KR20180124014A - Ebv-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용 - Google Patents

Ebv-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20180124014A
KR20180124014A KR1020187019162A KR20187019162A KR20180124014A KR 20180124014 A KR20180124014 A KR 20180124014A KR 1020187019162 A KR1020187019162 A KR 1020187019162A KR 20187019162 A KR20187019162 A KR 20187019162A KR 20180124014 A KR20180124014 A KR 20180124014A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ala
ser
gly
arg
val
Prior art date
Application number
KR1020187019162A
Other languages
English (en)
Inventor
아르나우드 쉔
베노이트 가마인
스테파니 강나르드
Original Assignee
인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸)
유니베르시떼 빠리 디데롯- 빠리 7
인스티튜트 네셔널 트랜스퓨전 생귄
쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸), 유니베르시떼 빠리 디데롯- 빠리 7, 인스티튜트 네셔널 트랜스퓨전 생귄, 쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스) filed Critical 인스티튜트 내셔널 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰 메디칼르 (인 썸)
Publication of KR20180124014A publication Critical patent/KR20180124014A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A61K39/25—Varicella-zoster virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C07K16/205—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6025—Nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16271—Demonstrated in vivo effect
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 원치 않는 표적 세포 및/또는 미생물에 대한 EBV-존재 면역 반응을 전환 (redirecting) 하기에 유용한 면역원성 컨스트럭트, 상기 컨쥬게이트를 제조하는 방법, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 약학 응용, 및 그의 의약 응용과 일반적으로 관련된다.

Description

EBV-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용
본 발명은 원치 않는 표적 세포 및/또는 미생물에 대한 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-존재 면역 반응을 전환 (redirect) 하기에 유용한 면역원성 컨스트럭트 (construct), 상기 컨쥬게이트 (conjugate)를 제조하는 방법, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 약학 응용, 및 그의 의약 응용과 일반적으로 관련된다.
면역 치료는 암, 감염성 질환 및 신경퇴행성 질병과 같은 병리 이상에 대항하기 위한 신체의 면역 반응을 조절 (즉, 유도, 향상 또는 억제) 하기 위한 치료 유형이다. 지난 25년간, 질병에 걸린 세포 및/또는 병원체를 특이적으로 인식하고, 더 나은 면역 반응을 유도함으로써 또는 직접적인 세포독성의 방식으로 상기 원치 않는 성분의 제거를 유발할 수 있는 면역원성 제제를 설계하기 위하여 많은 노력이 이루어져 왔다. 이러한 목적을 위해 단백질 및 항체와 같은 많은 표적-결합 제제가 개발되어 왔으며, 이러한 제제는 세균성 독소 또는 방사성 화합물 등과 같은 다른 활성 제제와 결합될 수 있다.
상기 제제의 이점 중 하나는 그들의 표적에 대한 그들의 특이성인데, 이는 이 제제가 잠재적인 부작용을 최소화할 뿐만 아니라, 표적의 제거를 최대화할 수 있기 때문이다. 이와 관련하여, 항체, 특히 단일클론 항체 (mAb) 및 VHH, Fab 또는 scFv와 같은 항체 단편에 대한 관심이 최근에 늘어나고 있는데, 이는 이들이 표적 세포 상의 단일 분자 부위 또는 에피토프를 인식할 수 있는 능력을 가지기 때문이다.
많은 치료용 단일클론 항체의 주요 작용 기작 중 하나는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 의존한다. 안타깝게도, 치료용 mAb에 대한 분차 반응은 문헌에서 보고되어 왔으며, 적어도 Fc 수용체 유전자 서열 내 특정 다형성과 적어도 일부는 연관되는 것으로 생각된다. Fc 수용체에 대한 친화력은 효과적인 세포 반응을 촉진하는데 매우 중요하므로, 이는 임상적 맥락에서의 사용을 매우 제한한다.
그에 반해, VHH, Fab 및 scFv는 정확히는 Fc 영역이 없기 때문에, ADCC, 옵소닌 식작용 및/또는 보체 활성화와 같은 임의의 Fc 효과기 기능을 매개할 수 없다. 따라서 이러한 단일 사슬 항체 내 Fc 사슬의 조작이 Fc 효과기 기능을 획득하기 위하여 요구된다. 그러나, 이러한 조작은 번거로우며 작은 세포강 및 빈틈 (cellular cavity and cleft) 내 존재하는 잠재적인 에피토프의 접근성을 감소시킬 수 있다.
따라서 업계에서는 상기 논의된 한계를 극복할 수 있는 대안적인 면역원성 제제를 발굴하고자 하는 요구가 있다.
여기서 본 발명자들은 특정 세포 및/또는 미생물을 표적하는 항체에 결합하는 EBV B-세포 항원이 상기 원치 않는 표적을, 보다 구체적으로 옵소닌 식작용을 통해 제거하는 면역 반응을 생체내 유발할 수 있음을 예기치 않게 발견하였다. 놀랍게도, 항체에 Fc 영역이 없는 경우 이러한 반응이 심지어 나타날 수 있다. 이는 아마도 상기 EBV 항원에 의해 발휘되는 간접적 효과기 기능 덕분에 가능할 것이다. 표적-결합 항체에 결합될 때 상기 능력을 보이는 특정 EBV B-세포 항원, 그리고 보다 구체적으로 상기 항원의 C-말단 내 특정 영역이 본 발명자들에 의해 추가로 확인되었다.
따라서, 본 명세서에 개시된 발견을 토대로, 본 발명은 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티 (moiety)를 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) B-세포 항원을 포함하는 면역원성 컨쥬게이트, 상기 컨쥬게이트를 제조하는 방법, 상기 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물, 및 관련 치료용 응용을 최초로 제공한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 학술적 그리고 기술적 용어는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 의미를 가질 것이다. 나아가, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 명명법, 및 분자 생물학, 생화학, 화학, 면역학 및 약학 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며 흔히 사용되는 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다 (특히 이를 참조한다: Molecular cloning: A laboratory manual 4th edition by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 2012; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2012; Kuby Immunology by Owen et al., 7th ed., Macmillan Education, 2013; Immunology Methods Manual vol. 1-4 by Lefkovits, Academic Press, 1996; Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation by Wong and Jameson, 2nd ed., CRC Press, 201 1 ; The Immunoassay Handbook by Wild et al., 4th ed., Elsevier, 2013; Bioconjugate techniques by Hermanson, 3rd ed., Elsevier, 2013).
본 발명에 의해 제안된 면역원성 컨쥬게이트는 EBV에 체액성 면역 반응을 나타내는 이를 필요로 하는 개체에서, 특정 원치 않는 표적 세포 또는 미생물의 제거에 대한 면역 반응을 전환하기 위해 사용될 수 있다. EBV에 대한 체액성 면역 반응 중, EBV에 대해 존재하는 체액성 반응은 개체의 EBV 최초-감염에서 흔히 관찰될 수 있는 반면, EBV에 대한 기존의 체액성 반응은 상기 바이러스에 대한 개체의 최초-감염 이후의 EBV 잠재성, 만성 감염에서 흔히 관찰될 수 있다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은:
i) 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티; 및
ii) 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) B-세포 항원을 포함하는 면역원성 컨쥬게이트에 관한 것이다.
용어 "면역원성"은 본 명세서에서, 개체에 투여될 때 면역 반응을 생체내 제거하는 능력을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 개체에 투여되면 본 발명의 컨쥬게이트에 의해 이렇게 직접적으로 유발되는 상기 면역 반응은, 보다 구체적으로 표적 세포 또는 미생물에 대한 옵소닌 식작용, 및/또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존적 보체 활성화 (및 그 이후의 보체-의존적 세포독성 (CDC))에 의한 표적의 용해를 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 명세서에서 상기 면역 반응은 표적 세포 및/또는 미생물의 옵소닌 식작용을 특징으로 한다. 상기 면역 반응은 보다 구체적으로, i) 개체 내 존재하는 원치 않는 표적 세포 및/또는 미생물에 대한 모이어티의 결합, 및 ii) EBV에 대해 체액성 면역 반응을 보이는 개체의 항체에 의한 EBV B-세포 항원의 면역 인식 (즉, 결합) 덕분에 일어난다. 하기 추가로 설명되는 것과 같이, 상기 면역 반응은 본 명세서에서 MHC 분자, 또는 임의의 TCR (T-세포 수용체)의 관여를 직접적으로 포함하지 않는 체액성 반응 (즉, B-세포 반응)이다.
용어 "옵소닌 식작용"은 본 명세서에서 원치 않는 성분 (본 명세서에서, 표적 세포 및/또는 미생물)이 개체 내에서 대식세포와 같은 자연의 식세포에 의해 섭취되거나 제거되는 과정과 관련된다. 이러한 과정은 원치 않는 성분에 복합된 (즉, 결합된) 대상 항체에 대한 식세포 Fc 수용체의 결합과 교차-결합에 의해 흔히 시작되며, 이로 인해 면역 복합체를 형성하고, 이는 결국 상기 원치 않는 성분의 식작용을 초래하는 신호-전달 경로를 유발한다.
용어 "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 본 명세서에서, 원치 않는 성분 (본 명세서에서, 표적 세포 및/또는 미생물)이 자연 살해 세포, 호중구, 대식세포 및/또는 호산구와 같은 Fc 수용체를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포 (효과기 세포로도 알려져 있음)에 의해 개체 내 제거되는 과정과 관련된다. 이러한 과정은 일반적으로 원치 않는 성분에 복합된 (즉, 결합된) 대상 항체에 대한 상기 세포 Fc 수용체의 결합에 의해 개시되며, 이는 결국 상기 원치 않는 성분의 용해를 유발한다.
용어 "항체-의존적 보체 활성화" 또는 "고전적 보체 경로"는 본 명세서에서 원치 않는 성분 (본 명세서에서, 표적 세포 및/또는 미생물)이 막공격 복합체 (MAC) (말단 보체 복합체, 즉, TCC로도 알려져 있음)에 의해 개체 내 제거되는 과정과 관련된다. 이러한 과정은 일반적으로 혈장 내 존재하는 C1 보체 및 원치 않는 성분에 복합된 (즉, 결합된) 대상 항체의 결합에 의해 개시되며, 결국 상기 C1 보체를 활성화하고, 원치 않는 성분의 막에 큰 공극을 형성하는 막공격 복합체의 형성을 분자 연속반응 (cascade)이 궁극적으로 이끌어 원치 않는 성분의 용해가 나타나도록 유도한다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트가 면역원성인지 여부를 검사하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다.
사실, ii) 개체의 항체에 대한 EBV B-세포 항원의 결합, 그리고 i) 표적 세포/미생물에 대한 모이어티의 결합 각각은, 이에 제한되는 것은 아니나, ELISA (효소-결합 면역흡착 어세이), 웨스턴-블롯, 면역형광 어세이, 유세포 계수법 또는 표면 플라스몬 공명 (The Immunoassay Handbook by Wild et al., 4th ed., Elsevier, 2013)과 같은 당업계의 통상적인 기술을 이용한 EBV B-세포 항원-결합 어세이 및 모이어티-결합 어세이의 설계에 의해 특히 평가될 수 있다.
그 외에, 옵소닌 식작용, ADCC 및 항체-의존적 보체 활성화는 문헌 [Chan et al. (2012), Jian et al. (2011) 및 Harboe et al. (2011)]에 특히 기술된 것과 같이, 통상적으로 당업계에서 사용되는 면역학적 어세이에 의해 평가될 수 있다. 이하의 실시예는 옵소닌 식작용, ADCC 및 항체-의존적 보체 활성화뿐만 아니라 표적 및 항원 결합을 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 추가로 제공한다.
용어 "컨쥬게이트"는 본 명세서에서 모이어티 및 EBV B-세포 항원이 다른 하나에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 커플링된다는 것을 의미한다. 이러한 커플링은 임의의 생물학적 또는 생리화학적 수단의 방식에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 그럼에도 불구하고 이러한 커플링은 가장 바람직하게는 생체내 적용을 위한, 예를 들어 공유 결합의 방식에 의한 안정된 커플링으로 이해될 것이다. 사실, 투여 방식 및 개체에 컨쥬게이트를 전달하기 위해 사용된 약학적 담체에 따라, 일부 결합은 위장과 같은 특정 생리학적 환경을 견디기 위한 다른 결합과 알맞지 않을 수 있다. 적합한 커플링은 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 보체 활성화가 일어나기 위해 더 중요한데, 그 이유는 세포 및/또는 미생물 및 EBV B-세포 항원을 표적하는 모이어티가 예를 들어 상기 모이어티 및/또는 상기 항원 간의 결합의 절단 때문에 생체내 다른 모이어티의 근처에 있지 않다면, 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 보체 활성화가 조정될 수 있기 때문이다.
따라서, 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 면역원성 컨쥬게이트를 제공하는 것이며, 상기 표적-결합 모이어티는 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원에 공유적으로 커플링된다. 더욱 바람직하게, 상기 표적-결합 모이어티는 상기 모이어티가 특히 생체내 상기 항원으로부터 비-절단성이라는 단서하에 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원에 공유적으로 커플링된다. 예를 들어, 모이어티 및 항원을 연결하는 공유 결합은 프로테아제 절단 부위와 같은 절단 부위를 포함하지 않는다.
더욱 바람직하게, 상기 표적-결합 모이어티는 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원에 공유적으로 직접 커플링된다. 즉, 이러한 컨쥬게이트의 성분은 임의의 링커를 통해 커플링되지 않는다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 면역원성 컨쥬게이트는 i) 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티, 및 ii) 엡스타인-바 바이러스 (EBV) B-세포 항원으로 이루어진다고 한다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 융합 단백질을 형성할 수 있다.
또는, 상기 표적-결합 모이어티는 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원에 공유적으로 그리고 간접적으로 커플링될 수 있다. 즉, 이러한 컨쥬게이트의 성분은 링커를 통해 커플링된다. 사실, 선택된 링커의 성질에 따라, 컨쥬게이트의 구조 탄력성, 그의 안정성 및/또는 가용성이 개선될 수 있으며, 두 성분을 커플링하는 링커의 존재는 컨쥬게이트의 면역원성 능력을 변화시키지 않는다는 것이 본 발명자들에 의해 관찰되었다.
"링커" 또는 "스페이서"는 본 명세서에서, 합성 또는 천연의, 2개의 분자를 다른 하나에 커플링시킬 수 있는 화학적 또는 생물학적 제제를 의미한다. 화학적 링커는 당업계에 잘 알려져 있으며 일반적으로 다양한 길이의 폴리머 사슬로 구성되고, 동일한 또는 동일하지 않은 반응기와 동종 또는 이종인 이작용기 (bifunctional)일 수 있으며, 적어도 하나의 원자, 바람직하게는 적어도 하나의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 이에 반해, 생물학적 링커는 다양한 길이의 핵산(들) 및/또는 아미노산 서열(들)로 일반적으로 구성되며, 적어도 하나의 핵산 및/또는 아미노산을 포함한다. 상술한 바와 같이, 상기 커플링은 본 명세서에서 안정적이고, 즉, 링커는 공유적으로 성분 i) 및 ii)에 결합하며 바람직하게는 (자체로) 특히 생체내 비-절단성이다. 보다 더 바람직하게, 상기 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. 이러한 링커 및 분자, 특히 단백질의 커플링 방법은 문헌, 특히 Chen et al. (2013)과 문헌 [Thermo Scientific: Crosslinking Technical Handbook (2015)]에 널리 기술되어 왔으며, 따라서 당업계의 통상의 기술자에 의해 쉽게 선택되고 설계될 수 있다. 링커는 2 내지 10개의 성분 당을 일반적으로 함유하는 탄수화물 폴리머 (예: 단순당 또는 단당류)로부터 또한 선택될 수 있다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 화학적 링커는 이에 제한되는 것은 아니나, 몇 가지만 예를 들면 아민-반응성 링커 (NHS 에스테르, 이미도에스테르), 카르복실-내지-아민 반응성 링커 (카르보디이미드), 술프히드릴-반응성 링커 (말레이미드, 티오술포네이트), 알데히드 반응성 링커 (히드라지드, 알콕시아민), 광-반응성 링커 (디아지린, 아릴아지드), 히드록실-반응성 링커 (이소시아네이트), 및 아지드-반응성 링커 (포스핀)를 포함한다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 생물학적 링커는 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리프롤린 (P)n (n은 보통 2 내지 8을 포함하는 정수이다) (서열번호 1), 폴리글리신 (G)n (n은 보통 6 내지 8을 포함하는 정수이다) (서열번호 2), 글리신-세린 링커 (GGGGS)n (n은 2 내지 6 (서열번호 85), 또는 2 내지 5 (서열번호 3)와 같이 보통 2 내지 10을 포함하는 정수이다 (서열번호 84)), A(EAAAK)nA (n은 2 내지 5를 보통 포함하는 정수이다) (서열번호 4)와 같은 α-나선-형성 펩티드 링커, 및 프롤린-알라닌 링커 PAPAP (서열번호 5) (Chen et al., 2013)를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 생물학적 비가역적 링커는 (GGGGS)n=6 (서열번호 86), (GGGGS)n=5 (서열번호 6), 또는 유리하게는 (GGGGS)n=4 (서열번호 7)와 같은 글리신-세린 링커 (GGGGS)n=2 내지 10 (서열번호 84)이다.
본 명세서에서 "표적-결합 모이어티" 또는 "표적화 모이어티"로 축약되는, "표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티"는 관심있는 세포 및/또는 미생물에 친화력을 보이며, 이에, 특히 그 표면에 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 관심있는 표적에 대한 분자의 친화력은 문헌 [The Immuno어세이 Handbook by Wild et al., 4th ed., Elsevier (2013)]에 특히 기술된 해리 상수 Kd 및/또는 결합 상수 Ka를 측정하여 평가될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 결합은 바람직하게는 상기 세포 및/또는 미생물에 특이적이며, 다시 말하면, 모이어티는 다른 표적에 결합할 수 없다 (즉, 다른 표적에 친화력이 없거나 매우 적다).
면역원성 컨쥬게이트의 모이어티는 단백질성 또는 비-단백질성 특징을 가질 수 있다.
용어 "단백질성", "펩티드의" 및 폴리펩티드"는 본 명세서에서 길이 또는 번역후 변형(들)에 무관하게 펩티드 결합 (-NHCO-)으로 연결된 아미노산의 서열을 지칭하며, 이는 천연 유래 또는 합성일 수 있고, 세포 시험관내 및/또는 생체내에서 구조적 및/또는 기능적 역할을 수행할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 모이어티는 리간드-결합 단백질이다.
리간드-결합 단백질은 표적에 대한 높은 친화력과 선택성을 나타낼 수 있기 때문에 특히 흥미롭다. 그 외에, 무수히 많은 리간드-결합 단백질은 이미 자연에서 입수가능하며 또한 재조합 기술에 의해 쉽게 설계, 조정, 및/또는 제조될 수 있다.
