KR20190002990A

KR20190002990A - 비강 세정용 조성물

Info

Publication number: KR20190002990A
Application number: KR1020170083381A
Authority: KR
Inventors: 박진오; 이지원; 전성현; 편두혁; 이인숙; 이혜자; 김은미
Original assignee: 대봉엘에스 주식회사
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-01-09
Also published as: KR102227420B1

Abstract

본 발명은 비강 세정용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지하 염수를 유효성분으로 포함함으로써 코 점액층의 리소자임의 활성화에 의한 항균 활성이 우수하여, 코 질환 증상의 개선, 예방 및 치료용으로 유용하게 이용할 수 있는 비강 세정용 조성물을 제공한다.

Description

비강 세정용 조성물{COMPOSITION FOR CLEANING NASAL CAVITY}

본 발명은 비강 세정용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지하 염수를 유효성분으로 포함함으로써 코 점액층의 리소자임의 활성화에 의한 항균 기능이 우수하여, 코 질환 증상의 개선, 예방 및 치료용으로 유용하게 이용할 수 있는 비강 세정용 조성물에 관한 것이다.

최근 중동 호흡기 질환인 메르스(MERS) 사태 및 중국발 미세먼지로 인해 호흡기 건강에 사람들의 관심이 늘어나고 있다. 특히, 후각 및 호흡에 있어 중추적인 역할을 하는 코는 호흡시, 코 속의 점막층에서 분비되는 점액, 코 안에 있는 작은 섬모, 부비동 속에 있는 호흡 섬모 등에 의해 공기 중에 있는 세균이나 바이러스의 유입을 막고 자가 정화작용을 하는 역할을 한다.

그런데 이 코 속의 점막층에 염증이 생기게 되면 재채기나 코막힘, 콧물 등이 과도하게 흘러내리게 되는데, 이러한 질환들을 일컬어 비염이라 한다.

비염을 포함하는 코 질환의 치료를 위해서는 항알레르기제나 항히스타민제를 처방하고 있는데, 이러한 항히스타민제는 재발이 잦은 등 부작용이 있으며, 국소용 스프레이도 장시간 사용하게 되면 오히려 축농증을 유발할 수 있는 문제점이 있다.

식염수를 이용한 비강 세정은 점소 및 리소자임(Lysozyme)의 분비를 증가시키고(Korean J Otolaryngol 2003;46:940-5 식염수 세척이 비강 점액분비에 미치는 영향), 뿐만 아니라 점액 섬수 기능 향상 및 코 점막 부종 감소, 염증 관여 인자의 활성 감소와 농축된 점액 청소시 매우 유용하다고 보고되어 있다(Clinical study and literature review of nasal irrigation., Laryngoscope. 2000 Jul;110(7): 1189~93).

따라서, 각종 비염 등과 같은 코 질환 개선, 예방 또는 치료용으로써 부작용이 적으면서도 간편하고 경제적인 방안으로 다양한 종류의 비강 세정용 제제에 대한 연구가 활발히 이루어 지고 있다.

일본 공개특허 제2001-247446호에는 심층수를 배합한 구강 또는 비강 세정제가 개시되어 있으며, 일본 공개특허 제2002-212081호에는 해양 심층수를 배합한 코 세정제로, 해양 심층수에 포함되어 있는 성분이 인체 체액의 조성과 유사하며 인체에 필요한 미량원소가 풍부하게 포함되어 있는 비강 세정 효과가 높은 저자극성인 코 세정제가 개시되어 있다.

일본 공개특허 제2002-519331호에는 세균 유래의 물질, 바이러스, 세균 및 기타 흡입되는 공기에 의해 옮겨지는 모든 염증성 및 알레르기성 성분을 포함한 염증 촉진제의 영향 하에서 사람 기도 점막의 염증 현상을 유발하는 원인인 케미컬 매개체(mediator)의 유리 또는 방출을 예방 및 치료하는 제제로써 등장성 염수용액, 특히 해수에서 얻어지는 등장성 염수용액을 사용하는 것이 개시되어 있다.

