ES2954834T3

ES2954834T3 - Método para producir células progenitoras del hígado adulto

Info

Publication number: ES2954834T3
Application number: ES15759717T
Authority: ES
Inventors: Etienne Sokal; Sarah Snykers; Tuba Baran; Kris Gellynck; Luca Falciola
Original assignee: Cellaion SA
Current assignee: Cellaion SA
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2023-11-27
Anticipated expiration: 2035-08-28
Also published as: LT3140393T; PT3140393T; SA517380984B1; JP2017530697A; BR112017003996A2; WO2016030525A1; US20170240863A1; EA201790357A1; JP2020127423A; AU2015308341B2; PL3140393T3; MA39959A; EP3140393A1; KR20170002664A; US20200095554A1; FI3140393T3; CN106795489A; KR102101060B1; SG11201701109WA; MX2017002667A

Abstract

Se han caracterizado nuevas células progenitoras hepáticas adultas (llamadas células madre H2) sobre la base de una serie de actividades y marcadores biológicos. Los métodos para producir células madre H2 permiten proporcionar dichas células en forma de células adherentes y grupos de células tridimensionales en suspensión que pueden diferenciarse en células que tienen fuertes actividades específicas del hígado y/o que pueden usarse para tratar enfermedades hepáticas o para evaluar la eficacia, metabolismo y/o toxicidad de un compuesto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir células progenitoras del hígado adulto

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a células progenitoras del hígado adulto que se generan utilizando células hepáticas primarias y su uso para la gestión médica de enfermedades hepáticas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El hígado es un órgano clave en la regulación de la homeostasis corporal y es el sitio de muchas vías metabólicas vitales. El deterioro de una sola proteína dentro de una vía metabólica compleja podría ser muy perjudicial. La gran presencia de enzimas hepáticas importantes aumenta sustancialmente el riesgo de aparición de diversas enfermedades hepáticas. En total, existen 200 errores congénitos diferentes del metabolismo hepático, que afectan a 1 niño entre 2500 nacidos vivos. Los tratamientos actuales y la gestión a largo plazo no son lo suficientemente eficientes. Lee et al., 2010 describe el uso de albúmina (diálisis de albúmina de paso único) en el tratamiento de enfermedades hepáticas, usando terapia de reemplazo renal continua que, sin embargo, tiene una serie de limitaciones. El trasplante de hígado ortotópico (OLT, por sus siglas en inglés) es altamente intrusivo, irreversible, limitado por la escasez de injertos de donantes y exige una cirugía de vanguardia. El trasplante de células hepáticas (LCT, por sus siglas en inglés) puede ejercer solo una eficacia de corto a medio plazo debido a la calidad de las preparaciones de hepatocitos. Mejoras adicionales en la tolerancia hacia la crioconservación, el injerto permanente y la alta funcionalidad de las células infundidas serían un gran avance (Sokal EM, 2011; Russo FP y Parola M, 2012; Allameh A y Kazemnejad S, 2012; Parveen N et al., 2011).

Esta mejora podría lograrse mediante el uso de células madre o progenitoras, en particular células progenitoras hepáticas que se han identificado en la bibliografía utilizando tejidos hepáticos de diferentes organismos, así como en tejidos hepáticos fetales o adultos (Schmelzer E et al., 2007; Sahin MB et al., 2008; Azuma H et al., 2003; Herrera MB et al., 2006; Najimi M et al., 2007; Darwiche H y Petersen BE, 2010; Shiojiri N y Nitou M, 2012; Tanaka M y Miyajima A, 2012; Berardis et al., 2014; Khuu DN et al., 2013). Células de este tipo pueden proporcionar, tras la exposición a estímulos hepatogénicos in vitro y/o tras la administración in vivo, células con características morfológicas y funcionales típicamente asociadas a la diferenciación hepática tales como actividades enzimáticas de fase I/II.

Estas células progenitoras hepáticas o células similares a los hepatocitos que se generan a partir de ellas se pueden utilizar en trasplantes celulares, así como para pruebas de fármacos en el desarrollo de nuevos fármacos, ya que representan un sustituto de los hepatocitos humanos primarios en el metabolismo de fármacos y en la detección farmacológica o toxicológica in vitro (Dan YY, 2012; Hook LA, 2012). Sin embargo, actualmente es imposible determinar cuáles de las células progenitoras hepáticas identificadas hasta ahora son las mejores para la terapia de una enfermedad o uso determinado. Esto se debe en gran parte a la gran variabilidad en los métodos utilizados para caracterizar las células y su capacidad de diferenciación, la variabilidad en los modelos de trasplante y los métodos inconsistentes para determinar el efecto del injerto celular in vivo.

Los esferoides de hepatocitos u organoides hepáticos, que son agregados multicelulares esféricos de hepatocitos de más de 50 μm de diámetro, pueden proporcionar una construcción de tejido tridimensional útil para el trasplante de células y los hígados bioartificiales. Para la formación de esferoides a partir de hepatocitos de mamíferos, se han empleado varios métodos, tales como el cultivo de hepatocitos en superficies plásticas no adherentes para el autoensamblaje y el cultivo rotativo a través de matraces giratorios (Lu Y et al., 2012; Saito R et al.., 2011; Soto-Gutiérrez A et al., 2010; Mitaka T y Ooe H, 2010; Tostoes RM et al., 2012). Estas estructuras pueden generarse proporcionando un soporte adecuado al crecimiento tridimensional de las células, en particular imitando sus interacciones con el microentorno del hígado y especialmente con la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés).

Existe evidencia considerable de estudios in vivo de que las proteínas de la matriz afectan la activación, expansión, migración y diferenciación de las células progenitoras del hígado adulto, pero la información sobre el papel que desempeñan las proteínas de la ECM específicas en las actividades in vivo e in vitro aún es limitada (Zhu C et al., 2013). Se han publicado algunas evidencias sobre la expresión de proteínas ECM en células progenitoras del hígado (Najimi M et al., 2007; Miyazaki M et al., 2007) o sobre su perfil inmunológico (Busser H et al., 2015; Najar M et al., 2012; Najar M et al., 2013; Raicevic G et al., 2015) en células madre mesenquimales y, en particular, en células progenitoras del hígado.

Sin embargo, no hay evidencia de cómo se pueden producir en cultivo celular células progenitoras del hígado u otras células pobremente diferenciadas de origen hepático que presentan una combinación específica de marcadores hepáticos, marcadores mesenquimales y actividades metabólicas específicas del hígado y que forman conglomerados de células tridimensionales, sin hacer uso de soluciones técnicas inadecuadas y/o complejas que involucren células madre embrionarias o pluripotentes, tecnologías de ADN recombinante o productos químicos. Adicionalmente, la fabricación industrial de células progenitoras del hígado para uso clínico requiere identificar criterios adicionales y fiables que permitan caracterizar su calidad a lo largo del proceso para su producción, formulación y/o selección del paciente y consecuentemente su eficiente preparación y uso farmacéutico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Diagrama de flujo que compara el proceso de obtención y uso de células ADHLSC y células H2Stem.

Tanto las células ADHLSC como las células H2Stem se pueden preparar a partir de células primarias aisladas de hígado humano que se pueden usar directamente o preparando preparaciones crioconservadas de células primarias de hígado humano para almacenamiento a largo plazo, en particular de hígado humano adulto. Las células H2Stem con características mejoradas específicas del hígado y una morfología meso-epitelial cuboide se pueden utilizar para generar progenie H2Stem para aplicaciones in vivo o in vitro apropiadas, ya sea en condiciones de cultivo celular bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) (es decir, manteniendo células H2Stem y progenie H2Stem como células adherentes o en matraces y otros recipientes con propiedades de baja adherencia celular, respectivamente). La progenie H2Stem tridimensional está formada por conglomerados de células que se caracterizan por medio de marcadores específicos y/o actividades biológicas. Inicialmente, las células H2Stem se pueden utilizar para generar, con o sin una expansión intermedia como células adherentes (p. ej., en un sustrato como el colágeno), una progenie H2Stem que se caracteriza como células similares a los hepatocitos adherentes diferenciadas (células H2Screen) o conglomerados tridimensionales que comprenden células progenitoras del hígado (células H3Stem). Cada uno de estos dos tipos de progenie H2Stem se puede utilizar además para generar progenie H2Stem tridimensional que comprende células altamente metabólicamente activas que se definen respectivamente como células H3Screen-1 y células H3Screen-2, de acuerdo con dos protocolos alternativos para generarlas. Las células H3Screen-2 también se pueden generar directamente a partir de progenie H2Stem (es decir, sin el paso de obtener células H3Stem) mediante el cultivo de progenie H2Stem en condiciones tridimensionales y en un medio de cultivo celular que proporciona una diferenciación específica del hígado in vitro. Dependiendo de las condiciones de cultivo celular en donde se mantengan las células H3Screen, estas células pueden formar formatos alternativos de conglomerados de células tridimensionales en suspensión (células H3Screen-2a y células H3Screen-1) o como células adherentes (células H3Screen-2b y células H3Screen-2c). El almacenamiento a largo plazo mediante crioconservación es aplicable tanto a las células ADHLSC como a las células H2Stem si es necesario (es decir, si la expansión, la diferenciación y/o el cultivo como progenie H2Stem tridimensional no es inmediato, sino que se aplica más adelante en el proceso), así como a una progenie H2Stem específica en un estado estructural o de diferenciación dado.

Figura 2: Características que distinguen las células ADHLSC adherentes e indiferenciadas o los hepatocitos humanos primarios de las células H2Stem adherentes e indiferenciadas y la progenie H2Stem cuando se cultivan en un sustrato como el colágeno. Morfológicamente, las células ADHLSC no diferenciadas aparecen como una población homogénea de células alargadas, mientras que las células H2Stem aparecen como una población homogénea de células meso-epiteliales cuboidales (A). Cuando se analizan mediante inmunocitoquímica utilizando un anticuerpo anti-CK-19, los hepatocitos humanos primarios aparecen (como células ADHLSC) expresando pobremente CK-19, mientras que las células H2Stem aparecen como altamente positivas para CK-19, con núcleos rodeados de filamentos (B) más oscuros fuertemente positivos para CK-19. Las células se fotografiaron con un aumento de 10X (A) o 40x para (B).

Figura 3: Morfología de las células H2Stem que se obtienen mediante el cultivo de células hepáticas primarias en condiciones de cultivo celular apropiadas. Se tomaron imágenes utilizando equipos Cell-IQ cada hora en la misma posición en la placa desde los días 1 a -8 y se realizó una selección de imágenes en las horas indicadas para mostrar la transición morfológica de las células hepáticas primarias a un conglomerado de células H2Stem adherentes, en proliferación. Las células se fotografiaron con un aumento de 20x.

Figura 4: Características que distinguen las células ADHLSC diferenciadas y adherentes de las células H2Screen no diferenciadas y adherentes cuando se cultivan en un sustrato como el colágeno. Morfológicamente, después de la diferenciación como células adherentes, las células ADHLSC aparecen como una población de células homogénea poligonal no granular (A, panel izquierdo, fase temprana), mientras que una progenie H2Stem que comprende células H2Screen aparece como una población homogénea de células granulares, células cuboidales/poligonales con soporte estromal que, en una fase más avanzada de cultivo celular y diferenciación, pueden formar conglomerados de células distribuidas dentro de grandes estructuras estromales (A, panel derecho, fase tardía). En estas últimas imágenes, el recuadro blanco 1 indica que comienzan a aparecer zonas de células con morfología similar a los hepatocitos y canalículos biliares; el recuadro blanco 2 indica una zona con células binucleadas y matriz extracelular. Las células se fotografiaron con un aumento de 20x. Células ADHLSC diferenciadas y células H2Screen se caracterizaron de acuerdo con su actividad CYP3A4 (B) y secreción de urea (C). El nivel de referencia de actividad es 10 9 pmol/célula/4h y 5 pg/célula/24h, respectivamente. También se midieron niveles de secreción de urea más altos para las células H2Screen, en comparación con las células ADHLSC, realizando los ensayos durante períodos más cortos (2-6 horas). La inmunohistoquímica (D) confirma aún más la fuerte expresión de H2Screen, en comparación con el control negativo (sin anticuerpo primario), de albúmina intracelular y CK-19, así como del transportador de salida MRP2 (en la interfaz entre las células; véanse las flechas).

Morfología de distintas formas de progenie H2Stem que consiste en conglomerados de células tridimensionales. Las células H3Stem forman inicialmente conglomerados de aproximadamente 50 100 |um con un núcleo más denso de células que luego pueden formar estructuras más grandes (de hasta 1000 |um o más) y que comprenden 100000 o más células (A) de este tipo. Las células H3Screen-1 que se obtienen a partir de las células H2Screen aparecen como un conglomerado de células granulares cuboidales/poligonales, similares a los hepatocitos, rodeadas de estroma de soporte (B). Las células H3Screen-2a también consisten en conglomerados tridimensionales de células granulares cuboidales/poligonales parecidas a hepatocitos rodeadas de estroma de apoyo que se puede obtener mediante la diferenciación in vitro utilizando placas de baja unión (C) o pocillos de baja unión en forma de U, en que se obtienen células H3Screen-2a tridimensionales más uniformes (D; también las células H3Stem forman estructuras similares cuando se utiliza el mismo enfoque para cultivarlas). Finalmente, cuando las células H3Screen se cultivan en un sustrato como el colágeno, las células H3Screen-2b resultantes aparecen como conglomerados adherentes de células que son similares a los hepatocitos y se distribuyen dentro del estroma de soporte y extensas estructuras granulares intracelulares (E; el recuadro blanco en el panel 1 está ampliado en el panel 2). Las células se fotografiaron con un aumento de 10x (panel 1 de E).

Distintos tipos de progenie H2Stem pueden proporcionar progenie H2Stem tridimensional que tiene un tamaño homogéneo de acuerdo con diferentes enfoques. El diagrama de flujo resume los pasos para obtener preparaciones celulares (A) de este tipo. Se utiliza una progenie H2Stem específica para sembrar células, en un volumen y una concentración dados, en cada uno de los matraces de cultivo celular de fijación ultrabaja, agregando 5 ml de medio de cultivo celular fresco con la misma frecuencia. De lo contrario, se pueden utilizar microplacas de cultivo de células redondas/en forma de U de fijación ultrabaja que contienen 96 pocillos para sembrar y hacer crecer estas células con el fin de obtener una estructura similar a una esfera para cada uno de los pocillos. La Progenie H2Stem tridimensional resultante se puede utilizar en el mismo pocillo (sustituyendo el medio de cultivo celular y/o añadiendo reactivos) o después de transferir y combinar el contenido de 2, 5, 10 o más pocillos en un recipiente adecuado. La foto en el cuadro de texto en la parte inferior del diagrama de flujo en (A) muestra una preparación agrupada de células H3Screen-2a, pero es representativa de otra progenie H2Stem tridimensional que no está diferenciada (células H3Stem) o está diferenciada (células H3Screen-1) y se obtiene utilizando el mismo enfoque. Se puede comparar la morfología de las estructuras similares a esferas que comprenden células H3Stem o células H3Screen-2a que se generan utilizando las microplacas de cultivo celular en forma de U/redondas de fijación ultrabaja (B). Debido a la diferenciación que proporciona células más grandes, las estructuras en forma de esfera que comprenden las células H3Screen-2a son más grandes que las estructuras en forma de esfera que comprenden un número equivalente de células H3Stem.

Comparación de la expresión de proteínas y las actividades de las enzimas hepáticas en diferentes categorías de Progenie H2Stem y en una preparación de hepatocitos humanos primarios. Se compara la actividad de CYP3A4 a lo largo de un período de 4 horas (A). El análisis de transferencia Western (B) muestra que, en presencia de cantidades similares de proteína en los extractos (como se confirmó mediante el uso de un anticuerpo anti-beta actina como control), las células H2Stem presentan una cantidad baja de proteínas SULT1 y UGT1A que son más expresadas en células H3Stem y (en particular para SULT1) en células H3Screen-2a. Múltiples bandas son visibles para SULT1, ya que el anticuerpo que se ha utilizado es una preparación comercial de un anticuerpo policlonal de conejo que reconoce un epítopo común a diferentes isoformas humanas de SULT1A (Sulfotransferasa 1A1, 1A2 y 1A3) y presenta reacción cruzada parcial con otra familia de miembros de la familia SULT de origen humano (véase la descripción para anticuerpo H-55 de SULT1; Santa Cruz cat. N° sc-32928). Los datos sobre la expresión de proteínas se confirman cualitativamente ensayando las actividades enzimáticas correspondientes (C). La capacidad de las células H3Stem y las células H3Screen-2a para absorber tres sustratos químicos específicos (taurocolato, estrona-3-sulfato, 1 -metil-4-fenilpiridinio) por sus respectivos transportadores (polipéptido co-transportador de taurocolato de sodio, NTCP; polipéptido transportador de aniones orgánicos, OATP; transportador de cationes orgánicos, OCT) se ha determinado en células de este tipo en dos intervalos, con un perfil cinético de la absorción que confirma cómo H3Screen-2b muestra un proceso genuinamente activo, y no un simple proceso de difusión pasiva, para compuestos (D) de este tipo. Se obtuvieron datos cualitativamente equiparables sobre la metabolización basal e inducida de fármacos por enzimas de Fase I (fenoacetina por CYP1A2; bupropión por CYP2B6; diclofenaco por CYP2C9; midazolam por CYP3A4) después de 4 horas, comparando H3Stem y H3Screen-2a con hepatocitos primarios.

Figura 8: Otras actividades y marcadores específicos del hígado caracterizan a progenie H2Stem. La actividad de la carboxilasa hepática (actividad CES1) se comparó con células ADHLSC, la línea celular de referencia HepG2, los hepatocitos primarios, las células H2Stem y las células H3Stem lo largo del período de tiempo indicado (A). La secreción de alfa-1 -antitripsina (AAT) se ha comparado utilizando ELISA entre células ADHLSC y células H2Stem (B).

Figura 9: El proteoma de las células ADHLSC y las células H2Stem se puede caracterizar mediante el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés), identificando grupos de proteínas que están sobrerrepresentados / sub-representados en estas poblaciones específicas de células progenitoras del hígado adulto cuando se comparan entre sí. El proteoma general de distintas preparaciones de células se representa gráficamente (véanse puntos para distintas preparaciones de células ADHLSC y estrellas para distintas preparaciones de células H2Stem). Este enfoque permite concluir que las diferentes preparaciones de células ADHLSC y células H2Stem aún pueden agruparse por el tipo de célula (A). Este análisis basado en proteoma sobre la presencia (o ausencia) combinada de proteínas específicas (o isoformas de proteínas) según lo establecido por un enfoque de este tipo puede validarse aún más mediante estudios basados en transcriptómica, RT-PCR o mediante tecnologías basadas en anticuerpos (tales como Citometría de Flujo, Transferencia Western, Inmunocitoquímica). Este enfoque también se puede aplicar para identificar marcadores que distingan las células H2Stem (o un tipo de progenie H2Stem) de otras poblaciones celulares in vivo y/o in vitro, así como para evaluar las actividades metabólicas específicas del hígado o las características específicas de las células H2Stem entre diferentes preparaciones de células H2Stem o Progenie H2Stem.

Figura 10: Las proteínas de la superficie celular se pueden utilizar como biomarcadores para distinguir células H2Stem de células ADHLSC. Una proteína de la superficie celular denominada proteína 2 que contiene el dominio de Sushi (SUSD2) se expresa mucho más fuerte cuando se comparan los extractos de proteínas de células H2Stem y ADHLSC mediante Transferencia Western, utilizando un anticuerpo anti-SUSD2 y (como control de la cantidad de proteínas totales en la muestra) un anticuerpo anti-beta actina (A). Cuando el análisis se realiza mediante FACS para comparar la expresión de SUSD2 con otro marcador de la superficie celular tal como CD140b y el punto de corte entre las células que expresan y las que no expresan se coloca en la intensidad en donde el 3% de las células es positivo para el control de isotipo negativo, la diferencia en la expresión de SUSD2 parece más reducida, especialmente cuando se compara la positividad de CD140b, lo que claramente permite diferenciar entre células H2Stem de baja expresión y células ADHLSC de alta expresión (B). Sin embargo, los detalles sobre la distribución de la intensidad de la señal para el fluoróforo específico en células positivas (PE-pos) demuestran que aquellas células ADHLSC que expresan SUSD2 en realidad lo expresan a niveles mucho más bajos que las células H2Stem, mientras que los datos de CD140b demuestran que este marcador está claramente fuertemente expresado solo en una gran mayoría de células ADHLSC.

Figura 11: Se pueden usar proteínas de la superficie celular adicionales como biomarcadores para caracterizar las células H2Stem y HHALPCs. A) Detalles sobre la distribución de la intensidad de la señal de citometría de flujo (usando el mismo punto de corte del 3% entre las células que expresan y las que no expresan que se coloca para el control negativo de isotipo) para el fluoróforo específico en células positivas (PE-pos) usando un anticuerpo anti-CD49b humano o un anticuerpo anti-CD51 para la preparación inicial de células hepáticas humanas primarias (que comprenden principalmente hepatocitos, paneles superiores) que se ha utilizado para producir HHALPCs (paneles centrales) y células H2Stem (paneles inferiores). B) Las mismas preparaciones de células se analizaron de manera similar mediante citometría de flujo usando un CD271 anti-humano, comparándolo además con una línea celular humana denominada LX-2 como control positivo (Castilho-Fernandes A et al., 2011).

Figura 12: Actividad y presencia de células H2Stem que se inyectan en el modelo de ratones FRG. A) Se inyectan células H2Stem o hepatocitos humanos primarios por vía intra-hepática o intra-esplénica y se mide la concentración de albúmina humana (hAlb) en el suero en el control y en diferentes momentos después de la inyección (se muestran datos ejemplares para ratones M1 y M2 por cada uno de los tratamientos). B) Inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés) de cortes de hígado obtenidos por ratones FRG en donde se inyectaron células H2Stem o hepatocitos humanos primarios por vía intrahepática, utilizando el antígeno nuclear Ku80 como marcador de células de origen humano que se injertan, diferencian y proliferan en tejido hepático de ratón (los conglomerados de células humanas están dentro de la zona limitada por líneas discontinuas blancas). Las células se fotografiaron con un aumento de 10x. C) Inmunohistoquímica de cortes de hígado obtenidos de ratones FRG en los que se inyectaron células H2Stem por vía intrahepática, mostrando la presencia de conglomerados de células de origen humano que se injertan, se diferencian, proliferan y expresan Arginasa humana (ARG1) en tejido hepático de ratón (la zona de recuadro del panel izquierdo está ampliada en el panel derecho; se generaron datos similares para el gen Ornitina Carbamoiltransferasa y Albúmina). Las células fueron fotografiadas con un aumento de 1 x y 4x, respectivamente. D) Inmunohistoquímica de cortes de hígado obtenidos de ratones en los que se inyectaron células H2Stem por vía intrahepática, mostrando la presencia de conglomerados de células de origen humano (dentro de la zona limitada por líneas discontinuas blancas) que se injertan, diferencian y proliferan, perdiendo la expresión de Citoqueratina-19 (panel izquierdo) al tiempo que mantienen una fuerte expresión de alfa-1-antitripsina (AAT, difundida por todo el conglomerado de células) y Citocromo P4503A4 (CYP3A4, concentrado principalmente en zonas en el borde externo de cada uno de los conglomerados de células). La distribución del transportador de salida MRP2 en la interfaz entre las células (véase la Fig. 4D) también se confirmó utilizando este modelo animal dentro de los mismos conglomerados de células humanas. Las células se fotografiaron con un aumento de 10x.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en la observación de que las condiciones específicas de cultivo celular permiten obtener nuevas células progenitoras del hígado adulto con un perfil de expresión específico y características biológicas mejoradas y que pueden utilizarse para producir composiciones farmacéuticas basadas en células que pueden administrarse para el tratamiento de enfermedades del hígado, o células metabólicamente activas y hepato-activas que pueden usarse para caracterizar la eficacia, el metabolismo y/o la toxicidad de un compuesto.

Las células descritas en el presente documento, denominadas células H2Stem, que no forman parte de la presente invención, representan una población celular que tiene características morfológicas y funcionales que son distintas de las identificadas en las células progenitoras del hígado adulto descritas anteriormente que se aíslan o se producen de otro modo a partir de donantes humanos, en particular con respecto al alto nivel de expresión de proteínas que proporcionan actividades metabólicas específicas del hígado (p. ej., actividad CYP3A4) en combinación con al menos un marcador mesenquimal (por ejemplo, seleccionado de vimentina, CD90, CD73, CD29, CD44, alfa actina del músculo liso) y al menos un marcador hepático (por ejemplo, seleccionado de albúmina, HNF-3b, HNF-4). Además, en algunas realizaciones, marcadores intracelulares adicionales pueden proporcionar criterios relevantes para caracterizar células H2Stem, como la presencia significativa de células que expresan citoqueratina 19.

Uno o más marcadores de superficie pueden proporcionar criterios relevantes para caracterizar las células progenitoras del hígado (en particular, células H2Stem, pero también otras células identificadas en la bibliografía tales como las células ADHLSC; véase Najimi M et al., 2007, Khuu DN et al., 2011; Scheers I et al.2012) durante su fabricación que permiten producir preparaciones farmacéuticas de células de este tipo con viabilidad, proliferación, almacenamiento y/o características funcionales mejoradas. Estos uno o más marcadores de la superficie celular, cuando su determinación se combina con la determinación de los marcadores que caracterizan células de este tipo, pueden ayudar a guiar las mejoras en la fabricación, formulación y/o condiciones médicas para usos y preparaciones farmacéuticas específicos.

Células H2Stem que se obtienen o se pueden obtener mediante los métodos descritos en el presente documento se definen como una población celular que es positiva para al menos un marcador mesenquimal (opcionalmente seleccionado de ASMA, vimentina, CD90, CD73, CD44 y CD29), que es positiva para al menos un marcador hepático (opcionalmente seleccionado de HNF-4, HNF-3B y albúmina) y es positiva para al menos una actividad metabólica específica del hígado (opcionalmente seleccionada de secreción de urea, conjugación de bilirrubina y actividad de CYP3A4). Adicionalmente, las células H2Stem pueden comprender, además, una o más de las siguientes propiedades adicionales: comprender al menos un 20%, entre un 20% y un 90%, o entre un 20% y un 40% de células positivas para citoqueratina 19 (cuando se mide por citometría de flujo), ser positivas para un marcador para la proteína que contiene el dominio 2 de Sushi, presentar una morfología meso-epitelial cuboidal (es decir, una morfología similar a las células epiteliales derivadas del mesodermo), ser positivas para al menos un marcador adicional (seleccionado de CD49b, CD51, y los enumerados en la Tabla 2 o la Tabla 4) y/o ser capaz de formar conglomerados de células tridimensionales que presentan actividades metabólicas específicas para el hígado.

También se describe, pero no forma parte de la presente invención, una célula progenitora del hígado adulto que se mide como positiva para una combinación de actividades biológicas y para marcadores que pueden identificarse en su superficie, intracelulares y/o secretados, incluidos los siguientes:

(a) al menos un marcador hepático seleccionado de albúmina, HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 y CYP3A4;

(b) al menos un marcador mesenquimal seleccionado de vimentina, CD90, CD73, CD44 y CD29;

(c) al menos una actividad específica para el hígado seleccionada de secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1-antitripsina y actividad de CYP3A4;

(d) proteína 2 que contiene el dominio Sushi (SUSD2);

(e) al menos un marcador adicional seleccionado de CD49b y CD51; y

(f) citoqueratina-19 (CK-19).

Esta célula progenitora del hígado adulto se puede caracterizar, además, por una serie de marcadores negativos, en particular, células H2Stem se pueden medir como negativas para uno o más de CD140b, CD45, CD117, CD31, CD133, CD271 y CD326. Otros marcadores negativos candidatos son los enumerados en la Tabla 3 y la Tabla 5. En realizaciones adicionales, las células H2Stem también pueden medirse como positivas para una o más de las siguientes actividades y marcadores: citoqueratina-18 (CK-18); alfa actina del músculo liso (ASMA); una o más proteínas secretadas relacionadas con la coagulación (tales como fibrinógeno alfa, fibrinógeno beta, fibrinógeno gamma, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor XI y Factor XIII); una o más actividades adicionales específicas del hígado (tales como actividad de sulfotransferasa, actividad de triptófano-2,3-dioxigenasa, actividad de carboxilasa hepática, metabolismo de amoníaco y almacenamiento de glucógeno).

Las actividades biológicas, los marcadores y las características morfológicas/funcionales enumeradas anteriormente pueden estar presentes en las células H2Stem en diversas combinaciones diferentes. Las células H2Stem se pueden medir:

(a) positivas para albúmina, vimentina, CD90, CD73, secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1 -antitripsina, actividad de CYP3A4, proteína 2 que contiene el dominio Sushi, citoqueratina-19 y actividad de carboxilasa hepática; y también

(b) negativas para CD140b y CD271.

También se pueden determinar criterios adicionales para células H2Stem en cualquier combinación funcional y técnica, por ejemplo, mediante la medición positiva de:

- al menos un marcador hepático adicional seleccionado de HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 y CYP3A4;

- al menos un marcador mesenquimal adicional seleccionado de CD44 y CD29;

- al menos una actividad específica del hígado adicional seleccionada de actividad de sulfotransferasa, actividad de triptófano-2,3-dioxigenasa, metabolismo de amoníaco y almacenamiento de glucógeno;

- al menos uno de citoqueratina-18 (CK-18) y alfa actina del músculo liso (ASMA);

- al menos uno de ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 y CD81;

- al menos uno de HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM y APOC1; y/o

- al menos una proteína secretada relacionada con la coagulación seleccionada de fibrinógeno alfa, fibrinógeno beta, fibrinógeno gamma, Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor XI y Factor XIII.

