KR20180104158A - 아쿠아포린 수분 통로를 포함하는 자기조립 나노구조물과 분리막 및 이들의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

아쿠아포린 수분 통로를 포함하는 자기조립 나노구조물과 분리막 및 이들의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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마리아나 스펄버
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Abstract

본 발명은 폴리알킬렌이민(PAI) 및 아쿠아포린 단백질 등의 세제 가용화 막횡단 단백질을 포함하는 자기조립 나노구조물에 관한 것이다.

Description

아쿠아포린 수분 통로를 포함하는 자기조립 나노구조물과 분리막 및 이들의 제조 및 사용 방법
본 발명은 아쿠아포린 수분 통로(AQP: aquaporin water channel)와 같은 막횡단 단백질과 폴리알킬렌이민(PAI:polyalkyleneimine) 사이에 형성되는 자기조립 나노구조물과 나노구조물을 포함하는 여과막에 관한 것이다. 본 발명은 또한 중공 섬유 및 중공 섬유 모듈과 같은 나노구조물과 분리막을 제조하는 방법 및 이들의 이용에 관한 것이다.
이중층 또는 이중층과 유사한 구조를 갖는 자기조립 소포를 형성하기 위한 양친매성 지질과 블록 공중합체의 이용은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 특히 아쿠아포린 수분 통로(AQP)와 같은 양친매성 막 단백질을 고정화하는 것으로 잘 공지되어 있다. AQP를 포함하는 소포를 이용하여 수질 정화(WO2006/122566) 또는 염분차 발전(WO2007/033675)과 같은 응용을 위해 고정화된 AQP를 갖는 막을 제조할 수 있으며, 일반적으로 소포를 지지 기질 상에 층으로 또는 필름으로 증착함으로써 막을 통한 나노 여과, 역삼투, 정삼투 또는 압력지연삼투로 물 분자를 선택적으로 통과시킬 수 있다.
WO2013/043118은 아쿠아포린 수분 통로(AQP: aquaporin water channels)가 막의 활성층에 혼입된 박막 복합 분리막(TFC: thin film composite membrane)을 개시한다. 또한, 박막 복합 분리막을 생산하는 방법과 나노 여과 및 삼투 여과 공정과 같은 여과 공정 안에서 이들의 용도를 개시한다. TFC 막은 TFC 활성층에 혼입된 지질-AQP/ 공중합체-AQP 소포를 포함한다. WO2010/146365는 고정화된 AQP를 혼입합기 위한 소포 형성 물질로 양친매성 트리 블록 공중합체를 이용하는 TFC-아쿠아포린-Z(AqpZ) 여과막 제조를 기술한다.
WO2014/108827은 아쿠아포린 수분 통로가 TFC 층 내로 혼입되기 전에 소포 내로 혼입되는 아쿠아포린 수분 통로를 포함하는 TFC 층으로 개질된 섬유를 갖는 중공 섬유(HF: hollow fiber) 모듈을 개시한다.
그러나 통상적으로 종래 기술에서, 소포 생산에 사용되는 양친매성 지질과 블록 공중합체는 사염화탄소(CCl4) 또는 클로로포름(CHCl3)과 같은 강력한 용매에 용해되어 이들의 주된 소수성 부분을 가용화할 필요가 있는 고체이다. 막 합성에서, 이 용매를 증발시켜 필름 형성을 허용한 다음, 양친매성 물질을 AQP 막 단백질의 동시 혼입과 함께 각종 에멀전 형태(소포와 같은)로 유도하도록 다시 수화된다. 그러나 실제로, 최종 소포 크기를 조절하는 것이 어려울 때가 많아, 소포의 지름이 약 60~80nm 내지 약 1000nm 이상인 분산 에멀전이 생성된다. 막 단백질은 이중층 구조에서 양친매성 구조에 따라 정렬되고 단백질의 소수성 부분과 소포 막의 두께를 일치시킬 필요가 있기 때문에 각 소포에 혼입될 수 있는 AQP의 수에 제한이 있을 수도 있다. 폴리에틸렌이민(PEI: Polyethylenimine)은 음전하 DNA와 복합체를 형성할 수 있는 양이온 밀도가 높기 때문에 세포 내로 유전자를 전달하기 위한 다용도 벡터로 알려져 있다. 이 출원에서, PEI-DNA 복합체는 예컨대 효소에 대한 물리적 장벽을 제공하거나 PEI와 효소 사이의 정전기 상호 작용에 의한 효소 분해에 대비하여 DNA에 대한 안정적인 환경을 제공한다(Thomas & Venkiteswaran, Biophysical Journal, 106(2):276-277, 2014). PEI는 분지 형태와 수지상 형태의 선형으로 존재한다. 선형 사슬은 2차 아민기를 가지지만 분지형 사슬 또는 덴드리머는 1차, 2차 및 3차 아민기를 가질 수 있다. 또한, 짧은 폴리에틸렌이민(PEI, Mw 600)이 각종 포화 수준에서 지질 꼬리가 결합하는 양이온 백본으로 선택되었다는 것이 문헌에 공지되어 있다. 용액에서 이러한 폴리머-지질 하이브리드는 siRNA와 복합체를 형성할 수 있는 나노 입자를 형성하기 위해 스스로 조립한다. 이 복합체는 특히 세포 독성을 낮은 상태로 유전자를 침묵시킨다(Schroeder A, et al., J. of Controlled Release, 160 (2): 172-176, 2012).
대체로, 본 발명은 막횡단 단백질, 또는 아쿠아포린 수분 통로와 같은 특정 유형의 내재성 막 단백질(포어(pore) 단백질)을 갖는 자기조립 나노구조물을 형성하기 위한 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 폴리알킬렌이민(PAI)의 이용에 관한 것이다. 따라서 PAI-단백질 나노구조물은 막횡단 단백질이 고정화되고 활성인 분리막의 제조에, 예컨대 물 분자가 막을 통과할 수 있도록 하기 위해 이용될 수 있다.
예컨대, 막 횡단 단백질을 포함하는 분리막 제조를 위해, 자기조립 나노구조물은 박막 복합 활성 막 층을 형성하기 위한 반투과성 지지체 상의 계면 중합 반응에 포함될 수 있는 수성 액상 조성물에 현탁될 수 있거나, 자기조립 나노구조물은 층상 기술 또는 활성 선택 층을 갖는 기타 유형의 여과막에 의해 형성된 여과막에 혼입될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되기를 바라지 않고, 폴리알킬렌이민 분자 내에 존재하는 양전하 질소 원자와 나노구조물 및/또는 나노구조물을 포함하는 막을 형성하는 데 사용되는 조건(pH, pKs 등)에 따라 음전하 막횡단 단백질 내 아미노산 잔기 사이의 정전기 상호 작용을 통해 자기조립 나노구조물이 형성되는 것으로 생각한다.
따라서, 본 발명의 자기조립 나노구조물은 막횡단 단백질을 포함하는 막이 단백질이 개별 소포 또는 세포의 이중층에 혼입되거나 그 외의 경우는 액체 막 내에 인접한 세포들 사이의 경계층에 혼입되며, 이 두 경우 모두 이중층이 세포가 현탁된 주변 외부 상으로부터 세포 내의 내부 상을 분리하는 기능을 갖는다는 점에서 종래 기술 소포와 다르다. 위와 대조적으로, 본 발명의 자기조립 나노구조물에서, 막횡단 단백질 분자와 폴리알킬렌이민 분자는 내부 상과 외부 상을 별도로 유도하는 경계층을 실질적으로 유발하지 않고 오히려 분리막의 활성층 및/또는 선택 구조로 증착되거나 달리 제공될 수 있는 나노구조물의 조성을 제공하는 방식으로 복합체를 결합하거나 형성한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 폴리알킬렌이민(PAI) 등의 양전하 폴리머와 AQP와 같은 하나 이상의 막횡단 단백질 사이에 형성되고, 특히 막횡단 단백질이 세제에 의해 가용화된 자기조립 나노구조물을 제공한다. 막횡단 단백질은 예컨대 정전기 상호 작용을 통해 집합체를 형성하기 위해 양전하 폴리머의 복합체 형성 또는 전하 상호 작용에 사용할 수 있는 음전하 아미노산 잔기를 갖는다. 더 구체적으로는, 형성된 나노구조물의 크기는 분자 구조와 PAI(또는 PEI) 폴리머의 분자량 및 사용된 폴리머 대 단백질의 비율에 의존한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 활성층에 AQP가 혼입된 여과막 또는 TFC 막과 같은 분리막을 제공하여 AQP가 자기조립 PEI 나노구조물과 같은 자기조립 PAI 나노구조물에 고정화되는 물 운송을 용이하게 한다. 본 발명은 나노 여과막, 정삼투막 및 역삼투막과 같은 각종 분리막(여과막 포함)의 활성층에 혼입될 수 있는 PAI-단백질 나노구조물을 포함하는 액상 조성물을 추가로 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 자기조립 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질된 섬유를 갖는 중공 섬유(HF) 모듈을 제공한다. 편리하게는, 선택 층은 섬유의 내면 상에 박막 복합체(TFC) 층을 포함하지만, 특정 실시예에서 TFC 층은 섬유의 외부에 형성될 수 있다.
관련된 양태에서, 본 발명은 보호 쉘로 둘러싸인 섬유 다발을 포함하는 중공 섬유(HF) 모듈을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 섬유는 본 발명의 자기조립 나노구조물을 포함하며, 상기 방법은 자기조립 나노구조물을 포함하는 액상 조성물과 섬유를 접촉시키는 단계 및 계면 중합 반응으로 액상 조성물을 반응시켜 자기조립 나노구조물을 포함하는 선택 층을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 층상 증착 방법으로 활성층의 형성 중에 액상 조성물을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 평막 및 관형막과 같은 각종 다른 막 형태의 선택 층을 형성하는 데 사용할 수 있다.
