CN109069617A - 包含ebv细胞抗原和靶向部分的免疫原性构建体及其应用 - Google Patents

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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Paris
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National Institute Of Blood Transfusion
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Diderot Paris 7
National Institute of Health Sciences
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Abstract

本发明一般涉及一种免疫原性构建体，用于将存在EBV的免疫应答重定向至非期望的靶细胞和/或微生物，涉及用于制备所述缀合物的方法，涉及包含所述缀合物的药物应用以及其医学应用。

Description

包含EBV细胞抗原和靶向部分的免疫原性构建体及其应用
技术领域
本发明一般涉及一种免疫原性构建体，用于将存在EB病毒(EBV)的免疫应答重定向至非期望的靶细胞和/或微生物，涉及用于制备所述缀合物的方法，涉及包含所述缀合物的药物应用以及其医学应用。
背景技术
免疫疗法是一种旨在调节(即诱导、增强或抑制)身体的免疫应答以对抗病状的治疗，比如癌症、感染性疾病和神经退行性疾病。在过去的25年中已经进行了许多努力来设计这样的免疫原性试剂，即其能够特异性识别疾病细胞和/或病原体，并且通过引发更好的免疫应答或者通过直接的细胞毒性来引发所述不需要的(unwanted)元素的消除。许多靶结合试剂已经被开发用于此目的，比如蛋白和抗体，并且可以与其它活性试剂如微生物毒素或放射性化合物等缀合。
所述试剂的优点之一是它们对靶的特异性，因为它不仅可以使潜在的副作用最小化，而且可以最大化地消除靶。就此而言，抗体特别是单克隆抗体(mAb)和抗体片段如VHH、Fab或scFv，近年来获得了很大关注，因为它们具有识别靶细胞上的单个分子位点或表位的能力。
许多治疗性单克隆抗体的一个主要作用模式依赖于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。不幸的是，文献中报道了对治疗性mAb的不同应答，并且认为至少部分与Fc受体基因序列中的特异性多态性相关。这大大限制了它们在临床上的使用，因为与Fc受体的亲和力对于促进有效的细胞应答是至关重要的。
相比之下，VHH、Fab和scFv不能介导任何Fc效应功能，比如ADCC、调理素吞噬作用和/或补体活化，因为它们恰恰缺乏Fc区。因此需要在那些单链抗体中工程化Fc链以获得Fc效应功能。然而，这种工程化是麻烦的，并且可能会降低存在于小的细胞腔和裂隙中的潜在隐蔽表位的可及性。
因此，本领域需要鉴定可以克服上述限制的可选择的免疫原性试剂。
在本文中发明人出乎意料地发现，与靶向特异性细胞和/或微生物的抗体缀合的EBV B细胞抗原能够在体内触发消除所述不需要的靶的免疫应答，更具体地，通过调理素吞噬作用。令人惊讶的是，如果抗体缺乏Fc区，甚至可以实现这种应答。这最有可能是由于所述EBV抗原产生的间接效应功能。本发明人进一步鉴定了特异性EBV B细胞抗原，并且更具体地，所述抗原的C末端内的特异性区域在与靶结合抗体缀合时显示上述能力。
因此，基于本文公开的发现，本发明首次提供了一种免疫原性缀合物，其包含与靶细胞和/或微生物结合的部分以及EB病毒(EBV)B细胞抗原，提供了用于制备所述缀合物的方法，提供了包含所述缀合物的药物组合物，以及相关的治疗应用。
发明内容
除非本文另有定义，有关本发明使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则本文使用的命名法以及分子生物学、生物化学、化学，免疫学和药理学的技术是本领域公知的和常用的那些。这些技术在文献中有充分的解释(尤其参见：Molecular cloning:A laboratory manual第4版，Sambrook等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,2012；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,2012；Kuby Immunology，Owen等人,第7版,Macmillan Education,2013；Immunology Methods Manual 1-4卷,Lefkovits,Academic Press,1996；Chemistry ofProtein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation，Wong和Jameson,第二版,CRC Press,2011；The Immunoassay Handbook，Wild等人,第4版,Elsevier,2013；Bioconjugate techniques,Hermanson,第3版,Elsevier,2013)。
本发明提供的免疫原性缀合物可以用于在有需要的受试者中重定向免疫应答至清除特异性的不需要的靶细胞或微生物，所述受试者对EBV表现出体液免疫应答。在对EBV的体液免疫应答中，通常可以在受试者的EBV初次感染观察到对EBV存在的体液应答，而在受试者初次感染所述病毒后，对于EBV潜伏的、慢性感染，通常可以观察到对EBV的预先存在的体液应答。
因此，在第一方面中，本发明涉及免疫原性缀合物，其包含：
i)结合靶细胞和/或微生物的部分；和
ii)EB病毒(EBV)B细胞抗原。
术语“免疫原性”在本文中是指当施用于受试者时在体内引发免疫应答的能力。在本发明的上下文中，更具体地，在受试者中施用时，由本发明的缀合物直接触发的所述免疫应答的特征在于靶细胞或微生物的调理素吞噬作用，和/或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或通过抗体依赖性补体活化(和随后的补体依赖性细胞毒性(CDC))对靶进行裂解。优选地，在本文中，所述免疫应答的特征在于靶细胞和/或微生物的调理素吞噬作用。所述免疫应答更具体地由于部分i)与受试者中存在的不需要的靶细胞和/或微生物的结合、和表现出对EBV的体液免疫应答的受试者的抗体对EBV B细胞抗原ii)的免疫识别(即结合)而发生。如以下进一步解释的，在本文中，所述免疫应答是不直接涉及MHC分子的体液应答(即B细胞应答)，其也不涉及任何TCR(T细胞受体)。
在本文中，术语“调理素吞噬作用”涉及在受试者中通过天然吞噬细胞如巨噬细胞摄取并消除不需要的元素(本文中为靶细胞和/或微生物)的过程。这种过程通常通过吞噬细胞Fc受体与复合(即结合)至不需要的元素的受试者抗体的结合和交联来启动，由此形成免疫复合物，从而触发信号转导途径，导致对所述不需要的元素的吞噬作用。
在本文中，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”涉及通过表达Fc受体的非特异性细胞毒性细胞(也称为效应细胞)消除不需要的元素(本文中为靶细胞和/或微生物)的过程，如受试者中的自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和/或嗜酸性粒细胞。通常通过将所述细胞Fc受体结合到与不需要的元素复合(即结合)的受试者抗体上来启动所述过程，从而触发所述不需要的元素的裂解。
在本文中，术语“抗体依赖性补体活化”或“经典补体途径”涉及在受试者中通过膜攻击复合物(MAC)(也称为末端补体复合物或TCC)消除不需要的元素(本文中为靶细胞和/或微生物)的过程。这种过程通常由血浆中存在的C1补体与复合(即结合)至不需要的元素的受试者抗体的结合而启动，从而依次活化所述C1补体并触发分子级联，最终导致形成膜攻击复合物，其在不需要的元素的膜上形成大孔，从而导致其裂解。
本领域技术人员能够测试根据本发明的缀合物是否具有免疫原性。
实际上，EBV B细胞抗原ii)与受试者的抗体以及部分i)与靶细胞/微生物的各自结合，尤其可以通过设计EBV B细胞抗原结合测定和部分结合测定进行评估，其使用本领域常规技术，比如但不限于ELISA(酶联免疫吸附测定)、Western印迹、免疫荧光测定、流式细胞术或表面等离子体共振(The Immunoassay Handbook，Wild等人，第4版，Elsevier，2013)。
此外，调理素吞噬作用、ADCC和抗体依赖性补体活化可以通过本领域常规使用的免疫测定来评估，尤其如Chan等人(2012)、Jian等人(2011)和Harboe等人(2011年)的文献中描述的。下文的实施例进一步提供了用于评估靶和抗原结合以及调理素吞噬作用、ADCC和抗体依赖性补体活化的详细规程。
在本文中，术语“缀合物”是指部分和EBV B细胞抗原直接或间接地彼此结合或偶联。这种偶联可以通过任何生物或生理化学手段进行。
在本发明的上下文中，应当理解，这种偶联最优选为用于体内应用的稳定偶联，例如通过共价结合的方式。实际上，取决于用于将缀合物递送给受试者的施用模式和药物载体，一些键可能不如其它键适合承受某些生理环境如胃。稳定的偶联对于调理素吞噬作用、ADCC和/或补体活化发生更为关键，因为如果在体内靶向细胞和/或微生物的部分和EBV B细胞抗原不在彼此附近，例如由于所述部分和/或所述抗原之间的键的切割，则这些作用可能会受到影响。
因此，一个优选的实施方案提供一种根据本发明的免疫原性缀合物，其中所述靶结合部分与所述EB病毒B细胞抗原共价偶联。更优选地，所述靶结合部分共价偶联至所述EB病毒B细胞抗原，条件是所述部分从所述抗原不可切割，特别是在体内。例如，连接部分和抗原的共价键不包含切割位点，如蛋白酶切割位点。
更优选地，所述靶结合部分与所述EB病毒B细胞抗原共价和直接偶联。换言之，缀合物的这些组分不通过任何接头偶联。在这种情况下，根据本发明的免疫原性缀合物由i)与靶细胞和/或微生物结合的部分，和ii)EB病毒(EBV)B细胞抗原组成。例如，缀合物可以形成融合蛋白。
可选择地，所述靶结合部分可以共价和间接偶联至所述EB病毒B细胞抗原。换言之，缀合物的这些组分通过接头偶联。实际上，取决于所选接头的性质，缀合物的结构柔性、其稳定性和/或溶解度可以得到改善，并且本发明人观察到，偶联两种组分的接头的存在不会改变缀合物的免疫原性能力。
在本文中，“接头”或“间隔物”是指能够将两种分子彼此偶联的合成的或天然的化学或生物试剂。化学接头在本领域中是公知的，并且通常由不同长度的聚合物链制成，其可以是具有相同或不相同的反应性基团的同双官能团或异双官能团，并且包含至少一个原子，优选至少一个碳原子。相比之下，生物接头通常由不同长度的核酸和/或氨基酸序列制成，并且包含至少一个核酸和/或氨基酸。如上所述，在本文中所述偶联是稳定的，即接头与组分i)和ii)共价结合，并且优选(自身)不可切割，特别是在体内。甚至更优选地，所述接头不包含蛋白酶切割位点。这种接头和偶联分子特别是蛋白的方法，已经在文献中被广泛描述，尤其是Chen等人(2013)和Thermo Scientific：Crosslinking Technical Handbook(2015)，并且因此可以由本领域技术人员容易地选择和设计。接头也可以选自通常含有2-10个组分糖(例如简单的糖或单糖)的碳水化合物聚合物。
根据本发明的具体优选的化学接头包括但不限于胺反应性接头(NHS酯、亚氨酸酯)、羧基-胺反应性接头(碳化二亚胺)、巯基反应性接头(马来酰亚胺、硫代磺酸酯)、醛反应性接头(酰肼、烷氧基胺(alikoxyamine))、光反应性接头(diazirinz，芳基叠氮化物)、羟基反应性接头(异氰酸酯)和叠氮反应性接头(磷化氢)等等。
根据本发明的具体优选的生物学接头包括但不限于聚脯氨酸(P)n(n通常为2和8之间的整数)(SEQ ID NO：1)、聚甘氨酸(G)n(n通常为6和8之间的整数)(SEQ ID NO：2)、甘氨酸-丝氨酸接头(GGGGS)n(n通常为2和10之间的整数(SEQ ID NO：84)，如n＝2至6(SEQ IDNO：85)或n＝2至5(SEQ ID NO：3))、形成α-螺旋的肽接头如A(EAAAK)nA(n通常为2和5之间的整数)(SEQ ID NO：4)以及脯氨酸-丙氨酸接头PAPAP(SEQ ID NO：5)(Chen等，2013)。根据本发明的优选的生物学不可逆接头是甘氨酸-丝氨酸接头(GGGGS)n＝2至10(SEQ ID NO：84)，如(GGGGS)n＝6(SEQ ID NO：86)、(GGGGS)n＝5(SEQ ID NO：6)或有利地(GGGGS)n＝4(SEQ ID NO：7)。
“与靶细胞和/或微生物结合的部分”，在本文中缩写为“靶结合部分”或“靶向部分”，其是指对感兴趣的细胞和/或微生物显示亲和力的分子，因此能够与其结合，尤其是在其表面上。尤其如The Immunoassay Handbook，Wild等人，第4版，Elsevier(2013)中描述的，可以通过测量解离常数Kd和/或结合常数Ka来评估分子对感兴趣靶的亲和力。在本发明的上下文中，结合优选对所述细胞和/或微生物是特异性的，即部分不能与另一种靶结合(即对其它靶没有亲和力或亲和力很小)。
免疫原性缀合物的部分可以具有蛋白或非蛋白性质。
在本文中，术语“蛋白”、“肽”和多肽“是指通过肽键(-NHCO-)连接的氨基酸序列，无论其长度或翻译后修饰如何，其可以是天然存在的或合成的，并且其可以在体外和/或体内在细胞中发挥结构和/或功能作用。
在一个优选的实施方案中，所述部分是配体结合蛋白。
实际上，配体结合蛋白特别令人感兴趣，因为它们可以对其靶表现出高亲和力和选择性。此外，大量的配体结合蛋白已经可以天然获得，并且也可以通过重组技术容易地设计、定制和/或生产。
在本文中，术语“配体结合蛋白”涵盖能够结合分子(即配体)的任何天然或合成蛋白。换言之，在本发明的上下文中，所述蛋白与靶细胞和/或微生物的表面上表达的配体结合。
根据本发明的具体优选的配体结合蛋白包括但不限于抗体、其结合片段、抗体模拟物、细胞表面受体、细胞表面配体及其任何组合。
在配体结合蛋白中，抗体、其衍生物和类似物是特别有利的，因为它们具体表现出对它们靶的高度特异性亲和力(通常在纳摩尔范围内)、延长的稳定性(长达几个月)，并且可以通过常规的重组工程技术容易地和快速地生产。
更确切地，在本文中，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是指能够特异性识别抗原的蛋白。为此，抗体的互补位与抗原的表位相互作用。完整的抗体由四条多肽组成，两条全长轻链和两条全长重链，它们通过二硫键相互连接形成Y形蛋白。每条重链含有一个可变(VH)结构域，接着是恒定结构域(CH1)，铰链区和两个或三个以上恒定结构域(CH2、CH3和任选的CH4)，而每条轻链含有一个可变(VL)和一个恒定(CL)结构域。抗体经由位于“Y”的每个尖端的所谓可变区特异性识别其相应的抗原，并且其对每种抗体(其代表抗原结合位点)是特异性的，而抗体触发免疫应答的能力由位于“Y”的底部的Fc区介导。在哺乳动物中，抗体被分成称为IgA、IgD、IgE、IgM和IgG的五种主要同种型，IgG被进一步分成四种亚型(人类中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。术语“抗体”在本文中旨在涵盖单克隆抗体和多克隆抗体(即由B细胞的单个或不同克隆产生)、单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体(即结合一种或多种抗原)，以及单价、双价和多价抗体(即具有一个或两个抗原结合位点的抗体)。为了本发明的目的，结合靶细胞和/或微生物的抗体优选是单克隆和单特异性的。此外，所述抗体优选根据本领域常规使用的方法人源化(Immunobiology，Janeway等人,第5版,Garlandpublishing,2001；Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic，An等人,Wiley版本,2009)。
本文中抗体片段优于完整抗体，因为它们由于其较小的尺寸而表现出较大的溶解度、组织渗透(特别是固体组织)以及对热和/或酶的稳定性，以及较低的生产成本。
更具体地，术语“抗体片段”或“抗体结合片段”指至少保留如上定义的抗体的抗原结合功能的片段。本领域公知的抗体片段的示例包括但不限于Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、单链抗体(scFv)、重链抗体(HCAb)特别是单结构域抗体(sdAb)及其任何组合。
Fab(抗原结合片段)抗体由重链和轻链各自的一个可变区、轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)组成，具有抗原结合位点(互补位)。Fab'与Fab的不同之处在于它们在重链的CH1结构域的C末端进一步包含至少一个半胱氨酸残基，而F(ab')2由在铰链区的半胱氨酸残基之间具有二硫键的两个Fab'分子组成。Fv(可变片段)抗体由重链和轻链各自的一个可变区组成，而单链Fv(scFv)抗体由通过肽接头共价连接重链和轻链的各自的可变区的Fv组成。最后，单结构域抗体衍生自最初在骆驼和鲨鱼中鉴定的重链抗体(HCAb)，也称为结构域抗体、单结构域抗体或纳米抗体(当由骆驼产生时缩写为VHH，以及当由软骨鱼如鲨鱼产生时缩写为IgNAR或VNAR)，仅对应于抗体重链的可变区，并且至今是含有亲本抗体的最初特异性和结合亲和力的最小抗体片段。
本领域技术人员能够例如通过采用蛋白酶处理完整抗体(例如通过采用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体分别可以产生Fab或F(ab')2)或通过基因重组技术的方式(例如通过scFv或VHH的分子设计和纯化)，可以从亲本抗体生产这种片段。
还必须注意的是，上述抗体片段可以没有Fc区。有趣的是，如下文实施例中所说明的，它们的Fc区的缺乏不会改变缀合物在体内触发消除靶的免疫应答的能力，特别是通过调理素吞噬作用、ADCC和/或抗体依赖性补体活化。
根据本发明的具体优选的抗体片段是单结构域抗体。
实际上，与其它抗体相比，单结构域抗体表现出优越的物理化学性质，其中由于其较小的尺寸(15kDa)而更快的组织渗透和识别隐蔽表位的能力、由单个基因编码的可能性(这有利于它们的工程化并消除scFv观察到的部分去折叠的风险)、它们在室温下储存的能力、高溶解度和低免疫原性潜力。
此外，如在下文的实施例中所证明的，与EBV B细胞抗原偶联的单结构域抗体保留它们对其靶的完整功能性和特异性，同时允许免疫原性缀合物被受到或已经受到EBV感染的受试者的IgG高度识别，由此特别通过调理素吞噬作用、ADCC和/或抗体依赖性补体活化，在体内触发消除靶的免疫应答。
根据本发明的可选择的蛋白部分由抗体模拟物表示。术语“抗体模拟物”、“抗体模拟支架”、“抗体样支架”、“非抗体支架”和“非免疫球蛋白支架”是指与抗体结构上不相关的人造肽或蛋白，一般具有比完整抗体更低的分子量。因此，由于其尺寸小，抗体模拟物表现出与上述抗体片段类似的有利性质。根据本发明的合适的抗体模拟物的示例包括但不限于ABD、adhiron、adnectin/单体(monobody)、affibody、affilin、affitin/nanofitin、affimer、alphabody、anticalin、armadillo重复蛋白、atrimer/四连接素(tetranectin)、avimer/maxibody、centyrin、DARPin、fynomer、Kunitz结构域、obody/OB折叠、pronectin、repebody、transbody和三聚体X(Skrlec等人,2015)。
根据本发明具体优选的抗体是：
-抗DARC抗体，其与红细胞的达菲(Duffy)抗原/趋化因子受体结合，更优选抗DARC单结构域抗体，如Smoralek等人所描述的(2010年)。最优选地，根据本发明的所述抗DARC抗体包含或由序列SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9组成，最优选包含或由SEQ ID NO：9组成；
-抗VAR2CSA抗体，其结合疟疾相关抗原VAR2CSA，更优选抗VAR2CSA单结构域抗体，如由Nunes等人(2014)所描述的。最优选地，根据本发明，所述抗VAR2CSA抗体包含或由序列SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11组成，最优选包含或由SEQ ID NO：11组成；
-抗VSG抗体，其与可变表面糖蛋白结合，所述可变表面糖蛋白是通常在感染性微生物如布氏锥虫(Trypanosoma brucei)表面表达的主要表面抗原，更优选抗VSG单结构域抗体，如Conrath等人(2005年)所描述的。最优选地，所述抗VSG抗体包含或由序列SEQ IDNO：12或SEQ ID NO：13组成，最优选包含或由SEQ ID NO：13组成；和
-抗CD20抗体，其结合通常由癌细胞过表达的分化簇20，更优选抗CD20ScFv，比如Otz等人(2009)、Liu等人(1987)或Olafsen等人(2009)所描述的。最优选地，所述抗CD20抗体包含或由序列SEQ ID NO：80组成。
在本发明的上下文中，实际上，包含抗VAR2CSA抗体的免疫原性缀合物旨在治疗疟疾，而包含抗VSG抗体的缀合物旨在治疗锥虫病(也称为昏睡病)，以及包含抗CD20抗体的缀合物旨在治疗癌症。
可选择地，细胞表面受体可用作根据本发明的配体结合蛋白。例如，如果靶细胞是疟疾感染的红细胞(即，由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染的红细胞)和/或靶微生物是恶性疟原虫，用作靶向部分的具体优选的细胞表面受体包括但不限于以下的内皮细胞受体：蛋白C受体(EPCR)(也称为活化蛋白C受体或APC受体，优选包含或由序列SEQ IDNO：14组成)、分化簇36(CD36)、分化簇31(CD31或PECAM-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和E-选择素。实际上，如本领域公知的，恶性疟原虫感染的红细胞与内皮细胞受体的细胞粘附与严重的疟疾有关(Aird等人，2014)。因此，包含任何上述内皮细胞受体的根据本发明的免疫原性缀合物将与疟疾感染的红细胞结合并触发它们的消除。