Las células H2Stem también pueden medirse como positivas para una o más de las actividades enzimáticas que se enumeran en la Tabla 6 y la Tabla 7. Preferiblemente, las células H2Stem pueden medirse como negativas para al menos un marcador adicional seleccionado entre CD45, CD117, CD31, CD133, CD271 y CD326. Las células H2Stem también se pueden medir como negativas para uno o más de los siguientes marcadores: ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5 y NCAM1. Adicionalmente, las células H2Stem también se pueden medir como negativas para uno o más de los siguientes marcadores: m Mp 1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2 y HMCN1. Las células H2Stem pueden presentar una morfología y/o características funcionales específicas. En particular, las células H2Stem pueden ser adherentes y pueden presentar una morfología meso-epitelial cuboidal. Además, las células H2Stem pueden ser más capaces de formar conglomerados de células tridimensionales en suspensión (denominados células H3Stem). Como se resume en la Figura 1, tanto las células H2Stem como H3Stem pueden diferenciarse aún más en células que presentan fuertes actividades específicas del hígado, siendo células adherentes (denominadas células H2Screen) y conglomerados de células tridimensionales en suspensión (denominadas células H3Screen).

De hecho, las células H2Stem se pueden usar para proporcionar poblaciones de células aisladas adicionales, agrupadas colectivamente bajo el nombre de progenie H2Stem, que comprenden células H2Stem como se define anteriormente que se obtienen haciéndolas pasar en condiciones de cultivo celular. En particular, la progenie H2Stem resulta del mantenimiento, proliferación y/o diferenciación de células H2Stem en condiciones de cultivo celular (o después de la implantación en un modelo animal), según se requiera para el uso deseado, y en particular como conglomerados de células tridimensionales (progenie H2Stem tridimensional). Estas estructuras tridimensionales no solo presentan actividades metabólicas específicas del hígado mejoradas y mantienen una combinación de marcadores celulares específicos, sino que también proporcionan progenie H2Stem en un formato que es particularmente apropiado para establecer formulaciones para usos terapéuticos y detección de alto rendimiento.

Por lo tanto, la población celular anterior incluye la progenie H2Stem aislada que comprende células que presentan la actividad biológica, los marcadores, la morfología y/o las características funcionales enumeradas anteriormente en una gran mayoría (p. ej., al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%). En una realización preferida, una población de células H2Stem comprende al menos un 60%, o entre un 60% y un 99% o entre un 70% y un 90% de células que se miden:

(a) positivas para albúmina, vimentina, CD90, CD73, secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1 -antitripsina, actividad CYP3A4, proteína 2 que contiene el dominio Sushi, citoqueratina-19, CD49b, CD51 y actividad carboxilasa hepática; y

(b) negativas para CD140b y CD271.

Además, la progenie H2Stem se puede proporcionar como células adherentes o formando conglomerados de células tridimensionales en suspensión, que se hacen pasar, como células adherentes o como conglomerados de células tridimensionales, no más de 2, no más de 3, no más de 4 o más de 5 veces en cultivo. Una progenie H2Stem de este tipo también presenta, preferiblemente, actividad dependiente de CYP de Fase I inducible y captación de taurocolato, estrona-3-sulfato o 1 -metil-4-fenilpiridinio. Además, una población celular de este tipo puede diferenciarse adicionalmente en células que presentan actividades específicas del hígado, in vitro e in vivo.

Células H2Stem y progenie H2Stem también se pueden modificar por medio de uno o más agentes químicos, medios de cultivo celular, factores de crecimiento y/o vectores de ácidos nucleicos para cualquier uso in vivo o in vitro que requiera agregar o eliminar de manera adecuada cualquier propiedad de células de este tipo.

También se describe y no forma parte de la invención un método que permite producir células H2Stem y progenie H2Stem mediante un método para obtener células progenitoras del hígado adulto, que comprende:

(a) disociar hígado adulto o una parte del mismo para formar una población de células hepáticas primarias;

(b) generar una preparación de las células hepáticas primarias de (a);

(c) cultivar las células comprendidas en la preparación de (b) sobre un soporte que permita la adherencia y el crecimiento de las células al mismo y la aparición de una población de células que tengan morfología meso-epitelial cuboidal;

(d) hacer pasar las células de (c) al menos una vez; y

(e) aislar una población de células obtenidas después del pase de (d) que son positivas para al menos un marcador hepático y al menos un marcador mesenquimal, tienen al menos una actividad metabólica específica del hígado y mantienen una morfología meso-epitelial cuboidal.

También se describe y no forma parte de la invención un método para obtener células progenitoras del hígado adulto, que comprende:

(b) generar una preparación de las células hepáticas primarias de (a);

(c) cultivar las células comprendidas en la preparación de (b) sobre un soporte que permita la adherencia y el crecimiento de las células al mismo y la aparición de una población de células con morfología meso-epitelial cuboidal;

(d) hacer pasar las células de (c) al menos una vez; y

(e) aislar una población de células obtenidas después de pasar por el paso (d) que mantienen una morfología mesoepitelial cúbica y que son positivas para al menos un marcador hepático, al menos un marcador mesenquimal y tienen al menos una actividad específica del hígado, en donde al menos una fracción de la población celular del paso (e) que puede oscilar entre al menos el 20% o entre el 20 y el 40% de la población celular total del paso (e), es positiva para citoqueratina-19 por citometría de flujo.

Los métodos descritos en el presente documento se refieren al aislamiento de células hepáticas que pueden proporcionar células H2Stem (y, en consecuencia, proporcionar también progenie H2Stem) después de mantenerse en condiciones de cultivo celular apropiadas. Estos métodos son aplicables a partir de células hepáticas primarias frescas de origen humano y/o a partir de preparaciones crioconservadas de células hepáticas primarias. En algunas realizaciones de los métodos, estos métodos también pueden implicar medir la positividad de uno o más marcadores en el paso (e) y/o en el paso (c).

Por ejemplo, las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) pueden medirse como positivas para al menos un marcador o actividad seleccionada de citoqueratina 19, albúmina, secreción de alfa-1-antitripsina, proteína 2 que contiene el dominio Sushi y CYP3A4. Preferiblemente, las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) se miden positivas para:

(i) al menos un marcador mesenquimal seleccionado de vimentina, CD90, CD73, CD44 y CD29;

(ii) al menos un marcador hepático seleccionado de alfa-1 -antitripsina, HNF-3B, HNF-4, albúmina, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1;

(iii) al menos una actividad metabólica específica del hígado elegida entre secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1-antitripsina y actividad de CYP3A4;

(iv) la proteína 2 que contiene el dominio Sushi;

(v) al menos uno de ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 y CD81;

(vi) al menos uno de HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM y APOC1; y

(vii) Citoqueratina-19 (CK-19).

Las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) pueden medirse, además, como positivas para citoqueratina-18 (CK-18) y/o alfa actina del músculo liso (ASMA), y pueden medirse como negativas para CD140b y CD271. En algunas de las realizaciones anteriores, las células H2Stem también se pueden medir como positivas para una o más de las actividades enzimáticas que se enumeran en la Tabla 6 o la Tabla 7.

Preferiblemente, las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) se miden positivas para un marcador si se determina que al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%, o entre el 60% y el 99%, o entre el 70% y el 90% de las células de la población son positivas para ese marcador. Preferiblemente, las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) se miden como negativas para un marcador si se determina que menos del 20% o menos del 10% de las células de la población son negativas para el marcador. Preferiblemente, la población celular del paso (e) comprende células adherentes o forma conglomerados de células tridimensionales en suspensión, mientras que en otras realizaciones anteriores la población celular del paso (e) presenta actividad dependiente de CYP de Fase 1 inducible y captación de al menos uno de taurocolato, estrona-3-sulfato y 1-metil-4-fenilpiridinio. Las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) también pueden modificarse por medio de agentes químicos, medio de cultivo celular, factores de crecimiento y/o vectores de ácido nucleico para cualquier uso posterior apropiado in vivo o in vitro, también de acuerdo con los hallazgos de las Tablas 6 y 7.

Por lo tanto, los métodos anteriores permiten obtener células H2Stem y progenie H2Stem descritas en este documento y no forman parte de la invención. Preferiblemente, las células del paso (c) y/o la población celular del paso (e) se pueden cultivar en un soporte que se puede recubrir con colágeno u otro péptido o proteína de matriz extracelular apropiado, se puede aislar midiendo al menos la positividad para combinaciones específicas de marcadores hepáticos, marcadores mesenquimales y actividades metabólicas específicas del hígado. Luego, dependiendo del uso deseado de células H2Stem y progenie H2Stem, las células que se obtienen o se pueden obtener por este método se pueden mantener en condiciones de cultivo celular que permitan su proliferación como células adherentes, suspensiones celulares o aplicando condiciones específicas para mantenerlas, como células similares a hepatocitos o hepatoactivas. En particular, los conglomerados de células tridimensionales (progenie H2Stem tridimensional) se pueden formar de una manera particularmente eficiente utilizando recipientes de baja adherencia comercialmente disponibles (en forma de placas o pocillos en forma de U) o en un biorreactor y caracterizar de acuerdo con sus características funcionales, dimensionales, morfológicas y/o antigénicas. El método como se describe en el presente documento puede comprender, además, un paso (f), en el que la población celular del paso (e) se mantiene en una condición de cultivo celular para diferenciarla en células que presentan actividades específicas del hígado.

Una progenie H2Stem es una población celular que se puede obtener mediante los métodos descritos en este documento y que comprende células que presentan la actividad biológica, los marcadores, la morfología y/o las características funcionales enumeradas anteriormente en una gran mayoría (p. ej., al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99%). En una realización preferida, una población de células H2Stem que se puede obtener mediante los métodos descritos en este documento comprende entre el 60% y el 99% o entre el 70% y el 90% de células que presentan las características enumeradas anteriormente en relación con el paso (e).

El método como se describe en el presente documento también proporciona progenie H2Stem como células adherentes o que forman conglomerados de células tridimensionales en suspensión, que preferiblemente también presentan actividad dependiente de CYP de Fase I inducible y captación de al menos uno de taurocolato, estrona-3-sulfato y 1 -metil-4-fenilpiridinio. Además, poblaciones celulares de este tipo pueden diferenciarse adicionalmente en células que presentan actividades específicas del hígado. Una población de células H2Stem que se obtiene mediante los métodos descritos en el presente documento también puede modificarse mediante agentes químicos, medios de cultivo celular, factores de crecimiento y/o vectores de ácidos nucleicos para cualquier uso in vivo o in vitro adecuado.

Los materiales biológicos que se obtienen cuando se generan células H2Stem o una progenie H2Stem de acuerdo con la invención pueden usarse adicionalmente para identificar entidades biológicas que pueden tener usos específicos, en particular distintas aplicaciones médicas. Estos materiales biológicos incluyen no solo células H2Stem y progenie H2Stem (o subpoblaciones, líneas celulares y fracciones de los mismos de este tipo) que presentan características específicas (p. ej., marcadores basados en proteínas o ácidos nucleicos, actividades biológicas y/o morfología), sino también cualquier otra entidad que se obtiene al producir preparaciones de células H2Stem o progenie H2Stem a partir del cultivo de células hepáticas primarias. Materiales biológicos como se describen en este documento incluyen, por ejemplo, medios de cultivo celular acondicionados (p.ej., en forma de sobrenadante de cultivo celular) y fracciones de estos medios que pueden contener proteínas, metabolitos, vesículas de membrana, antígenos y/o ácidos nucleicos que, junto o no con otras características que caracterizan a las propias células (p. ej., antígeno de superficie celular o actividades enzimáticas), pueden identificarse y usarse como marcadores para detectar células de interés médico o como compuestos que presentan actividades o distribución de interés médico, en particular en relación con enfermedades hepáticas. De hecho, el análisis comparativo de los extractos de proteínas que se obtuvieron de las células H2Stem ha hecho posible la identificación de la proteína 2 que contiene el dominio Sushi como un marcador adicional para el que las células H2Stem son positivas y que puede usarse para caracterizar las células H2Stem y la progenie H2Stem.

Células H2Stem, progenie H2Stem, materiales biológicos que se obtienen al generar células H2Stem o una progenie H2Stem, y las composiciones que comprenden células o materiales biológicos ("Productos H2Stem", colectivamente) de este tipo, pueden ser útiles para un gran número de métodos y aplicaciones, ya sea in vivo o in vitro. En particular, un Producto H2Stem puede usarse para o en el tratamiento de enfermedades (p. ej., enfermedades hepáticas) y para establecer métodos y ensayos biológicos que requieren células que presenten características biológicas (tales como actividades metabólicas o enzimáticas, o un perfil antigénico) lo más similares posible a las observadas para los hepatocitos primarios durante el tiempo deseado, una vez diferenciados in vivo o in vitro. Productos H2Stem preferidos son una progenie H2Stem, un material biológico que se obtiene cuando se genera la progenie H2Stem y una composición que comprende progenie H2Stem o material biológico de este tipo. Más preferiblemente, un producto H2Stem es una progenie H2Stem o una composición que comprende una progenie H2Stem.

En particular, un producto H2Stem se puede utilizar para la administración in vivo (en seres humanos o en animales tal como en modelos animales), por ejemplo, en forma de una composición farmacéutica que comprende células de este tipo, para tratar una enfermedad hepática (tal como un error congénito del metabolismo hepático, un trastorno hereditario de la coagulación de la sangre, colestasis intrahepática familiar progresiva tipo 1/2/3, deficiencia de alfa 1-antitripsina, defecto de los transportadores de células hepáticas, porfiria, hígado graso u otra enfermedad hepática fibrótica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, enfermedad degenerativa del hígado e insuficiencia hepática aguda o crónica). Células H2Stem también se pueden usar en forma de una composición farmacéutica que comprende células de este tipo, para tratar una enfermedad relacionada con la ausencia o la inactivación de cualquiera de las actividades enzimáticas enumeradas en la Tabla 6 o la Tabla 7. Estas composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar como productos H2Stem que combinan células H2Stem (o una progenie H2Stem dada) con un soporte (p. ej., una matriz, una cápsula, un armazón o un dispositivo) y/o una solución (p. ej., medio de cultivo celular o tampón) que es apropiado para el método deseado de tratamiento, administración y/o almacenamiento, así como en los medios preferidos para proporcionar composiciones farmacéuticas de este tipo (p. ej., dentro de un kit). También pueden combinarse en composiciones de este tipo otros agentes de origen biológico (p. ej., anticuerpos o factor de crecimiento) o químico (p. ej., fármacos, compuestos conservantes o marcadores) que pueden proporcionar cualquier otro efecto útil.

Un método para prevenir y/o tratar una enfermedad comprende administrar un producto H2Stem, tal como células H2Stem o una progenie H2Stem dada, y preferiblemente dentro de una composición, a un sujeto que lo necesite. En particular, un método para tratar una enfermedad (p. ej., una enfermedad del hígado) en un paciente que lo necesite comprende administrar una cantidad eficaz de un producto H2Stem al paciente.

La administración o el uso terapéutico de un producto H2Stem puede comprender la administración o el uso de otro producto (que puede ser, por ejemplo, un fármaco, un agente terapéutico, otro tipo de células u otro material biológico). Un producto H2Stem se puede usar en (o para uso en) un método de tratamiento como se describe en el presente documento, en donde al paciente también se le administra otro producto como parte del método. El otro producto puede administrarse en combinación con el producto H2Stem, por ejemplo, como parte de la misma composición, o por separado, simultánea o secuencialmente (en cualquier orden). El otro producto puede tener efectos compatibles, o incluso sinérgicos, con los efectos (en particular, con los efectos terapéuticos) de un producto H2Stem, tal como una progenie H2Stem o un medio de cultivo celular acondicionado obtenido a partir de una progenie H2Stem.

Un producto H2Stem también se puede utilizar para estudios in vitro, en particular para estudios farmacológicos para evaluar la eficacia, el metabolismo, la estabilidad y/o la toxicidad de uno o más componentes exógenos, tales como un producto biológico (tal como una proteína, un ácido nucleico, lípidos, o un azúcar) o un compuesto químico (orgánico o inorgánico, incluyendo sales o metales). Este enfoque también se puede utilizar para estudiar los efectos de otras células (tales como bacterias u otras células, preferiblemente de origen humano) en un producto H2Stem, así como para evaluar la infección y/o la replicación de virus específicos del hígado (p. ej., virus de la hepatitis) o parásitos (tales como especies de Plasmodium, en relación con el estudio de la malaria y los fármacos antipalúdicos) que luego pueden purificarse o detectarse de otra manera.

El producto H2Stem también se puede proporcionar en un kit, por ejemplo, para los usos y métodos de las aplicaciones descritas anteriormente, incluyendo para transferir un producto H2Stem a una institución clínica y proporcionar medios para administrarlo a un paciente. Este kit puede comprender un producto H2Stem y, opcionalmente, otros elementos que permitan usar y/o detectar el producto H2Stem y sus actividades, así como usar y/o detectar cualquier compuesto adicional relevante. Este kit puede comprender uno o más viales que contengan un producto H2Stem (p. ej., una progenie H2Stem o una composición que comprenda progenie H2Stem) y uno o más de los siguientes elementos a seleccionar de acuerdo con el uso específico: dispositivos, materiales desechables, soluciones, productos químicos, productos biológicos y/o instrucciones de uso de los elementos de dicho kit.

La invención se refiere a células progenitoras del hígado adulto (que pueden denominarse HHALPCs) que pueden proporcionarse como población celular, así como preparaciones celulares y composiciones farmacéuticas que las contienen, en particular mediante procedimientos de fabricación farmacéuticos. Estas células y poblaciones celulares presentan una combinación de actividades biológicas y marcadores que pueden ser identificados en su superficie, intracelulares y/o secretados, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

También se describen, y no forman parte de la invención, las células que son:

(a) positivas para a-actina del músculo liso (ASMA), albúmina (ALB) y CD140b; y

(b) negativas para citoqueratina-19 (CK-19) y SUSD2.

Estas células también pueden ser positivas para:

(c) al menos una actividad específica del hígado seleccionada de secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1-antitripsina y actividad de CYP3A4;

(d) al menos un marcador seleccionado de ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 y CD81; y

(e) al menos un marcador seleccionado de MMP1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2 y HMCN1.

Las HHALPCs también se pueden medir como positivas para una o más de las actividades enzimáticas enumeradas en la Tabla 6. En algunas realizaciones, este tipo de células progenitoras del hígado adulto se puede caracterizar, además, por una serie de marcadores negativos, en particular para uno o más del grupo que consiste en ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5 y NCAM1. Además, las HHALPCs también pueden medirse como negativas para uno o más del grupo que consiste en HP, CP, RBP4, ^aP^oB, LBP, ORM1, CD24, CPM y APOC1.

Las actividades biológicas, los marcadores y las características morfológicas/funcionales enumeradas anteriormente pueden estar presentes en HHALPCs en diferentes combinaciones de marcadores, tales como:

(a) positivas para actividad de a-actina del músculo liso, albúmina, vimentina, CD90, CD73, CD44, CD29, CD140b y CYP3A4; y

(b) negativas para la proteína 2 que contiene el dominio Sushi, citoqueratina-19 y CD271.

También se pueden determinar criterios adicionales para HHALPCs de la realización anterior en cualquier combinación funcional y técnica, por ejemplo, midiendo la positividad para al menos un marcador adicional seleccionado de ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 y CD81. En algunas realizaciones de este tipo, las HHALPCs se pueden medir como negativas para al menos un marcador adicional seleccionado del grupo que consiste en ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5 y NCAM1. En algunas realizaciones de este tipo, las HHALPCs pueden medirse como negativas para al menos uno de HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM y APOC1.

Las HHALPCs se pueden utilizar de acuerdo con la divulgación del documento WO2007071339 y otra bibliografía a sobre células ADHLSC, así como otras divulgaciones relacionadas con células H2Stem anteriores (en términos de métodos, usos, kits, material biológico o composiciones celulares, las HHALPCs se establecen como suspensiones de células hepato-activas aisladas y no como estructuras multicelulares tridimensionales. Las HHALPCs también se pueden usar en forma de una composición farmacéutica que comprende células de este tipo, para tratar una enfermedad que está relacionada con la ausencia o inactivación de cualquiera de las actividades enzimáticas enumeradas en la Tabla 6.

La Descripción Detallada que figura más adelante y los Ejemplos proporcionan detalles adicionales sobre las células, las poblaciones celulares, los métodos, las células que se pueden obtener mediante estos métodos y sobre realizaciones adicionales de la invención que están asociadas a dichos métodos, a productos H2Stem y a las HHALPCS.

También se describen y no forman parte de la invención células H2Stem y progenie H2Stem caracterizadas por combinaciones novedosas de actividades biológicas y marcadores que pueden identificarse en su superficie, intracelulares y/o secretados en el medio de cultivo celular. Estas características, junto con las características morfológicas y funcionales, se determinaron en asociación con los métodos para producir células H2Stem y progenie H2Stem en condiciones de cultivo celular, caracterizando los criterios positivos (o negativos) a dichas células, en particular para un método que comprende:

(a) disociar el hígado adulto o una parte del mismo para formar una población de células hepáticas primarias;

(b) generar preparaciones de las células hepáticas primarias de (a);

(c) cultivar las células comprendidas en las preparaciones de (b) sobre un soporte que permita la adherencia y el crecimiento de las células al mismo y la aparición de una población de células con morfología meso-epitelial cuboidal;

(d) hacer pasar las células de (c) al menos una vez; y

(e) aislar la población de células que se obtiene después del paso (d) que sean positivas para al menos un marcador hepático y un marcador mesenquimal y para al menos una actividad metabólica específica del hígado, y mantener una morfología meso-epitelial cuboidal.

En cuanto al paso (a) del método, el paso de disociación implica obtener hígado adulto o una parte del mismo que contiene, junto con hepatocitos completamente diferenciados, una cantidad de células primarias que pueden usarse para producir células H2Stem. Las células primarias del hígado se aíslan preferentemente de tejidos del hígado humano que pueden obtenerse de hígado adulto.

El término "hígado" se refiere al órgano hepático. La expresión "parte del hígado" se refiere generalmente a una muestra de tejido derivada de cualquier parte del órgano hepático, sin ninguna limitación en cuanto a la cantidad de dicha parte o la región del órgano hepático donde se origina. Preferiblemente, todos los tipos de células presentes en el órgano hepático también pueden estar representados en dicha parte del hígado. La cantidad de la parte del hígado puede derivarse, al menos en parte, de consideraciones prácticas a la necesidad de obtener suficientes células hepáticas primarias para poner razonablemente en práctica el método de la invención. Por lo tanto, una parte del hígado puede representar un porcentaje del órgano hepático (p. ej., al menos 1%, 10%, 20%, 50%, 70%, 90% o más, típicamente p/p). En otros ejemplos no limitantes, una parte del hígado puede definirse por peso (por ejemplo, al menos 1 g, 10 g, 100 g, 250 g, 500 g o más). Por ejemplo, una parte del hígado puede ser un lóbulo hepático, por ejemplo, el lóbulo derecho o el lóbulo izquierdo, o cualquier segmento o muestra de tejido que comprenda un número suficiente de células que se extirpa durante una operación de división del hígado o en una biopsia del hígado.

La expresión "hígado adulto" se refiere al hígado de sujetos que son post-natales, es decir, en cualquier momento después del nacimiento, preferiblemente a término completo, y puede ser, p. ej., al menos 1 día, 1 semana, 1 mes o más de 1 mes de edad después del nacimiento, o al menos 1, 5, 10 años o más. Por lo tanto, se puede encontrar un "hígado adulto" o hígado maduro en sujetos humanos que de otro modo se describirían en los términos convencionales de "bebé", "niño", "adolescente" o "adulto". El hígado o parte del mismo se obtiene de un "sujeto" o "donante", refiriéndose indistintamente a un animal vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. En otra realización, el hígado adulto o parte del mismo puede ser de un sujeto animal no humano, preferiblemente un sujeto mamífero no humano (p. ej., un roedor o un cerdo).

Un donante puede estar vivo o muerto, según lo determinen los criterios clínicamente aceptados, tales como el criterio de "corazón-pulmón" (que implica un cese irreversible de las funciones circulatorias y respiratorias) o el criterio de "muerte cerebral" (que implica un cese irreversible de todas las funciones de todo el cerebro, incluido el tronco encefálico). La recolección puede involucrar procedimientos conocidos como biopsia, extirpación o escisión. Es posible que la recolección de tejido hepático de un donante humano vivo deba ser compatible con el sustento de la vida futura del donante. El hígado o parte del mismo puede obtenerse de un donante, esp. donante humano, que tiene circulación sostenida, p. ej., un corazón que late, y funciones respiratorias sostenidas, por ejemplo, pulmones que respiran o ventilación artificial. Típicamente, solo se puede extraer una parte del hígado de un donante humano vivo (p. ej., mediante biopsia o extirpación), de modo que se mantenga un nivel adecuado de funciones hepáticas normales en el donante, según lo exigen las normas legales y éticas.

Sujeto a las normas éticas y legales, es posible que el donante tenga o no muerte cerebral (p. ej., la eliminación de todo el hígado o una parte del mismo, que no sería compatible con la supervivencia futura de un donante humano, puede permitirse en seres humanos con muerte cerebral). La recolección de hígado o parte del mismo de dichos donantes es ventajosa, ya que el tejido no sufre una anoxia (falta de oxigenación) sustancial, que normalmente resulta de la isquemia (cese de la circulación). En el momento de la recolección, el tejido puede haber cesado la circulación y/o las funciones respiratorias, sin ventilación artificial. Si bien el hígado o parte del mismo de estos donantes puede haber sufrido al menos cierto grado de anoxia, el hígado de donantes cadavéricos se puede usar para obtener células H2Stem en condiciones de cultivo celular, por ejemplo, en aproximadamente 1 hora, 3 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas o más después de que cesó la circulación del donante.

Los tejidos (de muestras de hígado extirpadas quirúrgicamente o biopsias de hígado) que se recolectan como se indicó anteriormente pueden enfriarse a aproximadamente temperatura ambiente o a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, pero habitualmente se evita la congelación del tejido o partes del mismo, esp. en los casos en los que dicha congelación daría lugar a la nucleación o al crecimiento de cristales de hielo. Por ejemplo, el tejido se puede mantener a cualquier temperatura entre aproximadamente 1 °C o aproximadamente 4 °C y la temperatura ambiente, y se puede mantener ventajosamente a aproximadamente 4 °C, p. ej., sobre hielo. El tejido puede enfriarse durante todo o parte del tiempo de isquemia, es decir, el tiempo después del cese de la circulación en el donante. Es decir, el tejido puede someterse a isquemia caliente, isquemia fría o una combinación de isquemia caliente y fría. El tejido recolectado puede conservarse así, p. ej., hasta 48 horas antes del procesamiento, preferiblemente durante menos de 24 horas, p. ej., más preferiblemente durante menos de 12 horas (p. ej., menos de 6, 3 o 1 hora). El tejido recolectado puede ser ventajosamente, pero no es necesario que se mantenga, p. ej., completamente o al menos parcialmente sumergido en un medio adecuado y/o puede ser, pero no es necesario, perfundido con el medio adecuado, antes del procesamiento adicional del tejido. Una persona experta es capaz de seleccionar un medio adecuado que pueda ayudar a la supervivencia de las células del tejido durante el período anterior al procesamiento.

El método de la invención comprende disociar tejido hepático adulto como se describe anteriormente para formar una población de células primarias. El término "disociación", como se usa en este documento, generalmente se refiere a la interrupción parcial o total de la organización celular de un tejido u órgano, es decir, la interrupción parcial o total de la asociación entre las células y los componentes celulares de un tejido u órgano, para obtener una suspensión de células (una población celular) de dicho tejido u órgano. La suspensión puede comprender células solitarias o individuales, así como células unidas físicamente para formar conglomerados o agrupaciones de dos o más células. La disociación preferiblemente no provoca o provoca una reducción lo más pequeña posible en la viabilidad celular. Un método adecuado para disociar el hígado o parte del mismo para obtener una población (suspensión) de células primarias a partir del mismo puede ser cualquier método bien conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitados a digestión enzimática, separación mecánica, filtración, centrifugación y combinaciones de los mismos. En particular, el método para disociar el hígado o parte del mismo puede comprender la digestión enzimática del tejido hepático para liberar las células hepáticas y/o la rotura o separación mecánica del tejido hepático para liberar las células hepáticas. Fragmentos pequeños y delgados de tejidos hepáticos que se obtienen mediante una biopsia hepática pueden usarse directamente para continuar con el cultivo celular de acuerdo con el siguiente paso (c) sin alteración enzimática o mecánica.

Métodos para disociar el hígado o parte del mismo como los anteriores están documentados en la bibliografía como la técnica de perfusión de colagenasa ampliamente utilizada en dos o más pasos, que se ha adaptado y modificado de diversas formas para realizarla con hígados completos o segmentos de hígado. El tejido hepático se perfunde con una solución tampón libre de cationes divalentes, precalentada a 37 °C, que contiene un agente quelante de cationes (p. ej., EDTA o EGTA). Las soluciones tampón pueden comprender soluciones salinas (p. ej., HEPES, medio E de Williams) o cualquier otra solución salina equilibrada que también puede incluir sales tales como NaCl y KCI, entre otras. Esto conduce a la interrupción de las estructuras desmosomales que mantienen unidas a las células. Luego, el tejido se perfunde con la solución tampón que contiene cationes divalentes, tales como Ca2+ y Mg2+, y enzimas que degradan la matriz que actúan para digerir el tejido.