용어 "리간드-결합 단백질"은 본 명세서에서 분자 (즉, 리간드)에 결합할 수 있는 임의의 천연 또는 합성 단백질을 포괄한다. 즉, 본 발명의 맥락에서, 상기 단백질은 표적 세포 및/또는 미생물의 표면 상에 발현되는 리간드에 결합한다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 리간드-결합 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, 항체, 그의 결합 단편, 항체 모방체(antibody mimetic), 세포-표면 수용체, 세포-표면 리간드, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
리간드-결합 단백질 중, 항체, 그의 유도체 및 유사체는 다른 것들 중에서도 매우 특이적인 표적에 대한 친화력 (보통 나노몰 범위로), 연장된 안정성 (최대 7개월까지)을 보이며, 통상적인 재조합 공학 기술에 의해 쉽고 빠르게 제조될 수 있으므로, 특히 유리하다.
보다 정확하게, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 본 명세서에서 특이적으로 항원을 인식할 수 있는 단백질을 지칭한다. 이를 위해, 항체의 파라토프는 항원의 에피토프와 상호작용한다. 전체 항체는 4개의 폴리펩티드 (2개의 전장 경쇄 및 2개의 전장 중쇄)로 이루어지며, 이들은 다른 하나와 Y-형 단백질을 형성하는 이황화결합에 의해 결합된다. 각 중쇄는 불변 영역 (CH1), 힌지 영역, 및 2 또는 3 이상의 불변 영역 (CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)에 이어 하나의 가변 (VH) 영역을 포함하는 반면, 각 경쇄는 하나의 가변 (VL) 및 하나의 불변 (CL) 영역을 포함한다. 항체는 각 항체에 특이적이며 "Y"의 각 끝에 위치한 소위 가변 영역 (이는 항원 결합 부위로 표시된다)을 통해 그의 상응하는 항원을 특이적으로 인식하는 반면, 항체가 면역 반응을 유도하는 능력은 "Y"의 맨 아래에 위치한 Fc 영역에 의해 매개된다. 포유류에서, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG로 알려진 5개의 주요 아형으로 나뉘어지며, IgG는 다시 4개의 서브타입 (인간에서는 lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4)으로 나뉘어진다. 용어 "항체"는 본 명세서에서 단가-, 이가- 및 다가-항체 (즉, 1 또는 2개의 항원 결합 부위를 갖는)를 비롯하여, 단일 및 다클론 항체 (즉, 하나의 또는 상이한 B 세포 클론에 의해 제조됨), 단일-, 이중- 및 다중-특이적 항체 (즉, 1 이상의 항원에 결합하는)를 포괄하도록 의도된다. 본 발명의 목적을 위하여, 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 항체는 바람직하게는 단일클론 및 단일특이적이다. 뿐만 아니라, 상기 항체는 바람직하게는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법 (Immunobiology by Janeway et al., 5th edition, Garland publishing, 2001 ; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic by An et al., Wiley editions, 2009)에 따라 인간화된 것이다.
항체 단편은 본 명세서에서 전체 항체보다 선호되는데, 이는 이들이 작은 크기 덕분에, 낮은 생산 가격뿐만 아니라 보다 큰 가용성, 조직 침투성 (특히 고체 조직), 및 열 및/또는 효소에 대한 안정성을 나타내기 때문이다.
용어 "항체 단편" 또는 "항체-결합 단편"은 보다 구체적으로 상기 정의된 항체의 항원-결합 기능을 적어도 보유하는 단편을 지칭한다. 당업계에서 잘 알려진 항체 단편의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니나, Fab 항체, Fab' 항체, F(ab')2 항체, Fv 항체, 단일 사슬 항체 (scFv), 중쇄 항체 (HCAb) 특히 단일 영역 항체 (sdAb) 및 그의 임의의 조합이 포함된다.
Fab (단편 항원 결합) 항체는 항원 결합 부위 (파라토프)와 함께, 각 중쇄 및 경쇄의 하나의 가변 영역, 경쇄의 불변 영역, 및 중쇄의 제1 불변 영역 (CH1)으로 이루어진다. Fab'은 적어도 하나의 시스테인 잔기를 중쇄의 CH1 영역의 C-말단에 더 포함한다는 점에서 Fab와 구별되는 반면, F(ab')2는 힌지 영역의 시스테인 잔기 사이의 이황화결합을 가지는 2개의 Fab' 분자로 이루어진다. Fv (변이 단편) 항체는 각 중쇄 및 경쇄의 하나의 변이 영역으로 구성되는 반면, 단일 사슬 Fv (scFv) 항체는 중쇄 및 경쇄의 각 변이 영역이 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 Fv로 이루어진다. 마지막으로, 낙타와 상어에서 처음 확인된 중쇄 항체 (HCAb)로부터 유래되어 영역 항체, 단일-영역 항체 또는 나노바디라고도 알려진 (그리고 낙타로부터 생산되는 경우 VHH로 약칭되며, 상어와 같은 연골 어류로부터 생산되는 경우 IgNAR 또는 VNAR로 약칭되는) 단일 영역 항체는 오로지 항체의 중쇄의 변이 영역에 대응하며, 모 (parent) 항체의 본래의 특이성 및 결합 친화력을 포함하는 오늘날까지 가장 작은 항체 단편이다.
예를 들어 전체 항체를 프로테아제로 처리하거나 (예: 전체 항체를 파파인 또는 펩신으로 분해하여 Fab 또는 F(ab')2 각각을 생산할 수 있다), 유전자 재조합 기술의 방식으로 (예: scFv 또는 VHH의 분자 설계 및 정제에 의하여) 모 항체로부터 이러한 단편을 생산하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다.
상기 언급된 항체 단편에 Fc 영역이 전혀 없을 수 있음에 보다 주목하여야 한다. 흥미롭게도, 이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, 이들의 Fc 영역의 결핍은 특히 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 항체-의존적 보체 활성화를 통해 표적을 제거하는 면역 반응을 생체내 유발하는 컨쥬게이트의 능력을 변화시키지 않는다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 항체 단편은 단일-영역 항체이다.
사실, 단일 영역 항체는 다른 항체와 비교할 때 뛰어난 물리-화학적 특성을 보이며, 그 중에는 더 작은 크기 (15 kDa)로 인한 보다 빠른 조직 침투성 및 잠재 에피토프를 인식하는 능력, 단일 유전자에 의해 코딩될 가능성 (이는 scFv에서 관찰되는 것과 같이 그의 가공을 용이하게 하고 부분 풀림 (unfolding)의 위험성을 제거함), 상온에 보관될 수 있는 능력, 높은 가용성, 및 낮은 면역원성 잠재력이 있다.
게다가, 이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, EBV B-세포 항원에 커플링된 단일 영역 항체는 그의 전체 기능성 및 그의 표적에 대한 특이성을 유지하는 반면, EBV에 의해 영향을 받거나 받아온 대상의 IgG에 의해 면역원성 컨쥬게이트가 매우 잘 인식되도록 하며, 이로 인해 특히 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 항체-의존적 보체 활성화를 통해 표적을 제거하는 면역 반응을 생체내 유발한다.
본 발명에 따른 대안적인 단백질성 모이어티는 항체 모방체로 표현된다. 용어 "항체 모방체", "항체 모방 스캐폴드", "항체-유사 스캐폴드", "비-항체 스캐폴드" 및 "비-면역글로불린 스캐폴드"는 구조적으로 항체와 관련이 없고 전체 항체에 비해 유전적으로 더 낮은 분자량을 가지는 인공적인 펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 따라서, 더 작은 크기 때문에, 항체 모방체는 항체 단편에 대해 상기한 것과 유사한 유리한 특성을 나타낸다. 본 발명에 따른 적합한 항체 모방체의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, ABD, 애드히론 (adhiron), 애드넥틴(adnectin)/모노바디, 애피바디 (affibody), 애필린 (affilin), 애피틴 (affitin)/나노피틴 (nanofitin), 애피머 (affimer), 알파바디 (alphabody), 안티칼린 (anticalin), 아르마딜로 (armadillo) 반복 단백질, 아트리머 (atrimer)/테트라넥틴 (tetranectin), 애비머 (avimer)/맥시바디 (maxibody), 센티린 (centyrin), DARPin, 피노머 (fynomer), Kunitz 영역, 오바디 (obody)/OB-폴드 (fold), 프로넥틴 (pronectin), 리피바디 (repebody), 트랜스바디 (transbody) 및 trimers X (Skrlec et al., 2015)가 포함된다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 항체는 다음과 같다:
- 적혈구의 더피 (Duffy) 항원/케모카인 수용체에 결합하는 항-DARC 항체, 그리고 더욱 바람직하게는 Smoralek et al. (2010)에 기술된 것과 같은 항-DARC 단일 영역 항체. 가장 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 항-DARC 항체는 서열번호 8 또는 서열번호 9, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
- 말라리아-관련 항원 VAR2CSA에 결합하는 항-VAR2CSA 항체, 그리고 더욱 바람직하게는 Nunes et al. (2014)에 기술된 것과 같은 항-VAR2CSA 단일 영역 항체. 가장 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 항-VAR2CSA 항체는 서열번호 10 또는 서열번호 11, 가장 바람직하게는 서열번호 11의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다;
- 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei)와 같은 감염성 미생물의 표면에 흔히 발현되는 주요 표면 항원인 변이성 표면 당단백질에 결합하는 항-VSG 항체, 그리고 더욱 바람직하게는 Conrath et al. (2005)에 기술된 것과 같은 항-VSG 단일 영역 항체. 가장 바람직하게, 상기 항-VSG 항체는 서열번호 12 또는 서열번호 13, 가장 바람직하게는 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다; 그리고
- 암 세포에 의해 흔히 과발현되는 분화클러스터 (Cluster of Differentiation) 20에 결합하는 항-CD20 항체, 더욱 바람직하게는 Otz et al. (2009), Liu et al. (1987) 또는 Olafsen et al.(2009)에 기술된 것과 같은 항-CD20 ScFv. 가장 바람직하게, 상기 항-CD20 항체는 서열번호 80의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 맥락에서, 항-VAR2CSA 항체를 포함하는 면역원성 컨쥬게이트는 말라리아를 치료하도록 의도되는 반면, 항-VSG 항체를 포함하는 컨쥬게이트는 트리파노소마감염증 (trypanosomiasis) (수면병 (sleeping sickness)으로도 알려져 있음)을 치료하도록 의도되고, 항-CD20 항체를 포함하는 컨쥬게이트는 암을 치료하도록 의도된다.
또는 세포-표면 수용체는 본 발명에 따른 리간드-결합 단백질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 말라리아 감염된 적혈구 (즉, 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)에 의해 감염된 적혈구)일 것이며/것이거나 표적 미생물은 플라스모디움 팔시파룸일 것이고, 특히 표적화-모이어티로 사용될 바람직한 세포-표면 수용체는 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 내피 세포 수용체를 포함한다: 단백질 C 수용체 (EPCR) (바람직하게는 서열번호 14의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 활성화된 단백질 C 수용체 또는 APC 수용체로도 알려져 있음), CD36 (Cluster of Differentiation 36), CD31 (Cluster of Differentiation 31 또는 PECAM-1), 세포간 부착 분자-1 (ICAM-1), 및 E-셀렉틴 (selectin). 사실, 당업계에 잘 알려져 있는 것과 같이, 플라스모디움 팔시파룸-감염된 적혈구의 내피 세포 수용체에 대한 세포부착 (cytoadhesion)은 중증 말라리아와 관련된다 (Aird et al., 2014). 따라서, 상기 언급된 임의의 내피 세포 수용체를 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 컨쥬게이트는 말라리아 감염된 적혈구에 결합하여 그의 제거를 유도할 것이다.
또는 세포-표면 리간드는 본 발명에 따른 리간드-결합 단백질로 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 암 세포일 것이며, 특히 표적화-모이어티로 사용될 바람직한 세포-표면 리간드는 이에 제한되는 것은 아니나, 황산 콘드로이틴 A (CSA) 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 플라스모디움 팔시파룸-유래 VAR2CSA 단편을 포함한다. 사실, 당업계에 잘 알려져 있는 것과 같이, CSA는 흔히 암 세포에 의해 과발현된다. 따라서, 임의의 VAR2CSA 단편을 포함하는 본 발명에 따른 면역원성 컨쥬게이트는 암 세포에 결합하여 그의 제거를 유도할 것이다. 특히 바람직한 VAR2CSA 단편은 Srivastava et al.(2011) 또는 Clausen et al.(2012)에 기술된 것과 같은 CSA 결합 영역을 포함하거나 더욱 바람직하게는, 서열번호 82의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 바람직한 실시양태에서, 표적-결합 모이어티는 비-단백질성이다. 사실, 본 발명에 따른 모이어티는 예를 들어 세포 표면 수용체에 결합함으로써 세포의 표면 및/또는 미생물의 표면에 결합할 수 있는 비-단백질성 리간드일 수 있다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 비-단백질성 모이어티는 이에 제한되는 것은 아니나, 엽산과 같은 비타민 (Zwicke et al., 2012), 갈락토오스 유도체와 같은 탄수화물 (Wu et al., 2002), 황산 콘드로이틴, 헤파린 또는 황산 헤파란과 같은 글리코사미노글리칸 (Vogt et al., 2003), DNA 또는 RNA 압타머와 같은 작은 핵산 (Estevez et al.,2010; Birch et al., 2015), 및 저분자 화합물을 포함한다.
특히, 엽산은 많은 암 세포의 표면에 많이 발현되는 엽산 수용체에 결합할 수 있는 반면, 일부 갈락토오스 유도체는 간세포 및 간암 세포 상에 발현되는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR)에 결합할 수 있고, 황산 콘드로이틴 및 황산 헤파란은 플라스모디움 팔시파룸에 감염된 적혈구의 표면에 결합할 수 있다.
DNA 또는 RNA 압타머 및 저분자 화합물과 관련하여, 이들은 SELEX (지수 증식에 의한 리간드의 계통적 진화) (Stoltenburg et al., 2007)와 같은 당업계의 통상적인 기술을 이용하여, 특이적으로 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하기 위하여 통상의 당업자에 의해 쉽게 설계될 수 있다.
그럼에도 불구하고 상기 단백질성 및 비-단백질성 표적화-모이어티의 예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 이에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 임의의 다른 적합한 표적화 모이어티는, 관심있는 세포 및/또는 미생물에 결합할 수 있는 능력을 보이는 한, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트에서 사용되는 항원은 엡스타인-바 바이러스로부터 분리된 B-세포 항원이다.
용어 "항원"은 본 명세서에서 개체에 투여되면 특정 환경에서 항체의 생성을 유도하여 면역반응을 생성할 수 있는 임의의 분자 (예: 핵산, 펩티드, 단백질, 다당류 등)를 나타낸다. 분자 수준에서, 항원은 면역 체계에 의해 인식되는 영역에 대응하는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개의 에피토프(들)를 특징으로 하며 보다 구체적으로는 순환 항체, B 세포 또는 T 세포 (오로지 막-결합 항체만으로는 아니나, 이로 구성된 B 및 T 세포 수용체)를 특징으로 한다. 용어 "B-세포 항원"은 B-세포 반응을 제거할 수 있는, 또는 다시 말하면, 면역 체계의 B-세포에 의해 상기 항원에 특이적으로 작용하는 항체를 생성 (체액성 반응으로도 알려져 있음)할 수 있는 상기 정의된 것과 같은 항원을 지칭한다. 따라서 이러한 B-세포 반응은 항원이 투여되는 개체의 혈장으로부터 IgG 역가와 같은 항체의 역가를 측정하여 검출할 수 있다. B-세포 항원의 에피토프는 대응되는 항체의 파라토프에 의해 인식되는 B-에피토프로 특징 지어진다.
본 발명의 목적을 위하여, B-세포 항원은 존재하는 또는 기존의 B-세포 (즉, 체액성) 면역 반응을, 본 발명의 컨쥬게이트가 투여되는 개체에서 이끌어낼 수 있다. 즉, 상기 항원은 개체의 B 세포가 이미 감작되어 있는 것이다. 보다 구체적으로, 상기 B-세포 항원은 엡스타인-바 바이러스로부터 기원되며 "EBV B-세포 항원" 또는 "엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원"과 같이 불려진다.
"인간 헤르페스 바이러스-4" 또는 "HHV4"로도 알려진 "엡스타인 바 바이러스" 또는 "EBV"는 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae)에 속하는 흔한 바이러스로, 전세계 인구의 95%를 감염시키며, 몇 개만 들자면 전염성 단핵구증 (infectious mononucleosis), 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma) 및 호지킨 림프종 (Hodgkin's lymphoma)을 포함하는 중증 질환에 관련되어 있다. 1차 감염에 이어, EBV는 발산 및 전염을 가능하게 하는 잦은 가벼운 바이러스 재활성화를 특징으로 하는 평생 지속되는 감염을 일으킨다. EBV 재활성화뿐만 아니라 1차 EBV 감염은 높은 항체 수준을 특징으로 하며, 대부분 세포 친화성 유형이다. EBV는 EBV 타입 1 및 EBV 타입 2이라는 2개의 주요 서브타입으로 나누어진다. 그의 감염된 숙주에서의 복제 동안, 상기 바이러스는 항체가 발생할 수 있는 무수한 항원 (즉, B-세포 항원)을 발현하며, 이는 LYDMA (림프구-결정 막 항원), EBNA (엡스타인-바 핵 항원), EMA (초기 막 항원), EA (초기 항원), LMA (후기 막 항원), 및 VCA (바이러스 캡시드 항원) 항원으로 분류된다. 이러한 분류의 항원은 그 자체로 하기의 수많은 항원을 포함한다: 예를 들어, EBNA 클래스는 EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, 및 EBNA-리더 단백질 (EBNA-LP)을 포함하는 반면; VCA 클래스는 항원 P18 (즉, BFRF3), P23 (즉, BLRF2), GP125 (즉, BALF4), P143 (즉, BNRF1), P150 (즉, BcLF1) 및 P40 (즉, BdRF1)을 포함한다.
본 명세서에서 본 발명자들은 엡스타인-바 바이러스 P18 및 P23 항원, 보다 구체적으로 상기 항원의 C-말단 근처에 및/또는 C-말단 내의 특이적인 영역이 상기한 것과 같이 표적-결합 모이어티에 결합되는 경우, 면역 복합체의 형성 및 그 이후의 상기 표적의 제거를, 보다 구체적으로 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 항체-의존적 보체 활성화를 통해 유도하는 생체내 체액성 (즉, B-세포) 면역 반응을 유발할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원은 서열번호 15 서열의 P18 항원, 서열번호 16 서열의 P23 항원, 그의 기능성 변이체 및 기능성 단편, 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며; 상기 서열은 보다 구체적으로 하기와 같이 정의된다:
- 서열번호 15
MX1RRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFC
YEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTG
ALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6
DTAPRGARKKQ, 여기서:
o X1은 A 또는 S,
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고,
o X6은 Q 또는 H이고;
- 서열번호 16
MSAPRKVRLPSVKAVDMSMEDMAARLARLESENKALKQX1VLRGGACASSTSVPSX2
X3VPPPEPLTARQREVMITQATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQN
LTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17K
KVQISD, 여기서:
o X1은 Q 또는 R,
o X2는 A 또는 V,
o X3은 P 또는 T,
o X4는 D 또는 E
o X5는 M 또는 L,
o X6은 N 또는 K,
o X7은 T 또는 P,
o X8은 P, L 또는 S,
o X9는 R, N 또는 존재하지 않고,
o X10은 E, D 또는 존재하지 않고,
o X11은 S, P 또는 존재하지 않고,
o X12는 N 또는 S,
o X13은 A, T, S 또는 N,
o X14는 S 또는 존재하지 않고,
o X15는 R 또는 존재하지 않고,
o X16은 R 또는 C이고,
o X17은 A 또는 S이다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 P18 항원은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 17 내지 서열번호 22 서열의 항원을 포함하는 반면; 특히 본 발명에 따른 바람직한 P23 항원은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 23 내지 서열번호 38 서열의 항원을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 P18 항원은 서열번호 17의 서열이고/이거나 본 발명에 따른 P23 항원은 서열번호 23의 서열이다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 P18 및 P23 항원의 기능성 변이체 및 기능성 단편을 더 포괄한다.
