KR20180104184A - 항균성 미량원소 킬레이트 및 동물사료에서의 이들의 이용 - Google Patents

항균성 미량원소 킬레이트 및 동물사료에서의 이들의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 통성 병원성 박테리아를 억제하기 위한, 미량원소 유기물 O-킬레이트 또는 N-킬레이트 착화합물에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 이들 화합물을 포함하는 조성물, 사료첨가제 또는 사료 뿐 아니라, 이들의 제조 방법과 축산업에서 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항균성 미량원소 킬레이트 및 동물사료에서의 이들의 이용{ANTIBACTERIAL MICROELEMENT CHELATES AND THE USE THEREOF IN ANIMAL FEEDS}
본 발명은 통성 병원성 박테리아(facultative pathogenic bacteria) 억제를 위한, 미량원소 유기물 킬레이트 착화합물에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 이들 화합물을 포함하는 조성물, 사료첨가제, 사료 뿐 아니라 이들의 제조 방법 및 축산업에서 이들의 이용 방법에 관한 것이다.
미네랄은 생물의 생리학적 및 생화학적 작용에 있어서 다양하고, 필수적인 역할을 한다. 미네랄은 무엇보다도 효소의 구성 성분(Zn, Cu, Mn, Mg, Fe)이고, 비타민의 구성 성분(Co)이다. 미네랄은 각기 다른 보호 기전에서 결정적 역할을 한다(Cu, Zn, Fe, Se). 미네랄은 조혈작용(Cu, Fe)과 증식(P, Cu, K, Mn, Zn, Mg)에서 역할을 한다. 미네랄은 핵산과 단백질의 합성을 가능하게 한다. 사료작물의 미네랄 함량은 식물의 분류배치(taxonomical place), 토양의 조성 및 pH, 연간 강수 분포, 농경 기술과 같은 몇몇 요소들에 의존하며, 매우 높은 다양성을 보여준다. 건기에 사료작물의 미네랄 함량은 감소한다. 미네랄 함량은 식물계절 초기 단계에서 증가하기 시작하여, 최대치에 도달한 다음에는 감소하기 시작한다. 수확시 발생하는 용탈(leaching away) 또는 받침꽃잎 식물(vexillar plant)의 잎 손실의 경우 역시 상당한 미네랄 함량 감소가 동반된다. 토양 회복기 동안, 가축 분뇨의 이용 포기는 토양의 재순환 균형을 방해하고, 토양은 계속해서 산성화되고, 쇠약해진다.
가축동물 중에서 사료 동물(fodder eating animals)(돼지, 가금류)의 미네랄 수요 결정을 위하여, 우리는 조사료 동물(roughage eating animals)에 비해 급식 테이블에 제공되는 사료 작물의 미네랄 량에 의지할 수 있다. 식물의 줄기나 잎과 같은 생장관련 부위(vegetative parts)에 비해 씨앗과 같은 배 부위(germinal parts)에서 미네랄 함량의 변동은 덜 심하지만, 그럼에도 불구하고 씨앗의 경우에도 미네랄 변동은 2-3배 차이가 날 수 있다. 하지만 고수율로 사육되는 가축들에는 증가되고 균형잡힌 미네랄(미량원소 포함) 보충이 요구된다. 현재 이러한 요구조건은 여러가지 다른 미네랄 염을 사용하여 미량원소들을 혼합한 사료를 통해 전적으로 충족될 수 있다.
요구되는 보충 수준은 기본사료의 조성과 추가사료의 양을 알지 않고서는 계획할 수 없다. 요구조건은 품종(species), 연령대, 이용 형태에 서로 다르게 의존한다. 사료를 통한 미네랄 공급 부족은 두 가지 측면에서 결정될 수 있다. 1차적 결핍은 사료에 내재된 원소가 부족할 때 발생한다. 2차적 결핍은 몸이 사료에 들어 있는 원소를 이용할 수 없을 때, 예를 들면 미네랄을 흡수하기 위해 필요한 인자가 없거나, 길항 원소의 우세는 주어진 원소의 흡수를 억제시킨다(Kakukk-Schmidt, 1988).
미량원소는 미네랄 화합물 그룹, 식물체 또는 동물체에서 극소량 발생하는 금속 또는 비금속 원소에 속한다. 미량원소는 정적(static), 항상적(homeostatic) 또는 효소적(Fe, Zn, Cu, Mn, Mo, I, Ni, Se, Cr) 요소로서 기능한다. 미네랄이 결핍된 경우 이들은 필수 성분으로 분류되나, 고농도에서 미네랄은 유독할 수 있다. 따라서, 특정 미량원소는 유기체에 존재하는 농도에 따라 필수적이거나 유독할 수 있다(Kakukk-Schmidt, 1988). 미네랄은 양이온 또는 음이온의 이온 형태, 또는 부형 단백질(carrier protein)에 결합된 형태, 또는 유기체 내에 능동수송(칼륨 제외)으로 흡수될 수 있다. 금속 이온은 가역적인 전자공여 리간드를 가지는 금속 착물의 형태, 소위 킬레이트를 형성할 수 있다. 이러한 공정은 상당한 양의 ATP를 소모한다(Kakukk-Schmidt, 1988). 양전하 금속 이온은 수용액 환경에서 루이스 산으로 작용하고, 착물, 배위 화합물(coordinated compound) 또는 배위 이온이 형성되는 동안 이들은 전자 공여체(루이스 염기)와 반응할 수 있다. 킬레이트의 정전 효과(electrostatic effect)는 단지 수용액상(aqueous phase)(아쿠아킬레이트)에서 관찰될 수 있다. 그러므로 그외 불용성 화합물은 금속 착물의 형태로 용해된 후에 흡수될 수 있다. 초기 연구에서, 휴믹산(humic acid), 및 해조류의 가수분해물로 생성된 휴모-킬레이트, 또는 알기네이트는 금속 킬레이트가 금속염보다 더 유용하다는 것을 입증하였다. 이것들은 비록 요구량이 적을 지라도 생산 비용이 매우 높기 때문에 널리 이용되지는 않았다(Kakukk-Schmidt, 1988).
원소의 생물학적 효과는 이들의 화학적 형태에 큰 영향을 받는다. 염화물, 황산염과 같은 금속염은 산화물이나 탄산염에 비해 더 잘 이용된다(Kakukk-Schmidt, 1988). 이들 원소가 식물내에 주로 유기 화합물로 존재함에도 불구하고, 예비배합물(premix)을 생산하는 공장은 무기물 형태의 미량원소를 이용한다. 지난 10-15 년간 과학적 연구는 유기물 결합 미량원소가 무기물 형태에 비해 유리함을 명확히 하였다. 금속함유 유기 착물은 생물학적 시스템에서 주요 화합물 형태 중 하나이다. 금속 이온은 착물, 이온, 분자, 천연 유기화합물(아미노산, 펩티드, 단백질, 탄수화물 등), 즉 금속 이온에 결합하는 리간드의 중심 위치를 차지한다. 이온과 유기화합물 서로간의 화학 반응은 금속 이온이 리간드의 2이상의 원자와 결합될 때 킬레이트를 생성한다. 금속-리간드 상호작용을 가진 킬레이트 화합물은 이러한 착물에서 금속의 활성은 이온 형태에 비해 105-107배 더 높기 때문에 유기체에 가장 유용하다.
킬레이트는 기능에 따라 수송 킬레이트, 저장 킬레이트, 신진대사성 킬레이트일 수 있다. 신진대사성 킬레이트는 헤모글로빈, 엽록소와 같이, 그 중심에 Fe2 +, Cu2+ 를 가진 포르피린 구조(porphyrin scaffold) 화합물이다. 수송 킬레이트는 통상적으로는 아미노산(글리신, 시스틴, 히스티딘)이고, 드물게는 펩티드일 수 있다(Kakukk-Schmidt, 1988). 대부분의 미량원소에 있어서 다음의 킬레이트 착물이 형성된다: 아미노산, 단백질, 유기산 등으로 형성된 착물, 그 중에서도 단백질(아미노산) 미량원소 착물이 기본적이다. 동물들에 대한 Fe2 +, Mn2 +, Cu2 +, Zn2 + 및 Cr3 + 충분 요구량을 감소시키기 위해, 축산분야에서는 현재 가용한 것들보다 좀더 유용한 사료 첨가제가 필요하다. 유기물 형태로 제공되는 미량원소가 더욱 유용하나, 미량원소의 이용 정도는 이용된 화합물의 화학적 구조에 의존한다는 것이 문헌을 통해 알려져 있다. 게다가 사료에 첨가된 미량원소의 경우 미량원소의 이용이 더 좋을수록, 원소간 상호작용은 상당히 감소한다(Du, 1994, Shi et al., 1995, Mahan, 1997).
연구 및 실제 경험의 결과, 유기 결합한 미량원소의 흡수 및 생물학적 효과가 더 유리하나, 요구를 만족할만한 량은 미량원소 및 동물 종에 따라 결정될 것이다. 이는 사료안에 투여할 수 있는 최대 수준의 미량원소는 엄격한 음식 안정성과 환경 규제에 기인하여 지속적으로 감소하고 있기 때문에 더욱 중요하다. 어떤 케이스에서 이러한 감소는 동물의 미량원소 부족은 우수하거나 잘 흡수된 미량원소 공급으로 충족될 수 있음을 의미한다.
동시에, (황산구리, 산화아연과 같은) 몇몇 무기 화합물은 항균 효과를 지닌다. 우리의 경험에 따르면 우리는 유기물과 결합된 금속 착물이 항균 특성을 가진다는 것을 금속 함유 제품(셀레늄-효모균 제품)을 통해 발견하였다. 그러나, 이러한 항균 효과는 미량원소의 수준이 동물에 독성이 있어 실질적으로 유용하지 않다. CuSO4 과 ZnSO4 의 유사 효과 역시 독성 미량원소 농도에 관대한 산업적 발효에 이용된다. Whittaker 등(1993)은 실험에서 킬레이트 결합으로 금속염을 함유하는 금속 화합물이 예컨데 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)에 유용하다는 것을 발견하였다. 유사한 발견이 미국 특허등록 6,429,225에 보고 되었다. 헬리코박터 파이로리는 몇몇 이유에서 독특한 병원균으로 알려져 있는데, 예를 들어 헬리코박터 파이로리는 위장의 강한 산성 환경에서 생존한다. 따라서, 킬레이트 선행기술의 항-헬리코박터 파이로리 특성으로부터 장내세균총에 존재하는 박테리아가 어떻게 유기 금속 킬레이트 화합물과 반응하는 지, 적어도 어떤 타입의 것들이 시도되었는지 명확한 결론이 도출되지 않았다.
몇몇 특허출원은 축산분야에서 금속 킬레이트 착물의 사용을 개시하고 있다.
중국특허출원 CN1484971A(SHIJIAZHUANG CITY KEXING ANIMA; 2004.03.31)는 아미노산 금속 킬레이트 착물을 함유하는 동물 사료를 개시한다. 킬레이트 착물은 무엇보다 철, 구리, 망간 및 아연의 아미노산 킬레이트를 포함한다.
중국특허출원 CN101941931A(HUBEI SHENZHOU CHEMICAL CO LTD.; 2011.01.12)는 메티오닌 금속 킬레이트 제조방법을 개시한다. 메티오닌 및 용해성 금속염(예컨데, 황산구리, 염화구리, 황산아연, 염화아연, 염화크롬, 황산철, 염화철)은 알코올 존재 하에서 서로 혼합되고, 혼합물은 40-150 ℃에서 1-8 시간동안 유지된 후 여과되고 건조된다. 메티오닌 금속 킬레이트는 동물 사료로 이용된다.
중국특허출원 CN101838214A(INST. OF SUBTROPICAL AGRICULTURE CHINESE ACADEMY OF SCIENCES; 2010.09.22)는 DL-트레오닌 구리 킬레이트의 제조방법을 개시한다. DL-트레오닌 킬레이트는 글리신 구리 킬레이트와 아세트알데히드로부터 제조된다. DL-트레오닌 구리 킬레이트는 동물 사료로 이용된다.
중국특허출원 CN101744120A(UNIV. HEBEI AGRICULTURE; 2010.06.23)는 젖먹이 새끼돼지를 위해 제조된 미량원소 사료를 개시한다. 사료는 철 비스-글리시네이트 킬레이트, 글리신 아연염, 글리신 구리염, 황산 마그네슘, 요오드칼륨 및 효모를 포함한다.
중국특허출원 CN102150751A(TANGSHAN NORMAL UNIVERSITY; 2011.08.17)는 모피동물 사료로 유용한 예비배합물(premix)을 개시한다. 예비배합물은 무엇보다 철, 아연, 망간, 구리, 셀레늄의 아미노산 킬레이트이고, 바람직하게는 모피동물의 임신 및 산후보호 기간에 사용된다.
상기 문헌들의 목적은 향상된 흡수 특성을 가지는 금속 화합물의 제조에 있다.