Las células hepáticas primarias se liberan habitualmente mediante una disrupción mecánica suave y/o presión a través de filtros, para completar mecánicamente el proceso de disociación celular. Filtros de este tipo pueden tener tamaños de tamiz que permitan el paso de células a través de aproximadamente 0,1 mm, 0,25 mm, 0,50 mm, 1 mm o más. Puede usarse una sucesión de filtros con tamaños de tamiz progresivamente más pequeños para disociar gradualmente el tejido y liberar las células. Las células disociadas se enjuagan con un tampón que contiene inhibidor de proteasa, suero y/o plasma para inactivar la colagenasa y otras enzimas utilizadas en el proceso de perfusión, y luego se separan de la mezcla granulándolas con centrifugación a baja velocidad (p. ej., entre 10 x g y 500 x g). La mayoría de las células viables, si no todas, se pueden sedimentar, mientras que las células muertas y los restos celulares se eliminan sustancialmente y, posteriormente, se lavan con una solución tampón helada para purificar la suspensión celular. El número y la calidad de las células hepáticas primarias pueden variar según la calidad del tejido, las composiciones de las diferentes soluciones que se utilizan y el tipo y la concentración de la enzima. La enzima es frecuentemente colagenasa, pero también pueden usarse pronasa, tripsina, hialuronidasa, termolisina y combinaciones de las mismas. La colagenasa puede consistir en una mezcla de enzimas pobremente purificada y/o exhibir actividad de proteasa, lo que puede causar reacciones no deseadas que afectan la calidad y cantidad de células viables que, a su vez, pueden evitarse seleccionando preparaciones de enzimas de suficiente pureza y calidad. Otros métodos de recolección de células hepáticas primarias pueden excluir las técnicas de digestión enzimática y pueden implicar la perfusión del hígado con soluciones que contienen sacarosa, seguido de una disrupción mecánica.

Con respecto al paso (b) del método, la preparación de células hepáticas primarias que se obtiene después de la disociación del tejido hepático puede ser típicamente una población heterogénea de células hepáticas primarias, que comprende células que pertenecen a cualquier tipo de células que constituyen el hígado, incluidas las células progenitoras o células madre, que pueden haber estado presentes en el parénquima hepático y/o en partes no parenquimatosas del mismo. Tipos de células que constituyen el hígado ejemplares incluyen hepatocitos, colangiocitos, células de Kupffer, células estrelladas hepáticas y células endoteliales hepáticas, además de células madre o progenitoras que pueden estar presentes u originarse en una muestra de tejido hepático.

El término "hepatocito" abarca células hepáticas parenquimatosas epiteliales, que incluyen, pero no se limitan a hepatocitos de diferentes tamaños o ploidía (p. ej., diploides, tetraploides, octaploides).

La expresión "célula primaria" incluye células presentes en una suspensión de células obtenidas de un tejido u órgano de un sujeto, p. ej., hígado, disociando las células presentes en dicho tejido u órgano explantado con técnicas apropiadas.

Los métodos de la invención pueden partir preferiblemente de una población celular representativa de la mayoría, sino de todos los tipos de células hepáticas en el ámbito de la obtención de las células progenitoras del hígado adulto deseadas en condiciones de cultivo celular. Una población celular de partida adecuada para la obtención de células H2Stem puede comprender hepatocitos en diferentes proporciones (0,1%, 1%, 10% o más del total de células), de acuerdo con el método de disociación del hígado y/o cualquier método de fraccionamiento o enriquecimiento de la preparación inicial para hepatocitos y/u otros tipos de células sobre la base de propiedades físicas (dimensión, morfología), viabilidad, condiciones de cultivo celular o expresión de marcadores de superficie celular mediante la aplicación de cualquier técnica adecuada.

La población de células primarias tal como se define y se obtiene en este documento mediante la disociación del hígado (o parte de él) se puede usar inmediatamente para establecer cultivos celulares como células hepáticas primarias frescas o, preferiblemente, almacenar como preparaciones crioconservadas de células hepáticas primarias utilizando tecnologías comunes para su conservación a largo plazo. De hecho, el uso de preparaciones de células crioconservadas parece tener un efecto positivo en la eficiencia con la que se producen más tarde células H2Stem y progenie H2Stem en cultivos celulares. Las células de estas muestras se pueden congelar en un medio de cultivo celular o en una solución para conservar células u órganos (p. ej., Viaspan, Cryostor, Celsior) complementada o no con otros compuestos tales como factores de crecimiento, suero, soluciones tampón, glucosa, albúmina, etilenglicol, sacarosa, dextrosa, DMSO o cualquier otro crioprotector. Cada una de las preparaciones crioconservadas puede contener al menos 103, 104, 105, 106, 107, 108 células o más por criovial o bolsa, con el objetivo de producir y aislar una mayor cantidad de células H2Stem en condiciones de cultivo celular después de descongelar adecuadamente la muestra y, si es necesario, lavar las células con tampón o medio de cultivo celular apropiado para eliminar el medio de cultivo celular residual o una solución para conservar células u órganos.

Con respecto al paso (c) del método, la preparación de células primarias de hígado (como una suspensión celular o como fragmentos de tejidos hepáticos que se obtienen mediante una biopsia del hígado) se puede cultivar directamente sobre un soporte totalmente sintético (p. ej., plástico o cualquier sustancia polimérica) o un soporte sintético pre-recubierto con células alimentadoras, extractos proteicos o cualquier otro material de origen biológico que permita la adherencia y la proliferación de células primarias similares y la aparición de una población de células progenitoras hepáticas adultas con una morfología meso-epitelial cúbica. Preferiblemente, las células de la población celular primaria que se han adherido a dicho sustrato se cultivan durante al menos 7 días, preferiblemente al menos 10 o al menos 12 días. Más preferiblemente, las células de la población de células primarias se cultivan dentro de los 7 y 12 días, para obtener una población de células adherentes que esté suficientemente enriquecida para células primarias viables que puedan proporcionar células H2Stem.

El término "cultivo" se refiere en términos generales a las condiciones para el mantenimiento y/o crecimiento de células y, en particular, de H2Stem y/o progenie H2Stem en cultivo celular. Elementos tales como el soporte donde se cultivan las células y que permite la adhesión celular (o, cuando es necesario, permiten el crecimiento de conglomerados de células en suspensión), composición del medio de cultivo celular, densidad a la que se siembran y mantienen las células, la concentración de O2 y CO2, puede adaptarse para cultivar células H2Stem y progenie H2Stem, como se detalla más adelante en la Descripción Detallada y en los Ejemplos.

La expresión "célula progenitora del hígado" se refiere a una célula no especializada y competente en proliferación que se produce utilizando el cultivo de células que se aíslan del hígado y que o cuya progenie pueden dar lugar a al menos un tipo de célula relativamente más especializada. Una célula progenitora del hígado da lugar a descendientes que pueden diferenciarse a lo largo de uno o más linajes para producir células cada vez más especializadas (pero preferiblemente hepatocitos o células hepato-activas), en donde descendientes de este tipo pueden ser células progenitoras, o incluso producir células hepáticas diferenciadas terminalmente (p. ej., células completamente especializadas, en particular células que presentan características morfológicas y funcionales similares a las de los hepatocitos humanos primarios).

Dado que los tejidos hepáticos que se utilizan en los Métodos de la invención provienen de hígado adulto, las células H2Stem pueden definirse como células progenitoras del hígado adulto, que tienen una morfología meso-epitelial cuboidal con citoplasma grande y transparente, membrana irregular sin protuberancias, desarrollando contactos y uniones intercelularmente, y mostrando inhibición por contacto de crecimiento. Después de la aparición y proliferación como colonia adherente o conglomerados de células (véase la Fig. 3), las células H2Stem pueden caracterizarse aún más mediante tecnologías que permiten detectar marcadores relevantes ya en esta etapa (es decir, antes del paso de las células como se indica en el paso (d)) y que inicialmente se caracterizaron en una fase posterior, como se describe más adelante en el paso (e) como un marcador hepático y al menos un marcador mesenquimal, y al menos una actividad específica del hígado.

Entre las tecnologías para identificar marcadores de este tipo y medirlos como positivos o negativos, se prefieren la inmunocitoquímica o el análisis de medios de cultivo celular, ya que permiten la detección de marcadores incluso con la baja cantidad de células H2Stem disponibles en este paso, sin destruirlas (como sería en el caso de la T ransferencia Western o la Citometría de Flujo). En particular, la detección de células positivas para citoqueratina-19 (como se muestra en la Fig. 2B), o de proteínas hepáticas secretadas, incluyendo la albúmina o enzimas tales como alfa-1-antitripsina (véanse las Fig. 8B y Fig. 12C), puede realizarse en esta fase, junto o no con la detección de otros marcadores relevantes como se describe más adelante, incluida la proteína de la superficie celular (tales como SUSD2, CD90, CD73, CD29, CD44 y/o transportadores específicos del hígado), proteínas intracelulares (tales como vimentina o ASMA), y enzimas hepáticas y actividades relacionadas (tales como carboxilasa hepática, tirosina transferasas, triptófano-2,3-dioxigenasa, secreción de urea, CYP3A4 o cualquier otra actividad del citocromo P450 de fase I). Marcadores positivos adicionales son los identificados en el Ejemplo 3 (por FACS y/o por tecnologías tales como proteómica o transcriptómica) y/o en el Ejemplo 4 (por ELISA, inmunohistoquímica u otras tecnologías basadas en anticuerpos). En particular, una o más de las proteínas del grupo de la lista de la Tabla 2 pueden usarse, además de CD49b y CD51, como marcadores de superficie positivos adicionales.

Células H2Stem aparecen de la población primaria de células hepáticas que se siembran en placas sobre un sustrato que permite la adherencia de las células dentro de un entorno in vitro capaz de promover la supervivencia y/o el crecimiento de células de este tipo. Este entorno puede evitar un intercambio no deseado de materia entre dicho entorno (es decir, el recipiente de cultivo celular) y los alrededores (p. ej., evitando la contaminación del entorno del laboratorio), mientras que puede permitir el intercambio continuo o intermitente de otros componentes útiles entre recipientes de cultivo (p. ej., por un intercambio ocasional de una parte o la totalidad del medio de cultivo, el intercambio continuo de gases).

Los recipientes de cultivo pueden ser frascos de cultivo celular, botellas, placas de pocillos, pilas de células de múltiples bandejas, biorreactores y placas de diversos formatos, pero que muestren una o más superficies de sustrato compatibles con la adhesión celular, de modo que las células sembradas en placas puedan contactar este sustrato para mantenerse como cultivos de células adherentes. En general, un sustrato que permite la adherencia de las células al mismo puede ser cualquier sustrato sustancialmente hidrófilo, ya sea vidrio o un material polimérico sintético (tal como policarbonatos, poliestirenos, poliortoésteres, polifosfacenos, polifosfatos, poliésteres, nailones o mezclas de los mismos) que generalmente se conforman y se tratan con el fin de proporcionar superficies de sustrato hidrófilas y, con ello, potenciar la probabilidad de una unión celular efectiva (como se muestra en los Ejemplos usando materiales comerciales CellBind). El tratamiento de la superficie puede adoptar la forma de un revestimiento de superficie o puede implicar la generación de grupos químicos en la superficie del polímero que tengan una afinidad general por el agua o que muestren suficiente polaridad para permitir la adsorción estable a otro grupo polar. Estos grupos funcionales conducen a la hidrofilia y/o a un aumento del oxígeno en superficie y son propiedades reconocidas para potenciar el crecimiento celular en superficies de sustrato modificadas. Grupos químicos pueden incluir grupos tales como aminas, amidas, carbonilos, carboxilatos, ésteres, hidroxilos o sulfhidrilos que también pueden introducirse tratándolos con tecnologías específicas basadas en la frecuencia de onda.

La adhesión celular se puede facilitar revistiendo las superficies de plástico tratadas con una capa de una matriz adecuada. El recubrimiento puede implicar policationes adecuados (p. ej., poliomitina o polilisina) o, preferiblemente, uno o más componentes de la matriz extracelular: fibrina, laminina, colágenos no fibrosos/fibrosos (preferiblemente colágeno tipo 1), glicosaminoglicanos (p. ej., heparina o sulfato de heparán) o proteínas tales como fibronectina, gelatina, vitronectina, elastina, tenascina, agrecano, agrina, sialoproteína ósea, proteína de la matriz del cartílago, fibrinógeno, fibulina, mucinas, entactina, osteopontina, plasminógeno, restrictina, serglicina, osteonectina, versicano, trombospondina 1 o células moléculas de adhesión celular que incluyen cadherinas, conexinas, selectinas, solas o en diversas combinaciones. Ejemplos preferidos pueden incluir composiciones de colágeno, que comprendan o no otros componentes de la matriz extracelular). Alternativamente, en este ámbito se pueden utilizar péptidos sintéticos que son fragmentos o derivados de otro modo de las proteínas enumeradas anteriormente, geles, armazones moleculares y otras estructuras tridimensionales que se forman a partir de materiales sintéticos y/o biológicos.

La suspensión de células primarias puede ponerse en contacto con la superficie adherente durante un período de tiempo (p. ej., al menos 2, 4, 6, 12, 24 horas o más) que sea suficiente para permitir que las poblaciones de células hepáticas primarias se adhieran al sustrato adherente antes de eliminar cualquier materia no adherente del sistema de cultivo (p. ej., células no viables o muertas y desechos celulares), descartando el medio del sistema de cultivo y, opcionalmente, lavando, una o varias veces, las células adherentes. Luego, se proporciona al sistema de cultivo cualquier medio adecuado o tampón isotónico (p. ej., PBS). Con ello, las células de la población primaria de células hepáticas, que se han adherido a la superficie, se seleccionan para su posterior cultivo y se pueden contar con el fin de evaluar la densidad de siembra que se puede expresar como el número de células sembradas en placas por cm2 de dicha superficie (p. ej., entre 10 y 105 células/cm2).

La preparación de las células primarias, directamente en la siembra en placa o después del lavado de las células, se mantiene en un medio líquido que favorece la supervivencia y/o el crecimiento de las células. El medio se puede añadir al sistema antes, junto con o después de la introducción de las células en el mismo. El medio puede ser reciente (es decir, no utilizado previamente para el cultivo de células) o puede comprender al menos una fracción que ha sido acondicionada mediante el cultivo previo de células de origen hepático (o de cualquier otro origen) en él. En particular, el medio puede ser cualquier medio de cultivo adecuado para cultivar células progenitoras hepáticas como se describe en la bibliografía y puede intercambiarse regularmente (p. ej., cada hora, 3 horas, 12 horas, 24 horas o más) con un medio reciente que presente las características iguales o diferentes (p.ej., composición, pH o estado oxidativo). Se puede cambiar todo el volumen del medio o, alternativamente, solo se puede cambiar una parte del medio, de manera que se retenga una fracción del medio acondicionado por el cultivo previo de las células. Alternativamente, el medio no se cambia hasta que las células se transfieran a otro recipiente de cultivo, lo que prolonga el cultivo de las células de manera que la mayoría de las células que no son de interés (p. ej., hepatocitos y otras células completamente diferenciadas de origen hepático) se separan y mueren, y el medio reciente se puede simplemente agregar regularmente.

Las células primarias adherentes se cultivan en presencia de un medio de cultivo líquido para el cultivo de células adherentes que se basa en medios químicos definidos con adición de suero bovino, humano u otro animal que, además de proporcionar nutrientes y/o promotores del crecimiento, también puede promover el crecimiento/la adherencia o la eliminación/el desprendimiento de tipos celulares específicos.

Las formulaciones de medios basales (disponibles, p. ej., de la American Type Culture Collection, ATCC; o de Invitrogen, Carlsbad, California) se pueden usar para cultivar las células primarias del presente documento, incluyendo, pero no limitados a medio esencial mínimo (MEM) de Eagle, Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo alfa modificado (alfa-MEM), medio esencial básico (BME), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medio BGJb, mezcla de nutrientes F-12 (Ham), Liebovitz L-15, DMEM/F-12, Medio de Eagle Modificado Esencial (EMEM), RPMI-1640, Medio 199, MB 752/1 de Waymouth o Medio E de Williams, y modificaciones y/o combinaciones de los mismos. En general, se conocen composiciones de estos medios basales y los criterios para adaptar las concentraciones de medios y/o complementos de medios según sea necesario para las células cultivadas. Una formulación de medio basal preferida puede ser una de las disponibles comercialmente, tales como Medio E de Williams, IMDM o DMEM, que se informa que mantienen el cultivo in vitro de células hepáticas adultas e incluyen una mezcla de factores de crecimiento para su crecimiento, proliferación y mantenimiento apropiados de los marcadores deseados y/o la actividad biológica o el almacenamiento a largo plazo.

Formulaciones de medios basales de este tipo contienen ingredientes necesarios para el desarrollo de células de mamíferos, que son conocidos per se, tales como sales inorgánicas (en particular sales que contienen Na, K, Mg, Ca, Cl, P y posiblemente Cu, Fe, Se y Zn), tampones fisiológicos (p. ej., HEPES, bicarbonato), nucleótidos, nucleósidos y/o bases de ácidos nucleicos, ribosa, desoxirribosa, aminoácidos, vitaminas, antioxidantes (p. ej., glutatión) y fuentes de carbono (p. ej., glucosa, piruvato). Se pueden usar complementos adicionales para suministrar a las células los oligoelementos y sustancias necesarios para un crecimiento y una expansión óptimos. Complementos de este tipo incluyen insulina, transferrina, sales de selenio y combinaciones de los mismos. Estos componentes se pueden incluir en una solución salina tal como la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, por sus siglas en inglés), la solución salina de Earle. Se pueden añadir complementos antioxidantes adicionales, p. ej., p-mercaptoetanol. Si bien muchos medios basales ya contienen aminoácidos, algunos aminoácidos pueden complementarse posteriormente, p. ej., L-glutamina, que se sabe que es menos estable cuando está en solución. Un medio puede suministrarse además con antibióticos y/o compuestos antimicóticos, tales como, típicamente, mezclas de penicilina y estreptomicina, y/u otros compuestos. Lo que es más importante, los medios de cultivo celular pueden complementarse con plasma o sueros de mamíferos que contienen factores y componentes celulares que son necesarios para la viabilidad y expansión celular y que, bajo ciertas condiciones, pueden reemplazarse por componentes sintéticos.

El término "suero", como se define convencionalmente, se obtiene a partir de una muestra de sangre entera permitiendo primero que se produzca la coagulación en la muestra y luego separando el coágulo así formado y los componentes celulares de la muestra de sangre del componente líquido (suero) mediante una técnica apropiada, típicamente por centrifugación. Un catalizador inerte, p. ej., perlas de vidrio o polvo, puede facilitar la coagulación. Ventajosamente, el suero se puede preparar utilizando recipientes de separación de suero (SST, por sus siglas en inglés), que contienen el catalizador inerte para mamíferos.

El suero o plasma puede obtenerse comercialmente y a partir de un organismo de la misma especie que la especie de la que se obtienen las células hepáticas primarias. Puede usarse suero o plasma humano para cultivar células hepáticas humanas primarias. Alternativamente, el medio comprende suero o plasma bovino, preferiblemente suero o plasma fetal bovino (ternero), más preferiblemente suero fetal bovino (ternero) (FCS o FBS). El medio comprende entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 40% (v/v) de suero o plasma o reemplazo de suero, preferiblemente entre aproximadamente 5% y 20% (v/v), p. ej., entre aproximadamente 5% y 15% (v/v), p. ej. aproximadamente 10% (v/v). Un medio para cultivar células hepáticas humanas puede comprender una mezcla de plasma o suero humano, preferiblemente suero humano, y plasma o suero bovino, preferiblemente suero bovino.

Antes del almacenamiento o uso, el plasma o suero puede irradiarse (p. ej., radiación gamma) o inactivarse por calor. La inactivación por calor se utiliza en la técnica principalmente para eliminar el complemento. La inactivación por calor implica típicamente incubar el plasma o el suero a 56 °C durante 30 a 60 minutos, p. ej., 30 minutos, con una mezcladura constante, después de lo cual se deja que el plasma o el suero se enfríe gradualmente a temperatura ambiente. Opcionalmente, el plasma o suero también puede esterilizarse antes de su almacenamiento o uso (p. ej., mediante filtración a través de uno o más filtros con un tamaño de poro inferior a 1 gm) o puede tratarse según cualquier política reglamentaria aplicable para el cultivo de células humanas para uso terapéutico.

Los componentes ordinarios de los medios basales (antes de la adición de suero o plasma), p. ej., en particular, solución salina isotónica, tampones, sales inorgánicas, aminoácidos, fuentes de carbono, vitaminas, antioxidantes, indicadores de pH y antibióticos, no se consideran factores de crecimiento ni factores de diferenciación en la técnica.

Por otro lado, el suero o plasma es una composición compleja que posiblemente comprende uno o más factores de crecimiento de este tipo.

La expresión "factor de crecimiento", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia biológicamente activa que influye en la proliferación, el crecimiento, la diferenciación, la supervivencia y/o la migración de diversos tipos de células, y que puede efectuar cambios en el desarrollo, morfológicos y funcionales en un organismo, ya sea solo o cuando es modulado por otras sustancias. Un factor de crecimiento puede actuar típicamente uniéndose, como ligando, a un receptor (p. ej., un receptor de superficie o intracelular) presente en las células. Un factor de crecimiento en el presente documento puede ser particularmente una entidad proteica que comprende una o más cadenas polipeptídicas. La expresión "factor de crecimiento" abarca los miembros de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la familia de la proteína morfogénica ósea (BMP), la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), el factor de crecimiento nervioso (NGF), la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), la familia del factor de crecimiento relacionado con la insulina (IGF), la familia del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), la familia de la interleucina-6 (IL-6) (p. ej., oncostatina M), factores de crecimiento hematopoyéticos (HeGF), el factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF), la angiopoyetina, la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o los glucocorticoides. En los casos en los que el método se usa para células hepáticas humanas, el factor de crecimiento usado en el presente método puede ser un factor de crecimiento humano o recombinante. Se prefiere el uso de factores de crecimiento humanos y recombinantes en el presente método, ya que se espera que factores de crecimiento de este tipo provoquen un efecto deseable sobre la función celular.

El medio puede comprender una combinación de suero o plasma con uno o más factores de crecimiento añadidos de forma exógena como se definió anteriormente, preferiblemente a concentraciones en donde factores de crecimiento particulares pueden inducir un efecto sobre células cultivadas in vitro. Por ejemplo, el medio puede comprender EGF e insulina, o EGF y dexametasona, o insulina y dexametasona, o cada uno de EGF, insulina y dexametasona. El EGF se puede usar típicamente a concentraciones entre aproximadamente 0,1 ng/ml y 1 μg/ml y preferiblemente entre 1 ng/ml y 100 ng/ml, p. ej., a aproximadamente 25 ng/ml; la insulina se puede usar típicamente a concentraciones entre aproximadamente 0,1 μg/ml y 1 mg/ml y preferiblemente entre aproximadamente 1 μg/ml y 100 μg/ml, p. ej., a aproximadamente 10 μg/ml; la dexametasona se puede usar típicamente a concentraciones entre aproximadamente 0,1 nM y 1 μM, preferiblemente entre aproximadamente 1 nM y 100 nM, p. ej., a aproximadamente 10 nM.

Hormonas también se pueden usar en cultivo celular, por ejemplo, D-aldosterona, dietilestilbestrol (DES), dexametasona, insulina, estradiol, hidrocortisona, prolactina, progesterona, hidrotropina, tiroxina, L-tironina. Células hepáticas también pueden beneficiarse del cultivo con triyoditironina, acetato de a-tocoferol y glucagón. Lípidos y soportes de lípidos también se pueden usar para complementar los medios de cultivo celular. Lípidos y soportes de este tipo pueden incluir, pero no se limitan a ciclodextrina, colesterol, ácido linoleico conjugado con albúmina, ácido linoleico y ácido oleico conjugado con albúmina, ácido linoleico no conjugado, ácido linoleico-oleico-araquidónico conjugado con albúmina, ácido oleico no conjugado y conjugado con albúmina, entre otros. La albúmina se puede usar de manera similar en formulaciones libres de ácidos grasos.

Las características morfológicas y fenotípicas de las células H2Stem descritas en los Ejemplos pueden permitir obtener células de este tipo no solo cuando las preparaciones crioconservadas de células hepáticas primarias tienen una baja eficiencia de siembra en placas, sino también al testar y/o adaptar tecnologías conocidas para preparar células adherentes a partir de preparaciones heterogéneas de células hepáticas primarias, seleccionando y combinando diferentes tecnologías, condiciones y/o materiales (p. ej., el material polimérico sintético, el o los componentes de la matriz extracelular, el medio de cultivo celular, la cantidad de oxígeno y/o CO2 en la incubadora, el tampón de lavado, etc.). En particular, se pueden aplicar cultivos en condiciones hipóxicas (como las que se obtienen al agregar un compuesto antioxidante a concentraciones milimolares o menores), junto con una o más combinaciones de estos otros elementos con el fin de obtener células H2Stem en mayor cantidad y/o más rápidamente del cultivo celular.

Este paso de cultivo de células hepáticas primarias como se definió anteriormente conduce a la aparición y proliferación de células H2Stem en el cultivo y puede continuar hasta que las células H2Stem hayan proliferado lo suficiente. Por ejemplo, dicho cultivo se puede continuar hasta que la población de células alcance un cierto grado de confluencia (p. ej., al menos un 50%, un 70% o al menos un 90% o más de confluencia). El término "confluencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una densidad de células cultivadas en donde las células se ponen en contacto entre sí, cubriendo sustancialmente todas las superficies disponibles para el crecimiento (es decir, totalmente confluentes).

En cuanto al paso (d) del método, las células primarias se cultivan en un medio de cultivo celular manteniendo su adherencia y la proliferación y la aparición de una población celular homogénea que, después de al menos un pase, se enriquece progresivamente en células H2Stem. Las células H2Stem se pueden expandir rápidamente para generar células suficientes para obtener progenie H2Stem que tenga las propiedades deseadas (p. ej., como células adherentes bidimensionales o conglomerados de células tridimensionales, a una densidad y/o estado de diferenciación determinados), con la duplicación de células que puede obtenerse dentro de 48-72 horas y el mantenimiento de progenie H2Stem con las propiedades deseadas durante al menos 2, 3, 4, 5 o más pases.

Cuando se hacen pasar, las células cultivadas se separan y se disocian del sustrato de cultivo y entre sí. El desprendimiento y la disociación de las células puede llevarse a cabo como se conoce generalmente en la técnica, p. ej., mediante tratamiento enzimático con enzimas proteolíticas (p. ej., elegidas de tripsina, colagenasa, p.ej., tipo I, II, III o IV, dispasa, pronasa, papaína, etc.), tratamiento con quelantes de iones bivalentes (p. ej., EDTA o EGTA) o tratamiento mecánico (p. ej., pipeteo repetido a través de una pipeta de diámetro pequeño o punta de pipeta), o cualquier combinación de estos tratamientos.

Un método adecuado de desprendimiento y dispersión de células debería garantizar una calidad deseada de desprendimiento y dispersión de células, conservando al mismo tiempo la mayoría de las células en el cultivo. Preferiblemente, la separación y disociación de las células cultivadas produciría una proporción sustancial de células como células viables únicas (p. ej., al menos el 50%, el 70%, el 90% de las células o más). Las células restantes pueden estar presentes en conglomerados de células, cada uno de los cuales contiene un número relativamente pequeño de células (p. ej., en promedio, entre 1 y 100 células).

A continuación, las células así desprendidas y disociadas (típicamente como una suspensión celular en un tampón isotónico o un medio) se pueden volver a sembrar en placas sobre un sustrato que permite la adherencia de las células al mismo, y posteriormente se cultivan en un medio como se describe anteriormente, manteniendo la mayor proliferación de células H2Stem y de progenie H2Stem. Estas células pueden luego ser cultivadas volviendo a sembrarlas en placas a una densidad de entre 10 y 105 células/cm2, y con una relación de división entre aproximadamente 1/16 y 1/2, preferiblemente entre aproximadamente 1/8 y 1/2, más preferiblemente entre aproximadamente 1/4 y 1/2. La relación de división designa la fracción de las células que han pasado que se siembran en un recipiente de cultivo vacío (típicamente uno nuevo) de la misma área superficial que el recipiente del que se obtuvieron las células. El tipo de recipiente de cultivo, así como la superficie que permite la adherencia de las células al recipiente de cultivo y al medio de cultivo celular, puede ser el mismo que se usó inicialmente y como se describió anteriormente, o puede ser diferente. Preferiblemente, las células se mantienen sobre CellBind o cualquier otro soporte apropiado que esté recubierto con proteínas de la matriz extracelular (tal como colágenos, y preferiblemente colágeno tipo I) o péptidos sintéticos.

Con respecto al paso (e) anterior, el aislamiento de la población de células H2Stem se aplica a las células que han mantenido una morfología meso-epitelial cuboidal, que son positivas para al menos un marcador hepático y al menos un marcador mesenquimal, y que tienen al menos una actividad específica del hígado, validando adicionalmente los criterios para la identificación inicial de células H2Stem en el paso (c) anterior, pero que se puede establecer más fácilmente dada la mayor cantidad de células que están disponibles después del pase.

Los términos "aislando" o "aislamiento" se refieren tanto a la identificación física como al aislamiento de una población celular de un cultivo celular o una muestra biológica que se puede realizar mediante la aplicación de tecnologías de biología celular apropiadas que se basan en la inspección de cultivos celulares y en la caracterización (y separación física cuando sea posible y deseable) de células correspondientes a los criterios, o en la clasificación automatizada de células de acuerdo con la presencia/ausencia de antígenos y/o el tamaño celular (tal como por FACS). En algunas realizaciones, los términos "aislando" o "aislamiento" pueden comprender un paso adicional de separación física y/o cuantificación de las células, especialmente mediante la realización de citometría de flujo.