이와 관련하여, P18 및 P23 항원 내 포함된 시스테인 잔기(들)은 표적-결합 모이어티 내에 포함된 티올기와 이황화결합을 형성할 수 있고, 이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, 컨쥬게이트의 가용성 및 안정성을 변화시킬 수 있다. 따라서 임의의 티올기, 즉, 본 명세서에서 임의의 시스테인 잔기를 포함하지 않도록 기능성 변이체 및/또는 기능성 단편을 설계하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태는 상기 모이어티가 적어도 하나의 티올기를 포함할 때, P18 및/또는 P23 항원의 기능성 변이체 및 기능성 단편은 임의의 시스테인 잔기를 포함하지 않는다 (즉, 결여된다)는 단서 하에, 상기 정의된 면역원성 컨쥬게이트를 제공한다. 티올기는 그 자체로 시스테인 잔기에 포함될 수 있고, 모이어티는 단백질성 특징을 가질 것이다.
이러한 EBV B-세포 항원의 "기능성 변이체"는 B-세포 반응, 및 특히 옵소닌 식작용 및/또는 ADCC 및/또는 보체 활성화을 유발하는 능력을 유지하면서 구조적으로 상기 항원들 중 하나와 상이한 아미노산 서열을 나타낸다. 변이체는 천연 또는 비-천연 유래일 수 있다. 비-천연 유래 변이체는 돌연변이유발에 의해 흔히 생성되며, 변이된 변이체와 같이 지칭될 수 있다. 후자는 참조 아미노산 서열 및 변이체 간의 치환, 삭제 및/또는 삽입과 같은 보존 또는 비-보존 아미노산 변이를 원인으로 할 수 있다. 기능성 변이체는 본 명세서에서 원래의 (native) 항원의 아미노산 서열에 대한 정렬 이후에 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포괄한다. 이러한 변이체는 또한 상기 아미노산 서열에 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 99.999%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 아미노산 서열 간의 동일성은 흔히 전역 상동성 정렬 (global homology alignment)에 의해 결정될 수 있다.
임의의 시스테인 잔기를 가지지 않는 본 발명에 따른 기능성 변이체는 바람직하게는 서열번호 39 서열의 P18 항원 기능성 변이체 및 서열번호 40 서열의 P23 항원 기능성 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기 서열은 보다 구체적으로 하기와 같이 정의된다:
- 서열번호 39
MX1RRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFSYEE
YVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSA
PSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGAR
KKQ, 여기서:
o X1은 A 또는 S,
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고,
o X6은 Q 또는 H이고;
- 서열번호 40
MSAPRKVRLPSVKAVDMSMEDMAARLARLESENKALKQX1VLRGGASASSTSVPSX2X3V
PPPEPLTARQREVMITQATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQNLTLRIQ
VSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD,
여기서:
o X1은 Q 또는 R,
o X2는 A 또는 V,
o X3은 P 또는 T,
o X4는 D 또는 E,
o X5는 M 또는 L,
o X6은 N 또는 K,
o X7은 T 또는 P,
o X8은 P, L 또는 S,
o X9는 R, N 또는 존재하지 않고,
o X10은 E, D 또는 존재하지 않고,
o X11은 S, P 또는 존재하지 않고,
o X12는 N 또는 S,
o X13은 A, T, S 또는 N,
o X14는 S 또는 존재하지 않고,
o X15는 R 또는 존재하지 않고,
o X16은 R 또는 C이고,
o X17은 A 또는 S이다.
특히 본 발명에 따른 바람직한 기능성 변이체는 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 41 서열의 P18 항원 기능성 변이체 및/또는 서열번호 42 서열의 P23 항원 기능성 변이체를 포함한다.
이러한 B-세포 항원의 "기능성 단편"은 상기 항원의 아미노산 서열의 일부만을 포함하며, 상기 일부는 상기한 것과 같이 평가될 수 있는 상기 항원들 중 하나와 동일한 생물학적 기능, 즉, 항체-매개 면역 반응의 유발, 및 특히 옵소닌 식작용 및/또는 ADCC 및/또는 보체 활성화를 나타내기 위한 모든 필수적인 영역 또는 에피토프를 포함한다. 상기 반응이 유지된다면 이러한 일부는 다양한 길이일 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 기능성 단편은 상기 항원의 적어도 5개의 아미노산 잔기, 또는 상기 항원의 적어도 10개의 아미노산 잔기, 또는 상기 항원의 적어도 15개의 아미노산 잔기, 그리고 바람직하게는 상기 항원의 적어도 20개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 기능성 단편은 약 5개의 아미노산 잔기 내지 약 150개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 10개의 아미노산 잔기 내지 약 150개의 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 약 15개의 아미노산 잔기 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 그리고 가장 바람직하게는 약 20 아미노산 잔기 내지 약 100개의 아미노산 잔기를 포함한다.
더 바람직하게, 본 발명에 따른 기능성 단편은 약 5개의 연속 아미노산 잔기 내지 약 150개의 연속 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 약 10개의 연속 아미노산 잔기 내지 약 150개의 연속 아미노산 잔기, 보다 더 바람직하게는 약 15개의 연속 아미노산 잔기 내지 약 100개의 연속 아미노산 잔기, 그리고 가장 바람직하게는 약 20개의 연속 아미노산 잔기 내지 약 100개의 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
보다 바람직하게, 본 발명에 따른 기능성 단편은 서열번호 43 내지 서열번호 49 및 서열번호 75로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편 및/또는 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이며, 상기 서열은 보다 구체적으로 하기와 같이 정의된다:
- 서열번호 43
VDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ, 여기서 X6은 Q 또는 H이다;
- 서열번호 44
AGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAA
TSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고,
o X6은 Q 또는 H이고;
- 서열번호 75
AASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGG
GQPX6DTAPRGARKKQ, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고,
o X6은 Q 또는 H이고;
- 서열번호 45
RQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2
TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAA, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고;
- 서열번호 46
AGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAA
TSGATAAX4X5AAAA, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고;
- 서열번호 47
SX2TPSVSSSISX3LRAATSGA, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N이고;
- 서열번호 48
SVSSSISX3LR, 여기서:
o X3은 S 또는 N이고;
- 서열번호 49
RQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2
TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ, 여기서:
o X2는 A 또는 V,
o X3은 S 또는 N,
o X4는 A 또는 존재하지 않고,
o X5는 S 또는 존재하지 않고,
o X6은 Q 또는 H이고;
- 서열번호 50
EX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15S
RGX16EX17KKVQISD, 여기서:
o X5는 M 또는 L,
o X6은 N 또는 K,
o X7은 T 또는 P,
o X8은 P, L 또는 S,
o X9는 R, N 또는 존재하지 않고,
o X10은 E, D 또는 존재하지 않고,
o X11은 S, P 또는 존재하지 않고,
o X12는 N 또는 S,
o X13은 A, T, S 또는 N,
o X14는 S 또는 존재하지 않고,
o X15는 R 또는 존재하지 않고,
o X16은 R 또는 C이고,
o X17은 A 또는 S이고,
- 서열번호 51
ATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGE
GX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD, 여기서:
o X4는 D 또는 E,
o X5는 M 또는 L,
o X6은 N 또는 K,
o X7은 T 또는 P,
o X8은 P, L 또는 S,
o X9는 R, N 또는 존재하지 않고,
o X10은 E, D 또는 존재하지 않고,
o X11은 S, P 또는 존재하지 않고,
o X12는 N 또는 S,
o X13은 A, T, S 또는 N,
o X14는 S 또는 존재하지 않고,
o X15는 R 또는 존재하지 않고,
o X16은 R 또는 C이고,
o X17은 A 또는 S이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 단편은 서열번호 43 내지 서열번호 49로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편 및/또는 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이다.
다른 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 단편은 서열번호 43, 서열번호 75 및 서열번호 45 내지 서열번호 49로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 단편은 서열번호 43, 서열번호 49 및 서열번호 75로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편 및/또는 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이다.
특히, P18 항원 기능성 단편 중 선호도 순으로, 서열번호 75, 뒤이어 서열번호 49, 그리고 이윽고 서열번호 43의 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 단편을 선택하여야 한다. 즉, 본 발명에 따른 가장 바람직한 P18 항원 기능성 단편은 서열번호 75의 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 것이다. 사실, 이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, 이 단편은 시험된 P18 기능성 항원 단편들 중 가장 우수한 면역 반응을 나타내었다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 기능성 단편의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 52 내지 서열번호 58 및 서열번호 76로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이 포함된다. 더욱 바람직하게는, 상기 기능성 단편은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 52 내지 서열번호 58로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편을 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 기능성 단편은 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 52, 서열번호 76 및 서열번호 54 내지 서열번호 58로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편을 포함한다. 상기 단편은 개체 내 IgG 인식, 그리고 이에 따른 생체내 면역 복합체의 생성, 및 관심있는 표적을 제거하는 면역 반응의 유발에 필수적인 최소한의 에피토프를 포함하기 때문에 본 발명에 따른 가장 바람직한 EBV B-세포 항원이다.
보다 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 기능성 단편의 예는 서열번호 52, 서열번호 58 및 서열번호 76으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 P23 항원 기능성 단편이다.
특히, P18 항원 기능성 단편 중 선호도 순으로, 서열번호 76, 뒤이어 서열번호 58, 그리고 이윽고 서열번호 52의 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 단편을 선택하여야 한다. 즉, 본 발명에 따른 가장 바람직한 P18 항원 기능성 단편은 서열번호 76의 서열을 적어도 포함하거나 이로 이루어지는 것이다. 사실, 이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, 이 단편은 시험된 P18 기능성 항원 단편들 중 가장 우수한 면역 반응을 나타내었다.
상술한 바와 같이, 상기 단편은 바람직하게는 임의의 시스테인 잔기를 가지지 않을 수 있다.
중요하게도, 컨쥬게이트의 결합 모이어티에 의해 표적된 세포 및/또는 미생물은, 이를 필요로 하는 개체에 존재하는 상기 세포 및/또는 미생물을 제거하고자 하는 한, 임의의 기원의 것일 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 질병에 걸린 세포, 바람직하게는 암 세포 또는 바이러스, 세균, 진균 및/또는 기생충과 같은 병원체에 의해 감염된 세포이고/이거나 표적 미생물은 병원성 미생물, 바람직하게는 바이러스, 세균, 진균 및/또는 기생충이다.
이후 실시예에서 나타나는 것과 같이, 본 발명자들은 CD20- 또는 CSA-발현 세포를 각각 표적하여 암을 치료하기 위한 2개의 별개의 면역원성 컨쥬게이트를 비롯하여, 플라스모디움 팔시파룸을 표적하여 말라리아를 치료하기 위한 2개의 별개의 면역원성 컨쥬게이트를 보다 구체적으로 설계하였다.
따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 질병에 걸린 세포는 말라리아 감염된 적혈구이고/이거나, 상기 병원성 미생물은 플라스모디움 팔시파룸이다.
만약 표적화된 질병에 걸린 세포가 말라리아 감염된 적혈구라면, 상기 모이어티는 바람직하게 상기 세포의 표면 상에 발현되는 말라리아-관련 항원에, 바람직하게는 VAR2CSA 또는 VAR19 항원과 같은 플라스모디움 팔시파룸 적혈구 막 단백질 1 (PfEMPI) 변이체에 결합해 있을 수 있다. VAR19에 결합하는 모이어티의 예는 단백질 C 수용체 (서열번호 14를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 EPCR)이다.
다른 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 질병에 걸린 세포는 암 세포이다.
만약 질병에 걸린 세포가 암 세포라면, 상기 모이어티는 바람직하게 상기 세포의 표면 상에 발현되는 CSA에, 또는 B 세포 기원으로부터의 암의 경우 (B 림프종), 상기 세포의 표면 상에 발현되는 CD20 (Cluster of differentiation 20)에 결합해 있을 수 있다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 표적-결합 모이어티의 특성에 따라, 그리고/또는 화학적 또는 펩티드 링커가 EBV B-세포 항원에 상기 모이어티를 커플링하기 위해 사용된다면 달라질 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은:
i) 상기한 것과 같은 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티를;
ii) 상기한 것과 같은 엡스타인-바 바이러스 (EBV) B-세포 항원에
커플링하는 단계를 포함하는 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 방법에 대한 것이다.
이를 위해, 상기 커플링은, 모이어티와 EBV B-세포 항원이 특히 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 항체-의존적 보체 활성화를 통해 표적을 제거하는 생체내 면역 반응을 이루기 위하여 근접하게 있을 수 있도록, 바람직하게는 상기한 것과 같이 공유적이다.
더욱 바람직하게, 상기 커플링은 공유적이며 특히 생체내 비-절단성이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 커플링은 화학적 커플링이다.
이러한 커플링을, 상기한 것과 같이 링커와 함께 또는 링커 없이 수행하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다. 분자를 커플링하는 통상적인 방법은 문헌 [Hermanson, 3rd ed., Elsevier(2013) 및 Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation by Wong and Jameson, 2d ed., CRC Press (2011)]에 의한 생체컨쥬게이트 기술에 특히 기술되어 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 EBV-B 세포 항원은 컨쥬게이트의 생체내 사용을 위한 안정적인 결합의 형성을 제공할 수 있는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS 에스테르) 반응 특성을 이용하여, 그의 리신 잔기 (1차 아민기)를 통해 표적-결합 모이어티에 화학적으로 커플링될 수 있다.
그럼에도 불구하고 통상의 당업자는, 면역원성 컨쥬게이트가 전체 단백질성 특징을 가지는 경우 화학적 커플링이 필수적으로 바람직한 것은 아닐 수 있음을 이해할 것이다. 사실, 이러한 경우, 적합한 미생물에서의 재조합 공학 및 발현 기술에 직접적으로 의존할 수 있다 (Molecular cloning: A laboratory manual by Sambrook et al., 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press - Cold Spring Harbor, NY, USA, 2012).
따라서, 다른 양태에서, 컨쥬게이트가 융합 단백질인 경우, 본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는 방법은 바람직하게는 하기의 단계를 포함한다:
a) 숙주 세포를 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트를 코딩하는 핵산을 발현하는 벡터로 형질전환하는 단계;
b) 상기 숙주 세포를 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및
c) 상기 배지로부터 면역원성 컨쥬게이트를 회수하는 단계.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 방법은 단계 c)에서 얻은 면역원성 컨쥬게이트를 정제하는 단계 d)를 추가로 포함한다.
이러한 컨쥬게이트를 제조하는 전체 세부사항은 이하 추가로 기술되는 실시예에서 제공된다.
상기와 관련하여, 본 발명은 추가로 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 (예: 플라스미드, 세균, 및 바이러스 벡터), 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 (예: 원핵 또는 진핵)에 관한 것이다.
추가적인 본 발명의 양태는 상기 정의된 적어도 하나의 면역원성 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "약학적으로 허용가능한 부형제"는 약동학적 작용을 하지 않으므로 비활성 또는 불활성, 그리고 이에 따라 무독성인 성분을 의미하며, 이는 유효 기간, 적용 부위에서의 머무름 시간, 소비자 수용성 (consumer acceptance) 등과 같은 조성물의 특성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이는 이에 제한되는 것은 아니나 생리적으로 호환가능한, 계면활성제 (양이온성, 음이온성, 또는 중성); 표면 안정화제; 보존제, 습윤제 또는 유화제와 같은 기타 증진제; 용매; 버퍼; 염 용액; 분산매; 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 부형제는 예를 들어, 미결정 셀룰로오스, 락토오스, 녹말, 및 대두 분말과 같은 약학 제품에 흔히 사용되는 임의의 부형제를 포함한다.
상기 면역원성 컨쥬게이트는 바람직하게는 상기 조성물 내에 관심있는 표적을 옵소닌 식작용, ADCC 및/또는 항체-의존적 보체 활성화를 통해 제거하는 생체내 면역 반응을 유발하기에 충분한 양, 즉 유효한 양으로 존재한다. 전달되는 컨쥬게이트의 바람직한 유효한 양을 당업계의 일반적인 방법에 의해, 예를 들어 표적 세포 또는 동물에 투여되는 투여량을 다양하게 하여 투여량-반응 실험을 수행함으로써 결정하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다.
이와 관련하여, 본 발명의 약학 조성물은 바람직하게는 약 0.000001% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.000002% 내지 약 5%, 그리고 보다 더 바람직하게는 약 0.000005 내지 약 1% 중량부의 본 발명에 따른 1 이상의 면역원성 컨쥬게이트로부터의 조성물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 목적에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 액체 현탁액, 고체 투여 형태 (과립, 알약, 캡슐 또는 정제), 또는 페이스트 또는 겔과 같은 비경구, 경구 또는 국소 투여에 적합한 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 또는 근육내 주사를 포함한다.
약학 조성물은 또한 다른 활성 제제를 포함할 수 있고, 이는 표적 세포 및/또는 미생물의 제거를 촉진할 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 약학 조성물은 컨쥬게이트에 의해 매개되는 면역 반응을 강화하기 위해, 적어도 하나의 보조제 (adjuvant)를 더 포함한다. 일부 보조제는 항원과 면역 체계 사이의 상호작용의 지속을 매우 돕고 연장시킬 수 있는 반면, 다른 일부는 적합한 반응을 유도하기 위하여 천연 면역의 세포를 유도하고 활성화할 수 있다. 전자 카테고리에 속하는 보조제는 이에 제한되는 것은 아니나, 백반, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 수산화 인산 칼슘과 같은 광물 화합물; 파라핀 오일, 녹말 오일, 프로인트 완전/불완전 보조제 (FCA/FIA), 사포닌 (예: 퀼라야 (Quillaja), 대두, 폴리갈라 세네가 (polygala senega) 식물로부터의)과 같은 유성 에멀젼을 포함한다. 후자 카테고리에 속하는 보조제는 이에 제한되는 것은 아니나, 사이토카인 (예: GM-CSF, 11-1, IL-2, IL6, IL8, IL12, TNF-, IFN- 등)과 같은 면역자극성 복합체 (ISCOM); 열-충격 단백질 (HSP), 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 무라밀디펩티드 (MDP), 리포폴리사카라이드 (PLS)와 같은 세균 산물을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 약학 조성물은 표적 세포 및/또는 미생물에 대항하는 적어도 하나의 치료용 제제를 더 포함한다. 따라서 상기 치료용 제제는 바람직하게는 이를 필요로 하는 개체에서, 원치 않는 세포 및/또는 미생물의 존재를 특징으로 하는 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 예를 들어, 치료용 제제는 항암제, 및 항-바이러스제, 항생제, 항-진균제 및/또는 항-기생충제일 수 있다. 바람직하게, 상기 치료용 제제는 항-말라리아제, 또는 항암제이다.