HF 모듈에서 보호 쉘은 일반적으로 보호 쉘 내부에 길이 방향으로 배치되는 섬유 다발과 함께 가늘고 긴 형태를 갖는다. 실시예들에 개시된 실험은 모듈의 쉘 면에 진공을 적용하는 것이 TFC 코팅 방법에서 이점을 나타낸다는 것을 입증한다. 또한, 수상(aqueous phase) 건조 중에 보호 쉘이 실질적으로 수평 배향으로 유지되는 것이 더 유리할 수 있다. 상기 진공을 적용하는 이점에는 유기 상을 도입하기 전에 모듈 길이를 따르는 수상으로부터 막 표면의 균일한 건조 및/또는 쉘 내부 섬유의 외면 상 모듈 쉘 측 수상의 중량 측정에 의한 유동의 감소 또는 방지가 포함된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 정삼투를 통한 순수의 추출을 위해 본 발명 HF 모듈의 사용을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예컨대 WO2015/124716에 개시된 방식으로 혈액투석, 혈액투석여과 또는 혈액여과를 통해 손실된 환자의 혈장으로부터 순수를 다시 추출하기 위한 본 발명의 HF 모듈 사용을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 천연 수원으로부터 중수 부분의 상향농축을 위한 본 발명의 HF 모듈 사용을 제공한다.
본 발명의 각종 양태는 PEI와 같은 폴리알킬렌이민(PAI) 및 세제로 가용화된 막횡단 단백질을 자기조립하여 형성된 자기조립 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질된 중공 섬유 막을 갖는 중공 섬유(HF) 모듈을 사용한다. 일반적으로, PEI는 평균 분자량이 약 2,000 Da 내지 약 10,000 Da, 예컨대 약 3,000 Da 내지 약 5,000 Da이면서 실질적으로 선형인 폴리머이며, 막횡단 단백질이 아쿠아포린 수분 통로이고, 세제는 LDAO, OG, DDM 또는 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 선택 층이 계면 중합 반응을 통해 섬유의 내면 상에 형성된 박막 복합체(TFC) 층을 포함하며, TFC 층이 PAI 또는 PEI 나노구조물에 기능적으로 캡슐화된 아쿠아포린 수분 통로를 포함하거나 아쿠아포린 수분 통로가 하기 예 11에 기재된 바와 같이 이중블록 또는 삼중 블록 공중합체와 같은 양친매성 소포 또는 지질 소포에 혼입되며, 상기 HF 모듈은 본원에 기술된 방법을 사용하여 코팅된다.
또한, 상기 막횡단 단백질이 이온 통로나 아쿠아포린 등을 포함하고, 상기 막횡단 단백질을 포함하는 상기 나노구조물이 상기 활성층 또는 선택 층에 고정화 또는 혼입될 때, 다양한 선택성 및 운송 특성을 갖는 분리막 또는 여과막, 예컨대 상기 막횡단 단백질이 이온 통로인 경우, 이온 교환막, 또는 상기 막횡단 단백질이 아쿠아포린인 경우 수분 여과막을 제조하는 것이 가능해진다. 막횡단 단백질은 자기조립 나노구조물 내로 복합체가 형성되고 분해되지 않도록 보호되면 생물학적 활성 접힘 구조를 유지하므로 민감한 양친매성 단백질조차도 실험실과 산업 규모로 분리막 내로 처리할 때 충분히 안정되어 기능을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명은 자기조립 나노구조물을 포함하는 액상 조성물에 관한 것으로 막횡단 단백질은 전술한 바와 같은 아쿠아포린 수분 통로로 선택적으로 완충액을 포함하며, 액상 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 폴리알킬렌이민 용액은 세제 가용화 막 단백질과 혼합되어 실온 이상에서도 안정적인 액상 제제를 형성한다. 액상 조성물 형태는 TFC 층을 형성하는 계면 중합 중과 같이 막 제조 공정 중에 MPD 용액에 첨가되거나 달리 적용될 수 있는 중간체로 특히 유용하다. 본 발명의 특별한 특징은 PAI 나노구조물이 하기와 같이 상기 계면 중합에 참여할 수 있고, 이에 따라 박막 및 아쿠아포린 수분 통로의 고정화를 보강할 수 있다는 점이다(Kah et al., pH stable thin film composite polyamine nanofiltration membranes by interfacial polymerisation; Journal of Membrane Science, 478: 75-84, 2015).
본 발명의 분리막은 나노여과 공정, 정삼투 공정 또는 역삼투 공정에서 분리막을 통해 수용액을 여과하는 것과 같이 순수 여과액을 제조하는 방법에 유용하다.
또한, 본 발명의 분리막은 생성물 용액을 농축하는 방법으로 유용하며, 상기 방법은 예컨대 정삼투로 생성물 용액으로부터 물을 추출하기 위해 필터 하우징 또는 모듈에 장착된 본 발명의 분리막을 이용하여 내부에 최종 농도가 더 높고 원하는 용질의 생성물 용액을 생성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 분리막은 또한 압력지연삼투를 이용하는 염분차 전력 생산을 위한 방법에서 추가로 유용할 수 있으며, 상기 방법은 정수압을 증가시키기 위해 상기 분리막을 이용하고, 동력원으로 정수압의 상승을 이용하는 단계를 포함한다(참조: WO2007/033675 및 WO2014128293 (A1)).
도 1. AQPZ의 PEI 자기조립 나노구조물에 대한 원편광 이색성 프로파일. AQPZ의 2차 구조. PEI 자기조립 나노구조물로 재구성된 도 1은 208nm(222/208nm 비는 1.15임)에 비해 222nm에서 음의 타원율 띠를 나타내었고, 대장균 총 지질로 재구성된 시금치 아쿠아포린에 대해 보고된 것과 유사하게 단백질이 펼쳐지지 않았다(Hansen et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1808: 2600-2607, 2011).
도 2. 실시예 11에 기술된 바와 같이 혈액여과(HF: Hemofiltration) 모듈에 적용된 본 발명의 자기조립 나노구조물에 대한 코팅 프로토콜을 도시하는 개략도. Ⅰ- MPD-물 습윤, IIA - 측면 1에서 모듈 건조, IIB - 측면 2에서 모듈 건조, III - TMC-isopare와의 반응. FV-유량계, RH-습도 센서.
도 3. 2.3m2 모듈 시험에 사용된 적용 LPRO 설정 개략도. FV- 유량계, P- 압력계, C- 전도도계
도 4. 2.3m2 모듈 시험에 사용된 적용 단일 패스 정삼투 시험 방법 개략도. 범례 FV- 유량계, P- 압력계, C- 전도도계.
이제 본 발명의 실시예를 예를 들어 설명하되, 첨부된 예와 도면을 참조하는 것으로 한정하지 않는다. 그러나 본 발명의 다양한 추가 양태와 실시예는 본 개시 내용을 고려하면 당업자에게 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용하는 "및/또는"은 다른 특징이나 구성 요소를 포함하거나 포함하지 않는 특정한 두 가지 특징이나 구성 요소 각각의 구체적인 개시로 간주한다. 예컨대, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각이 본 명세서에 개별적으로 명시된 것처럼 구체적으로 개시된 것으로 간주해야 한다.
문맥에 달리 명시하지 않는 한, 전술한 특징의 설명과 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시예로 한정되지 않으며 기술된 모든 양태와 실시예에 동등하게 적용된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 자기조립 나노구조물에 관한 것으로, 이 나노구조물은 음전하 단백질의 존재하에 양전하 PEI의 자기조립으로 형성된다.
막횡단 단백질의 예로는 아쿠아포린 수분 통로, 즉 아쿠아포린 및 아쿠아글리세로포린(아래 열거된 것과 같은)을 포함하는 내재성 막 단백질이 있다. PH 7.5에서 단백질은 제타 전위 값이 음의 값을 나타내는 프로테오리포좀 내부에서 재구성될 때 증명된 바와 같이 음전하를 띤다(Wang S 등, Membranes, 5 (3): 369-384, 2015). 이것은 pKa가 아스파르트산은 3.9이고 글루탐산은 4.2인 음전하 아미노산 잔기(아스파르트산 및 글루탐산)의 존재 때문이다(Kong S 외, RSC Adv., 4: 37592-37599, 2014). 또한, 이들 단백질은 적절하게 접혔을 때 외부 표면에 위치한 시스테인 잔기를 가지며, 상기 시스테인은 pH 7.5에서 음전하를 띠면서 AqpZ를 함유한 1,2-디피타노일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(DPhPC) 프로테오리포솜에 대해 보여준 바와 같이 음의 제타 전위 값을 또한 유도한다. (Li et al., Fusion behaviour of aquaporin Z incorporated proteoliposomes investigated by quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D); Colloids and Surfaces B-biointerfaces, 111 :. 446-452, 2013).
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 자기조립 나노구조물을 포함하는 액상 조성물에 관한 것으로, 막횡단 단백질이, 음전하 아미노산 잔기의 pKa에 상응하는, 예컨대 인산염 완충액을 사용하여, 예컨대 pH 4 이상으로 완충되는 아쿠아포린에 대해, 상기 막횡단 단백질의 음전하 아미노산 잔기를 유지하기 위해 LDAO, OG, DDM 등과 같은 적합한 세제를 선택적으로 pH 완충액과 결합해 사용하여 세제로 가용화된다. 액상 조성물의 다른 옵션 성분은 생물학적 완충액, 예컨대 HEPES 나트륨 염이다. 참조: Fluka의 54466 HEPES 나트륨 염, (Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs), Tris 완충액, TES, MES 및 MOPS 완충액.