Las expresiones "población celular" y "población de células" se refieren generalmente a un grupo de células. A menos que se indique lo contrario, la expresión se refiere a un grupo de células que consiste esencialmente en o que comprende células como se define en el presente documento. Una población celular puede consistir esencialmente en células que tienen un fenotipo común o puede comprender al menos una fracción de células que tienen un fenotipo común. Se dice que las células tienen un fenotipo común cuando son sustancialmente similares o idénticas en una o más características demostrables, incluyendo, pero no limitadas a la apariencia morfológica, el nivel de expresión de componentes o productos celulares particulares (p. ej., ARN o proteínas), actividad de ciertas vías bioquímicas, capacidad y/o cinética de proliferación, potencial de diferenciación y/o respuesta a señales de diferenciación o comportamiento durante el cultivo in vitro (p. ej., adherencia o crecimiento en monocapa). Por lo tanto, características demostrables de este tipo pueden definir una población celular o una fracción de la misma. Una población celular puede ser "sustancialmente homogénea" si una mayoría sustancial de células tienen un fenotipo común. Una población celular "sustancialmente homogénea" puede comprender al menos el 60%, p. ej., al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o incluso al menos el 99% de células que tienen un fenotipo común, tal como el fenotipo referido específicamente a células H2Stem (o a progenie H2Stem). Además, una población celular puede consistir esencialmente en células que tienen un fenotipo común, tal como el fenotipo de las células H2Stem (es decir, una progenie H2Stem) si cualquier otra célula presente en la población no altera o tiene un efecto material en las propiedades generales de la población celular y, por lo tanto, se puede definir como una línea celular.

En general, cualquier tecnología para identificar y caracterizar marcadores celulares para un tipo de célula específico (p. ej., marcadores mesenquimales, hepáticos, hematopoyéticos, epiteliales, endoteliales) o que tengan una localización específica (p. ej., intracelular, en la superficie celular o secretada) que se publique en la bibliografía puede considerarse apropiada para caracterizar células H2Stem y progenie H2Stem. Tecnologías de este tipo se pueden agrupar en dos categorías: las que permiten mantener la integridad celular durante el análisis y las basadas en extractos (que comprenden proteínas, ácidos nucleicos, membranas, etc.) que se generan a partir de células de este tipo. Los Ejemplos contienen datos sobre cómo se han utilizado tecnologías de este tipo para caracterizar células H2Stem y progenie H2Stem, p. ej., realizando un análisis de la presencia de antígenos de la superficie celular antes de realizar un análisis más detallado y comparativo con otras células progenitoras del hígado o células primarias del hígado adulto para evaluar sus características distintivas y actividades biológicas.

A nivel de proteínas, tecnologías como la citometría de flujo, FACS o inmunocitoquímica, permiten determinar la presencia/ausencia de proteínas de superficie o intracelulares en células H2Stem mediante el uso de anticuerpos u otros reactivos específicos de proteínas. La citometría de flujo es una tecnología preferida para caracterizar poblaciones celulares de acuerdo con la presencia/ausencia combinada de marcadores de superficie o intracelulares, según lo determinado por técnicas de tinción únicas o múltiples, y/o evaluación de tamaño y granularidad. La inmunocitoquímica también proporciona información relevante sobre las características morfológicas asociadas a la presencia/ausencia combinada de marcadores de superficie, citoesqueléticos y/u otros marcadores intracelulares. De hecho, los Ejemplos demuestran que, en algunas realizaciones, un porcentaje significativo de células en una preparación de células H2Stem es positivo para citoqueratina-19 (CK-19), un marcador citoesquelético e intracelular. Este porcentaje se puede estimar en al menos un 20% o entre un 20 y un 40% cuando se detecta mediante citometría de flujo, pero puede ser mucho mayor (es decir, hasta un 90% o más) cuando se detecta CK-19 mediante inmunocitoquímica (véase la Fig. 2B). Esta característica adicional (es decir, la positividad para CK-19) permite establecer e identificar una población celular que se produce mediante el cultivo de células hepáticas primarias como células H2Stem.

En particular, la presencia de al menos un marcador mesenquimal (en particular, seleccionado de ASMA vimentina, CD90, CD73 y CD29) y de al menos un marcador hepático debe medirse por citometría de flujo, inmunocitoquímica o cualquier otra técnica (generalmente haciendo uso de anticuerpos, lectinas u otras proteínas y que no requieren la extracción de proteínas o ácidos nucleicos) que permite evaluar el porcentaje de células que presentan el receptor. La positividad para marcadores de la superficie celular adicionales distintos de los estrictamente asociados con características hepáticas o mesenquimales (tales como CD140b, CD49b, CD51 o cualquier otro marcador positivo que se menciona en la Tabla 2, Tabla 4, Tabla 6 y Tabla 7 en el Ejemplo 3) puede medirse de manera similar. La positividad por citometría de flujo e inmunocitoquímica se define aquí cuando al menos el 60% de las células presentan el marcador o receptor deseado (como se muestra en los Ejemplos). De manera similar, la negatividad por citometría de flujo e inmunocitoquímica se define aquí cuando menos del 20% de las células presentan el marcador o receptor dado (como se muestra en los Ejemplos). En algunas realizaciones, menos del 10% de las células presentan un marcador negativo dado, como en el caso de CD140b (véase la Fig. 10B) o de CD271 (véase la Fig. 11B).

En algunas realizaciones, cuando se mide un marcador dado, el agente que se usa para la detección de un marcador como se define anteriormente o una proteína de la superficie celular se inmoviliza en una fase sólida (p. ej., una perla, una placa o un biomaterial), se marca (p. ej. marcado con fluorescencia) y/o es reconocido por otro compuesto que está marcado (p. ej., un anticuerpo secundario). Existen numerosos métodos mediante los cuales el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, deseablemente por examen visual o por radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador u otro componente del sistema productor de señales también se pueden unir a un participante en la unión específico, a otra molécula o a un soporte tal como perlas, usando cualquier método conocido en la técnica, tal como la reticulación química o usando el sistema biotina-estreptavidina. El marcador puede producir directamente una señal y, por lo tanto, no se requieren componentes adicionales para producir una señal. Numerosas moléculas orgánicas, por ejemplo, los fluorocromos (tales como FITC, PE, PC5, PC7, APC o cualquier otro que se sepa que es compatible con la citometría de flujo), absorben la luz ultravioleta y visible. Otros tipos de marcadores producen directamente una señal, tales como los isótopos radiactivos y los colorantes. Alternativamente, el marcador puede necesitar otros componentes para producir una señal, y el sistema de producción de señales incluiría todos los componentes necesarios para producir una señal mensurable, que puede incluir sustratos, coenzimas, iones metálicos o sustancias que reaccionan con productos enzimáticos (p. ej., detección quimioluminiscente de peroxidasa de rábano picante).

Las actividades metabólicas específicas del hígado de células H2Stem comprenden actividades biológicas generalmente asociadas con las células hepáticas (y con los hepatocitos en particular) y que distinguen a las células hepáticas de las células presentes en otros tejidos y, en particular, comprenden actividades que implican unión, activación y/o degradación de proteínas u otros sustratos como se describe en la bibliografía y en los Ejemplos. Estas actividades biológicas se establecen sobre la base de la detección de actividades metabólicas específicas del hígado que pueden ser actividades de unión a proteínas/fármacos y, más preferiblemente, actividades enzimáticas en sustratos determinados, o en asociación con moléculas específicas del hígado que se detectan mediante tecnologías de transferencia (transferencia Western o Northern), secuenciación, isoelectroenfoque, ELISA o de la internalización de compuestos sintéticos o naturales que se sabe que se transportan y metabolizan específicamente dentro de las células hepáticas. Otras actividades enzimáticas relevantes distintas de las estrictamente asociadas a las características hepáticas (tales como las mencionadas en el Ejemplo 3) pueden medirse y compararse de manera similar con las medidas dentro de los hepatocitos u otros tipos de células utilizando técnicas que se describen en la bibliografía.

A nivel de ácido nucleico, la secuenciación del genoma completo, la PCR o la RT-qPCR se pueden usar para caracterizar las células H2Stem o la progenie H2Stem. De este modo, la PCR en tiempo real se puede utilizar para cuantificar la expresión del gen en investigación, en función del número de ciclos y normalizándolo frente a los ciclos obtenidos para 1 o más controles endógenos. En particular, la reacción de RT-PCR se puede realizar utilizando células H2Stem y cebadores y tampones adecuados, pero el número de ciclos para obtener una señal no debe superar los 25, 30 o 35 ciclos.

A nivel de actividad, la presencia de una actividad metabólica específica del hígado puede medirse mediante cualquier técnica apropiada que permita evaluar la presencia y/o el nivel de actividad de las enzimas específicas del hígado, pero preferiblemente debe permitir cuantificar in vitro la actividad enzimática real, con un límite dado de detección del producto final específico (como se puede establecer fácilmente con el apoyo de la bibliografía y los productos disponibles comercialmente) para medir las actividades de CYP450, desintoxicación, almacenamiento de glucógeno, secreción de alfa-1-antitripsina o albúmina, producción de bilis, producción de trombopoyetina, producción de angiotensinógeno, conversión de amoníaco en urea, síntesis de colesterol, glucogenólisis, glucogénesis y lipogénesis. En particular, la positividad para al menos una actividad metabólica específica del hígado se define aquí cuando la actividad se mide como estadísticamente superior al límite de detección del producto final (siendo al menos dos, cinco o diez veces más que el límite de detección) o acercándose al nivel de actividad de los hepatocitos primarios (superior, idéntico o 10%; 25%, 50%, 75% o 90% inferior).

La bibliografía proporciona una descripción extensa de las tecnologías para evaluar las actividades del citocromo P450 en hepatocitos humanos in vitro, en particular con respecto a los compuestos que inducen específicamente una actividad enzimática y los formatos que pueden usarse para realizar estos experimentos (Baudoin R et al., 2012; Gerets HH et al., 2012; Gomez-Lechon MJ et al., 2012; Halladay JS et al., 2012; Hoffmann SA et al., 2012; Lubberstedt M et al., 2011; Smith CM et al., 2012). Entre los diferentes inductores, el metabolismo de fármacos en estas células se puede evaluar usando midazolam, etoxirresorufina, benzoxiresorufina, bupropión, fenacetina, diclofenaco, tolbutamida, fenobarbital, rifampicina, cafeína, beta-naftoflavona, omeprazol, dextrometorfano, 3-metilcolantreno, repaglinida u otros compuestos citotóxicos/hepatotóxicos conocidos como sondas que se enumeran en la bibliografía (Bale S et al., 2014). La detección y cuantificación de metabolitos se puede asociar a la actividad de las enzimas hepáticas sobre compuestos específicos tales como CYP1A2 (al detectar paraxantina o paracetamol), CYP3A4 (al detectar 1-OH-midazolam u omeprazol sulfona), CYP2C6 (al detectar HO-bupropión), CYP2C8 (al detectar hidroxilorepaglinida), CYP2C9 (al detectar 4'HO-diclofenaco), CYP2C19 (al detectar hidroxi-omeprazol o HO-mefenitoína), CYP2D6 (al detectar dextrorfano), CYP2E1 (al detectar 6-OH-clorzoxazona), así como para otras actividades principales del citocromo P450 tales como CYP1A2, CYP2A6, CYP1B1, CYP2B6, CYP3A5, CYP3A7 o CYP7A1 (solos o en combinaciones apropiadas).

Otras enzimas cuya expresión o (preferiblemente) actividad puede establecerse en células H2Stem y progenie H2Stem son UDP-glucuronosiltransferasas (tales como UGT1A1, UGT2B4, UGT2B7), sulfotransferasas (que catalizan la conjugación de sulfato de varias moléculas endógenas farmacológicamente importantes y xenobióticos), tirosina transferasas, triptófano-2,3-dioxigenasa (TDO2 o TDO), indolamina-2,3-dioxigenasas (IDO1 o IDO2), lisil oxidasa (LOX), glutatión S-transferasas (p. ej., GSTalfa), proteínas de resistencia a múltiples fármacos (MDR o MRP-1/-2/-3), transportadores específicos del hígado (tales como OATP1B1) y otras enzimas de biotransformación de fase I/II/III. Además, la producción y secreción de albúmina/urea, el metabolismo del amoníaco, el almacenamiento de glucógeno, la producción de bilis, la producción de trombopoyetina/angiotensinógeno y las tasas de eliminación de galactosa/sorbitol también se pueden observar y comparar aplicando protocolos bien establecidos.

Cuando se obtiene una preparación de células H2Stem mediante los métodos descritos en el presente documento, esta población celular se puede mantener y/o propagar en condiciones que permitan el crecimiento y la duplicación sin diferenciación. Preferiblemente, las células H2Stem se hacen pasar como células adherentes no diferenciadas (o, como se indicó anteriormente, conglomerados de células tridimensionales denominados células H3Stem), no más de 2, no más de 3, no más de 4 o más de 5 veces en cultivo, de modo que se pueda evaluar el número de duplicaciones celulares para establecer las condiciones más apropiadas para su posterior uso in vivo o in vitro. Después de uno o más pases en este estado, se puede inducir la diferenciación en células similares a hepatocitos o hepato-activas (véanse las Fig. 1, Fig. 4A y Fig. 5B-E). En ambos casos, las células resultantes representan progenie H2Stem. En el primer caso, las condiciones para mantener las células H2Stem como progenie H2Stem indiferenciada pueden ser las mismas condiciones utilizadas para obtener la población original de células H2Stem con el fin de aumentar el número de células disponibles o, como se muestra en los Ejemplos, generar conglomerados de células tridimensionales (células H3Stem). En el segundo caso, se pueden aplicar condiciones de cultivo celular bien establecidas para diferenciar células progenitoras hepáticas del hígado adulto en células que tienen características morfológicas, biológicas y funcionales típicas de las células que se diferencian en hepatocitos.

Después del paso (e) de los métodos descritos en el presente documento, un paso adicional opcional (f) puede comprender el mantenimiento de células H2Stem en condiciones de cultivo celular que permitan la diferenciación en células que presenten actividades específicas del hígado, por ejemplo, células similares a hepatocitos o células hepato-activas. (es decir, células progenitoras del hígado adulto que han perdido su positividad para la mayoría, si no todos, los marcadores mesenquimales y son positivas para la mayoría, si no todas, las características morfológicas, biológicas y funcionales de los hepatocitos). Los Ejemplos proporcionan detalles sobre cómo generar células similares a los hepatocitos o hepato-activas tales como progenie H2Stem en forma de células adherentes (tales como células H3Screen-2b, H3Screen-2c o H2Screen) o conglomerados de células tridimensionales que pueden ser fácilmente mantenidas en suspensión (tales como células H3Screen-1 o como células H3Screen-2a).

En este último aspecto, los Ejemplos demuestran que las placas o matraces de cultivo celular de fijación ultrabaja, e incluso más apropiadamente microplacas de cultivo en forma de U/redondas de fijación ultrabaja, proporcionan progenie H2Stem tridimensional como conglomerados de células en suspensión que muestra características funcionales. y estructurales mejoradas que caracterizan a los hepatocitos y, en general, a las células hepato-activas. Las microplacas de cultivo en forma de U/redondas de 96 o 384 pocillos (o en cualquier otro formato disponible que contenga un número diferente de pocillos con fondo en forma de U y que permita mantener cultivos celulares en un volumen de medio de cultivo inferior a 0,5 ml o, incluso mejor, por debajo de 0,25 ml) proporcionan progenie H2Stem tridimensional como conglomerados de células en suspensión con un tamaño y forma más regular que los hace más apropiados para usos in vitro e in vivo.

Por lo tanto, la población celular que se produce y aísla en el paso (e) anterior puede, en algunas realizaciones, mantenerse en condiciones de cultivo celular que permitan la formación de conglomerados de células que representan progenie H2Stem tridimensional específica. Este paso del método puede ser un paso (g) adicional (p. ej., para obtener células H3Screen-1 a partir de células H2Screen), como un paso (f1) alternativo (p. ej., para obtener células H3Stem a partir de células H2Stem), o como un paso (f2) alternativo adicional que combina la diferenciación in vitro y la formación de progenie H2Stem tridimensional (p. ej., para obtener células H2Screen-2a directamente a partir de células H2Stem).

Los pases adicionales (p. ej., desprendimiento y dispersión de células, la siembra renovada en placas, etc.) y el cultivo (p. ej., adición de medio o cambios después de la confluencia, etc.) pueden realizarse en condiciones sustancialmente idénticas o análogas a las del primer pase, como se describe anteriormente, o que incluya modificaciones que se sugieran en la bibliografía y/o para el uso específico de células H2Stem o progenie H2Stem, en particular en forma de conglomerados de células tridimensionales (progenie H2Stem tridimensional). Por lo tanto, las condiciones para mantener y/o diferenciar células H2Stem o progenie H2Stem en cultivo celular pueden optimizarse aún más de acuerdo con diferentes criterios, tales como el tiempo/medio para la diferenciación en células similares a hepatocitos o hepato-activas, sistemas para mantener cultivos celulares tridimensionales como suspensiones celulares, el uso de sustratos o armazones específicos, hipoxia, adición combinada o secuencial de factores de crecimiento y compuestos químicos dentro del medio de cultivo celular, o densidad celular.

Los métodos descritos en el presente documento proporcionan células H2Stem, que presentan características morfológicas, de expresión de proteínas y funcionales que son distintas de las identificadas en las células hepáticas progenitoras adultas descritas anteriormente. En consecuencia, las células H2Stem que se obtienen o se pueden obtener mediante los métodos definidos anteriormente representan una realización adicional. Estos métodos permiten proporcionar poblaciones celulares que comprenden una alta proporción de células específicas (al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más), incluso dando como resultado una población celular sustancialmente homogénea puede evaluarse mediante cualquier método estándar apropiado, p. ej., mediante citometría de flujo o cualquier otro enfoque de inmunotinción. Los elementos del estroma en una determinada progenie H2Sstem, en particular dentro de las células hepato-activas y los conglomerados de células tridimensionales (véanse las Fig. 4A y Fig. 5), se consideran parte de una progenie de este tipo y no deben considerarse como elementos que contaminan conglomerados de células de este tipo, sino más bien como elementos constitutivos.

Células H2Stem y progenie H2Stem se pueden usar para establecer cultivos celulares para cualquier uso inmediato o se pueden almacenar como preparaciones crioconservadas, cada una de las cuales contiene al menos 103, 106, 109 células o más, destinadas a producir o utilizar una mayor cantidad de células H2Stem o progenie H2Stem después de descongelar adecuadamente las preparaciones y, si es necesario, para producir células H2Stem y progenie H2Stem a escala industrial (p. ej., utilizando biorreactores, membranas, microesferas, microfluidos o cualquier otra solución técnica para mejorar el bioprocesamiento y la expansión celular manteniendo las propiedades celulares deseadas). Muestras de poblaciones celulares correspondientes a cualquiera de las células H2Stem y progenie H2Stem se pueden crioalmacenar en un medio de conservación que contenga suero o sin suero (p. ej., formulaciones de crioconservación disponibles comercialmente) y/o en presencia de un agente crioprotector (p. ej., dimetilsulfóxido en una concentración adecuada). Con respecto a la microfluídica, la progenie H2Stem (también en forma de células H3Stem que se mantienen como estructuras tridimensionales) puede ser compatible con sistemas comerciales desarrollados para aplicaciones de órganos en un chip en ensayos de seguridad, estudios fisiopatológicos y otros modelos hepáticos basados en células para el desarrollo de fármacos y la toxicología (Alépée N et al., 2014; Lin C et al., 2015).

En particular, las preparaciones de células H2Stem y progenie H2Stem que comprenden un número predeterminado de células (p. ej., 50000, 100000, 500000, 1 millón, 10 millones, 100 millones, 1 billón o más células) o de conglomerados de células tridimensionales, cada uno de los cuales tiene aproximadamente un número similar de células (p. ej., 1, 10, 100, 1000 o más esferoides como los que se muestran en la Fig. 6) se puede proporcionar en uno o más viales que luego se pueden incluir en un kit que comprende dichos viales (u otro envase o recipiente apropiado como los que se usan para aplicaciones de microfluidos) que luego se pueden incluir en un kit que comprende dichos viales, recipientes, aparatos de microfluidos y cualquier otro dispositivo apropiado, materiales desechables (p. ej., filtros, jeringas), soluciones (p. ej., PBS, medio de cultivo celular, diluyente), productos químicos (p. ej., sustratos enzimáticos, fluorocromos, fármacos), productos biológicos (p. ej., factores de crecimiento, anticuerpos, cebadores) y/o instrucciones para usar los componentes de un kit de este tipo que pueden empaquetarse adecuadamente y enviarse a los clientes para usar células H2Stem y progenie H2Stem in vivo (p. ej. para la administración a un paciente o a un animal) o in vitro (p, ej., para testar la toxicidad o la eficacia de los compuestos como fármacos candidatos) en consecuencia.

El mantenimiento, la proliferación y/o diferenciación de células H2Stem y progenie H2Stem en condiciones de cultivo celular (o después de la implantación en un modelo animal o en un paciente) se puede realizar según se requiera para el uso deseado. La bibliografía proporciona varios protocolos para mantener células progenitoras hepáticas y/o generar a partir de ellas células similares a hepatocitos o hepato-activas. Los Ejemplos proporcionan medios para obtener células H2Stem y progenie H2Stem en condiciones de cultivo celular, y para diferenciarlas en células que presentan actividades específicas del hígado en forma de células adherentes o como conglomerados de células tridimensionales. En este último caso, células H2Stem y progenie H2Stem se pueden proporcionar para el uso deseado como conglomerados de células tridimensionales similares a los esferoides u organoides hepáticos que, de acuerdo con la bibliografía, pueden proporcionar a las células mejoras significativas en viabilidad y funcionalidad cuando se administran intra- o extra-hepáticamente, utilizadas para testar la hepatotoxicidad de compuestos, mantenidas como preparaciones crioconservadas, expandidas en biorreactores o pilas de bandejas múltiples para aumentar el proceso de fabricación, o utilizadas en dispositivos de asistencia hepática (Lu Y et al., 2012; Saito R et al., 2011; Massie I et al., 2011; Soto-Gutierrez A et al., 2010; Mitaka T y Ooe H, 2010; Meng Q, 2010; Tostoes RM et al., 2012). Además de los métodos descritos en los Ejemplos, el crecimiento tridimensional de células H2Stem y progenie H2Stem también puede obtenerse encapsulando las células en matrices sintéticas o biológicas. En particular, las matrices descelularizadas o extracelulares del hígado pueden usarse como armazones para cultivar uno o más tipos de células, como recubrimiento de sustrato bidimensional y plataforma de hidrogel inyectable tridimensional para generar organoides hepáticos (Lee J et al. 2014; Caralt M et al., 2014).

El mantenimiento, la proliferación y/o diferenciación de células H2Stem y progenie H2Stem se puede mejorar adaptando las condiciones de cultivo celular utilizando soluciones técnicas bien conocidas en la técnica para células madre, progenitoras o mesenquimales de diferente origen. Por ejemplo, los protocolos ex-vivo de atmósferas bajas en oxígeno que no dañan las células y otros enfoques para adaptar microentornos in vitro pueden facilitar la supervivencia, la estabilidad genética, la proliferación, la diferenciación posterior al injerto, el alojamiento y la repoblación en el hígado, la secreción de factores paracrinos y potencial terapéutico general de células de este tipo (Muscari C et al., 2013; Cigognini D et al., 2013). De lo contrario, los componentes derivados de la sangre humana, tales como el suero de la sangre del cordón umbilical y el lisado de plaquetas, se testan y desarrollan como componentes de cultivo celular que son una alternativa no xenogénica al suero bovino fetal y aún cumplen con las pautas de buenas prácticas de fabricación (GMP, por sus siglas en inglés) para producir dosis de células clínicamente relevantes sin los conocidos problemas asociados al suero tales como variabilidad en la calidad, riesgo de contaminación y efectos inmunizantes no deseados (Bieback K, 2013; Griffiths S et al., 2013).

Antes de administrarse o usarse de otro modo, las células H2Stem y progenie H2Stem pueden modificarse de manera transitoria o estable al exponer dichas células a agentes químicos o biológicos heterólogos, o al introducir dichos agentes en las células. En particular, células H2Stem y progenie H2Stem pueden modificarse (o diseñarse, después de su transformación con vectores apropiados) en cultivo celular (p. ej., después y/o antes de su diferenciación) tratando las células con factores de crecimiento y/o introduciendo ácidos nucleicos que afectan el perfil de expresión general de las células, preferiblemente hacia características hepáticas específicas o características que ayuden al cultivo celular (p. ej., mediante la transducción de células con microARNs o con vectores lentivirales que expresan proteínas recombinantes, tales como factores de crecimiento o factores de transcripción que se sabe que afectan a la diferenciación hepática o la diferenciación hacia cualquier otro tipo de célula, y/o la producción de proteínas específicas de interés terapéutico, o proteínas fluorescentes).

En particular, células H2Stem y progenie H2Stem pueden, en consecuencia, presentar actividades biológicas mejoradas y/o adicionales in vivo y/o in vitro, después y/o antes de su diferenciación en células que presentan una gama completa de actividades específicas del hígado. Preferiblemente, células H2Stem y progenie H2Stem se modifican antes de diferenciarse, de modo que cualquiera de la progenie de células de este tipo se modifique consistentemente para tener actividades biológicas mejoradas, independientemente de cualquier posterior diferenciación in vitro o uso in vivo (que puede implicar, o no, daño hepático) u otro tipo de diferenciación).

El tratamiento de progenie H2Stem con agentes químicos, medio de cultivo celular y/o vectores de ácido nucleico que se sabe que inducen la diferenciación de otras células progenitoras/madre hepáticas conocidas en otros tipos de células no hepáticas (p. ej., osteocitos, células beta productoras de insulina, o células de la médula ósea) pueden proporcionar igualmente tipos de células no hepáticas de este tipo. Poblaciones de células no hepáticas que se obtienen aplicando estas tecnologías conocidas en la bibliografía a las células H2Stem (o cualquier tipo específico de progenie H2Stem) son tipos adicionales de progenie H2Stem diferenciada que la descrita en los Ejemplos (obtenidas mediante el uso de un medio de cultivo celular para inducir la diferenciación hepática) que pueden utilizarse in vitro y/o in vivo (en particular, para usos terapéuticos) de acuerdo con las actividades biológicas que la progenie H2Stem ha perdido y/o adquirido como consecuencia de un tratamiento de este tipo (p. ej,, una progenie H2Stem diferenciada que produce y secreta insulina pueden usarse para tratar la diabetes).

Métodos convencionales de transferencia de genes aplicables a las células progenitoras hepáticas se pueden utilizar para introducir ácidos nucleicos en células H2Stem y progenie H2Stem, incluyendo microinyección, electroporación, co-precipitación con fosfato de calcio, liposomas o transfección viral. Después de su transformación con vectores apropiados, células H2Stem y progenie H2Stem pueden expresar proteínas recombinantes o contener ácidos nucleicos que permiten que dichas células realicen actividades biológicas mejoradas y/o adicionales in vivo y/o in vitro, después y/o antes de su diferenciación en células similares a hepatocitos o hepato-activas (por ejemplo, en el ámbito del establecimiento de modelos basados en células progenitoras hepáticas para terapia génica). Cuando los vectores sean vectores virales (p. ej., un vector de lentivirus), se caracterizarán determinando su título con el fin de seleccionar las condiciones óptimas de eficiencia de transducción y tasa de proliferación, y analizar su perfil de expresión así como su seguridad.

El hígado está conectado anatómicamente con el sistema circulatorio de tal manera que permite una liberación eficiente de diversas proteínas al torrente sanguíneo. Por lo tanto, los genes que codifican proteínas que tienen efectos sistémicos pueden insertarse en células H2Stem y progenie H2Stem (en particular antes de ser cultivados para obtener conglomerados de células tridimensionales) para mejorar aún más su eficacia (en particular cuando se administran sistémicamente, p. ej., por vía intravenosa, intramuscular o inyección intraperitoneal), así como para su injerto y mantenimiento cuando se administran in vivo. Como se muestra en el Ejemplo 4, al usar un modelo de ratón relevante, las células H2Stem presentan un alto nivel de injerto, localización y diferenciación hepática en los tejidos hepáticos, lo que potencialmente proporciona medios eficientes para administrar proteínas exógenas.

Por ejemplo, una variedad de genes que codifican hormonas o anticuerpos pueden insertarse en células hepáticas de la presente invención para la secreción de sus productos génicos en la circulación. En particular, células H2Stem y progenie H2Stem pueden modificarse para sobre-expresar de manera constitutiva o transitoria una proteína normalmente expresada por los hepatocitos (y posiblemente ya expresada por células de este tipo), pero que es defectuosa o está ausente en un paciente (este defecto subyace a un estado patológico del paciente, como en los errores congénitos del metabolismo hepático) y luego ayudar a restaurar la producción de la proteína y, por lo tanto, ayudar en el tratamiento del paciente. Ejemplos de proteínas de este tipo son proteínas metabólicas tales como ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arigininosuccinato liasa, arginasa, carbamil fosfato sintasa, N-acetil glutamato sintasa, glutamina sintetasa, glucógeno sintetasa, glucosa-6-fosfatasa, fosfatasa alcalina, succinato deshidrogenasa, glucocinasa, piruvato quinasa, acetil CoA carboxilasa, ácido graso sintetasa, alanina aminotransferasa, glutamato deshidrogenasa, ferritina, receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL), enzimas del citocromo P450, aldehído deshidrogenasa y/o alcohol deshidrogenasa.

Alternativamente, células H2Stem y progenie H2Stem pueden modificarse introduciendo el ADN que codifica una proteína plasmática secretada tal como albúmina, un factor de crecimiento u hormona, insulina, transferrina, proteínas del complemento (como el componente C3), alfa2-macroglobulina, cadena alfa/beta/gamma del fibrinógeno, Factores de coagulación (Factor V, Factor VII, Factor VIII, Factor XI, Factor XIII, Factor IX), alfa-1-antitripsina, o similares.

