은 상업적으로, 및 1차 간 세포의 수득 기원이 되는 종과 동일한 종의 유기체로부터 수득될 수 있다. 인간 혈청 또는 혈장은 1차 인간 간 세포를 배양하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 배지는 소 혈청 또는 혈장, 바람직하게는 소 태아 (송아지) 혈청 또는 혈장, 보다 바람직하게는 소 태아 (송아지) 혈청 (FCS 또는 FBS)을 포함한다. 배지는 약 0.5% (v/v) 내지 약 40% (v/v)의 혈청 또는 혈장 또는 혈청 대체물, 바람직하게는 약 5% (v/v) 내지 20% (v/v), 예를 들어 약 5% (v/v) 내지 15% (v/v), 예를 들어 약 10% (v/v)를 포함한다. 인간 간 세포를 배양하기 위한 배지는 인간 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 인간 혈청, 및 소 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 소 혈청의 혼합물을 포함할 수 있다.
저장 또는 사용 이전에 혈장 또는 혈청에 방사선을 조사할 수 있거나 (예를 들어, 감마 방사선을 조사할 수 있거나), 또는 열 불활성화시킬 수 있다. 열 불활성화는 관련 기술분야에서 주로 보체를 제거하는데 사용된다. 열 불활성화는 전형적으로 지속적으로 혼합하면서, 혈장 또는 혈청을 56℃에서 30 내지 60분 동안, 예를 들어 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 혈장 또는 혈청을 점진적으로 주변 온도까지 냉각시키는 것을 수반한다. 임의적으로, 혈장 또는 혈청을 또한 저장 또는 사용 이전에 (예를 들어, 공극 크기가 1 μm보다 작은 1종 이상의 필터를 통과시켜 여과시킴으로써) 멸균시키거나 또는 치료 용도를 위한 인간 세포를 배양하는데 적용가능한 임의의 규제 정책에 따라 처리할 수 있다.
(혈청 또는 혈장 첨가 이전의) 기초 배지의 보통 성분, 예를 들어 특히, 등장성 염수, 완충제, 무기 염, 아미노산, 탄소원, 비타민, 항산화제, pH 지시제 및 항산화제는 관련 기술분야에서 성장 인자 또는 분화 인자로 간주되지 않는다. 한편, 혈청 또는 혈장은 가능하게는 1종 이상의 이러한 성장 인자를 포함하는 복합 조성물이다.
본원에 사용된 "성장 인자"이라는 용어는 단독으로, 또는 다른 물질에 의해 조정될 때, 다양한 세포 유형의 증식, 성장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 주고, 유기체에서 발생적, 형태학적 및 기능적 변화를 초래할 수 있는 생물학적 활성 물질을 의미한다. 성장 인자는 전형적으로 리간드로서, 세포에 존재하는 수용체 (예를 들어, 표면 또는 세포내 수용체)에 결합함으로써 작용할 수 있다. 본원에서 성장 인자는 특히 1종 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 단백질성 실재물일 수 있다. "성장 인자"라는 용어는 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 골 형성 단백질 (BMP) 패밀리, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-베타) 패밀리, 신경 성장 인자 (NGF) 패밀리, 표피 성장 인자 (EGF) 패밀리, 인슐린 관련 성장 인자 (IGF) 패밀리, 간세포 성장 인자 (HGF) 패밀리, 인터루킨-6 (IL-6) 패밀리 (예를 들어, 온코스타틴 M), 조혈 성장 인자 (HeGF), 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 패밀리, 또는 글루코코르티코이드 구성원을 포함한다. 본 방법이 인간 간 세포에 대해 사용될 경우, 본 방법에서 사용되는 성장 인자는 인간 또는 재조합 성장 인자일 수 있다. 인간 및 재조합 성장 인자는 세포 기능에 대하여 바람직한 효과를 유도할 것으로 기대되므로, 본 발명의 방법에서는 이러한 성장 인자를 사용하는 것이 바람직하다.
배지는 상기 정의된 바와 같은 외인성으로 첨가된 1종 이상의 성장 인자와 혈청 또는 혈장의 조합물을 바람직하게는, 특정한 성장 인자가 시험관내에서 배양된 세포에 대한 효과를 유도할 수 있는 농도로 포함할 수 있다. 예를 들어, 배지는 EGF 및 인슐린, 또는 EGF 및 덱사메타손, 또는 인슐린 및 덱사메타손, 또는 각각의 EGF, 인슐린 및 덱사메타손을 포함할 수 있다. EGF는 전형적으로 약 0.1 ng/ml 내지 1 μg/ml, 바람직하게는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 예를 들어 약 25 ng/ml의 농도로 사용될 수 있고; 인슐린은 전형적으로 약 0.1 μg/ml 내지 1 mg/ml, 바람직하게는 약 1 μg/ml 내지 100 μg/ml, 예를 들어 약 10 μg/ml의 농도로 사용될 수 있고; 덱사메타손은 전형적으로 약 0.1 nM 내지 1 μM, 바람직하게는 약 1 nM 내지 100 nM, 예를 들어 약 10 nM의 농도로 사용될 수 있다.
호르몬, 예를 들어 D-알도스테론, 디에틸스틸베스트롤 (DES), 덱사메타손, 인슐린, 에스트라디올, 히드로코르티손, 프로락틴, 프로게스테론, 티로트로핀, 티록신, L-티로닌이 또한 세포 배양에 사용될 수 있다. 간 세포는 또한 트리아이오도티로닌, α-토코페롤 아세테이트, 및 글루카곤과의 배양으로부터 이익을 얻을 수 있다. 지질 및 지질 담체는 또한 세포 배양 배지를 보충하는데 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체는 그 중에서도 특히 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 접합된 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산 및 올레산, 비접합 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 비접합 올레산 및 알부민에 접합된 올레산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 알부민은 유사하게 지방산 무함유 제제에서 사용될 수 있다.
1차 간 세포의 동결보존된 제제가 낮은 플레이팅 효율을 가질 때 뿐만 아니라, 상이한 기술, 조건, 및/또는 물질 (예를 들어, 합성 중합체 물질, 세포외 매트릭스의 성분(들), 세포 배양 배지, 인큐베이터내 산소 및/또는 CO2의 양, 세척 완충제 등)을 선택하고 조합함으로써 1차 세포의 이종 제제로부터 부착성 세포를 제조하기 위해 공지 기술을 시험하고/거나 적합화시킴으로써 실시예에 기재된 H2스템 세포의 형태학적 및 표현형 특징을 통해 이러한 세포를 수득할 수 있다. 특히, H2스템 세포를 세포 배양물로부터 더 많은 양으로 및/또는 보다 빠르게 수득하기 위해 이들 다른 요소의 1종 이상의 조합과 함께 (항산화제 화합물을 밀리몰 또는 더 낮은 농도로 첨가함으로써 수득되는 바와 같은) 저산소 조건 하에 배양하는 것이 적용될 수 있다.
상기 정의된 바와 같이 이러한 1차 간 세포 배양 단계를 통해 배양물에서 H2스템 세포의 출현 및 증식이 일어나고, 이는 H2스템 세포가 충분히 증식될 때까지 계속 진행될 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 세포 집단이 특정 정도의 전면성장 (예컨대, 적어도 50%, 70%, 또는 적어도 90% 또는 그 초과의 전면성장)을 달성할 때까지 계속 진행될 수 있다. 본원에 사용된 "전면성장"이라는 용어는 성장에 이용가능한 표면을 실질적으로 모두 덮을 정도로 (즉, 완전 전면성장) 세포가 서로 접촉하게 되는, 배양된 세포의 밀도를 의미한다.
본 방법의 단계 (d)와 관련하여, 1차 세포를, 그의 부착, 및 적어도 1회의 계대배양 이후에 점진적으로 H2스템 세포가 풍부화된 동종 세포 집단의 증식 및 출현을 유지시켜 주는 세포 배양 배지 중에서 배양한다. H2스템 세포는 목적하는 특성을 갖는 H2스템 자손 (예를 들어, 주어진 밀도 및/또는 분화 상태의 2차원 부착성 세포 또는 3차원 세포 클러스터)를 수득하기 위하여 충분한 세포를 생성하기 위해 빠르게 확장될 수 있으며, 여기서 세포 배가는 48-72시간 이내에 수득될 수 있고, 목적하는 특성을 갖는 H2스템 자손은 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과의 계대배양 동안 유지될 수 있다.
계대배양될 때, 배양된 세포는 배양 기재로부터 및 서로로부터 탈착되고, 해리된다. 세포의 탈착 및 해리는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 예를 들어 (예, 트립신, 콜라게나제, 예 I, II, III 또는 IV형, 디스파제, 프로나제, 파파인 등으로부터 선택되는) 단백질 분해 효소로의 효소 처리, 2가 이온 킬레이터 (예, EDTA 또는 EGTA)로의 처리, 또는 기계적 처리 (예, 구경이 작은 피펫 또는 피펫 팁을 통한 반복적 피펫팅), 또는 이들 처리의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.
세포를 탈착 및 분산시키는데 적합한 방법은 배양물 중의 세포 대다수는 보존시키면서, 반드시 세포를 목적하는 정도로 탈착 및 분산시켜야 한다. 바람직하게는, 배양된 세포의 탈착 및 해리를 통해 세포를 단일의 생존가능한 세포로서 상당 비율로 (예를 들어, 세포를 적어도 50%, 70%, 90% 또는 그 초과로) 수득하게 된다. 남은 세포는 각각이 비교적 소수의 세포 (예를 들어, 평균적으로, 1 내지 100개 세포)를 함유하는 세포 클러스터로 존재할 수 있다.
이어서, 이와 같이 탈착되고 해리된 세포 (전형적으로 등장성 완충제 또는 배지 중의 세포 현탁액으로서 것)를 세포의 그에의 부착을 허용하는 기재 상에 재플레이팅할 수 있고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 H2스템 세포 및 H2스템 자손의 추가 증식을 지속시켜 주는 배지 중에서 배양한다. 이어서, 이들 세포를 10 내지 105개 세포/cm2의 밀도로, 및 약 1/16 내지 1/2, 바람직하게는 약 1/8 내지 1/2, 보다 바람직하게는 약 1/4 내지 1/2인 분할비로 재플레이팅함으로써 그를 배양할 수 있다. 분할비란, 세포를 수득한 용기와 동일한 표면적을 갖는 비어있는 (전형적으로 새로운) 배양 용기로 시딩되는 계대배양된 세포의 분율을 의미한다. 배양 용기 유형 뿐만 아니라, 배양 용기로의 세포 부착을 허용하는 표면 및 세포 배양 배지의 유형은 처음 사용되고, 상기 기재된 것과 동일한 것일 수 있거나, 상이한 것일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 셀바인드, 또는 세포외 매트릭스 단백질 (예컨대, 콜라겐, 및 바람직하게는, 콜라겐 I형) 또는 합성 펩티드로 코팅된 임의의 다른 적절한 지지체 상에서 유지된다.
상기 단계 (e)와 관련하여, H2스템 세포 집단의 단리는 처음에 상기 단계 (c)에서 H2스템 세포를 확인하기 위한 기준을 추가로 검증하면서, 입방 중-상피 형태를 유지하고, 적어도 1종의 간 마커 및 적어도 1종의 중간엽 마커에 대하여 양성이고, 적어도 1종의 간-특이적 활성을 갖지만, 계대배양 이후에 더 많은 양의 세포가 이용가능하다고 가정할 때, 보다 용이하게 확립될 수 있는 세포에 적용된다.
"단리시키는" 또는 "단리"라는 용어는 세포 배양물 검사에 기반하고, 기준에 상응하는 세포의 특징화 (및 가능하고, 바람직할 경우, 물리적 분리)에 기반하거나, 또는 항원의 존재/부재 및/또는 세포 크기에 따른 (예컨대, FACS에 의한) 자동 세포 분류에 기반하는 적절한 세포 생물학적 기술을 적용함으로써 수행될 수 있는, 세포 배양 또는 생물학적 샘플로부터의 세포 집단의 물리적 확인 및 단리, 둘 모두를 의미한다. 일부 실시양태에서, "단리시키는" 또는 "단리"라는 용어는 특히 유동 세포측정법을 수행함으로써 세포를 물리적으로 분리 및/또는 정량화시키는 추가의 단계를 포함할 수 있다.
"세포 집단" 및 "세포의 집단"이라는 용어는 일반적으로 세포 군을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어는 본원에서 정의된 바와 같은 세포로 본질적으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 세포 군을 의미한다. 세포 집단은 본질적으로 공통 표현형을 갖는 세포로 이루어질 수 있거나, 또는 적어도 공통 표현형을 갖는 세포의 분획을 포함할 수 있다. 세포는 시험관내 배양 (예를 들어, 부착 또는 단일층 성장) 동안 형태학적 외관, 특정 세포 성분 또는 생성물 (예를 들어, RNA 또는 단백질)의 발현 수준, 특정의 생화학적 경로의 활성, 증식 능력 및/또는 동역학, 분화능 및/또는 분화 신호 또는 거동에 대한 반응을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 1종 이상의 입증가능한 특징이 실질적으로 유사하거나, 또는 동일할 때, 공통 표현형을 가진다고 한다. 따라서, 이러한 입증가능한 특징이 세포 집단 또는 그의 분획을 정의할 수 있다. 실질적으로 세포의 대다수가 공통 표현형을 가진다면, 세포 집단은 "실질적으로 동종"일 수 있다. "실질적으로 동종"인 세포 집단은 공통 표현형, 예컨대, 구체적으로 H2스템 세포 (또는 H2스템 자손)로 지칭되는 표현형을 갖는 세포를 적어도 60%, 예를 들어 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 심지어는 적어도 99%로 포함할 수 있다. 게다가, 집단 중에 존재하는 임의의 다른 세포가 세포 집단의 전반적인 특성을 변경시키지 않거나, 또는 그에 대해 중요한 영향을 미치지 않을 경우, 세포 집단은 본질적으로 공통 표현형, 예컨대, H2스템 세포 (즉, H2스템 자손)의 표현형을 갖는 세포로 이루어진 것일 수 있으며, 따라서, 이는 세포주로서 정의될 수 있다.
일반적으로, 문헌에 공개된, 특이적 세포 유형 (예를 들어, 중간엽, 간, 조혈, 상피, 내피 마커)에 대한, 또는 특이적 국재화 (예를 들어, 세포내, 세포 표면상, 또는 분비된 것)를 갖는 것에 대한 세포 마커를 확인하고, 특징화하는 임의의 기술이 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 특징화하는데 적절한 것으로 간주될 수 있다. 이러한 기술은 2개의 카테고리: 분석 동안 세포 완전성을 유지시킬 수 있는 것, 및 이러한 세포를 사용하여 생성되는 (단백질, 핵산, 막 등을 포함하는) 추출물에 기반하는 것으로 분류될 수 있다. 실시예는 예를 들어, H2스템 세포 및 H2스템 자손의 특징 및 생물학적 활성을 평가하기 위하여 다른 간 전구 세포 또는 성체 간 1차 세포와 보다 상세한 비교 분석을 수행하기 이전에 세포 표면 항원의 존재의 분석을 수행함으로써 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 특징화하는데 이러한 기술이 어떻게 사용되었는지에 관한 데이터를 포함한다.
단백질 수준에서, 기술, 예컨대, 유동 세포측정법, FACS, 또는 면역세포화학을 통해 항체 또는 다른 단백질-특이적 시약을 사용함으로써 H2스템 세포 중의 표면 또는 세포내 단백질의 존재/부재를 측정할 수 있다. 단일 또는 다중 염색 기술, 및/또는 크기 및 입상 평가에 의해 측정시에, 유동 세포측정법은 표면, 또는 세포내 마커의 조합된 존재/부재에 따라 세포 집단을 특징화하는데 바람직한 기술이다. 면역세포화학이 또한 표면, 세포 골격, 및/또는 다른 세포내 마커의 조합된 존재/부재와 관련된 형태학적 특징에 관한 관련 정보를 제공한다. 실제로, 실시예는 일부 실시양태에서, H2스템 세포 제제 중 유의한 백분율의 세포가 시토케라틴-19 (CK-19), 세포 골격 및 세포내 마커에 대하여 양성이라는 것을 나타낸다. 이 백분율은 유동 세포측정법에 의해 검출되었을 때 적어도 20% 또는 20 내지 40%인 것으로 추정될 수 있지만, CK-19가 면역세포화학에 의해 검출될 때에는 그보다 훨씬 더 높다 (즉, 최대 90% 이상) (도 2B 참조). 이러한 추가 특징 (즉, CK-19에 대한 양성성)을 통해 H2스템 세포로서 1차 간 세포를 배양함으로써 제조되는 세포 집단을 확립하고 확인할 수 있다.
특히, (특히, ASMA 비멘틴, CD90, CD73, 및 CD29로부터 선택되는) 적어도 1종의 중간엽 마커 및 적어도 1종의 간 마커의 존재는 수용체를 나타내는 세포의 백분율을 평가하도록 하는 유동 세포측정법, 면역세포화학, 또는 (일반적으로 항체, 렉틴, 또는 다른 단백질을 이용하지만, 단백질 또는 핵산 추출물은 필요로 하지 않는) 임의의 다른 기술에 의해 측정되어야 한다. 간 또는 중간엽 특징과 엄격하게 연관된 것 (예컨대 CD140b, CD49b, CD51, 또는 실시예 3에서 표 2, 표 4, 표 6 및 표 7에 언급된 임의의 다른 양성 마커) 이외의 추가의 세포 표면 마커에 대한 양성성이 유사하게 측정될 수 있다. (실시예에 나타낸 바와 같이) 유동 세포측정법 및 면역세포화학에 의한 양성성은 본원에서 적어도 60%의 세포가 목적하는 마커 또는 수용체를 나타내는 경우로 정의된다. 유사하게, (실시예에 나타낸 바와 같이) 유동 세포측정법 및 면역세포화학에 의한 음성성은 본원에서 20% 미만의 세포가 주어진 마커 또는 수용체를 나타내는 경우로 정의된다. 일부 실시양태에서, CD140b (도 10B 참조) 또는 CD271 (도 11B 참조)의 경우에서와 같이, 10% 미만의 세포가 주어진 음성 마커를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 주어진 마커를 측정할 때, 상기 정의된 바와 같은 마커 또는 세포 표면 단백질의 검출에 사용되는 작용제는 고체상 (예를 들어, 비드, 플레이트, 또는 생체물질) 상에 고정화되고/거나, 표지되고/거나 (예를 들어, 형광 표지되고/거나), 표지된 또 다른 화합물 (예를 들어, 2차 항체)에 의해 인식된다. 표지가 외부 수단에 의해, 예를 들어, 바람직하게는 시각적 검사에 의해 또는 전자기 방사선, 열, 및 화학적 시약에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있게 하는 방법이 다수 존재한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대, 화학적 가교 결합을 사용하여, 또는 비오틴-스트렙트아비딘 시스템을 사용하여 표지 또는 다른 신호 생성 시스템 성분 또한 특이적 결합 파트너, 또 다른 분자에, 또는 지지체, 예컨대, 비드에 결합시킬 수 있다. 표지는 신호를 직접 생성할 수 있고, 따라서, 신호를 생성하는데 추가 성분이 필요하지 않다. 다수의 유기 분자, 예를 들어, 형광색소 (예컨대, FITC, PE, PC5, PC7, APC, 또는 유동 세포측정법과 양립하는 것으로 공지된 임의의 다른 것)는 자외선 및 가시광선을 흡수한다. 다른 유형의 표지, 예컨대 방사성 동위 원소 및 염료는 직접 신호를 생성한다. 대안적으로, 표지는 신호 생성을 위해 다른 성분을 필요로 할 수 있고, 이어서 신호 생성 시스템은 측정가능한 신호를 생성하는데 필요한 성분 모두를 포함할 수 있으며, 이는 기질, 효소, 금속 이온, 또는 효소 생성물과 반응하는 물질 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다제의 화학발광성 검출)을 포함할 수 있다.
H2스템 세포의 간-특이적 대사 활성은 일반적으로 간 세포와 (및 특히 간세포와) 관련되고, 간 세포를 다른 조직에 존재하는 세포와 구별하는 생물학적 활성을 포함하고, 특히, 문헌상에 및 실시예에 기재된 바와 같이 단백질 또는 다른 기질의 결합, 활성화, 및/또는 분해를 포함하는 활성을 포함한다. 이들 생물학적 활성은 단백질/약물 결합 활성, 및 보다 바람직하게는, 주어진 기질 상의 효소 활성일 수 있거나, 또는 블롯팅 기술 (웨스턴 또는 노던 블롯), 서열분석, 등전기초점화, ELISA에 의해 검출되는 간-특이적 분자와 관련된 간-특이적 대사 활성의 검출, 또는 구체적으로 간 세포 내에서 수송되고, 대사되는 것으로 공지된 합성 또는 천연 화합물의 내재화의 검출에 기초하여 확립된다. 간 특징과 엄격하게 연관된 것 (예컨대 실시예 3에서 언급된 것) 이외의 다른 관련 효소 활성이 유사하게 측정될 수 있고, 문헌에 기재된 기술을 사용하여 간세포 또는 다른 세포 유형 내에서 측정된 것과 비교할 수 있다.
핵산 수준에서, 전체 게놈 서열분석, PCR, 또는 RT-qPCR이 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 특징화하는데 사용될 수 있다. 이에 의해, 연구 중인 유전자의 발현을 정량화하는데 실시간 PCR이 사이클 회수에 기초하고, 1종 이상의 내인성 대조군에 대하여 수득되는 사이클에 대하여 정규화시킴으로써 사용될 수 있다. 특히, RT-PCR 반응은 H2스템 세포 및 적절한 프라이머 및 완충제를 사용하여 수행될 수 있지만, 신호를 수득하기 위한 사이클 수는 25, 30 또는 35회 사이클을 초과하지 않아야 한다.
활성 수준에서, 간-특이적 대사 활성의 존재는, 간-특이적 효소의 활성의 존재 및/또는 수준을 평가할 수 있도록 하지만, 바람직하게는 CYP450 활성, 해독, 글리코겐 저장, 알파-1-항트립신 또는 알부민의 분비, 담즙 생산, 트롬보포이에틴 생산, 안지오텐시노겐 생산, 암모니아의 요소로의 전환, 콜레스테롤 합성, 글리코겐 분해, 글리코겐 생성 및 지질 생성을 측정하기 위한 (문헌 및 상업적으로 이용가능한 제품의 지원하에 용이하게 확립될 수 있는 바와 같이) 특이적 최종 생성물의 소정의 검출 한계를 이용하여 시험관내에서 실제 효소 활성을 정량화하도록 하여야 하는 임의의 적절한 기술에 의해 측정될 수 있다. 특히, 적어도 간-특이적 대사 활성에 대한 양성성은 본원에서 활성이 최종 생성물의 검출 한계를 통계적으로 초과하거나 (검출 한계보다 적어도 2배, 5배, 또는 10배 더 크거나), 또는 1차 간세포의 활성 수준에 가까운 것 (보다 우수함, 동일함, 또는 10%; 25%, 50%, 75%, 또는 90% 더 낮음)으로 측정되는 경우로 정의된다.