의도된 목적을 위한 적절한 보조제 및/또는 치료용 제제를 선택하는 것은 당업자의 통상의 기술 범위 내이다.
보조제 또는 치료용 제제는 또한 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트와 공동으로, 동시에, 별도로, 또는 연속하여 투여될 수 있다. 컨쥬게이트, 보조제 및/또는 치료용 제제는 별도의 또는 연속적인 방식으로 투여될 것이며, 이들은 별개의 약학적 형태로 투여될 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 동시에, 별도로, 또는 연속하여 투여하기 위한 조합된 제제로서 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트 및 상기한 것과 같은 보조제 및/또는 치료용 제제에 관한 것이다. 달리 말하면, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 동시의, 별도의, 또는 연속된 투여를 위한 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트와 보조제 및/또는 치료용 제제의 조합된 사용을 제안한다.
본 발명의 면역원성 컨쥬게이트, 또는 상기 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 원치 않는 세포 및/또는 미생물을 특정 방식으로 제거하는 컨쥬게이트의 능력이 제공하는 이점을 얻을 수 있는 의료 응용분야에서 사용될 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 면역원성 컨쥬게이트, 또는 상기한 것과 같은 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 의약은 이를 필요로 하는 개체에서 표적 세포 및/또는 미생물의, 옵소닌 식작용 및/또는 ADCC에 의한 용해 및/또는 항체-의존적 보체 활성화에 의한 용해를 유발하도록 의도된다. 더욱 바람직하게, 상기 의약은 이를 필요로 하는 개체에서 표적 세포 및/또는 미생물의 옵소닌 식작용을 유발하도록 의도된다.
예를 들어, 면역원성 컨쥬게이트 또는 약학 조성물은 특히 암 세포, 또는 바이러스, 세균, 진균 및/또는 기생충과 같은 병원체에 감염된 세포를 포함한 질병에 걸린 세포를 파괴하기 위하여, 및/또는 바이러스, 세균, 진균 및/또는 기생충과 같은 병원성 미생물을 파괴하기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 암, 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및/또는 기생충 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트 또는 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 정확히, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 암, 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및/또는 기생충 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트 또는 약학 조성물의 용도에 대한 것이다. 즉, 본 발명은 상기 개체에 본 발명의 면역원성 컨쥬게이트 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 암, 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염 및/또는 기생충 질환을 치료하기 위한 방법에 대한 것이다. 의약의 투여 방법은 통상의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 더 자세히 설명할 필요는 없다.
본 발명에 따른 바람직한 기생충 질환은 말라리아이다. 본 발명에 따른 바람직한 다른 질환은 암이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료하는", "치료" 또는 "치료하다"는 그 중에서도 치료요법에 개입하거나 이로부터 초래된 것을 포함하는 결핍, 기능 장애, 질환, 또는 기타 유해한 과정을 예방, 개선, 억제 또는 치유하는 것을 포괄한다.
용어 "개체"는 본 명세서 전체에서 인간 또는 동물, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 맥락에서, 개체는 EBV에 대해 존재하는 또는 기존의 체액성 면역 반응을 나타낸다.
본 발명은 실시예를 포함하는 다음의 상세한 실험에 대한 설명에 비추어 보다 잘 이해될 것이다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 이러한 상세한 설명이 제한적이지 않으며 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 수정, 대체, 생략 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
도 1. 컨쥬게이트 DARC VHH - EBV P18 항원 및 DARC VHH - EBV P23 항원의 IMAC 정제. 원래의 조건 하 DARCVHH-P23의 Ni-NTA 정제 (A-B) 또는 변성 조건 하 DARCVHH-P18 및 DARCVHH-P23의 Ni-NTA 정제 (C-D). SDS PAGE에 이어, 단백질 겔은 쿠마시 블루로 염색되거나 (A 및 C) 탐침 항체로서 항-His를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 위하여 니트로셀룰로오스 막에 이동되었다 (B 및 D).
도 2. 컨쥬게이트 DARC VHH - EBV 변이된 P18 항원 및 DARC VHH - EBV 변이된 P23 항원의 IMAC 정제. 원래의 조건 하 변이된 컨쥬게이트 DARCVHH-P18 (C56S)* 및 DARCVHH-P23 (C46S)*의 Ni-NTA 정제. SDS PAGE에 이어, 단백질 겔은 쿠마시 블루로 염색되었다.
도 3. 항- DARC VHH 단독을 비롯한 컨쥬게이트 DARC VHH - EBV 변이된 P18 항원 및 DARC VHH -EBV P18 항원 단편의 겔 여과 크로마토그래피. IMAC 정제에 이어, DARCVHH-P18 (C56S)* (A), DARCVHH-P18F2 (B), DARCVHH-P18F3 (C), DARCVHH-P18F4 (D), 및 DARCVHH (E)에 대한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
도 4. 컨쥬게이트 DARC VHH - EBV P18 및 VAR2CSA VHH - EBV P18 (변이된 및 단편)의 IMAC 정제 및 겔 여과 크로마토그래피 정제. IMAC 정제에 이어, DARCVHH-P18(C56S)*에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다 (A). 정제된 컨쥬게이트 DARCVHH-P18 단편 및 VAR2CSAVHH-P18F2 단편을 비롯하여 그들의 정제된 각 분자 표적 DARC 및 VAR2CSA의 쿠마시 블루 염색 (B). 재조합 DARC325 단백질은 DARCVHH에 의해 표적되는 에피토프를 포함하는 반면, 재조합 DARC403은 에피토프 서열이 없다. VAR2CSA의 전장 세포외 부분은 6개의 DBL 영역 (DBL1-DBL6ε), DBL4ε 영역을 표적하는 VAR2CSAVHH를 포함한다.
도 5. 비- 결합된 그리고 결합된 DARC VHH 및 VAR2CSA VHH 의 각 분자 표적, 즉, DARC 및 VAR2CSA에 대한 친화력의 비교 분석. 전장 재조합 DARC325 및 VAR2CSA (3D7-DBL1X-6ε)는 CM5 칩에 고정되었고 분석체는 상이한 농도로 주입되었다. DARC325에 대한 DARCVHH-P18F2, DARCVHH-P18F3, DARCVHH-P18F4, DARCVHH의 친화력 상수 및 VAR2CSA에 대한 VAR2CSAVHH-P18F2, VAR2CSAVHH-P18F3, VAR2CSAVHH의 친화력 상수는 EBV-항원 컨쥬게이션에 의해 유의하게 수정되지 않았다.
도 6. DARC VHH - EBV P18 및 VAR2CSA VHH - EBV P18 컨쥬게이트 (단편)의 면역 인식. DARCVHH-EBV P18F2에 대한 항체 역가 (IgG) 결정의 실시예. 공여자 20120617에 대한 항체 역가는 최대 OD 신호의 50%에 도달했을 때의 혈장 희석배수로 간주된다 (A). DARCVHH-P18F2, DARCVHH-P18F3, DARCVHH-P18F4, DARCVHH, VAR2CSAVHH-P18F2, VAR2CSAVHH-P18F3, VAR2CSAVHH 및 MBP EBV-P18 및 MBP P23의 22개의 상이한 혈장 샘플의 면역 인식 (IgG) 비교 (B). BSA 및 MBP는 대조군으로 사용되었다.
도 7. 컨쥬게이트 DARC VHH - EBV P18 항원 단편 F2의 그의 원래의 표적, 즉, DARC + 공여자의 적혈구 표면에 발현된 DARC에 대한 결합. DARC+ 적혈구는 DARCVHH-P18F2의 연속 희석액과 함께 배양되었다. 막 결합 단백질은 항-His PE-결합된 항체를 이용하여 유세포 계수법에 의해 모니터링되었다.
도 8. DARC VHH - EBV P18 컨쥬게이트 (변이된 및 단편)에 의해 매개된 적혈구 옵소닌화. (A) 적혈구 옵소닌화를 입증하기 위하여, DARC+ 적혈구를 DARCVHH-P18 (C56S)*, 및 이어 인간 혈장의 연속 희석액과 함께 배양하였다 (좌측 패널). 막 관련 IgG는 항-hlgG PE-결합된 항체를 이용한 유세포 계수법에 의해 검출되었다 (우측 패널). 형광 강도 (PE)의 이동은 적혈구 세포 표면의 면역 복합체의 존재를 반영한다 (우측 패널) (B). 컨쥬게이트 DARCVHH-EBV P18 항원 단편 F3에 의해 매개된 적혈구 응집. DARC+ 적혈구는 DARCVHH-P18F3 및 이어 인간 혈장의 연속 희석액과 함께 배양되었다. 플레이트의 원심분리에 이어, 대조군 조건 (인간 혈장을 배제한)에서의 적혈구는 뚜렷한 세포 펠렛을 형성하는 반면 ( a,b,c ) DARCVHH-P18F3 및 인간 혈장의 존재 하에서 배양되는 적혈구는 퍼져있는 응집을 형성하였다 (d, e, f) (B).
도 9. DARC VHH - EBV P18 컨쥬게이트 (변이된 및 단편)에 의해 매개된 옵소닌 식작용. (A) 적혈구 옵소닌화가 식작용을 유도함을 입증하기 위하여, THP1 유래 대식세포는 DARCVHH-P18(C56S)*로 미리-옵소닌화된 CFSE-염색된 DARC+ 적혈구 및 인간 IgG와 함께 배양되었다. 3시간 후, THP1 세포는 유세포 계수법으로 분석되었다. CFSE 양성 THP1 세포는 적어도 하나의 포식된 (phagocyted) 적혈구를 갖는 세포로 여겨졌다. (B) THP1 세포는 DARCVHH-P18F3으로 미리-옵소닌화된 CFSE-염색된 DARC+ 적혈구 및 인간 IgG와 함께 배양되었다. 3시간 후, THP1 세포는 유세포 계수법으로 분석되었다. CFSE 양성 THP1 세포는 적어도 하나의 포식된 적혈구를 갖는 세포로 여겨졌다. (C) DARCVHH-EBV P18 컨쥬게이트에 의해 매개된 옵소닌 식작용. DARC+ 적혈구를 상이한 DARCVHH-EBV P18 컨쥬게이트로 처리하는 것이 세포 옵소닌화 및 THP1 세포에 의한 연이은 식작용을 매개한다는 것을 입증하기 위하여, CFSE-염색된 적혈구는 등몰 농도 (10 nM)의 DARCVHH, DARCVHH-EBV P18F2, DARCVHH-EBV P18F3, DARCVHH-EBV P18F4 및 10% 인간 혈장과 함께 배양되었다. 인간 혈장 샘플은 P18에 대한 그의 반응성에 따라 스크리닝된 후 EBV 항원을 인식하는 그의 능력에 따라 3개 그룹의 풀 (pool)에 포함되었다: P18에 대한 고반응성 (High), P18에 대한 중간반응성 (Medium) 또는 저반응성 (Low). 공배양한지 3시간 후, THP1 세포는 유세포 계수법에 의해 분석되었다. CFSE 양성 THP1 세포는 적어도 하나의 포식된 적혈구를 갖는 세포로 여겨졌다. 결과는 임의의 컨쥬게이트를 갖지 않는, 적혈구 (RBC) 단독의 실험 조건과 비교한 증가 배수로 표시되었다.
도 10. hCD20 ScFv - P18F3 및 VAR2CSA - P18F3 컨쥬게이트의 IMAC 정제 및 겔 여과 크로마토그래피 정제. IMAC 정제에 이어, hCD20ScFv-P18F3 및 VAR2CSA-P18F3에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. hCD20ScFv-P18F3, VAR2CSA-P18F3 및 "네이키드 (naked)" 단백질 hCD20ScFv 및 VAR2CSA의 쿠마시 블루 염색.
도 11. hCD20 ScFv - P18F3 및 VAR2CSA - P18F3 컨쥬게이트의 그들의 원래의 표적, 즉, B 세포의 표면에 발현되는 CD20 및 암 세포의 표면에 발현되는 CSA 각각에 대한 결합. CD20- 및 CSA-발현 RAJI 세포는 50 μg/ml의 hCD20ScFv, hCD20ScFv-P18F3 또는 50 μg/ml의 VAR2CSA, VAR2CSA-P18F3와 함께 배양되었다. 막 결합 단백질은 마우스 항-His 항체 및 항-마우스 IgG- PE-결합된 항체를 이용한 유세포 계수법에 의해 모니터링 되었다.
도 12. hCD20 ScFv - P18F3 컨쥬게이트에 의해 매개된 CD20 + RAJI 세포 옵소닌 화. B 세포 옵소닌화를 입증하기 위하여, CD20+ RAJI 세포는 hCD20ScFv 또는 hCD20ScFv-P18F3의 연속 희석액 및 이어 일정한 인간 혈장 희석액 (1:100)과 함께 배양되었다. (A) 막 관련 IgG는 항-hlgG PE-결합된 항체를 이용한 유세포 계수법에 의해 검출되었다. 형광 강도 (PE)의 이동은 세포 표면의 면역 복합체의 존재를 반영한다. (B) 유세포 계수법 분석에 의해 생성된 데이터의 도표 표시.
도 13. VAR2CSA - P18F3 컨쥬게이트에 의해 매개된 CSA + RAJI 세포 옵소닌화 . B 세포 옵소닌화를 입중하기 위하여, CSA+ RAJI 세포는 VAR2CSA 또는 VAR2CSA-P18F3의 연속 희석액 및 이어 일정한 인간 혈장 희석액 (1:100)과 함께 배양되었다. (A) 막 관련 IgG는 항-hlgG PE-결합된 항체를 이용한 유세포 계수법에 의해 검출되었다. 형광 강도 (PE)의 이동은 세포 표면의 면역 복합체의 존재를 반영한다. (B) 유세포 계수법 분석에 의해 생성된 데이터의 도표 표시.
도 14. hCD20 ScFv - P18F3에 의해 매개된 보체 활성화. hCD20ScFv-P18F3에 의해 매개된 B 세포 옵소닌화가 막공격 복합체의 형성에 대한 보체 연속반응을 활성화할 수 있음을 입증하기 위하여, CD20+ RAJI 세포는 5 μg/ml의 hCD20ScFv 또는 hCD20ScFv-P18F3 및 이어 활성화 형태 또는 열에 의해 비활성화된 10% EBV+ 인간 혈장과 함께 배양되었다. 마우스 단일클론 항-C5-b9 항체 및 항-마우스 lgG-PE-결합된 항체를 이용한 배양 1시간 후에, 막공격 복합체 구성 성분 C5-b9의 침전이 세포 막 표면에서 검출되었다. 활성화된 인간 혈장 단독에 의해 관찰된 RAJI 세포 표면의 약한 C5-b9 침전은 아마도 암 세포주에 의한 대안의 (항체 비의존성) 보체 경로의 활성화 때문인 것으로 보인다.
도 15. hCD20 ScFv - P18F3 (A) 및 VAR2CSA - P18F3 (B)에 의한 항체 의존성 세포 세포독성 ( ADCC ). 효과기 세포 내 NFAT 경로를 통한 유전자 전사의 활성화는 ADCC에서의 컨쥬게이트의 생물학적 활성을 반영하며 생산된 루시퍼라아제 (발광 판독)를 통해 정량화된다. RAJI 세포는 포화 농도의 컨쥬게이트 및 이어 EBV+ 인간 혈장의 연속 희석액과 함께 배양된다. 적격 (competent) 효과기 세포와의 공배양 6시간 후, NFAT 경로 활성화는 각 플레이트 웰의 발광 정도를 읽음으로써 모니터링되었다 (CPS (초 당 총합계)로 표시됨).
도 16. 컨쥬게이트 EPCR - P18F3의 IMAC 정제 및 겔 여과 크로마토그래피 정제. IMAC 정제에 이어, EPCR-P18F3에 대한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. (A) EPCR-P18F3의 쿠마시 블루 염색 및 (B) 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석. 정제된 EPCR-P18F3을 포함하는 겔 여과 (GF) 분획은 모아져 기능 어세이에 사용되었다.
도 17. 컨쥬게이트 EPCR - P18F3의 그의 표적, 즉, Pf 감염된 적혈구의 표면에 발현되는 VAR19에 대한 결합. VAR19-발현 감염된 적혈구 (iRBC)는 EPCR-P18F3의 연속 희석액 (100 μg/ml 내지 0.19 μg/ml의 범위)과 함께 배양되었다. 막 결합 단백질은 마우스 항-His 항체 및 항-마우스 IgG-PE-결합된 항체를 이용한 유세포 계수법에 의해 모니터링되었다. (A) 세포의 형태학적 게이팅 (gating). (B) 감염된 적혈구 (iRBC)와 감염되지 않은 적혈구 (RBC)를 구별하도록 하는 TOPR03 염색. (C) iRBC 군집 및 (D) RBC 군집 내에서의 막 결합 EPCR-P18F3의 검출.
도 18. EPCR - P18F3에 의해 매개된 옵소닌 식작용. EPCRP18F3에 의해 매개된 VAR19-발현 감염된 적혈구 (iRBC) 옵소닌화가 식작용을 유도함을 입증하기 위하여, THP1 유래 대식세포는 EPCR-P18F3로 미리-옵소닌화된 CFSE-염색된 VAR19-발현 iRBC 및 hlgG와 함께 배양되었다. 3시간 후, THP1 세포는 유세포 계수법으로 분석되었다. CFSE 양성 THP1 세포는 적어도 하나의 포식된 iRBC를 갖는 세포로 간주되었다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1. 본 발명에 따른 면역원성 컨쥬게이트의 제조
EBV (B95-8 균주) P18 및 P23 단백질을 코딩하는 BFRF3 및 BLRF2의 DNA 서열을 대장균 (E. coli)에서의 발현을 최대화하기 위하여 코돈-최적화하였다 (통합 DNA 기술). 정제 목적으로, C-말단 His-태그된 단백질을 발현시키기 위하여 전장 P18 및 P23 재코딩된 뉴클레오티드 서열과 그의 잘린 단편을 pET28a 플라스미드 (Novagen)에 클로닝하였다.
일부 컨쥬게이트에서, 2개의 상이한 모듈 (즉, 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티의 모듈 그리고 EBV-B 세포 항원의 모듈)의 적합한 기능적 속성을 유지하고 가능하다면 개선시키기 위하여 (Hu et al., 2004; Chen et al., 2013), 20개 아미노산 (GGGGS)4 (서열번호 7)의 유연한 링커를 결합 모이어티 (VHH, scFv, 세포 표면 수용체, 또는 세포-표면 리간드)와 EBV-B 세포 P18 또는 P23 항원 사이에 첨가하였다. 이후, 결합 모이어티 서열 (EPCR 제외)을 변형된 pET28a 플라스미드의 Ncol 및 Nhel 제한 부위 사이에 삽입하였다. EPCR 컨쥬게이트에 대하여, 가용성 EPCR (잔기 S18-S210;[Uniprot:Q9UNN8; 서열번호 14)을 코딩하는 유전자를 인간 폐 내피 cDNA 라이브러리로부터 PCR로 증폭하고, P18F3로 코딩되는 재코딩된 유전자 단편에 융합시켰다. EPCR-P18F3 서열을 헥사-His C-말단 태그를 가진 pTT3 벡터에 클로닝하였다.