Los materiales biológicos que se obtienen al generar células H2Stem y progenie H2Stem se pueden usar adicionalmente para identificar entidades biológicas que pueden tener usos específicos, en particular aplicaciones médicas distintas. Estos materiales biológicos incluyen no solo subpoblaciones (o líneas celulares) de células H2Stem o de progenie H2Stem que presenten marcadores, actividades y/o morfología específicos (como se determina en los Ejemplos 3 y 4), sino también cualquier otra entidad biológica que se obtenga como productos intermedios o finales, tales como medios de cultivo celular acondicionados y fracciones de estas células y medios que incluyen proteínas, metabolitos, vesículas celulares y/o ácidos nucleicos que pueden usarse como biomarcadores para detectar células de interés médico o como compuestos que presentan actividades o distribución de interés médico. Aunque este enfoque se puede seguir usando las células de interés directamente, también se puede determinar información adicional midiendo el contenido de los medios de cultivo celular acondicionados (p. ej., en forma de sobrenadante de cultivo celular) que puede proporcionar información relevante sobre el secretoma y, en particular, sobre los efectos paracrinos de células H2Stem y progenie H2Stem.

Características biológicas relevantes de células H2Stem o progenie H2Stem pueden identificarse mediante el uso de tecnologías tales como citometría de flujo, inmunocitoquímica, espectrometría de masas, electroforesis en gel, un inmunoensayo (p. ej., inmunotransferencia, transferencia Western, inmunoprecipitación, ELISA), amplificación de ácidos nucleicos, actividad enzimática, tecnologías ómicas (proteómica, glucómica, transcriptómica, metabolómica) y/u otra actividad biológica. En particular, tecnologías tales como la genómica, la transcriptómica, la proteómica, la lipidómica, la glucómica, etc. pueden proporcionar medios adicionales para comparar células H2Stem o progenie H2Stem utilizando bases de datos y otros conjuntos de datos publicados para células madre o progenitoras y, en particular, para células progenitoras hepáticas. (Yu J, et al., 2012; Santamaria E, et al., 2012; Slany A, et al., 2010; Sison-Young R et al., 2015). De esta manera, proteínas tales como SUSD2 pueden identificarse como marcadores cuya presencia significativamente mayor en células H2Stem las diferencia de células de origen similar tales como células ADHLSC (o, en sentido contrario, la ausencia de expresión de CD140b distingue a las células H2Stem de células ADHLSC, como se muestra en la Fig. 10). Marcadores adicionales que se pueden usar durante el paso inicial de la preparación de progenie H2Stem o más adelante (p. ej., para comparar y validar lotes fabricados industrialmente de progenie H2Stem o para evaluar la idoneidad para uso farmacéutico) son CD49b, CD51, con o sin uno o más de proteínas el grupo en la lista de la Tabla 2 que figura más adelante.

Estos enfoques pueden proporcionar medios para definir nuevos biomarcadores asociados a células progenitoras del hígado adulto, ya sea in vivo o in vitro (p. ej., para establecer la cantidad, la calidad y la homogeneidad de una población celular antes, durante o después de su preparación y uso). En particular, los biomarcadores pueden definirse mediante la concentración de una determinada población celular (células H2Stem y/o progenie H2Stem) en una muestra biológica o en un cultivo celular en general o en combinación con la concentración de células que presentan una determinada proteína, lípido, enzima, fosfolípido y/o glicano. Biomarcadores de este tipo pueden corresponder a un péptido, una proteína, un fosfolípido, un lípido, un ácido nucleico, un glicano o cualquier combinación de elementos componentes de este tipo. El biomarcador puede ser específico para evaluar la idoneidad de una población celular que sea células H2Stem o progenie H2Stem, para un uso dado (p. ej., tratar una enfermedad hepática específica, obtener tipos de células hepato-activas después de la diferenciación o modificación in vitro con agentes químicos y/o vectores de ácidos nucleicos, evaluando el metabolismo de un compuesto específico), en particular cuando se compara progenie H2Stem obtenida de diferentes donantes y/o mediante la aplicación de diferentes procesos de fabricación. Por otra parte, el biomarcador permite evaluar si un determinado tejido hepático (o una muestra de células hepáticas frescas o crioconservadas) es adecuado para obtener células H2Stem de manera más eficiente (p. ej, detectando bancos de tejidos hepáticos y colecciones de otras muestras biológicas de origen hepático, tales como extractos de proteínas y colecciones de ADNc) para establecer qué donantes y/o muestras se pueden seleccionar).

El término "biomarcador" o "marcador" se refiere a una molécula, un parámetro, una característica o una entidad que se mide y evalúa objetivamente como una característica de las células H2Stem y/o progenie H2Stem. La evaluación cuantitativa de un biomarcador asociado a células H2Stem y/o progenie H2Stem en una muestra específica (tal como un tejido o un fluido biológico) puede asociarse a una evaluación cuantitativa de células totales, a la eficiencia con la que células H2Stem y/o progenie H2Stem se puede producir y aislar, para una tecnología in vitro específica, o para un uso o estado médico específico de un paciente.

Células H2Stem y progenie H2Stem se pueden usar en medicina regenerativa y en ensayos biológicos que requieren células que presenten características biológicas (como actividades metabólicas o enzimáticas, un perfil antigénico u otro fenotipo) lo más similares posible a las observadas en los hepatocitos primarios para el período de tiempo deseado, una vez que se diferencian in vivo o in vitro, o incluso antes de inducir una diferenciación completa hacia células que presentan un mayor número y/o actividades específicas del hígado más fuertes (es decir, células hepatoactivas). Células H2Stem y progenie H2Stem también se pueden utilizar para aplicaciones in vitro, tales como estudios farmacológicos o toxicológicos (p. ej., detección y caracterización de agentes biológicos o químicos). Células H2Stem y progenie H2Stem permiten establecer modelos in vitro y animales de toxicología, farmacología y farmacogenética (como se describe ampliamente para hepatocitos primarios y células similares a hepatocitos derivadas de células progenitoras o madre de diversos orígenes) o identificación de biomarcadores para identificar in vivo y/o in vitro una población celular de interés médico, en particular en relación con el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de enfermedades hepáticas.

La expresión "in vitro", como se usa en el presente documento, indica fuera o en el exterior del cuerpo animal o humano. Debe entenderse que la expresión "in vitro", como se usa en el presente documento, incluye "ex vivo". La expresión "ex vivo" se refiere típicamente a tejidos o células extraídos de un cuerpo animal o humano y mantenidos o propagados fuera del cuerpo, p. ej., en un recipiente de cultivo o un biorreactor.

Si las células H2Stem y las células H3Stem se pueden utilizar preferentemente para aplicaciones in vivo, la progenie H2Stem correspondiente a las células H2Screen, las células H3Screen-1 y las diferentes categorías de células H3Screen-2 se pueden utilizar preferentemente como células diferenciadas similares a hepatocitos o hepato-activas para el descubrimiento/validación de fármacos.

Células H2Stem y progenie H2Stem (o los materiales biológicos correspondientes que se obtienen al generarlas) pueden proporcionarse en composiciones que las comprenden y, en particular, como composiciones farmacéuticas que pueden usarse en métodos terapéuticos para administración in vivo (en seres humanos o en modelos animales) o aplicaciones in vitro en forma de una composición que incluye células de este tipo tales como células frescas o células adecuadas para el almacenamiento a largo plazo (p. ej., células crioconservadas). Preferiblemente, una composición que comprende células H2Stem o progenie H2Stem puede comprender al menos 103; 106, 109 o más células. Composiciones de este tipo basadas en células también pueden incluir otros agentes de origen biológico (p. ej., anticuerpos o factor de crecimiento) o químico (p. ej., fármacos, compuestos de conservación o marcaje de células) que pueden proporcionar un efecto terapéutico, de diagnóstico o cualquier otro efecto útil adicional. La bibliografía proporciona varios ejemplos de aditivos, excipientes, vehículos y/o soportes opcionales que son compatibles con las composiciones farmacéuticas basadas en células que pueden incluir tampones, factores de crecimiento o adyuvantes específicos adicionales, en donde la cantidad de cada uno de los componentes de la composición (en términos de microgramos/miligramos, volumen o porcentaje), así como los medios para combinarlos con células H2Stem y progenie H2Stem.

Células H2Stem y progenie H2Stem se pueden administrar en forma de una composición que, dependiendo del método de administración elegido, puede ser una suspensión de células, una esponja u otra estructura tridimensional en donde las células puedan crecer y diferenciarse in vitro y/o in vivo, incluyendo dispositivos hepáticos bioartificiales, matrices naturales o sintéticas, u otros sistemas que permitan el injerto y la funcionalidad de las células. En particular, células H2Stem y progenie H2Stem pueden administrarse mediante inyección (que abarca también la administración por catéter) o implantación, p. ej., inyección localizada, inyección sistémica, inyección intraesplénica, inyección intraarticular, inyección intraperitoneal, inyección intraportal, inyección en la pulpa del hígado, p. ej., debajo de la cápsula hepática, administración parenteral o inyección intrauterina en un embrión o feto. Cuando se inyecta sistémicamente y no localmente, el producto H2Stem puede tener un efecto en una ubicación distante, ya sea porque células H2Stem de este tipo se mueven en el torrente sanguíneo y se injertan en lugares distantes (tales como órganos internos o articulaciones), o porque las proteínas secretadas por las células H2Stem llegan a tipos de células específicas, gracias al torrente sanguíneo. Además, células H2Stem y progenie H2Stem se pueden utilizar como componentes biológicos de dispositivos de desintoxicación, tales como perfusión hepática o dispositivos de asistencia hepática con una cubierta exterior rígida de plástico y fibras de membrana semipermeables huecas en donde se siembran células H2Stem o progenie H2Stem (al igual que otras células madre, células humanas primarias tales como hepatocitos diferenciados o tipos de células derivados de células madre). Los fluidos corporales pueden perfundirse a través del dispositivo para la desintoxicación según procedimientos bien conocidos y luego devolverse al paciente.

Células H2Stem, progenie H2Stem o la composición que las contiene se pueden usar para la ingeniería de tejidos y la terapia celular a través del trasplante de células hepáticas (LCT) en ubicaciones intrahepáticas o extrahepáticas (incluyendo la modulación de la respuesta inmunológica al trasplante anterior o posterior de hígado u otros órganos y tejidos). Utilizando este enfoque, también se pueden obtener modelos animales de enfermedades hepáticas humanas trasplantando células H2Stem de origen humano, progenie H2Stem de origen humano o una composición que las contenga en animales en donde los efectos de un compuesto en hepatocitos humanos se pueden evaluar de manera más efectiva y se puede distinguir de los efectos en el modelo animal.

Cuando se administra una composición terapéutica que comprende células H2Stem o una progenie H2Stem específica, generalmente ésta se puede formular en una dosificación unitaria. En cualquier caso, puede ser deseable incluir agentes y/o adaptar métodos conocidos para administrar células a pacientes que aseguren la viabilidad de células H2Stem y progenie H2Stem, por ejemplo, incorporando las células en un biopolímero o polímero sintético. Ejemplos de biopolímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a fibronectina, fibrina, fibrinógeno, trombina, colágeno y proteoglicanos, lamininas, moléculas de adhesión, proteoglicanos, hialuronanos, cadenas de glicosaminoglicanos, quitosano, alginato, péptidos naturales o modificados sintéticamente que se derivan de proteínas y polímeros sintéticos, biodegradables y biocompatibles de este tipo. Estas composiciones pueden producirse con o sin incluir citoquinas, factores de crecimiento y administrarse como una suspensión o como un gel tridimensional con las células embebidas en su interior.

Los métodos descritos en este documento contemplan no solo el uso de cualquier donante de tejidos hepáticos para generar células H2Stem o progenie H2Stem, sino también el uso del propio tejido hepático del paciente para producir y aislar células H2Stem y generar progenie H2Stem o una composición que las contenga. Células de este tipo serían autólogas para el paciente y podrían administrarse fácilmente al paciente. Por otra parte, las células H2Stem pueden producirse y aislarse a partir de tejido que no sea el propio del paciente. Cuando se contempla la administración de células de este tipo a un paciente, puede ser preferible que el tejido hepático sometido al método descrito en el presente documento para obtener células H2Stem se seleccione para maximizar, al menos dentro de los límites alcanzables, la compatibilidad del tejido entre el paciente y las células administradas, reduciendo con ello la posibilidad de rechazo de las células administradas por el sistema inmunitario del paciente (p. ej., rechazo de injerto frente a huésped).

Una cuestión relacionada con el uso terapéutico de células H2Stem y progenie H2Stem es la cantidad de células necesaria para lograr un efecto óptimo. Las dosis para la administración pueden ser variables, pueden incluir una administración inicial seguida de administraciones posteriores; y puede ser determinado por el experto en la materia aplicando las enseñanzas de la presente divulgación. Típicamente, la dosis o dosis administradas proporcionarán una cantidad terapéuticamente eficaz de las células y puede requerir la optimización de la cantidad de células administradas. Por lo tanto, la cantidad de células a administrar variará para el sujeto que esté siendo tratado (p. ej., entre 102 y 1010 células por cada tratamiento en un ciclo o para todo el ciclo de tratamiento). Sin embargo, la determinación precisa de una dosis terapéuticamente eficaz puede basarse en factores individuales de cada paciente, incluidos su tamaño, edad, tamaño del daño tisular y cantidad de tiempo desde que se produjo el daño.

Preferiblemente, las composiciones que comprenden células H2Stem o una progenie H2Stem específica deben contener una población celular sustancialmente homogénea como se definió anteriormente y la cantidad de células dentro de cada dosis se puede ajustar en consecuencia. En particular, cuando la composición comprende células H3Stem o cualquier otra progenie H2Stem que forme conglomerados de células tridimensionales, composiciones de este tipo se pueden preparar de acuerdo no solo con el número total de células (o de conglomerados de células) sino también con su dimensión seleccionando conglomerados de células a administrar que tengan un diámetro dentro de un intervalo determinado (p. ej., entre 50 μm y 200 μm o entre 50 μm y 100 μm) o por debajo/por encima de un tamaño determinado (p. ej., 100 μm, 200 μm, 500 μm o 1000 μm) y/o que comprendan un número dado de células (p. ej., al menos 10000, 20000, 50000, 100000 o más).

La distribución, diferenciación y/o proliferación de células H2Stem o progenie H2Stem se puede determinar después de su administración o implantación (así como su actividad después/antes de la administración de un agente terapéutico diferente) y se puede testar en sujetos humanos o en modelos animales (preferiblemente un roedor). Por ejemplo, el análisis de los hígados de ratones SCID a los que se trasplantaron intraesplenicamente células H2Stem o progenie H2Stem puede demostrar que estas células son capaces de injertarse en el hígado y repoblar el órgano mediante la detección de un marcador humano, y diferenciarse en hepatocitos maduros y activos mediante la detección de albúmina humana, o cualquier otro marcador típico específico del hígado humano (o un gen recombinante que se transfectó previamente en las células H2Stem administradas o progenie H2Stem).

Otro aspecto de la invención es un método para prevenir y/o tratar una enfermedad hepática, que comprende la administración de células H2Stem, progenie H2Stem o una composición que las contiene a un sujeto que lo necesite. Células H2Stem y progenie H2Stem pueden usarse para o en el tratamiento de enfermedades hepáticas, en particular aquellas que requieren el restablecimiento permanente (o limitado en el tiempo) de la función hepática en un sujeto que, de acuerdo con la bibliografía, requiere trasplante de hígado, trasplante de hepatocitos, o regeneración hepática dada la pérdida de masa y/o función hepática que se observa y que se pueden agrupar en diferentes categorías.

Un método para tratar una enfermedad hepática comprende administrar un producto H2Stem, tal como células H2Stem o una progenie H2Stem dada, y preferiblemente dentro de una composición, a un sujeto que lo necesite. En particular, un método para tratar una enfermedad en un paciente que lo necesite comprende la administración de una cantidad efectiva de un producto H2Stem al paciente, siendo la enfermedad preferiblemente una enfermedad hepática tal como un error congénito del metabolismo hepático, un trastorno hereditario de la coagulación de la sangre, colestasis intrahepática familiar progresiva tipo 1/2/3, deficiencia de alfa1 -antitripsina, defecto de los transportadores de células hepáticas, porfiria, hígado graso u otra enfermedad fibrótica del hígado, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, enfermedad degenerativa del hígado o insuficiencia hepática aguda o crónica. Una primera categoría de enfermedades hepáticas está representada por errores congénitos del metabolismo hepático que se pueden distinguir en errores del metabolismo de aminoácidos (tales como la enfermedad de la orina con jarabe de arce, fenilcetonurias, tirosinemia, acidemia propiónica, aciduria orgánica y trastornos del ciclo de la urea, incluida la aciduria argininosuccínica), deficiencia de carbamoil-fosfato sintasa I, citrulinemia, hiperargininemia y deficiencia de ornitina carbamoiltransferasa), del metabolismo de metales (tales como la enfermedad de Wilson o la hemocromatosis) y del metabolismo de los carbohidratos (tales como la enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo I/II, fructosemia o galactosemias), trastornos lisosomales (tales como la enfermedad de Wolman, enfermedad de Niemann Pick), trastornos peroxisomales (tales como la enfermedad de Refsum), hipercolesterolemias familiares y otros trastornos del metabolismo de los lípidos, enfermedades mitocondriales (tales como la deficiencia de piruvato carboxilasa) e hiperbilirrubinemia (tales como el síndrome de Crigler-Najjar, síndrome de Gilbert o síndrome de Dubin-Johnson). Una segunda categoría está representada por los trastornos hereditarios de la coagulación de la sangre, tales como la deficiencia del Factor V, la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor VIII, la deficiencia del Factor IX, la deficiencia del Factor XI, la deficiencia del Factor XIII y otras deficiencias debidas a la cantidad insuficiente de otros factores relacionados con la coagulación (incluyendo otros factores de coagulación y cadenas alfa/beta/gamma de fibrinógeno) u otras proteínas específicamente expresadas y secretadas por el hígado al torrente sanguíneo (tal como la albúmina). Una tercera categoría está representada por otras enfermedades hepáticas no asociadas directamente con deficiencias de la coagulación o el metabolismo e incluye colestasis intrahepática familiar progresiva tipo 1/2/3, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, enfermedad de Caroli, defectos de los transportadores de células hepáticas, porfirias (tales como porfiria aguda intermitente), hígado graso y otras enfermedades fibróticas del hígado (NASH/NAFLD), cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, enfermedades degenerativas del hígado o insuficiencia hepática aguda o crónica (p.ej., insuficiencia hepática crónica).

Como se discutió anteriormente, un producto H2Stem puede administrarse o usarse en combinación con otro producto (tal como un fármaco, agente terapéutico, otro tipo de célula u otro material biológico). Esto se aplica a cualquiera de las administraciones y usos terapéuticos descritos en este documento. En particular, el otro producto terapéutico puede administrarse sustancialmente al mismo tiempo que un producto H2Stem (dentro de la misma composición farmacéutica o en una composición farmacéutica distinta) o en momentos diferentes (en composiciones farmacéuticas distintas y en cualquier orden o frecuencia). Ya sea que el otro producto terapéutico se administre por separado o no de un producto H2Stem, los efectos resultantes pueden ser sinérgicos, es decir, los efectos son superiores a los adicionales que se esperan, los efectos negativos de uno de dichos componentes se mitigan o desaparecen, y/o los efectos positivos de uno de dichos componentes se obtienen administrándolo en menor cantidad o con menor frecuencia.

Cuando el producto H2Stem es una progenie H2Stem, estas células se pueden administrar (ya sea que se hayan co cultivado o no previamente en condiciones in vitro) en combinación con otro tipo de células (p. ej., hepatocitos humanos primarios, células ADHLSC u otro tipo o población de células humanas que es una célula primaria, madre, mesenquimal y/o progenitora como las descritas en el documento WO2006126219 y otras células progenitoras o madre de origen hepático) o sus correspondientes medios de cultivo celular acondicionados, en forma de un sobrenadante de cultivo celular. La combinación de células H2Stem con otro tipo de células puede mejorar la eficacia terapéutica, el injerto, la localización, la repoblación, la proliferación y/o la estabilidad de uno u otro tipo de células dentro del cuerpo humano. La progenie H2Stem se puede administrar como parte de una formulación que también comprende otro tipo de células, o se puede administrar por separado, pero en combinación con ese otro tipo de células, tal como secuencial o simultáneamente (en cualquier orden). Los dos tipos de células pueden administrarse como una suspensión o co-cultivo de células, o dentro de una esponja u otra estructura tridimensional en donde las células pueden crecer, proliferar y diferenciarse in vitro y/o in vivo, incluyendo los dispositivos hepáticos bioartificiales y naturales o matrices sintéticas que sustentan el mantenimiento de estas células en el cuerpo humano. La combinación de células H2Stem con los medios de cultivo celular acondicionados de otro tipo celular puede proporcionar una progenie H2Stem con mayor eficacia terapéutica, injerto, proliferación y/o estabilidad dentro del cuerpo humano, junto con otras propiedades útiles relacionadas con la composición de los medios de cultivo celular acondicionados del otro tipo celular.

Alternativamente, cuando el producto H2Stem es un medio de cultivo celular acondicionado de una progenie H2Stem, esta preparación se puede administrar en combinación con otro tipo de células (p. ej., hepatocitos humanos primarios, células ADHLSC u otro tipo de célula humana o población que sea una célula primaria, mesenquimal y/o células progenitora como las descritas en el documento WO2006126219 y otras células progenitoras o madre de origen hepático) o sus correspondientes medios de cultivo celular acondicionados. La combinación de medios de cultivo celular acondicionados de una progenie H2Stem con otro tipo de célula puede mejorar el injerto, la estabilidad, la localización, la proliferación, la repoblación y/o la estabilidad de este último tipo de célula dentro del cuerpo humano. Nuevamente, el producto H2Stem puede administrarse como parte de una formulación que también comprende otro tipo de células, o puede administrarse por separado, pero en combinación con ese otro tipo de células, tal como secuencial o simultáneamente (en cualquier orden). Todavía alternativamente, la combinación de medios de cultivo celular acondicionados de una progenie H2Stem con los medios de cultivo celular acondicionados de otro tipo celular puede proporcionar una solución con eficacia terapéutica mejorada, combinando potencialmente los efectos de las proteínas secretadas que están contenidas aquí. De nuevo, los medios de cultivo de células madre acondicionados de la progenie H2Stem pueden administrarse como parte de una formulación que también comprende otro medio de cultivo de células condicionado, o pueden administrarse por separado, pero en combinación con ese otro medio, tal como secuencial o simultáneamente (en cualquier orden).

La administración o el uso terapéutico de un producto H2Stem (de manera similar a la administración y el uso terapéutico de células ADHLSC o los medios de cultivo celular acondicionados de células ADHLSC, como se describe en el documento WO2015001124) también pueden proporcionar efectos positivos inesperados. En particular, la administración o el uso terapéutico de una progenie H2Stem o de los medios de cultivo celular acondicionados obtenidos a partir de una progenie H2Stem pueden combinarse con la administración de una proteína requerida específicamente para tratar una enfermedad hereditaria tal como una enzima metabólica (p. ej., ornitina transcarbamilasa o UDP-glucuronosil transferasa 1A1) o un factor de coagulación (p. ej., Factor VIII, Factor IX o Factor XI). Proteínas o factores de coagulación de este tipo pueden usarse junto con proteínas y enzimas proporcionadas por el producto H2Stem (o por células ADHLSC o medios de cultivo celular acondicionados correspondientes) y que están involucradas en la misma ruta metabólica o función fisiológica (p. ej., coagulación de la sangre), posiblemente obteniendo efectos sinérgicos. Cuando un producto H2Stem se administra o se usa en combinación con otro producto, como se mencionó anteriormente, ese otro producto puede ser, por lo tanto, una proteína para tratar una enfermedad hereditaria, tal como una enzima metabólica o un factor de coagulación. Además, las composiciones farmacéuticas pueden generarse crioconservando el producto H2Stem a alta concentración (10 millones/ml, 50 millones/ml, 100 millones/ml o más, en soluciones comerciales apropiadas tales como Cryostor) que se descongelan y administran a los pacientes, reconstituyendo la composición farmacéutica con un diluyente adecuado directamente dentro de los viales de crioconservación (sin necesidad de un entorno clasificado y con menos requisitos logísticos)

Este enfoque puede proporcionar composiciones farmacéuticas que proporcionen efectos terapéuticos más prolongados y/o mejorados que la administración de la proteína recombinante aislada, como se usa comúnmente para tratar una deficiencia de enzima o factor de coagulación. Por lo tanto, una composición farmacéutica puede comprender (a) un producto H2Stem como se describe en el presente documento, tal como progenie H2Stem o medio de cultivo acondicionado del mismo, (b) otro producto como se describe en el presente documento, tal como un fármaco, agente terapéutico, otro tipo de célula u otro material biológico, más particularmente una proteína para tratar una enfermedad hereditaria, tal como una enzima metabólica (p. ej., ornitina transcarbamilasa o UDP-glucuronosil transferasa 1A1) o un factor de coagulación (p. ej., Factor VIII, Factor IX o Factor XI) y (c) un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable. En este ámbito, se pueden seleccionar tipos específicos de productos H2Stem y células ADHLSC (tales como subpoblaciones, líneas celulares y fracciones de las mismas) durante el proceso de fabricación, ya que presentan el nivel de producción más apropiado para una serie de proteínas (como valores absolutos). y/o como relación entre proteínas de este tipo) que están involucradas en una vía metabólica dada o función fisiológica (p. ej., coagulación de la sangre). Por ejemplo, se pueden seleccionar subpoblaciones específicas de células H2Stem o células ADHLSC (y el procedimiento de fabricación relacionado) ya que se proporcionan poblaciones celulares (que se pueden mantener como líneas celulares, preparaciones de células depositadas o almacenar de otro modo) que tienen una expresión equilibrada de múltiples factores de coagulación (p. ej., dos o más de los factores extrínsecos Factor V, Factor VII y Factor X y/o dos o más de los factores intrínsecos Factor VIII, Factor XI, Factor XIII, Factor XII y Factor IX) que sea apropiada para uno de los diferentes tipos de deficiencia de la coagulación de la sangre, tal como la hemofilia (el tipo A está asociado con la deficiencia de factor; el tipo B está asociado con la deficiencia de Factor IX; el tipo C está asociado con la deficiencia de Factor XI; véase Kabel A 2014 para una revisión de los trastornos hemorrágicos y su gestión terapéutica).

El uso de células H2Stem o progenie H2Stem en general (o poblaciones de células específicas, tales como células H3Stem), dentro de composiciones y en métodos de tratamiento, puede proporcionar efectos terapéuticos para enfermedades hepáticas como las enumeradas anteriormente, pero también puede asociarse a estudios in vitro en sustitución de hepatocitos primarios o líneas celulares del hígado. En particular, la progenie H2Stem se puede usar en métodos farmacológicos y toxicológicos (tempranos) para evaluar la eficacia (si el producto H2Stem expresa un posible objetivo farmacológico para una enfermedad hepática específica o no específica), el metabolismo, la estabilidad y/o la toxicidad de los compuestos (p. ej., entidades biológicas o químicas).

Células H2Stem y progenie H2Stem (en particular cuando forman conglomerados de células tridimensionales) pueden usarse en métodos para testar agentes para tratar infecciones hepáticas o para permitir la replicación eficiente de un virus que infecta hígado y hepatocitos en particular. Células H2Stem y progenie H2Stem pueden diferenciarse y/o modificarse genéticamente antes o después de la exposición al virus (p. ej., un virus de la hepatitis). Luego, la población de células infectadas puede exponerse a una cantidad predeterminada de compuesto candidato para tratar la infección para observar cualquier efecto útil (p. ej., en la replicación viral), puede usarse para purificar partículas virales o puede usarse para evaluar cualquier efecto potencial in vivo de la infección viral, como se muestra para otras células progenitoras hepáticas en relación con la infección por hepatitis C, la fibrosis hepática o la carcinogénesis (Wu X et al., 2012; Wang C et al., 2012; Torres DM y Harrison SA, 2012).

La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención de modo alguno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación y Caracterización de Células H2Stem y Progenie de Células H2Stem de Tejidos Hepáticos Primarios

Materiales y Métodos

Medios y Otros Materiales para el Cultivo Celular

Se utilizaron los siguientes materiales: medio E de Williams (Cat. N° 22551022, Invitrogen), DMEM con alta concentración de glucosa (4,5 g/l) y L-glutamina (alto contenido en glucosa DMEM, Cat. N° 41965047, Invitrogen), IMDM (Cat. N° 21980032, Invitrogen), IMDM sin rojo fenol (Cat. N° 21056023, Invitrogen), Medio de cultivo de hepatocitos (HCM; Cat. N° CC-3198, Lonza), Suero bovino fetal (FBS; Cat. N° F7524, Sigma), factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF; Cat. N° AF-100-15, Peprotech), factor de crecimiento de hepatocitos humano recombinante (HGF; Cat. N° 100-39, Peprotech), oncostatina M humana recombinante (OSM; Cat. N° 300-10, Peprotech), insulina humana recombinante (INS; Cat. N° HI0219, Lilly), complemento de insulina-transferrina-selenio-G (ITS; Cat. N° 41400045, Invitrogen), albúmina humana (50 g/L, Cat. N° 1501466 Baxter), heparina sódica (Heparina LEO®) Dexametasona (Dex; Cat. N° D4902, Sigma), penicilina/estreptomicina líquida (P/S; Cat. N° 15070063, Invitrogen), matraces T-75 recubiertos con colágeno I de cola de rata (Biocoat, Cat. N° 356485, BD Biosciences), Corning® CellBIND® 75cm2 Matraz de cultivo celular rectangular con boca inclinada y tapa de ventilación (Cat. N° 3290, Corning).