문헌은 시험관내에서 인간 간세포에서의 시토크롬 P450 활성을 평가하기 위한 기술에 관한, 특히, 특이적으로 효소 활성을 유도하는 화합물, 및 본 실험을 수행하는데 사용될 수 있는 포맷에 관한 광범위한 설명을 제공한다 (Baudoin R et al., 2012; Gerets HH et al., 2012; Gomez-Lechon MJ et al., 2012; Halladay JS et al., 2012; Hoffmann SA et al., 2012; Lubberstedt M et al., 2011; Smith CM et al., 2012). 상이한 유도제 중에서 이들 세포에서의 약물 대사는 미다졸람, 에톡시레소루핀, 벤즈옥시레소루핀, 부프로피온, 페나세틴, 디클로페낙, 톨부타미드, 페노바르비탈, 리팜피신, 카페인, 베타-나프토플라본, 오메프라졸, 덱스트로메토르판, 3-메틸콜란트렌, 레파글리니드, 또는 문헌 (Bale S et al., 2014)에 열거된 프로브로서 공지된 다른 세포독성/간독성 화합물을 사용하여 평가될 수 있다. 대사물 검출 및 정량화는, CYP1A2 (파라크산틴 또는 아세트아미노펜 검출에 의해), CYP3A4 (1-OH-미다졸람 또는 오메프라졸 술폰 검출에 의해), CYP2C6 (HO-부프로피온 검출에 의해), CYP2C8 (히드록실-레파글리니드 검출에 의해), CYP2C9 (4'HO-디클로페낙 검출에 의해), CYP2C19 (히드록시-오메프라졸 또는 HO-메페니토인 검출에 의해), CYP2D6 (덱스트르판 검출에 의해), CYP2E1 (6-OH-클로르족사존 검출에 의해) 뿐만 아니라, 다른 주요 시토크롬 P450 활성, 예컨대, CYP1A2, CYP2A6, CYP1B1, CYP2B6, CYP3A5, CYP3A7, 또는 CYP7A1 (단독으로 또는 적절한 조합으로)과 같은 특정 화합물에 대한 간 효소의 활성과 관련될 수 있다.
그의 발현 또는 (바람직하게) 활성이 H2스템 세포 및 H2스템 자손에서 확립될 수 있는 다른 효소는 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 (예컨대, UGT1A1, UGT2B4, UGT2B7), (약리학상 중요한 수개의 내인성 분자 및 생체이물의 술페이트 접합을 촉매화하는) 술포트랜스퍼라제, 티로신 트랜스퍼라제, 트립토판-2,3-디옥시게나제 (TDO2 또는 TDO), 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO1 또는 IDO2), 리실 옥시다제 (LOX), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (예를 들어, GST알파), 다중 약물 단백질 (MDR 또는 MRP-1/-2/-3), 간-특이적 수송체 (예컨대, OATP1B1), 및 다른 I/II/III상 생체내변환 효소이다. 게다가 알부민/요소 생산 및 분비, 암모니아 대사, 글리코겐 저장, 담즙 생산, 트롬보포이에틴/안지오텐시노겐 생산, 및 갈락토스/소르비톨 제거율 또한 잘 확립된 프로토콜을 적용시킴으로써 관찰되고, 비교될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 H2스템 세포의 제제를 수득할 때, 이 세포 집단은 분화 없이 성장 및 배가를 허용하는 조건에서 유지되고/거나, 증식될 수 있다. 바람직하게는 H2스템 세포는 비-분화된 부착성 세포 (또는, 상기 나타낸 바와 같이, H3스템 세포로 명명된 3차원 세포 클러스터)로서 배양물에서 2회 이하, 3회 이하, 4회 이하, 또는 5회 이하 계대배양되고, 이에 의해 추가의 생체내 또는 시험관내 용도에 가장 적절한 조건을 달성하기 위한 세포 배가의 횟수를 평가할 수 있다. 이 상태에서 1회 이상의 계대배양 이후에, 간세포-유사 또는 간-활성 세포로 분화되도록 유도될 수 있다 (도 1, 도 4A, 및 도 5B-E 참조). 두 경우 모두, 생성된 세포는 H2스템 자손을 나타낸다. 첫번째 경우에서, 미분화 H2스템 자손으로서 H2스템 세포를 유지시키기 위한 조건은 이용가능한 세포의 수를 증가시키기 위한 목적으로 원래의 H2스템 세포 집단을 수득하는데 사용된 조건과 동일할 수 있거나, 또는 실시예에 제시된 바와 같이, 3차원 세포 클러스터 (H3스템 세포)를 생성하는데 사용된 것과 동일한 조건일 수 있다. 두번째 경우에서, 간세포로 분화되는 세포를 대표하는 형태학적, 생물학적, 기능적 특징을 갖는 세포로 성체 간 전구 세포를 분화시키기 위한 것으로서 잘 확립된 세포 배양 조건이 적용될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (e) 이후에, 임의적인 추가의 단계 (f)는 간-특이적 활성을 보이고, 예를 들어, 간세포-유사 또는 간-활성 세포 (즉, 모두는 아니지만, 대부분의 중간엽 마커에 대한 그의 양성성을 상실하였고, 모두는 아니지만, 대부분의, 간세포의 형태학적, 생물학적 및 기능적 특징에 대하여 양성인 성체 간 전구 세포)인 것인 세포로 분화되도록 하는 세포 배양 조건에서 H2스템 세포를 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 실시예는 (H3스크린-2b, H3스크린-2c, 또는 H2스크린 세포로서) 부착성 세포 형태로, 또는 (H3스크린-1 세포로서 또는 H3스크린-2a 세포로서) 현탁액에서 용이하게 유지될 수 있는 3차원 세포 클러스터의 형태의 H2스템 자손으로서 이러한 간세포-유사 또는 간-활성 세포를 생성하는 방법에 관한 상세한 설명을 제공한다.
이러한 후자의 측면에서, 실시예는 초-저부착(Ultra-Low Attachment) 세포 배양 플레이트 또는 플라스크, 및 보다 적절하게는 초-저부착, U자형/라운드형 배양 마이크로플레이트가, 간세포, 및 일반적으로 간-활성 세포를 특징화하는 기능상 및 구조상 개선된 특징을 보이는 현탁액 중의 세포 클러스터로서 3차원 H2스템 자손을 제공한다는 것을 보여준다. 96 또는 384 웰을 포함하는 (또는 임의의 다른 이용가능한 포맷에서, U자형 바닥을 가진 상이한 수의 웰을 함유하고, 0.5 ml 미만, 또는 보다 양호하게는 0.25 ml 미만의 세포 배양 배지 부피에서 세포 배양물을 유지시키도록 하는) U자형/라운드형 배양 마이크로플레이트는, 시험관내 및 생체내 용도에 보다 적절하게 만드는, 보다 일정한 크기와 형상을 갖는 현탁액 중의 세포 클러스터로서 3차원 H2스템 자손을 제공한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 단계 (e)에서 제조되고 단리된 세포 집단은 특이적 3차원 H2스템 자손을 나타내는 세포 클러스터 형성을 허용하는 세포 배양 조건에서 유지될 수 있다. 본 방법의 상기 단계는 (예를 들어, H2스크린 세포로부터 H3스크린-1 세포를 수득하기 위한) 추가의 단계 (g)로서, (예를 들어, H2스템 세포로부터 H3스템 세포를 수득하기 위한) 대안적 단계 (f1)로서, 또는 (예를 들어, H2스템 세포로부터 직접 H2스크린-2a 세포를 수득하기 위한) 시험관내 분화 및 3차원 H2스템 자손의 형성을 조합한 추가의 대안적 단계 (f2)로서 존재할 수 있다.
상기 기재된 바와 같거나, 또는 문헌에서 제안되고/되거나, 특히 3차원 세포 클러스터 (3차원 H2스템 자손) 형태의 H2스템 세포 또는 H2스템 자손의 구체적인 용도를 위한 변형을 포함하여, 제1 계대배양의 조건과 실질적으로 동일하거나 또는 유사한 조건에서, 추가 계대배양 (예를 들어, 세포 탈착 및 분산, 재플레이팅 등) 및 배양 (예를 들어, 전면성장 후 배지 첨가 또는 교체 등)을 수행할 수 있다. 따라서, 세포 배양물 중에서 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 유지시키고/거나 분화시키는 조건은 상이한 기준, 예컨대, 간세포-유사 또는 간-활성 세포로의 분화를 위한 타이밍/배지, 세포 현탁액으로서 3차원 세포 배양물을 유지시키기 위한 시스템, 특정 기재 또는 스캐폴드의 사용, 산소 결핍, 세포 배양 배지 내의 성장 인자 및 화학적 화합물의 조합된 또는 순차적 첨가, 또는 세포 밀도에 따라 추가로 최적화될 수 있다.
본 발명의 방법은 앞서 기재된 성체 전구 간 세포에서 확인된 것과는 다른 형태학적, 단백질 발현, 및 기능적 특징을 보이는 H2스템 세포를 제공한다. 결과적으로, 상기 정의된 방법에 의해 수득되거나, 또는 수득될 수 있는 H2스템 세포가 본 발명의 추가의 실시양태를 나타낸다. 본 방법을 통해 특정 세포를 고비율로 (적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과로) 포함하는 세포 집단을 제공할 수 있으며, 심지어는, 임의의 적절한 표준 방법에 의해, 예를 들어 유동 세포측정법 또는 임의의 다른 면역염색 접근법에 의해 평가될 수 있는 바, 실질적으로 동종인 세포 집단을 수득할 수 있다. 주어진 H2스템 자손 중의, 특히, 간-활성 세포 및 3차원 세포 클러스터 내의 기질 요소 (도 4A 및 도 5 참조)는 이러한 자손의 일부로서 간주되며, 이러한 세포 클러스터를 오염시키는 요소로 간주되지 않아야 하며, 대신 구성 요소로서 간주되어야 한다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손은 임의의 즉시 사용을 위한 세포 배양물을 확립하는데 사용될 수 있거나, 또는 제제를 적절하게 해동시킨 후, 더 많은 양의 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 제조 또는 사용하기 위한 목적으로, 및 필요할 경우, (원하는 세포 특성은 유지시키면서, 바이오처리 및 세포 확장을 개선시키기 위하여 생물반응기, 막, 마이크로스피어, 마이크로플루이딕스, 또는 임의의 다른 기술적 해결 방안을 사용하여) 산업 규모로 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 제조하기 위해, 각각이 적어도 103, 106, 109개 또는 그 초과의 세포를 함유하는 동결보존된 제제로서 저장될 수 있다. H2스템 세포 및 H2스템 자손 중 임의의 것에 상응하는 세포 집단의 샘플은 혈청 함유 또는 혈청 무함유 보존 배지 (예를 들어, 상업적으로 이용가능한 동결보존 제제) 중에서, 및/또는 동결보호제 (예를 들어, 적절한 농도의 디메틸 술폭시드)의 존재에서 동결저장될 수 있다. 마이크로플루이딕스와 관련하여, H2스템 자손 (또한 3차원 구조물로서 유지된 H3스템 세포의 형태)은 약물 개발 및 독성학을 위한 안전성 시험, 병리생리학적 연구, 및 다른 세포-기반 간 모델에서 칩-상-기관 적용을 위해 개발된 상업적 시스템과 상용될 수 있다 (Alepee N et al., 2014; Lin C et al., 2015).
특히, 미리 결정된 수의 세포 (예를 들어, 50,000, 100,000, 500,000, 100만, 1,000만, 1억, 10억개 또는 그 초과의 세포), 또는 각각이 대략 유사한 수의 세포 (예를 들어, 도 6에 나타낸 바와 같이, 1, 10, 100, 1,000개 또는 그 초과의 스페로이드)를 갖는, 상기 수의 3차원 세포 클러스터를 포함하는 H2스템 세포 및 H2스템 자손의 제제는 하나 이상의 바이알에 제공될 수 있고, 이후 바이알은 이러한 바이알 (또는 다른 적절한 용기 또는 컨테이너, 예컨대 마이크로플루이딕스 적용에 사용되는 것)을 포함하는 키트에 포함될 수 있거나, 이러한 바이알, 컨테이너, 마이크로플루이딕스 장치, 및 임의의 다른 적절한 장치, 1회용 물질 (예를 들어, 필터, 시린지), 용액 (예를 들어, PBS, 세포 배양 배지, 희석제), 화학물질 (예를 들어, 효소 기질, 형광색소, 약물), 생물학적 생성물 (예를 들어, 성장 인자, 항체, 프라이머), 및/또는 결과적으로 H2스템 세포 및 H2스템 자손의 생체내 (예를 들어, 환자에게 또는 동물에게 투여하기 위한) 또는 시험관내 (예를 들어, 후보 약물로서 화합물의 독성 또는 효능을 검사하기 위한) 사용을 위해 적절하게 패키징되고, 클라이언트에게 송부될 수 있는, 상기 키트 성분 사용에 관한 사용 지침을 포함하는 키트에 포함될 수 있다.
세포 배양 조건에서 (또는 동물 모델에서 또는 환자에서의 이식 이후에) H2스템 세포 및 H2스템 자손의 유지, 증식, 및/또는 분화는 목적하는 용도에 맞게 필요에 따라 수행될 수 있다. 문헌에는 간 전구 세포를 유지시키기 위한 및/또는 그로부터 간세포-유사 또는 간-활성 세포를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 제공되어 있다. 실시예는 세포 배양 조건에서 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 수득하기 위한, 및 그를, 부착성 세포 형태로 또는 3차원 세포 클러스터로서, 간-특이적 활성을 보이는 세포로 분화시키기 위한 수단을 제공한다. 이러한 후자의 경우, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 목적하는 용도를 위해, 문헌에 따라 간내로 또는 간외로 투여되었을 때, 화합물의 간독성 시험을 위해 사용되었을 때, 동결보존된 제제로서 유지되었을 때, 제조 공정 규모 확장을 위해 생물반응기 또는 다중-트레이 스택에서 확장되었을 때, 또는 간 보조 장치에서 사용되었을 때, 생존가능성 및 기능성이 유의하게 개선된 세포를 제공할 수 있는, 간 스페로이드 또는 오르가노이드와 유사한 3차원 세포 클러스터로서 제공될 수 있다 (Lu Y et al., 2012; Saito R et al., 2011; Massie I et al., 2011; Soto-Gutierrez A et al., 2010; Mitaka T and Ooe H, 2010; Meng Q, 2010; Tostoes RM et al., 2012). 실시예에 기재되어 있는 방법 이외에도, H2스템 세포 및 H2스템 자손의 3차원적 성장은 또한 합성 또는 생물학적 매트릭스에 세포를 캡슐화함으로써 수득할 수 있다. 특히, 간 탈세포화된 또는 세포외 매트릭스는 1종 이상의 세포 유형의 배양을 위해 스캐폴드로서, 간 오르가노이드의 생성을 위해 2차원 기재 코팅 및 3차원 주사가능한 히드로겔 플랫폼으로서 사용될 수 있다 (Lee J et al. 2014; Caralt M et al., 2014).
H2스템 세포 및 H2스템 자손의 유지, 증식, 및/또는 분화는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술적 해결 방안을 이용하여 기원이 다른 줄기, 전구, 또는 중간엽 세포에 맞게 줄기, 전구, 또는 중간엽 세포에 대한 세포 배양 조건을 적합화시킴으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 비-세포손상 저산소 분위기의 생체외 프로토콜 및 시험관내 미세환경을 적합화시키는 다른 접근법이 이러한 세포의 생존, 유전적 안정성, 증식, 이식 후 분화, 간에서의 귀소 및 재증식, 주변분비 인자 분비, 및 전반적인 치료 잠재능을 촉진시킬 수 있다 (Muscari C et al., 2013; Cigognini D et al., 2013). 다르게는, 인간 혈액-유래 성분, 예컨대, 제대혈 혈청 및 혈소판 용해물을, 소 태아 혈청에 대한 비-이종성 대안이면서, 여전히 의약품 제조 관리 기준(good manufacturing practice: GMP) 가이드라인에 부합하는 세포 배양 성분으로서 시험하고, 개발하여 품질의 변동성, 오염 위험성, 및 원치않는 면역 효과와 같이, 혈청과 관련된 널리 공지된 문제 없이, 임상적으로 적절한 세포 용량을 수득한다 (Bieback K, 2013; Griffiths S et al., 2013).
투여 또는 다르게는 사용하기 전, H2스템 세포 및 H2스템 자손을 이종 생물학적 또는 화학적 작용제에 노출시키거나, 또는 상기 작용제를 세포 내로 도입함으로써 상기 세포를 일시적으로 또는 안정적으로 변형시킬 수 있다. 특히, H2스템 세포 및 H2스템 자손을 성장 인자로 처리하고/거나, (예를 들어, 세포에 마이크로RNA를 형질도입시키거나, 또는 간 분화 또는 임의의 다른 세포 유형으로의 분화, 및/또는 치료적 관심이 있는 특정 분자의 생산에 영향을 주는 것으로 공지된 재조합 단백질, 예컨대, 성장 인자, 또는 전사 인자, 또는 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입시킴으로써) 바람직하게는 특이적 간 특징 또는 세포 배양에 도움이 되는 특징으로 이루어지도록 세포의 전반적인 발현 프로파일에 영향을 주는 핵산을 도입함으로써 상기 세포를 세포 배양시에 (예를 들어, 그의 분화 이후 및/또는 이전에) 변형시킬 수 있다 (또는 적절한 벡터로 형질전환시킨 이후에 조작할 수 있다).
특히, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 결과적으로 폭넓은 간-특이적 활성을 보이는 세포로의 그의 분화 이후 및/또는 이전에 생체내 및/또는 시험관내에서 개선된 및/또는 추가의 생물학적 활성을 보일 수 있다. 바람직하게는, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 분화되기 이전에 조작되고, 이에 의해 이러한 세포의 자손 중 임의의 것은 일관적으로, 임의의 이후의 시험관내 분화 또는 생체내 용도 (간 또는 다른 유형의 분화을 의미하거나 또는 그렇지 않을 수 있음)와는 상관없이, 개선된 생물학적 활성을 갖도록 변형된다.
다른 공지된 간 전구/줄기 세포의 다른 비-간 세포 유형 (예를 들어, 골세포, 인슐린-생산 베타 세포, 또는 골수 세포)으로의 분화를 유도하는 것으로 공지된 화학적 작용제, 세포 배양 배지, 및/또는 핵산 벡터로 H2스템 자손을 처리하면, 이러한 비-간 세포 유형을 동등하게 제공할 수 있다. 문헌에 공지된 이들 기술을 H2스템 세포 (또는 임의의 특이적 유형의 H2스템 자손)에 적용시킴으로써 수득되는 비-간 세포 집단은 이러한 처리에 대한 결과로서 H2스템 자손이 손실하고/거나 획득한 생물학적 활성에 따라 (특히, 치료학적 용도로) 시험관내 및/또는 생체내에서 사용될 수 있는, (간 분화 유도를 위해 세포 배양 배지를 사용하여 수득된) 실시예에 기재되어 있는 것보다 오히려 분화된 H2스템 자손의 추가 유형이다 (예를 들어, 인슐린을 생산하고 분비하는 분화된 H2스템 자손은 당뇨병 치료를 위해 사용될 수 있다).
미세주입, 전기천공, 인산칼슘과의 공동-침전, 리포솜, 또는 바이러스 형질감염을 비롯한, 간 전구 세포에 적용될 수 있는 종래 유전자 전달 방법을 사용하여 핵산을 H2스템 세포 및 H2스템 자손 내로 도입할 수 있다. 그의 적절한 벡터로의 형질전환 이후에, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 그의 간세포-유사 또는 간-활성 세포로의 분화 이후 및/또는 이전에 (예를 들어, 유전자 요법을 위한 간 전구 세포-기반 모델을 확립하는 범주에서) 상기 세포가 생체내 및/또는 시험관내에서 개선된 및/또는 추가의 생물학적 활성을 수행하도록 하는 핵산을 함유할 수 있거나 재조합 단백질을 발현할 수 있다. 벡터가 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)일 때, 벡터는 최적의 형질도입 효율 조건 및 증식률을 선택하기 위해, 및 그의 발현 프로파일 뿐만 아니라, 그의 안전성을 분석하기 위해 그의 역가를 측정함으로써 특징화될 것이다.
간은 다양한 단백질이 혈류 내로 효율적으로 방출되도록 하는 방식으로 해부학적으로 순환계와 연결되어 있다. 따라서, H2스템 세포 및 H2스템 자손의 효능을 추가로 개선시키기 위해서 (특히 전신 투여되는 경우, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 복강내 주사) 뿐만 아니라, 생체내 투여되었을 때, 그의 이식 및 유지를 위해, 전신 영향을 미치는 단백질을 코딩하는 유전자를 H2스템 세포 및 H2스템 자손 내로 삽입할 수 있다 (특히, 3차원 세포 클러스터를 수득하기 위해 배양하기 이전에). 관련 마우스 모델을 사용하여 실시예 4에서 보여주는 바와 같이, H2스템 세포는 고수준의 간 조직으로의 이식, 귀소 및 간 분화를 보이고, 이에 따라 잠재적으로 외인성 단백질의 효율적인 투여 수단을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 간 세포의 유전자 생성물의 순환 내로의 분비를 위해 호르몬 또는 항체를 코딩하는 다양한 유전자를 본 발명의 간 세포 내로 삽입할 수 있다. 특히, 정상적으로는 간세포에 의해 발현되나 (및 가능하게는 이러한 세포에 의해 이미 발현된), 환자에서는 결함 또는 부재 (이러한 결함이 간 대사의 선천성 이상에서와 같이, 환자의 병적 상태의 기초가 됨)하는 단백질을, 구성적으로 또는 일과적으로 과다발현하여 이후, 단백질 생산 수복에 도움을 주고, 이에 의해, 환자 치료에 도움을 주도록 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 변형시킬 수 있다. 이러한 단백질의 예는 대사 단백질, 예컨대, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신테타제, 아르기니노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 카르바밀 포스페이트 신타제, N-아세틸 글루타메이트 신타제, 글루타민 신테타제, 글리코겐 신테타제, 글루코스-6-포스파타제, 알칼리성 포스파타제, 숙시네이트 데히드로게나제, 글루코키나제, 피루베이트 키나제, 아세틸 CoA 카르복실라제, 지방산 신테타제, 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 글루타메이트 데히드로게나제, 페리틴, 저밀도 지질단백질 (LDL) 수용체, 시토크롬 P450 효소, 알데히드 데히드로게나제, 및/또는 알콜 데히드로게나제이다.
대안적으로, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 분비형 혈장 단백질, 예컨대, 알부민, 성장 인자 또는 호르몬, 인슐린, 트랜스페린, 보체 단백질 (예컨대, 성분 C3), 알파2-마크로글로불린, 피브리노겐 알파/베타/감마 쇄, 응고 인자 (인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 XI, 인자 XIII, 인자 IX), 알파-1-항트립신 등을 코딩하는 DNA를 도입함으로써 변형될 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손을 생성할 때 수득되는 생물학적 물질은 특정 용도, 특히, 상이한 의학적 적용을 가질 수 있는 생물학적 실재물을 확인하는데 추가로 사용될 수 있다. 이러한 생물학적 물질은 특이적 마커, 활성, 및/또는 형태 (실시예 3 및 4에서 결정됨 바와 같음)를 보이는 H2스템 세포의, 또는 H2스템 자손의 하위집단 (또는 세포주) 뿐만 아니라, 중간 또는 최종 생성물로서 수득되는 임의의 다른 생물학적 실재물, 예컨대 의학적 관심 세포를 검출하기 위한 바이오마커로서, 또는 의학적 관심 활성 또는 분포를 보이는 화합물로서 사용될 수 있는 단백질, 대사물, 세포 소포체, 및/또는 핵산을 포함하는, 조건화된 세포 배양 배지 (예를 들어, 세포 배양물 상청액의 형태) 및 상기 세포 및 배지의 분획을 포함한다. 비록 상기 접근법은 직접적으로 관심 세포를 사용하여 진행될 수 있지만, 세크리톰에 관한, 및 특히 H2스템 세포의, 및 H2스템 자손의 주변분비 효과에 관한 관련 정보를 제공할 수 있는 조건화된 세포 배양 배지의 내용물을 측정함으로써 추가 정보가 추가로 측정될 수 있다.