또한, 일본 공개특허 제2013-028583호에는 나트륨이 1500~13000 mg/L, 염화물 이온이 2550~21000 mg/L, pH 8.0 이상인 비강 인후 내 세정액이 개시되어 있으며, 비강이나 인후 내 흡착되어 있는 잡균, 먼지, 화분 등을 씻어내고, 동시에 점막의 염증 치유에 즉효성이 있다고 기재되어 있어 있다.

국내의 경우, 한국 공개특허 제10-2010-0017239호에는 pH 7.8~8.4, 건물량 1-2중량%, 삼투압 농도 250-350 mOsm/kg, 나트륨 500-2600 mg/L, 칼륨 40-6500 mg/L, 염소 5800-6000 mg/L, 칼슘 20-400 mg/L, 마그네슘 50-1500 mg/L 인 감기 또는 플루 증후군의 합병증을 예방하기 위한 의료 기구 제조에 사용되는 등장성 해수계 이온 용액의 용도에 대하여 기재되어 있으며, 한국 공개특허 제10-2013-0059048호에는 광천수를 함유한 비강 세척용 조성물이 개시되어 있다.

한편, Clinical Science (2001) 100, 327-333 Comparison of nasal pH values in black and white individuals with normal and high blood pressure에서는 인종이나 환경에 따라 차이가 있으나 일반적으로 코 속의 pH가 6.4 내지 7.0 이라고 보고되어 있다.

그러나 비강 세정용 용액의 원수로 주로 사용되는 해양수의 pH는 8 내지 9로(Handbook of Chemistry and Physics, 63rd edition, 1982-1983), 사람의 코 속 pH와는 차이가 있어 비강 세정시 코에 자극을 줄 수 있다는 문제점이 있다.

JP

2001-247446

A

JP

2002-212081

A

JP

2002-519331

A

JP

2013-028583

A

KR

10-2010-0017239

A

KR

10-2013-0059048

A

Korean J Otolaryngol, 식염수 세척이 비강 점액분비에 미치는 영향, 2003, 46, 940-945. Laryngoscope, Clinical study and literature review of nasal irrigation, 2000 Jul, 110(7), 1189-1193. Clinical Science, Comparison of nasal pH values in black and white individuals with normal and high blood pressure, 2001, 100, 327-333. Handbook of Chemistry and Physics, 63rd edition, 1982-1983.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 지하 염수를 유효성분으로 포함함으로써 코 점막층에서 분비되는 리소자임의 활성화를 통하여 항균 기능을 향상 시킬 수 있는 비강 세정용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, pH가 6.8 내지 7.8 인 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비강 세정용 조성물을 제공한다.

상기 지하 염수는 제주도 지하 100 내지 200m를 굴착하여 취수한 것일 수 있다.

상기 지하 염수는 삼투압농도가 900 ~ 1100 mOsmol/kg이고, 나트륨(Na) 9500 ~ 10500 mg/L, 칼륨(K) 300 ~ 600 mg/L, 칼슘(Ca) 300 ~ 600 mg/L, 마그네슘(Mg) 1100 ~ 1500 mg/L, 염소(Cl) 15000 ~ 17000 mg/L를 함유할 수 있으며, 게르마늄(Ge), 브롬(Br), 철(Fe), 아연(Zn), 망간(Mn), 셀레늄(Se), 바나듐(V), 및 스트론듐(Sr)을 더 함유할 수 있다.

상기 지하 염수는 화산암반층에 의해 해수가 해양에서 육지로 정화 및 여과 처리된 것일 수 있다.

상기 지하 염수는 탈염 처리된 것일 수 있다.

상기 지하 염수는 코 점막층의 리소자임 활성에 의한 항균 기능을 개선시킬 수 있다.