본 연구에서, 하기 컨쥬게이트는 이렇게 설계되었다:
- 링커와 함께 프레임 내 DARCVHH에 융합된 EBV P18 전장 항원;
- 링커와 함께 프레임 내 DARCVHH에 융합된 EBV P23 전장 항원;
- 링커와 함께/링커 없이 프레임 내 DARCVHH에 융합된 EBV P18 변이된 항원;
- 링커와 함께/링커 없이 프레임 내 DARCVHH에 융합된 EBV P23 변이된 항원;
- 링커 없이 프레임 내 DARCVHH, VAR2CSAVHH, VAR2CSA, hCD20ScFv 또는 EPCR에 융합된 다양한 EBV P18 단편; 및
- 링커 없이 프레임 내 DARCVHH에 융합된 다양한 EBV P23 단편.
이들 링커는 하기 표 1에 요약될 수 있다.
면역원성 컨쥬게이트
표적 모이어티
(N-말단 내)		 링커 EBV 항원
(C-말단 내)		 전체 상응하는 서열
DARCVHH
(서열번호 9)
Smolarek et al., 2010		 (GGGGS)4
(서열번호 7)		 P18 (서열번호 17) 서열번호 61
(GGGGS)4
(서열번호 7)		 P18-C56S (서열번호 41) 서열번호 62
없음 P18-C56S (서열번호 41) 서열번호 63
없음 P18F2 (서열번호 58) 서열번호 64
없음 P18F3 (서열번호 76) 서열번호 77
없음 P18F4 (서열번호 52) 서열번호 66
VAR2CSAVHH
(서열번호 11)
Nunes et al.,
2014		 없음 P18F2 (서열번호 58) 서열번호 67
없음 P18F3 (서열번호 76) 서열번호 78
없음 P18F4 (서열번호 52) 서열번호 69
DARCVHH
(서열번호 9)
Smolarek et al., 2010		 (GGGGS)4
(서열번호 7)		 P23 (서열번호 23) 서열번호 70
(GGGGS)4
(서열번호 7)		 P23-C46S (서열번호 42) 서열번호 71
없음 P23-C46S (서열번호 42) 서열번호 72
없음 P23F2 (서열번호 60) 서열번호 73
없음 P23F3 (서열번호 59) 서열번호 74
CD20 scFv
Otz et al., 2009;
Liu et al., 1987
(서열번호 80)		 없음 P18F3 (서열번호 76) 서열번호 81
VAR2CSA
(서열번호 82)		 없음 P18F3 (서열번호 76) 서열번호 83
EPCR
(서열번호 14)		 없음 P18F3 (서열번호 76) 서열번호 79
1.2. 컨쥬게이트의 발현 및 정제
단백질 발현을 위하여, 세포질 이황화결합을 형성하도록 하는 SHuffle® 대장균 (E. coli) (New England Biolabs)을 상이한 pET28a계 컨쥬게이트로 형질전환하였다. 세균 배양을 OD600nm 0.5에서 0.2 mM IPTG로 유도하고, 단백질 발현을 20℃에서 16시간 동안 수행하였다. 단백질 정제를 위하여, 세균 현탁액을 얼음에서 해동시키고 EmulsiFlex-C5 고압 균질기 (high-pressure homogenizer)에 통과시켜 세포 현탁액을 용해하였다. 가용성 단백질에 2단계의 정제 과정을 가하였다. His-태그된 단백질을 먼저 Ni-NTA Superflow (Qiagen) 상에서 정제하고 이후 Superdex 200 10/300 GL 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 통과시켰다.
특히, EPCR 컨쥬게이트에 대하여, FreeStyle 293-F 세포 (Invitrogen)를 Freestyle 293 무혈청 발현 배지에서 배양한 후 Invitrogen의 권고사항에 따라 EPCR-P18F3 서열을 함유하는 pTT3 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 72시간 후, 세포를 원심분리하고 배양 배지를 회수하였다. 0.22 μm 필터에서 여과한 후, 10 kDa 컷오프 Vivaf low 200 System (Vivasciences)을 이용하여 상등액을 5회 농축하였다. 가용성 단백질에 2단계의 정제 과정을 가하였다. His-태그된 단백질을 먼저 Ni-NTA Superflow (Qiagen)에서 정제하고 이후 Superdex 200 10/300 GL 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare)에 통과시켰다.
1.3. 표면 플라스몬 공명에 의한 친화력 확인
컨쥬게이트와 그들의 각 분자 표적 간의 상호작용을 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 Biacore X100 기구 (GE Healthcare)를 이용하여 연구하였다. 모든 실험은 25uC의 HBSEP 버퍼 (GE Healthcare)에서 수행하였다. 재조합 전장 DARC325 또는 VAR2CSA 단백질을 800 RU의 전체 로딩에 대한 아민 커플링에 의해 CM5 칩 (GE Healthcare)의 분석 Fc2 채널 상에 고정하였다. 참조 채널 Fc1을 동일한 화학적 특성을 이용하여 1 M 에탄올아민-HCI pH 8.5로 블로킹하였다. 컨쥬게이트를 코팅된 칩 상의 연속 희석액에 30 μL/min으로 주입하였다. 컨쥬게이트의 최고 농도는 1 mM였고 10개의 2배의 연속 희석액을 또한 주입하였다. 주입 사이에, 칩 표면을 2번의 15 ml의 10 mM HCI pH2를 주입하여 재생하였다. Fc1 상의 반응에 의한 Fc2 상의 분석물에 의해 나타난 반응을 제하여 특이적 결합 반응을 얻었다. 키네틱 센소그램 (kinetic sensorgram)을 제조업자의 소프트웨어를 사용하여 전역 1:1 상호작용 랭뮤어 모델 (Langmuir model)에 적합시켰다.
1.4. 컨쥬게이트의 면역 인식
ELISA 플레이트 (Nunc)를 PBS에 1 μg/ml로 희석된 웰 당 100 ml의 컨쥬게이트로 코팅하고 4℃에서 밤새 배양하였다. BSA (PBS 내 2%)를 백그라운드 측정을 위해 코팅하였다. 코팅 후, 웰을 PBS 2% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거한 후, PBS 2% BSA 내 인간 혈장 희석액을 가하고 플레이트를 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 웰을 150 ml의 PBS 0.05% Tween20 (PBST)으로 3회 세척하였다. PBS 2% BSA에 1:4000로 희석된 호스라디쉬 퍼옥시다아제-결합된 (HRP) 항-인간 IgG (Jackson Immunoresearch 709-036-098)를 이용하여 인간 IgG 결합을 검출하고, 이를 상온에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 세척한 후, 플레이트를 웰 당 100 ml의 TMB (3,39,5,59-테트라메틸벤지딘) 기질 (Biorad)로 전개시키고 흡광도를 655 nm에서 측정하였다.
1.5. 컨쥬게이트에 의한 세포 표면 인식
DARCVHH-EBV 컨쥬게이트가 적혈구의 표면에 발현된 원래의 (native) DARC를 인식하는 능력, hCD20ScFv-P18F3 컨쥬게이트 중 하나가 B 세포 표면에 발현된 원래의 CD20 단백질을 인식하는 능력, VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트 중 하나가 암 세포 표면에 발현된 원래의 글리코사미노글리칸 황산 콘드로이틴 A (CSA)를 인식하는 능력, 및 EPCR-P18F3 컨쥬게이트 중 하나가 플라스모디움 팔시파룸-감염된 세포 표면에 발현된 원래의 VAR19 단백질을 인식하는 능력을 유세포 계수법으로 검사하였다.
이를 위하여, DARC+ 적혈구 (DARCVHH-EBV 컨쥬게이트에 대하여), CD20+ RAJI 세포 (hCD20ScFv-P18F3 컨쥬게이트에 대하여), CSA+ RAJI 세포 (VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트에 대하여) 또는 VAR19-발현 적혈구 (EPCR-P18F3 컨쥬게이트에 대하여)를 PBS 2% BSA 내 컨쥬게이트의 연속 희석액과 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 세포를 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 30분 동안 상온에서 PBS 2% BSA에 5 mg/ml로 희석된 마우스 항-펜타His IgG (Qiagen, Cat.no.34660)와 함께 배양하였다. 30분 후, 세포를 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 30분 동안 상온에서 PE-결합된 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG (Beckman Coulter, IM0855, PBS 2% BSA에 1:100로 희석됨)와 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 이를 유세포 계수법 분석하였다. BD FACScanto II 유세포 계수기 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 데이터를 얻고, FLOWJO 8.1 소프트웨어 (Tree Star Inc.)를 이용하여 분석을 수행하였다. 세포 잔여물은 전방 및 측방 산란을 이용한 적합한 게이팅에 의해 분석에서 제외하였다.
표면-발현된 DARC (DARCVHH-EBV 컨쥬게이트에 대하여), RAJI 세포의 표면 (hCD20ScFv-P18F3 및 VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트에 대하여), 또는 표면-발현된 VAR19 (EPCR-P18 컨쥬게이트에 대하여)에 대한 검사된 컨쥬게이트의 반응성은 PE 채널에서의 형광 강도의 기하 평균의 증가 (기하 평균 PE)에 의해 반영되었다.
1.6. 옵소닌화 어세이
옵소닌화 어세이를 위하여, DARC+ 적혈구를 PBS 2% BSA 내 일정한 농도의 DARCVHH-EBV 컨쥬게이트와 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 세포를 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 1시간 동안 상온에서 PBS 2% BSA 내 인간 혈장의 연속 희석액과 함께 배양하였다. 이후 세포를 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 30분 동안 상온에서 PE-결합된 당나귀 F(ab')2 항-인간 IgG (Jackson Immunoresearch 709-1 16-098, PBS 2% BSA 내 1:100으로 희석됨)와 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 유세포 계수법으로 분석하였다.
반면, RAJI 세포를 PBS 2% BSA 내 hCD20ScFv-P18F3 또는 VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트의 연속 희석액과 함께 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 이후 상기 세포를 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 1시간 동안 상온에서 PBS 2% BSA 내 일정한 인간 혈장 희석액 (1:100)과 함께 배양하였다. 상기 세포를 DARC+ 적혈구에 적용된 것과 동일한 프로토콜에 따라 세척하였다.
1.7. 옵소닌 식작용 어세이
비-접착성 인간 단핵 세포주 THP-1 (Sigma)을 10% (v/v) 소 태아 혈청 (Gibco, Grand Island, NY), 2 mM L-글루타민, 100 units/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 (THP-1 배양 배지)를 포함하는 150 cm2 플라스크에서 유지하였다. 세포를 3일마다 서브배양하고 밀도를 2x105 세포/ml 미만으로 유지하였다; 배양은 5% (v/v) CO2 및 95% (v/v) 공기 조건의 가습된 37℃ 배양기에서 유지하였다.
THP-1 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 2.5x105 세포로 접종하고 각 웰의 부피를 THP-1 배양 배지를 이용하여 3 ml로 만들었다. 대식세포를 얻기 위하여, 세포를 10 ng/ml 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트를 이용하여 24시간 동안 5% (v/v) CO2, 37℃에서 분화시켰다. 상등액 및 미부착 세포를 흡인하여 제거한 후, 3 ml의 신선한 THP-1 배양 배지로 웰을 채우기 전에, 부착된 대식세포를 THP-1 배양 배지로 2회 세척하였다. 이들을 식세포 어세이를 수행하기 전에 추가로 48시간 동안 배양하였다.
제조업자의 설명에 따라 적혈구를 CellTrace™CFSE로 표지하고 상기한 것과 같이 컨쥬게이트 및 인간 혈장을 옵소닌화하였다. 표지되고 옵소닌화된 적혈구를 THP-1 유래 대식세포와 함께 3시간 동안 공배양하였다. 적혈구를 웰로부터 세척하고 그 후 대식세포를 트립신 처리하여 떼어낸 후 유세포 계수법 분석하였다. CFSE 양성 THP-1 세포를 적어도 하나의 포식된 (phagocyted) 적혈구를 갖는 세포로 간주하였다.
1.8. 보체 활성화 어세이
보체 활성화 어세이를 위하여, RAJI 세포를 PBS 1% BSA 내 5 μg/ml의 hCD20ScFv 또는 hCD20ScFv-P18F3에서 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 이후 세포를 PBS 1% BSA로 2회 세척하고 열 처리 (56℃에서, 45분 동안)에 의해 미리-비활성화된 활성화 형태의 10% EBV+ 인간 혈장과 함께 1시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% PFA로 상온에서 15분 동안 고정하였다. 이후 세포를 PBS 5% BSA로 3회 세척하고 1시간 동안 상온에서 PBS 5% BSA로 블로킹한 후 마우스 단일클론 항체 항-C5b9 (Abeam ab66768, PBS 1% BSA 내에서 1:100)와 함께 배양하였다. 이후 세포를 PBS 1% BSA로 3회 세척하고 30분 동안 상온에서 PE-결합된 염소 F(ab')2 항-마우스 IgG (Beckman Coulter, IM0855, PBS 1% BSA 내 1:100으로 희석됨)와 함께 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고 유세포 계수법으로 분석하였다. BD FACScanto II 유세포 계수기 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 데이터를 얻고 FLOWJO 8.1 소프트웨어 (Tree Star Inc.)를 이용하여 분석을 수행하였다. 세포 잔여물은 전방 및 측방 산란을 이용한 적합한 게이팅에 의해 분석에서 제외하였다. RAJI 세포 표면의 C5-b9 침전물은 PE 채널에서의 형광 강도의 증가에 의해 반영되었다.
1.9. 항체-의존적 세포 세포독성 ( ADCC ) 어세이
ADCC 어세이를 위하여, RAJI 세포를 2.5x105 - 106 세포/ml의 밀도로 10% FCS 및 1X 항생제-항진균 용액 (Gibco)으로 보충된 RPMI (Glutamax™-I)에서 37℃, 5% CO2로 유지하였다. 우리의 시스템에 맞추기 위해 제조업자의 설명을 약간 변형하여 ADCC 리포터 바이오어세이 (Promega)를 이용하여 ADCC 어세이를 수행하였다. 300000 RAJI 세포를 먼저 PBS 2% BSA로 2회 세척하고 1시간 동안 4℃에서 포화 농도의 컨쥬게이트 (25 μg/ml hCD20ScFv, hCD20ScFv-P18F3 또는 50 μg/ml VAR2CSA, VAR2CSA-P18F3)와 함께 배양하였다. 이후 세포를 PBS 2% BSA로 1회 세척하고 12500 세포 (25 μl 내)를 흰색, 평평한 바닥의 96-웰 플레이트의 웰에 도입하였다. EBV+ 인간 혈장을 56℃에서 45분 동안 비활성화/보체제거 하였다. 연속 희석액을 ADCC 어세이 배지 (RPMI 1640, 4%의 적은 IgG FCS) 내에 제조하고 25 μl의 희석된 혈장을 웰에 RAJI 표적 세포와 함께 도입하였다. 효과기 세포를 해동하고 75000 세포 (25 μl 내)를 즉시 웰에 분배하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양 6시간 후, 플레이트를 배양기에서 제거하고 각 웰에 75 μl의 Bio-Glo™ 시약을 가하기 전에 상온에서 15분 동안 유지하였다. 발광을 VICTOR 플레이트 리더 플랫폼 (PerkinElmer)을 이용하여 측정하였다.
2. 결과
2.1. 컨쥬게이트의 발현 및 정제
컨쥬게이트 DARCVHH-EBV P18 및 DARCVHH-EBV P23 (각각 EBV P18 또는 EBV P23 항원에 융합된 항-DARCVHH, 상기 항원 각각은 폴리-히스티딘 서열로 C-말단에 표지됨)의 원래의 조건 내에서의 IMAC (고정된 금속 이온 친화력 크로마토그래피) 정제는 성공적이지 않았다 (도 1A-B). 사실, C-말단의 His-태그는 변성 조건 하 IMAC에 의한 상기 컨쥬게이트의 성공적인 정제에서 나타난 것과 같이, 원래의 조건에 접근할 수 없었다 (도 1 C-D). N-말단 His-태그된 융합을 정제하려는 시도는 나은 결과를 도출하지 않았다.
EBV P18 Cys (아미노산 위치 56) 및 EBV P23 Cys (아미노산 위치 46)을 세린으로 대체하는 부위-지정 돌연변이유발을 수행하였다. 새로운 컨쥬게이트 DARCVHH-EBV P18 (C56S)* 및 DARC-EBV P23 (C46S)*은 IMAC에 의해 성공적으로 정제되었다 (도 2). 그럼에도 불구하고, 정제 과정의 2번째 단계 (크로마토그래피)는 대부분의 융합 단백질이 고염 버퍼에서조차 응집을 형성하는 경향이 있었음을 보여준다 (도 3A 및 4A).
이러한 문제를 극복하기 위하여, 보다 짧은 변이체 pf P18 및 P23을 설계하였다. 결과로 도출된 융합 단백질 DARCVHH-EBV P18F2, DARCVHH-EBV P18F3, DARCVHH-EBV P18F4은 DARCVHH-EBV P18(C56S)*와 비교할 때 가용성이 상당히 증가하였으며, 겔 여과 정제 단계 동안 응집을 더 적게 형성하였다 (도 3B-E). DARCVHH-EBV P23 (C46S)*의 가용성을 개선하기 위하여 유사한 접근법을 수행하였다 (데이터 미도시).
컨셉에 대한 증거를 다른 컨쥬게이션 시스템에 대해 확장하기 위하여, 플라스모디움 팔시파룸에 의해 감염된 태반 기원의 적혈구의 표면에 존재하는 플라스모디움 팔시파룸 단백질을 인식할 수 있는 VHH 서열 (VAR2CSAVHH)을 또한 EBV P18 및 EBV P23 항원에 융합시켰다. DARCVHH 컨쥬게이트와 유사하게, EBV P18 및 EBV P23의 N-말단 클러스터의 제거는 용액 내 컨쥬게이트 가용성 및 안정성을 급격하게 개선하였다. 모든 제조된 컨스트럭트의 겔 전기영동 분석은 본 연구에서 사용된 고순도의 재조합 단백질을 나타내었다 (도 4B).
각 분자 표적에 대한 DARCVHH-EBV P18 항원 컨쥬게이트 및 VAR2CSAVHH EBV P18 항원 컨쥬게이트의 친화력을 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다. 컨쥬게이트의 각 표적에 대한 특이성 및 친화력은 VHH 단독의 친화력과 비교할 때 유의하게 수정되지 않았다 (도 5).
본 발명의 컨셉의 증거는 3개의 다른 컨쥬게이션 시스템에서 추가로 입증되었다:
ㆍ 그의 정제가 성공적인, EBV P18F3 항원에 융합된 CD20 (암 세포에 의해 흔히 과발현되는 마커)을 인식할 수 있는 scFv 서열 (도 10); 및
· 정제가 또한 성공적인, EBV P18F3 항원에 융합된 EPCR 수용체 (도 16).
ㆍ 정제가 또한 성공적인, EBV P18F3 항원에 융합된 VAR2CSA 변이체 단백질 (도 10)
2.2. 컨쥬게이트의 면역 인식
컨쥬게이트의 면역 인식을 반영하는 면역글로불린 G 역가를 EBV 감염에 양성인 12명의 건강한 공여자로부터의 혈장의 연속 희석액에 의해 확인하였다. DARCVHH-EBV P18F2는 상기 혈장에 존재하는 IgG에 의해 매우 잘 인식되었다 (표 2 및 도 6A). 컨쥬게이트 DARCVHH-EBV P18 (C56S)*, 및 DARCVHH-EBV P23 (C46S)*로 유사한 데이터를 얻었다.