H2스템 세포 또는 H2스템 자손의 관련 생물학적 특징은 기술, 예컨대, 유동 세포측정법, 면역세포화학, 질량 분광분석, 겔 전기영동, 면역검정 (예를 들어, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역침전, ELISA), 핵산 증폭, 효소 활성, 오믹스(omics) 기술 (프로테오믹스, 글리코믹스, 트랜스크립토믹스, 메타볼로믹스) 및/또는 다른 생물학적 활성을 사용함으로써 확인할 수 있다. 특히, 기술, 예컨대, 게노믹스, 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스, 리피도믹스, 글리코믹스 등은 줄기 또는 전구 세포, 및 특히, 간 전구 세포에 대해 공개된 데이터베이스 및 다른 데이터세트를 사용하여 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 비교하기 위한 추가의 수단을 제공할 수 있다 (Yu J, et al., 2012; Santamaria E, et al., 2012; Slany A, et al., 2010; Sison-Young R et al., 2015). 이러한 방식으로, 단백질, 예컨대, SUSD2는, 그의 H2스템 세포에서의 유의하게 더 높은 존재가 그를 ADHLSC 세포와 기원이 유사한 세포와 구별하는 (또는 반대 방향으로, 도 10에 제시된 바와 같이, CD140b 발현의 부재가 H2스템 세포를 ADHLSC 세포와 구별하는) 마커로서 확인될 수 있다. H2스템 자손 제제의 초기 단계 또는 그 후 동안 (예를 들어, H2스템 자손의 산업적으로 제조된 배치의 비교 및 검증 또는 제약 용도에 대한 적합성의 평가를 위해) 사용될 수 있는 추가의 마커는 CD49b, CD51이며, 하기 표 2의 목록의 군의 단백질 중 1종 이상을 수반하거나 수반하지 않는다.
이러한 접근법은 생체내 또는 시험관내에서 성체 간 전구 세포와 관련된 신규한 바이오마커를 정의하기 위한 (예를 들어, 세포 집단의 제조 및 사용 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 그의 양, 품질, 및 균질성을 확립하기 위한) 수단을 제공할 수 있다. 특히, 바이오마커는 일반적으로 또는 특정 단백질, 지질, 효소, 인지질, 및/또는 글리칸을 나타내는 세포의 농도와 함께 조합하여, 생물학적 샘플 중 또는 세포 배양물 중 주어진 세포 집단 (H2스템 세포 및/또는 H2스템 자손)의 농도에 의해 정의될 수 있다. 이러한 바이오마커는 펩티드, 단백질, 인지질, 지질, 핵산, 글리칸, 또는 상기 효소 성분의 임의의 조합에 상응할 수 있다. 바이오마커는 주어진 용도를 위해 (예를 들어, 특정 간 질환 치료를 위해, 화학적 작용제 및/또는 핵산 벡터를 이용한 변형 또는 시험관내 분화 이후에 간-활성 세포 유형을 수득하기 위해, 특정 화합물의 대사를 평가하기 위해), 특히 상이한 공여자로부터 수득한 H2스템 자손과 비교하고/거나 상이한 제조 방법을 적용할 때, H2스템 세포 또는 H2스템 자손인 세포 집단의 적합성을 평가하는데 특이적일 수 있다. 다르게는, 바이오마커를 통해 공여자 및/또는 샘플을 선택할 수 있을지 확립하기 위하여 주어진 간 조직 (또는 새로운 또는 동결보존된 간 세포의 샘플)이 (예를 들어, 간 조직의 뱅크 및 다른 간 기원의 생물학적 샘플의 라이브러리, 예컨대, 단백질 추출물 및 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써) H2스템 세포를 보다 효율적으로 수득하는데 적절한지 여부를 평가할 수 있다.
"바이오마커" 또는 "마커"라는 용어는 객관적으로 측정되고, H2스템 세포 및/또는 H2스템 자손을 특징화하는 것과 같이 평가되는 분자, 파라미터, 특징, 또는 실재물을 의미한다. 특정 샘플 (예컨대 조직 또는 생물학적 유체) 중 H2스템 세포 및/또는 H2스템 자손와 관련된 바이오마커의 정량적 평가는 전체 세포의 정량적 평가, H2스템 세포 및/또는 H2스템 자손이 제조 및 단리될 수 있는 효율, 특정 시험관내 기술, 또는 환자의 특정 의학적 용도 또는 상태와 관련이 있을 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손은 일단 생체내 또는 시험관내에서 분화되고 나면, 또는 심지어 보다 많은 수 및/또는 보다 강력한 간-특이적 활성을 보이는 세포 (즉, 간-활성 세포)로의 완전한 분화를 유도하기 이전에, 목적하는 기간 동안 1차 간세포에 대하여 관찰된 것과 가능한 한 유사한 생물학적 특징 (예컨대, 대사 또는 효소 활성, 항원성 프로파일, 또는 다른 표현형)을 보이는 세포를 필요로 하는 생물학적 검정에서 및 재생 의학에서 사용될 수 있다. H2스템 세포 및 H2스템 자손은 또한 시험관내 적용, 예컨대, 약리학적 또는 독성학적 연구 (예를 들어, 생물학적 또는 화학적 작용제의 스크리닝 및 특징화)를 위해 사용될 수 있다. H2스템 세포 및 H2스템 자손을 통해 (다양한 기원의 전구 또는 줄기 세포로부터 유래된 1차 간세포 및 간세포-유사 세포에 대하여 광범위하게 기재된 바와 같이) 독성, 약리학 및 약물 유전학의 시험관내 및 동물 모델을 확인할 수 있거나, 또는 생체내 및/또는 시험관내에서 특히, 간 질환의 진단, 예방, 및/또는 치료와 관련하여, 의학적 관심 세포 집단을 확인하기 위한 바이오마커를 확인할 수 있다.
본원에 사용된 "시험관내"라는 용어는 동물 또는 인간 신체 바깥쪽 또는 외부를 의미한다. 본원에 사용된 "시험관내"라는 용어는 "생체외"를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. "생체외"라는 용어는 전형적으로 동물 또는 인간 신체로부터 제거되고, 신체 바깥쪽에서, 예컨대, 배양 용기 또는 생물반응기에서 유지 또는 증식되는 조직 또는 세포를 의미한다.
H2스템 세포 및 H3스템 세포가 바람직하게 생체내 적용을 위해 사용될 수 있는 경우, H2스크린 세포, H3스크린-1 세포, 및 다른 카테고리의 H3스크린-2 세포에 상응하는 H2스템 자손은 바람직하게 약물 발견/검증을 위한 분화된 간세포-유사 또는 간-활성 세포로서 사용될 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손 (또는 그를 생성할 때 수득되는 상응하는 생물학적 물질)는 그를 포함하는 조성물에, 및 특히, 새로운 세포 또는 장기간 저장에 적합한 세포 (예를 들어, 동결보존된 세포)로서 이러한 세포를 포함하는 조성물 형태로 (인간에서 또는 동물 모델에서) 생체내 투여를 위한 치료 방법에서, 또는 시험관내 적용에서 사용될 수 있는 제약 조성물로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 포함하는 조성물은 적어도 103; 106, 109개 또는 그 초과의 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포-기반 조성물은 또한 추가의 치료, 진단, 또는 임의의 다른 유용한 효과를 제공할 수 있는 생물학적 (예를 들어, 항체 또는 성장 인자) 또는 화학적 기원 (예를 들어, 약물, 세포 보존 또는 표지 화합물)의 다른 작용제를 포함할 수 있다. 문헌은 추가의 특정 완충제, 성장 인자, 또는 아주반트를 포함할 수 있는 세포-기반 제약 조성물 (여기서, 조성물의 각 성분의 양은 (마이크로그램/밀리그램, 부피, 또는 백분율로) 정의됨)과 상용성인 임의적 첨가제, 부형제, 비히클, 및/또는 담체 뿐만 아니라, 그를 H2스템 세포 및 H2스템 자손와 조합하는 수단에 관한 여러 예를 제공한다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손은 선택되는 투여 방법에 따라 세포가 여기서 시험관내 및/또는 생체내에서 성장 및 분화될 수 있는, 세포의 생착 및 기능을 허용하는 생체인공 간 장치, 천연 또는 합성 매트릭스, 또는 다른 시스템을 비롯한, 세포 현탁액, 스폰지, 또는 다른 3차원 구조일 수 있는 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 특히, H2스템 세포 및 H2스템 자손은 주사 (카테터 투여 또한 포괄) 또는 이식을 통해, 예를 들어 국소화된 주사, 전신 주사, 비장내 주사, 관절내 주사, 복강내 주사, 문맥내 주사, 간 속질, 예를 들어 간 피막 아래로의 주사, 비경구 투여, 또는 배아 또는 태아로의 자궁내 주사를 통해 투여될 수 있다. 전신 및 비-국부 주사되는 경우에, H2스템 생성물은 이러한 H2스템 세포가 혈류에서 이동하여 원위 위치 (예컨대 내부 기관 또는 관절)에 생착되거나 또는 H2스템 세포에 의해 분비된 단백질이 혈류 덕분에 특정 세포 유형에 도달하기 때문에 원위 위치에 영향을 미칠 수 있다. 게다가, H2스템 세포 및 H2스템 자손은, H2스템 세포 또는 H2스템 자손 (예컨대 다른 줄기 세포, 1차 인간 세포, 예컨대 분화된 간세포, 또는 줄기 세포로부터 유래된 세포 유형)가 시딩되는 강성, 플라스틱 외부 쉘 및 중공 반투과성 막 섬유가 있는 간 관류 또는 간 보조 장치와 같은 해독 장치의 생물학적 성분으로 사용될 수 있다. 체액은 널리 공지된 방법에 따라 해독 장치를 통해 관류된 후, 환자에게 돌아갈 수 있다.
H2스템 세포, H2스템 자손 또는 그를 함유하는 조성물은 간내 또는 간외 위치에서 간 세포 이식 (LCT)을 통해 조직 조작 및 세포 요법을 위해 (간 또는 다른 기관 및 조직의 사전 또는 후속 이식에 대한 면역 반응을 조절하기 위한 것 포함) 사용될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 인간 기원의 H2스템 세포, 인간 기원의 H2스템 자손, 또는 그를 함유하는 조성물을 동물에 이식함으로써 인간 간 질환의 동물 모델이 또한 수득될 수 있고, 여기서 화합물이 인간 간세포에 미치는 효과는 동물 모델에서의 효과로부터 보다 효과적으로 평가되고 구별될 수 있다.
H2스템 세포 또는 특정 H2스템 자손을 포함하는 치료 조성물을 투여할 때, 이는 일반적으로 단위 투여량으로 제제화될 수 있다. 임의의 경우에서, 예를 들어, 세포를 생체중합체 또는 합성 중합체 내로 도입함으로써 H2스템 세포 또는 H2스템 자손의 생존가능성을 보장하는, 환자에게 세포를 투여하는 공지된 방법을 적합화시키고/거나, 작용제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 생체중합체의 예는 피브로넥틴, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 콜라겐, 및 프로테오글리칸 라미닌, 부착 분자, 프로테오글리칸, 히알루로난, 글리코사미노글리칸 쇄, 키토산, 알기네이트, 상기 단백질로부터 유래된 천연 또는 합성적으로 변형된 펩티드, 및 합성, 생체분해성 및 생체적합성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 조성물은 시토카인, 성장 인자를 포함하거나, 또는 포함하지 않고 제조될 수 있고, 그 안에 세포가 포매되어 있는 현탁액으로서, 또는 3차원 겔로서 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 생성하기 위해 간 조직의 임의의 공여자를 사용하는 것 뿐만 아니라, H2스템 세포를 제조하고 단리시켜 H2스템 자손 또는 그를 함유하는 조성물을 생성하기 위해 환자 그 자신의 간 조직을 사용하는 것을 또한 고려한다. 이러한 세포는 환자에게 자가적일 것이며, 이는 환자에게 용이하게 투여될 수 있다. 다르게는, H2스템 세포는 환자 그 자신의 것이 아닌 조직으로부터 제조되고 단리될 수 있다. 이러한 세포를 환자에게 투여하는 것이 고려될 때, H2스템 세포를 수득하는 본 발명의 방법의 대상이 되는 간 조직은 예컨대, 적어도 달성가능한 제한 범위 이내에서 환자와 투여되는 세포 사이의 조직 적합성을 최대화시킴으로써 환자의 면역계에 의한 투여된 세포 거부 (예컨대, 이식 대 숙주 거부)의 기회를 감소시키기 위해 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손의 치료학적 용도에 관한 문제는 최적의 효과를 달성하는데 필요한 세포의 양이다. 투여 용량은 가변적일 수 있고, 초기 투여에 이어 후속 투여를 포함할 수 있고; 본 개시내용의 교시를 적용시킴으로써 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다. 전형적으로, 투여되는 용량 또는 용량들은 치료상 유효량의 세포를 제공할 것이며, 이는 투여되는 세포 양의 최적화를 필요로 할 수 있다. 따라서, 투여하고자 하는 세포의 양은 치료받는 대상체에 따라 달라질 것이다 (예컨대, 사이클에서, 또는 전체 치료 사이클 동안 매 치료마다 102 내지 1010개 세포). 그러나, 치료상 유효 용량에 관한 정확한 결정은 환자의 크기, 연령, 조직 손상 크기, 및 손상이 발생된 이후의 시간의 양을 비롯한, 각 환자에 대해 개별적인 인자에 기초할 수 있다.
바람직하게는, H2스템 세포 또는 특이적 H2스템 자손을 포함하는 조성물은 상기 정의된 바와 같이 실질적으로 동종 세포 집단을 함유하여야 하고, 결과적으로 각 용량 내의 세포의 양은 조정될 수 있다. 특히, 조성물이 3차원 세포 클러스터를 형성하는 H3스템 세포 또는 임의의 다른 H2스템 자손을 포함할 때, 이러한 조성물은 투여되는 세포 클러스터를 직경이 주어진 범위 (예를 들어, 50 μm 내지 200 μm 또는 50 μm 내지 100 μm) 이내인 것, 또는 주어진 크기 (예를 들어, 100 μm, 200 μm, 500 μm, 또는 1,000 μm) 미만/초과인 것으로 선택하고/거나, 주어진 수의 세포 (예컨대, 적어도 10,000, 20,000, 50,000, 100,000개 또는 그 초과)를 포함함으로써 세포의 (또는 세포 클러스터의) 전체 수 뿐만 아니라, 그의 크기에 기초하여 제조될 수 있다.
H2스템 세포 또는 H2스템 자손 투여 또는 이식 후, 그의 분포, 분화, 및/또는 증식 (뿐만 아니라, 상이한 치료제의 투여 이후/이전의 그의 활성)이 결정될 수 있고, 인간 대상체에서, 또는 동물 모델 (바람직하게는, 설치류)에서 시험될 수 있다. 예를 들어, H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 비장내로 이식받은 SCID 마우스의 간 분석은 이들 세포가 인간 마커의 검출에 의해 간에 이식되어 기관을 재증식시킬 수 있고, 인간 알부민, 또는 임의의 다른 전형적인 인간 간-특이적 마커 (또는 투여된 H2스템 세포 또는 H2스템 자손에서 앞서 형질감염된 재조합 유전자)의 검출에 의해 활성인 성숙한 간세포로 분화될 수 있다는 것을 입증할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 간 질환 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 H2스템 세포, H2스템 자손 또는 그를 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 간 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법이다. H2스템 세포 및 H2스템 자손은 문헌에 따라, 간 질량 손실 및/또는 관찰되고, 상이한 카테고리로 분류될 수 있는 기능을 고려할 때, 간 이식, 간세포 이식, 또는 간 재생을 필요로 하는 간 질환, 특히 대상체에서 간 기능의 영구적 (또는 한시적) 재확립을 필요로 하는 것을 치료하는데 사용될 수 있다.
간 질환 치료 방법은 간 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 H2스템 생성물, 예컨대, H2스템 세포 또는 주어진 H2스템 자손 및 바람직하게는 조성물 내의 것을 투여하는 단계를 포함한다. 특히, 질환, 바람직하게는 간 질환, 예컨대, 선천성 간 대사 이상, 유전성 혈액 응고 장애, 진행성 가족성 간내 담즙정체 1/2/3형, 알파 1-항트립신 결핍, 간 세포 수송체의 결함, 포르피린증, 지방간 또는 다른 섬유증 간 질환, 원발성 담즙성 간경변증, 경화성 담관염, 퇴행성 간 질환, 또는 급성 또는 만성 간 부전을 그의 치료를 필요로 하는 환자에서 치료하는 방법은 환자에게 유효량의 H2스템 생성물을 투여하는 단계를 포함한다. 간 질환의 제1 카테고리는 아미노산 대사 이상 (예컨대, 단풍 당밀뇨 질환, 페닐케톤요증, 티로신혈증, 프로피온산혈증, 유기 산뇨증, 및 요소 사이클 장애, 예컨대 아르기니노숙신산뇨증, 카르바모일-포스페이트 신타제 I 결핍, 시트룰린혈증, 고아르기닌혈증, 및 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 결핍), 금속 대사 이상 (예컨대, 윌슨병 또는 혈색소증), 및 탄수화물 대사 이상 (예컨대, 글리코겐 축적 질환 I/II형, 프룩토스혈증, 또는 갈락토스혈증), 리소좀 장애 (예컨대, 울만병(Wolman disease), 니만 피크병(Niemann Pick disease)), 퍼옥시좀 장애 (예컨대, 레프숨병(Refsum Disease)), 가족성 고콜레스테롤혈증 및 다른 지질 대사 장애, 미토콘드리아 질환 (예컨대, 피루베이트 카르복실라제 결핍), 및 고빌리루빈혈증 (예컨대, 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar Syndrome), 길버트 증후군, 또는 듀빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome))으로 추가로 구별될 수 있는 선천성 간 대사 이상에 의해 대표된다. 제2 카테고리는 유전성 혈액 응고 장애, 예컨대, 인자 V 결핍, 인자 VII 결핍, 인자 VIII 결핍, 인자 IX 결핍, 인자 XI 결핍, 인자 XIII 결핍 및 불충분한 양의 다른 응고-관련 인자 (다른 응고 인자 및 피브리노겐 알파/베타/감마 쇄 포함) 또는 간에 의해 특이적으로 발현되고, 혈류 내로 분비되는 다른 단백질 (예컨대, 알부민)에 기인하는 다른 결핍에 의해 대표된다. 제3 카테고리는 응고 또는 대사 결핍과 직접적인 관련이 없는 다른 간 질환에 의해 대표되고, 진행성 가족성 간내 담즙정체 1/2/3형, 알파-1-항트립신 결핍, 카롤리병, 간 세포 수송체 결함, 포르피린증 (예컨대, 급성 간헐성 포르피린증), 지방간 및 다른 섬유증 간 질환 (NASH/NAFLD), 원발성 담즙성 간경변증, 경화성 담관염, 간 퇴행성 질환, 또는 급성 또는 만성 간 부전 (예를 들어, 간 절제술 후, 전격성, 바이러스에 의해 유도된, 급만성 간 부전)을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, H2스템 생성물은 또 다른 생성물 (예컨대 약물, 치료제, 또 다른 세포 유형, 또는 다른 생물학적 물질)과 조합하여 투여 또는 사용될 수 있다. 이는 본원에 기재된 임의의 투여 및 치료 용도에 적용된다. 특히, 다른 치료 생성물은 실질적으로 H2스템 생성물과 동일한 시간에 (동일한 제약 조성물 내에서 또는 별개의 제약 조성물로) 또는 상이한 시간에 (별개의 제약 조성물로 및 임의의 순서 또는 빈도로) 투여될 수 있다. 다른 치료 생성물이 H2스템 생성물과 개별적으로 투여되는지 또는 그렇지 않은지에 상관없이, 생성된 효과는 상승작용적일 수 있으며, 즉 효과는 예상되는 합산 효과보다 우수하고, 이러한 성분 중 하나의 부정적 효과가 완화 또는 제거되고/거나 이러한 성분 중 하나의 긍정적 효과가 이를 보다 낮은 양으로 또는 보더 덜 빈번하게 투여하여 얻어진다.
H2스템 생성물이 H2스템 자손인 경우에, 이들 세포는 또 다른 세포 유형 (예를 들어, 1차 인간 간세포, ADHLSC 세포, 또는 1차, 줄기, 중간엽, 및/또는 전구 세포인 또 다른 인간 세포 유형 또는 집단, 예컨대 WO2006126219에 기재된 것 및 간 기원의 다른 전구 또는 줄기 세포) 또는 그의 상응하는 조건화된 세포 배양 배지와 조합되어 세포 배양물 상청액의 형태로 투여될 수 있다 (시험관내 조건에서 사전에 공동-배양되거나 또는 그렇지 않음). H2스템 세포와 또 다른 세포 유형의 조합은 인간 신체 내에서 하나의 및/또는 다른 세포 유형의 치료 효능, 생착, 귀소, 재증식, 증식, 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다. H2스템 자손은 이러한 또 다른 세포 유형을 또한 포함하는 제제의 일부로서 투여될 수 있거나, 또는 다른 세포 유형과 개별적으로, 그러나 조합하여, 예컨대 순차적으로 또는 동시에 (임의의 순서로) 투여될 수 있다. 2가지 세포 유형이 세포의 현탁액 또는 공동-배양물로서, 또는 생물인공 간 장치, 및 인간 신체에서 이들 세포의 유지를 지속시키는 천연 또는 합성 매트릭스를 포함하는, 세포가 시험관내 및/또는 생체내에서 성장, 증식 및 분화할 수 있는 스폰지 또는 다른 3차원 구조 내에서 투여될 수 있다. H2스템 세포와 또 다른 세포 유형의 조건화된 세포 배양 배지의 조합은 인간 신체 내에서 개선된 치료 효능, 생착, 증식, 및/또는 안정성을, 다른 세포 유형의 조건화된 세포 배양 배지의 조성과 관련된 추가의 유용한 특성과 함께 또는 이들 없이, 갖는 H2스템 자손을 제공할 수 있다.
대안적으로, H2스템 생성물이 H2스템 자손의 조건화된 세포 배양 배지인 경우에, 이 제제는 또 다른 세포 유형 (예를 들어, 1차 인간 간세포, ADHLSC 세포, 또는 1차, 줄기, 중간엽, 및/또는 전구 세포인 또 다른 인간 세포 유형 또는 집단, 예컨대 WO2006126219에 기재된 것 및 간 기원의 다른 전구 또는 줄기 세포) 또는 그의 상응하는 조건화된 세포 배양 배지와 조합되어 투여될 수 있다. H2스템 자손의 조건화된 세포 배양 배지와 또 다른 세포 유형의 조합은 인간 신체 내에서 이러한 후자의 세포 유형의 생착, 안정성, 귀소, 증식, 재증식, 및/또는 안정성을 개선시킬 수 있다. 다시, H2스템 생성물은 이러한 또 다른 세포 유형을 또한 포함하는 제제의 일부로서 투여될 수 있거나, 또는 다른 세포 유형과 개별적으로, 그러나 조합되어, 예컨대 순차적으로 또는 동시에 (임의의 순서로) 투여될 수 있다. 여전히 대안적으로, H2스템 자손의 조건화된 세포 배양 배지와 또 다른 세포 유형의 조건화된 세포 배양 배지의 조합은 개선된 치료 효능, 잠재적으로는 여기에 함유된 분비된 단백질의 조합 효과를 갖는 용액을 제공할 수 있다. 다시, H2스템 자손의 조건화된 줄기 세포 배양 배지는 이러한 또 다른 조건화된 세포 배양 배지를 또한 포함하는 제제의 일부로서 투여될 수 있거나, 또는 다른 배지와 개별적으로, 그러나 조합되어, 예컨대 순차적으로 또는 동시에 (임의의 순서로) 투여될 수 있다.