상기 비강 세정용 조성물은 액상 또는 스프레이용 제제일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, pH 6.8 내지 pH 7.8인 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비염 또는 부비동염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 비강 세정용 조성물에 의하면, 코 속의 자극을 완화할 수 있으며, 코 점막층에서 분비되는 리소자임의 활성화를 통하여 항균 기능을 향상시켜 비염 또는 부비동염 등의 코 질환 증상의 개선, 예방 또는 치료를 효과적으로 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 비강 세정용 조성물을 수득하기 위한 수득공정을 도시한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 비강 세정용 조성물 및 비교예의 조성물에 의한 리소자임 유전자 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 pH에 따른 점소 및 리소자임의 농도 분포를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 pH에 따른 총 단백 및 알부민의 농도 분포를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.

본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.

본 발명을 설명함에 있어서 사용되는 정도의 용어 '약', '실질적으로', '정도' 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명의 일 실시예에 의한 비강 세정용 조성물은 지하 염수를 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 지하 염수는 화산암반층(현무암층)을 통과하여 육지 지하로 흘러 든 해수를 의미한다.

일반적으로 지하 염수란 염분이 포함된 지하수를 의미하며, 삼투압이 높은 해수가 지층 구조를 따라 침투하여 생성된 지하수로, 해수 자체 또는 육지 지하수와 혼합되어 생성될 수 있다. 지하 염수는 지하수의 생성 과정 및 해수의 혼입 과정에서 지층 구조에 의한 천연 여과 기능을 거치기 때문에 인체에 무해한 중금속이나 세균과 같은 유해성분이 자연적으로 제거된 상태이다. 뿐만 아니라 지하 염수는 지층에 포함된 미네랄 성분들이 지층으로부터의 용출 기능 등으로 인하여 다양한 미네랄 성분이 포함되어 있다.

특히, 제주도의 기저층은 투수성이 양호한 화산암반층(현무암층)이 호층으로 두껍게 분포하고 있어 해수가 해양에서 육지 지하로 화산암반층을 통과하는 과정에서 자연적으로 정화 및 여과 과정을 거치게 된다. 따라서, 지하 염수는 일반적인 해수에 비하여 중금속이나 세균과 같은 유해물질이 걸러진 안전한 해수이다. 또한, 지하 염수는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등의 무기물 성분뿐만 아니라, 철, 아연, 망간, 바나듐, 게르마늄, 셀레늄 및 스트론듐과 같은 인체에 유용한 희귀 미네랄 성분들을 다양하게 함유하고 있으며, 함유된 희귀 미네랄 성분들의 함유농도도 높다.

따라서, 지하 염수는 유용 성분을 대량으로 함유하고 있으므로 산업적 활용가치가 매우 높다. 그 중에서도 인슐린 분비를 안정시키는 작용으로 현재는 당뇨병 치료, 고지혈증 개선효과가 있는 바나듐과 혈액순환 촉진, 면역력 증강, 항암작용을 갖는 게르마늄, 지방의 산화작용억제, 심장과 간을 유지하는 상승효과, 라디칼 소거능력, 항암, 불임, 노화 및 콜레스테롤 수치 개선효과가 있는 셀레늄의 함유는 해양심층수에서도 보고된 적이 없는 지하 염수만의 특징이다. 게다가 이들 미네랄은 이온화된 상태에 있으며, 이온화된 미네랄은 인체나 타 동물에 대해 소화흡수가 용이하다. 또한, 지하 염수에는 대장균, 질산성질소, 인산염인, 페놀류 등이 검출되지 않은 청정한 지하수 자원이다.

이에 본 발명자들은 해수를 이용하여 비강을 세정할 수 있는 비강 세정액을 개발하던 중, 제주도 지역에서 취수한 지하 염수가 비염 또는 부비동염 등의 코질환 증상을 개선시키는데 우수하다는 것을 확인하고, 상기 지하 염수를 이용하여 비강 세척용 조성물을 발명하게 되었다.