可选择地，细胞表面配体可用作根据本发明的配体结合蛋白。例如，如果靶细胞是癌细胞，用作靶向部分的具体优选的细胞表面配体包括但不限于恶性疟原虫衍生的VAR2CSA片段，其可结合硫酸软骨素A(CSA)细胞表面的受体。实际上，如本领域公知的，CSA通常由癌细胞过度表达。因此，包含任何VAR2CSA片段的根据本发明的免疫原性缀合物将与癌细胞结合并触发它们的消除。具体优选的VAR2CSA片段涵盖CSA结合区，比如由Srivastava等人(2011)或Clausen等人(2012)所描述的，或更优选包含或由序列SEQ IDNO：82组成。
在另一个优选的实施方案中，靶结合部分是非蛋白的。实际上，根据本发明的部分可以是能够结合细胞表面和/或结合微生物表面的非蛋白配体，例如通过结合细胞表面受体。
根据本发明的具体优选的非蛋白部分包括但不限于维生素如叶酸(Zwicke等人，2012)、碳水化合物如半乳糖衍生物(Wu等人，2002)、葡萄糖胺聚糖如硫酸软骨素、肝素或硫酸乙酰肝素(Vogt等人，2003)，小核酸如DNA或RNA适体(Estevez等人，2010；Birch等人，2015)和小化学化合物。
特别是，叶酸能够与许多癌细胞表面高度表达的叶酸受体结合，而一些半乳糖衍生物可以与肝细胞和肝癌细胞上表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合，而硫酸软骨素和硫酸乙酰肝素可以结合恶性疟原虫感染的红细胞表面。
关于DNA或RNA适体和小化学化合物，使用本领域常规方法，如通过指数富集的配体的系统进化(SELEX)(Stoltenburg等人，2007)，本领域技术人员可以容易地设计那些DNA或RNA适体和小化学化合物，以特异性结合靶细胞和/或微生物。
然而应该理解，上述蛋白和非蛋白靶向部分的示例仅用于说明性目的，因此不是限制性的。因此，只要其表现出结合感兴趣的细胞和/或微生物的能力，任何其它合适的靶向部分都可以用于本发明的上下文中。
如上所述，用于本发明的免疫原性缀合物中的抗原是从EB病毒分离的B细胞抗原。
在本文中术语“抗原”表示在受试者施用后，在某些情况下可以促进产生抗体从而产生免疫应答的任何分子(例如核酸、肽、蛋白、多糖等)。在分子水平上，抗原的特征在于对应于免疫系统，并且更具体地通过循环抗体、B细胞或T细胞(B和T细胞受体由膜结合抗体组成，但不仅限于此)所识别的区域的至少一个、优选至少两个表位。术语“B细胞抗原”是指如上所定义的抗原，其能够引发B细胞应答，或者换言之，免疫系统的B细胞产生特异性针对所述抗原的抗体(也称为体液应答)。这种B细胞应答因此可以通过从施用了抗原的受试者的血浆测量抗体滴度如IgG滴度来检测。B细胞抗原的表位被表征为B表位，其被相应的抗体互补位识别。
为了本发明的目的，B细胞抗原可以引发施用本发明缀合物的受试者中存在的或预先存在的B细胞(即体液)免疫应答。即，所述抗原是受试者的B细胞已经对其敏感化的抗原。更具体地说，所述B细胞抗原来源于EB病毒，并且被指定为“EBV B细胞抗原”或“EB病毒B细胞抗原”。
“EB病毒”或“EBV”也被称为“人疱疹病毒-4”或“HHV4”，是属于疱疹病毒(Herpesviridae)科的常见病毒，其感染全世界95％的人群，并涉及几种疾病，包括感染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤等等。原发感染后，EBV建立终身持续感染，其特征为频繁的轻度病毒再活化以允许脱落和传播。原发EBV感染以及EBV再活化以高抗体水平为标志，并且主要为嗜细胞(cytophylic)类型。EBV可分为EBV 1型和EBV 2型的两种主要亚型。在感染的宿主中的复制期间，所述病毒表达大量抗原(即B细胞抗原)，针对所述抗原可发展抗体，并将所述抗原分类为LYDMA(淋巴细胞识别膜抗原)、EBNA(EB核抗原)、EMA(早期膜抗原)、EA(早期抗原)、LMA(晚期膜抗原)和VCA(病毒衣壳抗原)抗原。这些类别的抗原本身包含多种抗原：例如，EBNA类包含EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C和EBNA先导蛋白(EBNA-LP)；而VCA类包含抗原P18(即BFRF3)、P23(即BLRF2)、GP125(即BALF4)、P143(即BNRF1)、P150(即BcLF1)和P40(即BdRF1)。
在本文中，本发明人发现，当与上述靶结合部分缀合时，EB病毒P18和P23抗原，更具体是在所述抗原的C末端附近和/或其内的特异性区域，体内触发体液(即B细胞)免疫应答，导致形成免疫复合物并随后消除所述靶，更具体地通过调理素吞噬作用、ADCC和/或抗体依赖性补体活化。
因此，在一个优选的实施方案中，所述EB病毒B细胞抗原选自序列SEQ ID NO：15的P18抗原、序列SEQ ID NO：16的P23抗原、其功能变体和功能片段、以及其任何组合；更具体地，所述序列定义如下：
-SEQ ID NO：15
MX1RRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ，其中：
○ X1是A或者S，
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，
○ X5是S或者没有，和
○ X6是Q或者H；
以及
-SEQ ID NO：16
MSAPRKVRLPSVKAVDMSMEDMAARLARLESENKALKQX1VLRGGACASSTSVPSX2X3VPPPEPLTARQREVMITQATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD，其中：
○ X1是Q或者R，
○ X2是A或者V，
○ X3是P或者T，
○ X4是D或者E，
○ X5是M或者L，
○ X6是N或者K，
○ X7是T或者P，
○ X8是P、L或者S，
○ X9是R、N或者没有，
○ X10是E、D或者没有，
○ X11是S、P或者没有，
○ X12是N或者S，
○ X13是A、T、S或者N，
○ X14是S或者没有，
○ X15是R或者没有，
○ X16是R或者C，和
○ X17是A或者S。
根据本发明的具体优选的P18抗原包括但不限于序列SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：22的抗原；而根据本发明的具体优选的P23抗原包括但不限于序列SEQ ID NO：23至SEQ IDNO：38的抗原。
更优选地，根据本发明的P18抗原是序列SEQ ID NO：17和/或根据本发明的P23抗原是序列SEQ ID NO：23。
如上所述，本发明还涵盖本文所述的P18和P23抗原的功能变体和功能片段。
就此而言，P18和P23抗原内含有的半胱氨酸残基可与靶结合部分中含有的巯基形成二硫键，如下文实施例中所说明的，其可改变缀合物的溶解度和稳定性。因此可能需要设计功能变体和/或功能片段，使得它们不含有任何巯基，即本文中任何半胱氨酸残基。
因此，本发明的一个优选实施方案是提供如上定义的免疫原性缀合物，条件是当所述部分包含至少一个巯基时，P18和/或P23抗原的功能变体和功能片段不包含(即缺乏)任何半胱氨酸残基。如果该部分具有蛋白性质，则巯基本身可以包含在半胱氨酸残基中。
这种EBV B细胞抗原的“功能变体”在结构上表现出与所述抗原之一不同的氨基酸序列，同时保留引发B细胞应答的能力，特别是调理素吞噬作用和/或ADCC和/或补体活化。变体可以是天然的或非天然存在的。非天然存在的变体通常通过诱变产生，并且可以被称为如突变变体。后者可由保守或非保守氨基酸突变产生，比如参考氨基酸序列与变体之间的取代、缺失和/或添加。在本文中，功能变体涵盖与天然抗原的氨基酸序列比对后至少85％相同的氨基酸序列。这些变体还可以与所述氨基酸序列具有90％、95％、96％、97％、98％、99％和99.999％的序列同一性。氨基酸序列之间的同一性通常可以通过全局同源性比对来确定。
缺乏任何半胱氨酸残基的根据本发明的功能变体优选选自序列SEQ ID NO：39的P18抗原功能变体和序列SEQ ID NO：40的P23抗原功能变体，更具体地，所述序列定义如下：
-SEQ ID NO：39
MX1RRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFSYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ，其中：
○ X1是A或者S，
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，
○ X5是S或者没有，和
○ X6是Q或者H；
以及
-SEQ ID NO：40
MSAPRKVRLPSVKAVDMSMEDMAARLARLESENKALKQX1VLRGGASASSTSVPSX2X3VPPPEPLTARQREVMITQATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD，
其中：
○ X1是Q或者R，
○ X2是A或者V，
○ X3是P或者T，
○ X4是D或者E，
○ X5是M或者L，
○ X6是N或者K，
○ X7是T或者P，
○ X8是P、L或者S，
○ X9是R、N或者没有，
○ X10是E、D或者没有，
○ X11是S、P或者没有，
○ X12是N或者S，
○ X13是A、T、S或者N，
○ X14是S或者没有，
○ X15是R或者没有，
○ X16是R或者C，和
○ X17是A或者S。
根据本发明的具体优选的功能变体包括但不限于序列SEQ ID NO：41的P18抗原功能变体和/或序列SEQ ID NO：42的P23抗原功能变体。
这种B细胞抗原的“功能片段”仅含有所述抗原的氨基酸序列的部分，所述部分包含用于表现与所述抗原之一相同的生物学功能的所有必需区域或表位，即引发抗体介导的免疫应答，特别是可以如上所述评估的调理素吞噬作用和/或ADCC和/或补体活化。这些部分可以具有不同的长度，只要保留所述应答。
例如，根据本发明的功能片段可以包含所述抗原的至少5个氨基酸残基，或所述抗原的至少10个氨基酸残基，或所述抗原的至少15个氨基酸残基，并且优选所述抗原的至少20个氨基酸残基。
优选地，根据本发明的功能片段包含约5个氨基酸残基至约150个氨基酸残基，更优选约10个氨基酸残基至约150个氨基酸残基，甚至更优选约15个氨基酸残基至约100个氨基酸残基，最优选约20个氨基酸残基至约100个氨基酸残基。
然而，优选地，根据本发明的功能片段包含约5个连续的氨基酸残基至约150个连续的氨基酸残基，更优选约10个连续的氨基酸残基至约150个连续的氨基酸残基，甚至更优选约15个连续的氨基酸残基至约100个连续的氨基酸残基，最优选约20个连续的氨基酸残基至约100个连续的氨基酸残基。
仍优选地，根据本发明的功能片段是P18抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQID NO：43至SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：75的序列组成，和/或P23抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的序列组成，更具体地，所述序列如下定义：
- SEQ ID NO: 43
VDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ其中，X6是Q或者H；
- SEQ ID NO： 44
AGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAA
TSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ，其中：
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，
○ X5是S或者没有，和
○ X6是Q或者H；
-SEQ ID NO：75
AASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ，其中：
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，
○ X5是S或者没有，和
○ X6是Q或者H；
-SEQ ID NO：45
RQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAA，其中：
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，和
○ X5是S或者没有；
-SEQ ID NO：46
AGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAA，其中：
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，和
○ X5是S或者没有；
-SEQ ID NO：47
SX2TPSVSSSISX3LRAATSGA，其中：
○ X2是A或者V，和
○ X3是S或者N；
-SEQ ID NO：48
SVSSSISX3LR，其中：
○ X3是S或者N；
-SEQ ID NO：49
RQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSX2TPSVSSSISX3LRAATSGATAAX4X5AAAAVDTGSGGGGQPX6DTAPRGARKKQ，其中：
○ X2是A或者V，
○ X3是S或者N，
○ X4是A或者没有，
○ X5是S或者没有，和
○ X6是Q或者H；
-SEQ ID NO：50
EX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD，其中：
○ X5是M或者L，
○ X6是N或者K，
○ X7是T或者P，
○ X8是P、L或者S，
○ X9是R、N或者没有，
○ X10是E、D或者没有，
○ X11是S、P或者没有，
○ X12是N或者S，
○ X13是A、T、S或者N，
○ X14是S或者没有，
○ X15是R或者没有，
○ X16是R或者C，和
○ X17是A或者S；
以及
-SEQ ID NO：51
ATGRLASQAMKKIEX4KVRKSVDGVTTRNEX5EX6ILQNLTLRIQVSMLGAKGQPSPGEGX7RX8X9X10X11X12DPNX13TRRARX14X15SRGX16EX17KKVQISD，其中：
○ X4是D或者E，
○ X5是M或者L，
○ X6是N或者K，
○ X7是T或者P，
○ X8是P、L或者S，
○ X9是R、N或者没有，
○ X10是E、D或者没有，
○ X11是S、P或者没有，
○ X12是N或者S，
○ X13是A、T、S或者N，
○ X14是S或者没有，
○ X15是R或者没有，
○ X16是R或者C，和
○ X17是A或者S。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的功能片段是P18抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：43至SEQ ID NO：49的序列组成，和/或是P23抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的序列组成。
根据另一个优选的实施方案，根据本发明的功能片段是P18抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：45至SEQ ID NO：49的序列组成，和/或是P23抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的序列组成。
根据一个更优选的实施方案，根据本发明的功能片段是P18抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：75的序列组成，和/或是P23抗原功能片段，其包含或由至少选自SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的序列组成。
特别是，按照P18抗原功能片段中的优选顺序，应该选择包含或由至少是序列SEQID NO：75组成的片段，之后是SEQ ID NO：49，最后是SEQ ID NO：43。换言之，根据本发明的最优选的P18抗原功能片段是包含或由至少是序列SEQ ID N：75组成的那个。实际上，如下文实施例中所说明的，该片段在所测试的P18功能性抗原片段中表现出最佳的免疫应答。
根据本发明的具体优选的功能片段的示例包括但不限于P18抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：76的序列组成，和/或P23抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的序列组成。更优选地，所述功能片段包括但不限于P18抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：58的序列组成，和/或P23抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的序列组成。然而，甚至更优选地，所述功能片段包括但不限于P18抗原功能片段，其包含或由选自SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：54至SEQ ID NO：58的序列组成，和/或P23抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的序列组成。所述片段是根据本发明的最优选的EBV B细胞抗原，因为它们含有对于受试者中的IgG识别所必需的最小表位，并且因此用于产生体内免疫复合物并触发消除感兴趣的靶的免疫应答。
根据一个更优选的实施方案，根据本发明的功能片段的示例是P18抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：76的序列组成，和/或P23抗原功能片段，其包含或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的序列组成。
特别是，按照P18抗原功能片段中的优选顺序，应该选择包含或由序列SEQ IDNO：76组成的片段，之后是SEQ ID NO：58，最后是SEQ ID NO：52。换言之，根据本发明的最优选的P18抗原功能片段是包含或由序列SEQ ID NO：76组成的片段。实际上，如下文实施例中所说明的，该片段在所测试的P18功能性抗原片段中表现出最佳的免疫应答。
如上所述，上述片段可以优选缺乏任何半胱氨酸残基。
重要的是，缀合物的结合部分靶向的细胞和/或微生物可以是任何来源的，只要预期消除存在于有需要的受试者中的所述细胞和/或微生物。
因此，在一个优选的实施方案中，靶细胞是疾病细胞，优选癌细胞或由病原体如病毒、细菌、真菌和/或寄生虫感染的细胞，和/或靶微生物是病原微生物，优选病毒、细菌、真菌和/或寄生虫。
如下文实施例中所证明的，更具体地，发明人设计了旨在靶向恶性疟原虫的两种不同免疫原性缀合物，以治疗疟疾，以及旨在分别靶向表达CD20或CSA的细胞的两种不同的免疫原性缀合物，以治疗癌症。
因此，在一个具体优选的实施方案中，所述疾病细胞是感染疟疾的红细胞，和/或所述病原微生物是恶性疟原虫。
如果靶向的疾病细胞是疟疾感染的红细胞，则所述部分优选可以与所述细胞表面上表达的疟疾相关抗原结合，优选与恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)变体如VAR2CSA或VAR19抗原结合。与VAR19结合的部分的示例是蛋白C受体(EPCR，其可以包含或由SEQ IDNO：14组成)。
在另一个具体优选的实施方案中，所述疾病细胞是癌细胞。
如果疾病细胞是癌细胞，所述部分可以优选与所述细胞表面上表达的CSA结合，或者在来自B细胞来源的癌症(B淋巴瘤)的情况中，与在所述细胞的表面上表达的分化簇20(CD20)结合。
根据本发明的缀合物可以通过不同的方法来制备，根据靶结合部分的性质，和/或如果使用化学或肽接头来将所述部分偶联至EBV B细胞抗原，所述方法可以变化。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种制备本发明缀合物的方法，其包括以下步骤：将
i)如上所述的与靶细胞和/或微生物结合的部分；与
ii)如上所述的EB病毒(EBV)B细胞抗原偶联。
为此，如上所述，所述偶联优选为共价的，使得部分和EBV B细胞抗原保持紧密接近以实现体内消除靶的免疫应答，特别是通过调理素吞噬作用、ADCC和/或抗体依赖性补体活化。
更优选地，所述偶联是共价和不可切割的，特别是在体内。
根据一个优选的实施方案，该偶联是化学偶联。
本领域技术人员能够在具有或不具有如上所述的接头的情况下进行这种偶联。在Bioconjugate techniques,Hermanson,第三版,Elsevier(2013)和Chemistry of Proteinand Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation,Wong和Jameson,第2版,CRC Press(2011)中尤其描述了偶联分子的常规方式。
例如，通过使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)反应化学，根据本发明的EBV-B细胞抗原可以通过其赖氨酸残基(伯胺基团)与靶结合部分化学偶联，所述N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)反应化学可以提供稳定键的形成用于体内的缀合物。
然而，本领域技术人员将理解，当免疫原性缀合物具有完整的蛋白性质时，化学偶联可能不一定是优选的。实际上，在这种情况中，可以直接依靠在合适的微生物中的重组工程和表达技术(Molecular cloning:A laboratory manual，Sambrook等人,第4版,ColdSpring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,2012)。
因此，在另一个方面中，当缀合物是融合蛋白时，用于制备本发明缀合物的方法优选包括以下步骤：
a)采用表达编码本发明的免疫原性缀合物的核酸的载体转化宿主细胞；
b)在培养介质中生长所述宿主细胞；和
c)从所述介质中回收免疫原性缀合物。