H2스템 생성물의 투여 또는 치료 용도 (WO2015001124에 기재된 바와 같은 ADHLSC 세포 또는 ADHLSC 세포의 조건화된 세포 배양 배지의 투여 및 치료 용도와 유사하게)는 또한 예상하지 못한 긍정적 효과를 제공할 수 있다. 특히, H2스템 자손 또는 H2스템 자손으로부터 수득한 조건화된 세포 배양 배지의 투여 또는 치료 용도는 유전성 질환을 치료하기 위해 특별히 요구되는 단백질, 예컨대 대사 효소 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카르브아밀라제 또는 UDP-글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1) 또는 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 또는 인자 XI)의 투여와 조합될 수 있다. 이러한 단백질 또는 응고 인자는 H2스템 생성물에 의해 (또는 ADHLSC 세포 또는 상응하는 조건화된 세포 배양 배지에 의해) 제공되고 동일한 대사 경로 또는 생리학적 기능 (예를 들어, 혈액 응고)에 관여하는 단백질 및 효소와 함께 사용될 수 있으며, 이로부터 상승작용적 효과를 얻을 가능성이 있다. H2스템 생성물이 상기 논의된 바와 같이 또 다른 생성물과 조합되어 투여 또는 사용되는 경우에, 다른 생성물은 따라서 유전성 질환을 치료하기 위한 이러한 단백질, 예컨대 대사 효소 또는 응고 인자일 수 있다. 게다가, 제약 조성물은 H2스템 생성물을 고농도 (적절한 상업적 용액, 예컨대 크리오스토르 중 10 x 106개/ml, 50 x 106개/ml, 100 x 106개/ml 또는 그 초과)로 동결보존시켜 생성될 수 있으며, 이를 해동시키고, 제약 조성물을 동결보존 바이알 내에서 (기밀 환경을 요구하지 않고 보다 덜 실행적인 요건에서) 적절한 희석제로 직접 재구성하여 환자에게 투여한다.
이러한 접근법은 효소 또는 응고 인자 결핍을 치료하는데 통상적으로 사용되는 바와 같은 단리된 재조합 단백질의 투여보다 긴 및/또는 개선된 치료 효과를 제공하는 제약 조성물을 제공할 수 있다. 제약 조성물은 따라서 (a) 본원에 기재된 바와 같은 H2스템 생성물, 예컨대 H2스템 자손 또는 그의 조건화된 배양 배지, (b) 본원에 기재된 바와 같은 또 다른 생성물, 예컨대 약물, 치료제, 또 다른 세포 유형, 또는 다른 생물학적 물질, 보다 특히 유전성 질환을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 대사 효소 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카르브아밀라제 또는 UDP-글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1) 또는 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 또는 인자 XI) 및 (c) 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이러한 범주에서, 특정 유형의 H2스템 생성물 및 ADHLSC 세포 (예컨대, 그의 하위집단, 세포주, 및 분획)가 주어진 대사 경로 또는 생리학적 기능 (예를 들어, 혈액 응고)에 관여하는 일련의 단백질에 대해 가장 적절한 생산 수준 (절대값으로서 및/또는 이러한 단백질 사이에서의 비로서)을 보이기 때문에 제조 방법 동안 선택될 수 있다. 예를 들어, H2스템 세포 또는 ADHLSC 세포의 특정 하위집단 (및 관련 제조 방법)은 상이한 유형의 혈액 응고 결핍 중 하나, 예컨대 혈우병 (유형 A는 인자 결핍과 연관되고; 유형 B는 인자 IX 결핍과 연관되고; 유형 C는 인자 XI 결핍과 연관됨; 출혈 장애 및 그의 치료적 관리에 대한 검토를 위해 문헌 [Kabel A 2014] 참조)에 적절한 다중 응고 인자 (예를 들어, 외인성 인자인 인자 V, 인자 VII, 및 인자 X 중 2종 이상 및/또는 내인성 인자인 인자 VIII, 인자 XI, 인자 XIII, 인자 XII, 및 인자 IX 중 2종 이상)의 균형을 이룬 발현을 갖는 세포 집단 (세포주로서, 기탁된 세포 제제로서, 또는 달리 저장되어 유지될 수 있음)을 제공하기 때문에 선택될 수 있다.
조성물 내에서, 및 치료 방법에서 일반적으로 H2스템 세포 또는 H2스템 자손 (또는 특정 세포 집단, 예컨대, H3스템 세포)의 용도는 간 질환, 예컨대, 상기 열거된 것에 치료 효과를 제공할 수 있지만, 이는 또한 1차 간세포 또는 간 세포주 대체에서 시험관내 연구와도 관련이 있을 수 있다. 특히, H2스템 자손은 화합물 (예를 들어, 생물학적 또는 화학적 실재물)의 효능 (H2스템 생성물이 간-특이적 또는 비-특이적 질환에 대한 잠재적인 약물 표적을 발현하는 경우), 대사, 안정성, 및/또는 독성을 평가하기 위한 (조기의) 약리학적 및 독성학적 방법에서 사용될 수 있다.
이러한 시험관내 방법 및 용도는 일반적으로 하기 단계를 포함한다:
(a) H2스템 생성물의 제제 (예를 들어, 세포, 세포 추출물, 또는 H2스템 세포 또는 H2스템 자손으로부터 수득된 조건화된 배지 형태의 H2스템 세포 또는 H2스템 자손)를 제공하는 단계;
(b) 상기 H2스템 생성물을 화학적 화합물, 단백질, 핵산, 지질, 당, 금속, 염, 바이러스, 박테리아, 또는 세포로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 성분에 노출시키는 단계; 및
(c) 상기 1종 이상의 외인성 성분이 H2스템 생성물에 미치는 효과를 검출하는 단계 및/또는 H2스템 생성물에의 노출 이후 상기 1종 이상의 외인성 성분의 존재, 국재화, 또는 변경을 검출하는 단계.
H2스템 세포 및 H2스템 자손은 이미 등록된 약물, 여전히 개발 중인 및 간-특이적 효과에 대하여 임상 평가 중인 후보 약물인 화학 물질 대부분, 또는 원치 않는 것 (즉, 간독성 화합물인 경우) 또는 목적하는 것 (H2스템 세포 및 H2스템 자손이 그 자체가 간-특이적 또는 비-특이적 질환, 예컨대, 암에 대한 후보 약물에 대한 표적인 것으로 공지된 효소 및 다른 간-특이적 단백질을 발현한다면, 이때 화합물은 이러한 질환에 대한 후보 약물로서 간주될 수 있음)일 수 있는 간-특이적 효과를 갖는 것으로 의심되는 임의의 다른 화학 물질을 대사시키는 것으로 공지된 효소 및 다른 간-특이적 단백질을 고수준으로 발현한다.
일반적으로, 세포, 세포 추출물, 또는 H2스템 세포 또는 H2스템 자손으로부터 수득된 조건화된 배지 형태의 H2스템 세포 또는 H2스템 자손은 상기 단계 (c)에서 일반적 특징, 예컨대, 세포 형태 또는 생존가능성 (예를 들어, 세포독성 시험에서)의 분석에 의해 화학 물질, 무기 화합물, 생물학적 물질, 박테리아, 바이러스, 또는 세포의 대사, 제거 및 독성에 대하여 평가될 수 있다. 그러나, 대안적 또는 추가 기준, 예컨대 간-특이적 (또는 비-특이적) 단백질의 상향- 또는 하향-조절, 또는 H2스템 생성물 (예를 들어, H2스템 세포, H2스템 자손, 또는 세포 추출물, 또는 H2스템 세포 또는 H2스템 자손으로부터 수득된 조건화된 배지) 내의 단백질의 임의의 변경 (예를 들어, 분해, 응집, 활성화, 또는 억제)이 포함될 수 있다.
대안적으로 (또는 H2스템 세포 또는 H2스템 자손 및 유래된 생물학적 물질에 대해 평가되는 기준과 함께 조합하여), 단계 (c)는 이들 1종 이상의 외인성 성분이 H2스템 세포 또는 H2스템 자손 및 유래된 생물학적 물질에 의해 어떻게 내재화되고/거나, 변형되거나, 또는 그렇지 않은지에 관한 분석을 포함할 수 있다. 이러한 분석적 기준은 문헌에 기재된 바와 같은 외인성 성분의 유형, 예를 들어, 분해, 다른 단백질과의 결합, 세포 배양물 중에서 존속, 응집, 감염성 (바이러스의 경우), 또는 분화 또는 생존가능성 (세포의 경우)에 따라 달라진다.
세포 및 유래된 생성물 (즉, 세포 추출물, 조건화된 배지)을 포함하는 시험관내 검정에 관한 문헌은 세포, 조성물, 및 유래된 생물학적 물질 (즉, H2스템 생성물) 형태의 H2스템 세포 또는 H2스템 자손이 단계 (a)-(c)에서 명시된 바와 같이 시험관내에서 어떻게 사용될 수 있는지에 관한 가이던스, 예컨대, 농도, 타이밍, 배양 및 검정 조건, 및 분석 기술에 관한 가이던스를 제공할 수 있다. 유사한 검정은 또한 단계 (a)에서 동물에 H2스템 세포 또는 H2스템 자손을 도입한 후, 단계 (b)에서 1종 이상의 외인성 성분을 동물에게 투여하여 단계 (c)에서 상기 1종 이상의 성분이 H2스템 세포 또는 H2스템 자손 (또는 관련 생물학적 물질)를 변형시키는지 여부, 및/또는 이들 동물에서 H2스템 세포 또는 H2스템 자손에 의해 변형되는지 여부, 및 이것이 어떻게 이루어지는지를 결정함으로써 수행될 수 있다.
H2스템 생성물, 및 H2스템 세포 및 H2스템 자손은 특히 상기 기재된 바와 같은 키트 내에 상기 기재된 화학 물질 또는 생물학적 물질을 포함하는 생체내 (즉, 이러한 세포의 치료학적 용도를 위한) 및 시험관내 (예를 들어, 약리학적-독성학적 용도를 위한) 방법에 사용될 수 있다. 특히, 키트는 이러한 세포 (또는 유래된 생물학적 물질) 이외에도, 그가 (시험하고자 하는 화합물의 구조, 대사물, 및/또는 농도 중 적어도 하나의 변화로부터 생성되는) 화합물 패널에 노출되었을 때의 그 및 그의 활성을 사용 및/또는 검출하도록 하는 요소 뿐만 아니라, 참조 화합물, 용액, 및/또는 H2스템 세포 및 H2스템 자손 사용을 포함하는 검정에서 관찰되는 효과를 비교 및 평가하는데 도움이 되는 다른 세포를 추가로 포함할 수 있다.
전임상 평가 동안 화학적 실재물을 약물 후보로서 특징화하기 위해서는 (효능, 안전성, 또는 약동학적 성질 이외에도) 관련 대사 경로 뿐만 아니라, 잠재적인 약물-약물 상호작용 (시토크롬 P450-의존성 유도 및 억제와의 것)을 확인하기 위한 약물 대사 평가가 요구된다. 상기 정보는 선도 화합물에 대하여 임상 단계 개발을 계속 진행할지를 결정할 때 제약 산업에 필수적이다. 여전히 약물 후보 대부분이 특히 간독성에 대한 부적절한 독성학적 평가에 기인하여 임상 개발 동안 탈락하고 있기 때문에, 조기의 전임상 개발을 위한 혁신적이고, 신뢰가능하며, 예측적인 시험관내 세포 기반 검정이 절실히 요구되고 있다.
현재 시점에서, 이러한 세포-기반 모델은 인간 1차 간세포, 또는 설치류 또는 인간 간암-유래 세포주 (예컨대, HepaRG 또는 HepG2 세포)에 기초한다. 이용가능한 모델 중 어느 것도 일반적인 약리학적 및 독성 검사에 완전히 만족스럽지는 않다. 인간 간세포 사용은 그의 제한된 이용가능성, 및 신뢰가능한 공급원 및 배양물 중에서의 그의 간 기능을 장기간 유지시키는 것을 확립하는데 있어서의 기술상 어려움에 기인하는 정성적 및 정량적 이유, 둘 모두로 인해 제한된다.
대안적으로, 설치류 세포를 기초로 한 간세포 기반 모델은 인간 간 대사를 최적으로 나타내지 못한다. 이어서, 배양물 중에서 상기 세포는 (그의 중요한 특징, 예컨대, 약물 대사 효소를 계속해서 상실하면서) 빠르게 분화될 수 있고, 수명이 짧을 수 있다 (시험관내에서 확장되지 못함). 인간 간암 유래 세포주는 시험관내 확장이 용이하지만, 대사 및 독성을 측정하는데 중요할 수 있는 완전히 분화된 표현형이 부족하다. 따라서, 신뢰가능한 고처리량의 아만성 및 만성 독성 평가는 이용가능한 인간 간세포 기반 모델을 이용하여 평가될 수 없다. 한편, 급성 및 아급성 독성 스크리닝은 인간 간세포의 제한된 이용가능성 및 그의 확장 불능에 의해 방해를 받는다.
따라서, H2스템 세포 및 H2스템 자손 (특히, 3차원 세포 클러스터를 형성할 때)는 배치에서 배치로 및 배양물 중에서 시간 경과에 따라 안정적인 효소의 간세포-유사 패턴에서 변동성이 제한되어 있고, 특히, "ADMET" (투여, 분포, 대사, 제거 및 독성) 또는 세포독성 시험 (즉, 간세포 생존가능성 및/또는 기능적 효능에 관한 시험)에서 1차 간세포에 대한 대안적 세포로서, 연속적이고, 용이하게 이용가능한 세포를 포함하는 보다 우수한 시험관내 모델을 제공할 수 있다.
H2스템 세포 및 H2스템 자손 (특히, 3차원 세포 클러스터를 형성할 때)는 간 감염 치료 작용제를 검사하는 방법, 또는 특히, 간 및 간세포를 감염시키는 바이러스의 효율적인 복제를 허용하는 방법에서 사용될 수 있다. H2스템 세포 및 H2스템 자손은 바이러스 (예컨대, 간염 바이러스)에의 노출 이전 또는 이후에 분화되고/거나, 유전적으로 변형될 수 있다. 이어서, 감염된 세포 집단은 간염 C 감염, 간 섬유증, 또는 발암과 관련된 다른 간 전구 세포에 대하여 제시된 바와 같이 (Wu X et al., 2012; Wang C et al., 2012; Torres DM and Harrison SA, 2012), (예컨대, 바이러스 복제에 대한) 임의의 유용한 효과를 관찰하기 위하여 미리 결정된 양의 감염 치료용의 후보 화합물에 노출될 수 있거나, 바이러스 입자를 정제하는데 사용될 수 있거나, 또는 바이러스 감염의 임의의 잠재적인 생체내 효과를 평가하는데 사용될 수 있다.
본원에서 구체적으로 언급된 모든 참고 문헌의 교시는 참조로 포함된다. 이제, 본 발명은, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 한정하지 않는 하기 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 1차 간 조직으로부터의 H2스템 세포 및 H2스템 세포 자손의 제조 및 특징화
물질 & 방법
세포 배양용 배지 및 다른 물질
하기 물질을 사용하였다: 윌리엄스 E 배지 (카탈로그 번호 22551022, 인비트로젠), 고 농도의 글루코스 (4.5 g/l) 및 L-글루타민을 포함하는 DMEM (고 글루코스 DMEM, 카탈로그 번호 41965047, 인비트로젠), IMDM (카탈로그 번호 21980032, 인비트로젠), 페놀 레드를 포함하지 않는 IMDM (카탈로그 번호 21056023, 인비트로젠), 간세포 배양 배지 (HCM; 카탈로그 번호 CC-3198, 론자(Lonza)), 소 태아 혈청 (FBS; 카탈로그 번호 F7524, 시그마(Sigma)), 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF; 카탈로그 번호 AF-100-15, 페프로테크(Peprotech)), 재조합 인간 간세포 성장 인자 (HGF; 카탈로그 번호 100-39, 페프로테크), 재조합 인간 온코스타틴 M (OSM; 카탈로그 번호 300-10, 페프로테크), 재조합 인간 인슐린 (INS; 카탈로그 번호 HI0219, 릴리(Lilly)), 인슐린-트랜스페린-셀레늄-G 보충물 (ITS; 카탈로그 번호 41400045, 인비트로젠), 인간 알부민 (50 g/L, 카탈로그 번호 1501466 박스터(Baxter)), 헤파린 소듐 (헤파린 LEO®) 덱사메타손 (Dex; 카탈로그 번호 D4902, 시그마), 액체 페니실린/스트렙토마이신 (P/S; 카탈로그 번호 15070063, 인비트로젠), 래트 꼬리 콜라겐 I-코팅된 T-75 플라스크 (바이오코트(Biocoat), 카탈로그 번호 356485, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)), 벤트 캡이 장착된 코닝(Corning)® 셀바인드® 75cm2 직사각형 경사진 목형 세포 배양 플라스크 (카탈로그 번호 3290, 코닝).
1차 인간 간 세포 제조
인간 간 세포를 수득하는 방법은 이전 공개 문헌 (Najimi M et al., 2007)을 최소로 변형시켜 그에 기초하여 이루어진다. 제거 후, 먼저 간을 간문맥에 연결된 캐뉼라를 통해 빙냉 비아스판 용액 (브리스톨 마이어스 스큅 파마슈티칼즈(Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals))으로 플러싱한 후, 간 세포 단리를 위해 냉 멸균 조건에서 청정실로 옮겼다. 모든 미생물 오염은 단리 공정 이전, 그 동안, 및 그 이후에 엄격하게 제어하였다. 청정실에서 멸균 층류하에 2 단계 콜라게나제 관류 기술을 사용하여 인간 간 세포 단리를 수행하였다. 제1 관류는 37℃예열된, 0.5 mM 에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA; 시그마), 2 mg/L 젠타마이신, 100,000 UI/L 페니실린 G로 보충된, 칼슘 무함유 및 마그네슘 무함유의 EBSS 용액 (카탈로그 번호 14155-063, 라이프 테크(Life Tech))으로 이루어졌다. 이러한 제1 관류를 통해 세포외 이온 칼슘이 제거되고, 실질의 세포내 연접부는 약화될 수 있다. 제2 단계는 5 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES; 카탈로그 번호 11344-041, 라이프 테크.), 0.03 mg/mL의 트립신 억제제 (카탈로그 번호 10109878001, 로슈 어플라이드 사이언시즈), 2 mg/L 젠타마이신, 및 100,000 UI/L 페니실린 G로 보충된, 칼슘 함유 및 마그네슘 함유의 EBSS 용액 (카탈로그 번호 24010-043, 라이프 테크.) 중에 희석된 0.8 mg/mL 콜라게나제 (카탈로그 번호 11213857001, 로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences))를 이용한 효소 소화를 포함하였다. 이들 완충제의 조성은 추가 또는 대안적 GMP-등급의 시약 (예컨대, 특이적 효소 또는 N-아세틸시스테인)을 사용함으로써 실제 우수 의약품 제조 공정(Good Manufacturing Process) 요건에 맞게 적합화시킬 수 있다.
각 관류 단계는 간을 완전히 분해한 후, 기계적으로 파괴시키기 전 대략 10분이 소요되었다. 27.5 μg/mL 트립신 억제제, 0.05% 인간 알부민, 2.4 mg/L 젠타마이신, 100,000 UI/L 페니실린 G를 함유하는 냉 M199 용액 (론자)으로 소화된 실질을 세척하여 잔류 콜라게나제 활성을 중단시켰다. 소화된 간 세포 현탁액을 4.75 내지 0.25 mm 공극의 철망을 통해 여과시킨 후, M199 용액으로 3회에 걸쳐 세척하고, 4℃에서 3분 동안 저속 (예를 들어, 1,200 rpm)으로 원심분리하여 세포 파편과 대다수의 비-실질 세포를 제거하였다. 세포를 750 ml의 비아스판 용액, 16 mg 덱사메타손, 40 UI 인슐린 0.5% HEPES, 1 g/L 글루코스, 15%, 인간 알부민 20%, 10% DMSO에 첨가하여 제조된 동결보존 배지 중에 현탁시킨 후, 인간 세포의 장기간 저장 및 보존을 위해 적절한 바이알, 백, 또는 다른 시스템을 사용하여 액체 질소 중에 유지시킨다. 또한, 이 단계에서, 상기 완충제의 조성은 추가 또는 대체 GMP-등급의 시약을 사용함으로써 실제 우수 의약품 제조 공정 요건에 맞게 적합화시킬 수 있다.
생성된 간 세포 제제는 대개 실질 분획으로부터의 간세포에 의해 구성되며, 이 각각은 (제제의 부피 및/또는 특이적 인간 간에 따라) 106-109개 세포를 함유한다. 동결보존된 간 세포 현탁액은 그를 37℃에서 신속하게 해동시키고, 이를 2.5 g/L 글루코스, 0.084 g/L 바이카르보네이트 및 5,000 IE/UI/ml 헤파린 LEO®로 보충된 10x 부피의 인간 알부민 5% 중에서 2회 세척함으로써 사용된다. 224 g로 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 세포 펠릿을 필요한 세포 배양 배지 중에 현탁시킨다.
ADHLSC 세포 제조
ADHLSC 세포를 앞서 기재된 방법 (Najimi M et al., 2007; Khuu DN et al., 2011)을 최소로 변형시키거나, 또는 변형시키지 않고 그 방법을 적용시켜 수득한다. 간략하면, 간 세포 제제를 10% FBS, 25 ng/ml EGF (제조가 셀바인드에서 수행된 경우에 EGF는 세포 배양 배지 중에 존재하지 않을 수도 있다), 10 μg/ml INS, 1 μM DEX 및 1% P/S로 보충된 윌리엄스 E 배지 중에 재현탁시킨다. 세포를 래트 꼬리 콜라겐 I-코팅된 플라스크 또는 코닝 ® 셀바인드® 플라스크 상에서 배양하고, 5% CO2를 함유하는 완전히 습윤화된 대기 중 37℃에서 배양한다. 24시간 후, 비부착성 세포를 제거하기 위해 배지를 교체하고, 이후 주 2회에 걸쳐 교체하고, 반면 배양은 매일 현미경법으로 관찰한다. 간세포의 제거를 가속화시키고, ADHLSC 세포의 확장을 자극시키기 위해 12-16일 후에 배양 배지를 9% FBS 및 0.9% P/S로 보충된 고 글루코스 DMEM으로 교체한다. 중간엽-유사 형태를 갖는 세포 유형이 출현하고, 증식된다. 70-95% 전면성장에 도달하였을 때, 세포를 재조합 트립신 (trypLE; 라이프테크) 및 1 mM EDTA로 트립신 처리하고, 1-10 x 103개 세포/cm2의 밀도로 재플레이팅한다.
H2스템 세포 제조
5,000-20,000개 세포/cm2의 세포 밀도로 래트 꼬리 콜라겐 I-코팅된 T-75 플라스크 상에서 세포 배양물을 제조하기 위해 동결보존된 간 세포 현탁액을 사용하고, 이를 완전히 습윤화된 대기 5% CO2 중 37℃에서 인큐베이션시켰다. 대안적으로, 저산소 조건을 인큐베이션에 적용시키거나 (예컨대, 5% O2), 또는 세포 배양 배지 중 항산화제 (예컨대, 1 mM 또는 그보다 낮은 농도의 N-아세틸 시스테인)를 첨가하여 생성하였다. 출현 단계 동안 9% FBS, 0.9% P/S, 1 μM Dex; 10 μg/ml INS 및 12.5-25 ng/ml EGF로 보충된 윌리엄스 E 배지를 배양 배지로서 주 2회에 걸쳐 배지 교체 및 형태 분석을 수행한다. 일단 H2스템 세포가 세포 배양물 중에 지배적으로 존재하는 부착성 세포 클러스터로서 출현하고 나면, HGF (12.5-50 ng/ml)의 부재 또는 존재에서 9% FBS, 0.9% P/S, 1 μM Dex; 10 μg/ml INS, 12.5-25 ng/ml EGF로 보충된 윌리엄스 E 배지 중에서 추가 확장을 수행한다.