또한, 본 발명은 개시된 바와 같은 액상 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 일예로 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 PAI 용액을 음전하 아미노산 잔기를 갖는 음전하 단백질의 현탁액과 혼합한다. 이러한 방식으로 구조물은 PEI DNA와 PEI RNA 복합체에 대해 나타낸 바와 같이 PEI 용액이 전하 단백질을 복합할 때 형성된다(Sun et al, Molecular Dynamics Simulations of DNA/PEI Complexes: Effect of PEI Branching and Protonation State, Biophysical Journal Volume 100 June 201 1 2754-2763; Mansoor M Amiji Polymeric Gene Delivery: Principles and Applications). PEI의 예는 하기한 바와 같은 선형 및 분지형 폴리머이다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 자기조립 나노구조물을 포함하는 반투막 또는 선택적으로 투과성인 막 형태와 같은 분리막에 관한 것이다. 분리막은 다공성 기재 또는 지지막을 포함하는 여과막, 예컨대 분리 층을 갖는 나노 다공성 또는 미세 다공성 막 또는 자기조립 나노구조물이 고정화된 활성층 형태일 수 있다. 일부 경우에, 다공성 지지체 층은 예컨대 폴리에스테르 섬유로 형성된 직조 또는 부직 시트 상에 주조하여 추가로 보강할 수 있다. 예컨대, 상기 활성층은 박막 또는 TFC 층, 예컨대 가교된 방향족 폴리아미드 층을 형성하기 위해 계면 중합으로 형성된 물 선택 층일 수 있다. 또는, 활성/선택 층은 나노 크기의 교번하는 양전하 및 음전하 고분자 전해질, 즉 층상 필름(LbL: layer-by-layer film)을 증착하여 형성될 수 있다(참조: Wang 등, Membranes, 5(3):369-384, 2015).
본 발명에 따른 여과막은 막 제조 공정 중에, 예컨대 구조물 형성에 필요한 막횡단 단백질로 아쿠아포린 수분 통로 단백질을 갖는 상기 자기조립 나노구조물을 포함하는 액상 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다. 예컨대, TFC 층을 형성할 때 MPD 용액에 액상 조성물을 첨가하거나, LbL 피막을 형성할 때 액체 양전하 고분자 전해질에 첨가함으로써 수행할 수 있다. 발명 공정의 일 양태에서, 막횡단 단백질은 전압-의존성 음이온 채널과 같은 음이온 채널 단백질일 수 있으며, 이는 역전기투석을 위한 이온 교환 막의 제조에 유용하다. 참조: Dlugolecki 외(Journal of Membrane Science, 319, 214-222, 2008).
용어 정의
본원에 사용하는 용어 "막횡단 단백질"(TP: transmembrane protein)은 자연에서 영구적으로 부착된 생물학적 막 전체에 걸친 일종의 막 단백질이다. 즉, 자연에서 막 횡단 단백질은 막의 한 면으로부터 막의 다른 면으로 걸친다. 막횡단 단백질의 예로는 암모니아 운반체, 요소 운반체, 클로라이드 통로 및 아쿠아포린 수분 통로가 있다.
본원에서 사용하는 용어 "아쿠아포린 수분 통로"는 아쿠아포린 Z(AqpZ), GIPf, SoPIP2;1, 아쿠아포린 1 및/또는 아쿠아포린 2와 같은 기능적 천연 또는 합성 아쿠아포린이나 아쿠아글리세로포린 수분 통로를 포함한다. 아쿠아포린 수분 통로에는 아쿠아글리세로포린과 같은 관련 통로 단백질뿐 아니라 박테리아 아쿠아포린과 효모 아쿠아포린, 식물 아쿠아포린 및 포유류 아쿠아포린과 같은 진핵생물 아쿠아포린(아쿠아포린 9와 아쿠아포린 9 등)이 포함된다. 아쿠아포린과 아쿠아글리세로포린에는 AqpZ와 같은 원핵생물 아쿠아포린; Aqp1 및 Aqp2와 같은 포유류 아쿠아포린; 혈장 내재 단백질(TIP), 혈소판 내재 단백질(TIP), 노듈린 내재 단백질(NIP) 및 소형 내재 단백질(SIP)과 같은 식물 내재 아쿠아포린, 예컨대 SoPIP2;1, PttPIP2;5 및 PtPIP2; 효모 아쿠아포린, 예컨대 AQY1과 AQY2; 및 GlpF 및 Yfl054와 같은 아쿠아글리세로포린이 포함된다. 아쿠아포린 수분 통로 단백질은 본원에 기술된 방법에 따라 또는 문헌 [Karlsson 등(FEBS Letters 537: 68-72, 2003) 또는 Jensen 등 US 2012/0080377 A1(실시예 6 참조)]에 기술된 바에 따라 제조된다.
본원에서 사용하는 용어 "분리막"은 물과 선택적으로 음이온 및 양이온을 비롯한 특정한 작은 크기의 용질을 다른 용질, 입자, 콜로이드 및 거대 분자로부터 분리하는 데 유용한 편평한 시트, 관형 또는 중공 섬유 구조의 막을 포함한다.
분리막의 예로는 나노 여과(NF: nano filtration) 막, 정삼투(FO: forward osmosis) 막 및 역삼투(RO: reverse osmosis) 막과 같은 "여과막"이 있다. 여과막의 한 유형은 종종 나노 여과 및 역삼투막으로 분류되는 "박막 복합체"(TFC: thin film composite) 막이다. TFC 평막은 일반적으로 부직포 또는 직포 지지체의 상단에 주조된 폴리에테르설폰 또는 폴리설폰 다공성 층의 상단에 계면 중합을 통해 폴리아미드 층을 형성함으로써 제조된다. 중공 섬유의 내부 또는 외부 표면 상에 TFC 층을 제조하는 방법의 예는 본원에 참고로 인용된 WO2014/108827에 개시되어 있다. 폴리아미드 배제 층은 아민 수용액의 계면 중합을 통해 유기 용매 중 산 클로라이드 용액으로 형성된다. TFC 막은 WO 2013/043118(Nanyang Technological University & Aquaporin A/S)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 다른 유형의 여과막은 Gribova 등(Chem. Mater., 24: 854-869, 2012)과 Wang 등(Membranes, 5 (3): 369-384, 2015)에 기술된 바와 같은 층상(LbL) 증착 방법에 의해 형성된 막이다. 예컨대, 자기조립 나노구조는 Gribova 등의 <Polyelectrolyte Multilayer Assemblies on Materials Surfaces: From Cell Adhesion to Tissue Engineering. Chemistry of Materials: A Publication of the American Chemical Society, 24(5), 854-869. http://doi.org/10.1021/cm2032459.> 도 4(2012)에 요약된 대로 고분자 전해질 다층(PEM) 필름에 내장되거나 혼입될 수 있다.
HF 모듈은 당 업계에 공지되어 있고 일반적으로 계면 중합 등을 통해 박막 복합체 층을 형성하여 개질된 폴리에테르술폰(PES) 섬유 또는 폴리에테르술폰, 폴리페닐렌술폰, 폴리에테르이미드, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 블렌드 및 혼합물을 포함하는 폴리아크릴로니트릴과 같은 다른 적절한 다공성 지지체 재료 섬유를 포함한다. 또한, 각종 도핑 재료는 중공 섬유 지지체 재료를 제조할 때 사용할 수 있다. 이러한 HF 모듈은 맥주 및 와인 여과와 같은 음식료, 일부 용수 및 폐수 재사용, 수영장 물 재활용 및 혈액 투석을 포함한 폐수 처리 응용 분야에서 일반적으로 사용된다. 예컨대, 독일 회사 Membrana는 모듈당 전체 표면적이 75 제곱미터인 수천 개의 섬유가 포함된 중공 섬유 모듈을 공급한다. 일반적으로 1~2 제곱미터이면서 약 8,000~20,000개의 섬유가 있는 더 작은 모듈은 의료용 투석 응용(Fresenius Medical Care, Gambro)에 일반적으로 사용된다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 HF 모듈은 일반적으로 분자량 차단 범위가 20 내지 50 kDa 또는 30 내지 40 kDa인 미세 여과 모듈 또는 나노 여과 모듈이다. 원칙적으로, 이들 상업용 제품은 모두 계면 중합을 통해 본 발명의 자기조립 나노구조물 또는 조성물로 코팅될 수 있으며, 예컨대 아쿠아포린 수분 통로가 혼입된 박막 복합층을 생성시킬 수 있다. 본 발명에서 HF 모듈의 하우징 재료는 폴리카보네이트, 폴리술폰, POM(모두 투명함) 또는 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, PVDF 및 스테인레스 강과 같은 HF 모듈에 일반적으로 사용되는 임의의 적합한 재료일 수 있다. 섬유는 일반적으로 공지된 폴리우레탄 또는 에폭시 접착 재료 등을 사용하여 HF 모듈 하우징 내로 밀봉될 수 있다. 관형 모듈은 또한 다음에 설명된 바와 동일한 방식으로 코팅될 수 있다. http://synderfiltration.com/leaming-center/articles/module-configurations- process/tubular-membranes/
본 발명에 따라 개질된 TFC일 수 있는 HF 모듈의 추가 예는 다음과 같은 막 생산업체 웹 사이트에서 찾을 수 있다.