국제특허공개 WO 2009/066117는 부라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriaea)에 의한 돼지 설사병의 치료하기 위하여 EDTA 또는 이의 염의 사용을 개시한다.
국제특허공개 WO2004/080210는 마이크로캡슐화 공정을 통해 아연과 구리의 금속염과 무기산 및 유기산의 단순 복합체가 항균 특성뿐 아니라 소화관(digestive tract)의 첫 체절(segment)에서 흡수되지 않도록 하는 것을 개시하고 있다.
본 발명은 통성 병원성 박테리아(facultative pathogenic bacteria) 억제를 위해 특정구조의 미량원소 유기물 킬레이트 착화합물을 제공하고, 나아가 이들 화합물을 포함하는 조성물, 사료첨가제, 사료 뿐 아니라 이들의 제조 방법 및 축산업에서 이들의 이용 방법을 제시하는 데 그 목적이 있다.
본 발명은 병원성 박테리아를 억제하기 위한, 하기 일반식의 미량원소 유기물 킬레이트 착화합물을 제공한다.
(M)n(X)m(Y)o
상기 식에서, M은 Zn, Cu, Fe, Mn, Ag이고,
X 는 NH4 또는 H2O이고,
Y 는 아미노산(바람직하게는 자연발생되는 20종의 아미노산에서 선택된 것), 지방산(바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 프로피온산), 하이드록시산(바람직하게는 말레산 또는 락트산) 및/또는 폴리아미노-카르복시산(바람직하게는 니트릴로트리아세트산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산)이고,
n은 0-6, m은1-6, o는 1-8이다.
본 발명에 따른 미량원소 유기물 킬레이트 착화합물은 통성 병원성 박테리아(facultative pathogenic bacteria)의 활성을 억제를 억제하므로 이들 화합물을 포함하는 조성물, 사료첨가제, 사료는 축산업에서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 아연 모노-글리시네이트 킬레이트의 IR 스펙트럼이다.
도 2는 구리 모노-글리시네이트 킬레이트의 IR 스펙트럼이다.
도 3은 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)가 TSA 한천 배지에서 저지대를 형성하는 것을 보여준다.
본 발명자들은 유기물 킬레이트의 작용 기전에서 특정한 착화합물이 단독 또는 조합(combination)으로 장관(intestinal tract) 속에 있는 병원성 박테리아의 증식을 억제하여, 유용한 수의 정상 장내 세균총[락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium)]이 우위를 점하도록 하는 것을 새롭게 발견하였다. 지금까지의 종래 기술은 미량원소 아미노산 킬레이트 착물에 대한 항균 효과를 제시하지는 않았다.
따라서, 본 발명은 병원균 억제를 위한, 하기 일반식을 가지는 미량원소 유기물 킬레이트 착물에 관한 것이다.
(M)n(X)m(Y)o
상기 식에서, M은 Zn, Cu, Fe, Mn, Ag이고,
X 는 NH4 또는 H2O이고,
Y 는 아미노산, 지방산, 하이드록시산 및/또는 폴리아미노-카르복시산이고,
n은 0-6, m은1-6, o는 1-8이다.
국제특허공개 WO 2009/066117는 부라키스피라 하이오디센테리에(Brachyspira hyodysenteriaea)에 의한 돼지 설사병의 치료하기 위하여 EDTA 또는 이의 염의 사용을 개시한다. 상기 문헌에서 사용된 EDTA 또는 EDTA 나트륨염의 효율은 본 발명에 따른 미량원소 EDTA 물 킬레이트 착물 또는 미량원소 EDTA 암모늄 킬레이트 착물의 효율보다 낮다. 물 분자 또는 암모늄 분자로 형성된 킬레이트 착물은 유리한 킬레이트 구조로, 이러한 킬레이트는 사이드로포어 유사체 및/또는 항생물질 결합 분자 및/또는 QS 신호 분자와 결합하는 분자로 작용하고, 약 10-500 mg/kg의 최소 농도에서 병원성 박테리아를 억제시킨다.
국제특허공개 WO2004/080210가 마이크로캡슐화를 통해 소화관의 첫 체절에서 비흡수되는 방식으로 항균 효과를 발휘하는 화합물을 개시하는 것과 대조적으로, 본 발명은 미량원소 착물에 더하여 이들의 O-킬레이트와 N-킬레이트를 제조하면, 이와 같이 형성된 특별한 화합물의 생물학적 활성이 미량원소의 단순 착물에 비해 훨씬 높다는 사실을 발견한데 기초한다. 이러한 신규 발견에 따라, O-킬레이트 및 N-킬레이트 착물을 형성하는 화합물에 추가하여, 물 분자나 다른 O-킬레이트 형성 분자, 또는 암모늄이나 다른 N-킬레이트 형성 분자는 배위결합으로 존재하고, 미생물에 의존한다.
본 발명에서 이용되는 아미노산은 바람직하게는 20종의 자연 발생 아미노산으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 발명에서 이용되는 지방산은 바람직하게는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부틸산으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 발명에서 이용되는 하이드록시산은 바람직하게는 말레산 또는 락트산(젖산)이다.
본 발명에서 이용되는 폴리아미노 카르복시산은 바람직하게는 니트릴로트리아세트산 또는 에틸렌디아민 테트라아세트산이다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 화합물에 관련되고, 여기서 병원성 박테리아는 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica ), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 세로바 엔테리티디스 (Salmonella enterica subsp . enterica serovar Enteritidis ), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis), 살모넬라 갈리나리움 (Salmonella gallinarium ), 살모넬라 파라타이피 (S. paratyphi ), 살모넬라 아보르투스 에쿠이 (S. abortus - equi ), 살모넬라 자바(S. java), 살모넬라 콜레라(S. cholerae ), 살모넬라 타이피 수이스 (S. typhi -suis), 살모넬라 센다이(S. sendai ), 대장균( Escherichia coli ), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens ), 클로스트리디움 바라티 (Cl. barati ), 클로스트리디움 소르델리 (Cl. sordellii ). 클로스트리디움 보툴리늄 A-F(Cl. botulinum A -F), 클로스트리디움 노비 A, B, C, D(Cl. novyy A , B, C, D), 클로스트리디움 셉티쿰 (Cl. septicum ), 클로스트리디움 초베이 (Cl. chauvoei ), 클로스트리디움 히스토리티쿰 (Cl. hystoliticum ), 클로스트리디움 스포로제네스 (Cl. sporogenes ), 클로스트리디움 테타니 (Cl. tetani ), 브라키스피라 하이오디센테리애 ( Brachyspira hyodysenteriae), 브라키스피라 필로시콜리 ( Brachyspira pilosicoli ), 아카노박테리움 파이오제네스 ( Arcanobacterium pyogenes ), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ), 스트렙토코쿠스 아갈락티애 (Streptococcus agalactiae), 로소니아 인트라셀룰라리스 ( Lawsonia intracellularis )로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 가금류의 장질환, 돼지의 장질환, 소의 장질환 뿐만 아니라 표재성 질환 치료(superficial treatments), 예컨데, 가금류의 괴사성 피부염(necrotic dermatitis)을 동반한 궤양성 족피부염(ulcerative pododermatitis), 젖소의 유선염(mastitis), 젖소의 자궁염(metritis), 유제류(ungulate, 발굽이 있는 포유동물)의 발굽 병변, 다른 동물의 장 질환 및 표재성 질환(superficial diseases)으로 이루어진 군에서 선택된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 화합물에 관련된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 아연 테트라암모늄 비스-글리시네이트 킬레이트, 아연 말레이네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 말레이네이트 킬레이트, 아연 테트라암모늄 말레이네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 메티오네이트 킬레이트, 구리 디암모늄 리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 아미네이트 킬레이트, 바람직하게는 아연 모노-글리시네이트 킬레이트, 아연 디글리시네이트 킬레이트, 아연 비스-글리시네이트 킬레이트, 구리 모노-글리시네이트 킬레이트, 구리 디-글리시네이트 킬레이트, 구리 비스-글리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 비스-말레이네이트 킬레이트, 아연 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 디암모늄(말레이네이트)2 킬레이트, 더욱 바람직하게는 아연 모노-글리시네이트 킬레이트, 구리 모노-글리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 디암모늄(말레이네이트)2 킬레이트, 아연 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 구리 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 가장 바람직하게는 구리 디암모늄 비스-말레이네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 구리 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트로 이루어진 그룹에서 선택된 화합물과 관련된다. 상기 화합물들의 경우 킬레이트 명명(chelate denomination)은 염의 추가에서 소위 O-킬레이트(예컨데 물), 또는 소위 N-킬레이트(예컨데 암모늄)을 포함한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 소화관의 소장 부분에서 증식하여 질병을 일으키는 박테리아를 억제 및/또는 상기 박테리아에 의해 발생하는 질병의 치료나 예방을 위한 화합물과 관련된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물에는 선택적으로 다른 표준 첨가제가 추가될 수 있다.
더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 공동작용하는(synergically) 최소한 2가지 이상의 화합물을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물에는 선택적으로 다른 표준 첨가제가 추가될 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 서로 공동작용하는 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 화합물을 포함하고, 선택적으로 표준 첨가제가 추가될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 방출형(바람직하게는 과립)으로 적합한 부형제에 존재하는 사료첨가제를 제공한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물, 조성물 또는 사료첨가제를 포함하는 사료와 관련된다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 사료첨가제 제조 방법에 관련되고, 상기 방법은 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 혼합하는 것을 포함하고, 선택적으로는 표준 사료첨가제 성분을 더 포함하여 혼합한다.
추가적인 구현예에서, 본 발명은 사료 제조 방법에 관련되고, 상기 방법은 본 발명에 따른 화합물, 조성물 또는 사료첨가제를 표준 사료와 혼합하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물, 조성물, 사료첨가제 또는 사료를 체중량 증가 및/또는 사료 효율 및/또는 달걀 수율 증가, 및/또는 가금류, 돼지 및/또는 젖소의 폐사율 감소를 위하여 축산업에서 이용하는 방법에 관련된다.
유기물 금속 킬레이트의 이용 장점은 우수한 리간드를 선택함으로서 첨가제가 좀더 저렴해진다는 사실에 의해 더욱 지지될 수 있다. 이러한 조성물 생산은 매우 저렴해서, 확고한 가격 이점을 제공한다. 이들은 세균발육억제/살균 특성을 가지는 예방제로서 경제적인 생산에서 중요한 역할을 한다. 이들은 장내세균총(intestnal flora)의 균형 회복에 효과적이고, 이들의 증식에 효과적이며, 동물건강에 위협이 되는 통성 병원성 미생물과의 싸움에 효과적일 것이다. 나쁜 사료 효율과 동물폐사에 따른 이익감소와 더불어, 감염 개체수를 가진 축산농가의 연간 항생제 사용 비용 또한 매우 높다. 일부 사례에서는 양돈농가에서 돼지 설사병을 퇴치하는 비용이 사용되는 전체 약 비용의 70%를 초과하는 경우도 있다. 치료 비용은 동물 평균 당 약 2-7.5 달러이다. 이러한 치료는 미량원소 유기물 금속 킬레이트 예비배합물(premix)로 대체될 수 있다.
동시에, 유기물 형태로 제공되는 구리 글리시네이트 및 아연 글리시네이트는 더 유용할 뿐 아니라, 놀랍게도 미생물에서 억제효과를 가진다. 상호 조합된 유기물 결합 미량원소 킬레이트 조성물들은 장내세균총의 균형 회복, 증식과 동물건강에 위협이 되는 통성 병원성 미생물과의 싸움에 효과적이다. 유기물 킬레이트 착물은 몇몇 통성 병원성 세균에 의한 돼지 대장염(swine colitis)과 같이 복잡한 병인을 가진 질병에 효과적일 수 있다.