입방 중-상피 형태를 갖는 H2스템 세포가 작은 클러스터로서 발생하고, 이후 7-12일 이내에 확장되기 시작한다. 이어서, 이러한 세포에 의해 형성된 클러스터를 다음 2-3일 이내 (즉, 1차 간 세포 플레이팅 후 10-15일 이내에)에 트립신으로 처리한 후, 같은 배지에서 수회에 걸쳐 계대배양하기 위해 윌리엄스 E-기초 배지에서 5,000-8,000개 세포/cm2로 배양한다. 트립신 처리는 계대배양 1일 때부터 계속해서 콜라겐-코팅된 플레이트 상에서 80-90% 전면성장일 때 수행할 수 있다.
부착성 간세포-유사 세포로서의 세포 분화
세포를 BD 바이오코트 셀웨어, 콜라겐 I형 6-웰(BD BioCoat Cellware, Collagen Type I 6-Well) 코팅된 플레이트 (카탈로그 번호 356400, BD 바이오사이언시즈) 상에서 동일의 확장 배지 중에서 5,000-20,000개 세포/cm2의 밀도로 배양한다. 25 ng/ml EGF를 함유 (ADHLSC 세포의 경우), 또는 그를 함유하지 않는 (H2스템 세포의 경우), 20 ng/ml HGF, 20 ng/ml OSM, 1 μM Dex. 1% ITS를 함유하는 IMDM으로 배지를 교체함으로써 95-100% 전면성장시에 간 분화가 시작된다. 간 분화용의 상기 세포 배양 배지 (HepDif 배지)를 적어도 다음 2주 (H2스템 세포의 경우) 또는 4주 (ADHLSC 세포의 경우) 동안에 걸쳐 주 2회에 걸쳐 교체한다.
세포 배양 조건에서 세포의 형태학적 특징화
올림푸스 카메라 IX50 및 셀센스 디지털 이미징 소프트웨어(Cellsens Digital Imaging Software)를 사용하여 광학 현미경법 (위상차; 올림푸스(Olympus) UC30 현미경법)에 의해, 또는 광학 현미경이 일정한 시간 간격으로 같은 위치의 재초점 사진을 촬영하는 실시간 영상화 장비 셀-IQ (CM 기술)를 사용하여 영상을 촬영한다. 셀-IQ PC (위상차)는 영상 데이터의 자동 확인, 분석 및 정량화를 위해 온보드 애널라이저 소프트웨어 패키지(onboard Analyser Software Package) (머신 비젼 테크놀러지(Machine Vision Technology))와 위상차 및 명시야 영상화 능력을 도입한, 완전하게 통합된 연속 간 세포 영상화 및 분석 플랫폼이다.
RT-qPCR을 이용한, 세포 집단에 의해 발현된 유전자의 특징화
DNA-무함유™ 키트 (카탈로그 번호 AM1906, 앰비온(Ambion))로 DNAse 처리한 후, 진일루트 포유동물 키트(GenElute Mammaliam Kit) (카탈로그 번호 RTN70, 시그마)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출한다. 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit) (카탈로그 번호 04379012001, 로슈(Roche))를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 제1 가닥 cDNA를 합성한 후, 이어서, cDNA에 대하여 뉴클레아제 무함유 물 (카탈로그 번호 AM9938, 인비트로젠)을 이용하여 10 ng/μL로 희석한다. RT-PCR 증폭 혼합물 (20 μL)은 0.2 μg 주형 cDNA, 10 μL 2x 택맨 마스터 믹스(Taqman Master Mix) (카탈로그 번호 4369514, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)) 및 1 μL 20x 프라임타임(PrimeTime) qPCR 검정 (IDT)을 함유한다.
어플라이드 바이오시스템즈로부터의 어플라이드 바이오시스템즈 비이A™ 7 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems ViiA™ 7 Real-Time PCR System) 또는 임의의 다른 실시간 PCR 사이클러 상에서 2회에 걸쳐 샘플에 대해 수행한다. 사이클링 조건은 하기와 같다: 95℃에서 10 min 동안 폴리머라제 활성화, 95℃에서 15 sec 및 60℃에서 45 sec로 40회 사이클. 유전자 전사체 특이적 프라이머 서열 쌍은 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수하였으며, 이는 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure pat00001
내인성 대조군 전사체 GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제) 또는 PPIA (시클로필린 A)에 대하여 신호 강도를 정규화함으로써 유전자 발현의 상대적인 정량화를 확립하였다. 정규화한 후, 데이터를 플롯팅하고, 세포 집단 간의 비교를 실시하였다.
유동 세포측정법에 의해 세포 특징화
세포를 수거하고, PBS 완충제 (카탈로그 번호 SH30028.03, 써모 피셔(Thermo Fisher)) 중에 500-1,000/μL 농도로 현탁시키고, 제조업체에 의해 명시된 농도로 사용된 명시된 항원에 대하여 특이적인 하기의 형광색소-표지된 항체와 함께 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션시킨다: CD45-PE Cy7 (카탈로그 번호 557748, BD 바이오사이언시즈), CD90-FITC (카탈로그 번호 555595, BD 바이오사이언시즈), CD73-PE (카탈로그 번호 550257, BD 바이오사이언시즈), CD29-APC (카탈로그 번호 559883, BD 바이오사이언시즈), CD44-FITC (카탈로그 번호 555478, BD 바이오사이언시즈), CD133-PE (카탈로그 번호 130080901, 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec))), 알부민-FITC (카탈로그 번호 CLFAG2140, 산바이오(Sanbio)), 모노클로날 마우스 항-인간 시토케라틴 19 (CK-19) (클론(Clone) RCK108; M0888, 다코(Dako)), 항-마우스 IgG-다이라이트(DyLight) 488 (카탈로그 번호 715-485-150, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)), CD117-APC (카탈로그 번호 333233, BD 바이오사이언시즈), CD31-FITC (카탈로그 번호 555445, BD 바이오사이언시즈), CD31-PE (카탈로그 번호 340297, BD 바이오사이언시즈), CD326 (카탈로그 번호 347200, BD 바이오사이언시즈). 모노클로날 항체의 비-특이적 결합을 평가하기 위해 상응하는 대조군 이소형 항체를 사용한다. 이어서, 세포를 세척하고, BD 바이오사이언시즈 FACSCanto II 플로우 사이토미터(FACSCanto II Flow Cytometer)로 판독하기 위해 PBS/BSA 중에 현탁시킨다.
면역형광에 의한 또는 면역세포화학 의한 세포 특징화
세포를 실온에서 10-15분 동안 파라포름알데히드 4% (카탈로그 번호 43368, 알파 아에사르(Alfa Aesar))로 고정시키고, PBS로 3회에 걸쳐 세척한다. 필요할 경우, 과산화수소 3% (카탈로그 번호 31642, 시그마)와 함께 10분 동안 인큐베이션시켜 내인성 퍼옥시다제를 제거한다. 이어서, PBS 완충제 중 1% 트리톤 X-100 (카탈로그 번호 T8787, 시그마)을 사용하여 10-15분 동안 세포를 투과화시킨다. 면역세포화학의 경우, 5% 노말 당나귀 혈청 (카탈로그 번호 017-000-121, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))을 함유하는 PBS 완충제 중에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써, 또는 면역형광의 경우, 5% 소혈청 알부민 (BSA) (카탈로그 번호 A2153, 시그마)을 함유하는 PBS 완충제 중에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 비-특이적 면역염색을 막는다. 1차 항체와의 인큐베이션은 실온에서 1시간 동안 (4℃에서 밤새도록) 수행한다. 이어서, 샘플을 15분 동안 3회에 걸쳐 세정하고, 실온에서 30분 동안 (면역세포화학의 경우), 또는 1시간 동안 (면역형광의 경우) 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다.
면역세포화학 또는 면역형광을 위해 제조업체의 지침에 따라 하기 항체를 1차 항체로서 사용하였다: 모노클로날 마우스 항-인간 혈청 알부민 (카탈로그 번호 A6684, 시그마), 모노클로날 마우스 항-인간 비멘틴 (카탈로그 번호 10515, 프로겐(Progen)), 모노클로날 마우스 항-인간 알파 평활근 액틴 (ASMA, 카탈로그 번호 M0851, 다코), 모노클로날 마우스 항-인간 시토케라틴 19 (CK-19) (클론 RCK108; M0888, 다코), 모노클로날 마우스 항-인간 TDO2 항체 (카탈로그 번호 SAB1406519, 시그마), 모노클로날 마우스 항-인간 CK-18 항체 (카탈로그 번호 SAB3300015, 시그마), 모노클로날 항-인간 UGT 항체 (카탈로그 번호 ab129729, 압캠(Abcam)), 모노클로날 항-인간 MRP-2 (카탈로그 번호 ab3373, 압캠), 항-인간 간세포 핵 인자 4 (HNF-4; 카탈로그 번호 sc-8987, 산타 크루즈), 및 폴리클로날 마우스 항-인간 CYP3A4 (카탈로그 번호 SAB1400064, 시그마).
제조업체의 지침에 따라 하기 항체를 면역형광을 위한 2차 항체로서 사용하였다: 알렉사 플루오르(알렉사 플루오르)®488-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (카탈로그 번호 715-545-151, 잭슨 이뮤노리서치), Cy3-접합된 당나귀 항-토끼 IgG (카탈로그 번호 711-165-152, 잭슨 이뮤노리서치). 면역세포화학을 위해, 인비전(Envision)™ 항-마우스 (다코사이토메이션(Dakocytomation), 카탈로그 번호 K4001, 다코)를 이용하여 실온에서 30분 동안 검출을 수행한다. 퍼옥시다제-표지된 중합체 및 기질 발색체 (DAB, 카탈로그 번호 D416, 다코)와 함께 5 min 동안 인큐베이션시킨 후, PBS로 3회 세척한 후에 검출을 수행한다. 면역형광의 경우, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (벡타실드(Vectashield)®+DAPI, 카탈로그 번호 H-1200, ABCYS)을 사용하여, 또는 면역화학법의 경우, 메이어스 헤마톡실린(Mayer's Hematoxylin) (카탈로그 번호 MHS16, 시그마)으로 핵을 대조 염색한다. 세포를 면역세포화학을 위해 탑재시킨 후, 카메라 UC30에 커플링된 올림푸스 도립 현미경 IX50을 이용하여 10, 20 및 40x 배율로 검사한다. 셀센스 소프트웨어를 이용하여 디지털 영상을 획득한다. (상기 명시된 바와 같이 수득된) 인간 1차 간세포를 간 마커에 대한 양성 대조군으로서, 및 중간엽 마커에 대한 음성 대조군으로서 동시에 염색시킨다. 올림푸스 카메라 XC30 및 셀센스 소프트웨어가 장착된 형광 현미경 (올림푸스 AX70)에 의해 영상을 촬영한다.
생물학적 활성에 의한 세포 특징화
발광성 CYP3A4 활성 검정을 위해, ADHLSC 세포 또는 H2스템 세포로부터 수득된 분화된 간세포-유사 세포를 트립신 처리하고, 100,000개 세포/웰 농도로 96-웰-마이크로플레이트 (카탈로그 번호 734-1662, 코스타(Costar))로 옮기고, 루시페린-IPA (카탈로그 번호 V9002, 프로메가)를 이용하는 P450-글로™ CYP3A4 어세이(P450-Glo™ CYP3A4 Assay)를 이용하여 활성을 측정한다. 빅토르(Victor) IV 발광측정기 (퍼킨-엘머 라이프 사이언시즈(Perkin-Elmer Life Sciences))를 이용하여 발광을 측정한다. 동시에 비처리 세포를 측정하여 배경 잡음을 감산한다. 결과를 휴먼 CYP3A4 엔자임 시스템(Human CYP3A4 Enzyme System)에 의해 제공받은 CYP3A4 마이크로솜 (카탈로그 번호 V4820, 프로메가) 표준에 대하여 정규화하고, 피코몰/세포로 계산한다.
요소 분비 검정을 위해, 세포를 트립신 처리하고, 콜라겐 코팅된 48 웰-마이크로플레이트 (카탈로그 번호 356505, BD 바이오사이언시즈) 중 페놀 레드 무함유의 IMDM (카탈로그 번호 21056023, 인비트로젠)에서 인큐베이션시킨다. 요소 분비 증진을 위한 기질로서, 1 mM 오르니틴 (카탈로그 번호 O2375, 시그마) 및 5 mM NH4Cl (카탈로그 번호 A0171, 시그마)을 배양 배지에 첨가한다. 2-24시간 후, 비색 콴티크롬(Quantichrome) 요소 검정 키트 (카탈로그 번호 DIUR-500, 바이오어세이 시스템즈(BioAssay Systems))를 이용하여 요소 분비를 측정한다. 5-20 min 인큐베이션 후, 520 nm (샘플 중 요소 농도에 비례하는) 색상 강도를 판독하며, 이는 샘플 중 요소 농도에 정비례한다. 제조업체의 지침이 권장한 바에 따라, 페놀 레드 무함유의 IMDM 중에서 제작된 요소 표준 곡선을 사용하여 배양물 상청액 중의 전체 요소 (mg/dl)를 계산한 후, 분비된 요소의 양을 pg/세포/2-24h로 확립한다. 실제 신호 검출에서 임의의 간섭을 평가하기 위해, 오르니틴/암모니아 클로라이드, 및 오르니틴/암모니아 클로라이드 없이 인큐베이션된 세포 대조군을 포함하는 배지에서 요소 분비 평가를 수행한다. 이들 샘플은 특이성을 측정하고 가양성을 막기 위한 음성 대조군으로서의 역할을 한다.
빌리루빈 접합 검정을 위해, 세포를 20-50 μM 비-접합된 빌리루빈 (카탈로그 번호 B4126, 시그마)과 함께 인큐베이션시킨다. 2-24시간 후, 비색 직접 빌리루빈 검정 (카탈로그 번호 DZ151A-K, 디아자임(Diazyme)) 및 전체 빌리루빈 검정 (카탈로그 번호 DZ150A-K, 디아자임)을 이용하여 빌리루빈 및 전체 빌리루빈의 접합을 측정한다. 상기 검정에서, (비)접합된 빌리루빈을 계면활성제 및 바나데이트 또는 오직 바나데이트만 (pH 3)을 함유하는 디아자임의 즉석 시약과 함께 혼합한 후, 샘플 중 전체 또는 직접 빌리루빈을 각각 빌리베르딘으로 산화시킨다. 후자가 산화된 경우에는 빌리루빈에 특이적인 흡광도 감소가 일어난다. 바나데이트 산화 전후의 흡광도를 측정함으로써 샘플 중 전체/직접 빌리루빈 농도를 측정할 수 있다. 이어서, 제조업체의 지침이 권장한 바에 따라, 페놀 레드 무함유의 IMDM에서 제작된 빌리루빈 교정기 표준 곡선에 대하여 배양물 상청액 중 직접/전체 빌리루빈 농도 (mg/dl//세포/2-24h)를 계산한다. 임의의 간섭을 평가하기 위해, 20-50 μM 빌리루빈, 및 빌리루빈 없이 인큐베이션된 세포 대조군을 포함하는 배지에서 빌리루빈 접합 평가를 수행한다. 이들 샘플은 특이성을 측정하고 가양성을 막기 위한 음성 대조군으로서의 역할을 한다.
결과
ADHLSC 세포 및 H2스템 세포는 둘 모두가, 정상적인 인간 성체 간을 사용하여 제조된 동결보존된 인간 1차 간 세포의 제제로부터 유래될 수 있는 세포 집단이다. 그러나, 1차 인간 간 세포의 제제로부터 그를 출현시키는 프로토콜 및 세포 배양물 중에서 확장시키는 후속 확장 방법은 상이하며, 특히, 세포 배양 조건에서 부착 및 성장을 위해 콜라겐 (또는 다른 적절한 기질)을 사용할 때에 그러하다 (보다 상세한 설명을 위해서는 물질 & 방법 참조). 플레이팅 후 7-12일 이내에, 돌출부가 없는 크고 투명한 세포질을 나타내고, 세포간 연접부가 발생하고, 성장 접촉 억제를 보이며, 입방, 중-상피 형태를 갖는 세포 클러스터가 자발적으로 출현한다. 입방, 중-상피 형태를 갖는 H2스템 세포는 클러스터로 또는 콜로니로 증식하며, 출현 후 약 2-3일째, 이를 트립신 처리하고, 5,000-20,000개 세포/cm2의 밀도로 계대배양할 수 있다. 이러한 특징이 H2스템 세포를 문헌 [Najimi M et al. 2007]에 기재된, 더 크고, 추후에 출현하는 신장형의 ADHLSC 세포와 구별하는다 (도 2A).
셀바인드 또는 콜라겐-코팅된 지지체 (예컨대, 플레이트, 플라스크) 상에서 배양된 ADHLSC 세포와 비교하였을 때, H2스템 세포는 보다 빠른 속도로 성장하고, 세포 배양물로부터 우선적으로 확인될 수 있고, 확장될 수 있다. ADHLSC 세포에 대한 집단 배가 시간 (PDT)은 약 72-96시간인 반면, H2스템 세포는 48-72시간의 PDT를 보이고, 적어도 4-5회 계대배양 동안 빠르게 확장된다.
H2스템 세포는 유동 세포측정법 (여기서, 세포 중 적어도 60%이 주어진 특징을 나타낼 경우, 이때 마커에 대하여 양성인 것으로 정의된다), 면역세포화학, 및/또는 RT-PCR 분석에 의해 평가된 바, 다른 인간 간 전구 세포, 예컨대, ADHLSC 세포에 따라 세포 표면 상 (CD90, CD73, CD29, CD44 포함) 또는 세포내 (예컨대, 비멘틴, ASMA)의 일련의 중간엽 마커 뿐만 아니라, 간 마커 (HNF-3B, 알부민 및 시토케라틴 18)에 대하여 양성이다. ADHLSC 세포 및 H2스템 세포, 둘 모두 다른 세포 계통 (조혈, 상피, 및/또는 내피)에 대한 세포 표면 마커, 예컨대, CD45, CD117, CD31, CD133, 및 CD326을 매우 낮은 수준으로 (즉, 시험된 세포의 15% 미만, 및 대개는 10% 미만이 특이적 염색을 나타낸다) 발현한다.
그러나, H2스템 세포는 또한 세포내 마커의 존재를 비교함으로써 ADHLSC 세포로부터 구별될 수 있다. 예를 들어, 세포 골격 성분, 예컨대, 시토케라틴 19 (CK-19; 담관세포 상피 마커)는 ADHLSC 세포 및 간세포에서는 거의 검출불가능하다 (Najimi M et al., 2007). H2스템 세포에서 (심지어 세포 배양물 중에서 출현하였을 때인 초기 단계에서도), CK-19는 유동 세포측정법에 의해 평가하였을 때, 20% 내지 40%로 이루어진 H2스템 세포의 백분율로 발현되는 것으로 관찰되는데, 이러한 차이는 음성성인 것으로 정의될 수 없고, H2스템 세포의 제제 간에도 일관적으로 재현된다. 실제로, CK-19 발현을 면역세포화학 (세포내 단백질을 검출하는데 있어 유동 세포측정법보다 일반적으로 보다 고감도인 기술)에 의해 평가할 때, CK-19는 대다수의 H2스템에 의해, 심지어 조기 단계에서도 발현된다는 것은 분명하며 (도 2B), 따라서, 이는 세포 배양물 중에서 H2스템 세포 및 H2스템 자손 집단을 제조하는 과정 전 기간 동안 H2스템 세포 및 H2스템 자손 집단을 구별하고, 후속 조사하는데 사용될 수 있는 추가 마커를 제공한다.
CK-19의 검출은 다른 세포내 단백질, 예컨대, 전사 인자의 검출, 및 특히, 간 기능과 관련된 것의 검출과 직접적으로 (RT-PCR 또는 항체 기반 방법에 의해) 또는 간접적으로 (간-특이적 유전자의 동조 발현에 기초하였을 때) 관련이 있을 수 있다. 이러한 방식으로, ADHLSC 세포와 비교하였을 때 H2스템 세포는 전사 인자 유사 HNF-3b 및 HNF-4를 보다 강력하게 발현하는 것으로 특징화되었다. 세포내 수준에서 상기 전사 인자는 예를 들어, 둘 모두의 간 혈청 단백질 (예컨대, 알부민 및 알파-1-항트립신)의 발현, 및 (비-)대사 기능에 대한 효소의 발현을 활성화시킴으로써 간세포의 형태학적, 표현형 및 기능적 성숙을 수득하는데 가장 중요한 것들 중 하나 (Snykers S et al., 2009)이며, H2스템 세포의 존재를 평가하기 위해 세포 추출물 중에서, 또는 세포 배양물 상청액 중에서 직접적으로 검출될 수 있는 것이다.
어느 1차 인간 간 세포가, 면역형광 또는 면역조직화학법에 의해 분석될 수 있는, 상이한 형태를 갖는, 부착성의 증식성 H2스템 세포 클러스터를 생성할 수 있는지 확인하면서 (도 3), H2스템 세포를 수득하기 위한 과정에 대한 초기 단계 동안 H2스템 세포의 출현 또한 진행될 수 있다.
ADHLSC 세포 및 H2스템 세포를 구별하는 추가의 특징은 이들 세포 집단의 시험관내 분화, 특히, 부착성, 간세포-유사 세포로의 분화 동안, 또는 그 이후에 확립될 수 있다. H2스템 세포의 분화 과정을 ADHLSC 세포의 것과 비교하였을 때, 후자의 세포가 더 많은 시간 (1개월 대 H2스템 세포의 경우, 1 내지 2주)이 소요될 뿐만 아니라, 세포 배양 배지 내에 더 많은 EGF를 필요로 한다. 게다가, 두 세포 유형을 이용하여 생성된 간세포-유사 세포의 형태는 상이하며, 여기서, H2스템 세포로부터 수득된 세포 (H2스크린 세포로도 또한 명명되는 H2스템 자손; 도 1 참조)는 대사적으로 활성인 1차 간세포의 것과 보다 유사한 특징을 보인다. H2스크린 세포는 세포내 입상을 갖는 단핵 및 이핵 세포를 포함하는 입방 간세포-유사 형태를 취하며, 이는 효소 활성이 증가되었음을 시사한다 (도 4A).
간에 축적되고, 간세포에 의해 비효율적으로 대사된 경우에는 간독성을 띨 수 있고, 간 질환과 관련이 있을 수 있는 화합물의 분해를 측정함으로써 H2스템 세포의 간-특이적 대사 활성을 다른 성체 간 전구 세포 (예컨대, ADHLSC 세포)의 것과 비교할 수 있다. 약물 유도성 간독성이 신약 개발의 후반 단계 동안 후보 약물 손실의 가장 중요한 이유 중 하나인 바, 이에 이 분석은 임상 적용을 위해 세포의 사용을 평가하는데 뿐만 아니라, 제약 산업에서의 신약 발견 및 개발을 위해서 관심의 대상이 된다. 잠재적으로 간독성인 화합물 및 비-간독성인 화합물을 생체내 투여하기 이전에 상기 두 화합물 사이를 구별하기 위하여 흔히 간 기원의 세포에 기반한 상이한 모델에서 상이한 CYP450 유도제에의 노출이 유전자 발현 반응 및 CYP450-특이적 효소 활성에 미치는 효과를 측정하지만, 연구 중인 모델 중 어느 것도 간독성 화합물에 대한 조기의 신뢰가능하고 정확한 검출을 위한 모든 기준을 충족시키지 못한다 (Gerets HH et al., 2012).