12명의 EBV+ 공여자로부터의 혈장 내 IgG 역가 (항- DARCVHH-EBV P18F2).
공여자 ID IgG 역가
#20120621 460
#2012061 840
#20120312 230
#20120327 190
#20121029 130
#20120618 70
#20121001 440
#20120220 120
#20130313 360
#20120820 60
#201502171 430
#2015021711 2300
평균 (표준편차): 470 (618)
22개의 혈장 샘플 (1/200 희석)을 이용하여 수행한 면역 인식 비교 연구는 P18의 C-말단 부분이 면역-우세 에피토프를 가짐을 보여준다. EBV P18F2 및 EBV P18F3을 포함하는 컨쥬게이트 간에는 인식에서 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다.
2.3. 컨쥬게이트의 세포 표면 인식
컨쥬게이트에 의한 원래의 (native) 표적의 인식은 유세포 계수법으로 측정하였다.
DARCVHH-EBV P18F2는 FY+ (DARC+) 적혈구의 표면을 용량 의존성 방식으로 코팅할 수 있었다 (도 7). 250 ng 미만의 DARCVHH-EBV P18F2는 1,000,000 적혈구에 존재하는 모든 VHH-특이적 DARC-에피토프를 포화시키기에 충분하였다. 유사한 방식으로, VAR2CSAVHH- EBV P18F2는 그 표면에 VAR2CSA를 발현하는 플라스모디움 팔시파룸 감염된 적혈구를 코팅할 수 있었다.
hCD20ScFv-P18F3 컨쥬게이트는 CD20+ RAJI 세포를 코팅할 수 있다 (도 11).
VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트 CSA+ RAJI 세포를 코팅할 수 있다 (도 11).
EPCR-P18F3 컨쥬게이트는 용량 의존성 방식으로 VAR19-발현 적혈구의 표면을 코팅할 수 있다 (도 17).
2.4. 상기 세포를 표적하는 컨쥬게이트에 의한 적혈구 옵소닌화
뿐만 아니라, 세포-결합된 컨쥬게이트를 EBV+ 공여자의 혈장 샘플과 배양하면 FY+ (DARC+) 적혈구 옵소닌화, 즉, 공여자 혈장 IgG에 의한 세포의 코팅이 나타난다 (도 8A). 이는 또한 FY+ 적혈구를 DARCVHH-EBV P18F3 및 인간 혈장 (EBV 양성)와 연속적으로 배양하는 것이 세포의 응집을 유도하는 응집 어세이에서 설명되었다 (도 8B).
2.5. 옵소닌 식작용 어세이
식세포 어세이는 DARCVHH-EBV P18 및 EBV P23 항원 융합으로 처리함에 따른 THP1 단핵구에 의한 적혈구의 증가된 옵소닌 식작용을 보여주었다. 사실, 컨쥬게이트 DARCVHH-EBV P18 (C56S)*는 THP1-유래 대식세포에 의한 FY+ 적혈구의 옵소닌 식작용을 매개하였다 (도 9A). DARCVHH-EBV P18F3 (도 9B), 및 또한 EPCR-P18F3 컨쥬게이트 (VAR19-발현 감염된 적혈구를 이용함) 처리에 따라 유사한 관측을 수행하였다 (도 18).
세포-결합된 hCD20ScFv-P18F3 및 VAR2CSA-P18F3 컨쥬게이트를 EBV+ 공여자의 혈장 샘플과 배양하는 것은 RAJI 옵소닌화, 즉, 공여자 혈장 IgG에 의한 세포의 코팅을 또한 유도한다 (도 12 및 13).
흥미롭게도, FY+ 적혈구를 상이한 EBV P18 단편에 융합된 DARCVHH로 처리하는 것은 상기 단편이 IgG를 유도하는 능력과 유발된 세포 반응의 강도 간의 관계를 보여준다 (도 9C). 특히, 도 9C의 결과는 (i) 세포 반응 (식작용)과 옵소닌화를 위해 사용된 혈장으로부터의 항체 역가 (항-P18) 간의 관계, 및 (ii) 더 나은 반응을 보이는 P18F3 항원인, 상이한 P18 단편 간에 상이한 P18에 대한 혈장 반응성을 보여준다.
이러한 결과는, 결합 모이어티-EBV P18 또는 EBV P23 융합 단백질 처리 후에 정의된 표적 세포의 면역 제거가 이루어질 수 있음을 보여주는 최초의 유망한 시험관내 데이터이다.
2.6. 보체 활성화
보체 활성화 어세이는 가장 그럴듯한 고전적 항체 의존성 경로인 hCD20ScFv-P18F3 컨쥬게이트 처리에 따른 보체 연속반응의 증가된 활성화를 보여준다. 이는 표적 세포 용해를 초래할 세포 표면에서의 막공격 복합체의 형성에 의해 설명된다 (도 14).
2.7. ADCC
ADCC 어세이는 hCD20ScFv-P18F3 또는 VAR2CSA-P18F3으로 전처리된 표적 세포 (RAJI)에 의한 적격 (competent) 효과기 세포 내 NFAT 경로의 증가된 활성화를 보여주었다. 이는 EBV+ 혈장의 존재 하에서 발생하는 표적 세포의 옵소닌화가 효과기 세포 상의 표면 Fc 수용체의 관여 및 결국 표적 세포 용해를 유도할 그 이후의 세포내 경로의 활성화를 유도한다는 것을 반영한다 (도 15).
3. 결론
면역치료는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)뿐만 아니라 암 세포, 감염성 질환에 대해서도 사용되고 있다. 흥미롭게도, 최근의 연구는 단일클론 항체 치료 이후에 대식세포가 의존성 FcγRI 및 FcγRIV 식작용을 통해 순환 종양 세포를 제거함을 보여준다. 이에 제한되는 것은 아니나, Fab 항체, Fab' 항체, F(ab')2 항체, Fv 항체, scFv 항체, 낙타과 단일 영역 항체 (VHH), 및 상어 단일 영역 항체 (VNAR)를 포함하는 "항체 단편" 또는 "항체-결합 단편" 또는 대안의 "단백질 및 비-단백질" 모이어티에 의해 세포 매개 Fc 효과기 기능이 유도되지 않았다. 하나의 가능성은 Fc 사슬을 모이어티를 표적하는 것에 융합하는 것이다. 그러나, Fc 사슬을 첨가하는 것은 작은 공강 및 빈틈 (small cavities and clefts) 내 존재하는 에피토프의 접근 가능성을 감소시킬 뿐만 아니라 재조합 발현의 어려움을 초래한다.
본 발명은 이러한 문제를 극복하기 위하여, 원치 않는 표적 세포 및/또는 미생물에 대한 EBV-존재하는 (또는 기존의) 면역 반응을 전환할 수 있는 새로운 그리고 획기적인 면역원성 컨스트럭트를 제안한다. EBV 항원에 융합되는 표적화 모이어티가 정의된 표적의 옵소닌화, 및 면역 복합체의 형성 및 뒤이은 상기 표적의 제거를 촉진할 수 있다는 컨셉의 증거를 제공하기 위하여, 본 명세서에서 3개의 시험관내 모델을 사용하였다. 첫 번째 모델에서, 적혈구의 표면에 발현된 단백질을 표적하는 단일 영역 항체 (DARCVHH)는 한 쌍의 상이한 EBV 항원 (EBV P18 및 EBV P23)에 결합되었다. 두 번째 모델에서, 플라스모디움 팔시파룸 감염된 적혈구의 표면에 발현된 말라리아 단백질 (각각 VAR2CSApfEMP1 및 VAR19pfEMP1)을 표적하는, 단일 영역 항체 (VAR2CSAVHH) 및 항체 (EPCR)로부터 유래하지 않은 단백질성 결합 모이어티는 EBV P18에 결합되었다. 세 번째 모델에서, B 세포 (B 림프종 포함)의 표면에 존재하는 CD20 분자 또는 암세포의 표면에 과발현된 CSA를 각각 표적하는, CD20 (Cluster of Differentiation 20) 및 항체로부터 유래하지 않은 단백질성 결합 모이어티 (VAR2CSA)에 직접 작용하는 scFv 항체 (hCD20ScFv)는 EBV P18에 결합되었다.
본 연구는 설계된 컨쥬게이트가 표적 세포, 각각 적혈구, 플라스모디움 팔시파룸 감염된 적혈구, 암 세포를 옵소닌화하고 그들의 제거를 면역 효과기 매커니즘, 즉, 옵소닌 식작용, ADCC 및 CDC에 의해 촉진할 수 있는 능력을 보여준다.
EBV P18 및 EBV P23의 N-말단 영역은 단백질 발현의 장애물로 생각되며, 이는 단백질 가용성과 안정성을 상당히 감소시킨다. EBV P18 및 EBV P23의 N-말단 부분의 제거는 컨쥬게이트가 가용성 발현 및 정제되도록 한다 (도 1 내지 4). 단백질 링커의 VHH 및 EBV 항원 사이의 존재는 올바른 단백질 생산을 위해 필수적인 것은 아니다.
중요하게도, 표면 플라스몬 공명 실험은 정의된 표적에 대한 결합 모이어티 (DARCVHH 및 VAR2CSAVHH)의 친화력 및 특이성이 EBV-항원에의 융합에 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다 (도 5).
EBV 양성 개체로부터의 혈장을 이용하여 수행된 면역 인식 실험은 EBV P18 또는 EBV P23을 포함하는 컨쥬게이트가 순환 IgG에 의해 매우 잘 인식됨을 보여준다 (도 6). F4가 IgG를 유도하기 위해 여전히 효과적이더라도, EBV P18 단편 EBV P18F3 (8.4 kDa)을 포함하는 컨쥬게이트는 최대의 IgG 반응성을 부여하는 EBV P18의 가장 짧은 단편으로 나타났다. EBV P18F3은 다양한 결합 모이어티에 융합되기에 알맞은 EBV 항원으로 나타났으며, 이는 다양한 면역 효과기를 표적 부위에 유도하도록 한다. 나아가 이는 i) DARCVHH-EBV P18F3이 EBV+ 인간 혈장의 존재 하에서 적혈구의 응집을 매개하는 것으로 나타난 응집 어세이 (도 8) 및 ii) EPCR-EBV P18F3, hCD20ScFv-EBV P18F3 및 VAR2CSA-EBV P18F3이 감염된 적혈구의 표면 (EPCR-EBV P18F3에 대하여) 및 RAJI 암 세포의 표면 (hCD20ScFv-EBV P18F3 및 VAR2CSA-EBV P18F3에 대하여)으로 혈장 IgG를 유도하여 면역 복합체의 형성을 이끄는 것으로 나타난 옵소닌화 어세이 (도 12, 13 및 17)에 의해 확인된다.
주요 관심사로서, 컨쥬게이트에 의해 매개된 면역 복합체의 형성은 면역 효과기 반응을 유도한다. DARC+ 적혈구에 대한 DARCVHH-EBV P18F3 처리는 대식세포에 의한 제거를 촉진한다 (도 9). EBV 단편 면역 인식의 결과와 비슷하게, DARCVHH-EBV P18F3은 DARCVHH-EBV P18F4보다는 옵소닌 식작용을 유도하기에 더 강력하다 (도 9).
나아가, 표적 세포를 P18F3 컨쥬게이트로 처리하는 것은 또한 i) 적격 효과기 세포에 의한 ADCC (도 15) 및 ii) 보체 연속반응의 활성화 (도 15) 및 표적 세포의 표면에서의 MAC (막공격 복합체)의 형성을 유도한다.
종합하면, 이러한 결과는 DARCVHH-EBV P18F3, EPCR-EBV P18F3, hCD20ScFv-EBV P18F3 및 VAR2CSA-EBV P18F3과 같은 면역원성 컨스트럭트가 존재하는 EBV 면역 반응을 특정 표적에 대하여 전환하여, 연속적으로 면역 복합체의 형성 및 결국 표적 제거를 유도하는 옵소닌 식작용, ADCC 및 CDC와 같은 뒤이은 면역 효과기 매커니즘의 유도를 초래할 수 있음을 보여준다.
안정적이고 생산하기 쉬우며 표적 성분의 옵소닌화에 매우 효과적인 제제의 유형은 단독 또는 병원체 및 암에 대항하기 위한 기존의 치료법과 조합되어 임상적 개입에서 매우 큰 가치를 지닌다.
참고 문헌
Aird WC, Mosnier LO, and Fairhurst RM (2014). Blood; 123(2): 163-167.
Birch CM, Hou HW, Han J, Niles JC (2015). Sci Rep.;5:11347.
Chan CL, Renia L, and Tan KS (2012). PLoS One; 7(6):e38523.
Chen X, Zaro JL, Shen WC (2013). Adv Drug Deliv Rev; 65(10):1357-1369.
Clausen TM, Christoffersen S, Dahlb*?*ck M, Langkilde AE, Jensen KE, Resende M, Agerbæk MØ, Andersen D, Berisha B, Ditlev SB, Pinto VV, Nielsen MA, Theander TG, Larsen S, and Salanti A (2012). J Biol Chem.; ;287(28):23332-45.
Conrath K, Vincke C, Stijlemans B, Schymkowitz J, Decanniere K, Wyns L, Muyldermans S, and Loris R (2005).
Estevez MC, Huang YF, Kang H, O'Donoghue MB, Bamrungsap S, Yan J, Chen X, Tan W (2010). Methods Mol Biol; 624:235-248. J.Mol.Biol.; 350: 112-125.
Eudes R, Le Tuan K, Delettre J, Mornon JP, Callebaut I (2007). BMC Struct Biol; 7: 2.
Harboe M, Thorgersen EB, and Mollnes TE (2011). Adv Drug Deliv Rev; 63(12):976-987.
Hu W, Li F, Yang X, Li Z, Xia H, et al. (2004). J Biotechnol; 107: 83-90.
Jiang XR, Song A, Bergelson S, Arroll T, Parekh B, May K, Chung S, Strouse R, Mire-Sluis A, and Schenerman M (2011). Nat Rev Drug Discov; 10(2):101-111.
Liu AY, Robinson RR, Murray ED Jr, Ledbetter JA, Hellstr
Figure pct00001
m I, and Hellstroem KE (1987). J Immunol. ;139(10):3521-6.
Nunes-Silva S, Gangnard S, Vidal M, Vuchelen A, Dechavanne S, Chan S, Pardon E, Steyaert J, Ramboarina S, Chene A et al. (2014). Sci Rep; 4:7373.
Olafsen T, Betting D, Kenanova VE, Salazar FB, Clarke P, Said J, Raubitschek AA, Timmerman JM, and Wu AM (2009). J Nucl Med.; 50(9):1500-8.
Otz T, Grosse-Hovest L, Hofmann M, Rammensee HG, and Jung G. Leukemia; 23(1):71-7.
Skrlec K, Strukelj B, and Berlec A (2015). Trends in Biotechnology; 33(7): 408-418.
Smolarek D, Hattab C, Hassanzadeh-Ghassabeh G, Cochet S, Gutierrez C, de Brevern AG, Udomsangpetch R, Picot J, Grodecka M, Wasniowska K, Muyldermans S, Colin Y, Le Van Kim C, Czerwinski M, and Bertrand O (2010). Cell Mol Life Sci.; 67(19):3371-87.
Srivastava A1, Gangnard S, Dechavanne S, Amirat F, Lewit Bentley A, Bentley GA, and Gamain B (2011). PLoS One .;6(5):e20270.
Stoltenburg R, Reinemann C, and Strehlitz B (2007). Biomol Eng.;24(4):381-403.
Zwicke GL, Mansoori GA, and Jeffery CJ (2012). Nano Rev, 3: 18496.
Wu J, Nantz MH, and Zern MA (2012). Front Biosci; 7:d717-725.
Vogt AM, Barragan A, Chen Q, Kironde F, Spillmann D, and Wahlgren M (2003). Blood; 101(6):2405-2411.