Preparación de células hepáticas humanas primarias

El procedimiento para la obtención de células hepáticas humanas se basa en publicaciones previas (Najimi M et al., 2007), con modificaciones menores. Después de la extracción, primero se enjuagó el hígado con solución ViaSpan helada (Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals) a través de cánulas conectadas al sistema de la vena porta, y luego se transfirió en condiciones frías y estériles a la sala limpia para el aislamiento de las células hepáticas. Toda contaminación microbiológica ha sido estrictamente controlada antes, durante y después del proceso de aislamiento. El aislamiento de células hepáticas humanas se realizó utilizando una técnica de perfusión de colagenasa de dos pasos bajo un flujo laminar estéril en salas limpias. La primera perfusión consistió en una solución de EBSS precalentada a 37 °C sin calcio y sin magnesio (Cat. N° 14155-063, Life Tech, complementada con ácido etilenglicolbis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N '- tetraacético 0,5 mM (EGTA; Sigma), gentamicina 2 mg/L, penicilina G 100 000 UI/L. Esta primera perfusión permite eliminar el calcio iónico extracelular y debilitar las uniones intercelulares del parénquima. El segundo paso incluyó digestión enzimática con 0,8 mg/mL de colagenasa (Cat. N° 11213857001, Roche Applied Sciences) diluida en solución de EBSS con calcio y magnesio (Cat. N° 24010-043, Life Tech.) complementada con ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinaetanosulfónico 5 mM (HEPES; Cat. N° 11344-041, Life Tech.), 0,03 mg/mL de inhibidor de tripsina (Cat. N° 10109878001, Roche Applied Sciences), 2 mg/L de gentamicina y 100000 UI/L de penicilina G. La composición de estos tampones se puede adaptar a los requisitos reales de las buenas prácticas de fabricación mediante el uso de reactivos de calidad GMP adicionales o alternativos (p. ej., enzimas específicas o N-acetilcisteína).

Cada paso de perfusión duró aproximadamente 10 minutos antes de que el hígado se digiriera por completo y luego se rompiera mecánicamente. La actividad de colagenasa residual se detuvo lavando el parénquima digerido con una solución M199 fría (Lonza) que contenía 27,5 μg/mL de inhibidor de tripsina, albúmina humana al 0,05%, 2,4 mg/L de gentamicina, 100000 UI/L de penicilina G. Se filtró la suspensión de células hepáticas digeridas a través de una malla de acero de poro de 4,75 a 0,25 mm, luego se lavó 3 veces con solución M199 y se centrifugó a baja velocidad (p. ej., 1200 rpm) durante 3 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares y la mayoría de las células no parenquimales. Las células se suspenden en un medio de crioconservación que se prepara añadiendo a 750 ml de solución ViaSpan, 16 mg de dexametasona, 40 UI de insulina HEPES al 0,5%, 1 g/L de glucosa al 15%, albúmina humana al 20%, DMSO al 10% y luego se mantienen en nitrógeno líquido mediante el uso de viales, bolsas u otro sistema adecuado para el almacenamiento y la conservación a largo plazo de células humanas. También en esta fase, la composición de estos tampones se puede adaptar a los requisitos reales para las buenas prácticas de fabricación haciendo uso de reactivos de calidad GMP adicionales o alternativos.

Las preparaciones de células hepáticas resultantes están constituidas predominantemente por hepatocitos de la fracción parenquimal, cada uno de los cuales contiene 106-109 células (dependiendo del volumen de las preparaciones y/o del hígado humano específico). Las suspensiones de células hepáticas crioconservadas se utilizan descongelándolas rápidamente a 37 °C y lavándolas dos veces en 10x volumen de albúmina humana al 5% complementada con 2,5 g/L de glucosa, 0,084 g/L de bicarbonato y 5000 IE/UI/ml de heparina LEO®. Después de la centrifugación a 224 g durante 10 minutos a 4 °C, el sedimento celular se suspende en el medio de cultivo celular requerido.

Preparación de Células ADHLSC

Las células ADHLSC se obtienen aplicando un método como el descrito anteriormente (Najimi M et al., 2007; Khuu DN et al., 2011), con o sin modificaciones menores. Brevemente, preparaciones de células hepáticas se resuspenden en medio E de Williams complementado con FBS al 10%, 25 ng/ml de EGF (el EGF puede no estar presente en el medio de cultivo celular si la preparación se realiza en CellBind), 10 μg/ml de INS, DEX 1 μM y P/S al 1%. Las células se cultivan en matraces recubiertos con colágeno I de cola de rata o matraces Corning® CellBlND® y cultivados a 37 °C en una atmósfera totalmente humidificada que contiene 5% de CO2. A las 24 horas se cambia de medio con el fin de eliminar las células no adherentes y se renueva dos veces por semana, mientras que el cultivo se sigue microscópicamente todos los días. El medio de cultivo se cambia después de 12-16 días a DMEM con alto contenido en glucosa complementado con FBS al 9% y P/S al 0,9% con el fin de acelerar la eliminación de los hepatocitos y estimular la expansión de las células ADHLSC. Aparece y prolifera un tipo de célula con morfología de tipo mesenquimal. Al alcanzar una confluencia del 70-95%, las células se tripsinizan con tripsina recombinante (tryμLE; LifeTech) y EDTA 1 mM y se vuelven a sembrar en placas a una densidad de 1-10 x 103células/cm2.

Preparación de Células H2Stem

Suspensiones de células hepáticas crioconservadas se utilizan para preparar cultivos celulares en matraces T-75 recubiertos con colágeno I de cola de rata a densidades celulares entre 5000 y 20000 células/cm2 y se incuban a 37 °C en una atmósfera totalmente humidificada de 5% de CO2. Alternativamente, las condiciones hipóxicas que se aplicaron en la incubadora (tal como 5% de O2) o que se generaron mediante la adición de agentes antioxidantes en el medio de cultivo celular (tal como N-acetilcisteína a una concentración de 1 mM o menor). El cambio de medio y el análisis de la morfología se realizan dos veces por semana usando, como medio de cultivo, medio E de Williams complementado con FBS al 9%, P/S al 0,9%, Dex 1 μM; 10μg/ml de INS y 12,5-25 ng/ml de EGF durante la fase de aparición. Una vez que las células H2Stem han aparecido como conglomerados de células adherentes que predominan en el cultivo celular, se realiza una expansión adicional en medio E de Williams complementado con FBS al 9%, P/S al 0,9%, Dex 1 μM; 10 μg/ml de INS, 12,5-25 ng/ml de EGF en ausencia o en presencia (12,5-50 ng/ml) de HGF.

Células H2Stem que tienen una morfología meso-epitelial cuboidal surgen como pequeños conglomerados y comienzan a expandirse dentro de los siguientes 7-12 días. Los conglomerados formados por células de este tipo se tripsinizan luego dentro de los próximos 2-3 días (es decir, dentro de los 10-15 días posteriores a la siembra en placas de las células hepáticas primarias) y luego se cultivan a razón de 5000-8000 células/cm2 en el medio basado en E de Williams para varios pasajes en el mismo medio. La tripsinización se puede realizar desde el Pasaje 1 en adelante con una confluencia del 80-90% en placas recubiertas de colágeno.

Diferenciación de Células como células similares a Hepatocitos Adherentes

Las células se cultivan en placas recubiertas de 6 pocillos BD BioCoat Cellware, Colágeno Tipo I (Cat. N° 356400, BD Biosciences) a una densidad de 5000 - 20000 células/cm2 en el mismo medio de expansión. La diferenciación hepática se inicia con una confluencia del 95-100% mediante el cambio de medio a IMDM que contiene 20 ng/ml de HGF, 20 ng/ml de OSM, 1 μM de Dex. ITS al 1%, con (para células ADHLSC) o sin (para células H2Stem) 25 ng/ml de EGF. Este medio de cultivo celular para la diferenciación hepática (medio HepDif) se cambia dos veces por semana durante al menos las siguientes 2 (para células H2Stem) o 4 (para células ADHLSC) semanas.

Caracterización Morfológica de Células en Condiciones de Cultivo Celular

Las imágenes se toman mediante microscopía óptica (contraste de fase; microscopía Olympus UC30) utilizando la cámara Olympus IX50 y el software Cellsens Digital Imaging o utilizando el equipo de imágenes en vivo Cell-IQ (CM technologies), en que un microscopio óptico toma una imagen re-enfocada de la misma posición a intervalos regulares de tiempo. Cell-IQ PC (Phase Contrast) es una plataforma de análisis e imágenes de células vivas continuas totalmente integradas que incorpora la capacidad de imágenes de contraste de fase y de campo claro con un paquete de software de analizador integrado (Machine Vision Technology) para la identificación, el análisis y la cuantificación automáticos de los datos de imagen.

Caracterización de los Genes expresados por Poblaciones Celulares mediante RT-qPCR

El ARN total se extrae de las células con el kit GenElute Mammaliam (Cat. N° RTN70, Sigma) después del tratamiento con ADNasa con el kit DNA-free™ (Cat. N° AM1906, Ambion). La primera cadena de ADNc se sintetiza usando el kit de síntesis de Transcriptor First Strand cDNA (Cat. N° 04379012001, Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y posteriormente se diluye con agua libre de nucleasas (Cat. N° AM9938, Invitrogen) hasta ADNc a 10 ng/gl. Las mezclas de amplificación de RT-PCR (20 gl) contienen 0,2 gg de ADNc molde, 10 gl de mezcla maestra 2xTaqman (Cat. N° 4369514, Applied Biosystem) y 1 gl de ensayo 20x PrimeTime qPCR (IDT).

Las muestras se procesan por duplicado en un Sistema de PCR en tiempo real ViiA™ 7 de Applied Biosystems o cualquier otro ciclador de PCR en tiempo real de Applied Biosystems. Las condiciones de la ciclación son las siguientes: 10 min de activación de polimerasa a 95 °C, 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 45 s. Los pares de secuencias de cebadores específicos de la transcripción de genes se obtuvieron de Applied Biosystems como se resume en la Tabla 1 que figura a continuación.

La cuantificación relativa de la expresión génica se estableció mediante la normalización de la intensidad de la señal frente a las transcripciones de control endógenas GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) o PPIA (ciclofilina A). Después de la normalización, los datos se trazaron y compararon entre poblaciones celulares.

Caracterización de las Células por Citometría de Flujo

Las células se recolectan, se suspenden a una concentración de 500-1000/gl en tampón PBS (Cat. N° SH30028.03, Thermo Fisher) y se incuban durante 30 min a 4 °C con los siguientes anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para los antígenos indicados que se utilizan en la concentración indicada por los fabricantes: CD45-PE Cy7 (Cat. N2557748, BD Biosciences), CD90-FITC (Cat. N2555595, BD Biosciences), CD73-PE (Cat. N2550257, BD Biosciences), CD29-APC (Cat. N° 559883, BD Biosciences), CD44-FITC (Cat. N° 555478, BD Biosciences), CD133-PE (Cat. N° 130080901, Miltenyi Biotec), Albumina-FITC (Cat. N° CLFAG2140, Sanbio), Citoqueratina 19 (CK-19) Anti-Humana monoclonal de ratón (Clon RCK108; M0888, Dako), IgG anti-ratón - DyLight 488 (Cat. N° 715-485-150, Jackson Immunoresearch), CD117-APC (Cat. N° 333233, BD Biosciences), CD31-FITC (Cat. N° 555445, BD Biosciences), CD31-PE (Cat. N° 340297, ^bD Biosciences), CD326 (Cat. N° 347200, BD Biosciences). Los anticuerpos de isotipo de control correspondientes se utilizan para evaluar la unión no específica de anticuerpos monoclonales. A continuación, las células se lavan y suspenden en PBS/BSA para su lectura con el citómetro de flujo FACSCanto II de BD Biosciences.

Caracterización de las Células por Inmunofluorescencia o por Inmunocitoquímica

Las células se fijan con paraformaldehído al 4% (Cat. N° 43368, Alfa Aesar) a temperatura ambiente durante 10-15 minutos y se lavan tres veces con PBS. Cuando sea necesario, la peroxidasa endógena se elimina por medio de 10 minutos de incubación con peróxido de hidrógeno al 3% (Cat. N° 31642, Sigma). A continuación, las células se permeabilizan durante 10-15 minutos utilizando Triton X-100 al 1% (Cat. N° T8787, Sigma) en tampón PBS. La inmunotinción no específica se previene mediante una incubación de 1 hora en tampón PBS que contiene un 5% de suero de burro normal (Cat. N° 017-000-121, Jackson ImmunoResearch) para inmunocitoquímica o mediante una incubación de 1 hora a 37 °C en un tampón PBS que contiene Albúmina de suero bovino (BSA) al 5% (Cat. N°A2153, Sigma) para inmunofluorescencia. La incubación con el anticuerpo primario se realiza durante 1 hora a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 °C). Luego, las muestras se enjuagaron tres veces durante 15 minutos y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 30 minutos (para inmunocitoquímica) o durante 1 hora (o inmunofluorescencia) a temperatura ambiente.

Los siguientes anticuerpos se usaron como anticuerpo primario de acuerdo con las instrucciones del fabricante para inmunocitoquímica o inmunofluorescencia: albúmina de suero anti-humano monoclonal de ratón (Cat. N° A6684, Sigma), vimentina anti-humana monoclonal de ratón (Cat. N° 10515, Progen), alfa actina del músculo liso anti-humana monoclonal de ratón (ASMA, Cat. N° M0851, Dako), citoqueratina 19 (CK-19) anti-humana monoclonal de ratón (clon RCK108; M0888, Dako), anticuerpo TDO2 anti-humano monoclonal de ratón (Cat. N° SAB1406519, Sigma), anticuerpo CK-18 anti-humano monoclonal de ratón (Cat. N° SAB3300015, Sigma), anticuerpo UGT anti-humano monoclonal (Cat. N° ab129729, Abcam), MRP-2 anti-humano monoclonal (Cat. N° ab3373, Abcam), factor nuclear de hepatocito anti-humano 4 (HNF-4; Cat. N° sc-8987, Santa Cruz) y CYP3A4 anti-humano policlonal de ratón (Cat. N° SAB1400064, Sigma).

Los siguientes anticuerpos marcados se usaron como anticuerpo secundario para la inmunofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante: IgG anti-ratón de burro conjugada con Alexa Fluor®488 (Cat. N° 715-545-151, Jackson ImmunoResearch), IgG anti-conejo de burro conjugado con Cy3 (Cat. N° 711-165-152, Jackson ImmunoResearch). Para la inmunocitoquímica, la detección se realiza mediante Envision™ anti-ratón (Dakocytomation, Cat. N° K4001, Dako) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La detección se realiza después de la incubación durante 5 min con polímero marcado con peroxidasa y sustrato cromógeno (DAB, Cat N° D416, Dako), seguido de un lavado tres veces con PBS. Los núcleos se contratiñen con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Vectashield®+DAPI, Cat. N° H-1200, ABCYS) para inmunofluorescencia o con Hematoxilina de Mayer (Cat. N° MHS16, Sigma) para inmunoquímica. Las células se montan para inmunocitoquímica y luego se examinan a 10, 20 y 40 aumentos usando un microscopio invertido Olympus IX50 acoplado a una cámara UC30. Las imágenes digitales se adquieren utilizando el software Cellsens. Los hepatocitos primarios humanos (obtenidos como se indicó anteriormente) se tiñen en paralelo como control positivo para marcadores hepáticos y control negativo para marcadores mesenquimales. Las imágenes se toman mediante microscopía de fluorescencia (Olympus AX70) equipada con una cámara Olympus XC30 y Cellsens Software.

Caracterización de las Células por Actividades Biológicas

Para el ensayo de actividad luminiscente de CYP3A4, se tripsinizan células similares a hepatocitos diferenciadas obtenidas de células ADHLSC o células H2Stem, se transfieren a microplacas de 96 pocillos (Cat. N° 734-1662, Costar) a una concentración de 100000 células/pocillo, y la actividad se mide usando el Ensayo de CYP3A4 P450-Glo™ con Luciferina-IPA (Cat. N° V9002, Promega). La luminiscencia se mide utilizando el luminómetro Victor IV (Perkin-Elmer Life Sciences). Las células no tratadas se miden en paralelo para restar el ruido de fondo. Los resultados se normalizan al patrón de microsomas CYP3A4 proporcionado por el sistema enzimático humano CYP3A4 (Cat. N° V4820, Promega) y se calculan como picomoles/célula.

Para el ensayo de secreción de urea, las células se tripsinizan y se incuban en IMDM sin rojo fenol (Cat. N° 21056023, Invitrogen), en microplacas de 48 pocillos recubiertas de colágeno (Cat, N° 356505, BD Biosciences). Como sustrato para potenciar la secreción de urea, ornitina 1 mM (Cat. N° O2375, Sigma) y NH4Cl 5 mM (Cat. N° A0171, Sigma) se añaden al medio de cultivo. Después de 2-24 horas, se mide la secreción de urea usando el kit de ensayo colorimétrico de urea Quanticchrome (Cat. N° DIUR-500, BioAssay Systems). La intensidad del color (proporcional a la concentración de urea en la muestra) se lee a 520 nm después de 5-20 min de incubación y es directamente proporcional a la concentración de urea en la muestra. La urea total (mg/dl) en el sobrenadante del cultivo se calcula utilizando la curva estándar de urea preparada en IMDM sin rojo fenol, como recomiendan las instrucciones del fabricante, antes de establecer la cantidad de urea secretada en μg/célula/2-24h. Para evaluar cualquier interferencia en la detección de la señal real, la evaluación de la secreción de urea se lleva a cabo en medios que incluyen ornitina/cloruro de amoníaco y controles celulares, incubados sin ornitina/cloruro de amoníaco. Estas muestras sirven como control negativo para determinar la especificidad y evitar la falsa positividad.

Para el ensayo de conjugación de bilirrubina, las células se incuban con bilirrubina no conjugada 20-50 μM (Cat. N° B4126, Sigma). La conjugación de la bilirrubina y la bilirrubina total se mide después de 2-24 horas utilizando el ensayo colorimétrico de bilirrubina directa (Cat. N° DZ151A-K, Diazyme) y el ensayo de bilirrubina total (Cat. N° DZ150A-K, Diazyme). En este ensayo, la bilirrubina (no) conjugada se mezcla con el reactivo listo para usar de Diazyme, que contiene el detergente y el vanadato o solo el vanadato (pH 3), después de lo cual la bilirrubina total o directa en la muestra se oxida a biliverdina, respectivamente. La última oxidación da como resultado una disminución de la absorbancia específica de la bilirrubina. La concentración de bilirrubina total/directa en la muestra se puede determinar midiendo la absorbancia antes y después de la oxidación con vanadato. A continuación, se calcula la concentración de bilirrubina directa/total (mg/dl//célula/2-24 h) en el sobrenadante del cultivo frente a la curva estándar del calibrador de bilirrubina preparada en IMDM sin rojo fenol, según lo recomendado por las instrucciones del fabricante. Para evaluar cualquier interferencia, la evaluación de la conjugación de bilirrubina se lleva a cabo en medios que incluyen bilirrubina 20-50 μM y controles celulares, incubados sin bilirrubina. Estas muestras sirven como control negativo para determinar la especificidad y evitar la falsa positividad.

Resultados

Células ADHLSC y células H2Stem son poblaciones celulares que pueden derivarse de preparaciones de células hepáticas primarias humanas crioconservadas que se producen utilizando hígados humanos adultos normales. Sin embargo, el protocolo para su aparición a partir de la preparación de células hepáticas humanas primarias y el posterior procedimiento de expansión en cultivo celular difieren, en particular, cuando se utiliza colágeno (u otro sustrato adecuado) para la adhesión y el crecimiento en condiciones de cultivo celular (Véase Materiales y Métodos para más detalles). Dentro de los 7-12 días posteriores a la siembra en placas aparecen espontáneamente conglomerados de células con una morfología meso-epitelial cuboidal, presentando un citoplasma grande y transparente sin protuberancias, desarrollando uniones intercelulares y mostrando inhibición del contacto de crecimiento. Las células H2Stem que tienen una morfología meso-epitelial cuboidal proliferan en conglomerados o colonias y, aproximadamente 2-3 días después de la aparición, se pueden tratar con tripsina y pasar a una densidad de 5000 20000 células/cm2. Estas características distinguen a las células H2Stem de las células ADHLSC alargadas, más grandes y de aparición tardía descritas en Najimi M et al. 2007 (Fig. 2A).

En comparación con las células ADHLSC que se cultivan en CellBind o soportes recubiertos de colágeno (p. ej., placas, matraces), las células H2Stem crecen con una tasa de proliferación más rápida y se pueden identificar preferentemente a partir del cultivo celular y expandirse. El tiempo de duplicación de la población (PDT, por sus siglas en inglés) para las células ADHLSC es de aproximadamente 72-96 horas, mientras que las células H2Stem muestran un PDT de 48-72 horas y se expanden rápidamente al menos durante 4 a 5 pases.

Las células H2Stem son positivas, de acuerdo con otras células progenitoras del hígado humano tales como las células ADHLSC, para una serie de marcadores mesenquimales en la superficie celular (incluyendo CD90, CD73, CD29, CD44) o intracelulares (tales como vimentina, ASMA), así como para marcadores hepáticos (incluyendo HNF-3B, albúmina y citoqueratina 18), como se evalúa mediante citometría de flujo (en donde la positividad para un marcador se define cuando al menos el 60% de las células presentan la característica dada), inmunocitoquímica y/o análisis de RT-PCR. Tanto las células ADHLSC como las células H2Stem se expresan a un nivel muy bajo (es decir, menos del 15% de las células testadas y, en su mayoría, menos del 10%, presenta una tinción específica) marcadores de la superficie celular para otros linajes celulares (hematopoyéticos, epiteliales y/o endoteliales) tales como CD45, CD117, CD31, CD133 y CD326.

Sin embargo, las células H2Stem también se pueden distinguir de las células ADHLSC comparando la presencia de marcadores intracelulares. Por ejemplo, un componente del citoesqueleto tal como citoqueratina 19 (CK-19; un marcador epitelial de colangiocitos) es casi indetectable en células ADHLSC y hepatocitos (Najimi M et al., 2007). En células H2Stem (incluso en el paso inicial al aparecer en cultivo celular), la CK-19 se encuentra expresada en un porcentaje de células H2Stem comprendido entre 20% y 40% cuando se evalúa por citometría de flujo, diferencia que no se puede definir como una negatividad y que se reproduce consistentemente a través de las preparaciones de células H2Stem. De hecho, cuando la expresión de CK-19 se evalúa mediante inmunocitoquímica (una técnica generalmente más sensible para detectar proteínas intracelulares que la citometría de flujo), es evidente que CK-19 es expresada por una gran mayoría de células H2Stem incluso en etapas tempranas (Fig. 2B), proporcionando así un marcador adicional que se puede utilizar para distinguir y hacer un seguimiento de las poblaciones de células H2Stem y progenie H2Stem durante todo el proceso para producirlas en cultivo celular.

La detección de CK-19 puede estar asociada a la detección de otras proteínas intracelulares tales como factores de transcripción y, en particular, de aquellas asociadas a funciones hepáticas, de forma directa (por RT-PCR o métodos basados en anticuerpos) o indirectamente (en base a la expresión coordinada de genes específicos del hígado). De esta manera, las células H2Stem se han caracterizado por expresar con más fuerza factores de transcripción tales como HNF-3b y HNF-4, en comparación con las células ADHLSC. A nivel intracelular, estos factores de transcripción se encuentran entre los más importantes para lograr la maduración morfológica, fenotípica y funcional de los hepatocitos, por ejemplo activando la expresión tanto de proteínas del suero hepáticas (tales como albúmina y alfa-1 -antitripsina) como de enzimas para funciones (no)metabólicas (Snykers S et al., 2009), que pueden detectarse en extractos celulares o directamente en sobrenadantes de cultivos celulares para evaluar la presencia de células H2Stem.

También se puede seguir la aparición de células H2Stem durante el paso inicial del proceso de obtención de células H2Stem, identificando qué células hepáticas humanas primarias pueden originar conglomerados de células H2Stem adherentes y proliferantes que tienen una morfología distintiva y que pueden ser analizadas por inmunofluorescencia o inmunohistoquímica (Fig. 3).

Se pueden establecer características adicionales que distinguen las células ADHLSC y las células H2Stem durante o después de la diferenciación in vitro de estas poblaciones celulares, en particular hacia células similares a hepatocitos adherentes. Al comparar el proceso de diferenciación de células H2Stem con el de las células ADHLSC, estas últimas células requieren más tiempo (un mes frente a 1 a 2 semanas para células H2Stem), así como EGF dentro del medio de cultivo celular. Además, la morfología de las células similares a hepatocitos que se generan utilizando los dos tipos de células difieren, en donde las células obtenidas de células H2Stem (la progenie H2Stem también denominada células H2Screen; véase la Fig. 1) presentan características más similares a las de hepatocitos primarios metabólicamente activos. Las células H2Screen adoptan una morfología similar a la de un hepatocito cuboidal con células mononucleadas y binucleadas que tienen una granularidad intracelular, lo que apunta a un aumento de las actividades enzimáticas (Fig. 4A).

Las actividades metabólicas específicas del hígado de las células H2Stem se pueden comparar con las de otras células progenitoras hepáticas adultas (como las células ADHLSC) al medir la degradación de los compuestos que se acumulan en el hígado y que, si los hepatocitos los metabolizan de manera ineficiente, pueden ser hepatotóxicos y asociarse a enfermedades hepáticas. Este análisis es de interés no solo para evaluar el uso de células para aplicaciones clínicas, sino también para el descubrimiento y desarrollo de fármacos en la industria farmacéutica, ya que la hepatotoxicidad inducida por fármacos es una de las razones más importantes para el abandono de fármacos candidatos durante las últimas fases del desarrollo de fármacos. El efecto de la exposición a diferentes inductores de CYP450 sobre las respuestas de expresión génica y las actividades enzimáticas específicas de CYP450 se miden a menudo en diferentes modelos basados en células de origen hepático para distinguir entre compuestos potencialmente hepatotóxicos y no hepatotóxicos antes de administrar compuestos de este tipo in vivo, pero ninguno de los modelos en estudio cumplen todos los criterios para la detección temprana, fiable y precisa de compuestos hepatotóxicos (Gerets HH et al., 2012).

En particular, CYP3A4 hepático contribuye al metabolismo de casi el 50% de los fármacos utilizados actualmente, así como de los corticosteroides endógenos y exógenos. La enzima CYP3A4 se expresa fuertemente en hepatocitos dentro del hígado adulto y la adquisición de la funcionalidad CYP3A4 se considera un criterio importante de diferenciación y maduración hepatogénica. La inmunocitoquímica y la RT-PCR ya muestran que la expresión de CYP3A4 es mucho mayor en las células H2Stem que en las células ADHLSC (es decir, antes de cualquier diferenciación específica del hígado), un hallazgo que también se confirmó a nivel de actividad. Las células H2Stem muestran una actividad específica en el intervalo de 10-8 μMol/célula/4h (ya muy por encima del límite de detección a 10-9 μMol/célula), pero aumentando en el intervalo de 10-7 μMol/célula/4 h después de la diferenciación in vitro en células H2Screen, en donde las células ADHLSC presentan una actividad superior a 10-8 μMol/célula/4h solo después de la diferenciación (Fig. 4B).

Esta comparación de las actividades metabólicas específicas del hígado entre las células H2Stem y las células ADHLSC, con o sin diferenciación adicional específica del hígado in vitro, se puede realizar usando otros indicadores de la actividad metabólica que se pueden evaluar usando kits comerciales o aplicando las técnicas que se describen en la bibliografía (como para la actividad enzimática y/o la expresión de ARNm específica de CYP1A2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2E1 o CYP2D6). En particular, se observó una fuerte regulación positiva en la expresión de CYP1A2, CYP2C9 y CYP2E1 para las células H2Stem. Estos hallazgos se confirmaron cuando las células H2Screen se comparan con las células ADHLSC diferenciadas, y también se extendieron a la expresión de genes para otras actividades enzimáticas específicas del hígado (tales como la ornitina transcarbamilasa, CYP2D6 o CYP2C19).

En el caso de la secreción de urea (otra importante actividad metabólica específica del hígado), las células H2Screen parecen capaces de sintetizar urea en presencia de sustratos (cloruro de amoníaco y ornitina) con propiedades metabólicas sustancialmente más altas en comparación con las células ADHLSC diferenciadas. Las células H2Screen presentan una mejora de esta actividad correspondiente a más de 1 log y demuestran la presencia de una funcionalidad hepática muy específica e integrada dentro de estas células (Fig. 4C).

La inmunohistoquímica también confirma que, en comparación con las células H2Stem, se mantiene una fuerte expresión intracelular de CK-19, CK-18 y de algunos marcadores hepáticos (tales como albúmina, TDO2 y UDP-glucuronosil transferasa), si no se aumenta aún más en células H2Screen, que también presentan la expresión de una importante proteína transportadora de salida tal como la proteína MRP-2 en la interfaz de célula a célula, una característica de gran importancia para evaluar la toxicidad inducida por fármacos relacionada con el polimorfismo del transportador (Fig. 4D).

Se obtuvieron evidencias cualitativamente similares al comparar la capacidad de Células ADHLSC diferenciadas y células H2Screen para conjugar bilirrubina, otra actividad biológica específica del hígado debido a la expresión del gen UGT1A1. Las células H2Screen muestran una actividad mucho mayor, posiblemente debido a una mayor expresión y/o una mayor localización nuclear de factores de transcripción tales como HNF-3b y HNF-4. La actividad de bilirrubina relacionada con UGT1A1 en células ADHLSC diferenciadas se mide en 0,05 mg/dl-0,3 mg/dl (0,5 mg/dl por excepción), lo que corresponde a 5-35% (50% por excepción) de conjugación después de 24 horas de exposición. La actividad de bilirrubina relacionada con UGT1A1 en células H2Screen se mide en 0,2 mg/dl-0,6 mg/dl después de 24 horas de exposición o como conjugación del 23-70%. Además, cuando la expresión de UGT1A1 se compara con los hepatocitos humanos mediante RT-PCR, alcanza el 10 % del nivel observado en los hepatocitos primarios, un nivel particularmente alto si se compara con las células que se obtienen al diferenciar in vitro otros tipos de células derivadas de progenitores hepáticos.

Por lo tanto, las células H2Stem aparecen como nuevas células progenitoras del hígado adulto que, en comparación con otras células del mismo tipo (en particular, aquellas producidas por un método más largo y complejo como las células ADHLSC), presentan algunas ventajas importantes e inesperadas para diferentes características (p. ej., proliferación, expresión de marcadores específicos del tipo celular o actividades enzimáticas específicas del hígado) que las hacen de interés tanto para aplicaciones clínicas como para estudios fármaco-toxicológicos.