양돈농가에서 병원미생물의 발생
병원균 단독 발생
(사건 수) 		복합 발생
(사건 수) 		전체 발생
(사건 수) 		발생빈도
(%)
브라키스피라 필로시콜리
(B. pilosicoli ) 		21 23 44 39
아티픽 브라키스피라
( Atypic Brachyspira ) 		7 2 9 8
브라키스피라 하이오디센테리
( Brachyspira hyodysenteriae ) 		6 3 9 8
로소니아 인트라셀룰라리스
(L. intracellularis ) 		3 10 13 12
살로넬라 종(Salmonella spp ). 4 8 12 11
예시니아 슈도튜버큘로시스
(Y. pseudotuberculosis) 		4 13 17 15
대장균(E. coli ) 1 5 6 5
클로스트리듐 페르프린젠스
(Clostridium perfringens ) 		0 2 2 2
유기물 킬레이트의 작용 기전에서 중요한 요소는 이들이 장관(intestinal tract) 속에 있는 병원성 박테리아의 증식을 억제하여, 유용한 수의 정상 장내세균총이 우위를 점하도록 하는 데 있다. 본 발명자들은 몇몇 타입의 모노-, 디-, 비스-의 글리시네이트, 메티오네이트, 리시네이트, 말레이네이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 발레리아네이트, 부틸레이트의 O-킬레이트 및/또는 N-킬레이트 화합물을 연구하였고, 이들의 박테리아/곰팡이균 증식에 대한 효과를 조사하였다. 개별 미량원소 킬레이트에 대한 MIC 값을 결정하는 과정에서, 우리는 경제적 이익을 고려한 가장 최적의 조합을 선택하였고, 연구는 킬레이트의 상호작용이 생물학적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 초점을 맞추어 진행되었다. 나아가, 미량원소 투여의 기본 질문은 금속 이온이 흡수 전에 장내세균총의 다른 성분과 상호작용하는 것을 어떻게 예방하는 지이고, 이러함 점은 현 특허 보호에 있는 제형을 제공하여 달성될 수 있다.철, 구리, 아연과 같은 미량원소는 절대(obligate) 호기성 미생물과 통성(facultative) 호기성 미생물의 대사과정에서 중심 역할을 하지만, 이들은 주변환경에서 소량 존재한다. 식물에서 철 이용도가 낮은 것은 주로 옥시수산화철 고분자(ferric oxyhydroxide polymers)의 낮은 용해도에 기인한다. 잘 산화된 식물 부분 내에서 예컨데 철의 용해도는 주로 수산화철(III)[Fe(OH)3]에 의존한다. 이들 화합물의 용해도 상수는 매우 낮아(Ksol = 10-38), pH 7에서 Fe3 + 농도가 10-17인 반면에, 정상적인 식물성장을 가능하게는 최소 농도는 10-6 M이다[Neilands et al. (1987)]. 상기 모순을 해결하는 것은 해당 미세환경의 미생물총의 미량원소 획득 전략이다. 이와 같은 환경에서 대부분의 이들 종(species)은 생존하거나 우위를 차지하고 있어서, 튼튼하고 매우 효과적인 철 획득 및/또는 미량원소 획득 기전을 가진다. 식물들은 이러한 목적을 위해 미생물의 도움을 받는다.
미생물은 불용성 미량원소[예컨데 산화철(III)]의 용해도를 높이기 위해 다음 3가지 주요 기전을 이용한다: 양자화(protonation), 환원 및 킬레이트 형성.
양자화는 평형상수를 변화시켜 예컨데 Fe(OH)3 착물의 해리(dissociation)가 증가하는 결과를 가져온다[pH의 1단위 감소는 철(III) 이온의 용해도 면에서 1천배 증가를 가져온다]. 이것은 단지 어떤 제한을 가지고 자연에서 이용될 수 있음은 명확하다. 어떤 pH에서 Fe(III)의 Fe(II) 전환은 용해도가 상당히 증가되는 결과를 가져온다. 하지만 이런 과정은 높은 에너지를 요구하는 단계를 가진다.
실제 세계에서 일반화된 킬레이트 형성은 주로 미생물에 의해 생산되는 소위 사이드로포어(siderophores)의 도움으로 발생된다. 미량원소가 미생물 환경에서 덜 가용적(available)일 때에는, 많은 유기체는 저분자량 대사물, 사이드로포어와, 미생물 종에 특성을 가지고 Fe3 +에 높은 친화력을 가지는 일부 세포외막 단백질을 생산하기 시작하고(세포외막단배질은 철-사이드로포어 착물의 인지 및 철 흡수에 역할을 한다[Weger et al. (1986)]), 이들 성분들은 미네랄과 (트랜스페린, 락토페린과 같은) 유기화화물로부터 미량원소를 용해한다. 사이드로포어는 저분자량이고, 미생물 종에 특이적이며, 주로 산소원자를 통해 철(III) 이온과 팔면체 방향으로 6쪽 결합하고 있는 2가 리간드 분자(divalent ligand molecules)이고, 킬레이트 형성 환경에서 Fe3 +를 차지하고, 이들을 미생물 세포로 수송한다[Neilands, J. B. (1981), Leong, J. (1986)]. 세포의 시토졸(cytosol)로의 미량원소 수송은 철-사이드로포어 착물을 인식하는 수송계(transport system) 뿐 아니라 특이적 막 수용체(specific membrane receptor)에 의해 매개된다. 그러므로 약산성, 중성, 알칼리 환경을 가지는 소장(small intestine)에서 미생물의 사이드로포어 생산은 이들의 증식 능력을 위해 필요한, 중요하고도 일반적인 현상이다.
사료 급식 전문가는 경험을 통해 미량원소(Zn, Cu, Fe, Mn 등)가 부족한 사료를 먹인 동물들이 위장 질환에 보다 쉽게 걸린다는 것을 알고 있다. 이러한 질환은 미량원소 투입으로 없어지는 것이 아니라 소화적 질환의 발병은 균형잡힌 미량원소 공급으로 감소된다.
정상 장내세균총(normal intestinal flora) 성분은 소장에서 약 109-1010 CFU/ml의 상당한 양으로 존재한다. 대부분 케이스에서 유익한 락토바실러스(Lactobacillus), 비피더스(Bifidobacterium) 종이 주로 락트산(젖산)을 생산하며, 약산성 pH를 제공하고, 따라서 이들은 사이드로포어 생산 부족에 있지는 않다. 예컨데 대장균, 살모넬라(Salmonella), 클로스트리디움 (Clostridium), 브라키스피라(Brachyspira)와 같은 소위 병원성 미생물은 최대 105 CFU/ml 이하에서 몸에 이로운 장내세균총에서 존재한다.
최근 문헌에 다르면, 위장관 계(gastrointestinal system)에서 병원성 미생물과 비-병원성 미생물간의 평형은 pH에 따른 결과인 것으로 알려졌다. 락토바실러스는 산성 pH에서 증식하고 락트산과 같은 산을 생산하기 때문에 이러한 가설에 실질적인 근거가 된다. 병원성 미생물은 많은 종의 정상 장내세균총(normal intestinal flora)이 번식할 수 없는 중성 또는 약알칼리에서 증식한다. pH와 관련한 이러한 발견은 수십년 동안 축산농가에서 프로바이오틱스(probiotics), 락토바실러스를 포함하는 조성물의 오랜 사용 결과에 바탕을 두고 있다. 이러한 처리 결과는 다양하고, 어떤 경우에는 놀랍도록 효과적이며, 또 다른 경우에는 전혀 효과적이지 않음이 알려졌다.
본 발명자들은 소화관(digestive tract) 문제 치료에 관한 최근 종래 기술에 비해 완전히 새롭고 놀라운 가능성을 제공하고자 한다. 미량원소 킬레이트는 이들의 특이적 구조에 기인하여, 좋은 흡수력과 이용 특성을 가지며, 놀라게도 통성 병원성 미생물의 증식을 억제할 수 있다. 치료에 유용한 화합물의 범주는 넓다. 프로바이오틱스의 경우에 몇몇 다른 미생물들이 이용되고, 기대되는 효과에 따라 이용 미생물의 조성은 달라진다. 어떤 미생물들은 조류(birds)에 이용되고, 어떤 미생물들은 돼지에 이용된다. 조류에서 문제를 발생시키는 병원성 미생물들은 돼지의 것과는 다르므로 본 발명에 따른 우리의 발견에 기초하여 이것들은 완전히 보증된다.
본 발명자들은 소위 사이드로포어 킬레이트를 형성하는 리간드가 정상 미생물총(normal microflora)과 병원성 미생물의 비율 형성에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 이론화하는 데, 병원성 미생물은 금속 이온을 "갈망하는(hungry)" 사이드로포어 생산 병원성 세균에 대해 소장의 약알칼리 또는 중성 환경 내에서 이점(advantage)을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 미량원소 킬레이트가 놀랍게도 박테리아 사이드로포어 결합 막 수용체에 달라붙을 때, 병원성 박테리아는 미량원소 흡수(uptake)와 이에 따른 증식(propagation)에 대한 이점을 가지지 못할 것이다.
대장에서 장내세균총의 조성은 소장과는 전혀 다르다. 대장은 예를들어 락토바실러스에 의해 지배되는 장내세균총 대신, 예를들어 클로스트리디움(Clostridium)에 의해 지배되는 장내세균총, 즉 병원성 세균이 지배하는 장내세균총을 가진다. 하지만 미량원소의 흡수는 소장의 후구역(posterior segment)에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 이것에 근거하여, 우리는 또한 미량원소(들)을 함유하는 착화합물인 사이드로포어 킬레이트 형성 인자들이, 만성 염증을 가진 대장 내에서 사이드로포어 리간드를 생산하는 박테리아에 대하여 배타적 이점을 제공한다는 것을 이론화한다.-이건은 조류에서 빈번하는 임상 상태이다. 상기 발견으로부터, 미량원소 화합물이, 미량원소와 유기 화합물의 조합으로 구성되어, 위장관에 존재하는 병원성, 사이드로포어 생산 미생물을 억제하는 것이 알려진다. 나아가, 만약 미량원소 함유 사이드로포어 수용체를 포화시키는 효과가 실제한다면, 소장은 저농도에서 병원성 미생물의 증식을 억제하는 반면, 단지 고농도에서 정상 장내세균총을 형성하면서 비-병원성이지만 사이드로포어를 생산하는 엔테로코쿠스(Enterococcus)에 영향을 미치는 화합물에 대해 연구될 필요가 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
<사이드로포어의 구조: A, B, C 타입의 철-사이드로포어 D, E , I 타입의 구리-사이드로포어>
추가적인 효과는 유기 미량원소 킬레이트 사이드로포어 타입 리간드는 증식 또는 세포 합성을 억제하는 항생물질 분자와 결합되며, 병원성 박테리아는 사이드로포어 수용체를 통해 이를 흡수한다. 그러므로 항생 화합물 단독보다는 유기물 킬레이트와 결합된 항생물질을 통하여 더 효과적인 억제 및/또는 살균 효과가 달성될 수 있다.
추가적인 효과는 박테리아 세포(bacterial cells) 간의 신호전달 즉, 퀘럼센싱(quorum sensing, QS)을 통해 박테리아는 그들의 유전 기능을 동시에 발생시키고, 많은 수로 증식될때 특정 화합물을 생산할 수 있다. 이것은 박테리아가 예컨데 내장 표면 또는 상처 표면에서 소위 콜로니를 형성하고 "바이오필름" 층을 형성하는 수에 도달하였을 때 발생한다. 이는 또한 박테리아가 혈액에서 충분한 수로 존재하고, 유기체내에서 공격을 받아 극대점에 도달할 때 발생할 수도 있다. 분비된 QS 신호 분자의 농도 증가는 박테리아가 집중적으로 증식을 시작하였다는 신호이다. QS 분자는 주로 긴사슬의 지방산, 퀴놀, 메틸 지방산 에스테르, N-아실 호모세린 화합물(N-acyl homoserine compounds)이고, 사이드로포어와 유사하며, 박테리아의 특정 수용체에 달라붙는다. 우리의 가설에 따라, 사이드로포어와 유사한 이러한 수용체는 미량원소 유기 킬레이트 화합물에 의해 특별히 포화될지도 모른다. 따라서 QS 신호 분자는 그들의 효과를 발휘할 수 없다. 이는 박테리아 간 신호전달을 막고, 따라서 이들의 증식, 콜로니형성 및 바이오필름 형성을 막는다.
우리의 실험에서, 본 발명자들은 주로 유기 결합하는 미량원소로서 주로 아연, 구리, 망간 및 철 화합물을 연구하였다. 본 발명자들은 이미 사료 산업에서 효과적인 미량원소 원천으로 이용되는 것으로 알려진 미량원소 글리시네이트, 미량원소 메티오네이트, 미량원소 말로네이트 등이 특정 병원 미생물에 선택적 억제 효과를 가진다는 것을 확인하였다. 이러한 선택성과 생물학적 활성은 미량원소 킬레이트 O- and N-킬레이트의 조합(combination)으로 향상될 수 있다. 선택적 생물학적 활성은 메티오닌, 리신, 글리신 등과 같은 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 부틸산, 이소부틸산과 같은 1가의 산(monovalent acids), 락트산과 같은 하이드록시산, 말레산, 폴리카르복실산의 아연염, 구리염, 망간염, 철염으로 달성될 수 있다. 놀랍게도 미생물학적 활성은 O-킬레이트(바람직하게는 물분자를 가진), N-킬레이트(바람직하게는 암모늄를 가진) 형성의 경우에 상당히 증가한다.
언급된 미량원소는 소위 킬레이트 형성 화합물이고, 따라서 우리는 연구를 생물학적 효과를 지니는 상기 미량원소의 N-킬레이트 및 O-킬레이트 화합물로 확대하였다.
나아가, 우리는 상기 기술된 N-킬레이트 및 O-킬레이트 형성에 더하여, 중심 금속 이온과 킬레이트 결합으로 0-6개 암모니아 또는 0-6개 물분자를 포함하는 킬레이트 화합물을 제조하였다.