본 발명에 따른 상기 비강 세정용 조성물에 유효성분으로 포함되는 상기 지하 염수는 pH 6.8 내지 pH 7.8일 수 있으며, 바람직하게는 pH 7.2 내지 pH 7.8일 수 있다. 상기 지하 염수는 제주도 지역에서 해발기준으로 지하 100 내지 200m를 굴착하여 취수한 것으로, 제주도 구좌읍, 성산읍, 표선면 등일 수 있으나 이들 지역에 한정되거나 제한을 두는 것은 아니다.

제주도 지역의 지하에서 취수되는 상기 지하 염수는 화산암반층에 의해 해수가 해양에서 육지로 정화 및 여과 처리된 것일 수 있다.

본 발명에 이용되는 상기 지하 염수의 pH는 6.8 내지 7.8로 pH가 6.4 내지 7.0이인 사람 코 속의 pH와 매우 유사함을 발견하였다.

반면, 해수의 pH는 염분의 농도, 온도, 지역 등에 따라 달라질 수는 있으나 일반적으로는 pH가 8 내지 9 인 염기성이다.

따라서, 해수를 이용한 비강 세정용 제제의 경우, 높은 pH로 인해 사람 코 속의 pH와는 차이가 커서 코 속의 피부 보호막을 파괴시키거나, 코 속 건조증을 유발시킬 수 있으며, 코 점막층의 pH를 높일 수 있게 된다.

한편, 코 점막층 속에는 리소자임이라는 박테리아 분해효소가 있는데, 이 효소는 점막하 점액선 중 장액선에서 분비되는 것으로써 박테리아와 같은 세균의 세포벽을 파괴하는 역할을 하는 것으로 pH가 7 인 조건에서 항균 활성이 가장 활발하다. 즉, 공기 호흡에 의해 각종 이물질 또는 바이러스 등과 같은 세균이 코 속으로 들어오게 되면 코 점막층에 달라붙게 되는데, 이때에 리소자임은 세균의 껍데기인 단백질을 파괴하여 세균류를 사멸시켜 코 속의 항균 기능을 수행한다.

따라서, 비강 세정용 제제는 코 속 피부 보호막의 손상이나 코 건조증의 유발을 적게 하면서도, 코 점막층의 리소자임의 활성을 높여서 항균력을 높일 수 있어야 한다.

이를 위해서는 사람 코 속의 pH와 유사하면서도, 리소자임이 활성화 되도록 코 점액층의 pH를 적정하게 유지하는 것이 중요하다. 상기 지하 염수의 pH가 6.8 미만이면 비강내 섬모 운동 능력이 저하되어 외부 물질을 걸러주는 역할을 제대로 할 수 없으며, pH가 7.8을 초과하게 되면 코 속 피부 보호막의 손상과 코 건조증을 유발할 수 있으며, 리소자임의 활성을 저하를 야기할 우려가 있다. 즉, 상기 지하 염수의 pH가 6.8 내지 7.8의 범위이면 코 점막층의 리소자임 활성에 의한 항균 기능을 개선시키는데 효과적이다.

상기 지하 염수는 삼투압농도가 900~1100 mOsmol/kg이고, 나트륨(Na) 9500~10500 mg/L, 칼륨(K) 300~600 mg/L, 칼슘(Ca) 300~600 mg/L, 마그네슘(Mg) 1100~1500 mg/L, 염소(Cl) 15000~17000 mg/L를 포함하고 있으며, 게르마늄(Ge), 브롬(Br), 철(Fe), 아연(Zn), 망간(Mn), 셀레늄(Se), 바나듐(V), 및 스트론듐(Sr) 등과 같은 희귀 미네랄 성분을 더 포함할 수 있다.

상기 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비강 세정용 조성물은 액상 또는 스프레이용 제제의 형태로 비강에 투여하여 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, pH 6.8 내지 7.8인 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비염 또는 부비동염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 비염 또는 부비동염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 유효성분으로 포함되는 지하 염수는 상기 비강 세정용 조성물에 포함되는 지하 염수일 수 있다.