특히, 간 CYP3A4는 현재 사용되는 약물 중 거의 50% 뿐만 아니라, 내인성 및 외인성 코르티코스테로이드의 대사에 기여한다. CYP3A4 효소는 성체 간 내의 간세포에서 강력하게 발현되고, CYP3A4 기능성 획득이 간형성성 분화 및 성숙화의 중요한 기준이 되는 것으로 간주된다. 면역세포화학 및 RT-PCR을 통해 CYP3A4 발현이 ADHLSC 세포에서보다는 H2스템 세포에서 훨씬 더 높은 것 (즉, 이미 임의의 간-특이적 분화 이전에)으로 이미 밝혀져 있으며, 이러한 관찰 결과는 또한 활성 수준으로도 확인되었다. H2스템 세포는 (이미 10-9 pMol/세포인 검출 한계보다 훨씬 더 높은) 10-8 pMol/세포/4h 범위로 상기와 같은 비활성을 보이지만, H2스크린 세포로의 시험관내 분화 이후에는 10-7 pMol/세포/4h 범위로 증가하며, 여기서, ADHLSC 세포는 오직 분화 이후에만 10-8 pMol/세포/4h보다 높은 활성을 보인다 (도 4B).
상업적 키트를 사용하여 평가될 수 있는 대사 활성에 관한 다른 지표를 사용하여, 또는 문헌에 기재되어 있는 기술을 적용시킴으로써 (CYP1A2-, CYP2C19-, CYP2C9-, CYP2E1-, 또는 CYP2D6-특이적 mRNA 발현 및/또는 효소 활성의 경우) 추가의 시험관내, 간-특이적 분화가 이루어지거나, 또는 그렇지 않은 H2스템 세포 및 ADHLSC 세포 사이의 상기와 같은 간-특이적 대사 활성 비교를 수행할 수 있다. 특히, H2스템 세포의 경우, CYP1A2, CYP2C9, 및 CYP2E1 발현이 강하게 상향-조절된 것이 관찰되었다. 이러한 관찰 결과는 H2스크린 세포를 분화된 ADHLSC 세포와 비교하였을 때 확인되었고, 이는 또한 다른 간-특이적 효소 활성 (예컨대, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, CYP2D6 또는 CYP2C19)에 대한 유전자 발현으로까지 확장되었다.
요소 분비 (또 다른 주요 간-특이적 대사 활성)의 경우, H2스크린 세포는 기질 (암모니아 클로라이드 및 오르니틴)의 존재하에서 요소를 합성할 수 있는 것으로 보이며, 분화된 ADHLSC 세포와 비교하였을 때, 실질적으로 더 높은 대사 특성을 가진다. H2스크린 세포는 1 로그 초과에 상응하는 정도로 이러한 활성의 개선을 보이며, 이는 이들 세포 내의 매우 특이적이고 통합된 간 기능성이 존재함을 입증한다 (도 4C).
면역조직화학법을 통해서도 또한, H2스템 세포와 비교하였을 때, H2스크린 세포에서는 CK-19, CK-18의, 및 일부 간 마커 (예컨대, 알부민, TDO2, 및 UDP-글루쿠로노실 트랜스퍼라제)의 강력한 세포내 발현이 추가로 증가되지 않는다면, 유지되고, 이는 또한 수송체 다형태와 관련된 약물 유도성 독성을 평가하는데 있어 매우 중요한 특징인, 세포와 세포의 경계면에서 주요 유출 수송체 단백질, 예컨대, MRP-2 단백질의 발현을 나타낸다는 것이 확인된다 (도 4D).
UGT1A1 유전자의 발현에 기인하는 또 다른 간-특이적 생물학적 활성인, 빌리루빈에 접합할 수 있는 능력에 관하여 분화된 ADHLSC 세포 및 H2스크린 세포를 비교하였을 때, 정량적으로 유사하다는 증거를 얻었다. H2스크린 세포는 가능하게는 전사 인자, 예컨대, HNF-3b 및 HNF-4의 더 높은 발현 및/또는 증가된 핵 국재화에 기인하여 훨씬 더 높은 활성인 나타낸다. 분화된 ADHLSC 세포에서의 UGT1A1과 관련된 빌리루빈 활성은 24시간 노출 후 0.05 mg/dl-0.3 mg/dl (0.5 mg/dl 예외)인 것으로 측정되고, 이는 5-35% (50% 예외) 접합에 상응한다. H2스크린 세포에서의 UGT1A1과 관련된 빌리루빈 활성은 24시간 노출 후 0.2 mg/dl-0.6 mg/dl로, 또는 23-70% 접합으로서 측정된다. 게다가, RT-PCR에 의해 UGT1A1 발현을 인간 간세포와 비교할 때, 이는 1차 간세포에서 관찰되는 수준의 10%, 특히, 다른 유형의 간 전구 유래 세포를 시험관내에서 분화시킴으로써 수득되는 세포와 비교하였을 때 고수준에 이른다.
따라서, H2스템 세포는 같은 유형의 다른 세포 (특히, 더 길고, 보다 복잡한 방법에 의해 제조된 것, 예컨대, ADHLSC 세포)와 비교하였을 때, 다른 특징 (예를 들어, 세포 유형 특이적 마커의 증식, 발현, 또는 간-특이적 효소 활성)에 대하여 일부 중요한 예상 밖의 이점을 제공하며, 이를 통해 임상적 적용 및 약리학적-독성학적 연구, 둘 모두에서 관심을 받게 되는 신규한 성체 간 전구 세포인 것으로 보여진다.
실시예 2: 3차원 세포 클러스터로서의 상이한 유형의 H2스템 자손 생성
물질 & 방법
H2스템 세포로부터의 H3스템 세포 생성
초-저부착 세포 배양 플라스크 (75 cm2; 카탈로그 번호 3814; 코닝) 상에 플레이팅하기 전에 15 ml 배지 중에 약 1-10 x 106개의 H2스템 세포를 현탁시킴으로써 초-저부착 세포 배양 플라스크에서 H3스템 세포를 생성한다.
0.1-0.2 ml 배지 중에 5,000-20,000개의 H2스템 세포를 현탁시킴으로써 초-저부착 96-웰 마이크로플레이트에서 H3스템 세포를 생성하고, 초-저부착, U자형/라운드형 96-웰 배양 마이크로플레이트 (카탈로그 번호 7007; 코닝) 상에 웰마다 플레이팅한다. 대안적으로, 75,000-100,000개의 H2스템 세포를 2.0-3.0 ml 배지 중에 현탁시키고, 초-저부착 6-웰 배양 플레이트 (카탈로그 번호 3471; 코닝) 상에 웰마다 플레이팅한다.
배양 배지는 우선적으로 HGF의 부재 또는 존재 (12.5-50 ng/ml)하의 9% FBS, 0.9% P/S, 1 μM Dex; 10 μg/ml INS 및 12-25 ng/ml EGF로 보충된 윌리엄스 E 배지이다. 윌리엄스 E 배지 대신 사용될 수 있는 대안적 상업적 세포 배양 배지는 윌리엄스 E 배지에 대하여 상기 명시된 바와 같이 보충된 IMDM 또는 DMEM이다. 새로운 세포 배양 배지를 각각 플라스크 및 다중웰 플레이트/마이크로플레이트 포맷에 대하여 주당 2회에 걸쳐 첨가 또는 치환한다. 3차원 H2스템 자손의 형성을 위상차 현미경법으로 관찰한다. 개별 세포는 24시간 후 상기 클러스터를 형성하기 시작하고, 다음 10-25일 이내에 CYP3A4 활성을 측정하기 위해, 면역조직화학법을 수행하기 위해, 또는 H3스크린-2 세포를 생성하기 위해 그 크기가 200 μm 초과인 크기에 도달하였을 때 (직경이 최대 600 μm 이하인 H3스템 세포의 클러스터를 수득할 수 있다) 수거한다.
H2스크린 세포로부터 H3스크린-1 세포 생성
3차원 H2스템 자손을 수득하기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 H2스크린 세포를, 적절한 세포 배양 시스템에서 및 H2스템 세포를 H2스크린 세포로 분화시키는데 사용된 것과 동일한 배지 중에서 상기 세포 현탁액에 유지시킴으로써 트립신 처리한다. "현적" 배양 시스템, 예컨대, 96 웰-플레이트 그래비티플러스플레이트(GravityPlusPlate) (인스페로(Insphero))이 사용되었을 때, 플레이트의 각 웰에서 20 μL를 흡인하고, 20 μL 새로운 배지를 첨가함으로써 배지의 절반을 주당 2-3회에 걸쳐 교체한다. 대안적으로, 같은 빈도로 5 ml의 새로운 세포 배양 배지를 첨가하면서, 1-10x106개의 H2스크린 세포를 초-저부착 세포 배양 플라스크 상에 플레이팅하였다. 다르게는, H3스템 세포를 생성하기 위해 초-저부착, U자형/라운드형 96-웰 배양 마이크로플레이트를 상기 기재된 바와 같이 사용하였다.
상기 세포 배양 시스템에서 H3스크린-1 세포의 형성을 H3스템 세포와 유사한 방식으로 관찰하고, 수득하고, 평가한다.
H3스템 세포로부터 H3스크린-2 세포 생성
확장 배지를 제거하기 위하여, 상기 기재된 바와 같이 확장시에 수득된 H3스템 세포를 224 g로 5분 동안 원심분리한다. 이어서, 주당 2회에 걸쳐 5 ml의 새로운 세포 배양 배지를 첨가하면서, 동일한 초-저부착 세포 배양 플라스크에서 HepDif 세포 배양 배지를 사용하여 분화를 시작한다 (실시예 1 참조). 다르게는, 분화를 위해 동일한 세포 배양 배지를 사용하여 상기 기재된 것과 같이 초-저부착, U자형/라운드형 96-웰 배양 마이크로플레이트를 사용하였다. 다음 10-20일 이내에 3차원 세포 클러스터에서 간 분화 및 CYP3A4 활성을 평가한다.
H3스크린-2 세포로부터 H3스크린-2a 세포 및 H3스크린-2b 세포 생성
H3스크린-2a 세포는 초-저부착 세포 배양 플라스크, U자형/라운드형 96-웰 배양 마이크로플레이트, 또는 "현적" 배양 시스템을 사용하여 현탁액 중에서 및 HepDif 배지 중에서 (실시예 1 참조) 유지된 H3스크린-2 세포에 상응한다.
H3스크린-2b 세포는 BD 바이오코트 셀웨어, 콜라겐 I형 코팅된 플레이트 (6, 24, 48개의 웰 포함)의 상이한 다중웰 포맷으로 옮겨진 H3스크린-2 세포에 상응한다. 이러한 조건에서, HepDif 배지 (실시예 1 참조) 중에서 플레이팅 시점에서부터 계속해서 3-4일 이내에 다각형 및 과립형 간세포가 관찰된다.
H2스템 세포로부터 H3스크린-2 세포 생성
H3스템 세포와 같은 중간 확장 단계 없이 H2스템 세포로부터 직접 H3스크린 세포를 생성할 수 있다. 이러한 경우, 5,000-20,000개의 H2스템 세포를 0.1-0.2 ml HepDif 배지 (실시예 1 참조) 중에 현탁시키고, 초-저부착 96-웰 배양 플레이트 상에 플레이팅한다. 대안적으로, 75,000-100,000개의 H2스템 세포를 2.0-3.0 ml 배지 중에 현탁시키고, 초-저부착 6-웰 배양 플레이트 상에 웰마다 플레이팅한다. HepDif 배지 중에서 세포를 유지시키고, H3스템 세포의 클러스터에 대해 제시된 바와 동등한 기간 동안에 유사한 크기의 H3스크린-2 세포의 클러스터를 관찰하면서, H2스템 세포로부터 H3스템 세포를 생성하기 위한 것이 세포 배양의 추가의 단계를 수행한다.
H3스템 세포로부터 H3스크린-2c 생성
H3스크린-2c 세포는 BD 바이오코트 셀웨어, 콜라겐 I형 코팅된 플레이트 (6, 24, 48개의 웰 포함)의 상이한 다중웰 포맷으로 옮겨지고, HepDif 배지에서 배양된 (실시예 1 참조) H3스템 세포에 상응한다.
3차원 H2스템 자손의 면역세포화학 (IHC), 면역형광 (IF), 및 형태학적 특징화
올림푸스 카메라 IX50 및 셀센스 프로그램을 이용하여 광학 현미경법 (위상차; 올림푸스 UC30 현미경법)에 의해 3차원 세포 클러스터의 크기 및 영상을 촬영한다.
상이한 유형의 3차원 H2스템 자손을 수거한 후, 4℃에서 밤새도록 4% 파라포름알데히드 (카탈로그 번호 43368, 알파 아에사르) 중에서 고정시킨 후, 이어서, 65℃에서 아가로스 2% (카탈로그 번호 16500, 인비트로젠) 중에, 및 이어서, 파라핀 중에 포매시킨다. 5 μm 너비의 섹션에서 파라핀을 제거하고, 단계적 알콜 시리즈에서 재수화시킨다.
면역조직화학법을 수행하기 이전에, 섹션을 97℃에서 90분 동안 시트르산 일수화물 용액 (pH 6.0) 중에서 인큐베이션시킨다. 슬라이드를 15분 동안 3% 과산화수소 메탄올 용액 중에서 인큐베이션시켜 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시킨다. 1% 소 혈청 알부민 (BSA, 카탈로그 번호 A2153-50G, 시그마)을 함유하는 PBS 완충제 중에서 섹션을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 비-특이적 면역염색을 막는다.
이어서, 섹션을 제조업체의 지침에 따라 및 0.1% BSA 중 희석된 하기 1차 항체 중 하나와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다: 모노클로날 마우스 항-인간 혈청 알부민 (카탈로그 번호 A6684, 시그마; IHC의 경우), 모노클로날 마우스 항-인간 CYP3A4 (카탈로그 번호 SAB1400064, 시그마; IHC의 경우), 폴리클로날 토끼 항-인간 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 (카탈로그 번호 HPA000570, 시그마; IHC의 경우), 폴리클로날 토끼 항-인간 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1 (카탈로그 번호 sc-27415, 산타 크루즈; IHC의 경우), MRP-2 (카탈로그 번호 ab3373, 압캠; IHC의 경우), 모노클로날 마우스 항-인간 시토케라틴 19 (CK-19) (클론 RCK108; M0888, 다코; IHC의 경우), 모노클로날 항-CK19 (카탈로그 번호 SAB3300018, 시그마, IF의 경우), 모노클로날 항-CK-18 (카탈로그 번호 SAB3300015, 시그마; IF의 경우), 모노클로날 마우스 항-인간 비멘틴 (카탈로그 번호 10515, 프로겐; IHC의 경우), 모노클로날 항-비멘틴 (카탈로그 번호 V6630, 시그마; IF의 경우), 항-인간 간세포 핵 인자 4 (HNF-4) (카탈로그 번호 sc-8987, 산타 크루즈; IHC의 경우), 모노클로날 항-HNF4 (카탈로그 번호 SAB4501409, 시그마; IF의 경우), 모노클로날 항-HNF3B (카탈로그 번호 SAB2500409, 시그마; IF의 경우). 제조업체의 지침에 따라 하기 표지된 항체를 면역형광 (IF)을 위한 2차 항체로서 사용하였다: 알렉사 플루오르®488-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (카탈로그 번호 715-545-151, 잭슨 이뮤노리서치), Cy3-접합된 당나귀 항-토끼 IgG (카탈로그 번호 711-165-152, 잭슨 이뮤노리서치). 면역조직화학법을 위해, 인비전 항-마우스 (카탈로그 번호 K4001, 다코사이토메이션), 항-토끼 (카탈로그 번호 K4003, 다코사이토메이션) 또는 항-염소 IgG-HRP (카탈로그 번호 sc-2020, 산타 크루즈) 및 발색원성 기질로서 시그마FAST™ 3,3'-디아미노벤지딘 정제 (카탈로그 번호 D4168, 시그마)를 사용하여 1차 항체를 검출하기 위해 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-기반 염색을 사용한다. 면역형광의 경우, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌 (벡타실드®+DAPI, 카탈로그 번호 H-1200, ABCYS)을 사용하여, 또는 면역조직화학법의 경우, 메이어스 헤마톡실린 (카탈로그 번호 MHS16, 시그마)으로 핵을 대조 염색한다. 카메라 UC30에 연결된 올림푸스 도립 현미경 IX50을 이용하여 분석을 수행한다. 셀센스 소프트웨어를 이용하여 디지털 영상을 획득한다.
웨스턴 블롯 분석에 의한 3차원 H2스템 자손 특징화
세포 (5x106개 세포/ml의 농도)를 10 mM HEPES pH 7.4, 80 mM KCl, 2 mM EDTA, 15 mM 베타-메르캅토에탄올, 0.1% 트리톤 X-100 및 1% PIC (프로테아제 억제제 칵테일)를 함유하는 완충제 중에서 용해시킨다. 단백질 추출물을 교반하면서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 얼음 상에서 포터 다운스(Potter Dounce) (10 A.R.)를 이용하여 균질화시킨다. 이어서, 세포 용해물을 4,000 g로 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화한다. 이어서, 상업적 키트 (바이오-래드(Bio-Rad))를 사용하여 고전적 브래드포드(Bradford) 방법에 따라 생성된 상청액 중 단백질 농도를 측정한다. SDS-PAGE를 사용하여 전기영동에 의해 단백질 추출물을 분리한 후, 니트로셀룰로스 막 (아머샴(Amersham: 영국)) 상에서 전기이동시켰다. 이어서, 막을 탈지유 (5% (W/v); 머크(Merck))를 함유하는 TBS-t 완충제 (트리스 완충처리된 염수-트윈: 트리스/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, 트윈(Tween)® 20 0.1%) 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 제조업체의 지침에 따라 막을 교반시키면서, 동일한 TBS-t/유액 5% (단, 1차 항체 함유) 중에서 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨다. TBS-t 완충제로 15분 동안 3회에 걸쳐 세척한 후, 막을 TBS-t/5% 유액 완충제 중에서 퍼옥시다제-표지된 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. TBS-t 완충제로 15분 동안 3회에 걸쳐 세척한 후, 화학 발광 (키트 ECL, 아머샴 파마시아 바이오테크.(Amersham Pharmacia Biotech.))에 의해 단백질 신호를 나타낸다.
제조업체의 지침에 따라 하기 항체를 1차 항체로서 사용한다: 폴리클로날 토끼 항-인간 CYP3A4 (카탈로그 번호 AB1254, 케미콘(Chemicon)), 폴리클로날 항-토끼 항-UGT1A1 (카탈로그 번호 4371, 셀 시그날링 테크놀러지(Cell Signaling Technology)) 및 항-SULT1 (카탈로그 번호 sc-32928, 산타 크루즈).
RT-qPCR을 이용한, 3차원 H2스템 자손에 의해 발현된 유전자의 특징화
6-웰 플레이트의 웰로부터 (또는 96-웰 마이크로플레이트로부터의 1 내지 10개의 웰로부터) 수득된 3차원 H2스템 자손을 1.5 ml 튜브에 수집하고, 1 ml PBS로 세정하고, 세포 클러스터가 중력에 의해 튜브 바닥에 떨어질 때까지 기다린 후, PBS를 제거한다. 30초 동안 튜브를 와동시키고, RNase 무함유 피스톤 (카탈로그 W5290W, 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))과 함께 피스톤 (카탈로그 W14044, 피셔 사이언티픽)을 회전시키는 전동 시스템을 이용하는 기계식 작용에 의해 스페로이드를 파괴시키면서, 세포 클러스터를 350 μL의 RLT 완충제 플러스를 이용하여 용해시킨다.
DNA-무함유™ 키트 (카탈로그 번호 AM1906, 앰비온)로 DNAse 처리한 후, RN이지® 플러스 미니 키트(RNeasy® Plus Mini Kit) (카탈로그 번호 74134 퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출한다. 트랜스크립터 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성 키트 (카탈로그 번호 04379012001, 로슈)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 제1 가닥 cDNA를 합성한 후, 이어서, cDNA에 대하여 뉴클레아제 무함유 물 (카탈로그 번호 AM9938, 인비트로젠)을 이용하여 10 ng/μL로 희석한다. RT-PCR 증폭 혼합물 (20 μL)은 0.2 μg 주형 cDNA, 10 μL 2x 택맨 마스터 믹스 (카탈로그 번호 4369514, 어플라이드 바이오시스템) 및 1 μL 20x 프라임타임 qPCR 검정 (IDT)을 함유한다. 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 어플라이드 바이오시스템즈 비이A™ 7 실시간 PCR 시스템 또는 임의의 다른 실시간 PCR 사이클러 상에서 2회에 걸쳐 샘플에 대해 수행한다. 사이클링 조건은 하기와 같다: 95℃에서 10 min 동안 폴리머라제 활성화, 95℃에서 15 sec 및 60℃에서 45 sec로 40회 사이클. 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이 유전자 전사체 특이적 프라이머 서열 쌍은 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수하였다.
생물학적 활성에 의한 3차원 H2스템 자손 특징화
부착성 세포에 대하여 수행된 것 (실시예 1 참조)과 유사한 방법과 함께 발광 검정을 이용하여 3차원 H2스템 자손의 CYP3A4 활성을 측정할 수 있다. 각각이 대략 20,000개의 세포를 함유하는, 최대 5개 이하의 3차원 세포 클러스터를 PBS 완충제로 세척하여 잔류 배지를 제거한 후, BD 바이오코트™ 콜라겐 48-웰-플레이트 (카탈로그 번호 356505, BD 바이오사이언시즈)로 옮겨 놓는다. 이후, 0.2 μL 루시페린-IPA (카탈로그 번호 V9002, 프로메가)를 함유하는 200 μL IMDM (카탈로그 번호 21980032, 인비트로젠)과 함께 4시간 동안 인큐베이션시킨다. 세포 현탁액 (100 μL의 배지)을 96-웰-플레이트 (카탈로그 번호 734-1662, 코스타)로 옮기고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 분석한다. 3차원 세포 클러스터와 함께 인큐베이션되지 않은 세포 배양 배지는 배경 잡음인 대조군으로서 사용한다.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 적절한 시약과 함께 인큐베이션된, 대략 100,000개의 세포 (H3스템 세포 또는 H3스크린-2a 세포의 구(sphere) 5개에 등가)를 함유하는 3차원 세포 클러스터를 이용하여 간-특이적 대사 활성을 시험하기 위한 요소 분비 및 빌리루빈 접합 검정을 수행하였다.
반응에 대한 기질로서 파라세타몰을 이용하여 UGT1A (즉, UGT1A1 및 다른 UGT1A 이소형 포함)와 함께 조합하여 SULT 활성을 시험하였다. 파라세타몰의 글루크론산화 및 술페이트 접합 생성물을 기재된 바와 같이 HPLC에 의해 정량화한다 (Lau G and Crichley J, 1994). 간략하면, 세포를 5 mM 파라세타몰 (카탈로그 번호 A7302, 시그마)과 함께 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 배지 상청액을 원심분리하고, 여과하고, 254 nm에서 UV-HLPC에 의해 분석한다. 내부 표준으로서 2-아세트아미노페놀을 첨가한다. 정량화를 위한 특이적 표준은 파라세타몰-술페이트 (카탈로그 번호 UC448, 시그마) 및 P-아세트아미도페닐-β-D-글루쿠로니드 (카탈로그 번호 A4438, 시그마)이다. 노바-팩 C18 레이디얼-팩 칼럼(Nova-Pak C18 Radial-Pak Column), 60 Å, 4 μm, 8.0 mm X 100 mm (워터스(Waters))를 고정상으로서 적용한다. 이동상은 0.1 M KH2PO4, 0.1% 아세트산 & 0.75% 프로판-2-올 (pH 3.8) (데빗 1.5 ml/min)로 이루어진다. 결과는 분당, 및 단백질 1 mg당 글루쿠- 또는 술포-대사물의 생산량 (pmol)로서 표현한다. 바이오-래드 키트를 사용하여 고전적 브래드포드 방법에 따라 단백질 농도를 평가한다.