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM) CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (C.N.R.S.) UNIVERSITE PARIS DIDEROT PARIS - 7 INSTITUT NATIONAL TRANSFUSION SANGUINE <120> IMMUNOGENIC CONSTRUCT COMPRISING AN EBV-CELL ANTIGEN AND A TARGETING MOIETY AND APPLICATIONS THEREOF <130> IPA180721-FR <150> EP15307014.9 <151> 2015-12-15 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1 <212> PRT <213> artificial <220> <223> polyproline linker (can be repeated between 2 and 8, inclusive) <400> 1 Pro 1 <210> 2 <211> 1 <212> PRT <213> artificial <220> <223> polyglycine linker (can be repeated between 6 and 8, inclusive) <400> 2 Gly 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> glycine-serine linker (can be repeated between 2 and 5, inclusive) <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Alpha-helix-forming linker A(EAAAK)nA (amino acid sequence from position 2 to position 6 can be repeated between 2 and 5, inclusive) <400> 4 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> proline-alanine linker <400> 5 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> glycine-serine linker (repeated between 2 and 5, inclusive) <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> glycine-serine linker <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 8 <211> 126 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DARC VHH <400> 8 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 128 <212> PRT <213> artificial <220> <223> DARC VHH with restriction site <400> 9 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VAR2CSA VHH <400> 10 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 125 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VAR2CSA VHH with restriction site <400> 11 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VSG VHH <400> 12 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Pro Cys 20 25 30 Thr Thr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Pro Gly Thr Ile Tyr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Gln Arg Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Ile Gln Cys Gly Val Arg Ser Ile Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VSG VHH with restriction site <400> 13 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Pro Cys 20 25 30 Thr Thr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Pro Gly Thr Ile Tyr Tyr Gln Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Gln Arg Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gln 85 90 95 Ile Gln Cys Gly Val Arg Ser Ile Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 14 <211> 198 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EPCR amino-acid 18-210 <400> 14 Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu Gln Ile Ser Tyr Phe Arg 1 5 10 15 Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn Ala Ser Leu Gly Gly His 20 25 30 Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ile Ile Gln 35 40 45 Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp Ala Arg Thr Gln Ser Gly 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly Leu Val Arg Leu Val His 65 70 75 80 Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr Ile Arg Cys Phe Leu Gly 85 90 95 Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala His Val Phe Phe Glu Val 100 105 110 Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe Arg Pro Glu Arg Ala Leu 115 120 125 Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly Val Val Thr Phe Thr Leu 130 135 140 Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Glu Phe 145 150 155 160 Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln Lys His Ile Ser Ala Glu 165 170 175 Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Leu Val Leu 180 185 190 Gly Val Leu Val Gly Ser 195 <210> 15 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> consensus full length EBV P18 antigen <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Ala can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (126)..(126) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (136)..(136) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (148)..(148) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (149)..(149) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (165)..(165) <223> Gln can be replaced by His <400> 15 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 16 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> consensus full length EBV 23 antigen <220> <221> VARIANT <222> (39)..(39) <223> Gln can be replaced by Arg <220> <221> VARIANT <222> (55)..(55) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (56)..(56) <223> Pro can be replaced by Thr <220> <221> VARIANT <222> (89)..(89) <223> Asp can be replaced by Glu <220> <221> VARIANT <222> (104)..(104) <223> Met can be replaced by Leu <220> <221> VARIANT <222> (106)..(106) <223> Asn can be replaced by Lys <220> <221> VARIANT <222> (132)..(132) <223> Thr can be replaced by Pro <220> <221> VARIANT <222> (134)..(134) <223> Pro can be replaced by Leu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (135)..(135) <223> Arg can be replaced by Asn or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (136)..(136) <223> Glu can be replaced by Asp or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (137)..(137) <223> Ser can be replaced by Pro or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (138)..(138) <223> Asn can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (142)..(142) <223> Ala can be replaced by Thr, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> (148)..(148) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (149)..(149) <223> Arg can be absent <220> <221> VARIANT <222> (153)..(153) <223> Arg can be replaced by Cys <220> <221> VARIANT <222> (155)..(155) <223> Ala can be replaced by Ser <400> 16 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 17 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus B95-8 strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 17 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 18 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 18 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 19 <211> 174 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 19 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 <210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 20 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Asn Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 21 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 21 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Val Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 22 <211> 176 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P18 antigen <400> 22 Met Ser Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 23 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus B95-8 strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 23 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 24 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 24 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 25 <211> 159 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 25 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 <210> 26 <211> 159 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 26 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Lys Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 <210> 27 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 27 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Ser Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 28 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 28 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Val Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 29 <211> 159 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 29 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Arg Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 <210> 30 <211> 159 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 30 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Thr Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 <210> 31 <211> 160 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 31 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 160 <210> 32 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 32 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Ser Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 33 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 33 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Pro Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 34 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 34 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Thr Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 35 <211> 159 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 35 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Lys Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 145 150 155 <210> 36 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 36 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Glu Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 37 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 37 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ser Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 38 <211> 162 <212> PRT <213> Epstein Barr virus alternative strain <220> <221> MISC_FEATURE <223> wt full length EBV P23 antigen <400> 38 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Cys Glu Ser Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 39 <211> 176 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV mutated P18 antigen (C56S)* <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Ala can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (126)..(126) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (136)..(136) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (148)..(148) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (149)..(149) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (165)..(165) <223> Gln can be replaced by His <400> 39 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 40 <211> 162 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV mutated P23 antigen (C46S)* <220> <221> VARIANT <222> (39)..(39) <223> Gln can be replaced by Arg <220> <221> VARIANT <222> (55)..(55) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (56)..(56) <223> Pro can be replaced by Thr <220> <221> VARIANT <222> (89)..(89) <223> Asp can be replaced by Glu <220> <221> VARIANT <222> (104)..(104) <223> Met can be replaced by Leu <220> <221> VARIANT <222> (106)..(106) <223> Asn can be replaced by Lys <220> <221> VARIANT <222> (132)..(132) <223> Thr can be replaced by Pro <220> <221> VARIANT <222> (134)..(134) <223> Pro can be replaced by Leu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (135)..(135) <223> Arg can be replaced by Asn or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (136)..(136) <223> Glu can be replaced by Asp or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (137)..(137) <223> Ser can be replaced by Pro or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (138)..(138) <223> Asn can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (142)..(142) <223> Ala can be replaced by Thr, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> (148)..(148) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (149)..(149) <223> Arg can be absent <220> <221> VARIANT <222> (153)..(153) <223> Arg can be replaced by Cys <220> <221> VARIANT <222> (155)..(155) <223> Ala can be replaced by Ser <400> 40 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 41 <211> 176 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV mutated P18 antigen (C56S)* <400> 41 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 20 25 30 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 35 40 45 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 50 55 60 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 85 90 95 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 115 120 125 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 165 170 175 <210> 42 <211> 162 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV mutated P23 antigen (C46S)* <400> 42 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 1 5 10 15 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 20 25 30 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 65 70 75 80 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 85 90 95 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 100 105 110 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp <210> 43 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P18 antigen fragment F4 <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Gln can be replaced by His <400> 43 Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 20 <210> 44 <211> 94 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P18 antigen fragment F3' <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (66)..(66) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (83)..(83) <223> Gln can be replaced by His <400> 44 Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala 20 25 30 Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val 35 40 45 Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 85 90 <210> 45 <211> 84 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P18 antigen fragment F2-F4 <220> <221> VARIANT <222> (57)..(57) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (79)..(79) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (80)..(80) <223> Ser can be absent <400> 45 Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala 35 40 45 Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala <210> 46 <211> 71 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus EBV P18 antigen fragment F3'-F4 <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (66)..(66) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Ser can be absent <400> 46 Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala 20 25 30 Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val 35 40 45 Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala 65 70 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus EBV P18 antigen fragment P18F5 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Ser can be replaced by Asn <400> 47 Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ser Gly Ala 20 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus EBV P18 antigen fragment P18F6 <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Ser can be replaced by Asn <400> 48 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P18 antigen fragment F2 <220> <221> VARIANT <222> (57)..(57) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (67)..(67) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (79)..(79) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (80)..(80) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (96)..(96) <223> Gln can be replaced by His <400> 49 Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala 35 40 45 Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln 85 90 95 Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 100 105 <210> 50 <211> 60 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P23 antigen fragment F3 <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Met can be replaced by Leu <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Asn can be replaced by Lys <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Thr can be replaced by Pro <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Pro can be replaced by Leu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Arg can be replaced by Asn or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (34)..(34) <223> Glu can be replaced by Asp or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (35)..(35) <223> Ser can be replaced by Pro or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (36)..(36) <223> Asn can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (40)..(40) <223> Ala can be replaced by Thr, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> (46)..(46) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (47)..(47) <223> Arg can be absent <220> <221> VARIANT <222> (51)..(51) <223> Arg can be replaced by Cys <220> <221> VARIANT <222> (53)..(53) <223> Ala can be replaced by Ser <400> 50 Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser 1 5 10 15 Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro 20 25 30 Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser 35 40 45 Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 50 55 60 <210> 51 <211> 88 <212> PRT <213> artificial <220> <223> consensus EBV P23 antigen fragment F2 <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> Asp can be replaced by Glu <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Met can be replaced by Leu <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Asn can be replaced by Lys <220> <221> VARIANT <222> (58)..(58) <223> Thr can be replaced by Pro <220> <221> VARIANT <222> (60)..(60) <223> Pro can be replaced by Leu or Ser <220> <221> VARIANT <222> (61)..(61) <223> Arg can be replaced by Asn or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (62)..(62) <223> Glu can be replaced by Asp or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (63)..(63) <223> Ser can be replaced by Pro or can be absent <220> <221> VARIANT <222> (64)..(64) <223> Asn can be replaced by Ser <220> <221> VARIANT <222> (68)..(68) <223> Ala can be replaced by Thr, Ser or Asn <220> <221> VARIANT <222> (74)..(74) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (75)..(75) <223> Arg can be absent <220> <221> VARIANT <222> (79)..(79) <223> Arg can be replaced by Cys <220> <221> VARIANT <222> (81)..(81) <223> Ala can be replaced by Ser <400> 51 Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn 20 25 30 Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala 35 40 45 Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn 50 55 60 Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 85 <210> 52 <211> 23 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F4 <400> 52 Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 20 <210> 53 <211> 92 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F3' <400> 53 Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln 1 5 10 15 Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser 20 25 30 Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser 35 40 45 Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala 50 55 60 Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro 65 70 75 80 His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 85 90 <210> 54 <211> 84 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F2-F4 <400> 54 Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala 35 40 45 Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala <210> 55 <211> 71 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F3'-F4 <400> 55 Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro 1 5 10 15 Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala 20 25 30 Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val 35 40 45 Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala 50 55 60 Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala 65 70 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment P18F5 <400> 56 Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ser Gly Ala 20 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment P18F6 <400> 57 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F2 <400> 58 Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala 35 40 45 Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser 50 55 60 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His 85 90 95 Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 100 105 <210> 59 <211> 60 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P23 antigen fragment F3 <400> 59 Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser 1 5 10 15 Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro 20 25 30 Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser 35 40 45 Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 50 55 60 <210> 60 <211> 88 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P23 antigen fragment F2 <400> 60 Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys 1 5 10 15 Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn 20 25 30 Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala 35 40 45 Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn 50 55 60 Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 85 <210> 61 <211> 324 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - glycine serine linker - EBV wt full length P18 antigen <400> 61 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly 145 150 155 160 Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln 165 170 175 Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln 180 185 190 Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr 195 200 205 Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys 210 215 220 Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala 245 250 255 Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln 260 265 270 Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala 275 280 285 Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala 305 310 315 320 Arg Lys Lys Gln <210> 62 <211> 324 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - glycine serine linker - EBV mutated P18 antigen (C56S)* <400> 62 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly 145 150 155 160 Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln 165 170 175 Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln 180 185 190 Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr 195 200 205 Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys 210 215 220 Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly 225 230 235 240 Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala 245 250 255 Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln 260 265 270 Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala 275 280 285 Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala 305 310 315 320 Arg Lys Lys Gln <210> 63 <211> 304 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV mutated P18 antigen (C56S)* <400> 63 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala 130 135 140 Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu 165 170 175 Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr 180 185 190 Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala 195 200 205 Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala 210 215 220 Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala 225 230 235 240 Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro 245 250 255 Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala 260 265 270 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 290 295 300 <210> 64 <211> 235 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P18 antigen fragment F2 <400> 64 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln 145 150 155 160 Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala 165 170 175 Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser 180 185 190 Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His 210 215 220 Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 225 230 235 <210> 65 <211> 220 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P18 antigen fragment F3' <400> 65 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln 130 135 140 Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser 145 150 155 160 Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser 165 170 175 Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala 180 185 190 Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro 195 200 205 His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 210 215 220 <210> 66 <211> 151 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P18 antigen fragment F4 <400> 66 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro 130 135 140 Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 145 150 <210> 67 <211> 232 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate VAR2CSA VHH (with restriction site)- EBV P18 antigen fragment F2 <400> 67 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Arg Gln Arg 115 120 125 Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His 130 135 140 Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr 165 170 175 Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser 180 185 190 Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala 210 215 220 Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 225 230 <210> 68 <211> 217 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate VAR2CSA VHH (with restriction site)- EBV P18 antigen fragment F3' <400> 68 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ala 115 120 125 His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln 130 135 140 Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser 145 150 155 160 Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser 165 170 175 Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr 195 200 205 Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 210 215 <210> 69 <211> 148 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate VAR2CSA VHH (with restriction site) - EBV P18 antigen fragment F4 <400> 69 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Asp Thr 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala 130 135 140 Arg Lys Lys Gln 145 <210> 70 <211> 310 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - glycine serine linker - EBV wt full length P23 antigen <400> 70 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val 145 150 155 160 Lys Ala Val Asp Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg 165 170 175 Leu Glu Ser Glu Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly 180 185 190 Ala Cys Ala Ser Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro 195 200 205 Glu Pro Leu Thr Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr 210 215 220 Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu 245 250 255 Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly 260 265 270 Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro 275 280 285 Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys 290 295 300 Lys Val Gln Ile Ser Asp 305 310 <210> 71 <211> 310 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - glycine serine linker - EBV mutated P23 antigen (C46S)* <400> 71 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val 145 150 155 160 Lys Ala Val Asp Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg 165 170 175 Leu Glu Ser Glu Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly 180 185 190 Ala Ser Ala Ser Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro 195 200 205 Glu Pro Leu Thr Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr 210 215 220 Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg 225 230 235 240 Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu 245 250 255 Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly 260 265 270 Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro 275 280 285 Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys 290 295 300 Lys Val Gln Ile Ser Asp 305 310 <210> 72 <211> 290 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV mutated P23 antigen(C46S)* <400> 72 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp 130 135 140 Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu 145 150 155 160 Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser 165 170 175 Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr 180 185 190 Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala 195 200 205 Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp 210 215 220 Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr 225 230 235 240 Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro 245 250 255 Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg 260 265 270 Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile 275 280 285 Ser Asp 290 <210> 73 <211> 216 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P23 antigen fragment F2 <400> 73 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys 130 135 140 Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn 145 150 155 160 Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala 165 170 175 Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn 180 185 190 Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu 195 200 205 Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 210 215 <210> 74 <211> 188 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P23 antigen fragment F3 <400> 74 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser 130 135 140 Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser 165 170 175 Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp 180 185 <210> 75 <211> 72 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Consensus EBV P18 antigen fragment F3 <220> <221> VARIANT <222> (22)..