미량원소 글리시네이트 킬레이트는 특히 사이드로포어 구조와 유사할 수 있고, 따라서 세포의 사이드로포어 수용체에 달라붙어 미생물의 철 이용처럼 미량원소를 방해하여 세포를 죽이는 것이 가능하다. 따라서 철, 아연, 구리, 망간의 글리세네이트 킬레이트 착물은 그 구조에 기인하여, 바람직하게는 해당 박테리아 세포의 종-특이적 막 수용체에 특이적 친화성을 가져, 세균 세포의 막 수용체를 덮을 수 있고, 미량원소 공급에 직접적으로 영향을 주고, 그 결과 생존, 증식에 영향을 주고, 결과적으로 바람직하게는 세포의 죽음에 이르게 할 수 있다. 이러한 효과는 해당 박테리아 종, 균주의 수용체 민감성에 의존하는 데, 어떤 종 또는 균주는 민감하지 않을 수 있다. 따라서 미량원소 킬레이트의 효과는 종-특이적이라 할 수 있으며, 효과적인 MIC 및/또는 CID 효과를 달성하기 위하여 모든 박테리아 그룹에 대하여 독립적으로 미생물학적 평가가 요구된다.
어떤 연구에 따르면, 예컨데 글리시네이트와 같은 향상된 미량원소 킬레이트는 혈중이라도 그람양성 미생물의 증식을 완전히 억제하였다. 슈도모나스 균주(Pseudomonas strain)의 증식에 대한 이의 억제효과는 보다 약했으나, 다른 그램양성 미생물뿐 아니라 곰팡이균에 대한 효과는 강했다. 지금까지 서로 다른 여러 미량원소 킬레이트 추출물에 대한 연구는 다양한 병원성, 식품부패 미생물에 대한 효과를 명확히 설명했다. 이러한 연구에 따라, 그람음성균보다는 그람양성균에 대한 활성이 더 높은데, 우리는 또한 다른 조성에서도 생체외 조건에서 그람음성에 대해서도 확고한 효과를 발견하였다.
조류(육계, 산란계, 칠면조)의 괴사성 피부염(necrotic dermatitis), 급성 돼지설사병의 경우, 장구균(enterococci)과 락토바실러스(lactobacilli) 수는 장내세균총에서 유의적으로 감소함과 동시에, 푸조박테리아(fusobacteria), 박테로이데스(Bacteroides) 속, 대장균과 특정 대장균군(coliform bacteria) 뿐만 아니라 클로스트리디움(Clostridiums)의 수는 증가한다. 오랫동안 지속된 사례에서, 클로스트리듐속 세균(clostridia)의 증가는 뚜렸하다. 이런 모든 것에 기인하여, 우리 연구는 다음과 같은 방향으로 진행되었다: 우리의 액체 배양 및 한천 확산 실험에 따라서, 미량원소 글리시네이트 킬레이트는 마이크로코쿠스 루테우스, 대장균, 살모넬라 엔테리티디스 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 균주 성장을 부분적으로 또는 완전히 억제한다. 최소생육저지농도(MIC) 또는 최소살균농도(CID)는 균주 각각에 대하여 생물학적 분석법에 따라 측정되고, 결정된다.
우리는 균주를 구리 및 아연 아미네이트 킬레이트 화합물과의 결합하는 것으로 세균 억제 능력을 향상시킬 수 있다. 미량원소 킬레이트 혼합물의 최적 비는 한천 확산 및 액체 배양 분석에서 결정된다. 생물학적 관점에서 금속 킬레이트 착물의 효과를 연구할 때, 우리는 특정 농도에서 투여될 때 병원성 미생물의 성장에 효과적인 것을 보았다. 반면 동일 농도에서 정상 장내세균총을 형성하는 미생물군의 증식은 영향을 받지 않는다. 서로 다른 금속 킬레이트 화합물 제조에 서로 다른 금속을 이용할 때 서로 다른 항균 효과가 관측될 수 있다. 착물 제조에 이용되는 아연, 구리, 철, 망간 이온은 심지어 우리가 착물 형성에 동일 리간드를 사용할 때에도 서로 다른 농도에서 미생물에 효과를 발휘한다. 실험동안, 우리는 미량원소 킬레이트 아연 및 구리 글리시네이트 조합이 생체외 실험에서 2성분의 공동작용 조합일 때 살모넬라 엔테리카(S. enterica)로 발병된 장질환(enteral diseases) 예방에서 유용하고, 3성분의 공동작용 조합에서 클로스트리디움 퍼프린젠스(C. perfringens)에 유용하는 반면, 정상 장내세균총(예컨데, 락토바실러스, 사카로미세스(Saccharomyces)에는 선택적으로 작용하여, 통성 병원성 미생물의 증식을 막는 반면, 정상 장내세균총을 형성하는 락트산 박테리아 및 효모를 억제하지는 않는다는 것을 발견하였다. 주로 표재성 질병을 일으키는 병원균인 클로스트리디움 바라티 (Cl. barati ), 클로스트리디움 소르델리 (Cl. sordellii ). 클로스트리디움 보툴리늄 A-F(Cl. botulinum A -F), 클로스트리디움 노비 A, B, C, D(Cl. novyy A , B, C, D), 클로스트리디움 셉티쿰 (Cl. septicum ), 클로스트리디움 초베이 (Cl. chauvoei ), 클로스트리디움 히스토리티쿰 (Cl. hystoliticum ), 클로스트리디움 스포로제네스 (Cl. sporogenes ), 클로스트리디움 테타니(Cl. tetani)는 구리 및 아연 유기 킬레이트, 바람직하게는 킬레이트 아미네이트 화합물에 민감하다.
물론, 본 발명에 따른 화합물은 인간 분야에서 각 통성 병원성 박테리아의 성장 억제, 장내 세균총의 유익한 성분 유지뿐 아니라 그와 같은 병원성 박테리아에 의해 발생되는 질병의 치료 및 예방에 동등하게 적합할 수 있다.
실시예 1: 아연 비스 - 글리시네이트 킬레이트의 제조
1몰 산화아연(ZnO)(79.5 g)에 200 ml 증류수, 2.1 mol 암모니아수(NH4OH) 및 48.5 g 이산화탄소(CO2)를 첨가한다. 120℃, 10-12 바(bar) 압력에서 4시간 동안 반응시켜 Zn(NH4)2CO3 를 생성한다. 수득된 킬레이트 화합물의 pH가 8.0이 되도록 CO2 로 조정한다. 이때, ZnCO3 침전물이 생성된다. 수득된 침전물을 여과한 다음, 2몰 글리신과 반응시킨다. 이러한 방법으로 하기 화학식 I의 화합물이 생성된다:
[화학식 I]
Figure pat00004
(M)(글리신)2, 상기 식에서 M은 아연(Zn) 또는 구리(Cu)이다. 상기 식에서 바람직한 예는 아연(글리신)2이다.
상기 화합물의 제조를 위한 건조공정은 바람직하게는 미량원소 화합물의 수분 함량이 적당한 수분 함량으로 유지되도록 하기 위하여 실시된다. 생성물이 12-14% 수분 함량을 가지도록 건조될 때, 화학식 I의 분말 제형이 얻어진다. 만약 수분량이 0에 가깝거나 약 3%까지 건조될 때에는 중심 금속 원자에 배위 결합된 수분 함량은 손실된다. 이러한 후자 생성물의 생물학적 활성은 다르고 화학식 I의 화합물에 비해 상당히 낮을 것이다. 생성물은 탁하고, 흡습성과 점성이 있고, 물 용해도가 높은 화합물이다.
실시예 2: 아연 디암모늄 비스-글리시네이트 킬레이트의 제조
1몰 산화아연(79.5 g)에 150 ml 증류수, 2.2 몰 암모니아수 및 48.5 g 이산화탄소를 첨가한다. 120℃, 10-12바 압력에서 4시간 동안 반응시켜 Zn(NH4)4CO3 를 생성한다. 수득된 킬레이트 화합물을 직접 2몰 글리신과 반응시킨다. 하기 화학식 II의 화합물이 수득된다:
[화학식 II]
Figure pat00005
(M)(NH4)2(글리신)2, 상기 화학식에서 M은 아연(Zn) 또는 구리(Cu)이다. 글리신은 다른 아미노산, 예컨데 메티오닌, 리신, 아스파트산 등으로 대체될 수 있다. 상기 화학식 II에 따른 바람직한 화합물은 Zn(NH4)2(글리신)2이다.
실시예 3: 아연 테트라암모늄 비스-글리시네이트 킬레이트의 제조
1몰 산화아연(79.5 g)에 100 ml 증류수, 4.2 몰 암모니아수 및 48.5 g 이산화탄소를 첨가한다. 120℃, 10-12 바 압력에서 4시간 동안 반응시켜 Zn(NH4)4CO3를 제조한다. 수득된 킬레이트 화합물을 직접2몰 글리신과 반응시킨다. 하기 화학식 III의 화합물이 수득된다:
[화학식 III]
Figure pat00006
(M)(NH4)4(글리신)2, 상기 화학식에서 M은 아연 또는 구리이다. 상기 글리신은 다른 아미노산, 예컨데 메티오닌, 리신, 아스파트산 등으로 대체될 수 있다. 상기 화학식 III에 따른 바람직한 화합물은 Zn(NH4)2(글리신)4이다.
실시예 4: 아연 말레이네이트 킬레이트의 제조
실시예 1에 기술된 방법으로 제조된 ZnCO3 화합물에 2.0 mol 말레산 수용액이 첨가된다. 하기 화학식 IV의 화합물이 수득된다:
[화학식 IV]
Figure pat00007
아연 말레이네이트. 말레산은 다른 하이드록시산, 예컨데 글리콜산, 락트산, 하이드록시-부틸산, 시트르산 등으로 대체될 수 있다. 아연은 다른 미량원소, 예컨데 구리 등으로 대체될 수 있다.
상기 화합물의 제조를 위한 건조공정은 바람직하게는 미량원소 화합물의 수분 함량이 적당한 수분 함량으로 유지되도록 하기 위하여 실시된다. 생성물이 12-14% 수분 함량을 가지도록 건조될 때, 화학식 IV의 분말 제형이 얻어진다. 만약 수분량이 0에 가깝거나 약 3%까지 건조될 때에는 중심 금속 원자에 배위 결합된 수분 함량은 손실된다. 이러한 후자 생성물의 생물학적 활성은 다르고 화학식 IV의 화합물에 비해 상당히 낮을 것이다.
실시예 5: 아연 디암모늄 말레이네이트 킬레이트의 제조
실시예 2에 기술된 방법으로 제조된 Zn(NH4)2CO3 화합물에 2.0 mol 말레산 수용액이 첨가된다. 하기 화학식 V의 화합물이 수득된다:
[화학식 V]
Figure pat00008
아연 디암모늄 말레이네이트. 말레산은 다른 하이드록시산, 예컨데 글리콜산, 락트산, 하이드록시-부틸산, 시트르산 등으로 대체될 수 있다. 아연은 다른 미량원소, 예컨데 구리 등으로 대체될 수 있다.
실시예 6: 아연 테트라암모늄 말레이네이트 킬레이트의 제조
실시예 3에 기술된 방법으로 제조된 Zn(NH4)4CO3 화합물에 2.0 mol 말레산 수용액이 첨가된다. 하기 화학식 VI의 화합물이 수득된다:
[화학식 VI]
Figure pat00009
아연 테트라암모늄 말레이네이트. 말레산은 다른 하이드록시산, 예컨데 글리콜산, 락트산, 하이드록시-부틸산, 시트르산 등으로 대체될 수 있다. 아연은 다른 미량원소, 예컨데 구리 등으로 대체될 수 있다.
실시예 7: 아연 디암노늄 메티오네이트 킬레이트의 제조
실시예 2에 기술된 방법으로 제조된 Zn(NH4)2CO3 화합물에 2.0 mol 메티오닌 수용액이 첨가된다.
[화학식 VII]
Figure pat00010
아연 디암노늄 메티오네이트.
실시예 8: 아연 디암모늄 리시네이트 킬레이트의 제조
실시예 2에 기술된 방법으로 제조된 1몰 Zn(NH4)2CO3 화합물에 2.0 몰 리신이 첨가된다.
[화학식 VIII]
Figure pat00011
아연 디암모늄 리시네이트.
실시예 9: 미량원소 아미네이트 킬레이트의 제조
실시예 1에 기술된 방법으로 제조된 1몰 ZnCO3 또는 CuCO3 화합물에 선택된 2몰 아미노산이 첨가된다. 수득된 화합물은 아연(아미네이트)2 킬레이트이다.