이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 비강 세정용 조성물의 유효성분으로 포함되는 지하 염수의 수득공정에 대해 설명한다.

도 1은 상기 비강 세정용 조성물에 포함되는 유효성분인 지하 염수를 수득하기 위한 수득공정을 도시한 순서도이다.

도 1을 참조하면, 상기 지하 염수를 수득하는 수득공정은 취수단계(S110), 여과단계(S120), 탈염단계(S130), 멸균단계(S140)를 포함한다.

먼저, 상기 비강 세정용 조성물의 원수로 사용되는 지하 염수를 취수하는 취수단계(S110)를 수행한다. 상기 취수단계는 제주도 지역에서 해발기준으로 지하 100 내지 200m를 굴착하여 지하 염수를 취수하게 된다. 제주도 지역에서 구좌읍, 성산읍, 표선면 등일 수 있으나 이들 지역에 한정되거나 제한을 두는 것은 아니다.

다음으로, 상기 취수된 지하 염수를 여과하는 여과단계(S120)을 수행한다. 상기 여과단계는 취수된 지하 염수나 취수단계에서 존재하는 부유물을 여과하기 위한 단계로 제거해야 하는 부유물의 크기에 따라 1단계만 수행할 수도 있고, 여러 단계를 수행할 수도 있다.

다음으로, 상기 여과된 지하 염수에 존재하는 고농도의 나트륨 등과 같은 염들을 제거하는 탈염단계(S130)를 수행한다.

일반적으로 염도가 높은 해수는 염분을 제거하는 탈염공정을 수행하는데, 역삼투압막을 이용해서 염분을 포함하는 모든 미네랄을 제거함으로써, 미네랄이 완전 제거된 순수한 물과 염분 농도가 아주 높은 물이 만드는 염삼투압방식, 선택적으로 염분을 제거할 수 있는 전기투석방식, 그리고 파동을 이용하여 해수를 담수화하는 방법으로 물질에 대응하는 특정 정보파동을 선택해서 염분, 칼슘, 마그네슘 등의 용해도를 낮추는 파동공법 등을 이용할 수 있으나, 탈염 방식에 제한을 두는 것은 아니다.

다음으로, 상기 탈염된 지하 염수를 멸균하는 멸균단계(S140)를 수행하여 상기 비강 세정용 조성물의 유효성분으로 포함되는 지하 염수를 수득하게 된다. 상기 멸균단계는 UV조사에 의한 멸균 과정일 수 있으나, 멸균 방법의 제한을 두는 것은 아니다.

한편 상기 멸균단계는 상기 지하 염수를 최종적으로 수득하는 단계에서 수행되는 것으로 설명하였으나, 상기 취수단계 후 수행되거나, 상기 여과단계 후 수행될 수도 있으며, 각 단계를 수행한 후에 여러 번 수행될 수도 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

[ 제조예 ] 탈염 처리된 지하 염수의 제조

제주도 서귀포시 표선면에서 지하 150m를 굴착하여 지하 130m에서 취수한 원수를 5㎛ 이하의 여과막을 이용하여 부유물 및 이물질을 제거한다. 상기 여과된 수용액을 전기투석장치를 이용하여 탈염하였다. 탈염시 이온교환막으로 전극 간에 직류를 가해서 선택적인 이온교환을 일으켜 1가 양이온 및 2가 음이온을 제거하였다. 이렇게 전기투석장치를 이용하여 탈염한 지하 염수를 강한 자외선을 방출하는 자외선 유수살균기에 통과시켜 살균하는 과정을 거쳐 최종적으로 탈염 처리된 지하 염수를 얻었다.

실험예 1. pH에 따른 코 점막층에서 리소자임 발현 증가 시험

1. 코점막층 상피세포의 배양

사람 코 점막층의 상피세포(Human Normal Nasal Epithelial Cells)는 ABM(Applied Biological Materials Inc.)로부터 구입하여 사용하였으며, 하기에 기술하는 방법에 의해 진행되었다.