根据一个优选的实施方案，所述方法进一步包括步骤d)纯化步骤c)中获得的免疫原性缀合物。
在以下进一步描述的实施例中提供了制备这种缀合物的完整细节。
结合前述内容，本发明进一步涉及一种编码本发明的免疫原性缀合物的核酸，涉及包含所述核酸的载体(例如质粒、细菌和病毒载体)，以及涉及采用所述载体转化的宿主细胞(例如原核或真核)。
本发明的另一个方面提供一种药物组合物，其包含至少一种如上定义的免疫原性缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指无活性或惰性且因此无毒的组分，因为它没有药理学作用，其可用于改善组合物的性质，比如保存期限、在应用位点的保留时间、用户接受度等。它包括但不限于生理上相容的表面活性剂(阳离子、阴离子或中性)；表面稳定剂；其它增强剂，比如防腐剂、润湿剂或乳化剂；溶剂；缓冲液；盐溶液；分散介质；等渗剂和吸收延迟剂等。根据本发明优选的赋形剂包括药物产品中常用的任何赋形剂，如，例如微晶纤维素、乳糖、淀粉和大豆粉。
所述免疫原性缀合物优选以足以在体内触发消除感兴趣靶的免疫应答(特别是通过调理素吞噬作用、ADCC和/或抗体依赖性补体活化)的量存在于所述组合物中，或者换言之以有效量存在于所述组合物中。本领域技术人员能够确定通过本领域常规方法递送缀合物的所需的有效量，例如，通过用施用于靶细胞或动物的不同剂量进行剂量反应实验。
就此而言，优选地，本发明的药物组合物包含占该组合物的约0.000001重量％至约10重量％、优选约0.000002重量％至约5重量％、甚至更优选约0.000005重量％至约1重量％的一种或多种根据本发明的免疫原性缀合物。
本发明的药物组合物可以是适用于本发明目的的任何形式。例如，所述组合物可以为适用于肠胃外、口服或局部施用的形式，比如液体悬浮液、固体剂型(颗粒、丸剂、胶囊或片剂)或糊剂或凝胶。本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内或肌内注射。
药物组合物还可以包含其它活性剂，其可以促进靶细胞和/或微生物的消除。
根据一个优选的实施方案，所述药物组合物还包含至少一种佐剂，以增强由缀合物介导的免疫应答。实际上，一些佐剂能够促进和延长抗原与免疫系统之间的相互作用的持续时间，而另一些佐剂能够招募和活化天然免疫的细胞以诱导适应性应答。属于前一类的佐剂包括但不限于无机化合物，比如明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢钙；油基乳剂，比如石蜡油、淀粉油、弗氏完全佐剂/不完全佐剂(FCA/FIA)、皂苷(例如来自植物皂树(Quillaja)、大豆、美远志(Polygala senega))。属于后一类的佐剂包括但不限于免疫刺激复合物(ISCOM)，比如细胞因子(例如GM-CSF、IL-1、IL-2、IL6、IL8、IL12、TNF-、IFN-等)；细菌产品，比如热休克蛋白(HSP)、病原体相关分子模式(PAMP)、海藻糖二霉菌酸酯(trehalose dimicolate，TDM)、胞壁酰二肽(muramyldipeptide，MDP)、脂多糖(PLS)。
根据一个优选的实施方案，药物组合物可以进一步包含至少一种针对靶细胞和/或微生物的治疗剂。因此所述治疗剂优选能够在有需要的受试者中预防和/或治疗特征在于存在不需要的细胞和/或微生物的病症或疾病。例如，治疗剂可以是抗癌剂、以及抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂和/或抗寄生虫剂。优选地，所述治疗剂是抗疟疾剂或抗癌剂。
本领域普通技术人员能够选择用于预期目的的合适的佐剂和/或治疗剂。
佐剂或治疗剂也可以与本发明的免疫原性缀合物联合施用，同时、分开或顺序。如果缀合物、佐剂和/或治疗剂以分开或顺序的方式施用，则它们可以以不同的药物形式施用。
因此，在另一个方面中，本发明涉及如上所述的本发明的免疫原性缀合物和佐剂和/或治疗剂，作为用于在有需要的受试者中同时、分开或顺序施用的组合制剂。换言之，本发明提出将本发明的免疫原性缀合物和佐剂和/或治疗剂组合使用，在有需要的受试者中同时、分开或顺序施用。
本发明的免疫原性缀合物、或包含所述缀合物的药物组合物可以用于医学应用中，所述医学应用受益于缀合物以特异性方式消除有需要的受试者中的不需要的细胞和/或微生物的能力。
因此，在另一个方面，本发明涉及如上所述的免疫原性缀合物或药物组合物，用作药物。
优选地，所述药物旨在用于触发调理素吞噬作用和/或通过ADCC来裂解和/或通过抗体依赖性补体活化来裂解有需要的受试者中的靶细胞和/或微生物。更优选地，所述药物旨在触发有需要的受试者中靶细胞和/或微生物的调理素吞噬作用。
例如，免疫原性缀合物或药物组合物可用于破坏疾病细胞，尤其包括癌细胞、或比如病毒、细菌、真菌和/或寄生虫的病原体感染的细胞，和/或破坏病原微生物，比如病毒、细菌、真菌和/或寄生虫。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及本发明的免疫原性缀合物或药物组合物，用于治疗有需要的受试者的癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染和/或寄生虫疾病。更确切地说，本发明涉及本发明的免疫原性缀合物或药物组合物用于制备治疗有需要的受试者的癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染和/或寄生虫疾病的药物的用途。换言之，本发明涉及一种用于在有需要的受试者中治疗癌症、病毒感染、细菌感染、真菌感染和/或寄生虫疾病的方法，其包括向所述受试者施用本发明的免疫原性缀合物或药物组合物。药物的施用方法是本领域技术人员公知的，在本文中不需要进一步详述。
根据本发明的优选寄生虫疾病是疟疾。根据本发明的另一种优选疾病是癌症。
本文所用的术语“治疗”涵盖预防、改善、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其它有害过程，包括干扰和/或由治疗产生的过程。
贯穿本说明书，术语“受试者”是指人或动物，优选指人。此外，在本发明的上下文中，受试者表现出对EBV存在的或预先存在的体液免疫应答。
根据以下实验的详细描述(包括实施例)将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将认识到，该详细描述不是限制性的，并且可以在不脱离本发明的范围的情况下进行不同的修改、替换、省略和改变。
附图说明
图1.缀合物DARCVHH-EBV P18抗原和DARCVHH-EBV P23抗原的IMAC纯化。在天然条件下的DARCVHH-P23的Ni-NTA纯化(A-B)或者在变性条件下DARCVHH-P18和DARCVHH-P23的Ni-NTA纯化(C-D)。在SDS PAGE之后，蛋白凝胶用考马斯蓝染色(A和C)或者转移至硝酸纤维素膜上使用抗His作为探针抗体进行western印迹分析(B和D)。
图2.缀合物DARCVHH-EBV突变的P18抗原和DARCVHH-EBV突变的P23抗原的IMAC纯化。天然条件下突变的缀合物DARCVHH-P18(C56S)*和DARCVHH-P23(C46S)*的Ni-NTA纯化。在SDSPAGE之后，蛋白凝胶用考马斯蓝染色。
图3.缀合物DARCVHH-EBV突变的P18抗原和DARCVHH-EBV P18抗原片段以及单独的抗DARC VHH的凝胶过滤色谱法。在IMAC纯化之后，对DARCVHH-P18(C56S)*(A)、DARCVHH-P18F2(B)、DARCVHH-P18F3(C)、DARCVHH-P18F4(D)和DARCVHH(E)进行尺寸排阻色谱法。
图4.缀合物DARCVHH-EBV P18和VAR2CSAVHH-EBV P18(突变和片段)的IMAC纯化和凝胶过滤色谱法纯化。在IMAC纯化之后，将DARCVHH-P18(C56S)*进行尺寸排阻色谱法(A)。纯化的缀合物DARCVHH-P18片段和VAR2CSAVHH-P18F2片段以及它们纯化的各自的分子靶DARC和VAR2CSA的考马斯蓝染色(B)。重组DARC325蛋白含有DARCVHH靶向的表位，而重组DARC403缺少表位序列。VAR2CSA的全长细胞外部分包含6个DBL结构域(DBL1-DBL6ε)，VAR2CSAVHH靶向DBL4ε结构域。
图5.非缀合对比缀合的DARCVHH和VAR2CSAVHH对其各自分子靶即DARC和VAR2CSA的亲和力的比较分析。将全长重组DARC325和VAR2CSA(3D7-DBL1X-6ε)固定在CM5芯片上，并以不同浓度注射分析物。DARCVHH-P18F2、DARCVHH-P18F3、DARCVHH-P18F4、DARCVHH对于DARC325以及VAR2CSAVHH-P18F2、VAR2CSAVHH-P18F3、VAR2CSAVHH对于VAR2CSA的亲和力常数没有被EBV-抗原缀合物显著改变。
图6.DARCVHH-EBV P18和VAR2CSAVHH-EBV P18缀合物(片段)的免疫识别。针对DARCVHH-EBV P18F2的抗体滴度(IgG)测定的实施例。供体20120617的抗体滴度视为达到最大OD信号的50％时的血浆稀释度(A)。DARCVHH-P18F2、DARCVHH-P18F3、DARCVHH-P18F4、DARCVHH、VAR2CSAVHH-P18F2、VAR2CSAVHH-P18F3、VAR2CSAVHH和MBP EBV-P18和MBP P23的22种不同血浆样品的比较免疫识别(IgG)(B)。BSA和MBP被用作对照。
图7.缀合物DARCVHH-EBV P18抗原片段F2与其天然靶(即在DARC+供体的红细胞表面表达的DARC)的结合。将DARC+红细胞与连续稀释的DARCVHH-P18F2孵育。使用抗His PE缀合的抗体通过流式细胞术监测膜结合蛋白。
图8.由DARCVHH-EBV P18缀合物介导的红细胞调理素作用(突变和片段)。(A)为了证明红细胞调理素作用，将DARC+红细胞与DARCVHH-P18(C56S)*孵育，随后连续稀释人血浆(左面)。使用抗hIgG PE缀合的抗体通过流式细胞术检测膜相关IgG(右面)。荧光强度(PE)的移动反映了红细胞表面处存在免疫复合物(右面)。(B)由缀合物DARCVHH-EBV P18抗原片段F3介导的红细胞凝集。将DARC+红细胞与DARCVHH-P18F3孵育，随后连续稀释人血浆。板离心后，来自对照条件(无人血浆)的红细胞形成明确的细胞沉淀(a、b、c)，而在DARCVHH-P18F3和人血浆存在下孵育的红细胞形成扩散凝集物(d、e、f)(B)。
图9.由DARCVHH-EBV P18缀合物(突变的和片段)介导的调理素吞噬作用。(A)为了证明红细胞调理素作用导致吞噬作用，将THP1衍生的巨噬细胞与采用DARCVHH-P18(C56S)*以及人IgG预促调理的CFSE染色的DARC+红细胞孵育。3小时后，通过流式细胞术分析THP1细胞。CFSE阳性THP1细胞被认为是吞噬了至少一个红细胞的细胞。(B)将THP1细胞与采用DARCVHH-P18F3以及人IgG预促调理的CFSE染色的DARC+红细胞孵育。3小时后，通过流式细胞术分析THP1细胞。CFSE阳性THP1细胞被认为是吞噬了至少一个红细胞的细胞。(C)由DARCVHH-EBV P18缀合物介导的调理素吞噬作用。为了证明用不同DARCVHH-EBV P18缀合物处理DARC+红细胞介导THP1细胞的细胞调理素作用和随后的吞噬作用，将CFSE染色的红细胞与等摩尔浓度(10nM)的DARCVHH、DARCVHH-EBV P18F2、DARCVHH-EBV P18F3、DARCVHH-EBV P18F4和10％人血浆孵育。筛选人血浆样品对P18的反应性，并根据它们识别EBV抗原的能力分为3组：对P18具有高度反应性(高)、对P18具有中等反应性(中)或低反应性(低)。共孵育3h后，通过流式细胞术分析THP1细胞。CFSE阳性THP1细胞被认为是吞噬了至少一个红细胞的细胞。结果表示为与没有任何缀合物、仅红血细胞(RBC)的实验条件相比的倍数增加。
图10.hCD20ScFv-P18F3和VAR2CSA-P18F3缀合物的IMAC纯化和凝胶过滤色谱法纯化。在IMAC纯化之后，对hCD20ScFv-P18F3和VAR2CSA-P18F3进行尺寸排阻色谱。hCD20ScFv-P18F3、VAR2CSA-P18F3和“裸”蛋白hCD20ScFv和VAR2CSA的考马斯蓝染色。
图11.hCD20ScFv-P18F3和VAR2CSA-P18F3缀合物分别与其天然靶，即，在B细胞表面表达的CD20和在癌细胞表面表达的CSA的结合。表达CD20和CSA的RAJI细胞与50μg/ml的hCD20ScFv、hCD20ScFv-P18F3或者50μg/ml的VAR2CSA、VAR2CSA-P18F3孵育。使用小鼠抗His抗体和抗小鼠IgG-PE缀合抗体，通过流式细胞术监测膜结合蛋白。
图12.由hCD20ScFv-P18F3缀合物介导的CD20+RAJI细胞调理素作用。为了证明B细胞调理素作用，将CD20+RAJI细胞与连续稀释的hCD20ScFv或hCD20ScFv-P18F3孵育，随后用恒定的人血浆稀释液(1:100)孵育。(A)使用抗hIgG PE缀合抗体通过流式细胞术检测膜相关IgG。荧光强度(PE)的移动反映了细胞表面存在免疫复合物。(B)通过流式细胞术分析产生的数据的图示。
图13.由VAR2CSA-P18F3缀合物介导的CSA+RAJI细胞调理素作用。为了证明B细胞调理素作用，将CSA+RAJI细胞与连续稀释的VAR2CSA或VAR2CSA-P18F3孵育，随后用恒定的人血浆稀释液(1:100)孵育。(A)使用抗hIgG PE缀合抗体通过流式细胞术检测膜相关IgG。荧光强度(PE)的移动反映了细胞表面存在免疫复合物。(B)通过流式细胞术分析产生的数据的图示。
图14.由hCD20ScFv-P18F3介导的补体活化。为了证明由hCD20ScFv-P18F3介导的B细胞调理素作用能够活化补体级联以形成膜攻击复合物，将CD20+RAJI细胞与5μg/ml的hCD20ScFv或hCD20ScFv-P18F3孵育，随后与活化形式或热灭活的10％EBV+人血浆孵育。使用小鼠单克隆抗C5-b9抗体和抗小鼠IgG-PE缀合抗体孵育1小时后，在细胞膜表面检测膜攻击复合物组成元件C5-b9的沉积。仅用活化人血浆观察到RAJI细胞表面轻微的C5-b9沉积，这很可能是由于癌细胞系对补体的替代途径(不依赖抗体)的活化。
图15.由hCD20ScFv-P18F3(A)和VAR2CSA-P18F3(B)介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过效应细胞中的NFAT途径活化基因转录反映ADCC中的缀合物生物学活性，并通过产生的荧光素酶定量(发光读数)。将RAJI细胞与饱和浓度的缀合物孵育，随后用连续稀释的EBV+人血浆进行孵育。与有效的效应细胞共培养6小时后，通过读取每个板孔的发光监测NFAT途径活化(以CPS表示：每秒计数)。
图16.缀合物EPCR-P18F3的IMAC纯化和凝胶过滤色谱法纯化。在IMAC纯化后，将EPCR-P18F3进行尺寸排阻色谱法。(A)EPCR-P18F3的考马斯蓝染色和(B)使用抗His抗体的Western印迹分析。合并含有纯化的EPCR-P18F3的凝胶过滤(GF)级分，并用于功能测定。
图17.缀合物EPCR-P18F3与其天然靶(即在Pf.感染的红细胞表面表达的VAR19)的结合。采用连续稀释的EPCR-P18F3(范围从100μg/ml至0.19μg/ml)孵育表达VAR19的感染的红细胞(iRBC)。使用小鼠抗His抗体和抗小鼠IgG-PE缀合抗体通过流式细胞术监测膜结合蛋白。(A)细胞形态门控。(B)TOPRO3染色允许区分感染的红细胞(iRBC)和未感染的红细胞(RBC)。iRBC群体(C)和RBC群体(D)中膜结合EPCR-P18F3的检测。
图18.由EPCR-P18F3介导的调理素吞噬作用。为了证明由EPCRP18F3介导的表达VAR19的感染的红细胞(iRBC)调理素作用诱导吞噬作用，将THP1衍生的巨噬细胞与用EPCR-P18F3以及hIgG预促调理的CFSE染色的表达VAR19的iRBC孵育。3小时后，通过流式细胞术分析THP1细胞。CFSE阳性THP1细胞被认为是吞噬了至少一个iRBC的细胞。
具体实施方式
实施例
1.材料和方法
1.1.根据本发明的免疫原性缀合物的构建
编码EBV(B95-8菌株)P18和P23蛋白的BFRF3和BLRF2的DNA序列经密码子优化(Integrated DNA Technology)以最大化其在大肠杆菌(E.coli.)中的表达。出于纯化目的，将全长P18和P23重新编码的核苷酸序列及其截短的片段克隆到pET28a质粒(Novagen)中以表达C末端His标签蛋白。
在一些缀合物中，在结合部分(VHH、scFv、细胞表面受体或细胞表面配体)与EBV-B细胞P18或P23抗原之间添加了20个氨基酸(GGGGS)4(SEQ ID NO：7)的柔性接头，以保持并且如果可能增强2个不同组件(即与靶细胞和/或微生物结合的部分以及EBV-B细胞抗原)的适当功能属性(Hu等人，2004；Chen等人，2013)。然后将结合部分序列(除了EPCR)插入修饰的pET28a质粒的NcoI和NheI限制性位点之间。对于EPCR缀合物，通过PCR从人肺内皮cDNA文库中扩增编码可溶EPCR的基因(残基S18-S210；[Uniprot：Q9UNN8；SEQ ID NO：14)并与编码P18F3的重新编码的基因片段融合。将EPCR-P18F3序列克隆到具有六个His的C末端标签的pTT3载体中。
在本研究中，因此设计了以下缀合物：
-EBV P18全长抗原与DARCVHH框内融合，具有接头；
-EBV P23全长抗原与DARCVHH框内融合，具有接头；
-EBV P18突变抗原与DARCVHH框内融合，具有和不具有接头；
-EBV P23突变抗原与DARCVHH框内融合，具有和不具有接头；
-不同的EBV P18片段与DARCVHH、VAR2CSAVHH、VAR2CSA、hCD20scFv或EPCR框内融合，不具有接头；和
-不同的EBV P23片段与DARCVHH框内融合，不具有接头。
这些接头可以总结在下表1中。
表1.免疫原性缀合物
1.2.缀合物的表达和纯化
为了蛋白表达，允许细胞质二硫键形成的大肠杆菌(New EnglandBiolabs)采用不同的基于pET28a的缀合物转化。采用0.2mM IPTG在OD600nm 0.5下诱导细菌培养物，并且蛋白表达在20℃下进行16小时。为了蛋白纯化，将细菌悬浮液在冰上解冻，并通过将细胞悬浮液通过EmulsiFlex-C5高压均质器来实现裂解。可溶蛋白进行2步纯化过程。首先在Ni-NTA Superflow(Qiagen)上纯化His标签蛋白，然后通过Superdex 200 10/300 GL凝胶过滤柱(GE Healthcare)。
特别是，对于EPCR缀合物，在Freestyle 293无血清表达介质中生长FreeStyle293-F细胞(Invitrogen)，并根据Invitrogen的推荐，采用含有EPCR-P18F3序列的pTT3载体转染。转染后72小时，将细胞离心并收获培养介质。在0.22μm过滤器上过滤后，使用10kDa截止的Vivaflow 200系统(Vivasciences)将上清液浓缩5倍。可溶蛋白进行2步纯化过程。首先在Ni-NTA Superflow(Qiagen)上纯化His标签蛋白，然后通过Superdex 20010/300 GL凝胶过滤柱(GE Healthcare)。
1.3.通过表面等离子体共振确定亲和力
使用Biacore X100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振(SPR)研究缀合物与它们各自的分子靶之间的相互作用。所有实验均在25uC下在HBSEP缓冲液(GEHealthcare)中进行。通过胺偶联将重组全长DARC325或VAR2CSA蛋白固定在CM5芯片(GEHealthcare)的分析Fc2通道上，使总载量为800RU。使用相同的化学方法用1M的乙醇胺-HClpH 8.5封闭参考通道Fc1。连续稀释的缀合物以30μL/分钟注射在包被的芯片上。缀合物的最高浓度是1mM，并且还注射了10份两倍连续稀释液。在注射之间，芯片表面采用2次注射15ml的10mM HCl pH2再生。该特异性结合应答通过对Fc1的应答减去由Fc2上的分析物给出的应答而获得。使用制造商的软件将动力学传感图拟合至全局1：1相互作用的Langmuir模型。
1.4.缀合物的免疫识别
采用以1μg/ml在PBS中稀释的缀合物以每孔100ml包被ELISA板(Nunc)，并在4℃下孵育过夜。包被BSA(PBS中2％)用于背景测量。包被后，将孔用PBS 2％BSA在室温T封闭1小时。去除封闭溶液后，加入在PBS 2％BSA中的人血浆稀释液，并将板在室温下孵育1小时。然后用150ml PBS 0.05％吐温20(PBST)洗涤孔3次。用在PBS 2％BSA中1：4000稀释的辣根过氧化物酶缀合的(HRP)抗人IgG(Jackson Immunoresearch 709-036-098)在室温下孵育1h，检测人IgG结合。用PBST洗涤后，将板用每孔100ml的TMB(3,39,5,59-四甲基联苯胺)底物(Biorad)显色，并在655nm处测量吸光度。
1.5.缀合物的细胞表面识别
通过流式细胞术测试DARCVHH-EBV缀合物识别在红细胞表面表达的天然DARC的能力、hCD20ScFv-P18F3缀合物识别在B细胞表面表达的天然CD20蛋白的能力、VAR2CSA-P18F3缀合物识别在癌细胞表面表达的天然葡萄糖胺聚糖硫酸软骨素A(CSA)的能力、以及EPCR-P18F3缀合物识别在恶性疟原虫感染细胞表面表达的天然VAR19蛋白的能力。
为此，将DARC+红细胞(对于DARCVHH-EBV缀合物)、CD20+RAJI细胞(对于hCD20ScFv-P18F3缀合物)、CSA+RAJI细胞(对于VAR2CSA-P18F3缀合物)或者表达VAR19的红细胞(对于EPCR-P18F3缀合物)与在PBS 2％BSA中连续稀释的缀合物在室温下孵育1小时。然后用PBS2％BSA将细胞洗涤两次，并用在PBS 2％BSA中稀释的5mg/ml的小鼠抗PentaHis IgG(Qiagen，目录号34660)在室温下孵育30分钟。在30分钟后，将细胞用PBS 2％BSA洗涤两次，并在室温下用PE缀合的山羊F(ab')2抗小鼠IgG(Beckman Coulter，IM0855，在PBS 2％BSA中1:100稀释)孵育30分钟。细胞用PBS洗涤并进行流式细胞术分析。使用BD FACScanto II流式细胞仪(Becton-Dickinson，San Jose，CA)获取数据并使用FLOWJO 8.1软件(TreeStar Inc.)进行分析。通过使用正向和侧向散射的适当门控，将细胞碎片排除在分析之外。