생성물이 12-14% 수분 함량을 가지도록 건조될 때, Zn(H2O)(아미네이트)2가 생성된다. 만약 수분량이 0에 가깝거나 약 3%까지 건조될 때에는 중심 금속 원자에 배위 결합된 수분 함량은 손실된다. 이러한 후자 생성물의 생물학적 활성은 다르고 Zn(H2O)(아미네이트)2 화합물에 비해 상당히 낮을 것이다.
실시예 10: 미량원소 디암모늄 킬레이트의 제조
실시예 2에 기술된 방법으로 제조된 1몰 Zn(NH4)2CO3 화합물에 선택된 2몰 아미노산이 첨가된다. 수득된 화합물은 아연 디암모늄 아미네이트 킬레이트이다.
실시예 11: 미량원소 EDTA 킬레이트의 제조
실시예 1에 기술된 방법으로 제조된 1몰 Zn(CO3) 화합물에 1 몰 EDTA 수용액이 첨가된다. 반응완결 후, 부형제에 적용되는 최종 생성물을 10% 수분량까지 건조하여 하기 O-킬레이트 화합물을 수득한다.
Figure pat00012
실시예 12: 미량원소 디암모늄 EDTA 킬레이트의 제조
실시예 2에 기술된 방법으로 제조된 1 몰 Zn(NH4)2CO3 화합물을 1몰 EDTA와 반응시켜 하기 화합물을 수득한다. 아연은 킬레이트 형성 미량원소로서 구리, 철 또는 망간으로 대체될 수 있다.
Figure pat00013
실시예 13: 공장 규모에서 아연 모노-글리시네이트 킬레이트의 제조
본 발명자들은 8,000 리터 반응기에서 킬레이트 제조를 실시하여 미량원소 킬레이트를 생산하였다. 4,000 리터 물에 2,875 kg 황산아연·7수화물과 750 kg 글리신을 첨가하였다. 90℃에서 4시간 반응시켜 아연 모노-글리시네이트를 생성하고, 유동상 건조기(fluid bed dryer)에서 마이크로-과립 형태로 전환하여 최종 생성물을 수득하였다.
수득된 생성물에서 킬레이트 결합의 형성은 구조 확인 기술(착화법 금속 이온 분석, 가열실험, 산-염기 적정법, 중심 IR 스펙트럼 기록)과 생성물의 원적외선(far IR) 스페트럼 기록을 통하여 확인되었다. 도 1은 아연 모노-글리시네이트 킬레이트의 IR 스펙트럼을 보여준다.
IR 스펙트럼의 평가:
2000-4000 cm-1:
두개의 뚜렷한 대역이 각각 3160-3211 cm-1 와 3456-3390 cm-1의 최대 대역에서 나타난다. 후반 대역의 경우 더 높은 파수(wave number) 범위에서 어깨선(shoulder)이 있다. 전반 대역은 암모늄기(NH3 +) 의 NH 원자가 진동(valence vibrations)에 할당될 수 있다(글리신, 글리신 염산염의 스펙트럼에 근거한). 후반 대역은 배위결합된 물 분자에 할당될 수 있다. "어깨선(shouler)"의 존재는 여러가지 다양한 힘(예컨데, 배위결합, 배위결합되지 않은, 단지 수소 브릿지로 결합된)을 가지는 물분자가 존재하다는 것을 가리킨다.
1600, 1400 cm-1 대역과 이의 주변:
양쪽 케이스에서, 각각 1개의 뽀족하고 강한 대역 최대가 관찰된다.[(1643, 1643, 1649, 1652, 1651 cm-1) 및 (1412, 1411, 1410, 1409, 1410 cm-1)]. 이는 각 케이스에서 글리신의 카르복시기가 배위되었다는 것을 가리킨다. 각기 대역 최대의 차이(231, 222, 239, 243, 241 cm- 1)는 두자리 배위(bidentate coordination), 즉 양쪽 산소가 배위되었다는 것을 가리킨다. X레이 회절 분석에 근거하여, Cu(글리신)SO4×2H2O, Zn(글리신)SO4×2H2O 착물의 경우에 제안되는 것과 같이 브릿지(bridge) 타입의 결합이 추정된다[3].
1500 cm-1 대역과 이의 주변:
각 시료에서, 중간세기 대역은 1500 cm-1 주변(1492, 1480, 1478, 1478, 1476 cm-1)에서 최대로 관찰되는 데, 이는 정확히 양자화된 글리신(NH3 +)의 존재를 가리키고, 2000-4000 cm-1 범위에서 관찰되는 것과 부합된다.
1100, 600 cm-1 대역과 이의 주변:
각 시료에서, 강한 대역이 1100 및 600 cm-1 가까이에서 관찰된다(1100, 1081, 1108, 1113, 1113, 1114 및 631, 617, 618, 618, 617 cm-1에서 각각). 이와 동시에, 더 높은 파수(wave number) 범위에서 어깨선(shoulder)이 관찰되는 데, 이는 황산이온 이온이 이온 또는/및 (단일 산소와) 한자리 배위 방식(monodentate manner)으로 금속 이온과 배위결합하고 있다는 것을 가리킨다.
글리신을 대신하여, 메티오닌, 리신, 아스파트산과 같은 다른 아미노산이 존재할 수 있다. 아연은 다른 미량원소, 예컨데 구리, 망간 등으로 대체될 수 있다.
실시예 14: 공정 규모에서 구리 모노-글리시네이트 킬레이트의 제조
1.8 입방미터 물에 375 kg 글리신이 60-70℃에서 첨가되었다. 상기 용액에 1,250 kg CuSO4 결정을 첨가하면서 80℃까지 가열한 다음, 30분간 냉각시켰다. 반응 생성물을 유동상 건조기에서 마이크로-과립 형태로 건조시켰다.
공장단위 생성물의 구리-킬레이트-글리신 배위는 IR 스펙트럼에서 명확히 알아볼 수 있다. 글리신 분자는 카르복시기를 통하여 배위되고, 아미노산기는 양자 상태로 존재한다. 카르복시기는 두자리 가교형태로 배위된다. 두가지 형태의 글리신 분자는 서로 다른 환경에서 배위되는 것이 관찰된다. 글리신은 두자리 가교 리간드로서 카르복시기를 통해 배위된다. 글리신의 아미노기는 양자 상태로 존재한다. 황산이온은 한자리 및/또는 두자리 방식으로 배위된다.
도 2는 구리 모노-글리시네이트 킬레이트의 IR 스펙트럼을 보여준다.
2000-4000 cm-1: 대역 최대는 3138 및 3192 cm-1 에서 각각 관찰된다. 낮은 파수 범위에서 몇몇 작은 피크가 관찰된다.
1600, 1400 cm-1 및 이의 주변: 1647, 1580 (양쪽 케이스에서) 및 1458, 1410 및 1463, 1409 cm-1 파수 값에서 각각 2개의 대역 최대가 관찰된다.
1500 cm-1 및 이의 주변: 1512 및 1502 cm-1에서 각각 중간 세기의 대역이 관찰된다.
1100, 600 cm-1 및 이의 주변: 3개 및 2개의 대역 최대가 어깨선을 가지는 것으로 관찰된다.
결론: 글리신의 카르복시기는 배위되었고, 아미노기는 양자화되었다. 황산이온은 두자리 배위 방식(bidentate manner)으로 구리이온과 결합한다.
실시예 15: 아연 모노- 글리시네이트 킬레이트 및 구리 모노- 글리시네이트 킬레이트의 혼합물 제조
실시예 1에서 제조된 1,000 L의 아연 모노-글리신 킬레이트를 실시예 12에서 제조된 250 L의 구리 모노-글리신 킬레이트를 60℃, 칼날 혼합 반응기(blade mixer reactor)에서 서로 혼합하여 얻어진 혼합물을 유동상 건조기에서 마이크로-과립 형태로 건조하였다.
실시예 16: 통성 병원성 미생물과 정상 장내세균총 성분에 대한 미량원소 킬레이트 화합물의 MIC 및 CID 농도 결정
현실적, 치료적 의약관점, 항균 제제의 저항 스펙트럼 면에서, 전형적인 항균 활성 연구방법은 디스크 확산법(disk diffusion)이나 한천 확산 분석법(agar well diffusion assays), 그리고 액체 배양에서 실시되는 희석 실험이다. 표준화된((NCCLS, DIN 등) 디스크 또는 홀 확산 분석법(hole diffusion assay)에서, 항균 제제의 효과는 한천 배양접시의 표면에서 확산되는 실험 미생물의 성장으로 연구된다. 한천 확산 분석에서 예컨데 박테리아 세포층(bacterial lawn)은 한천배지 접시에 준비된 다음, 실험실에서 정립된 절차에 따라, 접종된 플레이트는 한천 디스크 커팅기로 중간 부분이 펀칭된다. 그런 다음 10-100 ㎕ 분석 시료가 홀에 안치된다. 시험 화합물은 안치된 시험디스크로부터 박테리아 세포층으로 확산되거나 또는 한천 접시에 만들어진 홀로부터 배양 배지로 확산되어 디스크나 홀 주변에 성장-증식 저지대를 형성한다. 한천 확산 시험에 기초하여, 연구되는 균주의 시험 화합물에 대한 민감도(sensitivity)는 분명하게 확인될 수 있다. 항생 제제의 표준 분석법(여기서 저지대 지름은 항생제 농도에 비례한다)과 유사한 임상 실습에 따라, 우리는 민감도에 따라 디스크 홀 주변에 형성된 저지대를 분류한다.
각각의 제제에서, 미생물은 저지대 지름을 기준으로 주어진 제제에 저항적인지 또는 민감한지 자격이 주어진다. 새로운 항균 제제의 사용은 높은 수준의 주의가 요구된다. 다시말해, 배지의 pH, 용해된 산소(O2) 또는 이산화탄소(CO2)의 농도, 배지 성분 간 상호작용과 같이 어떤 점이 (한천 확산 분석법에서) 항균 제제 확산에 영향을 미치는 지는 아직 알려진 바 없다. 따라서 여러 요소에 근거하여, 준어진 제제 및 미생물 양쪽 모두에 적합한 기술 및 배지가 선택되어야 한다. 적절한 농도의 미생물은 배양 희석 실험법에서 액체 배양물로 준비되고, 성장 및 증식의 진행과정은 현미경 및/또는 광학 기술으로 확인된다. 이러한 실험은 주어진 미생물과 관련한 제제의 최소생육저지농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)의 결정을 가능케 한다. 나아가, 제제가 단지 정적(static)(성장 억제제) 효과를 가지는 지 또는 CID(즉, 미생물 살균 활성을 가짐) 효과를 가지는 지를 확인하기 위하여 시험관 안에서 성장을 보이지 않는 미생물의 죽음 또한 체크된다. 그런다음 최소살균농도(Minimal cid concentration, MCC)이 또한 결정된다. MCC/MIC 비(ratio)는 제제의 생체내 효능에 중요한 정보를 준다: 상기 값이 높다면, 제제의 생체내 이용가능성은 아마도 낮을 것이다.
연구에서 조사된 균주들
병원균 균주: 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 세로바 엔테리티디스(SALMO)
통성 병원균 균주: 대장균 ATCC 35218 (COLI)
마이크로코커스 루테우스 ( Micrococcus luteus ) NCAIM B 01072 (MCC)
브라키스피라 하이오디센테리애 (자체 분리, B/06)
스타필로코쿠스 아우레우스 NCAIM B.01065T
스트렙토코쿠스 아갈락티애 NCAIM B.01882T
클로스트리디움 퍼프린젠스 NCAIM B.01417T
정상 장내세균총의 성분, 락트산 생산균: 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 NCAIM B 02070T
락토바실러스 카제인 변종 람노수스 되더라인 (Lactobacillus casei v. rhamnosus Doderlein) LCR 35
류코노스톡 메센테로이데스 ( Leuconostoc mesenteroides ) (락트산 생산균)
곰팡이균: 사카로미세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae)(LSE)
분석에 사용될 때까지, 균주는 25% 살균 글리세롤이 TBS 브로스배지(Scharlau Microbiology)에 현탁액 형태로 -80℃에서 얼리거나 동결건조되어 저장되었다.
브라키스피라 하이오디센테리애 (B/06) 균주의 분리
브라키스피라 하이오디센테리애 균주는 헝가리의 각기 다른 지역에서 발생된 돼지 설사병 증상을 보이는, 성장하고 있는 돼지(store-pig)로부터 분리되었다. 도살장에서 도축한 후, 임상 증상을 보이는 돼지의 결장을 끈으로 묶고, 6시간 내에 실험실로 옮겼다. 결장(colon) 부위를 오픈한 후, 결장 점막을 긁어 시료를 채취하였다. 모든 케이스에서 점막에서 채취한 시료는 스트리커(streaker)를 이용하여 10% 섬유소제거된 소혈청 및 400 ㎕/ml 스펙티노마이신(Sigma-Aldrich 사)이 보충된 신선한 TSA 배지에 전개되었다. 접종 후, 배양물은 엄격한 혐기성 조건 하에서 42℃에서 96시간 동안 배양되었다. 혐기성 조건은 혐기성 가스 발생 주머니(Oxoid, Gas Generating Kit, Anaerobic system BR0038B)와 혐기성 배양 단지(Oxoid, Anaerobic jar)를 사용하여 이루어졌다. 1차 및 2차 생화학적 특성과 분리된 균주의 동정은 표준 기술(Quinn et al., 1994)을 통해 실행되었다.