http://www.membranafiltration.corn/filtration-modules/documentation.cfrn http://www.kochmembrane.com/PDFs/KMS_Puron_Hollow_Fiber_PSH300_PSH600_PSH1800
_Modul.aspx
http://www.kochmembrane.com/Membrane-Products/Hollow-Fiber/Ultrafiltration/PURON- Series.aspx
http://www.daicen.co.jp/english/membrane/kogata.html
http://www.spectmmlabs.com/filtration/hfmods.html
http://www.microdyn-nadir.com/en/Products/
본원에서 사용하는 "박막 복합체", 즉 "TFC" 막은 아민 반응물, 바람직하게는 수용액 내 1,3-디아미노벤젠 등과 같은 디아민 또는 트리아민(m-페닐렌디아민 > 99%, 예: Sigma-Aldrich에서 구입한 것) 및 2산 또는 3산 클로라이드와 같은 본원에서 아민 반응성 분자로 또한 공지된 아실 할라이드 반응물, 바람직하게는 벤젠-1,3,5-트리카보닐 클로라이드 등의 방향족 아실 할라이드(CAS No.84270-84-8, 트라이메소일 클로라이드(TMC), 98%, 예: Sigma-Aldrich로부터 구입한 것)로서, 상기 반응물이 계면 중합 반응에서 결합하는 유기 용매에 용해되는 것을 이용하여 제조할 수 있다. (미국 특허 제4,277,344호 참조: 지지막의 표면, 예컨대 폴리에테르술폰 막에 다공성 막 지지체에 적층된 폴리아미드를 포함하는 복합막의 형성을 상세하게 기술함.) 벤젠-1,3,5-트리카르보닐 클로라이드는 헥산(> 99.9%, Fisher Chemicals), 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸 등(직쇄 또는 분지형 탄화수소)을 포함하는 C6~C12 탄화수소와 같은 용매 또는 다른 저방향족 탄화수소 용매, 예컨대 이소알칸을 포함하는 주성분인 저취 유체를 생성하기 위해 촉매의 존재하에 수소로 처리된, 석유 기반 원료에서 생산되는 Isopar™ G Fluid에서 용해된다. Isopar™ G Fluid: 화학명: 탄화수소, C10~C12, 이소알칸, < 2% 방향족; CAS No: 64742-48-9, 화학명: 나프타(석유), 수소처리된 중질(ExxonMobil Chemical에서). 반응물 1,3-디아미노벤젠의 대안은 헥사메틸렌디아민 등과 같은 디아민을 포함하고, 반응물 벤젠-1, 3, 5-트리카보닐 클로라이드의 대안은 당 업계에 공지된 디아실 클로라이드, 아디포일 클로라이드 등을 포함한다. 흥미롭게도, TMC와 같은 아민 반응성 분자는 계면 중합 반응에서 PAI 폴리머에서 아민기와 축합 생성물 또는 폴리머를 형성할 수 있다. Feng 등(Journal of Membrane Science, 472:141-153, 2014)은 PEI와 TMC 사이의 계면 중합 반응에서 방향족 폴리아미드의 연속 층이 PES 지지체 상에 어떻게 형성되어 나노 여과막을 형성하는지를 보여 주었다.
"층상(LbL:layer-by-layer)" 증착 방법: 1966년에 처음으로 언급된 역 전하 고분자 전해질의 순차적 층상(LbL) 흡착은 박막 형성을 위한 효율적인 방법이고 재료 과학과 공학에서 일반적인 기술 중 하나이다(Decher et al., Phys. Chem. 95: 1430-1434, 1991). 고분자 전해질 다층의 형성을 위한 동력은 정전기 인력이기 때문에, LbL 기술은 맞춤형 조성과 조정 가능한 특성을 포함하는 초박형의 무결함 층의 제조에 적합하다(Joseph et al., Polym. Chem. 5: 1817- 1831, 2015). 조정 가능한 특성의 한 가지 예는 층수의 제어이며, 이에 따라 nm에서 μm 범위의 총 두께 또한 제어한다(Jian et al., Adv. Mater 18: 1068-1072, 2006). LbL 고분자 전해질 어셈블리는 폴리에테르술폰(PES), 폴리비닐아민, 폴리 4-메틸-1- 펜텐, 폴리아미드, 폴리아크릴로니트릴(PAN), 폴리비닐 피롤리돈, 평막 내 양극산화 알루미나, 관형 또는 중공 섬유 구조와 같은 초기 고분자 전해질 층을 흡수할 수 있는 여러 크기와 토폴로지를 가진 다수의 다공성 막 기질에 대한 막 분리에 사용되고 있다(Duong et al., J. Memb. Sci. 427:41 1-421, 2013.). 아주 다양한 고분자 전해질을 사용하여 막에 이르는 다층을 형성할 수 있으며, 아래의 표에 요약된 바와 같이 이중층 및 지지막의 수를 다양하게 할 수 있다(Zhang, Y.(2013) 내 표 2.2는 Zhang, P. 등(2008)에 기초한다).
이중층 수 지지막
고분자 전해질 쌍
60

PAN/PET(폴리아크릴로니트릴의 얇은 층으로 코팅한 폴리에틸렌 테레프탈레이트 플리스) PVA(폴리비닐알코올)/
PVS(폴리비닐 술폰산)
20 폴리이미드 PEI(폴리에틸렌이민)/알긴산염
10.5

알루미나

BDPA(1,3-비스 디페닐렌-2-페닐 알릴)
/ DABA(3,5-디아미노벤조산)
/ PAH(폴리알릴아민 하이드로클로라이드)
10 PAN(폴리아크릴로니트릴) PEI/PAA(폴리아크릴산)
4 PES(폴리에테르술폰) PAA/PEI
2.5 PAN(폴리아크릴로니트릴) PEI/PAA
용어 "폴리알킬이민"(PAI:polyalkylimine)은 적어도 하나의 "이민" 기(-N(H)-)가 혼입된 알킬이민 단량체의 중합에 의해 제조된 임의의 올리고머 또는 폴리머 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일 실시예에서, 폴리알킬이민은 주쇄에 알킬- 또는 알케닐- 유도 단위(C2-C << 알킬- 또는 알케닐 유도 단위)를 포함하는 폴리머를 함유하는 아민이다. 바람직하게는, PAI는 이민-유도 단위(아민기) 및 알킬 유도 단위를 포함하고, 가장 바람직하게는, PAI는 아민기와 알킬-유도 단위로 구성된다. 바람직하게는, PAI는 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 폴리프로필-코-에틸렌이민, 폴리알릴아민 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 어떤 경우이든, PAI는 바람직하게는 중량 평균 분자량(Mw)이 약 2,000 또는 3,000 또는 5,000 또는 10,000 또는 20,000 또는 40,000 Da와 같이 약 500 또는 약 1,000 이상이다.
본원에 기재된 축합 중합체는 일반적으로 아민-반응성 분자를 PAI와 결합하여 수용액에서 제조된다. 아민 반응성 분자는 아민/이민과 반응하여 공유 결합 또는 이온 화학 결합을 형성하고, 바람직하게는 공유 결합을 형성하는 적어도 하나의 모이어티를 포함하는 분자이다. 바람직하게는, PAI와 결합된 아민-반응성 분자의 0.1 또는 0.2 내지 0.6 또는 0.8 또는 1.0 또는 1.1 또는 1.2 또는 2.0 또는 2.5 또는 3.0까지 아민-반응성 등가물("ARE: amine-reactive equivalents")이 있다. 바람직하게는, 생성물은 용액 내 수성 희석제 또는 pH가 적어도 8에서 실질적으로 용액 내에서 단리될 수 있다. PAI와 아민 반응성 분자 간 축합 반응의 생성물은 본원에 기재된 바와 같은 축합 중합체이지만, 특정 실시예에서는 축합 중합체를 반응 매질로부터 특별히 단리할 필요가 없으므로, 특정 실시예에서, 유용한 축합 중합체는 전체 혼합물 또는 축합 생성물이다.
본원에서 사용하는 용어 "폴리에틸렌이민"(PEI:polyethyleneimine)은 -NHCH2CH2-(아민기 및 2개의 메틸렌기)로 이루어진 반복 단위의 폴리머를 포함한다.
Figure pct00001
선형 폴리에틸렌이민은 2차 아민을 함유하는 반면, 분지형 폴리에틸렌이민은 1차, 2차 및 3차 아미노기를 함유할 수 있다. 분자량이 1,000 Da 또는 1,500 Da 또는 2,000 Da 또는 2500 Da부터 4,000 Da 또는 5000 Da 또는 8,000 Da 또는 10,000 Da까지 범위인 다양한 선형 PEI뿐만 아니라 분자량이 800 Da 내지 2,000Da인 분지형 PEI가 사용될 수 있다. 일반적으로, PEI와 단백질 사이에 형성된 구조에서 단백질의 가능한 로딩의 증가로 이어지는 PEI의 분기 및 분자량 증가는 일반적으로 형성된 구조의 크기 증가를 수반한다. 여과막 제조와 같은 일부 응용 분야는 형성된 구조의 최종 크기가 최대 200nm을 초과하지 않는 것이 바람직하다는 점을 염두에 두고, 선형 및 분지형의 다양한 분자량을 가진 사용 가능한 PEI 라이브러리 전체를 고려할 수 있다. PEI-단백질 복합체의 경우, 약 200nm(150 내지 250nm)의 좁은 크기 분포가 현재 활성인 여과층 내로 혼입에 가장 유망한 것으로 간주된다. LbL 방법으로 여과막을 제조하기 위해, 형성된 구조체는 바람직하게는 200nm 미만, 예컨대 100nm 미만(예: 50, 20 또는 10nm)일 수 있으며, 이들은 모두 형성되는 층의 수, 막횡단 단백질의 접힌 구조와 활성층에 형성된 구조의 위치(들)에 의존한다.
현재 4000, 5000 및 10000 분지(측쇄기 + 더 많은 가용 양전하)가 잘 기능 한다. 모든 기능성 폴리머는 문헌과 관찰에 따라 양전하 농도를 갖는다. 자기조립 구조가 더 음전하일수록 DLS로 측정한 구조가 더 커진다. LDAO는 매우 희석되어 제타 전위로 측정한 바에 따라 음전하를 띤다. 제타 전위가 약 마이너스 30까지 떨어지는 경우에는 총 단백질 구조가 보이지 않는다. 구조물이 현탁 상태에서 유지되는 콜로이드계.
약자 Mn은 수 평균 분자량 의미하며, 폴리머의 총 중량을 폴리머 분자 수로 나눈 것을 의미한다. 따라서 Mn은 수분율에 따라 가중된 분자량이다. 약자 Mw는 중량 평균 분자량을 의미한다. 분자량은 중량 분율에 따라 가중치를 매겼다. 분자의 질량은 테트라히드로푸란 내 겔 투과 크로마토그래피(GPC: gel permeation chromatography)로 측정할 수 있다. Mn/Mw로 정의된 다분산도 지수는 GPC로 얻은 용리 곡선으로부터 결정된다.