배양 용기에 세포를 부착시키기 위해 10,000-15,000 cells/cm² 의 코 점막 층 상피세포를 Cell Extracellular Matrix(ECM)가 코팅되어 있는 PriCoat™ T25 플라스크 (abm, Cat. No. G299)를 사용하여 배양하였다. 여기서 사용된 배양액은 기본배지로 Prigrow I medium (ABM, Cat. No. TM001)를 사용하였으며, fetal bovine serum(FBS)를 최종농도 10%, 그리고 Penicillin/Streptomycin를 최종농도 1% 되도록 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양을 해주었다.

2. 약물처리에 의해 리소자임 발현 증가

1) 리소자임 발현 측정

24시간동안 배양된 세포의 상층액에서 리소자임의 양을 immunoblotting으로 정량하였다. 리소자임(Sigma, U.S.A.)을 표준으로 사용하였으며 리소자임에 대한 일차항체로는 다크론항체인 rabbitanti-serum항체(1：1000, Dako, Capenteria, U.S.A.)를 사용하였다. 나이트로셀룰로즈막에 적용하여 일차항체와 반응시킨 후 horse-radish peroxidase conjugated goat antimouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG에 반응시켰으며, chemiluminescence (ECL kit, Amersham, Buckingamshire, U.K.)로 발색시켰다. Standard curve를 선형회귀분석을 이용하여 그린 후 각 검사물의 발색정도와 비교하여 그 양을 정량하였다. 실험결과를 평균±표준편차로서 나타냈으며, 통계학적 처리는 Student t-test로 하였다.

2) 리소자임 유전자 발현 변화 측정

RNA를 분리하기 위하여, 먼저 코점막 상피세포를 18 시간 전 배양하고 시험 약물을 처리하여 24시간 배양하였다. 총 RNA 추출은 TRI-시약(reagent)(MRC)을 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI-시약을 500 ㎕ 첨가하여 균질화한 후, 클로로포름을 첨가하여 원심 분리시킨 다음, 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리시켜 RNA를 침전시키고 75 %의 DEPC 처리된 에탄올로 세척한 후, 건조시켜 DEPC 처리된 증류수에 녹인 다음, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280 nm의 비율이 1.7∼1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 리보뉴클레아제-프리(RNase-free)한 조건 하에서 이루어졌다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)은 합성된 cDNA로부터 lysozyme 유전자를 증폭시키기 위하여 2 ㎕ cDNA, 4 μM의 5′와3′프라이머, 10x 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 0.1 % Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM 염화마그네슘(MgCl₂), 1 단위 태그 폴리머라아제(Taq polymerase)(Promega, USA)를 섞고 증류수(distilled water)로 전체를 25 ㎕로 맞춘 다음 유전자증폭기(BIO-RAD, Gene Cycler, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다.

Oligonucleotide primers는 이미 발표된 유전자 배열에 의거하여 human lysozyme (Gen bank accession #J03801, 5' primer：CTCTCAT-TGTTCTGGGGC；3' primer：ACGGACA ACCCTC-TTTGC)으로 만들어 사용하였다.

3. 시험결과 및 해석

1) 리소자임 단백질 발현 증가

	pH	리소자임 단백질 발현량 (㎍/10⁶cells)
대조군	-	7.6±2.3
실시예 1	7.5	9.78±3.4
비교예 1	5.5	7.84±3.8
비교예 2	8.3	7.54±1.2

상기 표 1을 살펴보면, 사람 코 점막층의 상피세포에 약물을 처리하여 일정시간 배양하고, 상층액 내로 분비된 리소자임의 양을 정량한 결과, pH가 7.5인 실시예 1을 처리한 상피세포에서 10⁶세포당 9.78±3.4 ㎍으로 가장 높았다.