생체외(in vitro) 억제 실험
저장용액으로부터 주어진 양(ppm, mg/kg, ㎕/ml)의 미량원소가 미생물 배양 배지에 첨가되었다.
다양한 조성으로 된 시료액은 액체 배양 배지에서 24웰 Greiner 조직 배양 플레이트에 2배(2x)로 희석된 다음, 생리식염수로 준비되어 0.5 MacFarland 농도에 있는 5㎕ 박테리아 시료 현탁액은 각기 다른 농도의 액체 배양배지로 측정된다. 활성 성분의 조합 분석의 경우 교차 희석 기술(cross dilution technique)이 이용되는 데, 두개의 서로 다른 용액은 두 방향으로부터 플레이트 표면에 교차하여 희석된다. 플레이트는 박테리아 분석에 요구되는 대기압 조건에서 24시간 배양된다. 그런 다음 결과가 해독되고, 시료 화합물의 최소생육저지농도(MIC)는 결정된다. 최소치사농도(CID)가 분석되는 경우에, 배양기간 후 불투명(opacity)하지 않는 웰로부터 10㎕ 용액이 혈액한천배지 표면에 접종되고 배양기간 후 배양배지 표면에서 어떤 박테리아 성장이 발생했는지 여부를 체크한다.
한천 젤 확산
생리식염수로 준비되어 0.5 MacFarland 농도에 있는
클로스트리디움 퍼프린젠스: 호기성 또는 혐기성 용기에서 성장한 균주는 생리식염수로 준비되어 0.5 MacFarland 농도에 있는 무균 한천 배지에서 증식된 다음, 면봉으로 배양 배지 표면에 접종된다. 특수제작된 펀칭툴로 홀이 접종 배지에 타정(welled)된 후, 다양한 농도로 있는 50㎕ 미량원소 킬레이트 착물 시료액이 홀 속으로 투입된다. 배양물의 평가는 외관 검사로 실시된다. 홀 주변에 형성된 저지대의 존재는 시료액의 효능을 나타낸다.
브라키스피라 하이오디센테리애 (B/06): 이들 분석에서, 해동된 박테리아로부터 혈액한천배지(5-10% 섬유소제거된 소혈액이 보충되어 수정된 TSA배지)에서 전배양물(preculture)이 준비된다. 외관상 잘 용혈된 전배양 한천 플레이트로부터, 8-10개의 거의 동일크기(±5% 오차)의 한천 블록 배양이 실시되고, 끝이 약 5mm 직경의 둥근 유리 막대를 이용하여 90mm 직경인 한천 플레이트에 전개된다. 플레이트는 5분동안 덮은 형태로 건조된다.
실험실에서 정립된 절차에 따라, 접종된 플레이트는 한천 디스크 커팅기를 가지고 중간이 펀칭된다. 100㎕ 시험 화합물 희석액이 5mm 직경의 홀에 안치된다. 알려진 농도의 용액을 떨어뜨린 후, 플레이트는 15분 내로 혐기성 장치(anaerostat)(Oxoid anaerobic pouch and jar)에 안치되고, 산소없는 분위기에서 37℃에서 4-5일간 배양된다.
클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens ) 세균 배양은 한천 접시의 중간 홀에 안치된 미량원소 유기 킬레이트에 의해 억제된다. 한천배지에 확산된 화합물은 농도에 의존하여 또렷하고 동심원 모양의 저지대를 형성하고, 희석효과에 기인하여, 저지 효과는 특정 거리 밖에서 중단되고, 배양물은 지저대 밖에서 성장하는 것을 보여준다(도 3 참조).
CID 값의 결정
미생물의 완전 사멸을 일으키는 것은 활성 성분의 농도이다. 라미나 박스(laminar box)내에 무균 상태에서 24시간동안 배양된 액체 배양 배지로부터 일련의 희석액이 준비되고, 각 100 ㎕ 씩 일련의 희석액은 한천 접시에 안치되고, 살균 유리막대로 전개된다. 배양기간은 미생물 성장에 유리한 조간하에서 24시간이고, 한천 접시에 콜로니 수가 세어진다.
평가에 두가지 선택 사항이 고려될 수 있다.
1. 한천 접시에서 어떠한 콜로니도 육안 관찰되지 않는다.
2. 한천 접시에 셀수 있을 정도의 육안 관찰가능한 콜로니가 있다.
배양 후 배지에 어떠한 콜로니도 육안으로 관찰되지 않는 경우, 이는 미량원소 킬레이트의 미생물 살균 효과(CID)가 있음을 나타낸다. 한천 접시 상에 셀수 있을 정도의 콜로니의 수는 미량원소 킬레이트의 실질적 MIC 값을 준다.
실시예 17: 미량원소(아연, 구리, 철, 망간) 킬레이트(모노-, 디-, 비스-아미네이트, 지방산, 및 하이드록시 지방산, 폴리아미노카르복실산 ) 화합물의 미생물학적 MIC 및 CID 결과
미생물학적 분석 시스템은 연구된 미량원소 킬레이트 착물 시료를 가지고 서로 다른 농도에서 생물학적 활성을 보였다.
실험결과로부터 분석 시료는 서로 다른 MIC 값을 가지는 것이 확인되었다. 조사된 병원균과 통성 병원균은 정상 장내세균총, 곰팡이, 락트산 생산균의 성분의 것 보다 유의적으로 더 높은 민감도를 가진다. 시험 화합물을 사료에 혼합하는 것은 평형을 유지하는 것에 더하여 병원균 및 통성 병원균의 성장을 억제하는 것으로 결론될 수 있다. 조사된 킬레이트 화합물은 서로 다른 MIC 값을 가지는 것이 확인되었다.
ppm(mg/kg) 단위에서 미량원소 킬레이트 화합물의 최소생육저지농도(MIC)
분석된 킬레이트 마이크로코커스 루테우스 대장균 살모넬라 엔테리카 락트산 생산균 사카로미세스 세레비시애
아연 모노-글리시네이트 60 100 100 800 800
아연 디- 글리시네이트 60 100 120 800 800
아연 비스- 글리시네이트 440 360 320 800 800
아연 (H2O) 비스- 글리시네이트 60 120 220 800 500
구리 모노- 글리시네이트 200 400 400 800 800
구리 디- 글리시네이트 200 340 450 800 800
구리 비스- 글리시네이트 280 500 600 800 800
구리 (H2O) 비스- 글리시네이트 60 300 400 800 800
철 모노- 글리시네이트 100 350 450 1000 1000
망간 모노-글리시네이트 100 300 300 1000 1000
아연 디암모늄 비스-말레이네이트 NA 80 120 500 500
아연 비스-말레이네이트 NA 280 360 600 600
아연 (H2O) 비스-말레이네이트 NA 90 120 500 600
구리 디암모늄 비스-말레이네이트 NA 262 262 NA NA
아연 디암모늄 비스- 글리시네이트 NA 115 115 NA NA
아연 테트라암모늄 비스- 글리시네이트 NA 140 140 NA NA
아연 (H2O) 비스-알라니네이트 NA 100 110 NA NA
아연 (H2O) 비스-프로피오네이트 NA 160 160 NA NA
아연 (H2O) 비스-발레리아네이트 NA 120 120 NA NA
아연 (H2O) 비스-부티레이트 NA 110 110 NA NA
아연 비스-살리실레이트 n.a. >4000 >4000 n.v n.a.
아연 비스-벤조에이트 n.a. >4000 >4000 n.v n.a.
아연 니트릴로트리아세테이트 n.a. 40 40 n.v n.a.
구리 (H2O) 비스-말레이네이트 n.a. 120 210 n.a. n.a.
아연 디암모늄 아스파테이트 n.a. 92 184 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스-아스파테이트 n.a. 123 247 n.a. n.a.
아연 디암모늄 트리-아스파테이트 n.a. 114 228 n.a. n.a.
아연 모노-아스파테이트 n.a. 74 74 n.a. n.a.
아연 (H2O) 비스-아스파테이트 n.a. 103 103 n.a. n.a.
아연 (H2O) 트리-아스파테이트 n.a. 75 70 n.a. n.a.
아연 디암모늄 글루타메이트 n.a. 167 83 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스-글루타메이트 n.a. 123 123 n.a. n.a.
아연 디암모늄 트리-글루타메이트 n.a. 117 117 n.a. n.a.
아연 모노-글루타메이트 n.a. 70 115 n.a. n.a.
아연 (H2O) 비스-글루타메이트 n.a. 82 82 n.a. n.a.
아연 (H2O) 트리-글루타메이트 n.a. 70 280 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스-히스티디네이트 n.a. >4000 >4000 n.a. n.a.
아연 비스- 히스티디네이트 n.a. >4000 >4000 n.a. n.a.
구리 디암모늄 아스파라기네이트 n.a. 620 620 n.a. n.a.
구리 디암모늄 비스- 아스파라기네이트 n.a. 1025 2050 n.a. n.a.
구리 디암모늄 트리- 아스파라기네이트 n.a. 1400 >4000 n.a. n.a.
구리 디암모늄 글루타메이트 n.a. 688 343 n.a. n.a.
구리 디암모늄 비스- 글루타메이트 n.a. 775 775 n.a. n.a.
구리 디암모늄 트리- 글루타메이트 n.a. 1950 1950 n.a. n.a.
아연 디암모늄 시트레이트 n.a. 48 98 n.a. n.a.
스타필로코쿠스 아우레우스 스트렙토코쿠스 아갈락티애 클로스트리디움 퍼프린젠스 브라키스피라 하이오디센테리애 아카노박테리움 피오젠스
아연 디암모늄 비스-말레이네이트 80 20 340 2315 21
아연 (H2O) 비스-말레이네이트 160 180 360 4400 n.a.
구리 (H2O) 비스-말레이네이트 NA NA 50 88 n.a.
구리 디암모늄 (말레이네이트)2 262 131 65 143 n.a.
구리 모노-글리시네이트 n.a. NA 50 90 92
구리 디-글리시네이트 2 145 50 n.a. n.a.
구리 비스-글리시네이트 110 420 360 320 260
구리 (H2O) 비스-글리시네이트 5,3 171 100 96 32
아연 모노-글리시네이트 40 80 210 >4000 n.a.
아연 에틸디아민-테트라아세트산 n.a. n.a. 1000 450 n.a.
아연 (H2O)2- 에틸렌디아민 테트라아세트산 n.a. n.a. 400 320 n.a.
구리(H2O)2-에틸렌디아민 테트라아세트산 n.a. n.a. 60 100 n.a.
구리 니트롤로 트리아세트산 n.a. n.a. >4000 450 n.a.
구리 에틸렌디아민 테트라아세트산 n.a. n.a. 160 320 n.a.
아연 디아미노니트롤로 트리아세트산 n.a. n.a. 400 600 n.a.
아연 디아미노 에틸렌디아민 테트라아세트산 n.a. n.a. 100 >4000 n.a.
구리 디아미노니트롤로 트리아세트산 n.a. n.a. 120 200 n.a.
구리 디아미노에틸렌디아민 테트라아세트산 n.a. n.a. 20 80 n.a.
아연(H2O) 비스-알라니네이트 n.v n.v >4000 >4000 n.a.
아연 비스-살리실레이트 n.v n.v >4000 n.v n.a.
아연 비스-벤조에이트 n.v n.v >4000 n.v n.a.
아연 모노-글리시네이트 20 40 210 >4000 n.a.
아연 디-글리시네이트 20 20 165 >4000 n.a.
아연(H2O) 비스-글리신 4 29 180 >4000 n.a.
구리(H2O) 비스-말레이네이트 n.a. n.a. 50 88 n.a.
아연 디암모늄 아스파라기네이트 46 23 369 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스- 아스파라기네이트 62 15 494 n.a. n.a.
아연 디암모늄 tri- 아스파라기네이트 114 14 456 n.a. n.a.
아연 아스파라기네이트 18 37 297 n.a. n.a.
아연 비스- 아스파라기네이트 26 51 412 n.a. n.a.
아연 트리- 아스파라기네이트 18 19 450 n.a. n.a.
아연 디암모늄 글루타메이트 61 15 245 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스- 글루타메이트 42 21 334 n.a. n.a.
아연 트리암모늄 트리-글루타메이트 58 15 469 n.a. n.v
아연 글루타메이트 36 18 475 n.a. n.a.
아연(H2O) 비스-글루타메이트 21 10 331 n.a. n.a.
아연(H2O) 트리-글루타메이트 35 17 281 n.a. n.a.