나노구조물의 크기: 바람직하게는, 본 발명의 나노구조물은 나노구조물의 정확한 구성 요소 및 그 형성에 사용된 조건에 따라 입자 크기가 약 10nm 지름과 200nm 내지 약 250nm 지름 사이이다. 입자 크기는 일정한 범위의 크기를 지칭하고 본원에서 인용된 수치는 평균 지름, 가장 일반적으로 유체 역학적인 평균 지름을 지칭함이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명의 나노구조 조성물은 평균 지름이 약 200nm 내지 약 250nm 이하이며, 일부 경우에는 평균 지름이 약 180nm 이하 또는 약 150nm 이하 등의 200nm 미만의 나노 입자를 포함한다.
막횡단 단백질과 PAI(예:PEI)의 몰비 예는 사용된 막횡단 단백질, 사용된 PAI 유형, 선형 PAI와 반대되는 분지형 PAI의 정도 또는 양 및 원하는 나노 구조의 크기에 따라 다르다. 일예로 PEI 및 아쿠아포린 수분 통로의 나노구조물의 경우, 막횡단 단백질 대 PEI의 몰비는 1:200 내지 1:2000, 예컨대 1:400 내지 1:1500, 또는 1: 600 내지 1:1000일 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 선형 폴리에틸렌이민의 예: 폴리에틸렌이민, 선형, 764582 ALDRICH, (평균 Mn 5,000, PDI <1.2); 폴리에틸렌이민, 선형, 764604 ALDRICH, (평균 Mn 2,500, PDI <1.2); 및 폴리에틸렌이민, 선형, 765090 ALDRICH, (평균 Mn 10,000, PDI <1.2). 분지된 폴리에틸렌이민의 예: 407819 ALDRICH (LS로 평균 Mw 800, GPC로 평균 Mn 600), 폴리에틸렌이민, 408727 ALDRICH (LS로 평균 Mw ~25,000, GPC로 평균 Mn ~10,000). Polysciences, Inc는 선형 폴리에틸렌 Mw~17,000, 479136 ALDRICH, CAS 번호 30551-89-4, Linear Formula [CH2CH (CH2NH2)] n을 제공하는 업체이기도 하다.
BASF Lupasol®, 참조: http://product-finder.basf.com/group/corporate/product- finder/de/brand/LUPASOL (2016년 2월 8일에 액세스). 수상 돌기 PEI 예: 폴리에틸렌이민 수상 돌기 5000 Da 및 25000 Da(Nanopartica) 및 폴리에틸렌이민 수상 돌기 5000 Da 알칸 기능화(Nanopartica).
본원에서 사용하는 용어 "자기조립"은 폴리에틸렌이민, 구성 요소 및 막횡단 단백질 구성 요소와 같은 폴리알킬렌이민으로부터 형성된 나노구조물이 외부 방향 없이 성분들 사이의 이온성 또는 전하 상호 작용의 결과로 조직화된 규칙 구조를 형성하는 과정을 나타낸다. 본 발명에서 "자기조립"은 "분자 자기조립" 용어와 동의어이다. 자체 조립 시스템의 일반적인 특성은 다음을 참조한다. https://en.wikipedia.Org/wiki/Self-assembly#Interactions [accessed 8 February 2016] . 본 발명에서, 폴리에틸렌이민 성분과 (음) 전하 단백질 성분 사이에 형성된 자기조립 나노구조물은 양이온 전하 폴리에틸렌이민 분자와 단백질 성분의 음이온 전하 아미노산 잔기 사이의 이온 상호 작용에 의해 유도되는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용하는 용어 "나노구조물"은 규모가 나노 미터인 입자를 말하며 임의의 특정한 형상 제한을 전달하려고 하는 것은 아니다. 특히, "나노구조물"은 나노 구체, 나노 튜브, 나노 박스, 나노 덩어리, 나노 막대 등을 포함한다. 특정 실시예에서, 나노구조물은 일반적으로 다면체 또는 구형 형태 구조인 나노 입자 및/또는 나노 입자 코어일 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 "크기"는 자기조립 나노구조물의 유체 역학적 지름을 말한다.
실시예
본 발명은 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 추가로 예시한다.
실험 섹션
장비:
AKTA Unicorn 운영 체제를 사용하여 휴대용 컴퓨터와 연결된 AKTA Start FPLC
진공 기류.
살균 0.45 μM 진공 필터 컵.
15mL PP 튜브.
약어:
CV(column volume): 관 부피
AQP: 대장균의 아쿠아포린 Z
LDAO: N, N-디메틸도데실아민 N-옥사이드(# 40234, Sigma).
PAGE: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동.
재료 및 화학 물질:
XK16/20 칼럼(GE Healthcare)에 알려진 부피 또는 미리 채워진 1ml, 5 ml HisTrap 칼럼으로 포장된 HisTrap 겔 여과 재료(Ni Sepharose 6 Fast Flow # 17-5318-03, GE Healthcare).
AQP 결합 완충액: 20mM 인산 나트륨, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.2% LDAO, pH 8.0.
LDAO가 없는 AQP 결합 완충액: 20 mM 인산나트륨, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, pH 8.0. 이미다졸이 없는 AQP 결합 완충액: 20 mM 인산 나트륨, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.2% LDAO pH 8.0.
AQP 용리 완충액: 20 mM 인산 나트륨, 300 mM NaCl, 200 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.2% LDAO, pH 8.0, ddH2O.
아쿠아포린의 일반 정제와 아쿠아포린 원액의 제조
아쿠아포린 Z의 재조합 생산
아쿠아글리세로포린을 포함한 아쿠아포린 수분 통로 단백질의 모든 유형과 변이체는 본 발명에 따른 막과 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 참조: WO2010/146365에 기술된 방법. 대표적인 예로는 시금치 아쿠아포린 SoPIP2;1 단백질과 대장균의 박테리아 아쿠아포린-Z가 있다.
기능성 아쿠아포린-Z는 대장균 균주 BL21(DE3) 박테리아 배양물에서 담배 식각 바이러스 절단 부위가 있는 히스티딘 표지 단백질로 과잉 생산되었다. 융합 단백질은 264개의 아미노산과 27234 Da의 Mw를 갖는다. 대장균 DH5의 게놈 DNA가 AqpZ 유전자를 증폭하기 위한 소스로 사용되었다. AqpZ 유전자는 AqpZ의 N-말단에서 ENLYFQSN; 담배 식각 바이러스 절단 부위(TEV)가 첨가된 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 증식했다. 증식한 AqpZ를 효소 NdeI 및 BamHI로 분해한 다음 유사하게 분해한 6-히스티딘 표지 발현 pET28b 벡터 DNA에 연결(ligated) 했다. 양성 클론은 PCR 스크리닝에 의해 확인되었다. 그런 다음 DNA 염기 서열 분석에 의해 구조물의 신뢰성을 확인하였다.
대장균 균주 BL21(DE3)을 단백질의 발현에 사용하였다. 50 μg/ml의 카나마이신을 함유한 Luria Broth 배양물을 37℃에서 13~16시간 동안 배양하고 신선한 LB 브로스에 100배로 희석하여 약 1.2~1.5(외경 600nm에서)의 밀도로 증식시켰다. 원심 분리 전에 35℃에서 3시간 동안 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 수확된 세포를 0.4 mg/ml 리소자임, 50 단위 벤소나제와 3% n-옥틸 β-D-글루코피라노시드가 있는 빙냉 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl, 2 mM β-머캅토에탄올, 10% 글리세롤) 내에 다시 현탁하였다. 시료를 12,000Pa의 고압균질기에서 5회 용해 사이클에 적용하였다. 불용성 물질을 40,000x g에서 30분 원심 분리하여 펠릿화 하였다. 상등액을 Q-Sepharose 고속 유동 칼럼(Amersham Pharmacia)에 통과시키고, 통과액을 10회 수집하였다. 미리 평형화된 Ni-NTA 칼럼 상에 로딩하기 전에, 통과액 분획을 300mM NaCl로 얹었다. 비특이적 결합 물질을 제거하기 위해 칼럼을 100 칼럼 부피의 세척 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 25mM 이미다졸, 2 mM β-머캅토 에탄올, 10% 글리세롤)으로 세척했다. Ni-NTA 아가로즈 결합 물질을 용리 완충액(20mM Tris pH 8.0, 300mM NaCl, 300mM 이미다졸, 2mM β- 머캅토에탄올, 10mM 15 글리세롤, 30mM n-옥틸 β-D 글루 코피 라노 시드)을 2 베드 볼륨으로 용리했다. AqpZ를 음이온 교환 크로마토그래피(mono Q 칼럼(GE healthcare))로 추가 정제하였다. 시료 혼합물을 희석하고 농축하여 Amicon 농축기로 염 및 이미다졸 농도를 약 10mM으로 만들고 막을 MonoQ 칼럼에 로딩하기 전에 막을 10,000 Da로 절단했다. 음이온 교환 크로마토그래피 동안 사용된 완충액은 (A) 20mM Tris pH 8.0, 30mM OG, 10% 글리세롤 및 (B) 20mM 20 Tris pH 8.0, 1M NaCl, 30mM OG, 10% 글리세롤이었다. 이온 교환 칼럼으로부터 AqpZ를 함유하는 용리 피크 분획을 모았다. 정제된 AqpZ 추출물을 -80℃에서 동결시켰다.
아쿠아포린 단백질 정제 절차
대장균 발효로 얻은 아쿠아포린 Z(AQPZ)과 같은 아쿠아포린 단백질의 냉동 추출 배치(batch)를 본 발명의 단백질-PAI 나노구조물을 포함하는 막을 제조하고 특성화하기 위한 실험에 사용하기 위해 하기와 같이 수득하여 처리하였다.