2) 리소자임 유전자 발현 증가

사람 코 점막층 상피세포에 약물을 처리하여 일정시간 배양하고, 세포내 리소자임 유전자 발현정도를 측정한 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2를 참조하면, pH 7.5인 실시예 1이 pH 5.5인 비교예 1과 pH 8.3인 비교예 2에 비하여 리소자임 발현이 뚜렷하게 증가함을 확인할 수 있다.

위의 pH에 따른 코점막층 상피세포의 리소자임 단백질 발현 및 유전자 발현 결과를 보면, 산성이나 염기성인 비교예 1과 2보다는 중성에 가까운 pH 7.5인 실시예 1에서 리소자임의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 이로부터 pH 7.5에서 라이소좀(lysosome)에서 분비하는 효소인 리소자임의 발현이 증가되어 호흡기인 코 속으로 들어온 세균에 대한 항균 기능을 향상시킬 수 있음은 자명할 것이다.

실험예 2. pH에 따른 리소자임 활성 효과

1. Standard curve

리소자임의 농도는 리소자임이 Micrococcus lysodeikticus 박테리아의 세포벽을 파괴하는 원리를 이용한 turbidimetric assay를 이용 측정하였다. M. lysodeikticus(0.3 mg/ml), sodium azide(1 mg/ml) 및 bovineserum albumin(BSA：1 mg/ml)을 포함하는 PBS에 하비갑개 배양액을 넣어 상온에서 3시간 반응시킨 후 ELISA판에 옮겨 450 nm의 파장에서 광학밀도를 측정하였다. 리소자임의 농도는 egg white 리소자임(1.6~100 ng/ml)으로 standard curve를 얻어 측정하였다.

2. 활성 평가 방법

20-30대 비염환자를 실험군별 각 5명씩 20명을 선별하였으며, 피검자가 앉은 자세에서 먼저 비강 내를 등장성 식염수로 세정한 후에 흡입기로 조심스럽게 청소하였으며, 실험군별로 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 용액을 한 쪽 비강에 5 ml의 10초간 유지하여 배출 후 3분 후에 동측 비강을 5 ml의 등장성 식염수로 세정하여 다음검사를 위해 모아 두었다. 반대측 비강을 같은 방법으로 비강 세정액을 따로 모았다. 각각의 세정액에서 점소, 리소자임, 총 단백, 알부민을 측정하였다. 이 중 총 단백과 알부민은 일부에서만 측정하였고 세정한 반대측의 비강 세정액은 점소와 리소자임만을 측정하였다. 점소 및 리소자임은 하비갑개 배양액에서 측정방법인 ELLA, turbdimetric assay 방법을 각각 사용하였고 총 단백은 Cobas Mira®(Roche-BM, Switzerland)을 이용하여 pyrogallo red method 으로, 알부민은 Cobas Integra800®(Roche-BM, Switzerland)을 이용하여 immune turbidimetric method로 측정하였다. 실험결과는 Stat View 5.0 통계 분석 프로그램으로 하였다.

3. 평가 결과

pH	5.5	7.5	8.3
mucin	173.65	258.63	227.95
lysozyme	203.75	240.29	197.15
단위: ng/mL

상기 표 2를 살펴보면, pH에 따라 점소 및 리소자임의 농도가 변화함을 알 수 있다. 특히 pH 7.5에서 점소와 리소자임의 농도가 가장 높게 측정되었으며, 이는 코 점막층의 리소자임은 중성에서 높은 활성을 나타내며, 특히 pH 7.5에서 가장 높은 활성을 나타내었다.

pH	5.5	7.5	8.3
protein	8.05	11.5	8.38
Albumin	7.21	6.54	7.78
단위: ng/mL

상기 표 3을 살펴보면, 총 단백의 경우 pH 7.5에서 가장 높은 증가를 보였으나, 알부빈의 경우는 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

비강 세정에 따른 점막층의 점액선 및 혈관에 대한 영향은 pH에 따라 점소, 리조자임의 분비 증가 정도에 따라 관찰할 수 있었다.