(22) <223> Ala can be replaced by Val <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> Ser can be replaced by Asn <220> <221> VARIANT <222> (44)..(44) <223> Ala can be absent <220> <221> VARIANT <222> (45)..(45) <223> Ser can be absent <220> <221> VARIANT <222> (61)..(61) <223> Gln can be replaced by His <400> 75 Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala 50 55 60 Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 65 70 <210> 76 <211> 72 <212> PRT <213> artificial <220> <223> EBV P18 antigen fragment F3 <400> 76 Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala 50 55 60 Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 65 70 <210> 77 <211> 200 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate DARC VHH (with restriction site) - EBV P18 antigen fragment F3 <400> 77 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu 35 40 45 Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly 100 105 110 Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr 130 135 140 Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala 180 185 190 Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 195 200 <210> 78 <211> 197 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate VAR2CSA VHH (with restriction site)- EBV P18 antigen fragment F3 <400> 78 Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys 20 25 30 Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala 35 40 45 Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ser 115 120 125 Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala 130 135 140 Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala 145 150 155 160 Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp 165 170 175 Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly 180 185 190 Ala Arg Lys Lys Gln 195 <210> 79 <211> 270 <212> PRT <213> artificial <220> <223> conjugate EPCR amino-acid 18-210 - EBV P18 antigen fragment F3 <400> 79 Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu Gln Ile Ser Tyr Phe Arg 1 5 10 15 Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn Ala Ser Leu Gly Gly His 20 25 30 Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ile Ile Gln 35 40 45 Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp Ala Arg Thr Gln Ser Gly 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly Leu Val Arg Leu Val His 65 70 75 80 Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr Ile Arg Cys Phe Leu Gly 85 90 95 Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala His Val Phe Phe Glu Val 100 105 110 Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe Arg Pro Glu Arg Ala Leu 115 120 125 Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly Val Val Thr Phe Thr Leu 130 135 140 Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Glu Phe 145 150 155 160 Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln Lys His Ile Ser Ala Glu 165 170 175 Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Leu Val Leu 180 185 190 Gly Val Leu Val Gly Ser Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala 195 200 205 Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val 210 215 220 Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly 245 250 255 Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 260 265 270 <210> 80 <211> 245 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Anti-CD20 scFv <400> 80 Met Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser 130 135 140 Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met 145 150 155 160 Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser 195 200 205 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Leu Lys 245 <210> 81 <211> 319 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Anti-CD20 scFv - EBV P18 antigen fragment F3 <400> 81 Met Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln 50 55 60 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp 100 105 110 Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser 130 135 140 Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met 145 150 155 160 Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser 195 200 205 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu 245 250 255 Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser 260 265 270 Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr 275 280 285 Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln 305 310 315 <210> 82 <211> 1016 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VAR2CSA <400> 82 Met Asp Lys Ser Ser Ile Ala Asn Lys Ile Glu Ala Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Lys Ser Asp Asp Ser Lys Ile Asp Gln Ser Leu Lys Ala Asp Pro Ser 20 25 30 Glu Val Gln Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Leu Arg Lys 35 40 45 Asn Ile Cys Lys Ile Thr Val Asn His Ser Asp Ser Gly Thr Asn Asp 50 55 60 Pro Cys Asp Arg Ile Pro Pro Pro Tyr Gly Asp Asn Asp Gln Trp Lys 65 70 75 80 Cys Ala Ile Ile Leu Ser Lys Val Ser Glu Lys Pro Glu Asn Val Phe 85 90 95 Val Pro Pro Arg Arg Gln Arg Met Cys Ile Asn Asn Leu Glu Lys Leu 100 105 110 Asn Val Asp Lys Ile Arg Asp Lys His Ala Phe Leu Ala Asp Val Leu 115 120 125 Leu Thr Ala Arg Asn Glu Gly Glu Arg Ile Val Gln Asn His Pro Asp 130 135 140 Thr Asn Ser Ser Asn Val Cys Asn Ala Leu Glu Arg Ser Phe Ala Asp 145 150 155 160 Ile Ala Asp Ile Ile Arg Gly Thr Asp Leu Trp Lys Gly Thr Asn Ser 165 170 175 Asn Leu Glu Gln Asn Leu Lys Gln Met Phe Ala Lys Ile Arg Glu Asn 180 185 190 Asp Lys Val Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Lys Asp Gln Asn Tyr Arg Lys 195 200 205 Leu Arg Glu Asp Trp Trp Asn Ala Asn Arg Gln Lys Val Trp Glu Val 210 215 220 Ile Thr Cys Gly Ala Arg Ser Asn Asp Leu Leu Ile Lys Arg Gly Trp 225 230 235 240 Arg Thr Ser Gly Lys Ser Asn Gly Asp Asn Lys Leu Glu Leu Cys Arg 245 250 255 Lys Cys Gly His Tyr Glu Glu Lys Val Pro Thr Lys Leu Asp Tyr Val 260 265 270 Pro Gln Phe Leu Arg Trp Leu Thr Glu Trp Ile Glu Asp Phe Tyr Arg 275 280 285 Glu Lys Gln Asn Leu Ile Asp Asp Met Glu Arg His Arg Glu Glu Cys 290 295 300 Thr Ser Glu Asp His Lys Ser Lys Glu Gly Thr Ser Tyr Cys Ser Thr 305 310 315 320 Cys Lys Asp Lys Cys Lys Lys Tyr Cys Glu Cys Val Lys Lys Trp Lys 325 330 335 Ser Glu Trp Glu Asn Gln Lys Asn Lys Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln 340 345 350 Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gln Lys Asn Thr Ser Arg Tyr Asp Asp Tyr 355 360 365 Val Lys Asp Phe Phe Lys Lys Leu Glu Ala Asn Tyr Ser Ser Leu Glu 370 375 380 Asn Tyr Ile Lys Gly Asp Pro Tyr Phe Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ser Phe Ile Leu Asn Ser Ser Asp Ala Asn Asn Pro Ser Glu Lys Ile 405 410 415 Gln Lys Asn Asn Asp Glu Val Cys Asn Cys Asn Glu Ser Gly Ile Ala 420 425 430 Ser Val Glu Gln Glu Gln Ile Ser Asp Pro Ser Ser Asn Lys Thr Cys 435 440 445 Ile Thr His Ser Ser Ile Lys Ala Asn Lys Lys Lys Val Cys Lys His 450 455 460 Val Lys Leu Gly Val Arg Glu Asn Asp Lys Asp Leu Arg Val Cys Val 465 470 475 480 Ile Glu His Thr Ser Leu Ser Gly Val Glu Asn Cys Cys Cys Gln Asp 485 490 495 Phe Leu Arg Ile Leu Gln Glu Asn Cys Ser Asp Asn Lys Ser Gly Ser 500 505 510 Ser Ser Asn Gly Ser Cys Asn Asn Lys Asn Gln Glu Ala Cys Glu Lys 515 520 525 Asn Leu Glu Lys Val Leu Ala Ser Leu Thr Asn Cys Tyr Lys Cys Asp 530 535 540 Lys Cys Lys Ser Glu Gln Ser Lys Lys Asn Asn Lys Asn Trp Ile Trp 545 550 555 560 Lys Lys Ser Ser Gly Lys Glu Gly Gly Leu Gln Lys Glu Tyr Ala Asn 565 570 575 Thr Ile Gly Leu Pro Pro Arg Thr Gln Ser Leu Cys Leu Val Val Cys 580 585 590 Leu Asp Glu Lys Gly Lys Lys Thr Gln Glu Leu Lys Asn Ile Arg Thr 595 600 605 Asn Ser Glu Leu Leu Lys Glu Trp Ile Ile Ala Ala Phe His Glu Gly 610 615 620 Lys Asn Leu Lys Pro Ser His Glu Lys Lys Asn Asp Asp Asn Gly Lys 625 630 635 640 Lys Leu Cys Lys Ala Leu Glu Tyr Ser Phe Ala Asp Tyr Gly Asp Leu 645 650 655 Ile Lys Gly Thr Ser Ile Trp Asp Asn Glu Tyr Thr Lys Asp Leu Glu 660 665 670 Leu Asn Leu Gln Lys Ile Phe Gly Lys Leu Phe Arg Lys Tyr Ile Lys 675 680 685 Lys Asn Asn Thr Ala Glu Gln Asp Thr Ser Tyr Ser Ser Leu Asp Glu 690 695 700 Leu Arg Glu Ser Trp Trp Asn Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Trp Leu Ala 705 710 715 720 Met Lys His Gly Ala Gly Met Asn Ser Thr Thr Cys Cys Gly Asp Gly 725 730 735 Ser Val Thr Gly Ser Gly Ser Ser Cys Asp Asp Ile Pro Thr Ile Asp 740 745 750 Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Gln Glu Trp Val Glu His Phe 755 760 765 Cys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Val Lys Pro Val Ile Glu Asn Cys Lys 770 775 780 Ser Cys Lys Glu Ser Gly Gly Thr Cys Asn Gly Glu Cys Lys Thr Glu 785 790 795 800 Cys Lys Asn Lys Cys Glu Val Tyr Lys Lys Phe Ile Glu Asp Cys Lys 805 810 815 Gly Gly Asp Gly Thr Ala Gly Ser Ser Trp Val Lys Arg Trp Asp Gln 820 825 830 Ile Tyr Lys Arg Tyr Ser Lys Tyr Ile Glu Asp Ala Lys Arg Asn Arg 835 840 845 Lys Ala Gly Thr Lys Asn Cys Gly Pro Ser Ser Thr Thr Asn Ala Ala 850 855 860 Glu Asn Lys Cys Val Gln Ser Asp Ile Asp Ser Phe Phe Lys His Leu 865 870 875 880 Ile Asp Ile Gly Leu Thr Thr Pro Ser Ser Tyr Leu Ser Ile Val Leu 885 890 895 Asp Asp Asn Ile Cys Gly Ala Asp Lys Ala Pro Trp Thr Thr Tyr Thr 900 905 910 Thr Tyr Thr Thr Thr Glu Lys Cys Asn Lys Glu Thr Asp Lys Ser Lys 915 920 925 Leu Gln Gln Cys Asn Thr Ala Val Val Val Asn Val Pro Ser Pro Leu 930 935 940 Gly Asn Thr Pro His Gly Tyr Lys Tyr Ala Cys Gln Cys Lys Ile Pro 945 950 955 960 Thr Asn Glu Glu Thr Cys Asp Asp Arg Lys Glu Tyr Met Asn Gln Trp 965 970 975 Ser Cys Gly Ser Ala Arg Thr Met Lys Arg Gly Tyr Lys Asn Asp Asn 980 985 990 Tyr Glu Leu Cys Lys Tyr Asn Gly Val Asp Val Lys Pro Thr Thr Val 995 1000 1005 Arg Ser Asn Ser Ser Lys Leu Asp 1010 1015 <210> 83 <211> 1088 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VAR2CSA - EBV P18 antigen fragment F3 <400> 83 Met Asp Lys Ser Ser Ile Ala Asn Lys Ile Glu Ala Tyr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Lys Ser Asp Asp Ser Lys Ile Asp Gln Ser Leu Lys Ala Asp Pro Ser 20 25 30 Glu Val Gln Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Leu Arg Lys 35 40 45 Asn Ile Cys Lys Ile Thr Val Asn His Ser Asp Ser Gly Thr Asn Asp 50 55 60 Pro Cys Asp Arg Ile Pro Pro Pro Tyr Gly Asp Asn Asp Gln Trp Lys 65 70 75 80 Cys Ala Ile Ile Leu Ser Lys Val Ser Glu Lys Pro Glu Asn Val Phe 85 90 95 Val Pro Pro Arg Arg Gln Arg Met Cys Ile Asn Asn Leu Glu Lys Leu 100 105 110 Asn Val Asp Lys Ile Arg Asp Lys His Ala Phe Leu Ala Asp Val Leu 115 120 125 Leu Thr Ala Arg Asn Glu Gly Glu Arg Ile Val Gln Asn His Pro Asp 130 135 140 Thr Asn Ser Ser Asn Val Cys Asn Ala Leu Glu Arg Ser Phe Ala Asp 145 150 155 160 Ile Ala Asp Ile Ile Arg Gly Thr Asp Leu Trp Lys Gly Thr Asn Ser 165 170 175 Asn Leu Glu Gln Asn Leu Lys Gln Met Phe Ala Lys Ile Arg Glu Asn 180 185 190 Asp Lys Val Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Lys Asp Gln Asn Tyr Arg Lys 195 200 205 Leu Arg Glu Asp Trp Trp Asn Ala Asn Arg Gln Lys Val Trp Glu Val 210 215 220 Ile Thr Cys Gly Ala Arg Ser Asn Asp Leu Leu Ile Lys Arg Gly Trp 225 230 235 240 Arg Thr Ser Gly Lys Ser Asn Gly Asp Asn Lys Leu Glu Leu Cys Arg 245 250 255 Lys Cys Gly His Tyr Glu Glu Lys Val Pro Thr Lys Leu Asp Tyr Val 260 265 270 Pro Gln Phe Leu Arg Trp Leu Thr Glu Trp Ile Glu Asp Phe Tyr Arg 275 280 285 Glu Lys Gln Asn Leu Ile Asp Asp Met Glu Arg His Arg Glu Glu Cys 290 295 300 Thr Ser Glu Asp His Lys Ser Lys Glu Gly Thr Ser Tyr Cys Ser Thr 305 310 315 320 Cys Lys Asp Lys Cys Lys Lys Tyr Cys Glu Cys Val Lys Lys Trp Lys 325 330 335 Ser Glu Trp Glu Asn Gln Lys Asn Lys Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln 340 345 350 Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gln Lys Asn Thr Ser Arg Tyr Asp Asp Tyr 355 360 365 Val Lys Asp Phe Phe Lys Lys Leu Glu Ala Asn Tyr Ser Ser Leu Glu 370 375 380 Asn Tyr Ile Lys Gly Asp Pro Tyr Phe Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ser Phe Ile Leu Asn Ser Ser Asp Ala Asn Asn Pro Ser Glu Lys Ile 405 410 415 Gln Lys Asn Asn Asp Glu Val Cys Asn Cys Asn Glu Ser Gly Ile Ala 420 425 430 Ser Val Glu Gln Glu Gln Ile Ser Asp Pro Ser Ser Asn Lys Thr Cys 435 440 445 Ile Thr His Ser Ser Ile Lys Ala Asn Lys Lys Lys Val Cys Lys His 450 455 460 Val Lys Leu Gly Val Arg Glu Asn Asp Lys Asp Leu Arg Val Cys Val 465 470 475 480 Ile Glu His Thr Ser Leu Ser Gly Val Glu Asn Cys Cys Cys Gln Asp 485 490 495 Phe Leu Arg Ile Leu Gln Glu Asn Cys Ser Asp Asn Lys Ser Gly Ser 500 505 510 Ser Ser Asn Gly Ser Cys Asn Asn Lys Asn Gln Glu Ala Cys Glu Lys 515 520 525 Asn Leu Glu Lys Val Leu Ala Ser Leu Thr Asn Cys Tyr Lys Cys Asp 530 535 540 Lys Cys Lys Ser Glu Gln Ser Lys Lys Asn Asn Lys Asn Trp Ile Trp 545 550 555 560 Lys Lys Ser Ser Gly Lys Glu Gly Gly Leu Gln Lys Glu Tyr Ala Asn 565 570 575 Thr Ile Gly Leu Pro Pro Arg Thr Gln Ser Leu Cys Leu Val Val Cys 580 585 590 Leu Asp Glu Lys Gly Lys Lys Thr Gln Glu Leu Lys Asn Ile Arg Thr 595 600 605 Asn Ser Glu Leu Leu Lys Glu Trp Ile Ile Ala Ala Phe His Glu Gly 610 615 620 Lys Asn Leu Lys Pro Ser His Glu Lys Lys Asn Asp Asp Asn Gly Lys 625 630 635 640 Lys Leu Cys Lys Ala Leu Glu Tyr Ser Phe Ala Asp Tyr Gly Asp Leu 645 650 655 Ile Lys Gly Thr Ser Ile Trp Asp Asn Glu Tyr Thr Lys Asp Leu Glu 660 665 670 Leu Asn Leu Gln Lys Ile Phe Gly Lys Leu Phe Arg Lys Tyr Ile Lys 675 680 685 Lys Asn Asn Thr Ala Glu Gln Asp Thr Ser Tyr Ser Ser Leu Asp Glu 690 695 700 Leu Arg Glu Ser Trp Trp Asn Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Trp Leu Ala 705 710 715 720 Met Lys His Gly Ala Gly Met Asn Ser Thr Thr Cys Cys Gly Asp Gly 725 730 735 Ser Val Thr Gly Ser Gly Ser Ser Cys Asp Asp Ile Pro Thr Ile Asp 740 745 750 Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Gln Glu Trp Val Glu His Phe 755 760 765 Cys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Val Lys Pro Val Ile Glu Asn Cys Lys 770 775 780 Ser Cys Lys Glu Ser Gly Gly Thr Cys Asn Gly Glu Cys Lys Thr Glu 785 790 795 800 Cys Lys Asn Lys Cys Glu Val Tyr Lys Lys Phe Ile Glu Asp Cys Lys 805 810 815 Gly Gly Asp Gly Thr Ala Gly Ser Ser Trp Val Lys Arg Trp Asp Gln 820 825 830 Ile Tyr Lys Arg Tyr Ser Lys Tyr Ile Glu Asp Ala Lys Arg Asn Arg 835 840 845 Lys Ala Gly Thr Lys Asn Cys Gly Pro Ser Ser Thr Thr Asn Ala Ala 850 855 860 Glu Asn Lys Cys Val Gln Ser Asp Ile Asp Ser Phe Phe Lys His Leu 865 870 875 880 Ile Asp Ile Gly Leu Thr Thr Pro Ser Ser Tyr Leu Ser Ile Val Leu 885 890 895 Asp Asp Asn Ile Cys Gly Ala Asp Lys Ala Pro Trp Thr Thr Tyr Thr 900 905 910 Thr Tyr Thr Thr Thr Glu Lys Cys Asn Lys Glu Thr Asp Lys Ser Lys 915 920 925 Leu Gln Gln Cys Asn Thr Ala Val Val Val Asn Val Pro Ser Pro Leu 930 935 940 Gly Asn Thr Pro His Gly Tyr Lys Tyr Ala Cys Gln Cys Lys Ile Pro 945 950 955 960 Thr Asn Glu Glu Thr Cys Asp Asp Arg Lys Glu Tyr Met Asn Gln Trp 965 970 975 Ser Cys Gly Ser Ala Arg Thr Met Lys Arg Gly Tyr Lys Asn Asp Asn 980 985 990 Tyr Glu Leu Cys Lys Tyr Asn Gly Val Asp Val Lys Pro Thr Thr Val 995 1000 1005 Arg Ser Asn Ser Ser Lys Leu Asp Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly 1010 1015 1020 Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala 1025 1030 1035 Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr 1040 1045 1050 Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr 1055 1060 1065 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly 1070 1075 1080 Ala Arg Lys Lys Gln 1085 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> glycine-serine linker <220> <221> VARIANT <222> (1)..(5) <223> Can be repeated between 2 and 10, inclusive <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Glycine-serine linker <220> <221> VARIANT <222> (1)..(5) <223> Can be repeated between 2 and 6, inclusive <400> 85 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 86 <211> 30 <212> PRT <213> artificial <220> <223> glycine-serine linker <400> 86 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30

Claims (15)

  1. i) 표적 세포 및/또는 미생물에 결합하는 모이어티; 및
    ii) 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) B-세포 항원
    을 포함하는 면역원성 컨쥬게이트(immunogenic moiety).
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적-결합 모이어티는 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원에 공유적으로 커플링되는, 면역원성 컨쥬게이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모이어티는 항체, 그의 결합 단편, 항체 모방체, 세포-표면 수용체, 세포-표면 리간드 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 리간드-결합 단백질인, 면역원성 컨쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab 항체, Fab' 항체, F(ab')2 항체, Fv 항체, 단일 사슬 항체 (scFv), 및 단일-영역 항체, 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 면역원성 컨쥬게이트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모이어티는 비타민, 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 작은 핵산, 저분자 화합물(small chemical compound), 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비-단백질성 모이어티인, 면역원성 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엡스타인-바 바이러스 B-세포 항원은 서열번호 15 서열의 P18 항원, 서열번호 16 서열의 P23 항원, 그의 기능성 변이체 및 기능성 단편, 및 그의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 면역원성 컨쥬게이트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 모이어티가 티올기를 포함하는 경우, P18 및/또는 P23 항원의 기능성 변이체 및 기능성 단편은 임의의 시스테인 잔기를 포함하지 않는, 면역원성 컨쥬게이트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기능성 변이체는 서열번호 39 서열의 P18 항원 기능성 변이체 및 서열번호 40 서열의 P23 항원 기능성 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 면역원성 컨쥬게이트.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 기능성 단편은 상기 항원의 약 10개의 아미노산 잔기 내지 약 150개의 아미노산 잔기를 포함하는, 면역원성 컨쥬게이트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기능성 단편은 서열번호 75 및 서열번호 43 내지 서열번호 49로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하는 P18 항원 기능성 단편, 및/또는 서열번호 50 및 서열번호 51로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 적어도 포함하는 P19 항원 기능성 단편인, 면역원성 컨쥬게이트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 P18 항원 기능성 단편은 서열번호 76 및 서열번호 52 내지 서열번호 58로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지고/이루어지거나, 상기 P23 항원 기능성 단편은 서열번호 59 및 서열번호 60으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 면역원성 컨쥬게이트.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포는 질병에 걸린 세포, 바람직하게는 암 세포 또는 바이러스, 세균, 진균 및/또는 기생충과 같은 병원체에 의해 감염된 세포이고/이거나, 상기 표적 미생물은 병원성 미생물, 바람직하게는 바이러스, 세균, 진균, 및/또는 기생충인, 면역원성 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서,
    - 상기 질병에 걸린 세포는 말라리아 감염된 적혈구이고/이거나 상기 병원성 미생물은 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)이거나; 또는
    - 상기 질병에 걸린 세포는 암 세포인,
    면역원성 컨쥬게이트.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 면역원성 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  15. 의약으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 면역원성 컨쥬게이트, 또는 제14항에 정의된 약학 조성물.
KR1020187019162A 2015-12-15 2016-12-15 Ebv-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용 KR20180124014A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15307014 2015-12-15
EP15307014.9 2015-12-15
PCT/EP2016/081309 WO2017103020A1 (en) 2015-12-15 2016-12-15 Immunogenic construct comprising an ebv-cell antigen and a targeting moiety and applications thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180124014A true KR20180124014A (ko) 2018-11-20

Family

ID=55129470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187019162A KR20180124014A (ko) 2015-12-15 2016-12-15 Ebv-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11147868B2 (ko)
EP (1) EP3389707A1 (ko)
JP (1) JP6968799B2 (ko)
KR (1) KR20180124014A (ko)
CN (1) CN109069617A (ko)
AU (1) AU2016372447A1 (ko)
CA (1) CA3008192A1 (ko)
WO (1) WO2017103020A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220273781A1 (en) * 2019-07-23 2022-09-01 Deutsches Krebsforschungszentrum Polypeptides for treatment of aml

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10307517A1 (de) * 2003-02-21 2004-09-02 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Von Kapsidantigenen des Epstein-Barr-Virus abgeleitete Peptide und ihre Verwendung
EP1790358A1 (en) * 2005-11-23 2007-05-30 Université de Reims Champagne-Ardennes Protein constructs designed for targeting and lysis of cells
BR112013002940A2 (pt) * 2010-08-13 2019-09-24 Baylor Res Institute adjuvantes de nova vacina baseados no direcionamento dos adjuvantes para os anticorpos diretamente às células que apresentam antígenos
JP2015516376A (ja) * 2012-03-19 2015-06-11 ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム Ｔ細胞エピトープを含む、ｂ細胞受容体複合体結合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
CA3008192A1 (en) 2017-06-22
US20180360950A1 (en) 2018-12-20
WO2017103020A1 (en) 2017-06-22
EP3389707A1 (en) 2018-10-24
AU2016372447A1 (en) 2018-07-19
US11147868B2 (en) 2021-10-19
JP2019506372A (ja) 2019-03-07
CN109069617A (zh) 2018-12-21
JP6968799B2 (ja) 2021-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108864290B (zh) 双特异性重组蛋白及其应用
CA3080860A1 (en) Cd47 antigen-binding molecules
JP7118331B2 (ja) Ｈｅｒ３抗原結合性分子
JP7352973B2 (ja) 二重特異性抗体及びその使用
US20220098274A1 (en) Engineered pd-1 variants
KR20220086554A (ko) Her3 항원-결합 분자를 사용한 암의 치료 및 예방
JP2023528036A (ja) Ｔｉｇｉｔに対する抗体
JP2022545117A (ja) 抗ｐｄ－ｌ１シングルドメイン抗体
KR20230079165A (ko) 항-클라우딘18.2 및 cd3 이특이적 항체 및 이의 용도
EP4357365A1 (en) Antibody targeting axl protein and antigen binding fragment thereof, and preparation method therefor and application thereof
KR20180124014A (ko) Ebv-세포 항원 및 표적화 모이어티를 포함하는 면역원성 컨스트럭트 및 그의 응용
EP4335456A1 (en) Binding molecule against dll3 and use thereof
EP4245317A1 (en) Bispecific antibody for claudin 18a2 and cd3 and application of bispecific antibody
WO2022022709A1 (zh) 一种SIRPα-Fc融合蛋白
KR20230154235A (ko) NKp46에 대한 항체 및 이의 적용
WO2013170777A1 (zh) 一种抗vegf抗体的用途
RU2811431C2 (ru) Антитело против клаудина 18a2 и его применение
WO2023088295A1 (zh) 一种多特异性抗体及其药物用途
WO2022135468A1 (zh) 抗bcma×cd3双特异性抗体及其用途
WO2024094159A1 (zh) 靶向人源ror1的单域抗体
WO2023134716A1 (zh) 一种结合b7h3和nkp30的双特异性抗体及其应用
WO2024005713A1 (en) Bispecific antibodies for hbv surface antigen（hbsag）and cd3 and uses thereof
Kroetsch Optimized Engineering Platform for the Generation of Recycling Therapeutic Antibodies
IL309579A (en) VHH-based NKP30 binders
TW202204418A (zh) Ｐｄ－１抗原結合蛋白及其應用