测试的缀合物与表面表达的DARC(对于DARCVHH-EBV缀合物)的反应性、与RAJI细胞表面(对于hCD20ScFv-P18F3和VAR2CSA-P18F3缀合物)的反应性、或与表面表达的VAR19(对于EPCR-P18缀合物)的反应性，通过PE通道中荧光强度的几何平均值增加(几何平均值PE)来反映。
1.6.调理素作用测定
对于调理素作用测定，将DARC+红细胞与恒定浓度的在PBS 2％BSA中的DARCVHH-EBV缀合物在室温下孵育1小时。然后用PBS 2％BSA将细胞洗涤两次，并在室温下用在PBS2％BSA中连续稀释的人血浆孵育1小时。然后用PBS 2％BSA将细胞洗涤两次，并在室温下用PE缀合的驴F(ab')2抗人IgG(Jackson Immunoresearch 709-116-098，在PBS 2％BSA中1:100稀释)孵育30分钟。细胞用PBS洗涤并进行流式细胞术分析。
相比之下，将RAJI细胞与在PBS 2％BSA中连续稀释的hCD20ScFv-P18F3或VAR2CSA-P18F3缀合物室温孵育1小时。然后用PBS 2％BSA将这些细胞洗涤两次，并在室温下用在PBS2％BSA中的恒定的人血浆稀释液(1:100)孵育1小时。然后根据与适用于DARC+红细胞相同的规程洗涤所述细胞。
1.7.调理素吞噬作用测定
采用补充有10％(v/v)胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的RPMI 1640介质(THP-1培养介质)，将非粘附人单核细胞系THP-1(Sigma)保持在150cm2瓶中。细胞每3天传代培养，密度保持在每毫升2×105个细胞以下；将培养物保持在具有5％(v/v)CO2和95％(v/v)空气的湿润的37℃孵育箱中。
将THP-1细胞以每孔2.5×105个细胞接种在6孔板中，并用THP-1培养介质使每孔的体积为3ml。为了获得巨噬细胞，在37℃，在5％(v/v)CO2中，使用10ng/ml的佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯将细胞分化24小时。通过抽吸去除上清液和未附着的细胞，并用THP-1培养介质洗涤粘附的巨噬细胞两次，之后用3ml新鲜的THP-1培养介质填充孔。在进行吞噬作用测定之前，将它们进一步孵育48小时。
根据制造商的说明用CellTraceTM CFSE标记红细胞并如上所述用缀合物和人血浆促调理。标记和促调理的红细胞与THP-1衍生的巨噬细胞共同孵育3h。从孔中洗出红细胞，然后通过胰蛋白酶处理将巨噬细胞分离并进行流式细胞术分析。CFSE阳性THP-1细胞被认为是吞噬了至少一个红细胞的细胞。
1.8.补体活化测定
对于补体活化测定，将RAJI细胞与在PBS 1％BSA中5μg/ml的hCD20ScFv或hCD20ScFv-P18F3在4℃孵育1小时。然后将细胞用PBS 1％BSA洗涤两次，并在37℃，5％CO2，与10％EBV+人血浆(以其活性形式通过热处理预先灭活(56℃45分钟))中孵育1小时。然后用PBS洗涤细胞三次，并在室温下用4％PFA固定15分钟。然后将细胞用PBS 5％BSA洗涤三次，并用PBS5％BSA在室温下封闭1小时，然后与小鼠单克隆抗体抗C5b9(Abcam ab66768，在PBS 1％BSA中1:100)孵育。然后将细胞用PBS 1％BSA洗涤三次，并在室温下用PE缀合的山羊F(ab')2抗小鼠IgG(Beckman Coulter，IM0855，在PBS 1％BSA中1:100稀释)孵育30分钟。细胞用PBS洗涤并进行流式细胞术分析。使用BD FACScanto II流式细胞仪(Becton-Dickinson，SanJose，CA)获取数据并使用FLOWJO 8.1软件(Tree Star Inc.)进行分析。通过使用正向和侧向散射的适当门控，将细胞碎片排除在分析之外。RAJI细胞表面的C5-b9沉积由PE通道中增加的荧光强度反映。
1.9.抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定
对于ADCC测定，在37℃、5％CO2下，在补充有10％FCS和1×抗生素-抗真菌溶液(Gibco)的RPMI(GlutamaxTM-1)中，将RAJI细胞保持在2.5.105-106个细胞/ml的密度。根据制造商的说明稍作修改以适合我们的系统，使用ADCC Reporter Bioassay(Promega)进行ADCC测定。首先用PBS 2％BSA将300000个RAJI细胞洗涤两次，并与饱和浓度的缀合物(25μg/ml hCD20ScFv、hCD20ScFv-P18F3或50μg/ml VAR2CSA、VAR2CSA-P18F3)在4℃孵育1小时。然后用PBS 2％BSA将细胞洗涤一次，并将12500个细胞(在25μl中)引入白色平底96孔板的孔中。EBV+人血浆在56℃灭活/去补体(decomplemented)45分钟。在ADCC测定介质(RPMI1640，4％低IgG FCS)中制备连续稀释液，并将25μl稀释的血浆与RAJI靶细胞一起引入孔中。解冻效应细胞并立即将75000个细胞(在25μl中)分配到孔中。板在37℃、5％CO2下孵育。孵育6小时后，从孵育箱中取出板并在室温下放置15分钟，然后将75μl的Bio-GloTM试剂加入到每个孔中。使用VICTOR板读取平台(PerkinElmer)测量发光。
2.结果
2.1.缀合物的表达和纯化
缀合物DARCVHH-EBV P18和DARCVHH-EBV P23(分别与EBV P18或EBVP23抗原融合的抗DARCVHH，所述抗原中的每一个在C末端用多组氨酸序列标记)在天然条件下的IMAC(固定化金属离子亲和色谱)纯化未成功(图1A-B)。实际上，如在变性条件下通过IMAC成功纯化这些缀合物所证明的，C末端His标签在天然条件下不可接近(图1C-D)。尝试纯化N末端His标签融合体并没有带来更好的结果。
通过丝氨酸取代EBV P18Cys(氨基酸位置56)和EBV P23Cys(氨基酸位置46)进行定点诱变。新的缀合物DARCVHH-EBV P18(C56S)*和DARC-EBV P23(C46S)*通过IMAC成功纯化(图2)。尽管如此，纯化过程的第二步(色谱法)显示，即使在高盐缓冲液中，大部分融合蛋白也趋于形成聚集体(图3A和4A)。
为了克服这个问题，设计了pf P18和P23的较短变体。与DARCVHH-EBV P18(C56S)*相比，所得到的融合蛋白DARCVHH-EBV P18F2、DARCVHH-EBV P18F3、DARCVHH-EBV P18F4获得了显著的溶解度，并且在凝胶过滤纯化步骤期间形成非常少的聚集体(图3B-E)。进行类似的方法以改善DARCVHH-EBV P23(C46S)*溶解度(数据未显示)。
为了将概念证据扩展到另一种缀合系统，能够识别存在于恶性疟原虫感染的胎盘来源的红细胞表面的恶性疟原虫蛋白的VHH序列(VAR2CSAVHH)也融合到EBV P18和EBV P23抗原。类似于DARCVHH缀合物，去除EBV P18和EBV P23的N末端簇显著改善了缀合物在溶液中的溶解度和稳定性。所有产生的构建体的凝胶电泳分析显示了该研究中使用的重组蛋白的高纯度(图4B)。
通过表面等离子体共振评估DARCVHH-EBV P18抗原缀合物和VAR2CSAVHHEBV P18抗原缀合物对其各自分子靶的亲和力。与单独的VHH亲和力相比，缀合物对其靶的特异性和亲和力没有显著改变(图5)。
本发明的概念证据用三种其它缀合系统进一步验证：
·与EBV P18F3抗原融合的能够识别CD20(通常由癌细胞过度表达的标记物)的scFv序列，其纯化成功(图10)；和
·与EBV P18F3抗原融合的EPCR受体，其纯化也成功(图16)。
·与EBV P18F3抗原融合的VAR2CSA变体蛋白，其纯化也成功(图10)
2.2.缀合物的免疫识别
反映缀合物的免疫识别的免疫球蛋白G滴度，通过来自12名EBV感染阳性健康供体的血浆连续稀释液确定。DARCVHH-EBV P18F2被存在于所述血浆中的IgG高度识别(表2和图6A)。用缀合物DARCVHH-EBV P18(C56S)*和DARCVHH-EBV P23(C46S)*获得类似的数据。
表2.来自12名EBV+供体的血浆中的IgG滴度(抗DARCVHH-EBV P18F2)。
用22种血浆样品(1/200稀释度)进行的比较免疫识别研究显示，P18的C末端部分具有免疫优势表位。在包含EBV P18F2和EBV P18F3的缀合物间未观察到识别的显著差异。
2.3.缀合物的细胞表面识别
通过流式细胞术评估缀合物对天然靶的识别。
DARCVHH-EBV P18F2能够以剂量依赖性方式包被FY+(DARC+)红细胞的表面(图7)。少于250ng的DARCVHH-EBV P18F2足以饱和存在于1,000,000个红血细胞上的所有VHH特异性DARC表位。以类似的方式，VAR2CSAVHH -EBVP18F2能够包被在其表面表达VAR2CSA的恶性疟原虫感染的红细胞。
hCD20ScFv-P18F3缀合物能够包被CD20+RAJI细胞(图11)。
VAR2CSA-P18F3缀合物能够包被CSA+RAJI细胞(图11)。
EPCR-P18F3缀合物能够以剂量依赖性方式包被表达VAR19的红细胞的表面(图17)。
2.4.通过靶向所述细胞的缀合物进行的红细胞调理素作用
此外，结合细胞的缀合物与EBV+供体的血浆样品的孵育导致FY+(DARC+)红细胞调理素作用，即用供体血浆IgG包被细胞(图8A)。这也在凝集测定中说明，其中FY+红细胞与DARCVHH-EBV P18F3和人血浆(EBV阳性)的连续孵育导致细胞凝集(图8B)。
2.5.调理素吞噬作用测定
吞噬作用测定显示在用DARCVHH-EBV P18和EBV P23抗原融合物处理后，THP1单核细胞对红细胞的调理素吞噬作用增加。实际上，缀合物DARCVHH-EBVP18(C56S)*介导THP1衍生的巨噬细胞对FY+红细胞的调理素吞噬作用(图9A)。用DARCVHH-EBV P18F3处理(图9B)、以及用EPCR-P18F3缀合物处理(使用表达VAR19的感染的红细胞)(图18)进行类似观察。
结合细胞的hCD20ScFv-P18F3和VAR2CSA-P18F3缀合物与EBV+供体的血浆样品的孵育也导致RAJI调理素作用，即用供体血浆IgG包被细胞(图12和13)。
有趣的是，用与不同EBV P18片段融合的DARCVHH处理FY+红细胞显示所述片段招募IgG的能力和引发的细胞应答的强度之间存在关联(图9C)。尤其是，图9C的结果显示(i)细胞应答(吞噬作用)与来自用于调理素作用的血浆的抗体滴度(抗P18)之间的相关性，和(ii)不同P18片段之间对P18的血浆反应性不同，P18F3抗原显示更好的应答。
首先这些结果是有希望的体外数据，证明了在用结合部分-EBV P18或EBVP23融合蛋白处理后可以实现明确靶细胞的免疫清除。
2.6.补充活化
补体活化测定显示用hCD20ScFv-P18F3缀合物处理后补体级联的活化增加，最可能是经典的抗体依赖性途径。这通过在细胞表面形成膜攻击复合物来说明，其将导致靶细胞裂解(图14)。
2.7.ADCC
ADCC测定显示用hCD20ScFv-P18F3或VAR2CSA-P18F3预处理的靶细胞(RAJI)在有效的效应细胞中NFAT途径的活化增加。这反映出在EBV+血浆存在下发生的靶细胞的调理素作用导致效应细胞上的表面Fc受体的参与和随后细胞内途径的活化，最终导致靶细胞裂解(图15)。
3.结论
免疫疗法正在用于对抗癌细胞、感染性疾病以及阿尔茨海默病。有趣的是，最近的研究显示单克隆抗体治疗后巨噬细胞通过依赖性FcγRI和FcγRIV吞噬作用的消除循环肿瘤细胞。包括但不限于Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、scFv抗体、骆驼单结构域抗体(VHH)和鲨鱼单结构域抗体(VNAR)的“抗体片段”或“抗体结合片段”或可选择的“蛋白和非蛋白”部分不能驱动细胞介导的Fc效应功能。一种可能性是将Fc链融合到那些靶向部分。然而，添加Fc链将导致重组表达困难以及降低对存在于小腔和裂隙中的表位的可及性。
本发明提出采用新颖且创新的免疫原性构建体克服这些问题，所述免疫原性构建体能够将存在的(或预先存在的)EBV免疫应答重定向至非期望的靶细胞和/或微生物。为了提供与EBV抗原融合的靶向部分能够促进明确靶的调理素作用，以及免疫复合物的形成并随后清除所述靶的概念证据，本文使用三种体外模型。在第一种模型中，靶向在红细胞表面表达的蛋白的单结构域抗体(DARCVHH)与一对不同的EBV抗原(EBV P18或EBV P23)缀合。在第二种模型中，单结构域抗体(VAR2CSAVHH)和非抗体衍生的蛋白结合部分(EPCR)(二者均靶向在恶性疟原虫感染的红细胞表面表达的疟疾蛋白(分别为VAR2CSAPfEMP1和VAR19PfEMP1))与EBV P18缀合。在第三种模型中，针对分化CD20簇的scFv抗体(hCD20ScFv)和非抗体衍生的蛋白结合部分(VAR2CSA)(其分别靶向存在于B细胞表面(包括B淋巴瘤)表面的CD20分子或在癌细胞表面过表达的CSA)与EBV P18缀合。
本研究证明设计的缀合物促调理靶细胞的能力，所述靶细胞分别为红细胞、恶性疟原虫感染的红细胞、癌细胞，以及通过免疫效应机制即调理素吞噬作用、ADCC和CDC促进其清除的能力。
EBV P18和EBV P23的N末端区域被鉴定为蛋白表达的障碍，其显著降低了蛋白的溶解度和稳定性。EBV P18和EBV P23的N末端片段的缺失允许缀合物的可溶表达和纯化(图1-4)。VHH和EBV抗原之间蛋白接头的存在对于正确的蛋白生产不是强制性的。
重要的是，表面等离子体共振实验显示结合部分(DARCVHH和VAR2CSAVHH)对其明确靶的亲和力和特异性不受它们与EBV抗原融合的影响(图5)。
用来自EBV阳性个体的血浆进行的免疫识别实验显示包含EBV P18或EBVP23的缀合物被循环IgG高度识别(图6)。虽然F4对招募IgG仍然有效，包含EBV P18片段EBV P18F3(8.4kDa)的缀合物似乎是给出最大IgG反应性的EBVP18的最短片段。EBV P18F3表现为与不同的结合部分融合的足够的EBV抗原，并允许募集各种免疫效应物至靶位点。这通过以下进一步证实i)凝集测定，其中在EBV+人血浆存在下，DARCVHH-EBV P18F3显示介导红细胞聚集(图8)，和ii)通过调理素作用测定，其中EPCR-EBV P18F3、hCD20ScFv-EBV P18F3和VAR2CSA-EBV P18F3显示向感染的红细胞表面(对于EPCR-EBV P18F3)和RAJI癌细胞表面(对于hCD20ScFv-EBV P18F3和VAR2CSA-EBV P18F3)募集血浆IgG，因此导致形成免疫复合物(图12、13和17)。
主要感兴趣的是，由缀合物介导的免疫复合物的形成导致免疫效应应答。DARC+红细胞的DARCVHH-EBV P18F3处理促进其被巨噬细胞消除(图9)。根据EBV片段免疫识别的结果，DARCVHH-EBV P18F3比DARCVHH-EBV P18F4更有效地诱导调理素吞噬作用(图9)。
此外，用P18F3缀合物处理靶细胞还导致i)通过有效的效应细胞的ADCC(图15)和ii)补体级联的活化(图15)以及在靶细胞表面形成MAC(膜攻击复合物)。
总之，这些结果证明免疫原性构建体，比如DARCVHH-EBV P18F3、EPCR-EBVP18F3、hCD20ScFv-EBV P18F3和VAR2CSA-EBV P18F3能够将存在的EBV免疫应答重定向至特异性的靶，从而导致形成免疫复合物和随后募集的免疫效应机制，比如调理素吞噬作用、ADCC和CDC，最终导致靶消除。
试剂的类型稳定、易于生产且高效地调理靶元素，对于单独的临床干预或与现有的抗病原体和癌症疗法的组合是非常有价值的。
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<400> 8
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DARC VHH 具有限制性位点
<400> 9
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VAR2CSA VHH
<400> 10
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VAR2CSA VHH 具有限制性位点
<400> 11
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSG VHH
<400> 12
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Pro Cys
20 25 30
Thr Thr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Pro Gly Thr Ile Tyr Tyr Gln Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Gln Arg Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Ile Gln Cys Gly Val Arg Ser Ile Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSG VHH 具有限制性位点
<400> 13
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Pro Cys
20 25 30
Thr Thr Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Pro Gly Thr Ile Tyr Tyr Gln Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Gln Arg Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Gln
85 90 95
Ile Gln Cys Gly Val Arg Ser Ile Arg Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
<210> 14
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPCR 氨基酸 18-210
<400> 14
Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu Gln Ile Ser Tyr Phe Arg
1 5 10 15
Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn Ala Ser Leu Gly Gly His
20 25 30
Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ile Ile Gln
35 40 45
Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp Ala Arg Thr Gln Ser Gly
50 55 60
Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly Leu Val Arg Leu Val His
65 70 75 80
Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr Ile Arg Cys Phe Leu Gly
85 90 95
Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala His Val Phe Phe Glu Val
100 105 110
Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe Arg Pro Glu Arg Ala Leu
115 120 125
Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly Val Val Thr Phe Thr Leu
130 135 140
Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Glu Phe
145 150 155 160
Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln Lys His Ile Ser Ala Glu
165 170 175
Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Leu Val Leu
180 185 190
Gly Val Leu Val Gly Ser
195
<210> 15
<211> 176
<212> PRT
<213> EB 病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 一致性全长 EBV P18 抗原
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Ala 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (136)..(136)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (148)..(148)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (149)..(149)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (165)..(165)
<223> Gln 可以被His取代
<400> 15
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 16