비록 10초간의 짧은 시간 동안 비강 세정시 자극이 이루어진 점을 고려하더라도, 위의 실험결과를 보면, 점소 및 리자자임을 측정한 결과로부터 일관성 있게 pH 7.5 용액에서 증가함이 관찰되었다. pH별 리소자임 단백질 발현과 유전자 발현 결과를 비교하였던 실험예 1과 종합해 본다면, 가장 높은 활성도를 나타내는 pH 7.5 하에서 항균활성이 가장 높을 것을 예측할 수 있다.

실험예 3. 비염 및 부비동염 증상 개선 효과

1. 시험법 및 평가지수

20-30대 비염환자를 실험군별 각 5명씩 선별하였으며, 1일 3회씩(기상시, 오후 2시, 취침전) 머리를 숙이고 시험액 10mL를 한쪽 콧구멍 안에 주입하여 비강을 통해 반대쪽 콧구멍을 통해 흘러나오도록 하였으며, 다시 동일한 방법으로 반대쪽 콧구멍을 통해 비강을 세정하였다. 이와 같은 방법으로 10일간 비강 세정을 수행한 후, 피험자들이 느끼는 개선된 상태의 정도를 표 4의 평가지수에 따라 평가하였다.

점수	척도	기준
1	전혀 개선 없음	코막힘과 코건조함, 재채기가 아주 심함
2	20% 정도 개선	코막힘과 코건조함, 재채기가 자주 발생함
3	50% 정도 개선	코막힘과 코건조함, 재채기가 가끔 발생함
4	80% 정도 개선	코막힘과 코건조함, 재채기가 거의 없음
5	완전히 개선됨	코막힘과 코건조함, 재채기가 완전히 사라짐

2. 평가결과

No.	실시예 1(pH 7.5)	비교예 1(pH 5.5)	비교예 2(pH 8.3)
1	4	1	4
2	5	2	3
3	4	1	3
4	4	3	5
5	4	2	3
평균	4.2	1.8	3.2

상기 표 5를 살펴보면, 본 발명에 따른 비강 세정용 조성물은 코막힘과 코건조함 등 비염과 부비동염 증상에 대한 개선 효과는 4.2로 pH 5.5인 비교예 1과 pH 8.3인 비교예 2에 비하여 개선 효과가 현저히 높음을 확인할 수 있다.

상기 실험예 1 내지 3을 종합하여 보면, 본 발명의 pH 7.5인 비강 세정용 조성물은 비염과 부비동염의 치료 및 개선 효과뿐 아니라 리소자임의 활성화에 의한 항균 기능도 있음을 알 수 있다.

이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예 및 실험예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

pH가 6.8 내지 7.8 인 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지하 염수는 제주도 지하 100 내지 200m를 굴착하여 취수한 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지하 염수는 삼투압농도가 900~1100 mOsmol/kg이고, 나트륨(Na) 9500~10500 mg/L, 칼륨(K) 300~600 mg/L, 칼슘(Ca) 300~600 mg/L, 마그네슘(Mg) 1100~1500 mg/L, 염소(Cl) 15000~17000 mg/L를 함유하는 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 지하 염수는 게르마늄(Ge), 브롬(Br), 철(Fe), 아연(Zn), 망간(Mn), 셀레늄(Se), 바나듐(V), 및 스트론듐(Sr)을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지하 염수는 화산암반층에 의해 해수가 해양에서 육지로 정화 및 여과 처리된 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지하 염수는 탈염 처리된 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 지하 염수는 코 점막층의 리소자임 활성에 의한 항균 기능을 개선시키는 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 비강 세정용 조성물은 액상 또는 스프레이용 제제인 것을 특징으로 하는 비강 세정용 조성물.
pH가 6.8 내지 7.8인 지하 염수를 유효성분으로 포함하는 비염 또는 부비동염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물.