세포를 기질 칵테일 (10 mM 페나세틴, 100 mM 부프로피온, 10 mM 디클로페낙 및 3 mM 미다졸람)과 함께 인큐베이션시킨 후, LC/MS/MS에 의해 CYP-의존성 효소 활성을 측정하였다. 수송체 기능을 평가하기 위해, [14C] 수송체 마커 기질을 10 μM (0.5 μCi/mL)로 함유하는 500 μL의 HBSS 중에서 세포를 37℃에서 (또는 일부 실험의 경우, 4℃에서) 인큐베이션시켰다. 하기 기질을 사용하였다: 타우로콜레이트 (TC), 에스트론-3-술페이트 (E3S) 및 1-메틸-4-페닐피리디늄 (MPP). 인큐베이션 종료시, 상청액을 제거하고, 단일층을 빙냉 PBS로 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 300 μL NaOH 0.1 N을 각 웰에 첨가하여 세포를 용해시켰다. 트리 카르브 카운터(Tri Carb Counter)를 이용하여 세포 내부의 마커 기질의 농도를 평가하기 위해 분취물 (100 μL)을 취하고, 2 mL 울티마 골드 신틸란트(Ultima Gold scintillant)와 혼합하였다. 3일 동안 리팜피신 (10 μM) (CYP3A4, CYP2C9, CYP2B6) 및 베타-나프토플라본 (25 μM) (CYP1A2)으로 공동 처리한 후, I상 CYP-의존성 활성의 유도능이 입증되었다.
1차 인간 간세포 및 양성 대조군으로서 HepG2를 사용하고, H2스템, H3스템, ADHLSC로부터의 세포 배양물로부터 채취한 단백질을 사용하여, ELISA 키트 (카탈로그 번호 ab109717, 압캠)를 이용함으로써 카르복실에스터라제-1 (CES-1)의 효소 활성을 측정하였다. 제조업체의 지침에 따라 프로토콜을 사용하였다. 제조업체의 지침에 따라 ELISA 키트 (카탈로그 번호 ab108799, 압캠)를 사용하여 H2스템 세포 및 ADHLSC 세포로부터의 조건화된 배양 배지 중에서 분비된 알파-1-항트립신을 정량화하였다.
결과
미분화 및 분화된 ADHLSC 세포 (또는 다른 인간 간 전구 세포)로부터 H2스템 세포 및 H2스크린 세포를 구별하는 추가의 특징으로서, 실시예 1에 기재된 상기의 새로운 세포 집단이 세포 배양 조건에 따라 간 전구 세포 또는 간세포-유사 세포를 포함하는 상이한 유형의 3차원 세포 클러스터 (즉, 3차원 H2스템 자손)의 현탁액을 제공한다.
H2스템 세포 또는 H2스크린 세포를 현적 배양 시스템 또는 저부착 플레이트에서 유지시켰을 때, 직경이 50-100 μm인 3차원 세포 클러스터가 처음 2-4일 이내에 빠르게 형성되어 15-25일 후, 300 μm 내지 심지어 최대 600 μm까지의 크기에 이르게 된다 (도 5 및 6). 세포 사이에 일부 지지 기질을 보이는 이들 세포 클러스터는 1-2개월 이상까지 세포 배양물 중에 유지될 수 있다. 이에 반해, ADHLSC 세포 (같은 조건에서 배양된, 미분화 또는 분화된 것)는, 3차원 세포 클러스터를 형성하는 H2스템 자손에 대해 관찰되는 강력한 간-특이적 대사 활성을 보이지 않는, 최대 20 μm 크기의, 본질적으로 2차원인 응집체를 제공한다. 미분화 (H3스템 세포) 또는 분화된 (H3스크린 세포) 세포를 포함하는 3차원 H2스템 자손은 현적 배양 시스템, 초-저부착 세포 배양 플라스크, 플레이트, 또는 U자형/라운드형 웰을 포함하는 마이크로플레이트에서 생성될 수 있다. 상기 용기는 현탁액 중에서 배아체 또는 스페로이드와 같은 다른 세포를 배양하기 위해 개발되었다. 세포 배양물에 노출된 표면을, 친수성이고 중성으로 하전되고 세포 고정을 억제시키는 공유 결합된 히드로겔 층로 덮는다 (Saleh F. et al. 2012).
추가 용도에 따라, 단일 웰, 플레이트, 또는 플라스크의 내용물 (또는 3차원 H2스템 자손의 구체를 5, 10개 또는 그 초과로 수득하기 위하여 마이크로플레이트 중 웰의 내용물을 풀링한 결과물), 또는 각각의 구체-유사 클러스터를 같은 웰에서 따로따로 사용 또는 시험할 수 있거나, 또는 다른 기준 (예컨대, 효소 활성 또는 유전자/단백질 발현)과 병행하여 동시에 화합물 또는 세포 배양 조건이 주어진 3차원 H2스템 자손에 미치는 효과를 고처리량 방식으로 평가하도록 한다.
H3스템 세포는 주로 간 전구 세포에 의해 구성되고, H2스템 세포를 배양함으로써 수득될 수 있는 3차원 H2스템 자손이다. 3차원 H2스템 자손은 (H3스크린-1 세포 및 H3스크린-2 세포의 경우에서와 같이) 적절한 배지에서의 인큐베이션 이후에 간-활성 세포를 함유한다. 특히, H3스크린 세포는 세포 배양 조건에 따라, 즉, 이러한 상이한 유형의 3차원 H2스템 자손을 생성하는 조건이 특이적 순서로 또는 동시에 적용된다면, 부착성이거나 (H3스크린-2b 세포 및 H3스크린-2c 세포의 경우), 또는 현탁액 중에 존재하는 (H3스크린-2a 세포 및 H3스크린-1 세포의 경우) 3차원 H2스템 자손으로서 유지될 수 있다. 형태학적 및 표현형 수준에서, 3차원 H2스템 자손은 지지 기질 스캐폴드 및 내부 간 세포 덩어리로 이루어진 마이크로-간 스캐폴드와 유사하다 (도 5). U자형/라운드형, 96 웰 마이크로플레이트를 사용하면, 크기가 보다 균일한 표준화된 3차원 H2스템 자손이 더 많이 생성되고, 각 웰에서 보다 잘 제어된 방식으로 세포 클러스터가 생성된다. 실제로, 세포 배양을 위해 상기 시스템으로 옮겨진 H2스템 자손은 100,000개 초과의 세포를 함유할 수 있는 단일의, 구체-유사 세포 클러스터로 빠르게 응집된다 (도 5D 및 6).
3차원 H2스템 자손은 H2스템 세포에서 확인되는 마커, 예컨대, 중간엽 마커 유사 비멘틴 및 간 마커, 예컨대, 알부민을 여전히 발현한다. 게다가, 3차원 H2스템 자손은 일반적으로, ADHLSC 세포 뿐만 아니라, H2스템 세포 및 H2스크린 세포와 비교했을 때에도, 직접적으로 (예컨대, CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9, CYP2E1, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 및 UGT1A1), 또는 간접적으로 (전사 인자, 예컨대, HNF-3b 및 HNF-4의 경우) 주요 간-특이적 대사 활성을 더 높은 발현 수준으로 보인다. 이러한 관찰 결과는 3차원 H2스템 자손가, 간세포가 생체내에서 보이는 구조적 3차원 조직화 뿐만 아니라, 기능을 훨씬 더 잘 재현할 수 있다는 것을 제안한다. 면역조직화학법에 의해 분석하였을 때, H3스크린-1 세포는 강력한 CK-19 및 CK-18 발현과 함께, 알부민, CYP3A4, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC; 요소 회로의 효소) 및 UDP-글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1 (UGT1A1; 빌리루빈 접합을 위한 효소)의 강력한 발현을 나타낸다.
효소 활성 수준에서, 간세포-유사 세포를 포함하는 3차원 H2스템 자손의 CYP3A4 활성을 1차 간세포 및 H2스템 세포 및 H2스크린 세포와의 비교로 측정하였다. 절대값을 비교하였을 때 (도 7A), 분화 전후로 ADHLSC 세포와 비교하였을 때, H2스템 세포의 이미 유의하게 더 높은 CYP3A4 활성 (실시예 1 및 도 4B 참조)은 H3스템 세포에 의해 이미 이루어지고, H3스크린 세포, 예컨대, H3스크린-2a 세포에서 추가로 증가된다. 세포 수에 기초하여 정의될 때, 이들 값은 (세포의 총 수 및 밀도에 따라) 10-5-10-6 pmol/세포 범위에 상응하는, 10-2-10-3 pmol/세포 클러스터의 H3스크린-2a 세포 범위인 CYP3A4 활성을 나타내고, 따라서, H2스크린 세포와 비교하였을 때, 적어도 추가의 1 로그의 개선을 얻을 수 있다. 상기 값은 분화된 ADHLSC 세포에서 측정되는 CYP3A4 활성 수준보다 훨씬 높고, 1차 간세포에서 측정되는 수준에 이른다.
실시예 1에서 H2스템 세포 및 H2스크린 세포에 대하여 기재된 것, 예컨대, 요소 분비와 유사하게 (도 4 참조), 상이한 유형의 H3스크린 세포의 간-특이적 대사 활성에 대한 추가 검증을 수행할 수 있다. 대안적으로, 상업적 키트 또는 문헌에 기재되어 있는, 관련 마커에 대한 mRNA 및/또는 단백질 발현 수준 및/또는 효소 활성 (예컨대, 화합물의 CYP1A2-, CYP2C19-, CYP2C9-, 또는 CYP2D6-특이적 대사와 관련된 것) 수준을 측정하는 기술을 적용시킴으로써 대사 활성의 다른 지표를 평가할 수 있다.
게다가, 리팜피신 및 베타-나프토플라본으로 유도한 후 (약물-약물 상호작용의 측정가능한 효과를 평가하기 위한 시험), H2스템 세포 또는 H2스크린 세포와 비교하였을 때, H3스크린 세포 (및 특히, H3스크린-2a 및 -2b 세포)에서 유의하게 더 높은 효소 활성이 측정되었고, 그 결과, 유도 배수는 CYP1A2 활성의 경우, 36.22x, CYP2B6 활성의 경우, 93.71x, CYP2C9 활성의 경우, 2.13x, 및 CYP3A4 활성의 경우, 31.23x이었다.
H3스템 세포 및 H3스크린 세포는 또한 UGT1A 및 SULT 단백질 발현 및 활성 (도 7B 및 C)을 보이며, 이 경우에는 또한 10% 내지 최대 거의 100%인, 1차 간세포에서 측정된 수준에 이른다. 이러한 광범위한 글루크론산화 능력은 독성학적 스크리닝 모델 개발에 매우 중요할 뿐만 아니라, 예컨대, 크리글러-나자르 증후군에 대한 것과 같이, 상기의 신규한 세포의 임상적 적용 잠재능을 밝힌다. H3스크린 세포는 추가로 기질 (암모니아 클로라이드 및 오르니틴)의 존재하에서 요소를 합성할 수 있으며, 여기서, 시간 경과에 따라 요소 생산을 실질적으로 증가되거나, 축적되며, 이는 그의 광범위한 대사 능력을 확인시켜 준다.
타우로콜레이트, 에스트론-3-술페이트, 또는 MPP의 흡수를 측정함으로써 수송체 소듐 타우로콜레이트 공동-수송 폴리펩티드 (NTCP), 유기 음이온 수송 폴리펩티드 (OATP, 예컨대, OATP1B1 및 OATP1B3) 및 유기 양이온 수송체 (OCT (OCT1 및 2))의 흡수 능력을 평가하였다. H3스템 및 H3스크린-2a 세포, 둘 모두 15-60분 동안에 걸쳐 상기 화합물의 흡수 증가를 보였다 (도 7D). 게다가, H3스템 세포 및 H2스템 세포, 둘 모두 ADHLSC 세포 또는 통상 사용되는 세포주 유사 HepG2보다 우수할 뿐만 아니라, 시험관내에서 1차 인간 간세포에 대해 검출되는 것에 이르는, 간-특이적 활성 유사 CES1 (간 카르복실라제)을 보인다 (도 8A). 유사하게, H2스템 세포에 의한 알파-1-항트립신 분비는 ADHLSC 세포에 대해 관찰되는 것보다 상당히 우수하며 (도 8B), 이는 H3스템 세포 및 H3스크린 세포에서 추가로 평가될 수 있는 추가의 특징이 된다. 이러한 증거를 통해 후보 약물을 시험하는데 이용될 수 있는, H3스템 및 H3스크린 세포에서의 특이적 화합물의 대사 및 능동 흡수의 존재를 확인할 수 있다.
따라서, H2스템 세포는 간 전구 세포 또는 간-활성 세포를 포함하고, 세포 배양 조건에서 효율적으로 성장하고, 대사적으로 활성이고/또는 증식성인 세포를 제공하는데 유용한, 3차원 세포 클러스터 (3차원 H2스템 자손)로서 유지될 수 있는 H2스템 자손을 제공하는데 사용될 수 있다. 대사- 및 증식-관련 특징은 상기 확인된 바와 같이 3차원인 어느 유형의 3차원 H2스템 자손 (또는 기능적으로 또는 형태학적으로 결정될 수 있는 추가의 하위유형)가 주어진 용도에 보다 적절한 기능적, 형태학적, 또는 항원성 프로파일을 갖는지를 측정하기 위해 다른 특징 (예컨대, 세포 유형- 또는 활성-특이적 표면 마커의 존재/부재, 직경, 기질 구조 유형, 또는 다른 생물학적 활성)에 조합될 수 있다.
예를 들어, 3차원 H2스템 자손이 (예컨대, 장치 또는 생체적합성 매트릭스 내에서 또는 그렇지 않고, 트립신으로 임의의 예비 처리하고, 또는 그러한 처리 없이, 문맥내 주사 또는 간내/간외 이식에 의한) 생체내 투여용으로 의도되는 경우에, (세포의 평균 수 및 단백질/DNA의 양에 상응하는) 특정 범위의 직경, 시험관내 분화를 조합한, 또는 조합하지 않은 과정 (도 1 및 6 참조), 재조합 단백질을 발현하는 벡터로의 형질전환, 및/또는 특이적 항원성 프로파일이 바람직할 수 있다.
대안적으로, H2스크린 세포 (H3스크린-1 세포) 또는 H3스템 세포 (H3스크린-2a 세포 또는 H3스크린-2b 세포)로부터 현탁액 중에서 생성된 더 큰 3차원 H2스템 자손은 간-표적 바이러스에의 노출, 재조합 단백질을 발현하는 벡터로의 형질전환, 및/또는 화합물 패널에의 노출을 포함하는 시험관내 용도에 보다 적절할 수 있다. 본 실험은 상기 모델이 어떻게 바이러스 또는 인간 단백질을 효율적으로 발현시키도록 하는지, 또는 특히, 약리학적 또는 독성학적 전임상 스크리닝 및 검사를 위해 간 대사에 대한 화합물의 치료학적 효능, 대사, 안정성, 및/또는 독성을 평가하도록 하는지에 관한 관련 정보를 제공할 수 있다.
실시예 3: H2스템 세포를 특징화하는 분자적 특징
물질 & 방법
ADHLSC 세포 및 H2스템 세포의 프로테옴 분석
일부 부차적인 적응과 함께 앞서 기재된 바와 같이 (Vanheel A et al., 2012) 에탄(Ettan)™ DIGE 시스템 (2D-DIGE; GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈(GE Healthcare Life Sciences))을 사용하여 2차원 (2D) 겔에서 프로테옴 분석을 수행하였다. 간략하면, 95% 전면성장일 때 배양물 중에서 세포를 수거하고, 계수하고, 4℃에서 5분 동안 300 g로 원심분리하여 세포 펠릿을 제조하였다. 45 ml 포스페이트 완충처리된 염수 (PBS), 5 ml EDTA 용액 (50 mM; 카탈로그 번호 17-1324-01, GE 헬쓰케어(GE Healthcare)) 및 프로테아제 억제제 칵테일 정제 1개 (완전한 것; 카탈로그 번호 11873580001, 로슈 어플라이드 사이언시즈)를 사용하여 제조된 빙냉 세척 완충제 10 ml (5x106개 세포당)로 세포를 세척하였다. 균질화시, 세포를 5 x 106개 세포당 1 ml의 빙냉 세척 완충제 중에서 세척하고, 2회에 걸쳐 원심분리하였다. 최종적으로, 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 액체 질소 중에서 급속 동결시키고, -80℃에서 저장하였다.
세포 추출물 중 단백질 농도를 측정한 후, 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 N-히드록시숙신이미딜-에스테르 염료, Cy2, Cy3 및 Cy5 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈)를 이용하여 최소 표지를 수행하였다. 에탄 DIGE 이미저(Ettan DIGE Imager) (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈) 상에서 CyDye-표지된 2D-DIGE 겔을 스캐닝하였다. 3개의 CyDye 모두로부터 얻은 겔 영상을 데사이더(DeCyder) 7.0 소프트웨어 (GE 헬쓰케어 라이프 사이언시즈)에 로딩하고 분석하였다.
주성분 분석 (PCA)
스튜던츠 t 검정(Student's t test) 및 분산 분석 (ANOVA)을 이용하여 군 간의 변화 정도에 대한 군내 존재도의 차이의 통계적 유의도를 계산하였다. 겔 영상에 70%로 존재하고, ANOVA에 의해 통계학상 유의적인 (p ≤ 0.05) 스폿이 추가 분석을 위한 것으로 간주되었다. 데사이더 확장된 데이터 분석 (EDA) 모듈 (GE 헬쓰케어)을 이용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하였다. 각 스폿의 형광 강도를 상기 내부 표준으로 정규화하여 가능한 겔 사이의 비교를 수행한다. 본 방법은 데사이더 소프트웨어 (GE 헬쓰케어)에 의해 수행된다.
단백질-기반 세포 검출
프로테오믹스 분석에 의해 확인된 잠재적인 표면 바이오마커의 선별시 유동 세포측정법 또는 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. FACSCANTO 세포분석기 및 FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하였다. 세포를 고정화시킨 후, 분석 이전에 1차 항체 PE 마우스 항-인간 CD140b (BD 파르미겐(BD Pharmingen); 카탈로그 번호 558821) 및 PE 항-인간 SUSD2 (W5C5 및 W3D5 항원, 카탈로그 번호 327406 및 327506, 바이오레전드(BioLegend))와 함께 인큐베이션시켰다. 7AAD (카탈로그 번호 559925, BD 파르미겐)를 이용하여 생존가능성을 측정하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 제조업체의 지침에 따라 상업적 항-베타-액틴 항체를 대조군으로서 사용하였다. 유동 세포측정법에 사용된 다른 항체는 제조업체의 지침에 따라 따라 CD49b-PE (BD 바이오사이언시즈; 클론 12F1; 카탈로그 번호 555669;), CD51-PE (바이오레전드, 크론 NKI-M9, 카탈로그 번호 327909) 및 CD271-PE (밀테니(Miltenyi), 클론 ME20.4-1.H4; 카탈로그 번호 130-098-111)를 포함한다. 유동 세포측정법을 위해, 적절한 대조군 이소형의 양성성이 3%인 경우를 이용하여 양성 세포의 비율(%)을 정규화하였다.
결과
실시예 1 및 2는 상업적으로 이용가능한 제품 (항체, PCR 프라이머, 및/또는 키트)을 이용함으로써 제1 시리즈의 분자 또는 효소 특징을 통해 H2스템 세포 및 H2스템 자손을 다른 세포 유형으로부터 구별할 수 있도록 할 수 있다는 것에 관한 실험 데이터를 제시한다. 그러나, 이들 세포의 트랜스크립톰, 리피돔, 메타볼롬 및/또는 프로테옴을 광범위하게 분석하기 위한 상이한 기술에 의해 H2스템 세포 및 H2스템 자손에 대한 보다 일반적인 정성적 및 정량적 특징화를 수행할 수 있다. 이어서, 서로간의, 또는 상이한 세포 집단 (예컨대, H2스템 세포, H2스템 자손, 1차 인간 간세포, 또는 ADHLSC 세포의 상이한 제제)으로부터 수득된 유사 데이터와 결과 세트를 비교함으로써, 상이한 세포 집단 사이를 구별하는데 도움이 될 수 있는 바이오마커(들)를 확인함으로써 H2스템 세포 및 H2스템 자손의 보다 정확한 생물학적 프로파일을 확립할 수 있다.
제1 접근법으로서, 본 세포의 증식 배양물로부터 전체 단백질 내용물을 추출하고, 그에 대해 2차원 겔 분석을 수행하여 발현, 교체 및/또는 단백질 변형에서의 변화를 확인함으로써 ADHLSC 세포 및 H2스템 세포의 프로테옴을 비교하였다. 차등 발현 분석에 의해 차등적 스폿을 픽업하고, 실험군 사이의 가변성을 분석하는데 사용되는 무감독 다변량 통계학적 방법인 주성분 분석 (PCA)을 수행하기 위해 1원 ANOVA에 의해 정량화하였다. 모든 ANOVA 0.05-관련 스폿을 이용하여 PCA를 수행함으로써 두 세포 집단의 상이한 제제 사이의 (기능적 특징 이외의) 상이한 바이오마커 프로파일을 제안하는 스폿의 2개의 상이한 클러스터를 얻었다 (도 9).
실제로 관련 단백질을 확인한 후, 다른 기술 및 상업적 제품으로 (예컨대, 웨스턴 블롯 또는 유동 세포측정법에서의 항체, RT-PCR 프라이머를 사용하여) 상기 증거를 확인하기 위하여 질량 분광분석을 사용하여 단백질 서열분석을 실시함으로써 상기 차등적 스폿에 대한 보다 깊이있는 심층 분석을 수행할 수 있다. 대안적으로, 어레이 기반 기술 및 (프라이머, 표지된 항체, 또는 렉틴인) 대형 패널의 유전자-특이적 검출제를 제공하는 다른 접근법을 통해 상이한 샘플 중의 (활성, 국재 또는 다른 기준에 의해 분류된) 특이적 단백질의 양을 비교한 후, 상이한 세포 집단 및/또는 세포 배양 조건에서 보다 상세하게 분석될 가치가 있는 단백질의 수를 한정할 수 있다.
면역학적, 트랜스크립토믹 및/또는 글리코믹 분석으로부터 얻은 데이터를 조합할 때, H2스템 세포 또는 H2스템 자손에 대한 추가 정보는 추가 검증을 위해 잠재적으로 관심의 대상이 될 수 있는 이들 세포의 특징 (의학적 용도, 주변분비 효과, 및 다른 세포, 세포외 매트릭스 또는 다른 생물학적 이펙터와의 상호작용)을 제안할 수 있다. 이러한 접근법은 다른 세포 집단 (예를 들어, 부착성 세포 또는 3차원 세포 클러스터로서 유지되는, 1차 인간 간세포, H2스템 세포 또는 상이한 H2스템 자손의 상이한 제제) 뿐만 아니라, 이러한 세포 집단으로부터 유래된 생물학적 물질 (예컨대, 조건화된 배지 또는 특이적 세포 또는 단백질 분획)과의 비교를 포함할 수 있다.