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 一致性全长 EBV 23 抗原
<220>
<221> 变体
<222> (39)..(39)
<223> Gln 可以被Arg取代
<220>
<221> 变体
<222> (55)..(55)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (56)..(56)
<223> Pro 可以被Thr取代
<220>
<221> 变体
<222> (89)..(89)
<223> Asp 可以被Glu取代
<220>
<221> 变体
<222> (104)..(104)
<223> Met 可以被Leu取代
<220>
<221> 变体
<222> (106)..(106)
<223> Asn 可以被Lys取代
<220>
<221> 变体
<222> (132)..(132)
<223> Thr 可以被Pro取代
<220>
<221> 变体
<222> (134)..(134)
<223> Pro 可以被Leu或者Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (135)..(135)
<223> Arg 可以被Asn取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (136)..(136)
<223> Glu 可以被Asp取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (137)..(137)
<223> Ser 可以被Pro取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (138)..(138)
<223> Asn 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (142)..(142)
<223> Ala 可以被Thr、Ser或者Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (148)..(148)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (149)..(149)
<223> Arg 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (153)..(153)
<223> Arg 可以被Cys取代
<220>
<221> 变体
<222> (155)..(155)
<223> Ala 可以被Ser取代
<400> 16
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 17
<211> 176
<212> PRT
<213> EB病毒 B95-8 菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 17
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 18
<211> 176
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 18
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 19
<211> 174
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 19
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170
<210> 20
<211> 176
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 20
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Asn Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 21
<211> 176
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 21
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Val Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 22
<211> 176
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P18 抗原
<400> 22
Met Ser Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 23
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 B95-8 菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 23
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 24
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 24
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 25
<211> 159
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 25
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg
130 135 140
Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
145 150 155
<210> 26
<211> 159
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 26
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Lys Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg
130 135 140
Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
145 150 155
<210> 27
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 27
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Leu Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Ser Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 28
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 28
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Val Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
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100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
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130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
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<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 29
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
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35 40 45
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50 55 60
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Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
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<210> 30
<211> 159
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 30
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1 5 10 15
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Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg
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Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
145 150 155
<210> 31
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<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 31
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
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Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
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50 55 60
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145 150 155 160
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<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 32
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
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65 70 75 80
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100 105 110
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145 150 155 160
Ser Asp
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<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 33
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
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35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 34
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 34
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Thr Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 35
<211> 159
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 35
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
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Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
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100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg
130 135 140
Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
145 150 155
<210> 36
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 36
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 37
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 37
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
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145 150 155 160
Ser Asp
<210> 38
<211> 162
<212> PRT
<213> EB病毒 可选择的菌株
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> wt 全长 EBV P23 抗原
<400> 38
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Cys Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Cys Glu Ser Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 39
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV 突变的 P18 抗原 (C56S)*
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Ala 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (126)..(126)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (136)..(136)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (148)..(148)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (149)..(149)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (165)..(165)
<223> Gln 可以被His取代
<400> 39
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 40
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV 突变的 P23 抗原 (C46S)*
<220>
<221> 变体
<222> (39)..(39)
<223> Gln 可以被Arg取代
<220>
<221> 变体
<222> (55)..(55)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (56)..(56)
<223> Pro 可以被Thr取代
<220>
<221> 变体
<222> (89)..(89)
<223> Asp 可以被Glu取代
<220>
<221> 变体
<222> (104)..(104)
<223> Met 可以被Leu取代
<220>
<221> 变体
<222> (106)..(106)
<223> Asn 可以被Lys取代
<220>
<221> 变体
<222> (132)..(132)
<223> Thr 可以被Pro取代
<220>
<221> 变体
<222> (134)..(134)
<223> Pro 可以被Leu或者Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (135)..(135)
<223> Arg 可以被Asn取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (136)..(136)
<223> Glu 可以被Asp取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (137)..(137)
<223> Ser 可以被Pro取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (138)..(138)
<223> Asn 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (142)..(142)
<223> Ala 可以被 Thr、Ser或者Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (148)..(148)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (149)..(149)
<223> Arg 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (153)..(153)
<223> Arg 可以被Cys取代
<220>
<221> 变体
<222> (155)..(155)
<223> Ala 可以被Ser取代
<400> 40
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 41
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV 突变的 P18 抗原 (C56S)*
<400> 41
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1 5 10 15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
20 25 30
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
50 55 60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
85 90 95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
115 120 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
165 170 175
<210> 42
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV 突变的 P23 抗原 (C46S)*
<400> 42
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
1 5 10 15
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
20 25 30
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
50 55 60
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
65 70 75 80
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
85 90 95
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
100 105 110
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
130 135 140
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
145 150 155 160
Ser Asp
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段 F4
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> Gln 可以被取代 His
<400> 43
Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
20
<210> 44
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段F3'