아연 디암모늄 비스-히스티디네이트 >4000 12 1950 n.a. n.a.
아연 비스-히스티디네이트 >4000 4 650 n.a. n.a.
구리 디암모늄 아스파라기네이트 620 20 38 n.a. n.a.
구리 디암모늄 비스-아스파라기네이트 1025 16 32 n.a. n.a.
구리 디암모늄 트리-아스파라기네이트 1400 43 44 n.a. n.a.
구리 디암모늄 글루타메이트 343 11 43 n.a. n.a.
구리 디암모늄 비스-글루타메이트 387 24 97 n.a. n.a.
구리 디암모늄 트리-글루타메이트 487 8 30 n.a. n.a.
아연 디암모늄 시트레이트 49 49 n.a. n.a. n.a.
은 글리시네이트 n.v n.v n.v n.v 184
상기 결과로부터 몇가지 결론이 도출될 수 있다. 연구된 미량원소 킬레이트 화합물의 최소생육저지농도(MIC)는 하나 이상의 통성 병원성 미생물에 대하여 결정되었다. 예외없이 모두는 병원성 미생물을 억제할 수 있는 것이 확인되었다. 마이크로코커스 루테우스는 60-200 ppm 농도에서, 대장균은 70-400 ppm 농도에서, 살모넬라 엔테리카는 80-488 ppm 농도에서, 스타필로코쿠스 아우레우스는 40-498 ppm 농도에서, 스트렙토코쿠스 아갈락티애는 10-427 ppm 농도에서, 클로스트리디움 퍼프린젠스는 65-167 ppm 농도에서, 브라키스피라 하이오디센테리애는 90-494 ppm 농도에서, 및/또는 아카노박테리움 피오제네스(Arcanobacterium piogenes)는 21-184 ppm 농도에서 억제되었다.정상 장내세균총, 락트산 생산균인 락토코쿠스 락티스 아종 락티스, 락토바실러스 카제인 변종 람노수스와 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroide ), 및/또는 사카로미세스 세레비시애(LSE)는 단지 500 ppm 농도 이상, 바람직하게는 800-1000 ppm 농도에서 억제되었다.
실시예 18: 미량원소(아연, 구리, 철, 망간) 모노- 글리시네이트 킬레이트의 2성분 공동작용 조사. 미량원소 성분의 시너지 연구
두가지 이상의 시험 화합물에서 공동상승작용(synergy)가 있었고, 이들의 생물학적 효과는 이들의 상호작용으로 향상되었다. MIC 값과 CID 값을 아는 것은 미량원소 킬레이트의 선택성을 보장하는 데 중요한 것으로 여겨진다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 미량원소 킬레이트들의 공동상승 효과를 찾는 연구실험이 계속해서 이루어졌다.
공동상승 및 길항성을 보이지 않는 조성
미량원소 킬레이트의 2성분 공동상승 MIC 값(ppm)
2성분에서 분석된 킬레이트 클로스트리디움 LSE 및 락토코쿠스 대장균
상호간 억제효과		 살모넬라
상호간 억제효과		 브라키스피라 하이오디센테리애
Zn : Cu 모노-글리시네이트 Zn 360:Cu 50 Zn 800:Cu 800 - - Zn 43,7: Cu 22
Zn : Fe 모노-글리시네이트 Zn 350:Fe 1000 Zn 800:Fe 1000 Zn 180:Fe 110 -
Fe : Mn 모노-글리시네이트 Fe 1000:Mn 500 Fe 1000:Mn 1000 - -
Zn : Mn 모노-글리시네이트 Zn 350:n 500 Zn 800:Mn 1000 Zn 10:Mn 1940 Zn 10:Mn 1940
Cu : Mn 모노-글리시네이트 Cu 100:Mn 500 Cu 800:Mn 1000 - -
Cu : 모노-글리시네이트 Cu 100:Fe 1000 Cu 800:Mn 1000 - -
Zn 말레이네이트 - Cu 모노-글리시네이트 Zn 90:Cu 23 Zn 90:Cu 23
공동상승을 보이는 조성
미량원소 킬레이트의 2성분 공동상승 MIC 값(ppm)
2성분에서 분석된 킬레이트 대장균 살모넬라
Zn : Cu 모노-글리시네이트 Zn 90 : Cu 50 Zn 90 : Cu 50
Zn : Fe 모노-글리시네이트 Zn 30 : Fe 260
Fe : Mn 모노-글리시네이트 Fe 250 : Mn 240 Fe 230 : Mn 240
Zn : Mn 모노-글리시네이트
Cu : Mn 모노-글리시네이트 Cu 210 : Mn 240 Cu 210 : Mn 240
Cu : Fe 모노-글리시네이트 Cu 50 : Fe 230 Cu 50 : Fe 230
상기 결과에 근거하여, 6가지 미량원소 킬레이트들의 최소생육저지농도(MIC)가 병원성 살모넬라 엔테리티디스에 대하여 확인되었다. 이러한 미량원소 킬레이트 농도는 실질적으로 정상 장내세균총(LSE 및 락토코쿠스)(800 ppm)에 영향을 미치지 않았다. 하지만, 통성 병원성 대장균의 경우, 6가지 미량원소 중 5가지 서로 다른 조성이 공동상승적인 유효 MIC 값을 가진다.
실시예 19: 다중성분의 미량원소(아연, 구리) 및 음이온(아미노산, 유기산, 하이드록시산 등) 킬레이트의 공동상승 연구
실시예 18에 추가적으로, 미량원소들이 서로 조합될 때 공동상승 효과(synergy)가 발견될 뿐 아니라, 아미노산과 같이 화합물의 음이온 부분이 결합될 때 역시 공동상승 효과가 인정되었다(표 5).
표의 데이터를 근거로 염기 화합물 외에도 서로 다른 금속을 포함하는 화합물이 최적으로 혼합되고, 음이온 부분이 최적으로 혼합된다면 공동상승 효과가 있고, NH4 + , H2O 리간드를 포함하는 킬레이트가 혼합된다면 총체적인 효과가 있다는 것이 도출되었다.
6성분의 공동상승을 보이는 조성
아미네이트의 공동상승 대장균 살모넬라 엔테리티디스 스타필로코쿠스 아우레우스 스트렙토코쿠스 아갈락티애 클로스트리디움 퍼프린젠스
Zn 아미네이트 6
( gly 2 , asp 2 , glu 2 , his 2 , lys 2 , ala 2 ) 		195 ppm 97 49 97 390
Zn(NH4) 2 아미네이트 6
( gly 2 , asp 2 , glu 2 , his 2 , lys 2 , ala 2 ) 		75 150 37 78 298
Cu (NH4) 2 아미네이트 6
( gly 2 , asp 2 , glu 2 , his 2 , lys 2 , ala 2 ) 		29 117 15 30 117
설명:49-390 ppm 농도에서 아연 암모늄 카르보네이트 아미네이트 gly(글리신), asp(아스파트산), glu(글루탐산), his(히스티딘), lys(리신) 및 ala(알라닌)의 6 성분 조합에 있는 미량원소 음이온성 킬레이트, 37-238 ppm 농도에서 6성분 조합에 있는 미량원소 음이온성 킬레이트 아연 아미네이트, 및 15-117 ppm 농도에서 6가지 성분 조합에 있는 구리 암모늄 아미네이트는 통성 병원성 미생물의 증식에 간섭하는 것으로 생체외 실험에서 대장균, 살모넬라 엔테리티디스 , 스타필로코쿠스 아우레우스 , 스트렙토코쿠스 아갈락티애 및 클로스트리디움 퍼프린젠스에 의해 발병되는 질병을 예방하는 데 유용하다.
실시예 20: 미량원소(아연, 구리, 철) 모노- 글리시네이트 킬레이트의 다성분 공동상승 실험. 미량원소 성분의 공동상승 연구
2성분 공동작용의 미량원소 킬레이트가 미생물 증식에 50-80% 결과를 준다는 것을 알고서, 추가적으로 3성분 공동작용 연구가 실시되었다. 2성분 공동상승을 보이는 미량원소 킬레이트에서 3차로 미량원소 킬레이트를 더 첨가하였다. 3성분 공동작용 확인을 위해, 모든 분석 방법이 이용되었고, 얻어지 최종 결과는 2액 분석 뿐 아니라 마이크로플레이트 분석(microplate assay)에서 동일한 결과를 주는 것으로 확인되었다.
3성분 공동상승을 보이지 않은 조성
미량원소 킬레이트의 3성분 공동상승 MIC 값(ppm)
3성분 공동상승 변화 대장균 살모넬라 클로스트리디움
Zn 모노-글리시네이트 : Cu 모노-글리시네이트 : Fe 모노-글리시네이트
1 Zn 20 : Cu 100: Fe 20 Zn 90 : Cu 100: Fe 60 -
2 Zn 90 : Cu 10: Fe 40 Zn 20 : Cu 110: Fe 140 -
3 Zn 10 : Cu 60: Fe 260 - -
3성분 공동상승을 보이는 조성
미량원소 킬레이트의 3성분 공동상승 MIC 값(ppm)
3성분 공동상승 변화 대장균 살모넬라 클로스트리디움
Zn 모노-글리시네이트 : Cu 모노-글리시네이트 : Fe-글리시네이트
1 - - Zn 40 : Cu 30: Fe 70
2 - - Zn 40 : Cu 30: Fe 20
생체외 실험에서 미량원소 킬레이트는 통성 병원성 미생물의 증식을 선택적으로 억제하는 것으로, 2성분 조합에서는 대장균과 살모넬라에 의한 장질환 예방, 3성분 조합에서 클로스트리디움 미생물에 의한 장질환 예방에 유용한 반면, 정상 장내세균총을 형성하는 락트산 박테리아 및 효모를 억제하지 않는다.
실시예 21: 미량원소(아연, 구리, 철, 망간) 모노- 글리시네이트 킬레이트의 효과적인 CID 또는 고정 농도 확인
실시예 14에 기술된 것처럼 최소치사농도(CID)가 확인되었다.
대장균 살모넬라 락트산 생산균 LSE
Fe 318 ppm Zn 70 Fe 318 ppm Zn 70 Fe 318 ppm Zn 70 Fe 318 ppm Zn 70
Cu 206 Mn 242 Cu 206 Mn 242 Cu 206 Mn 242 Cu 206 Mn 242
Cu 52 Zn 88 Cu 52 Zn 88 Cu 52 Zn 88 Cu 52 Zn 88
Figure pat00014
살모넬라 균주의 경우에 아연 킬레이트의 CID 값은 MIC 값에 비해 30배 더 높은 반면, 클로스트리디움 균주의 경우에 구리 킬레이트의 CID 값은 MIC 값에 대해 단지 2배였다.
이러한 차이는 미생물 종이 각기 다른 민감성을 가지는 것으로 설명될 수 있다. 그러나, 정상 장내세균총 성분의 경우 양쪽 킬레이트는 MIC 및 CID 값에서 동일 농도를 가지는 데, 이러한 결과는 정상 장내세균총 성분의 경우에 미생물의 증식은 이들 농도에서 억제되는 것이 아니라 미생물이 사멸함을 가리킨다.
실시예 22: 아연 (H 2 O) 2 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 구리 (H 2 O) 2 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트 조합물 함유 조성물을 통한 파일럿 사료 실험
사양 시험은 브라키스피라 하이오디센테리애로 감염된 농가에서 파일럿 환경 하에서 두가지 경우에서 성장하는 돼지를 대상으로 실시되었다.
대조군과 실험군 양쪽은 100마리 스토어-돼지(store-pigs)로 구성되었다. 실험군은 실험실 테스트에서 정한대로 사료량 대비 1kg/톤의 실험 조성물을 섭취하였다. 1차 연구에서, 대조군은 예방적 양의 항생제가 함유된 사료를 먹였다(표 10). 2차 연구에서 설사병으로 고생하는 돼지를 개별적으로 선별하여 처리하였다(표 11). 파라미터는 치료 개체수, 손실 사항, 평균 도축 체중량, 및 사료 효율이다.
돼지의 수율 및 건강과 관련한 조성물의 효과(대조군은 예방적으로 항생제 처리를 받았다.)
표시 대조군
(항생제) 		실험군
동물 마리수 100 100
초기 평균 체중 (kg) 31.5 31.7
폐사 0 0
도축시 평균 체중 (kg) 109.5 112.3
사료 섭취(Feed uptake) (kg) 25,877 25,071
사료 효률 (kg/kg) 3.31 3.11
돼지의 수율과 관련한 조성물의 효과(대조군은 주사를 통해 개발적으로 항생제 처리를 받았다.)