정제 실험 하루 전에 AQP 추출물(-80℃ 냉동고에 보관)을 얼음 또는 4℃ 냉장고에서 해동했다. 완충액과 ddH2O의 일부는 4℃에서 준비했다. AQP 추출물을 자석 스틱으로 얼음 용기(ice bath) 상의 적당한 냉각 비이커에서 교반하여 침전물을 용해했다. 1.5 부피의 사전 냉각 LDAO가 없는 AQP 결합 완충액을 1 부피의 가용화 추출물(추출 튜브 및 여과 컵을 헹구기 위한 추가 0.5 부피의 완충액을 사용하여)에 조금씩 첨가하고 잘 혼합하여 멸균한 0.45 ㎛ 진공 필터 컵을 통해 여과한다. 과도한 거품을 피하기 위해 필터 컵에 진공을 인가하고 2시간 이내에 사용하기 위해 여과액을 얼음 위에 놓았다.
Histrap 칼럼을 살균수로 평형화한 후 AQP 결합 완충액을 실온에서 평형화시켰다. 유속은 1ml/분(1ml의 사전 충전 칼럼의 경우) 또는 2.5ml/분(5ml의 사전 충전 칼럼 및 자체 충전 칼럼의 경우)로 설정했다. 3배로 희석한 추출물(얼음 용기에서)을 AKTA 프로그램을 사용하여 Histrap 칼럼에 로딩하였다. 유속은 1ml/분(1mL 사전 충전 칼럼) 또는 2.5ml/분(5mL 사전 충전 칼럼 및 자체 충전 칼럼)으로 설정했다. 로딩 양은 30ml/ml 수지 미만이었다. 얼음물 용기 상의 추출물 통과액을 추후 사용을 위해 수집하여 4℃에서 보관했다. 칼럼을 10CV(칼럼 부피)의 빙냉 AQP 결합 완충액으로 세척했다. 유속은 2.5 ml/분(5ml의 사전 충전 칼럼 및 자체 충전 칼럼의 경우)으로 설정하거나 1ml의 사전 충전 칼럼에 대해 1ml/분으로 설정했다. AQTA 프로그램을 사용하여 AQP 단백질을 유속 2.5ml/분으로 얼음 냉각 AQP 용리 완충액(10 칼럼 부피)으로 용리했다. 분획 부피를 10ml로 설정하고 0.5~1 CV 후 15mL PP 튜브에서 수집을 시작했다.
용리된 분획을 캡핑하고 얼음 위에 또는 4℃에서 보관했다. AQP 순도와 형태를 각각 변성 및 천연 PAGE 분석으로 검사했다. 단백질 농도는 Nanodrop으로 측정했다. 추출물 통과액은 적합한 품질의 AQP 조성물을 제조하기 위해 필요에 따라 2회 및 3회 처리할 수 있다. AQP 품질 분석이 통과될 때, 단백질 농도는 2% LDAO를 함유하는 빙냉 무-이미다졸 AQP 결합 완충액을 첨가함으로써 5mg/ml로 조정될 수 있다. 마지막으로 AQP를 0.45μM 살균 컵을 통해 여과하여 살균하고 한 달 이내에 사용하려면 냉장고에서 4℃로 보관하고, 그렇지 않으면 냉동고에서 -80℃에 보관한다.
실시예 1. PEI-아쿠아포린-Z 나노 입자의 제조 및 흐름 정지 시험
4000 Da (선형)(PEI)의 MW를 갖는 폴리에틸렌이민을 Sigma Aldrich로부터 구매하여 다른 정제 없이 사용했다. NaCl 8g, KC1 0.2g, Na2HPO4 1.44g 및 KH2PO4 0.24g을 800㎖의 MilliQ 정제 H2O에 용해하고, HC1으로 pH를 7.2로 조절하고, 부피를 1 L로 완료하여 10mM 인산염 식염수(PBS)(pH 7.2, 136mM NaCl, 2.6mM KCl)를 제조했다. N, N-디메틸도데실아민 N-산화물 BioXtra(라우릴디메틸아민 N-산화물)(순도 99%), LDAO는 Sigma Aldrich로부터 구매했다. PEI 기반 자기조립 구조물은 직접 용해 방법으로 제조했다. 첫 번째 100ml의 경우 pH 7.2의 인산염 완충액 중 5 mg/ml PEI는 pH 7.2의 100mL PBS에 500mg PEI 분말을 용해하여 제조했다. 추가로 100 mL 5mg/mL PEI를 2% LDAO의 5mg/mL Aquaporin Z(AQPZ) 정제 원액으로부터 0.3 mL로 1.5 mg과 직접 혼합하였는데 이는 2성분 혼합물의 1/800 AQPZ/PEI 몰비에 해당한다 . PEI-AQPZ 혼합물을 1분당 170회전으로 하룻밤 동안 밤새도록 20시간 이하(그러나 12시간 이상으로)로 밤새 교반했다.
교반 후, 다음날 혼합물을 100mL 유리병에 옮기고 실온으로 유지하였다. 혼합물(PEI-AQPZ 기반 자기조립 구조물의 액상 제제 또는 조성)은 2개월 넘게 유지할 수 있다. 보관 유리병으로 이동한 후 PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 크기와 투과율을 Malvern의 ZetaSizer NanoZs 및 Bio-Logic SFM 300을 사용한 정지 흐름을 사용하여 동적 광산란으로 측정했다.
PEI-AQPZ 기반 자기조립 구조물의 크기는 114 ± 20nm(80%)로, 20%는 약 147 ± 15nm으로 측정되었다. 플러스에서 제타 전위가 PEI-AQPZ 자기조립 구조물에 대해 18.4mV로 측정되어 양전하 구조를 나타내었다.
삼투물질로 0.3M NaCl에서 정지 흐름 측정으로부터 얻은 투과성 데이터는 삼투 투과성 Pf 22μ1/초 및 11 LMH/bar(L/m2/h)/bar)의 투과성에 대응하는 1605 s-1의 빠른 확산 계수 Ki를 유도한다.
PEI 기반 자기조립 구조물의 온도 안정성은 30~100℃의 다양한 온도에서 10분 동안 5mL를 워밍업하여 측정했으며, 동적 광산란 및 정지 흐름 측정으로 크기와 수분 투과율을 추가로 측정했다. 열처리 후 자기조립 구조물의 크기를 표 2에 나타내었다.
표 2. 열처리 후 PEI 자기조립 폴리머 구조를 갖는 수성 조성물 내 나노 입자의 크기 분포.
온도/℃ 모집단 1 분포/% 모집단 1 크기/nm 모집단 2 분포/% 모집단 2 크기/nm
실온 80 111±18 20 147±25
30 81 117±20 19 178±28
40 69 118±15 31 164±14
50 93 112±22 7 156±23
60 85 108±23 15 148±32
70 94 92±15 6 132±24
80 81 108±12 19 137±18
90 84 110±14 16 136±22
100 76 115±23 24 142±16
표 2에서 볼 수 있듯이 60℃ 이상에서 약 10nm 전후로 약간의 감소가 관찰되더라도 온도 노출로 성형 구조물의 크기가 영향을 받지 않는다. 이러한 감소는 여과막의 활성층 내에 혼입될 때 혼합된 나노 구조물이나 아쿠아포린 수분 통로의 기능에 영향을 미치지 않는다.
AQPZ의 존재하에서 열처리 후 형성된 나노 입자의 투과성을 흐름 정지 측정으로부터 측정했다.
표 3. 0.3M NaCl 중 조성 PEI-AQPZ의 흐름 정지 결과.
온도/℃ Ki 값/ s-1 Pf/μm/초 유수량 1mh/bar
RT 1589 21.7 10.4
30 1601 23.1 11.1
40 1679 24.4 11.7
50 1611 22.2 10.7
60 1707 22.7 10.9
70 1713 20.1 9.9
80 1589 21.2 10.1
90 1540 20.9 10.03
100 1533 21.7 10.4
이 특별한 실험에서 투과성의 관점에서 볼 때, 100℃까지 현저한 변화는 관찰되지 않았으며, 투과성과 유수량 모두 약간의 변동은 크기 변화와 상관관계가 있었다.
실시예 2. AQP9와 AQP12 PEI 나노구조물 제조 및 시험
비슷한 방식으로, PEI 기반 자기조립 구조물인 인간 아쿠아포린, 보다 구체적으로는 아쿠아포린-9 및 아쿠아포린-12를 직접 용해 방법으로 제조하였다. 첫 번째 100ml의 경우 pH 7.2의 인산염 완충액 중 5mg/ml PEI는 pH 7.2의 100mL PBS에 500mg PEI 분말을 용해하여 제조했다. 또한, 100mL 5mg/mL PEI를, 2가지 성분 혼합물의 1/800 AQP/PEI 몰비에 상응하는, 2% LDAO 내 10mg/mL Aquaporin-9의 0.15mL 및 9mg/mL Aquaporin-12의 0.17mL 정제 원액으로부터의 1.5mg과 직접 혼합했다. PEI AQP 혼합물을 1분당 170회전을 하룻밤 동안 20시간 이하(그러나 12시간 이상)로 밤새 교반했다.
다음날 교반한 후, 혼합물을 100mL 유리병에 옮기고, 실온에서 유지하고 그다음 날 측정하였다. PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 크기와 투과성은 Malvern의 ZetaSizer Nano Zs 및 Bio-Logic SFM 300을 사용한 정지 흐름을 사용하여 동적 광산란으로 측정했다.
PEI-AQP9 기반 자기조립 구조물의 크기는 모집단의 85%는 91 ± 15nm로 측정되었고, 15%는 약 325±32nm의 크기였다. 플러스에서 제타 전위가 PEI-AQPZ 자기조립 구조물에 대해 17.9mV로 측정되어 구조물의 양전하를 나타내었다.
삼투물질로서 0.3M NaCl에서 정지 흐름 측정으로부터 얻은 투과성 데이터는 빠른 확산 계수 K;1326 s-1를 유도한다.