Ejemplo 2: Generación de Distintos Tipos de Progenie H2Stem como Conglomerados de Células Tridimensionales

Materiales y Métodos

Generación de Células H3Stem a partir de Células H2Stem

Células H3Stem se generan en frascos de cultivo de células de fijación ultrabaja suspendiendo aproximadamente 1 10 x 106 células H2Stem en 15 ml de medio antes de sembrarlas en matraces de cultivo celular de fijación ultrabaja (75 cm2; cat. N23814; Corning).

Células H3Stem se generan en microplacas de 96 pocillos de fijación ultrabaja mediante la suspensión de 5000 - 20 000 células H2Stem en 0,1-0,2 ml de medio y se siembran por pocillo en microplacas de cultivo de 96 pocillos de fijación ultrabaja, en forma de U/redondas (Cat. N° 7007; Corning). Alternativamente, se suspenden 75000-100 000 células H2Stem en 2,0-3,0 ml de medio y se siembran en placas por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos de fijación ultrabaja (cat. N° 3471; Corning).

El medio de cultivo es preferentemente medio E de Williams complementado con FBS al 9%, P/S al 0,9%, Dex 1 μM; 10 μg/ml de INS y 12-25 ng/ml de EGF en ausencia o presencia (12,5 - 50 ng/ml) de HGF. Los medios de cultivo celular comerciales alternativos que se pueden usar en lugar del medio E de Williams son IMDM o DMEM que se complementan como se indicó anteriormente para el medio E de Williams. Medio de cultivo celular fresco se agrega o sustituye dos veces por semana para los formatos de matraz y placa/microplaca multipocillos, respectivamente. La formación de progenie H2Stem tridimensional se sigue mediante microscopía de contraste de fase. Las células individuales comienzan a formar estos conglomerados después de 24 horas y se recolectan para medir la actividad de CYP3A4, realizar inmunohistoquímica o para generar células H3Screen-2 dentro de los siguientes 10-25 días, cuando alcanzan una dimensión superior a 200 μm (se pueden obtener conglomerados de células H3Stem que tienen un diámetro de hasta 600 μm).

Generación de Células H3Screen-1 a partir de Células H2Screen

Células H2Screen, que se obtienen como se describe en el Ejemplo 1, se tripsinizan para obtener progenie H2Stem tridimensional manteniendo esta suspensión celular en el mismo medio que se usó para diferenciar las células H2Stem en células H2Screen y en un sistema de cultivo celular apropiado. Cuando se utilizó un sistema de cultivo de "Gota Colgante", tal como una placa GravityPlus de 96 pocillos (Insphero), se cambia la mitad del medio 2-3 veces por semana mediante aspiración de 20 μl y adición de 20 μl de medio fresco en cada uno de los pocillos de la placa. Alternativamente, 1 - 10x106 células H2Screen se sembraron en placas en matraces de cultivo celular de fijación ultrabaja, añadiendo 5 ml de medio de cultivo celular fresco con la misma frecuencia. Por otra parte, se usaron microplacas de cultivo de 96 pocillos en forma de U/redondas de fijación ultrabaja como se describe anteriormente para generar células H3Stem.

La formación de células H3Screen-1 en estos sistemas de cultivo celular se sigue, obtiene y evalúa de manera similar a las células H3Stem.

Generación de Células H3Screen-2 a partir de Células H3Stem

Células H3Stem, obtenidas tras la expansión como se describe anteriormente, se centrifugan durante 5 minutos a 224 g con el fin de eliminar el medio de expansión. A continuación, se inicia la diferenciación en los mismos matraces de cultivo celular de fijación ultrabaja utilizando medio de cultivo celular HepDif (véase el Ejemplo 1), añadiendo 5 ml de medio de cultivo celular fresco dos veces por semana. Por otra parte, se usaron microplacas de cultivo de 96 pocillos en forma de U/redondas de fijación ultrabaja como se describió anteriormente usando el mismo medio de cultivo celular para la diferenciación. La diferenciación hepática y la actividad de CYP3A4 se evalúan en los conglomerados de células tridimensionales dentro de los siguientes 10 -20 días.

Generación de Células H3Screen-2a y Células H3Screen-2b a partir de Células H3Screen-2

Células H3Screen-2a corresponden a las células H3Screen-2 que se mantienen en suspensión usando frascos de cultivo celular de fijación ultrabaja, microplacas de cultivo de 96 pocillos en forma de U/redondas, o un sistema de cultivo de "Gota Colgante " y en medio HepDif (véase el Ejemplo 1).

Las células H3Screen-2b corresponden a las células H3Screen-2 que se transfieren en diferentes formatos multipocillos de BD BioCoat Cellware, placas recubiertas de colágeno tipo I (con 6 , 24 o 48 pocillos). En esta condición, se observan hepatocitos poligonales y granulares dentro de los 3-4 días desde la siembra en placas en medio HepDif (véase el Ejemplo 1).

Generación de Células H3Screen-2 a partir de Células H2Stem

Células H3Screen se pueden generar directamente a partir de Células H2Stem sin un paso de expansión intermedio como células H3Stem. En este caso, se suspenden 5000-20 000 células H2Stem en 0,1-0,2 ml de medio HepDif (véase el Ejemplo 1) y se siembran en placas de cultivo de 96 pocillos de fijación ultrabaja. Como alternativa, se suspenden 75000-100000 células H2Stem en 2,0-3,0 ml de medio y se siembran en placas por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos de fijación ultrabaja. Se realizan pases adicionales de cultivo celular como para generar células H3Stem a partir de células H2Stem, mantener las células en el medio HepDif y observar conglomerados de células H3Screen-2 de tamaño similar y en un período de tiempo equiparable al que se muestra para los conglomerados de células H3Stem.

Generación de Células H3Screen-2c a partir de Células H3Stem

Las células H3Screen-2c corresponden a células H3Stem que se transfieren en diferentes formatos multipocillos de BD BioCoat Cellware, placas recubiertas con colágeno tipo I (con 6, 24 o 48 pocillos) y se cultivan en medio HepDif (véase el Ejemplo 1).

Inmunocitoquímica (IHC), Inmunofluorescencia (IF) y Caracterización Morfológica de la Progenie H2Stem tridimensional

El tamaño de los conglomerados de células tridimensionales y las imágenes se toman mediante microscopía óptica (contraste de fase; microscopía Olympus UC30) utilizando la cámara Olympus IX50 y el programa Cellsens.

Los diferentes tipos de progenie H2Stem tridimensional se recolectan y luego se fijan durante la noche en paraformaldehído al 4% (Cat. N° 43368, Alfa Aesar) a 4 °C, posteriormente se incluyen en agarosa al 2 % (Cat. N° 16500, Invitrogen) a 65 °C y luego en parafina. Las secciones de cinco μm de ancho se desparafinan y se rehidratan en series graduadas de alcohol.

Antes de realizar la inmunohistoquímica, las secciones se incuban en una solución monohidratada de ácido cítrico (pH 6,0) a 97 °C durante 90 minutos. La actividad de la peroxidasa endógena se bloquea incubando los cortes en una solución de metanol con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos. La inmunotinción no específica se previene incubando secciones a temperatura ambiente en tampón PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% (BSA, Cat. N° A2153-50G, Sigma) durante 1 hora.

A continuación, las secciones se incuban durante la noche a 4 °C con uno de los siguientes anticuerpos primarios diluidos en BSA al 0,1% y de acuerdo con las instrucciones del fabricante: albúmina de suero anti-humano monoclonal de ratón (Cat. N° A6684, Sigma; para IHC), CYP3A4 anti-humana monoclonal de ratón (Cat. N° SAB1400064, Sigma; para IHC), ornitina carbamoiltransferasa anti-humana policlonal de conejo (Cat. N° HPA000570, Sigma; para IHC), UDP-glucuronosiltransferasa 1A1 anti-humana policlonal de conejo (Cat. N° sc-27415, Santa Cruz; para IHC), MRP-2 (Cat. N° ab3373, Abcam; para IHC), Citoqueratina 19 (CK-19) Anti-Humana monoclonal de ratón (Clon RCK108; M0888, Dako; para IHC), anti-CK19 monoclonal (Cat. N° SAB3300018, SIGMA, para IF), anti-CK-18 monoclonal (Cat. N° SAB3300015, SIG^mA; para IF), vimentina anti-humana monoclonal de ratón (Cat. N° 10515, Progen; para IHC), anti-vimentina monoclonal (Cat. N° V6630, SIGMA; para IF), factor nuclear de hepatocito anti-humano 4 (HNF-4) (Cat. N° sc-8987, Santa Cruz; para IHC), anti-HNF4 monoclonal (Cat. N° SAB4501409, SIGMA; para IF), anti-HNF3B monoclonal (Cat. N° SAB2500409, SIGMA; para IF). Los siguientes anticuerpos marcados se usaron como anticuerpo secundario para inmunofluorescencia (IF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante: IgG anti-ratón de burro conjugado con Alexa Fluor® 488 (Cat. N° 715-545-151, Jackson ImmunoResearch), IgG anti-conejo de burro conjugado con Cy3 (Cat. N° 711-165-152, Jackson ImmunoResearch). IgG anti-conejo de burro conjugado con Cy3 (Cat. N° 711 165-152, Jackson ImmunoResearch). Para la inmunohistoquímica, la tinción basada en peroxidasa de rábano picante (HRP) se usa para detectar anticuerpos primarios usando Envision IgG-HRP anti-ratón (Cat. N° K4001, Dakocytomation), anti-conejo (Cat. N°. K4003, Dakocytomation) o anti-cabra (Cat. No. sc-2020, Santa Cruz) y SIGMAFAST™ tabletas de 3,3'-diaminobencidina (Cat. N° D4168, Sigma) como sustrato cromogénico. Los núcleos se contratiñen con 4,6-diamidino-2-fenilindol (Vectashield®+DAPI, Cat. N° H-1200, ABCYS) para inmunofluorescencia o con hematoxilina de Mayer (Cat. N° MHS16, Sigma) para inmunohistoquímica. El análisis se realiza utilizando un microscopio invertido Olympus IX50 acoplado a una cámara UC30. Las imágenes digitales se adquieren utilizando el software Cellsens.

Caracterización de la Progenie H2Stem tridimensional mediante análisis de transferencia Western

Células (a una concentración de 5x106 células por ml) se lisan en un tampón que contiene HEPES 10 mM pH 7,4, KCl 80 mM, EDTA 2 mM, beta-mercaptoetanol 15 mM, Triton X-100 al 0,1% y PIC al 1% (cóctel inhibidor de proteasas). Los extractos de proteína se incuban con agitación a 4 °C durante 30 minutos y luego se homogeneizan usando un aparato Potter Dounce (10 A.R.) en hielo. A continuación, los lisados celulares se centrifugan a 4000 g durante 10 minutos para sedimentar los restos celulares. A continuación se determina la concentración de proteína en el sobrenadante resultante siguiendo el método clásico de Bradford, usando un kit comercial (Bio-Rad). Los extractos de proteínas se separan mediante electroforesis usando SDS-PAGE y luego se electrotransfieren en una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Reino Unido). A continuación, la membrana se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas en tampón TBS-t (Tris Solución salina Tamponada-tween: Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween® 20 al 0,1%) que contiene leche desnatada (5% (p/v); Merck). A continuación, la membrana se incuba a 4 °C con agitación durante la noche en el mismo TBS-t/leche al 5% pero que contiene el anticuerpo primario de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de tres lavados durante 15 minutos con tampón TBS-t, la membrana se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas con el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa en el tampón TBS-t/leche al 5%. Después de lavar tres veces durante 15 minutos con tampón TBS-t, la señal de la proteína se revela por quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).

Los siguientes anticuerpos se utilizan como anticuerpo primario de acuerdo con las instrucciones del fabricante: CYP3A4 anti-humano policlonal de conejo (Cat N° AB1254, Chemicon), anti-UGT1A1 policlonal anti-conejo (Cat. N° 4371, Cell Signaling Technology) y anti-SULT 1 (Cat. N° sc-32928, Santa Cruz).

Caracterización de los Genes expresados por Progenie H2Stem Tridimensional utilizando PT-qPCP

La progenie H2Stem tridimensional de un pocillo de una placa de 6 pocillos (o de 1 a 10 pocillos de una microplaca de 96 pocillos) se recoge en un tubo de 1,5 ml y se enjuaga con 1 ml de PBS, a la espera de que los conglomerados de células caigan en el fondo del tubo por gravedad, antes de retirar el PBS. Los conglomerados de células se lisan utilizando 350 μl de tampón RLT Plus, agitando el tubo durante 30 segundos y rompiendo los esferoides mediante acción mecánica utilizando un sistema motorizado para girar pistones (Cat. W14044, Fisher Scientific) con pistones libres de ARNasa (Cat. W5290W, Fisher Scientific).

El ARN total se extrae de las células usando el Mini Kit RNeasy® Plus (Cat. N° 74134 QIAGEN), después del tratamiento con ADNasa con el kit ADN free™ (Cat. N° AM1906, Ambion).La primera cadena de ADNc se sintetiza utilizando el kit de síntesis de Transcriptor First Strand cDNA (Cat. N° 04379012001, Roche), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y posteriormente se diluye con agua libre de nucleasas (Cat..N° AM9938, Invitrogen) a ADNc a 10 ng/μl. Las mezclas de amplificación de RT-PCR (20 μl) contienen 0,2 μg de ADNc molde, 10 μl de mezcla maestra 2xTaqman (Cat. N° 4369514, Applied Biosystem) y 1 μl de ensayo 20x PrimeTime qPCR (IDT). Las muestras se procesan por duplicado en un Sistema de PCR en tiempo real ViiA™ 7 de Applied Biosystems o cualquier otro ciclador de PCR en tiempo real de Applied Biosystems. Las condiciones de ciclación son las siguientes: 10 min de activación de polimerasa a 95 °C, 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 45 s. Los pares de secuencias de cebadores específicos de la transcripción de genes se obtuvieron de Applied Biosystems como se describe en el Ejemplo 1.

Caracterización de la Progenie H2Stem Tridimensional por Actividades Biológicas

La actividad CYP3A4 de la progenie H2Stem tridimensional se puede medir utilizando un ensayo de luminiscencia con un procedimiento similar al realizado para las células adherentes (véase el Ejemplo 1). Hasta cinco conglomerados de células tridimensionales, cada uno con aprox. 20000 células, se lavan con tampón PBS para eliminar el medio residual y luego se transfieren a placas de 48 pocillos de colágeno BD BioCoat™ Cat. N° 356505, BD Biosciences). Después de una incubación de 4 horas con 200 μl de IMDM (Cat. N° 21980032, Invitrogen) que contenía 0,2 μL de luciferina-IPA (Cat. N° V9002, Promega). La suspensión de células (100 μl de medio) se transfiere a placas de 96 pocillos (Cat. N° 734-1662, Costar) y se analiza como se describe en el Ejemplo 1. El medio de cultivo celular que no se incuba con los conglomerados de células tridimensionales se utiliza como control del ruido de fondo.

Se realizaron ensayos de secreción de urea y conjugación de bilirrubina para testar la actividad metabólica específica del hígado usando conglomerados de células tridimensionales, conteniendo cada uno aprox. 100 000 células (equivalentes a 5 esferas de células H3Stem o células H3Screen-2a), que se incuban con reactivos adecuados como se describe anteriormente en el Ejemplo 1.

La actividad de SULT se testó en combinación con UGT1A (es decir, incluyendo UGT1A1 y otras isoformas de UGT1 A) usando paracetamol como sustrato para la reacción. Los productos de glucuronidación y conjugación de sulfato de paracetamol se cuantifican por HPLC como se describe (Lau G y Crichley J, 1994). Brevemente, las células se incuban durante 24 horas con paracetamol 5 mM (Cat. N°. A7302, Sigma). Después de la incubación, los sobrenadantes de los medios se centrifugan, filtran y analizan mediante UV-HLPC a 254 nm. Se añade 2-acetaminofenol como patrón interno. Los patrones específicos para la cuantificación son sulfato de paracetamol (Cat. N° UC448 , Sigma) y P-acetamidofenil-p-D-glucurónido (Cat. N° A4438, Sigma). La columna Nova-Pak C18 Radial-Pak, 60 Å, 4 μm, 8,0 mm x 100 mm (Waters) se aplica como fase estacionaria. La fase móvil consiste en KH2PO40,1 M, ácido acético al 0,1% y propan-2-ol al 0,75% a pH 3,8 (débito de 1,5 ml/min). Los resultados se expresan como la producción de pmol de sulfometabolitos de glucosa por minuto y por mg de proteína. La concentración de proteínas se evalúa de acuerdo con el método clásico de Bradford, utilizando el kit Bio-Rad.

Las actividades enzimáticas dependientes de CYP se determinaron mediante LC/MS/MS después de incubar las células con un cóctel de sustrato (fenacetina 10 mM, bupropión 100 mM, diclofenaco 10 mM y midazolam 3 mM). Para evaluar la funcionalidad del transportador, las células se incubaron a 37 °C (o a 4 °C para algunos experimentos) en 500 μL de HBSS que contenía [14C] sustrato marcador transportador a 10 μM (0,5 μCi/mL). Se utilizaron los siguientes sustratos: taurocolato (TC), estrona-3-sulfato (E3S) y 1 -metil-4-fenilpiridinio (MPP). Al final de la incubación, se eliminaron los sobrenadantes y las monocapas se lavaron 3 veces con PBS enfriado con hielo. Luego, se añadieron 300 μL de NaOH 0,1 N a cada uno de los pocillos para lisar las células. Se tomó una parte alícuota (100 μL) y se mezcló con 2 mL de centelleante Ultima Gold para evaluar la concentración del sustrato marcador dentro de las células con un contador Tri Carb. La inducibilidad de la actividad dependiente de CYP de fase I se evidenció después del tratamiento conjunto con rifampicina (10 μM) (CYP3A4, CYP2C9, CYP2B6) y beta-naftoflavona (25 μM) (CYP1A2) durante tres días.

La actividad enzimática de la carboxilesterasa-1 (CES-1) se midió utilizando un kit ELISA (Cat. N°. ab109717, Abcam) utilizando la proteína extraída de cultivos celulares de H2Stem, H3Stem, ADHLSC, con hepatocitos humanos primarios y HepG2 como controles positivos. El protocolo se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La alfa-1-antitripsina secretada se cuantificó en medios de cultivo acondicionados de células H2Stem y células ADHLSC usando un kit ELISA (Cat. N° ab108799, Abcam), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

Como una característica adicional que distingue a las células H2Stem y las células H2Screen de las células ADHLSC no diferenciadas y diferenciadas (u otras células progenitoras del hígado humano), estas nuevas poblaciones de células que se describen en el Ejemplo 1 proporcionan suspensiones de distintos tipos de conglomerados de células tridimensionales (es decir, progenie H2Stem tridimensional) que comprenden células progenitoras del hígado o células similares a hepatocitos, dependiendo de las condiciones de cultivo celular.

Cuando las células H2Stem o las células H2Screen se mantienen en sistemas de cultivo de gota colgante o en placas de baja adherencia, se forman rápidamente conglomerados de células tridimensionales con un diámetro de 50 a 100 μm en los primeros 2-4 días, alcanzando un tamaño de más de 300 μm e incluso hasta 600 μm después de 15-25 días (Fig. 5 y 6). Estos conglomerados de células, que presentan algo de estroma de soporte entre las células, se pueden mantener en cultivo celular al menos hasta 1 -2 meses. Por el contrario, las células ADHLSC (ya sean no diferenciadas o diferenciadas, cultivadas en las mismas condiciones) proporcionan agregados esencialmente bidimensionales de un tamaño máximo de 20 μm que no presentan las fuertes actividades metabólicas específicas del hígado que se observan para la progenie H2Stem que forma conglomerados de células tridimensionales. La progenie H2Stem tridimensional que comprende células no diferenciadas (células H3Stem) o diferenciadas (células H3Screen) se puede generar en sistemas de cultivo de gota colgante, matraces de cultivo de células de fijación ultrabaja, placas o microplacas con pocillos en forma de U/redondos. Estos recipientes fueron desarrollados para cultivar cuerpos embrioides u otras células como esferoides en suspensión. La superficie expuesta al cultivo celular está cubierta por una capa de hidrogel unida covalentemente que es hidrófila, con carga neutra e inhibe la inmovilización celular (Saleh F. et al. 2012).

Dependiendo del uso posterior, el contenido de un solo pocillo, placa o matraz (o el resultado de combinar el contenido de los pocillos en una microplaca para obtener 5, 10 o más esferas de progenie H2Stem tridimensional), o cada uno de los conglomerados en forma de esfera se puede usar o testar por separado, en el mismo pocillo o de otro modo, lo que permite una evaluación de alto rendimiento de los efectos de los compuestos o la condición del cultivo celular en paralelo con otros criterios (tales como la actividad enzimática o la expresión de genes/proteínas) en una determinada progenie H2Stem tridimensional.

Las células H3Stem son una progenie H2Stem tridimensional que está constituida principalmente por células progenitoras del hígado y se puede obtener mediante el cultivo de células H2Stem. La progenie H2Stem tridimensional contiene células hepato-activas después de la incubación en un medio apropiado (como en el caso de las células H3Screen-1 y las células H3Screen-2). En particular, las células H3Screen se pueden mantener como progenie H2Stem tridimensional que son adherentes (en el caso de células H3Screen-2b y células H3Screen-2c) o en suspensión (en el caso de células H3Screen-2a y células H3Screen-1), dependiendo de las condiciones del cultivo celular, es decir, si se aplican condiciones para generar estos diferentes tipos de progenie H2Stem tridimensional en una secuencia específica o simultáneamente. A nivel morfológico y fenotípico, la progenie H2Stem tridimensional se asemeja a un armazón de micro-hígado que consiste en un armazón estromal de apoyo y una masa de células hepáticas internas (Fig. 5). El uso de microplacas de 96 pocillos en forma de U/redondas da como resultado una progenie H2Stem tridimensional más estandarizada, con un tamaño más uniforme y una generación más controlada de los conglomerados de células en cada uno de los pocillos. De hecho, progenie H2Stem que se transfiere en sistemas de este tipo para el cultivo celular se agrega rápidamente en un solo conglomerado de células con forma de esfera que puede contener más de 100000 células (Fig. 5D y 6).

La progenie H2Stem tridimensional aún expresa marcadores que se identifican en las células H2Stem tal como un marcador mesenquimal como vimentina y un marcador hepático como albúmina. Además, la progenie H2Stem tridimensional presenta generalmente niveles de expresión más altos de las principales actividades metabólicas específicas del hígado, directamente (tales como CYP3A4, CYP1A2, CYP2 B6 , CYP2C9, CYP2E1, ornitina transcarbamilasa y UGT1A1), o indirectamente (para factores de transcripción tales como HNF-3b y HNF-4), en comparación no solo con células ADHLSC, sino también con células H2Stem y células H2Screen. Estas observaciones sugieren que la progenie H2Stem tridimensional es capaz de reproducir mucho mejor no solo la organización tridimensional estructural, sino también las funcionalidades que presentan los hepatocitos. in vivo. Cuando se analizan por inmunohistoquímica, las células H3Screen-1 muestran una fuerte expresión de albúmina, CYP3A4, ornitina transcarbamilasa (OTC; una enzima del ciclo de la urea) y UDP-glucuronosil transferasa 1A1 (UGT1A1; la enzima para la conjugación de bilirrubina), junto con una fuerte expresión de CK-19 y CK-18.

A nivel de actividad enzimática, se midió la actividad de CYP3A4 en la progenie H2Stem tridimensional que comprende células similares a hepatocitos en comparación con los hepatocitos primarios y las células H2Stem y las células H2Screen. Cuando se comparan los valores absolutos (Fig. 7A), la actividad de CYP3A4 de las células H2Stem, que ya es significativamente mayor, en comparación con las células ADHLSC antes o después de la diferenciación (véase el Ejemplo 1 y la Fig. 4B), ya se alcanza con las células H3Stem y se aumentó en células H3Screen tales como las células H3Screen-2a. Estos valores, cuando se definen en base al número de células, indican una actividad de CYP3A4 en el intervalo de 10-2 - 10-3 μmol/conglomerado de células H3Screen-2a, correspondiente a un intervalo de 10 -5 - 10-6 pmol/célula (dependiendo del número total y la densidad de las células), obteniendo así al menos una mejora logarítmica adicional en comparación con las células H2Screen. Un valor de este tipo está muy por encima de los niveles de actividad de CYP3A4 que se miden en células ADHLSC diferenciadas y se acerca al nivel que se mide en hepatocitos primarios.

Se puede realizar una validación adicional de las actividades metabólicas específicas del hígado de los diferentes tipos de células H3Screen, de manera similar a lo que se describió en el Ejemplo 1 para células H2Stem y células H2Screen tal como la secreción de urea (véase la Fig. 4). Alternativamente, se pueden evaluar otros indicadores de la actividad metabólica usando kits comerciales o aplicando técnicas que se describen en la bibliografía para determinar el nivel de expresión de ARNm y/o proteínas para marcadores relevantes y/o de actividad enzimática (p. ej., en relación con la metabolización de compuestos específica de CYP1A2, CYP2C19, CYP2C9 o CYP2D6).

Además, se midió una actividad enzimática significativamente mayor en células H3Screen (y, en particular, células H3Screen-2a y -2b) en comparación con células H2Stem o células H2Screen después de la inducción con Rifampicina y beta-naftoflavona (un test para evaluar los efectos mensurables de interacciones fármaco-fármaco), lo que da como resultado un múltiplo de inducción de 36,22x para la actividad de CYP1A2, de 93,71x para la actividad de CYP2B6, de 2,13x para la actividad de CYP2C9 y de 31,23x para la actividad de CYP3A4.

Células H3Stem y células H3Screen también muestran una expresión y actividad sustanciales de las proteínas UGT1A y SULT (Fig. 7B y C), acercándose también en este caso a los niveles que se miden en los hepatocitos primarios, es decir, del 10% hasta casi el 100%. Esta amplia capacidad de glucuronidación no solo es de gran importancia para el desarrollo de modelos de detección toxicológica, sino que también revela un potencial de aplicación clínica de estas nuevas células para, p. ej., Síndrome de Crigler-Najjar. Además, las células H3Screen son capaces de sintetizar urea en presencia de sustratos (cloruro de amoníaco y ornitina), con una producción de urea sustancialmente aumentada o acumulada a lo largo del tiempo, lo que confirma su amplia capacidad metabólica.

La funcionalidad de los transportadores de captación del polipéptido co-transportador de taurocolato de sodio (NTCP, por sus siglas en inglés), los polipéptidos transportadores de aniones orgánicos (OATPs, tales como OATP1B1 y OATP1B3) y los transportadores de cationes orgánicos (OCTs (OCT1 y 2)) se evaluó midiendo la captación de taurocolato, estrona-3-sulfato o MPP. Tanto las células H3Stem como H3Screen-2a mostraron una mayor absorción de compuestos de este tipo durante 15-60 minutos (Fig. 7D). Además, tanto las células H3Stem como las células H2Stem presentan actividades específicas del hígado como CES1 (carboxilasa hepática) que no solo son superiores a las células ADHLSC o a una línea celular de uso común como HepG2, sino que también se acercan a las detectadas in vitro para los hepatocitos humanos primarios (Fig. 8A). De manera similar, la secreción de alfa-1-antitripsina por parte de células H2Stem es considerablemente superior a la observada para las células ADHLSC (Fig. 8B), una característica adicional que se puede evaluar adicionalmente en las células H3Stem y las células H3Screen Estas evidencias confirman la presencia de captación activa y metabolización de compuestos específicos en las células H3Stem y H3Screen que pueden explotarse para testar fármacos candidatos.

Por lo tanto, las células H2Stem se pueden usar para proporcionar progenie H2Stem que se puede mantener como conglomerados de células tridimensionales (progenie H2Stem tridimensional) que comprenden células progenitoras hepáticas o células hepato-activas, crecen de manera eficiente en condiciones de cultivo celular y son útiles para proporcionar células metabólicamente activas y/o en proliferación. Características relacionadas con el metabolismo y la proliferación se pueden combinar con otras características (tales como la presencia/ausencia de marcadores de superficie específicos del tipo o actividad celular, el diámetro, el tipo de estructura estromal u otras actividades biológicas) para determinar qué tipo de progenie H2Stem tridimensional como se identificó anteriormente (o un subtipo adicional que puede determinarse funcional o morfológicamente) tiene el perfil funcional, morfológico o antigénico más apropiado para un uso determinado.

Por ejemplo, un intervalo específico de diámetros (correspondiente a un número promedio de células y cantidad de proteína/ADN), un proceso que combina o no la diferenciación in vitro (véanse las Figs. 1 y 6), la transformación con vectores para expresar proteínas recombinantes, y/o un perfil antigénico específico se puede preferir cuando la progenie H2Stem tridimensional está destinada a la administración in vivo (p. ej., mediante inyección intraportal o implantación intra/extrahepática, con o sin tratamiento preliminar con tripsina, dentro o no de un dispositivo o una matriz biocompatible).

Alternativamente, la progenie H2Stem tridimensional más grande que se genera en suspensión a partir de células H2Screen (células H3Screen-1) o células H3Stem (células H3Screen-2a o células H3Screen-2b) puede ser más apropiada para usos in vitro que involucran la exposición a virus que fijan como objetivo el hígado, la transformación con vectores para expresar proteínas recombinantes y/o la exposición a un panel de compuestos. Estos experimentos pueden proporcionar información relevante sobre cómo un modelo de este tipo permitiría expresar proteínas virales o humanas de manera eficiente, o evaluar la eficacia terapéutica, el metabolismo, la estabilidad y/o la toxicidad del compuesto en el metabolismo hepático, en particular para la detección y el ensayo farmacológico o toxicológico preclínico.