대조군 실험군
동물 마리수 100 100
초기 평균 체중 (kg) 28.4 28.1
근육내 처리된 개채수 21 2
실험동안 폐사 0 0
도축시 평균 체중 (kg) 105.8 109.8
사료 효률 (kg/kg) 3.23 2.96
1차 실험(표 10)에서, 동일한 비육기간 후, 실험군에서 도축 체중이 대조군에 비해 2.8 kg, 즉 평균 2.6% 더 높았고, 1kg을 찌우는 데 필요한 사료량은 0.2 kg 감소하였는 데, 이는 사료 효율에서 6% 증가를 의미한다.2차 실험(표 11)에서, 도축 체중은 실험군에서 3.9% 더 높은 반면, 사료 효율은 대조군에 비해 실험군에서 9.1% 수치로 더 향상되었다.
실시예 23 : 구리 (H 2 O) 2 비스 - 글리시네이트 함유 조성물의 파일럿 사양 시험
사양 시험은 병원균 로소니아 인트라셀룰라리스 ( Lawsonia intracellularis )로 감염된 농가에서 쌍을 이루는 파일럿 환경조건 하에서 성장하는 돼지를 대상으로 실시되었다. 대조군은 통상의 항생 보충제를 섞은 사료를 먹였다. 실험군은 구리 디암모늄 비스-글리시네이트 보충된 부형제을 사료대비 1kg/톤의 비율로 사료에 첨가하여 먹였다.
파라미터는 치료 개체수, 손실 사항, 도축시 평균 체중, 사료 효율이다.
쌍을 이루는 동물 실험에서 수율대 대한 처리 효과
실험군 대조군
동물 마리수 326 331
비육 일수 101 101
초기 평균 체중 (kg) 30.86 33.74
증가 체중 (kg) 76.15 71.73
도축시 평균 체중 (kg) 107.01 105.47
사료 효률 (kg/kg) 3.10 3.31
도축시 체중은 실험군이 1.6% 더 높았다. 증가된 체중은 실험군에서 6.2% 더 높았다. 사료효율은 실험군이 대조군에 비해 6.8% 더 우수하였다.
실시예 24 : 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens ) 감염으로 발생된 괴사성 장염 증상을 보이는 농장에서 구리 암모늄 비스 - 글리시네이트 킬레이트의 파일럿 시험
실험은 2개 우리에서 각각 ROSS-308 병아리 17,100마리를 대상으로 이루어 졌다. 농장은 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염으로 전염되었다. 배치에는 항생제 처리가 요구된다.
대조군은 첫번째 우리에 수용되었고, 실험군은 두번째 우리에 수용되었다. 대조군은 사료에 어떠한 보충제를 섞지않았다. 실험군에는 구리 디암모늄 비스-글리시네이트가 보충된 부형제가 사료 대비 1.0 kg/톤 적용된 사료를 먹였다. 대조군의 사료에는 어떠한 보충제도 첨가되지 않았다.
실험 결과를 표 13에 요약하였다.
육계에서 실험 조성물의 사양 효과
측정 파라미터 대조군 실험군 차이
양육 일수 42 42
초기 병아리 수 17,100 17,100
선적(shipped) 병아리 수 16,242 16,238 4
총 생체중
(living weight)(kg)		 31,005 32,395 1,390 (4.5%)
총 증체량
(weight gain) (kg)		 30,298 31,681 1,383 (4.6%)
총 사용 사료 (kg) 59,260 59,880 620
도축시 평균 중량(g) 1,909 1,995*** 86 (4.5%)
상대적 사료 효율(kg/kg) 1.96 1.89 3.6%
*** 차이는 P = 0.001에서 유의적이다. 실험군의 증체량은 대조군의 증체량을 4.6% 초과 증가한 반면, 실험군의 단위 증체량에 대한 사료는 3.6% 감소하였다.
실험군에서 동물 표정은 건강해 보였으며, 설사병(diarrhea) 증상도 관찰되지 않았다.
깔집은 실험군이 대조군에 비해 다소 건조하였으나, 공기중 암모니아 수치는 직관적으로 더 낮았다.
실험 조성물 사양(feeding)시 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다.
실시예 25: 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens ) ) 감염된 산란계에 구리 에틸렌디아민테트라아세트산 암모늄염을 투여하는 실험.
실험실 조건 하에서, 32주령 산란 노계 108마리를 닭장 당 3마리씩 넣었다. 실험에 투입하기 전에 병원균 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 실험을 위하여 배설강 면봉(cloacal swabs) 처리하여, 감염시켰다.
108마리를 각각 36마리씩 3개의 동등한 구룹으로 나누었다.
1. 음성 대조군 I : 클로스트리디움 퍼프린젠스 음성
2. 양성 대조군 II : 클로스트리디움 퍼프린젠스 양성, 위장관 프로브를 통해 2 ml 106CFU/ml 클로스트리디움 퍼프린젠스 배양물을 접종.
3. 보충된, 처리군 III : 클로스트리디움 퍼프린젠스 양성, 위장관 프로브를 통해 2 ml 106CFU/ml 클로스트리디움 퍼프린젠스 배양물을 접종.
그 결과를 표 14에 나타내었다.
클로스트리디움 퍼프린젠스 감염 산란계의 수율 파라미터
데이터 음성 대조군
I		 양성 대조군
II		 처리군
III
총 달걀수(개) 1750 1526 1868
달걀수/닭 48.60 42.38 51.80
총 달걀 중량(kg) 114.07 103.99 125.70
달걀 중량(g/개) 65.1 g 68. 1 g 67.2 g
양성 대조군은 클로스트리디움 퍼프린젠스 감염으로 인해 음성 대조군 대비 13%이상 달걀 수율이 감소하였다. 처리군의 달걀 수율은 음성 대조군 대비 6.7%, 양성 대조군 대비 22.4% 증가하였다. 총 달걀 중량은 실험 동안 위와 유사한 경향을 보였다. 개별 달걀 무게는 양성대조군에서 가장 높았기 때문에 서로 다른 경향을 보였다.
실시예 26: 이유기(weaning)에 발병하는 설사병 예방을 위한 아연(H 2 O) 2 말레이네이트 사양시험
생후 32일된 젖뗀 새끼돼지에 아연 암모늄 말레이네이트가 보충된 사료를 먹였다. 실험 동물은 대장균 감염을 가지고 있다. 대장균 감염을 제어하기 위하여 대조구에는 표준 항생제가 보충된 사료를 투여하였다.
생산 수율을 표 15에 나타내었다.
시험기간 생산수율 파라미터
대조군 실험군
동물 수 28 31
초기 체중(kg) 9.11 9.19
시험 기간(일) 45 38
시험 기간 동안 폐사 1 0
시험 종료 후 체중(kg) 21.26 24.05
일간 체중 증가량(g) 270 391
사료 효율(kg/kg) 2.31 2.04
평균 일간 체중 증가량은 실험군이 대조군 보다 45% 더 높았다. 사료 효율은 실험군이 대조군 보다 13% 더 높았다. 실험군에서는 어떠한 폐사도 없었으나, 대조군에서는 실험기간 동안 1마리가 폐사(3.6%)하였다.
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Claims (14)

  1. 병원성 박테리아를 억제하기 위한, 하기 일반식의 미량원소 유기물 킬레이트 착화합물:
    (M)n(X)m(Y)o
    상기 식에서, M은 Zn, Cu, Fe, Mn, Ag이고,
    X 는 NH4 또는 H2O이고,
    Y 는 아미노산(바람직하게는 자연발생되는 20종의 아미노산에서 선택된 것), 지방산(바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 프로피온산), 하이드록시산(바람직하게는 말레산 또는 락트산) 및/또는 폴리아미노-카르복시산(바람직하게는 니트릴로트리아세트산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산)이고,
    n은 0-6, m은1-6, o는 1-8이다.
  2. 제1항에 있어서,
    통성 병원성 박테리아(facultative pathogenic bacterium)는 살모넬라(Salmonella), 대장균(E. coli), 클로스트리듐 속(Clostridium sp.), 브라키스피라 속(Brachyspira sp.), 아카노박테리움 속(Arcanobacterium sp.), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 스트렙토코쿠스 속(Streptococcus sp.), 로소니아 속(Lawsonia sp.), 리메렐라(Riemerella sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 병원성 박테리아는 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica ), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 세로바 엔테리티디스 (Salmonella enterica subsp . enterica serovar Enteritidis ), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 인판티스 (Salmonella infantis ), 살모넬라 갈리나리움 (Salmonella gallinarium), 살모넬라 파라타이피 (S. paratyphi ), 살모넬라 아보르투스 에쿠이 (S. abortus - equi ), 살모넬라 자바(S. java), 살모넬라 콜레라(S. cholerae ), 살모넬라 타이피 수이스 (S. typhi - suis ), 살모넬라 센다이(S. sendai ), 대장균(Escherichia coli ), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens ), 클로스트리디움 바라티 (Cl. barati ), 클로스트리디움 소르델리 (Cl. sordellii ). 클로스트리디움 보툴리늄 A-F(Cl. botulinum A -F), 클로스트리디움 노비 A, B, C, D(Cl. novyy A , B, C, D), 클로스트리디움 셉티쿰 (Cl. septicum ), 클로스트리디움 초베이(Cl. chauvoei ), 클로스트리디움 히스토리티쿰 (Cl. hystoliticum ), 클로스트리디움 스포로제네스 (Cl. sporogenes ), 클로스트리디움 테타니 (Cl. tetani ), 브라키스피라 하이오디센테리애 ( Brachyspira hyodysenteriae ), 브라키스피라 필로시콜리 (Brachyspira pilosicoli ), 아카노박테리움 파이오제네스 ( Arcanobacterium pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae ), 로소니아 인트라셀룰라리스 ( Lawsonia intracellularis)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    가금류의 장질환, 돼지의 장질환, 소의 장질환 뿐만 아니라 표재성 질환 치료(superficial treatments), 예컨데, 가금류의 괴사성 피부염(necrotic dermatitis)을 동반한 궤양성 족피부염(ulcerative pododermatitis), 젖소의 유선염(mastitis), 젖소의 자궁염(metritis), 유제류(ungulate, 발굽이 있는 포유동물)의 발굽 병변, 다른 동물의 장 질환 및 표재성 질환(superficial diseases)으로 이루어진 군에서 선택된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 것인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은 아연 테트라암모늄 비스-글리시네이트 킬레이트, 아연 말레이네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 말레이네이트 킬레이트, 아연 테트라암모늄 말레이네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 메티오네이트 킬레이트, 구리 디암모늄 리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 아미네이트 킬레이트, 바람직하게는 아연 모노-글리시네이트 킬레이트, 아연 디-글리시네이트 킬레이트, 아연 비스-글리시네이트 킬레이트, 구리 모노-글리시네이트 킬레이트, 구리 디-글리시네이트 킬레이트, 구리 비스-글리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 비스-말레이네이트 킬레이트, 아연 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 디암모늄 (말레이네이트)2 킬레이트, 더 바람직하게는 아연 모노-글리시네이트 킬레이트, 구리 모노-글리시네이트 킬레이트, 아연 디암모늄 비스-말레이네이트 킬레이트, 구리 디암모늄 (말레이네이트)2 킬레이트, 아연 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 구리 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산, 가장 바람직하게는 구리 디암모늄 비스-말레이네이트, 아연 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 아연 (H2O)2 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 아연 (H2O)2 말레이네이트 킬레이트, 구리 디암모늄 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 구리 (H2O)2 에틸렌디아민 테트라아세트산 킬레이트, 구리 (H2O)2 비스-글리시네이트 킬레이트, 구리 (H2O)2 비스-글리시네이트 킬레이트, 구리 암모늄 비스-글리시네이트 킬레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    박테리아 소화관의 소장 부위 또는 피부 표면에서 증식, 질병을 일으키는 것을 억제하거나 또는/및 상기 박테리아에 의한 발생되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 것인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하고, 선택적으로 표준 첨가제를 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른, 서로 상승작용을 하는 적어도 2 이상의 화합물을 포함하고, 선택적으로 표준 첨가제를 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물을 포함하는 사료 첨가제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 사료 첨가제는 적절한 부형물질에서 방출형, 파우더 및/또는 미세과립이고, 12-14% 이하, 바람직하게는 12% 이하의 수분를 가지는 것인, 사료 첨가제.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물, 또는 제9항 또는 제10항에 따른 사료 첨가제를 포함하는 사료.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물, 선택적으로 표준 사료 첨가제 성분을 더 추가하여 혼합하는 것을 포함하는, 사료 첨가제 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물, 또는 제9항 또는 제10항에 따른 사료 첨가제를 표준 사료에 혼합하는 것을 포함하는, 사료 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물, 또는 제9항 또는 제10항에 따른 사료 첨가제, 또는 제11항에 따른 사료를 축산업에서 체중 증가량을 증가 및/또는 사료효율 증가 및/또는 산란을 증가 및/또는 가금류 바람직하게는 영계, 산란계, 칠면조, 및/또는 돼지 바람직하게는 도축용 돼지 또는 새끼돼지, 및/또는 젖소의 폐사 감소를 위해 사용하는 방법.
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