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (66)..(66)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (67)..(67)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (83)..(83)
<223> Gln 可以被His取代
<400> 44
Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro
1 5 10 15
Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala
20 25 30
Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val
35 40 45
Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala
50 55 60
Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gln Pro Gln Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
85 90
<210> 45
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段F2-F4
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (67)..(67)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (79)..(79)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (80)..(80)
<223> Ser 可以缺失
<400> 45
Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala
35 40 45
Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser
50 55 60
Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala
<210> 46
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段F3'-F4
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (54)..(54)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (66)..(66)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (67)..(67)
<223> Ser 可以缺失
<400> 46
Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro
1 5 10 15
Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala
20 25 30
Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val
35 40 45
Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala
50 55 60
Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala
65 70
<210> 47
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段P18F5
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (12)..(12)
<223> Ser 可以被Asn取代
<400> 47
Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ala
20
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段P18F6
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Ser 可以被Asn取代
<400> 48
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段F2
<220>
<221> 变体
<222> (57)..(57)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (67)..(67)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (79)..(79)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (80)..(80)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (96)..(96)
<223> Gln 可以被His取代
<400> 49
Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala
35 40 45
Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser
50 55 60
Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln
85 90 95
Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
100 105
<210> 50
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P23 抗原片段F3
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> Met 可以被Leu取代
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Asn 可以被Lys取代
<220>
<221> 变体
<222> (30)..(30)
<223> Thr 可以被Pro取代
<220>
<221> 变体
<222> (32)..(32)
<223> Pro 可以被Leu或者Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (33)..(33)
<223> Arg 可以被Asn取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (34)..(34)
<223> Glu 可以被Asp取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (35)..(35)
<223> Ser 可以被Pro取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (36)..(36)
<223> Asn 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (40)..(40)
<223> Ala 可以被Thr、Ser或者Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (46)..(46)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (47)..(47)
<223> Arg 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (51)..(51)
<223> Arg 可以被Cys取代
<220>
<221> 变体
<222> (53)..(53)
<223> Ala 可以被Ser取代
<400> 50
Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser
1 5 10 15
Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro
20 25 30
Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser
35 40 45
Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
50 55 60
<210> 51
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P23 抗原片段F2
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> Asp 可以被Glu取代
<220>
<221> 变体
<222> (30)..(30)
<223> Met 可以被Leu取代
<220>
<221> 变体
<222> (32)..(32)
<223> Asn 可以被Lys取代
<220>
<221> 变体
<222> (58)..(58)
<223> Thr 可以被Pro取代
<220>
<221> 变体
<222> (60)..(60)
<223> Pro 可以被Leu或者Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (61)..(61)
<223> Arg 可以被Asn取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (62)..(62)
<223> Glu 可以被Asp取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (63)..(63)
<223> Ser 可以被Pro取代或者可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (64)..(64)
<223> Asn 可以被Ser取代
<220>
<221> 变体
<222> (68)..(68)
<223> Ala 可以被Thr、Ser或者Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (74)..(74)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (75)..(75)
<223> Arg 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (79)..(79)
<223> Arg 可以被Cys取代
<220>
<221> 变体
<222> (81)..(81)
<223> Ala 可以被Ser取代
<400> 51
Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys
1 5 10 15
Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn
20 25 30
Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala
35 40 45
Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn
50 55 60
Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu
65 70 75 80
Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
85
<210> 52
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F4
<400> 52
Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
20
<210> 53
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F3'
<400> 53
Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln
1 5 10 15
Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro
65 70 75 80
His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
85 90
<210> 54
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F2-F4
<400> 54
Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala
35 40 45
Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser
50 55 60
Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala
<210> 55
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F3'-F4
<400> 55
Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro
1 5 10 15
Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala
20 25 30
Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val
35 40 45
Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala
50 55 60
Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala
65 70
<210> 56
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段P18F5
<400> 56
Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ser Gly Ala
20
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段P18F6
<400> 57
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg
1 5 10
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F2
<400> 58
Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln
20 25 30
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala
35 40 45
Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser
50 55 60
Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His
85 90 95
Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
100 105
<210> 59
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P23 抗原片段F3
<400> 59
Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser
1 5 10 15
Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro
20 25 30
Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser
35 40 45
Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
50 55 60
<210> 60
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P23 抗原片段F2
<400> 60
Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys
1 5 10 15
Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn
20 25 30
Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala
35 40 45
Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn
50 55 60
Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu
65 70 75 80
Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
85
<210> 61
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - 甘氨酸丝氨酸
接头 - EBV wt 全长 P18 抗原
<400> 61
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly
145 150 155 160
Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln
165 170 175
Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln
180 185 190
Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr
195 200 205
Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys
210 215 220
Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala
245 250 255
Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln
260 265 270
Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala
275 280 285
Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala
305 310 315 320
Arg Lys Lys Gln
<210> 62
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - 甘氨酸丝氨酸
接头 - EBV 突变的 P18 抗原 (C56S)*
<400> 62
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly
145 150 155 160
Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln
165 170 175
Glu Leu Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln
180 185 190
Arg Ser Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr
195 200 205
Val Gln Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys
210 215 220
Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala
245 250 255
Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln
260 265 270
Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala
275 280 285
Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala
305 310 315 320
Arg Lys Lys Gln
<210> 63
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV 突变的 P18
抗原 (C56S)*
<400> 63
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
130 135 140
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
145 150 155 160
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
165 170 175
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
180 185 190
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