PEI-AQP12 기반 자기조립 구조물의 크기는 모집단의 92%가 244±36nm으로 측정되었고, 8%는 약 3±2nm의 크기였다. 플러스에서 제타 전위가 PEI-AQPZ 자기조립 구조물에 대해 17.3mV로 측정되어 구조물의 양전하를 나타내었다.
삼투 물질로 0.3M NaCl에서 정지 흐름 측정으로부터 얻은 투과성 데이터는 빠른 확산 계수 K;1432 s-1를 유도한다.
실시예 3. PEI 800 b 및 1000 b 나노구조물 제조 및 시험
AQPZ를 갖는 PEI 4000 Da 자기조립 구조물과 유사한 방식으로 PEI 800 분지형 및 10000 분지형을 직접 용해 방법으로 제조하였다. 첫 번째 100ml의 경우 pH 7.2 용액의 인산염 완충액 중 5 mg/ml PEI 800 분지형 또는 10000 분지형은 pH 7.2의 100mL PBS에 500mg PEI 800 분지형 또는 10000 분지형 분말을 용해하여 제조했다. 추가로 100 mL 5mg/mL PEI를 2% LDAO의 5mg/mL AqpZ 정제 원액으로부터 0.3 mL로 1.5 mg과 직접 혼합하였는데 이는 2성분 혼합물의 1/800 AQP/PEI 몰비에 해당한다. PEI AQP 혼합물을 분당 170회전으로 밤새 20시간 이하(그러나 12시간 이상)로 밤새 교반하였다. 다음날 교반한 후, 혼합물을 100mL 유리병에 옮기고, 실온에서 유지하고 다음날 측정하였다. PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 크기와 투과성은 Malvern의 ZetaSizer Nano Zs 및 Bio-Logic SFM 300을 사용한 정지 흐름을 사용하여 동적 광산란으로 측정했다.
PEI 800 b-AQPZ 기반 자기조립 구조물의 크기는 모집단의 100%가 180±23nm로 측정되었다. 플러스에서 제타 전위는 PEI-AQP 자기조립 구조물에 대해 14mV로 측정되어 양전하 구조를 나타내었다.
삼투 물질로 0.3M NaCl에서 정지 흐름 측정으로부터 얻은 투과성 데이터는 747 s-1의 빠른 확산 계수 Ki로 유도된다. PEI 10000 b-AQPZ 기반 자기조립 구조물의 크기는 모집단 100%가 220±37nm으로 측정되었다. 플러스에서 제타 전위는 PEI-AQP 자기조립 구조물에 대해 4mV로 측정되어 양전하 구조를 나타내었다.
삼투 물질로 0.3 M NaCl에서 정지 흐름 측정에서 얻은 투과성 데이터는 1516s-1의 빠른 확산 계수 Ki로 유도된다.
PEI 기반 자기조립 구조물의 온도 안정성은 30~100℃의 다양한 온도에서 10분 동안 5mL를 워밍업하여 측정했으며, 동적 광산란 및 정지 흐름 측정으로 크기와 수분 투과율을 추가로 측정했다. PEI 600 b 기반의 AQPZ 자기조립 나노 구조물의 경우 크기는 50℃까지 변화하지 않으며 50℃에서 200nm 이상으로 증가하고 Ki 값은 100s-1 미만으로 변한다. PEI 10000 b 기반 AQPZ 자기조립 나노구조물의 경우 크기는 40℃까지 변화하지 않으며 40℃에서 150nm 이상으로 증가하고 Ki 값은 100s-1 미만으로 변화한다.
실시예 4. 형광 상관 분광법
막횡단 단백질 AQPZ의 형광 표지는 N-히드록시석신이미드 에스테르(NHS-에스테르) 짝지음 반응으로 단백질 상의 1급 아민에 대해 수행되었다. AQPZ 단백질의 N 말단은 친수성 아미노산 잔기만을 함유한다. 따라서 수상의 표지 반응에 사용할 수 있으며 막 단백질의 소수성 부분에 묻히지 않는다. 이 경우 형광 염료 Oregon Green 488(OG488)을 사용했다.
표지(참조: Itel et al., Nano. Lett., 15 (6) : 3871-3878, 2015)에 1mg AQPZ 원액을 Oregon Green 488 석신이미딜 에스테르(OG488, DMSO 중 10mg/ml) 10배 몰 과량으로 배양하고, 어두운 곳에서 3시간 동안 교반하면서 얼음 위에서 배양하였다. 미반응 염료를 2000 Da 필터를 통해 원심 분리하여 제거한 후, 표지된 AQPZ를 선형 PEI 4000 Da 자기조립 나노구조물에서 재구성하기 위해 추가로 사용하였다. 분자 휘도로부터 PEI 나노구조물 당 AQPZ 테트라머의 수는 8 ± 1로 측정되었다. 자유 단백질은 검출되지 않았다. PEI 600 b 및 10000 b의 경우, PEI 나노구조물 당 AQPZ 테트라머의 수는 4±1(PEI 600 b) 및 5±2(PEI 1000 b)로 측정되었다.
실시예 5. 원형 이색성에 의한 특성
형성된 자기조립 나노구조물의 단백질 형태는 원형 이색성(CD)에 의해 특징지어질 수 있다. CD는 2차 구조(α-헬릭스 및 β 시트)의 신속한 측정과 그 기능을 측정하는 단백질의 접힘 특성에 적합한 방법이다. CD는 분자의 CD 스펙트럼이 파장 범위에서 측정되는 분광 기술이다(Greenfield NJ, Nat Protoc. 2006; 1(6): 2876-2890). 이를 위해 실시예 1에 따라 제조된 PEI-AQPZ 계 자기조립 구조물의 액상 제제를 측정 큐벳에 넣고 CD 스펙트럼을 기록 및 분석하여 혼입된 AQPZ의 2차 구조와 그 기능을 각각 평가하였다. 도 1은 AQPZ의 PEI 자기조립 나노구조물로의 원편광 이색성 프로파일을 도시한다. AQPZ의 2차 구조; PEI 자기조립 나노구조물로 재구성된 도 1은 208nm(222/208nm 비는 1.15와 같음)과 비교하여 222nm에서 음의 타원율 띠를 도시하였으며, 대장균 총 지질에서 재구성된 시금치 아쿠아포린에 대해 보고된 것과 유사하여 단백질이 펼쳐지지 않았음을 도시했다(Hansen et al., Biochimica et Biophysica Acta 1808: 2600-2607, 2011).
실시예 6. 수제 TFC 정삼투 여과막 제조
이 막은 하기 단계에 따라 제조되었다.
a) MilliQ 물에 MPD를 용해하여 2.5%(W/W) 농도를 얻는다(아래 참조).
b) Isopar에 TMC를 용해하여 0.15%(W/V)의 최종 농도를 얻는다.
c) 직사각형 형태의 막(예: 5.5cm x 11cm Membrana 1FPH PES 막)을 약 MPD 용액 20mL/m2 막으로 덮고 부드럽게 흔들어주면서 30초 동안 그대로 둔다. 실험용 건조지(예: Kim-Wipe)로 비활성면(뒷면)을 5~10초 동안 건조한다.
e) 막을 유리판 위에 놓고 반짝이는 표면이 흐릿해질 때까지 N2로 부드럽게 건조한다.
f) 막의 가장자리에 테이프를 붙인다(
Figure pct00002
1mm).
g) 유리 또는 금속 용기 내에 테이프를 붙인 막과 함께 유리판을 놓고 한쪽 끝에 약 155mL/m2 막 TMC-Isopar를 첨가하고 부드럽게 30초 동안 앞뒤로 흔든다.
h) 유리판을 저장소에서 꺼내 N2로 10~15초 동안 건조한다. 테이프를 제거한 후 막을 새로 형성된 활성면이 위로 오게 하여 MilliQ로 옮기고 필요할 경우 후속 단계에서 취급 중에 젖게 한다.
MPD 용액 계산:
MPD 1.05g을 달아 35mL의 MilliQ에 용해한다. 상술한 바와 같이 제조한 PEI-AQPZ 조성물(3mg PEI/mL) 7mL를 첨가한다. 가능한 한 불활성 가스(Ar 또는 N2)를 용액 위에 얹는다.
그런 다음 크기가 5.5cm x 11cm인 PEI-AQPZ의 TFC 막을 Sterlitech CF042 FO 셀(www.sterlitech.com)에 장착하고 탈이온수(MilliQ)를 피드로, 1 M NaCl 수용액을 연신 및 피드로 사용하여 정삼투 모드에서 60분(5개 막) 지속 시험 및 900분(4개 막) 지속 시험을 연신 속도 268 mL/분으로 수행하였다. 재현성 높은 유수량, Jw(LMH L/m2/h), 낮은 역행 염 제거, Js(GMH = g/m2/h) 및 5 μM 칼세인 Rca %의 피드 트레이서의 매우 높은 제거로 결과를 아래 표 4에 나타내었다.
표 4
60분
Jw
(LMH) 		60분
Js
(GMH) 		60분
Js/Jw
60분
Rca(%)

900분
Jw
(LMH)
900분
Js
(GMH) 		900분
Js/Jw
900분
Rca(%)
8.58 1.46 0.17 99.86 8.22 1.67 0.20 99.78
8.61 1.81 0.21 99.84 7.86 0.62 0.08 99.79
7.93 1.75 0.22 99.85 7.55 1.47 0.19 99.8
7.94 1.61 0.20 99.81 8.05 1.38 0.17 99.88
8.19
1.47
0.18
99.88



실시예 7. 파일럿 기계로 니트로화 막 제조
파일럿 코팅기를 사용하여 PES 지지막 상에 TFC 층을 형성했다.
a) MilliQ 물에 MPD를 용해하여 2.5%(W/W) 농도를 얻어 MPD/수용액을 제조하였다.
b) 아쿠아포린/MPD/수용액은 6.25g MPD, 10mCL Composition, 240ml 탈이온수를 용해하여 제조했다.
c) TMC는 Isopar에서 0.15% W/V의 최종 농도로 용해되었다.
d) Membrana 1 FPH 지지막 롤이 기계의 권출부(unwinding unit)에 설치되었다.
e) 막은 코팅을 통해 장착했다.
f) 세정조는 탈이온수로 채웠다.
g) 코팅 공정을 0.6m/분으로 수행했다.