상이한 기술을 통해 H2스템 세포 및 상이한 유형의 H2스템 자손으로부터의 상기 생물학적 물질 중의 특이적 단백질의 과대 또는 과소-표시에 대한 예비 데이터를 수득할 수 있고, ADHLSC 세포 뿐만 아니라, 성체 간 전구 세포 집단, 또는 심지어는 1차 인간 간세포와 비교할 수 있다. 상이한 세포 집단에서의 특이적 단백질의 과대 또는 과소-표시에 대한 이와 같은 증거는 (상기 상세한 설명에서 정의된 바와 같이) 그의 제조 방법 중 초기 단계에서, 및 후속 계대배양에서 적절하게 검증된 바이오마커를 사용함으로써 일반적으로는 성체 간 전구 세포 집단의, 및 특히, H2스템 세포의 (또는 1종 이상의 H2스템 자손 유형의) 품질 및/또는 양을 확립하는 것을 필요로 하는 상이한 생체내 및/또는 시험관내 적용을 위해 사용될 수 있다.
상기 바이오마커를 측정하는 바람직한 접근법은 낮은 처리량 또는 시험되고, 파괴되는 많은 양의 세포에 기인하는 제한 없이 검증될 수 있는 것이다. 따라서, 추가 연구는 세포 배양 배지의 상청액에 대해 및/또는 유동 세포측정법에 의해 평가될 수 있는 바이오마커에 초점을 맞출 수 있다. 이러한 범주에서, 2차원 (2D) 겔 전기영동 기술을 사용하여 H2스템 세포 및 ADLHSC 세포에 대해 단백질의 존재도를 먼저 평가할 수 있다. 세포 표면 상에 존재하고/거나, 세포 배양물 상청액 중 분비되어 있는 것으로 발견된 단백질을 상이한 형광 프로브를 사용하여 두 세포 집단에 대해 사전에 염색하거나, 또는 (예를 들어, 피어스 셀 서피스 프로테인 아이소레이션 키트(Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit), 써모 사이언티픽(Thermo scientific))를 이용하여 특이적으로 농축된 단백질 제제 중에서 단리된다. 동시에, 전체 단백질 추출물 및 다른 내부 대조군/표준 또한 각 세포 집단에 대해 제조된다. 이어서, 2D 겔 전기영동에 의해 단백질을 분리시키기 위해 샘플을 겔에 겔에 적용시킨다. 이어서, 생물 정보학 및 영상 기술을 사용하여 겔 중 세포 표면 및/또는 분비된 단백질의 존재도를 비교하고, (세포 집단 사이에 존재도에 있어서 통계학상 유의적인 차이가 검출되는) 흥미로운 스폿을 겔로부터 취하고, 질량 분광분석에 의해 이러한 스폿에서 단백질의 동일성을 확인하는 범주에서 트립신을 사용하여 분해한다.
이러한 방법을 사용하여 H2스템 세포와 ADHLSC 세포 사이에 차등적으로 발현된 것으로 확인된 단백질 중, 스시 도메인 함유 단백질 2 (SUSD2) 및 피브리노겐 베타 쇄 (FGB) 또는 다른 응고-관련 분비 단백질이 ADHLSC 세포와 비교하였을 때, H2스템 세포에서 강하게 발현된 것으로 나타났고, 따라서, 이는 (개별적으로 또는 조합하여) H2스템 세포 및 H2스템 자손에 대한 바이오마커로서 관심의 대상이 될 수 있다.
비록 현재까지 SUSD2의 SUSD2 생물학적 기능이 완전하게 확립되지는 않았지만, 문헌에서는 큰 세포외 도메인을 갖는 이러한 세포 표면 단백질에 관한 일부 관련된 정보를 제공한다. 유전자 및/또는 단백질 발현을 비교하는 많은 연구에서 상기 단백질이 확인되었고, 예를 들어, 부분 간 절제술 이후 즉시 과다발현되는 것으로 나타났다 (White P et al., 2005). SUSD2 및 상응하는 마우스 단백질 (SVS-1)은 적어도 천연 분자 (예컨대, 피브로넥틴 또는 갈렉틴-1) 또는 합성 분자 (예컨대, 매트리겔(Matrigel))를 사용하여 시험하였을 때, 세포외 매트릭스와 암 세포와의 상호작용을 변경시킴으로써 시험관내 또는 동물 모델에서 암 세포의 활성에 영향을 주는 것으로 보인다 (Sugahara T et al., 2007; Watson A et al., 2013). 최종적으로, SUSD2는 인간 골수, 자궁 내막, 연골, 및 다른 조직으로부터의 중간엽 줄기 세포를 특징화하는 것으로 정의되는 세포 표면 에피토프 (W5C5, W3D5)를 함유하는 것으로 확인되었다 (Sivasubramaniyan K et al., 2013; Benz K et al., 2013; Masuda H et al., 2012; Pilz G et al., 2011; Buehring HJ et al., 2007).
2D 겔 전기영동을 사용하였을 때 H2스템 세포에서 훨씬 더 강한 SUSD2 발현을 보인 것에 관한 초기의 관찰 결과는 웨스턴 블롯에서 인간 SUSD2에 대한 상업적 항체 (정제된 항-인간 SUSD2; 카탈로그 번호 327401, 바이오레전드)를 사용하여 (도 10A) 및 공초점 현미경을 사용하여 면역형광으로 확인하였다. SUSD2 세포외 도메인 또한 가용성 단백질로서 세포 배양 배지 중에 존재할 수 있고, H2스템 세포 및 특이적 H2스템 자손의 출현 및 제조 동안 그를 특징화하기 위한, 또는 구체적인 시험관내 및/또는 생체내 용도를 제안하는 특징을 확인하기 위한 분비된 바이오마커로서 사용될 수 있는 분비된 단백질 (예컨대, FGB, CES1, 또는 알파-1-항트립신 및 그의 상응하는 활성)과 함께 확인될 수 있다.
흥미롭게도, 소수의 다른 표면 단백질이 H2스템 세포보다는 ADHLSC 세포에 의해 보다 많이 발현되는 것으로 특징화되었으며, 이는 H2스템 세포 및 특이적 H2스템 자손의 출현 및 제조 동안 그를 특징화하는 대안적 접근법을 제안한다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포를 특징화하는 마커들 중에서 예로 자주 언급되는 CD140b는 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있는 것으로서, SUSD2의 것과는 반대되는 발현 프로파일을 갖는 것으로 보인다. 사실상, 상기 접근법은 대부분의 H2스템 세포에서 SUSD2가 얼마나 강하게 발현되는지, 및 SUSD2 발현이 훨씬 더 낮은 백분율의 ADHLSC 세포에서 어느 정도로 훨씬 더 낮은지를 보여주는데 있어 웨스턴 블롯 분석에 대해 상호 보완적인 것일 수 있고, 그와 조합될 수 있다 (도 10B 및 C). 기능적 특징과 함께, 양성/음성인 바이오마커의 이러한 조합을 통해서 ADHLSC 세포 뿐만 아니라, 앞서 기재된 간 마커 또는 간-특이적 활성을 보이지 않는 중간엽 줄기 세포 (Benz K et al., 2013)로부터 H2스템 세포를 추가로 구별할 수 있다.
추가적으로, 강한 양성성의 항-CD140b 항체가 그의 생산 동안 및/또는 그의 사용 전에 ADHLSC 세포의 품질, 순도, 및/또는 동일성을 평가하는데 사용될 수 있다. 문헌에 열거된 다른 기준 (Najimi M et al., 2007) 및 (이용가능한 경우) 최초 1차 간 세포 제제를 제공한 인간 대상체에 관한 임상 정보와 함께, CD140b의 검출은 추가로 ADHLSC 세포의 제제를 최적화시키고 가장 적절한 치료 용도 및/또는 세포를 투여할 인간 대상체를 선택하는 것을 허용할 수 있다.
표면 마커 및 효소 활성에 대한 이러한 초기 분석은 H2스템 세포 및 ADHLSC 세포에 뿐만 아니라, 상이한 공여자로부터 수득되고, H2스템 세포 (상기 기재된 바와 같음), ADHLSC 세포 (문헌에 기재된 바와 같음), 및 간 유전성 대사 질환, 예컨대 크리글러-나자르 증후군 및 요소 사이클 장애에 관한 임상 연구를 계속하기 위해 보다 높은 규모에서 생성된 ADHLSC 세포를 생성하는데 사용되는 1차 인간 간 세포의 상이한 제제에 걸쳐 적용되는 추가의 프로테오믹 및 트랜스크립토믹 기술의 사용을 가능하게 함으로써 확장되었다.
이들 후자의 세포 (HHALPC로 명명됨)는 특정 제조 및 품질 기준, 예컨대 GMP 조건에 대한 준수, 개선된 성장 속도 및 집단-배가 수준, 및 동결보존 및 임상 용도 이전의 품질 표준에 대한 준수 (즉 세포는 생존 및 미분화 상태로 유지되어야 하고, 양성/음성 마커의 주어진 조합을 보이는 한편, 기능적 간세포로 분화되도록 용량이 유지됨)가 요구된다. 일부 세포 배양 파라미터의 최적화가 요구되는 이러한 상위 과정은 처음에 다중-트레이 스택 (예를 들어 코닝 셀스택(Corning CellStack))에서 수행되고 이어서 다중플레이트 생물반응기 (예를 들어 폴 익스펜션 10(PALL Xpansion 10))로 전달되어, 간 전구 세포, 예컨대 ADHLSC 세포 및, 다음 추후의 H2스템 세포가 균질한 품질 및 양을 갖고 산업적 규모로 제공될 수 있음을 확인시켜 준다 (Egloff M et al., 2013).
그러나, 추가의 임상 적응증에서의 HHALPC 또는 H2스템 세포의 사용 및 제조 방법의 추가의 최적화와 관련하여, 처음에 요구된 기준은 세포 품질의 특징화 및 이러한 방법의 모든 단계 (즉 1차 간 세포, 세포 배양 조건, 제제화, 저장의 선택, 및/또는 환자의 선택)의 최적화를 가능하게 하는 추가의 마커 (세포 표면 단백질, 분비된 단백질이거나, 또는 효소 활성과 관련된 것임)를 확인하여 개선시킬 수 있다. 이러한 추가의 마커 중 일부가 상기에서 열거 및 시험되나, 데이터의 이러한 세트의 구축시에, HHALPC, H2스템 세포, 및 인간 1차 간세포의 샘플에 걸친 추가의 프로테오믹-/트랜스크립토믹-기반 비교는 유동 세포측정법, ELISA, 또는 다른 상업용 키트를 단일 마커 분석 또는 다중 병행 분석의 수준에서 사용하여 (예를 들어 eBD 라이오플레이트(Lyoplate)™ 키트에 함유된 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여) 시험될 수 있는 추가의 관련 마커를 시사한다.
대조 기준 (뿐만 아니라 간 또는 중간엽 세포를 특징화하는 것으로 문헌에 공지된 다른 기준, 문헌 [Yu J, et al., 2012; Santamaria E, et al., 2012; Slany A, et al., 2010; Sison-Young R et al., 2015] 참조)으로 상기 확인된 마커를 사용함으로써, 세포 동일성/품질 및 생물학적 활성/의학적 용도 둘 모두의 수준에서 HHALPC 및/또는 H2스템 세포를 추가로 검증하기 위한 일련의 후보가 확인되었다. 따라서, 이들 후보는 새로운 제조/제제화 과정의 개발 뿐만 아니라 특정 적응증 및/또는 환자 집단에서의 HHALPC 및/또는 H2스템 세포의 사용에 중요할 수 있다.
이러한 후보의 제1 예시는 HHALPC 및 H2스템 세포를 사용하여 생성된 상이한 프로테오믹 및 트랜스크립토믹 데이터 세트에서 강하게 발현되는 것으로 나타난 CD49b (또한 인테그린 알파-2, ITGA2, 또는 콜라겐 수용체로 공지됨) 및 CD51 (또한 인테그린 알파-V, ITGAV, 또는 비트로넥틴 수용체 서브유닛 알파로 공지됨)이다. 그의 양성성은 상이한 기원 또는 제조 특징을 보이는 HHALPC 및 H2스템 세포 제제 뿐만 아니라 처음에 이러한 마커에 대해 음성이었던 인간 1차 간 세포의 동일한 초기 제제로부터 기원된 HHALPC 및 H2스템 세포에서 유동 세포측정법에 의해 확인되었다 (도 11A). 이러한 접근법은 간 기원의 세포 유형에 관한 일부 항목에는 존재하는 것으로 공지되었을지라도, HHALPC 및 H2스템 세포를 사용하여 생성된 상이한 프로테오믹 및 트랜스크립토믹 데이터 세트에서 잘 발현되지 않는 것으로 나타난 바와 같이 나타난 세포 표면 마커 (CD271, 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 16, TNFRSF16, 낮은-친화도 신경 성장 인자 수용체로서 공지됨)에 대하여 확인되었다 (도 11B). 따라서, 이들 마커는 HHALPC 및 H2스템 세포의 확인에 있어서 추가의 양성 (CD49b 및 CD51의 경우) 또는 음성 (CD271의 경우)으로 상기 열거된 기준에 포함될 수 있다.
이들 결과는 HHALPC 및 H2스템 세포를 사용하여 생성된 양성/음성 마커에 관한 오믹스 데이터가 이러한 세포 집단에 걸쳐 유사한 발현 프로파일을 갖는 다른 단백질을 추가의 후보 마커 (세포 유형 둘 모두 또는 그들 사이의 분화에 대해) 또는 추가의 효소 활성인 것으로 규정하는데 사용될 수 있음을 시사하며, 후자는 또한 생체내 및/또는 시험관내 용도에 특정 관심이 있다.
추가의 후보 마커의 제1 카테고리는 유동 세포측정법 또는 다른 면역학적 검정에 의해 검증시에 HHALPC 및 H2스템 세포 (CD29, CD44, CD49b, CD51, CD73, 또는 CD90의 경우) 둘 모두에서 유사한 강한 발현 프로파일을 갖는 세포 표면 단백질을 포함한다 (하기 표 2 참조).
Figure pat00002
추가의 후보 마커의 제2 카테고리는 유동 세포측정법 또는 다른 면역학적 검정에 의해 검증시에 HHALPC 및 H2스템 세포 (CD45, CD117, CD31, CD34, CD133, CD271, 및 CD326의 경우) 둘 다에서 유사한 낮은 발현 프로파일을 갖는 세포 표면 마커를 포함한다 (하기 표 3 참조).
Figure pat00003
추가의 후보 마커의 제3 카테고리는 유동 세포측정법 또는 다른 면역학적 (또는 기능적) 검정에 의해 검증시에 HHALPC (SUSD2 또는 AAT의 경우)와 비교하여 H2스템 세포에서 유사한 보다 높은 발현 프로파일을 갖는 세포 표면 마커 (또는 분비된 단백질)를 포함한다 (하기 표 4 참조).
Figure pat00004
추가의 후보 마커의 제4 카테고리는 유동 세포측정법 또는 다른 면역학적 (또는 기능적) 검정에 의해 검증시에 H2스템 세포 (CD140b의 경우)와 비교하여 HHALPC에서 유사한 보다 높은 발현 프로파일을 갖는 세포 표면 마커 (또는 분비된 단백질)를 포함한다 (하기 표 5 참조).
Figure pat00005
추가의 후보 마커의 제5 카테고리는 관련 기재 및 효소 검정을 사용하여 검증시에 간 생물학적 활성에 관련되고 H2스템 세포 및 HHALPC에서 유사한 보다 높은 발현 프로파일을 갖는 효소를 포함한다 (하기 표 6 참조).
Figure pat00006
추가의 마커의 제6 카테고리는 관련 기질 및 효소 검정를 사용하여 검증시에 간 생물학적 활성과 관련되고 HHALPC (CES1의 경우)와 비교하였을 때 H2스템 세포에서 보다 높은 발현 프로파일을 갖는 효소를 포함한다 (하기 표 6 참조).
Figure pat00007
따라서, 상기 표에서 밝혀진 발견은 어떠한 마커 및 생물학적 활성이 HHALPC 및/또는 H2스템 세포 제제와 연관될 수 있는지를 추가로 확인하고, 이어서 제조 전반에서의 그의 품질 뿐만 아니라 그의 효율적인 제약 용도를 위한 그의 시험관내 또는 생체내 용도를 개선시키기 위한 가디언스를 제공한다.
실시예 4: 마우스 모델에서 주사된 H2스템 세포의 특징화
물질 & 방법
면역조직화학 분석
5 μm 간 절편을 탈파라핀화시키고, 등급화된 알콜 시리즈에서 재수화시켰다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 30분 동안 3% 과산화수소 메탄올 용액에서 인큐베이션시켜 차단시켰다. 절편을 시트르산 1수화물 용액 (pH 6.0) 중에서 98℃에서 35분 동안 인큐베이션시켜 항원 회수를 수행하였다. 사용된 키트에 따라 실온에서 1시간 인큐베이션시켜 비-특이적 면역-염색을 방지하였다. 조각을 인간 항원에 대한 하기 1차 항체와 함께 제조업체 지침에 따라 인큐베이션시켰다: 항-CK19 (다코, 카탈로그 번호 M0888; 희석 1/100), 항-CYP3A4 (엔조, 카탈로그 번호 BML-CR3340-0025; 희석 1/750), 항-알파1-항트립신 (압캠, 카탈로그 번호 ab9399; 희석 1/1000), 및 항-MRP2 (엔조, 카탈로그 번호 Alx-801-016; 희석 1/100). 염색 검출을 엔비전 다코 항-토끼 키트 (항-CYP3A4의 경우) 또는 MOM 키트 (항-MRP2, 항-CK19, 및 항-알파1-항트립신의 경우)에 의해, 발색원성 기질로서 디아미노벤지딘 (시그마, 벨기에)을 사용하여 시각화하였다. 핵을 마이어 헤마톡실린을 사용하여 10분 동안 대조염색하고, 네오-엔텔란® (머크)을 사용하여 현미경검사 분석을 위해 탑재하였다.
결과
H2스템 세포의 임상 용도는 이러한 세포가 실제로 조직, 특히 간 내에 생착하여 증식하는지, 그리고 존재하는 특징이 종양발생 변환 없는 간 분화에 연관되는지 여부 및 어떻게 그러한지를 밝히는 동물 모델에서의 초기 전임상 검증이 요구된다. 이 범주에서, H2스템 세포는 일련의 표준 파라미터 뿐만 아니라 잠재적 임상 용도에 관련된 일부 파라미터를 평가하는 동물 모델에 투여되었다.
H2스템 세포가 암 세포에서 공통적인 특징, 예컨대 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTET)의 변경된 핵형 또는 높은 발현을 보이지 않는 세포 배양물에서 시험된 후에, H2스템 세포의 잠재적 종양발생 효과를 세포가 간내로 투여된 NSG 마우스 모델 (이종이식에 의해 유발되는 세포 거부가 회피된 면역결핍 동물 NOD Scid 감마 마우스; NOD.Cg-PrkdcSCID Il2rgtm1Wjl/SZJ, 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories), 카탈로그 번호 005557)에서 HHALPC와 병행하여 시험하였다. HeLa 세포 (인간 자궁경부 선암종으로부터 유래된 종양발생 세포) 및 주사 비히클 (크리오스토르 5)이 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용된다.
단일 간내 세포 주사 (각각의 세포 유형에 대해 1 x 106개, 20 x 106개/Kg에 등가; 표준 절차에 따른 투여)로부터 6개월 후에, 마우스를 안락사시키고, 기관을 샘플링하여, H2스템 세포도 HHALPC도 음성 대조군에서 수득한 것으로부터 간내 투여시에 유의하게 상이한 수의 종양을 형성하지 않는다는 것을 확인하였다. 이 간내 경로를 사용하여, 어떠한 동물도 주사 동안 사망하지 않았고, 인간 기원의 어떠한 결절 (Ku80 항원에 대해 양성)도 아폽토시스 동안 발견되지 않았다. 게다가, 별개의 군의 동물을 H2스템 세포의 간내 또는 비장내 주사로부터 1주 후에 안락사시켰으며, 인간, Ku80-양성 세포의 응집체가 그의 간에서 발견되었고, 이는 H2스템 세포가 급속하게 생착될 수 있음을 입증한다. 따라서, 간내 주사에 의해 투여되는 HHALPC 및 H2스템을 기반으로 하는 세포 요법 치료는 안전하고, 종양 형성으로부터 안전하다.
보다 기능적인 검정에서, FAH 유전자를 또한 발현하는 H2스템 세포 (RT-PCR 및 트랜스크립토믹 데이터에 따름)를 FRG 마우스 모델에서 간내로 또는 비장내로 주사하였다. 이 연구는 양성 대조군으로서 동일한 수의 인간 1차 간세포를 사용하여 간 기능이 결여된 간 (기능적 FAH 유전자가 결여된 FAH 마우스, 인간 티로신혈증에서와 유사함)에서의 H2스템 세포의 생착, 재증식, 및 분화의 평가를 가능하게 한다. 시험관내 데이터를 확인하여, H2스템 세포가 마우스 혈청에서 인간 알부민을 분비하며, 여기서 이는 수주 동안 축적된다는 것이 확립되었다 (도 12A). 간내로 H2스템 세포- 또는 간세포-주사된 동물의 간을 형태학적으로 분석하고 일련의 인간 마커를 면역조직화학에 의해 분석한 경우, Ku80-양성 세포가 증식 및 간에서 분화된 세포의 유사한 큰 응집체를 형성하였고 (도 12B), 이는 H2스템 세포가 간-활성 세포를 필요로 하는 간의 재증식을 가능하게 한다는 것을 시시한다. 이들 세포 응집체는 간 효소, 예컨대 인간 아르기나제 및 OTC에 대해 강하게 양성이다 (도 12C). 이와 동시에, 다른 효소, 예컨대 알파-1-항트립신 및 CYP3A4가 또한 이들 생체내 분화된 H2스템 세포에서 검출되는 경우, CK-19 양성성은 사라진다 (도 12D). 이들 데이터는 H2스템 세포가 시험관내에서 보이는 간 활성을 유지하면서 (증가하지 않는 경우), H2스템 세포가 간 내에서의 그의 생착 및 증식 후에 비-간 마커의 일부를 잃고 보다 더 간-유사한 프로파일 (CK-19를 잘 발현하지 않는 간세포)을 획득한다는 것을 시사한다.
이들 생체내 모델은 간-활성 세포를 갖는 인간 간의 재증식을 요구하는 의학적 용도 (예컨대 특정 선천성 대사 간 장애 또는 급성/외상성 주요 간 손상에서, 또는 간 이식에 대한 대안으로서)를 위한 H2스템 세포의 적합성 뿐만 아니라 기능적 간세포에 의해 자연적으로 발현되는 효소, 성장 인자, 및 다른 단백질 (예컨대 관련 장애에 의해 이환된 환자의 경우에 응고, 간경변증, 또는 섬유증에 관련된 것) 또는 유전자 변형된 H2스템 세포에 의해 적절하게 발현되는 비-간 단백질 (예컨대 매우 다양한 적응증, 예컨대 암, 당뇨병, 또는 염증성 장애의 치료에 유용할 수 있는 항체 또는 호르몬)을 전신 전달하기 위해 이러한 세포를 사용할 가능성을 확인시켜 준다. 간 재증식 및 재생과 관련하여 간세포 또는 간 전구 세포 (예컨대 H2스템 세포)의 투여를 검증하기 위한 추가의 전임상 모델 및 접근법이 문헌에서 검토되었다 (서적 ["Liver Regeneration Basic Mechanisms, Relevant Models and Clinical Applications", Edit.:Udayan M. Apte, Elsevier 2015] 참조).
참고 문헌
Figure pat00008
Figure pat00009

Claims (1)

  1. 성체 간 전구 세포를 포함하는 단리된 세포 집단의 용도.
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