195 200 205
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
210 215 220
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
225 230 235 240
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
245 250 255
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
260 265 270
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
290 295 300
<210> 64
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P18 抗原
片段F2
<400> 64
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala
130 135 140
Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln
145 150 155 160
Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala
165 170 175
Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser
180 185 190
Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His
210 215 220
Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
225 230 235
<210> 65
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P18 抗原
片段F3'
<400> 65
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln
130 135 140
Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala
180 185 190
Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro
195 200 205
His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
210 215 220
<210> 66
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P18 抗原
片段F4
<400> 66
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro
130 135 140
Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
145 150
<210> 67
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 VAR2CSA VHH (具有限制性位点)- EBV P18 抗原
片段F2
<400> 67
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Arg Gln Arg
115 120 125
Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His
130 135 140
Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr
165 170 175
Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser
180 185 190
Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
195 200 205
Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala
210 215 220
Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
225 230
<210> 68
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 VAR2CSA VHH (具有限制性位点)- EBV P18 抗原
片段F3'
<400> 68
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ala
115 120 125
His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln
130 135 140
Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser
145 150 155 160
Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser
165 170 175
Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala
180 185 190
Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr
195 200 205
Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
210 215
<210> 69
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 VAR2CSA VHH (具有限制性位点) - EBV P18 抗原
片段F4
<400> 69
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Asp Thr
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala
130 135 140
Arg Lys Lys Gln
145
<210> 70
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - 甘氨酸丝氨酸
接头 - EBV wt 全长 P23 抗原
<400> 70
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val
145 150 155 160
Lys Ala Val Asp Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg
165 170 175
Leu Glu Ser Glu Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly
180 185 190
Ala Cys Ala Ser Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro
195 200 205
Glu Pro Leu Thr Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr
210 215 220
Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu
245 250 255
Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly
260 265 270
Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro
275 280 285
Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys
290 295 300
Lys Val Gln Ile Ser Asp
305 310
<210> 71
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - 甘氨酸丝氨酸
接头 - EBV 突变的 P23 抗原 (C46S)*
<400> 71
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val
145 150 155 160
Lys Ala Val Asp Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg
165 170 175
Leu Glu Ser Glu Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly
180 185 190
Ala Ser Ala Ser Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro
195 200 205
Glu Pro Leu Thr Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr
210 215 220
Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg
225 230 235 240
Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu
245 250 255
Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly
260 265 270
Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro
275 280 285
Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys
290 295 300
Lys Val Gln Ile Ser Asp
305 310
<210> 72
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV 突变的 P23
抗原(C46S)*
<400> 72
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Met Ser Ala Pro Arg Lys Val Arg Leu Pro Ser Val Lys Ala Val Asp
130 135 140
Met Ser Met Glu Asp Met Ala Ala Arg Leu Ala Arg Leu Glu Ser Glu
145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Lys Gln Gln Val Leu Arg Gly Gly Ala Ser Ala Ser
165 170 175
Ser Thr Ser Val Pro Ser Ala Pro Val Pro Pro Pro Glu Pro Leu Thr
180 185 190
Ala Arg Gln Arg Glu Val Met Ile Thr Gln Ala Thr Gly Arg Leu Ala
195 200 205
Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys Val Arg Lys Ser Val Asp
210 215 220
Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr
225 230 235 240
Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro
245 250 255
Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg
260 265 270
Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile
275 280 285
Ser Asp
290
<210> 73
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P23 抗原
片段F2
<400> 73
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Arg Leu Ala Ser Gln Ala Met Lys Lys Ile Glu Asp Lys
130 135 140
Val Arg Lys Ser Val Asp Gly Val Thr Thr Arg Asn Glu Met Glu Asn
145 150 155 160
Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser Met Leu Gly Ala
165 170 175
Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro Arg Glu Ser Asn
180 185 190
Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Glu
195 200 205
Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
210 215
<210> 74
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P23 抗原
片段F3
<400> 74
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Glu Met Glu Asn Ile Leu Gln Asn Leu Thr Leu Arg Ile Gln Val Ser
130 135 140
Met Leu Gly Ala Lys Gly Gln Pro Ser Pro Gly Glu Gly Thr Arg Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Thr Arg Arg Ala Arg Ser Arg Ser
165 170 175
Arg Gly Arg Glu Ala Lys Lys Val Gln Ile Ser Asp
180 185
<210> 75
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 一致性 EBV P18 抗原片段F3
<220>
<221> 变体
<222> (22)..(22)
<223> Ala 可以被Val取代
<220>
<221> 变体
<222> (32)..(32)
<223> Ser 可以被Asn取代
<220>
<221> 变体
<222> (44)..(44)
<223> Ala 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (45)..(45)
<223> Ser 可以缺失
<220>
<221> 变体
<222> (61)..(61)
<223> Gln 可以被His取代
<400> 75
Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr
1 5 10 15
Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Gln Asp Thr Ala
50 55 60
Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
65 70
<210> 76
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV P18 抗原片段F3
<400> 76
Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr
1 5 10 15
Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser
20 25 30
Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
35 40 45
Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala
50 55 60
Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
65 70
<210> 77
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 DARC VHH (具有限制性位点) - EBV P18 抗原
片段F3
<400> 77
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser Asp Gly Glu Arg Arg Gly Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Val Val Gly Gly Arg Tyr Cys Gly Gly Gly
100 105 110
Val Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr
130 135 140
Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala
165 170 175
Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala
180 185 190
Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
195 200
<210> 78
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 VAR2CSA VHH (具有限制性位点)- EBV P18 抗原
片段F3
<400> 78
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Ser Ile Phe Lys
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Thr Trp Asp Leu Ala Gly Trp Asn Thr Val Asp Glu Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ser
115 120 125
Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala
130 135 140
Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala
145 150 155 160
Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp
165 170 175
Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly
180 185 190
Ala Arg Lys Lys Gln
195
<210> 79
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缀合物 EPCR氨基酸18-210 - EBV P18 抗原片段F3
<400> 79
Ser Asp Gly Leu Gln Arg Leu His Met Leu Gln Ile Ser Tyr Phe Arg
1 5 10 15
Asp Pro Tyr His Val Trp Tyr Gln Gly Asn Ala Ser Leu Gly Gly His
20 25 30
Leu Thr His Val Leu Glu Gly Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ile Ile Gln
35 40 45
Leu Gln Pro Leu Gln Glu Pro Glu Ser Trp Ala Arg Thr Gln Ser Gly
50 55 60
Leu Gln Ser Tyr Leu Leu Gln Phe His Gly Leu Val Arg Leu Val His
65 70 75 80
Gln Glu Arg Thr Leu Ala Phe Pro Leu Thr Ile Arg Cys Phe Leu Gly
85 90 95
Cys Glu Leu Pro Pro Glu Gly Ser Arg Ala His Val Phe Phe Glu Val
100 105 110
Ala Val Asn Gly Ser Ser Phe Val Ser Phe Arg Pro Glu Arg Ala Leu
115 120 125
Trp Gln Ala Asp Thr Gln Val Thr Ser Gly Val Val Thr Phe Thr Leu
130 135 140
Gln Gln Leu Asn Ala Tyr Asn Arg Thr Arg Tyr Glu Leu Arg Glu Phe
145 150 155 160
Leu Glu Asp Thr Cys Val Gln Tyr Val Gln Lys His Ile Ser Ala Glu
165 170 175
Asn Thr Lys Gly Ser Gln Thr Ser Arg Ser Tyr Thr Ser Leu Val Leu
180 185 190
Gly Val Leu Val Gly Ser Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu Ala