Ejemplo 3: Características Moleculares que Caracterizan las Células H2Stem

Materiales y Métodos

Análisis proteómico de Células ADHLSC y Células H2Stem

El análisis proteómico se realizó en geles bidimensionales (2D) usando el Sistema DIGE Ettan™ (2D-DIGE; GE Healthcare Life Sciences) como se describió anteriormente (Vanheel A et al., 2012 ENREF 35) ENREF 29 con algunas adaptaciones menores. Brevemente, los sedimentos celulares se prepararon recolectando células en cultivos al 95% de confluencia, contando y centrifugando a 300 g durante 5 minutos a 4 °C. Las células se lavaron con 10 ml (por cada 5x106 células) de tampón de lavado enfriado con hielo que se prepara utilizando 45 ml de solución salina tamponada con fosfato (Pb S), 5 ml de solución de EDTA (50 mM; Cat. N° 17-1324-01, GE Healthcare) y 1 tableta de cóctel de inhibidores de proteasa (cOmplete; Cat N° 11873580001, Roche Applied Sciences). Tras la homogeneización, las células se lavaron y centrifugaron dos veces en 1 ml de tampón de lavado enfriado con hielo por cada 5 x 106 células. Finalmente, se eliminó el sobrenadante y los sedimentos celulares se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Después de determinar la concentración de proteínas en los extractos celulares, se realizó un marcaje mínimo con colorantes de éster de N-hidroxisuccinimidilo Cy2, Cy3 y Cy5 (GE Healthcare Life Sciences) según lo descrito por el fabricante. Los geles 2D-DIGE marcados con CyDye se escanearon en el aparato Ettan DIGE Imager (GE Healthcare Life Sciences). Las imágenes de gel de los tres CyDyes se cargaron en el software DeCyder 7.0 (GE Healthcare Life Sciences) y se analizaron.

Análisis de componentes principales (PCA)

La significancia estadística de la variación en la abundancia dentro de un grupo con respecto a la magnitud del cambio entre conglomerados se calculó utilizando el test t de Student y el análisis de varianza (ANOVA). Las manchas presentes en el 70% de las imágenes de gel y con un ANOVA estadísticamente significativo (p ≤ 0,05) se consideraron para análisis posteriores. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó utilizando el módulo de análisis de datos extendidos (EDA) DeCyder (GE Healthcare). La intensidad de fluorescencia de cada una de las manchas se normaliza con respecto a este patrón interno, lo que hace posible la comparación entre geles. Este proceso lo realiza el software DeCyder (GE Healthcare).

Detección de Células basada en Proteínas

Se realizaron análisis de citometría de flujo o transferencias Western en una selección de potenciales biomarcadores de superficie que se identificaron mediante análisis de proteómica. Se utilizó el citómetro FACSCANTO y el software FACSDiva (BD biosciences). Las células se incubaron después de la fijación con anticuerpos primarios CD140b anti humano de ratón PE (BD Pharmingen; Cat. N° 558821) y SUSD2 anti-humano PE (antígenos W5C5 y W3D5, Cat. N° 327406 y 327506, BioLegend) antes del análisis. La viabilidad se midió usando 7AAD (Cat. N° 559925, BD Pharmingen). Para el análisis de transferencia Western se usó un anticuerpo anti-beta-actina comercial como control de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Otros anticuerpos que se utilizaron en la citometría de flujo incluyen CD49b-PE (BD Biosciences; clon 12F1; cat. N2555669), CD51 -PE (Biolegend, clon NKI-M9, cat. N2327909) y CD271 -PE (Miltenyi, clon ME20.4-1.H4, cat. N° 130-098-111), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la citometría de flujo, los porcentajes de células positivas se normalizaron con un 3% de positividad del isotipo de control apropiado.

Resultados

Los Ejemplos 1 y 2 presentan datos experimentales sobre una primera serie de características moleculares o enzimáticas que pueden permitir distinguir células H2Stem y progenie H2Stem de otros tipos de células mediante el uso de productos disponibles comercialmente (anticuerpos, cebadores de PCR y/o kits). Sin embargo, se puede realizar una caracterización cualitativa y cuantitativa más general de células H2Stem y progenie H2Stem mediante diferentes tecnologías para analizar ampliamente el transcriptoma, el lipidoma, el metaboloma y/o el proteoma de estas células. Luego, al comparar el conjunto de resultados entre sí o con datos similares obtenidos de distintas poblaciones de células (p. ej., diferentes preparaciones de células H2Stem, progenie H2Stem, hepatocitos humanos primarios o células ADHLSC), puede establecerse un perfil biológico más preciso de células H2Stem y progenie H2Stem mediante la identificación de biomarcadores que pueden ayudar a distinguir entre diferentes poblaciones celulares.

Como un primer enfoque, se comparó el proteoma de células ADHLSC y células H2Stem extrayendo el contenido completo de proteínas de los cultivos en proliferación de estas células y sometiéndolo a un análisis de gel bidimensional para identificar cambios en la expresión, el recambio y/o la modificación de las proteínas. Puntos diferenciales se recogieron mediante análisis de expresión diferencial y se cuantificaron mediante ANOVA de 1 vía con el fin de realizar un análisis de componentes principales (PCA), un método estadístico multivariante no supervisado utilizado para analizar la variabilidad entre grupos experimentales. Se realizó un PCA con todos los puntos relevantes de ANOVA 0.05, lo que dio lugar a dos conglomerados distintos de puntos que sugerirían un perfil de biomarcador distinto (además de características funcionales) entre distintas preparaciones de las dos poblaciones celulares (Fig. 9).

Se puede realizar un análisis más profundo de estos puntos diferenciales mediante la secuenciación de proteínas usando espectrometría de masas para identificar realmente las proteínas relevantes y luego confirmar estas evidencias con otras tecnologías y productos comerciales (p. ej., mediante el uso de anticuerpos en transferencia Western o citometría de flujo, cebadores para RT- PCR). Alternativamente, las tecnologías basadas en matrices y otros enfoques que proporcionan grandes paneles de agentes de detección específicos de genes (siendo cebadores, anticuerpos marcados o lectinas) pueden permitir comparar la cantidad de proteínas específicas (agrupadas por actividad, localización u otros criterios) en distintas muestras y luego restringir el número de proteínas que merecen un análisis más detallado en diferentes poblaciones celulares y/o condiciones de cultivo celular.

Cuando se combinan datos de análisis inmunológico, transcriptómico y/o glucómico, más información sobre células H2Stem o progenie H2Stem puede sugerir características de estas células que pueden ser de interés potencial para una validación adicional (incluyendo usos médicos, efectos paracrinos e interacciones con otras células, matriz extracelular u otros efectores biológicos). Un enfoque de este tipo puede implicar la comparación con otras poblaciones celulares (p. ej., hepatocitos humanos primarios, diferentes preparaciones de células H2Stem o diferente progenie H2Stem, mantenidas como células adherentes o conglomerados de células tridimensionales), así como materiales biológicos derivados de poblaciones celulares de este tipo (tal como medio acondicionado o fracciones celulares o proteicas específicas).

Diferentes tecnologías permiten obtener datos preliminares sobre la representación excesiva o insuficiente de proteínas específicas en materiales biológicos de este tipo de células H2Stem y distintos tipos de progenie H2Stem y compararlas no solo con células ADHLSC sino también con poblaciones de células progenitoras del hígado adulto o incluso con hepatocitos humanos primarios Estas evidencias sobre la representación excesiva o insuficiente de proteínas específicas en distintas poblaciones celulares pueden utilizarse para diferentes aplicaciones in vivo y/o in vitro que requieren establecer la calidad y/o cantidad de poblaciones de células progenitoras del hígado adulto en general, y de células H2Stem (o de uno o más tipos de progenie H2Stem) en particular, mediante el uso de biomarcadores debidamente validados en el paso inicial de su proceso de producción y en pasos posteriores (como se define en la Descripción Detallada anterior).

Enfoques preferidos para determinar biomarcadores de este tipo son aquellos que se pueden validar sin la limitación debida al bajo rendimiento o a la gran cantidad de células que se van a testar y destruir. Por lo tanto, estudios adicionales pueden centrarse en biomarcadores que pueden evaluarse en el sobrenadante del medio de cultivo celular y/o mediante citometría de flujo. En este ámbito, la abundancia de proteínas se puede evaluar inicialmente en células H2Stem y células ADLHSC utilizando técnicas de electroforesis en gel bidimensional (2D). Las proteínas que están en la superficie celular y/o que se encuentran secretadas en el sobrenadante del cultivo celular se tiñen previamente para las dos poblaciones celulares usando sondas fluorescentes distintas, o se aíslan en preparaciones de proteínas enriquecidas específicamente usando biotinilación y cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando el kit Pierce Cell Surface de aislamiento de proteínas, Thermo Scientific). Paralelamente, también se preparan extractos de proteína total y otros controles/patrones internos para cada población celular. Luego, las muestras se aplican a geles para separar proteínas mediante electroforesis en gel 2D. A continuación, se utilizan técnicas bioinformáticas y de formación de imágenes para comparar la abundancia de la superficie celular y/o proteínas secretadas en los geles y los puntos interesantes (para los que se detecta una diferencia estadísticamente significativa en la abundancia entre las poblaciones celulares) se extraen del gel y se digieren utilizando tripsina en el ámbito de la identificación de la identidad de la proteína en dicha mancha por espectrometría de masas.

Entre las proteínas que se han identificado como expresadas diferencialmente entre las células H2Stem y las células ADHLSC utilizando métodos de este tipo, se ha encontrado que el dominio Sushi que contiene la proteína 2 (SUSD2) y la cadena beta de fibrinógeno (FGB) u otras proteínas secretadas relacionadas con la coagulación se expresan fuertemente en células H2Stem en comparación con células ADHLSC y, por lo tanto, pueden ser de interés como biomarcadores (por separado o en combinación) para células H2Stem y progenie H2Stem.

Incluso si la función biológica de SUSD2 no se ha establecido completamente hasta el momento, la bibliografía proporciona información relevante sobre esta proteína de la superficie celular que tiene un gran dominio extracelular. Esta proteína se ha identificado en muchos estudios que comparan la expresión de genes y/o proteínas y, por ejemplo, se ha encontrado sobre-expresada inmediatamente después de una hepatectomía parcial (White P et al, 2005). SUSD2 y la proteína de ratón correspondiente (SVS-1) parecen afectar a las actividades de las células cancerosas in vitro o en modelos animales al alterar su interacción con la matriz extracelular, al menos cuando se testan con materiales naturales (tales como fibronectina o galectina-1) o sintéticos (tales como Matrigel) (Sugahara T et al., 2007; Watson A et al., 2013). Finalmente, se ha identificado que SUSD2 contiene epítopos de la superficie celular (W5C5, W3D5) que se definen como células madre mesenquimales caracterizantes de la médula ósea, el endometrio, el cartílago y otros tejidos humanos (Sivasubramaniyan K et al., 2013; Benz K et al., 2013; Masuda H et al., 2012; Pilz G et al., 2011; Bühring HJ et al., 2007).

El hallazgo inicial realizado usando electroforesis en gel 2D sobre la expresión mucho más fuerte de SUSD2 en células H2Stem se confirmó usando un anticuerpo comercial (SUSD2 antihumano purificado; Cat. N° 327401, Biolegend) contra SUSD2 humano en transferencia Western (Fig. 10A) y en inmunofluorescencia, utilizando un microscopio confocal. El dominio extracelular SUSD2 también puede estar presente en el medio de cultivo celular como una proteína soluble e identificarse junto con proteínas secretadas (tales como FGB, CES1 o alfa-1-antitripsina y su actividad correspondiente) que pueden usarse como biomarcadores secretados para caracterizar células H2Stem y progenie H2Stem específica durante su aparición y producción, o para identificar características que sugieran usos específicos in vitro y/o in vivo.

Curiosamente, algunas otras proteínas de superficie se han caracterizado como más expresadas por las células ADHLSC que por las células H2Stem, lo que sugiere un enfoque alternativo para caracterizar las células H2Stem y la progenie H2 Stem específica durante su aparición y producción. Por ejemplo, CD140b, a menudo citado entre los marcadores que caracterizan a las células madre mesenquimales, parece tener un perfil de expresión opuesto al de SUSD2 que puede determinarse mediante citometría de flujo. De hecho, un enfoque de este tipo puede ser complementario y combinado con el análisis de transferencia Western para mostrar cuán fuertemente se expresa SUSD2 en la mayoría de las células H2Stem y cómo la expresión de SUSD2 es mucho menor en un porcentaje mucho menor de células ADHLSC (Fig. 10B y C). Esta combinación de positividad/negatividad del biomarcador, junto con las características funcionales, permite distinguir aún más las células H2Stem de las células ADHLSC, así como las células madre mesenquimales descritas anteriormente (Benz K et al., 2013) que no presentan marcadores hepáticos o actividades específicas del hígado.

Además, los anticuerpos anti-CD140b de fuerte positividad pueden usarse para evaluar la calidad, la pureza y/o la identidad de las células ADHLSC durante su obtención y/o antes de su uso. Junto con los otros criterios que se enumeran en la bibliografía (Najimi M et al., 2007) y (si está disponible) la información clínica sobre el sujeto humano que proporcionó la preparación primaria inicial de células hepáticas, la detección de CD140b puede permitir una mayor optimización de la preparación de células ADHLSC y la selección del uso terapéutico más apropiado y/o el sujeto humano al que se administran las células.

Este análisis inicial sobre marcadores de superficie y actividades enzimáticas se ha ampliado haciendo uso de tecnologías proteómicas y transcriptómicas adicionales que se aplicaron no solo en células H2Stem y células ADHLSC, sino también en diferentes preparaciones de células hepáticas humanas primarias que se obtuvieron de diferentes donantes y que se utilizaron para generar células H2Stem (como se describe anteriormente), células ADHLSC (como se describe en la bibliografía) y células ADHLSC que se produjeron a mayor escala para realizar estudios clínicos sobre enfermedades metabólicas genéticas del hígado, tales como el síndrome de Crigler-Najjar y trastornos del ciclo de la urea.

Estas últimas células (denominadas HHALPCs) requieren criterios de fabricación y calidad específicos, tales como el cumplimiento de las condiciones GMP, la tasa de crecimiento mejorada y el nivel de duplicación de la población, y el cumplimiento de las especificaciones de calidad antes de la criopreservación y el uso clínico (es decir, las células deben permanecer viables y sin diferenciar, presentar una determinada combinación de marcadores positivos/negativos, manteniendo al mismos tiempo la capacidad de diferenciarse hacia hepatocitos funcionales). Este proceso ampliado, que requería la optimización de algunos parámetros de cultivo celular, se logró inicialmente en una pila de múltiples bandejas (p. ej., Corning CellStack) y luego se transfirió a un biorreactor de múltiples placas (p. ej., PALL Xpansion 10), lo que confirma que las células progenitoras hepáticas, tales como las células ADHLSC y las células H2Stem de próximo futuro, se pueden proporcionar a escala industrial, con calidad y cantidad homogéneas (Egloff M et al., 2013).

Sin embargo, con la perspectiva de usar HHALPCs o células H2Stem en indicaciones clínicas adicionales y para optimizar aún más el proceso de fabricación, los criterios requeridos inicialmente pueden mejorarse mediante la identificación de marcadores adicionales (que sean proteínas de la superficie celular, proteínas secretadas o relacionadas con actividades enzimáticas) que permitan caracterizar la calidad de las células y optimizar cada paso de dicho proceso (es decir, selección de células hepáticas primarias, condiciones de cultivo celular, formulación, almacenamiento y/o selección de pacientes). Algunos de estos marcadores adicionales se enumeran y testan anteriormente, pero, basándose en este conjunto de datos, la comparación adicional basada en proteómica/transcriptómica entre muestras de HHALPC, células H2Stem y hepatocitos primarios humanos sugiere marcadores adicionales relevantes que pueden testarse utilizando citometría de flujo, ELISA u otros kits comerciales, ya sea a nivel de análisis de un solo marcador o de múltiples análisis en paralelo (p. ej., utilizando los anticuerpos para marcadores de la superficie celular que están contenidos en el kit eBD Lyoplate™).

Haciendo uso de los marcadores identificados anteriormente como criterios de control (así como otros criterios conocidos en la bibliografía que caracterizan las células hepáticas o mesenquimales, véase Yu J, et al., 2012; Santamaria E, et al., 2012; Slany A, et al., 2010; Sison-Young R et al., 2015), se identificó una serie de candidatos para una mayor validación de HHALPCs y/o células H2Stem a nivel de identidad/calidad celular y actividad biológica/uso médico. Por lo tanto, estos candidatos pueden ser fundamentales para el desarrollo de nuevos procesos de fabricación/formulación, así como para el uso de HHALPCs y/o células H2Stem en indicaciones específicas y/o poblaciones de pacientes.

Primeros ejemplos de candidatos de este tipo son CD49b (también conocido como integrina alfa-2, ITGA2 o receptor de colágeno) y CD51 (también conocido como integrina alfa-V, ITGAV o subunidad alfa del receptor de vitronectina) que se indicaron como fuertemente expresados en diferentes proteínas proteómicas y conjuntos de datos transcriptómicos que se generaron utilizando HHALPC y células H2Stem. Su positividad fue confirmada por citometría de flujo en preparaciones de HHALPCs y células H2Stem que presentaban diferente origen o características de fabricación, pero también en HHALPCs y células H2Stem originadas a partir de la misma preparación inicial de células hepáticas primarias humanas que inicialmente fue negativa para marcadores de este tipo (Fig. 11A). Este enfoque también se confirmó para un marcador de superficie celular (CD271, también conocido como miembro 16 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, TNFRSF16, receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad) que, aunque se sabe que está presente en algunos artículos sobre el tipo de célula de origen del hígado, se indicó como pobremente expresado en diferentes conjuntos de datos proteómicos y transcriptómicos que se generaron utilizando HHALPCs y células H2Stem (Fig. 11B). Por lo tanto, estos marcadores pueden incluirse en los criterios enumerados anteriormente como positivos adicionales (para CD49b y CD51) o negativos (para CD271) para identificar HHALPCs y células H2Stem.

Estos resultados sugieren que los datos ómicos sobre marcadores positivos/negativos que se generaron con HHALPCs y células H2Stem se pueden usar para definir otras proteínas con un perfil de expresión similar en poblaciones celulares de este tipo como marcadores candidatos adicionales (para ambos tipos de células o para diferenciar entre ellos) o actividades enzimáticas adicionales, siendo estas últimas de particular interés también para usos in vivo y/o in vitro.

Una primera categoría de marcadores candidatos adicionales incluye proteínas de la superficie celular que tienen perfiles de expresión fuertes similares tanto en HHALPCs como en células H2Stem (como para CD29, CD44, CD49b, CD51, CD73 o CD90), para ser validados por citometría de flujo u otros ensayos inmunológicos (véase la Tabla 2 a continuación).

Una segunda categoría de marcadores candidatos adicionales incluye marcadores de superficie celular que tienen perfiles de expresión bajos similares tanto en HHALPCs como en células H2Stem (como para CD45, CD117, CD31, CD34, CD133, CD271 y CD326), para ser validados por citometría de flujo u otros ensayos inmunológicos (véase la Tabla 3 a continuación).

Una tercera categoría de marcadores candidatos adicionales incluye marcadores de superficie celular (o proteínas secretadas) que tienen perfiles de expresión más altos similares en células H2Stem en comparación con HHALPCs (como para SUSD2 o AAT), para ser validados por citometría de flujo u otros ensayos inmunológicos (o funcionales) (véase la Tabla 4 a continuación).

Una cuarta categoría de marcadores candidatos adicionales incluye marcadores de superficie celular (o proteínas secretadas) que tienen perfiles de expresión más altos similares en HHALPCs en comparación con las células H2Stem (como para CD140b), para ser validados por citometría de flujo u otros ensayos inmunológicos (o funcionales) (véase la Tabla 5 a continuación).

Una quinta categoría de marcadores candidatos adicionales incluye enzimas que están relacionadas con las actividades biológicas del hígado y tienen perfiles de expresión superiores similares en células H2Stem y HHALPC, que se validarán mediante el uso de sustratos y ensayos enzimáticos relevantes (véase la Tabla 6 a continuación).

Una sexta categoría de marcadores adicionales incluye enzimas que están relacionadas con las actividades biológicas del hígado y tienen perfiles de expresión más altos en las células H2Stem en comparación con las HHALPCs (como para CES1), que se validarán mediante el uso de sustratos y ensayos enzimáticos relevantes (véase la Tabla 6 a continuación).

Por lo tanto, los hallazgos que se muestran en las Tablas anteriores proporcionan una guía para identificar qué marcadores y actividades biológicas adicionales se pueden asociar a las preparaciones de HHALPCs y/o células H2Stem, y luego mejorar su calidad durante la fabricación, así como sus usos in vitro o in vivo para su uso farmacéutico eficiente.

Ejemplo 4: Caracterización de Células H2Stem que se Inyectan en un Modelo de Ratones

Materiales y Métodos

Análisis inmunohistoquímico

Secciones de hígado de cinco gm se desparafinizaron y rehidrataron en series graduadas de alcohol. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación durante 30 min en una solución de metanol con peróxido de hidrógeno al 3%. La recuperación del antígeno se realizó incubando las secciones en una solución monohidratada de ácido cítrico (pH 6,0) a 98 °C durante 35 minutos. La inmunotinción no específica se evitó mediante una incubación de 1 hora a temperatura ambiente de acuerdo con el kit utilizado. Los cortes se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios contra antígenos humanos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante: Anti-CK19 (Dako, cat. N° M0888 ; dilución 1/100), Anti-CYP3A4 (Enzo, cat. N° BML-CR3340-0025; dilución 1/750), anti-alfal -antitripsina (Abcam, cat. N° ab9399; dilución 1/1000) y anti-MRP2 (Enzo, cat. N° Alx-801-016; dilución 1/100). La detección de la tinción se visualizó mediante el kit anti-conejo Envision Dako (para anti-CYP3A4) o los kits MOM (para anti-MRP2, anti-CK19 y anti-alfa1 -antitripsina) y utilizando diaminobencidina (Sigma, Bélgica) como sustrato cromogénico. Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina de Mayer durante 10 minutos y se montaron con Neo-Entellan® (Merck) para análisis microscópico.

Resultados

El uso clínico de células H2Stem requiere una validación preclínica inicial en un modelo animal que muestre si y cómo células de este tipo realmente se injertan y proliferan en los tejidos, en particular dentro del hígado, y presentan características asociadas a la diferenciación hepática sin transformación tumorigénica. En este ámbito, las células H2Stem se han administrado a modelos animales evaluando una serie de parámetros estándares, así como algunos parámetros relacionados con el uso clínico potencial.

Después de testar en cultivo celular que las células H2Stem no presentan características comunes en las células cancerosas, tal como un cariotipo alterado o una alta expresión de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTET), los posibles efectos tumorigénicos de las células H2Stem se testaron en paralelo con las HHALPCs en el modelo de ratón NSG (animales inmunodeficientes ratones NOD Scid Gamma en donde se evita el rechazo celular provocado por el xenotrasplante NOD.Cg-PrkdcSCID Il2rgtm1wjl/SZJ de Jackson Laboratories, cat. N° 005557) en donde las células se administran por vía intrahepática. Células HeLa (células tumorigénicas derivadas de adenocarcinoma cervical humano) y el vehículo para inyección (criostor 5) se utilizan como control positivo y negativo, respectivamente.

Después de 6 meses de una sola inyección de células intrahepáticas (1 millón para cada tipo de célula, equivalente a 20 millones/Kg; administración de acuerdo con procedimientos estándares), se sacrificó a los ratones y se tomaron muestras de los órganos, lo que confirmó que ni las células H2Stem ni las HHALPCs forman un número significativamente diferente de tumores tras la administración intrahepática de los obtenidos en el control negativo. Utilizando esta vía intrahepática, ninguno de los animales murió durante la inyección, y no se encontraron nódulos de origen humano (positivos para el antígeno Ku80) durante las autopsias. Además, un grupo separado de animales fue sacrificado después de una sola semana de una inyección intrahepática o intraesplénica de células H2Stem, se encontraron agregados de células positivas para Ku80 humanas en su hígado, lo que demuestra que las células H2Stem pueden injertarse rápidamente. Por lo tanto, los tratamientos de terapia celular basados en HHALPCs y H2Stem que se administran mediante inyección intrahepática son seguros y a salvo de la formación de tumores.

En un ensayo más funcional, se inyectaron células H2Stem, que también expresan el gen FAH (de acuerdo con RT-PCR y datos transcriptómicos), por vía intrahepática o intraesplénica en el modelo de ratones FRG. Este estudio permite evaluar el injerto, la repoblación y diferenciación de células H2Stem en un hígado sin función hepática (los ratones FAH carecen de un gen FAH funcional, de manera similar en la tirosinemia humana), utilizando un número equivalente de hepatocitos primarios humanos como control positivo. Se estableció que, confirmando los datos in vitro, las células H2Stem secretan albúmina humana en suero sanguíneo de ratón en donde se acumula durante varias semanas (Fig. 12A). Cuando el hígado de animales a los que se inyectaron por vía intrahepática células H2Stem o hepatocitos se analiza morfológicamente y para una serie de marcadores humanos mediante inmunohistoquímica, las células positivas para Ku80 forman agregados grandes similares de células proliferantes y diferenciadas hepáticamente (Fig. 12B), lo que sugiere que las células H2Stem pueden repoblar hígados que requieren células hepato-activas. Estos agregados celulares son fuertemente positivos para enzimas hepáticas tales como arginasa humana y OTC (Fig. 12C). Al mismo tiempo, si también se detectan otras enzimas tales como alfa-1-antitripsina y CYP3A4 en estas células H2Stem diferenciadas in vivo, la positividad de CK-19 desaparece (Fig. 12D). Estos datos sugieren que, si bien se mantiene (si no aumenta) la actividad hepática las células H2Stem presente in vitro, las células H2Stem pierden algunos de los marcadores no hepáticos y adquieren un perfil más parecido al hepático (los hepatocitos expresan pobremente CK-19) después de su injerto y proliferación dentro del hígado.

Estos modelos in vivo confirman la idoneidad de las células H2Stem para usos médicos que requieren la repoblación del hígado humano con células hepato-activas (como en ciertos trastornos hepáticos metabólicos congénitos o lesiones hepáticas graves/traumáticas agudas, o como alternativa al trasplante de hígado), así como la posibilidad de utilizar células de este tipo para suministrar enzimas sistémicas, factores de crecimiento y otras proteínas que se expresan de forma natural en hepatocitos funcionales (como los relacionados con la coagulación, la cirrosis o la fibrosis, en el caso de pacientes afectados por trastornos relacionados) o proteínas no hepáticas que se expresan adecuadamente mediante células H2Stem modificadas genéticamente (tales como anticuerpos u hormonas que pueden ser útiles en el tratamiento de una gran variedad de indicaciones, tales como cáncer, diabetes o trastornos inflamatorios). Se han revisado en la bibliografía modelos y enfoques preclínicos adicionales para validar la administración de hepatocitos o células progenitoras hepáticas (tales como células H2Stem) con respecto a la repoblación y regeneración del hígado (véase el libro "Liver Regeneration Basic Mechanisms, Relevant Models and Clinical Applications", Edit.:Udayan M. Apte, Elsevier 2015).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población aislada de células progenitoras del hígado adulto que comprende al menos un 60% de células que se miden:

(a) positivas para alfa actina del músculo liso (ASMA), albúmina (ALB) y CD140b;

(b) negativas para la proteína 2 que contiene el dominio Sushi (SUSD2) y citoqueratina-19 (CK-19);

(c) positivas para al menos un marcador hepático seleccionado de HNF-3B, HNF-4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2E1 y CYP3A4;

(d) positivas para al menos un marcador mesenquimal seleccionado de vimentina, CD90, CD73, CD44 y CD29; (e) positivas para al menos una actividad específica del hígado seleccionada de secreción de urea, conjugación de bilirrubina, secreción de alfa-1-antitripsina y actividad de CYP3A4;

(f) positivas para al menos un marcador seleccionado de ATP2B4, ITGA3, TFRC, SLC3A2, CD59, ITGB5, CD151, ICAM1, ANPEP, CD46 y CD81;

(g) positivas para al menos un marcador seleccionado de MMP1, ITGA11, FMOD, KCND2, CCL11, ASPN, KCNK2 y HMCN1;

(h) negativas para CD271;

(i) negativas para al menos un marcador seleccionado de ITGAM, ITGAX, IL1R2, CDH5 y NCAM1; y

(j) negativas para al menos un marcador seleccionado de HP, CP, RBP4, APOB, LBP, ORM1, CD24, CPM y APOC1.

2. La población celular aislada de la reivindicación 1, en donde dicha población celular es capaz de diferenciarse en células que presentan actividades específicas del hígado.

3. La población celular aislada de las reivindicaciones 1 o 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática.

4. La población celular aislada para uso de la reivindicación 3, en donde la enfermedad hepática es un error congénito del metabolismo hepático, un trastorno de la coagulación sanguínea hereditario, colestasis intrahepática familiar progresiva tipo 1/2/3, deficiencia de alfa 1 -antitripsina, defecto de los transportadores de células hepáticas, porfiria, hígado graso u otra enfermedad hepática fibrótica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante, enfermedad degenerativa del hígado o insuficiencia hepática aguda o crónica.

5. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la población celular aislada según las reivindicaciones 1 o 2 para uso en el tratamiento de una afección que puede beneficiarse de su injerto en un tejido humano.

6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha composición es adecuada para la administración intrahepática, intraesplénica o intravenosa.

7. Un kit que comprende una población celular aislada de las reivindicaciones 1 o 2.

8. El kit de la reivindicación 7, en donde dicho kit comprende, además, uno o más viales que contienen dicha población celular aislada y uno o más de los siguientes elementos: dispositivos, materiales desechables, soluciones, productos químicos, productos biológicos y/o instrucciones de uso de elementos de dicho kit.