195 200 205
Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser Val
210 215 220
Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
260 265 270
<210> 80
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 scFv
<400> 80
Met Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu
180 185 190
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
195 200 205
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Leu Lys
245
<210> 81
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 scFv - EBV P18 抗原片段F3
<400> 81
Met Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser
130 135 140
Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu
180 185 190
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser
195 200 205
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ser Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala Leu
245 250 255
Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro Ser
260 265 270
Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr
275 280 285
Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
305 310 315
<210> 82
<211> 1016
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VAR2CSA
<400> 82
Met Asp Lys Ser Ser Ile Ala Asn Lys Ile Glu Ala Tyr Leu Gly Ala
1 5 10 15
Lys Ser Asp Asp Ser Lys Ile Asp Gln Ser Leu Lys Ala Asp Pro Ser
20 25 30
Glu Val Gln Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Leu Arg Lys
35 40 45
Asn Ile Cys Lys Ile Thr Val Asn His Ser Asp Ser Gly Thr Asn Asp
50 55 60
Pro Cys Asp Arg Ile Pro Pro Pro Tyr Gly Asp Asn Asp Gln Trp Lys
65 70 75 80
Cys Ala Ile Ile Leu Ser Lys Val Ser Glu Lys Pro Glu Asn Val Phe
85 90 95
Val Pro Pro Arg Arg Gln Arg Met Cys Ile Asn Asn Leu Glu Lys Leu
100 105 110
Asn Val Asp Lys Ile Arg Asp Lys His Ala Phe Leu Ala Asp Val Leu
115 120 125
Leu Thr Ala Arg Asn Glu Gly Glu Arg Ile Val Gln Asn His Pro Asp
130 135 140
Thr Asn Ser Ser Asn Val Cys Asn Ala Leu Glu Arg Ser Phe Ala Asp
145 150 155 160
Ile Ala Asp Ile Ile Arg Gly Thr Asp Leu Trp Lys Gly Thr Asn Ser
165 170 175
Asn Leu Glu Gln Asn Leu Lys Gln Met Phe Ala Lys Ile Arg Glu Asn
180 185 190
Asp Lys Val Leu Gln Asp Lys Tyr Pro Lys Asp Gln Asn Tyr Arg Lys
195 200 205
Leu Arg Glu Asp Trp Trp Asn Ala Asn Arg Gln Lys Val Trp Glu Val
210 215 220
Ile Thr Cys Gly Ala Arg Ser Asn Asp Leu Leu Ile Lys Arg Gly Trp
225 230 235 240
Arg Thr Ser Gly Lys Ser Asn Gly Asp Asn Lys Leu Glu Leu Cys Arg
245 250 255
Lys Cys Gly His Tyr Glu Glu Lys Val Pro Thr Lys Leu Asp Tyr Val
260 265 270
Pro Gln Phe Leu Arg Trp Leu Thr Glu Trp Ile Glu Asp Phe Tyr Arg
275 280 285
Glu Lys Gln Asn Leu Ile Asp Asp Met Glu Arg His Arg Glu Glu Cys
290 295 300
Thr Ser Glu Asp His Lys Ser Lys Glu Gly Thr Ser Tyr Cys Ser Thr
305 310 315 320
Cys Lys Asp Lys Cys Lys Lys Tyr Cys Glu Cys Val Lys Lys Trp Lys
325 330 335
Ser Glu Trp Glu Asn Gln Lys Asn Lys Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln
340 345 350
Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gln Lys Asn Thr Ser Arg Tyr Asp Asp Tyr
355 360 365
Val Lys Asp Phe Phe Lys Lys Leu Glu Ala Asn Tyr Ser Ser Leu Glu
370 375 380
Asn Tyr Ile Lys Gly Asp Pro Tyr Phe Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ser Phe Ile Leu Asn Ser Ser Asp Ala Asn Asn Pro Ser Glu Lys Ile
405 410 415
Gln Lys Asn Asn Asp Glu Val Cys Asn Cys Asn Glu Ser Gly Ile Ala
420 425 430
Ser Val Glu Gln Glu Gln Ile Ser Asp Pro Ser Ser Asn Lys Thr Cys
435 440 445
Ile Thr His Ser Ser Ile Lys Ala Asn Lys Lys Lys Val Cys Lys His
450 455 460
Val Lys Leu Gly Val Arg Glu Asn Asp Lys Asp Leu Arg Val Cys Val
465 470 475 480
Ile Glu His Thr Ser Leu Ser Gly Val Glu Asn Cys Cys Cys Gln Asp
485 490 495
Phe Leu Arg Ile Leu Gln Glu Asn Cys Ser Asp Asn Lys Ser Gly Ser
500 505 510
Ser Ser Asn Gly Ser Cys Asn Asn Lys Asn Gln Glu Ala Cys Glu Lys
515 520 525
Asn Leu Glu Lys Val Leu Ala Ser Leu Thr Asn Cys Tyr Lys Cys Asp
530 535 540
Lys Cys Lys Ser Glu Gln Ser Lys Lys Asn Asn Lys Asn Trp Ile Trp
545 550 555 560
Lys Lys Ser Ser Gly Lys Glu Gly Gly Leu Gln Lys Glu Tyr Ala Asn
565 570 575
Thr Ile Gly Leu Pro Pro Arg Thr Gln Ser Leu Cys Leu Val Val Cys
580 585 590
Leu Asp Glu Lys Gly Lys Lys Thr Gln Glu Leu Lys Asn Ile Arg Thr
595 600 605
Asn Ser Glu Leu Leu Lys Glu Trp Ile Ile Ala Ala Phe His Glu Gly
610 615 620
Lys Asn Leu Lys Pro Ser His Glu Lys Lys Asn Asp Asp Asn Gly Lys
625 630 635 640
Lys Leu Cys Lys Ala Leu Glu Tyr Ser Phe Ala Asp Tyr Gly Asp Leu
645 650 655
Ile Lys Gly Thr Ser Ile Trp Asp Asn Glu Tyr Thr Lys Asp Leu Glu
660 665 670
Leu Asn Leu Gln Lys Ile Phe Gly Lys Leu Phe Arg Lys Tyr Ile Lys
675 680 685
Lys Asn Asn Thr Ala Glu Gln Asp Thr Ser Tyr Ser Ser Leu Asp Glu
690 695 700
Leu Arg Glu Ser Trp Trp Asn Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Trp Leu Ala
705 710 715 720
Met Lys His Gly Ala Gly Met Asn Ser Thr Thr Cys Cys Gly Asp Gly
725 730 735
Ser Val Thr Gly Ser Gly Ser Ser Cys Asp Asp Ile Pro Thr Ile Asp
740 745 750
Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Gln Glu Trp Val Glu His Phe
755 760 765
Cys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Val Lys Pro Val Ile Glu Asn Cys Lys
770 775 780
Ser Cys Lys Glu Ser Gly Gly Thr Cys Asn Gly Glu Cys Lys Thr Glu
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Glu Asn Lys Cys Val Gln Ser Asp Ile Asp Ser Phe Phe Lys His Leu
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885 890 895
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900 905 910
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Arg Ser Asn Ser Ser Lys Leu Asp
1010 1015
<210> 83
<211> 1088
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VAR2CSA - EBV P18 抗原片段F3
<400> 83
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1 5 10 15
Lys Ser Asp Asp Ser Lys Ile Asp Gln Ser Leu Lys Ala Asp Pro Ser
20 25 30
Glu Val Gln Tyr Tyr Gly Ser Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Leu Arg Lys
35 40 45
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ile Thr Cys Gly Ala Arg Ser Asn Asp Leu Leu Ile Lys Arg Gly Trp
225 230 235 240
Arg Thr Ser Gly Lys Ser Asn Gly Asp Asn Lys Leu Glu Leu Cys Arg
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Cys Lys Asp Lys Cys Lys Lys Tyr Cys Glu Cys Val Lys Lys Trp Lys
325 330 335
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340 345 350
Asn Lys Asn Glu Thr Ser Gln Lys Asn Thr Ser Arg Tyr Asp Asp Tyr
355 360 365
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370 375 380
Asn Tyr Ile Lys Gly Asp Pro Tyr Phe Ala Glu Tyr Ala Thr Lys Leu
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Val Lys Leu Gly Val Arg Glu Asn Asp Lys Asp Leu Arg Val Cys Val
465 470 475 480
Ile Glu His Thr Ser Leu Ser Gly Val Glu Asn Cys Cys Cys Gln Asp
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Asn Leu Glu Lys Val Leu Ala Ser Leu Thr Asn Cys Tyr Lys Cys Asp
530 535 540
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545 550 555 560
Lys Lys Ser Ser Gly Lys Glu Gly Gly Leu Gln Lys Glu Tyr Ala Asn
565 570 575
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580 585 590
Leu Asp Glu Lys Gly Lys Lys Thr Gln Glu Leu Lys Asn Ile Arg Thr
595 600 605
Asn Ser Glu Leu Leu Lys Glu Trp Ile Ile Ala Ala Phe His Glu Gly
610 615 620
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625 630 635 640
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660 665 670
Leu Asn Leu Gln Lys Ile Phe Gly Lys Leu Phe Arg Lys Tyr Ile Lys
675 680 685
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Leu Arg Glu Ser Trp Trp Asn Thr Asn Lys Lys Tyr Ile Trp Leu Ala
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725 730 735
Ser Val Thr Gly Ser Gly Ser Ser Cys Asp Asp Ile Pro Thr Ile Asp
740 745 750
Leu Ile Pro Gln Tyr Leu Arg Phe Leu Gln Glu Trp Val Glu His Phe
755 760 765
Cys Lys Gln Arg Gln Glu Lys Val Lys Pro Val Ile Glu Asn Cys Lys
770 775 780
Ser Cys Lys Glu Ser Gly Gly Thr Cys Asn Gly Glu Cys Lys Thr Glu
785 790 795 800
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly
1070 1075 1080
Ala Arg Lys Lys Gln
1085
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以在2至10之间重复，包括端点
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(5)
<223> 可以在2至6之间重复，包括端点
<400> 85
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 86
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30

Claims (15)

1.一种免疫原性缀合物，其包含：
i)结合靶细胞和/或微生物的部分；和
ii)EB病毒(EBV)B细胞抗原。
2.根据权利要求1所述的免疫原性缀合物，其中所述靶结合部分共价偶联至所述EB病毒B细胞抗原。
3.根据权利要求1或2所述的免疫原性缀合物，其中所述部分是配体结合蛋白，选自抗体、其结合片段、抗体模拟物、细胞表面受体、细胞表面配体及其任何组合。
4.根据权利要求3所述的免疫原性缀合物，其中所述抗体片段选自Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、单链抗体(scFv)和单结构域抗体及其任何组合。
5.根据权利要求1或2所述的免疫原性缀合物，其中所述部分是非蛋白部分，选自维生素、碳水化合物、葡萄糖胺聚糖、小核酸、小化合物及其任何组合。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性缀合物，其中所述EB病毒B细胞抗原选自序列SEQ ID NO：15的P18抗原、序列SEQ ID NO：16的P23抗原、其功能变体和功能片段，以及其任何组合。
7.根据权利要求6所述的免疫原性缀合物，条件是当所述部分包含巯基时，P18和/或P23抗原的功能变体和功能片段不包含任何半胱氨酸残基。
8.根据权利要求7所述的免疫原性缀合物，其中所述功能变体选自序列SEQ ID NO：39的P18抗原功能变体和序列SEQ ID NO：40的P23抗原功能变体。
9.根据权利要求6或7所述的免疫原性缀合物，其中所述功能片段包含所述抗原的约10个氨基酸残基至约150个氨基酸残基。
10.根据权利要求9所述的免疫原性缀合物，其中所述功能片段是P18抗原功能片段，其至少包含选自SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：43至SEQ ID NO：49的序列，和/或P19抗原功能片段，其至少包含选自SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51的序列。
11.根据权利要求10所述的免疫原性缀合物，其中所述P18抗原功能片段包含或由选自以下的序列组成：SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：52至SEQ ID NO：58，和/或所述P23抗原功能片段包含或由选自SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60的序列组成。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性缀合物，其中所述靶细胞是疾病细胞，优选癌细胞或由病原体如病毒、细菌、真菌和/或寄生虫感染的细胞，和/或靶微生物是病原微生物，优选病毒、细菌、真菌和/或寄生虫。
13.根据权利要求12所述的免疫原性缀合物，其中：
-所述疾病细胞是感染疟疾的红细胞和/或所述病原微生物是恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)；或者
-所述疾病细胞是癌细胞。
14.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1至13中任一项所述的免疫原性缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
15.如权利要求1至13中任一项所述的免疫原性缀合物或权利要求14所述的药物组合物，用作药物。
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