- 막을 언와인더로부터 펼쳤다.
- 그런 다음 풀라드(foulard) 조의 MPD/물에 담갔다.
- 표면의 물은 에어 나이프(0.5bar 공기)로 제거했다.
- 아쿠아포린/MPD/수용액을 슬롯 다이를 통해 1.2mL/분의 펌프 속도를 적용했다.
- 표면의 물을 에어 나이프를 통해 제거하여 계면 중합(0.75bar) 전에 표면에 작은 방울이 없도록 했다.
- TMC/Isopar를 4.2 mL/분의 슬롯 다이를 통해 적용하여 계면 중합을 시작했다.
- Isopar는 대기에서 막의 표면에서 건조된다.
- 남은 화학 물질은 세정조에서 제거했다.
- 코팅된 막은 활성면이 롤을 향하게 하여 말았다.
h) 코팅된 막을 최종 건조 단계를 통과하게 했다.
5개의 코팅된 막을 5.5cm x 11cm 형태로 절단한 다음 Sterlitech CF042 FO 셀에 개별적으로 끼우고, 탈이온수 공급 용액 및 1M NaCl 유도 용액에서 5 μM 칼세인으로 200분 동안 작동했다. 표준 편차와 함께 평균 결과는 표 5에 나와 있다.
표 5
Jw 총Js Js/Jw Rcalcein
[L/m2h] [g/m2h] [%]
8.72 1.94 0.22 99.81
0.95 SD 0.24 SD 0.03 SD 0.09 SD
실시예 8. 파일럿 기계로 정삼투 고플럭스 및 우수한 거부 여과막 제조
실시예 4에 기재된 것과 유사한 접근법을 사용하여, 우수한 투과 유량과 우수한 염 제거율에 각각 적합한 부직포 폴리프로필렌 배면을 갖는 2가지 유형의 미세 다공성 PES 막 상에 TFC 층을 형성시켰다. 미세 다공성 PES 막의 제1 롤을 파일럿 기계의 한 단부에 장착하고 연속적인 단계를 통해 운반하여 상단에 계면 중합 층을 생성시켰다. 막을 7mL/100mL PEI-AQP 조성물(실시예 1에 따라 제조), 3% ε-카프로락탐 및 0.1% SDS를 포함하는 수성 2% MPD 용액을 함유하는 탱크에 통과시켰다. 그런 다음 막을 압축 공기로 짧게 건조하고 Isopar 용액 중 0.20% TMC와의 반응을 위해 상단 장착 슬롯 다이를 통과시켜 활성 탑 층을 형성시켰다.
다공성 PES 막의 제2롤을 파일럿 기계의 한 단부에 장착하고 탱크를 통해 운반하여 상단에 계면 중합 층을 생성시켰다. 상기 탱크는 7ml/100ml PEI-AQP 조성물(실시예1에 따라 제조)을 포함하는 수성 2.75% MPD 용액을 함유하였다. 그런 다음 막을 압축 공기로 짧게 건조하고 Isopar 용액 내에서 0.25% TMC와의 반응을 위해 상단 장착 슬롯 다이를 통과시켜 활성 탑 층을 형성시켰다. 제조된 두 종류 막의 섹션을 5.5cm x 11cm의 직사각형 모양으로 절단한 다음 Sterlitech CF042 챔버에 장착하고 탈이온수를 피드로 및 1M NaCl 수용액을 유도로 사용하고 피드 및 유도 속도는 268 mL/분을 사용하여 PRO 모드에서 60분 동안 5회 시험을 거쳤다. 결과는 아래 표 6에 있다. 수용 가능하게 낮은 역 염분 플럭스(reverse salt flux)를 갖는 일정하게 높은 유수량이 고플럭스 막에 대해 측정되었고, 수용 가능하게 높은 유수량을 갖는 일정하게 낮은 역 염분 플럭스가 고탈염성 막에 대해 측정했다.
표 6
고유량,
Jw(LMH) 		고유량,
Js(GMH) 		높은 염 제거,
Jw(LMH) 		높은 염 제거,
Js(GMH)
12.66 5.25 7.40 0.61
14.31 2.00 8.27 0.55
14.87 6.02 7.40 0.32
12.40 3.50 6.41 0.85
13.26 4.61 8.07 0.94
실시예 9. 역삼투 저압용 수제 TFC PEI-AQPZ 여과막
a) 지지막, 예컨대 구조가 손가락 모양인 PES 부직포, 크기 5.5cm x 11cm를 제공한다.
b) 3 중량% MPD를 3 중량% ε-카프로락탐, 0.5 중량% NMP 및 93.5 중량% 탈이온수와 혼합하여 용액을 수득한다.
c) 현탁액을 얻기 위해 0.1mg/mL의 PEI-AQPZ 자기조립 나노구조물을 첨가한다.
d) C)의 현탁액을 2시간 동안 배양한다.
e) 0.09 중량% TMC, 0.9 중량% 아세톤 및 99.01 중량% Isopar로 TMC 용액을 제조한다
f) d)의 현탁액 내에서 지지막을 30초 동안 딥 코팅한다.
g) 에어 나이프로 건조한다.
h) e)의 TMC 용액을 계면 중합을 위해 추가한다.
i) 이어서 흄 후드에서 2분 건조한다.
TFC 막의 선택적 사후 처리:
4분 65℃ 10% 시트르산
2분 탈이온수
1분 5% IPA
2분 탈이온수
1분 0.1% NaOCl
2분 탈이온수
1분 0.2% NaHS03
4개의 막을 제조하여 Sterlitech CF042 역삼투 셀(www.sterlitech.com)에 넣고 500ppm NaCl을 피드로 사용하여 5bar에서 60분 동안 작동했다. 그 결과는 표 7에 있다. 역삼투 성능이 만족스럽고 재현성이 높다는 것을 알 수 있다.
표 7
시료
수
 투과성
평균 및 표준편차
(LMH/bar) 		거부(%)
평균 및 표준편차
4 8.28 ± 0.12 89.0 ± 1.40
실시예 10. 고효율 거부 여과용 수제 LbL 막
LbL 고분자 전해질 기술은 PES 막(지지 기질로) 및 PEI/PAA(폴리에틸렌이민/폴리아크릴산) 고분자 전해질 층을 기초로 하여 여과막을 제조하고 PEI에 기초한 아쿠아포린을 포함한 자기조립 나노구조물을 혼입하는데 사용할 수 있다. 막은 하기 절차에 따라 제조할 수 있다.
1단계. 대기 플라스마 처리로 부직포 지지체 상의 음전하 PES를 선택하여 제조한다.
2단계. 정전기 인력과 충전된 PES를 PEI 용액의 침지로 기질의 음전하 표면 상에 PEI를 흡착한다(실시예 1에 따라 제조된 PEI-AQPZ 기반 자기조립구조물의 PEI 제형과 유사한 농도 또는 목적하는 층의 최종 두께에 따라 다른 농도).
3단계. 표면에 강하게 흡착되지 않은 과량의 PEI 분자를 제거하기 위해 탈이온수로 기질 표면을 세척한다.
4단계. 음전하가 표면에 흡착되는 PAA 용액(PEI 농도에 해당하는 몰 농도)에 PEI로 덮인 PES를 담근다.
5단계. 과량의 PAA 분자를 제거하기 위해 PEI와 PAA로 덮인 PES 표면을 탈이온수로 세척한다.
6단계. 대상 다층 수-2에 도달할 때까지 2~5 단계를 반복한다.
7단계. PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 제형에 PAA로 덮인 PES 다층 구조물을 담근다(실시예 1에서 준비한 대로 그대로 사용).
8단계. 탈이온수로 세척한다.
9단계. PEI/아쿠아포린으로 덮인 PES 다층 구조물을 PAA 용액에 담근다.
다른 쌍의 전해질이 바람직한 경우, 유사한 절차를 막을 제조하기 위해 사용한다.
이 실시예에서, PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 제형은 사용된 폴리 양이온을 전해질 다층으로 대체하기 위한 마지막 단계에서 사용된다. 또는, PEI-AQPZ 자기조립 구조물의 제형을 사용하여 LbL 층 중 몇 개를 형성할 때 폴리 양이온을 대체할 수 있다.
실시예 11. 중공 섬유(HF) 혈액투석 모듈 코팅
2.3m2 HF 혈액투석 모듈을 위한 코팅 프로토콜은 다음 세 가지 주요 단계를 사용했다.: I. MPD-물 습윤. II. 모듈 건조. III. TMC-isopar와의 반응. 도 2에 도시된 바와 같이, 모듈 건조 단계(II 단계) 중에 모듈 내 물의 중력 운동을 제한할 수 있도록 수평으로 여기에 배치되며, 더 긴 모듈로는 물의 운동을 더 제한할 수 있다. 그러나 모듈 #74 및 #75는 단계 II 동안 수직 위치를 사용하여 코팅했다. 또한, 닫힌 쉘 연결부 대신에, 쉘 쪽이 쉘 쪽에 작은 진공을 생성하고 축적된 물을 모으는 진공 펌프(또는 연동 펌프)에 연결되었다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 쉘 쪽에 진공을 적용함으로써 섬유의 내강(lumen)이 모듈을 따라 보다 균일하게 건조된다는 것을 발견했다. 대부분의 물은 모듈에서 생성된 진공(쉘 쪽에서)에 의해 섬유의 내강에서 제거되고 건조를 위해 적용된 공기는 표면에 흡착된 물만을 제거한다. 이 원리는 수직 또는 수평 위치에서 유지되는 모듈 쉘과 독립적으로 사용될 수 있다(참고: 표 8의 성능 결과).
서로 다른 농도의 수성 MPD 용액을 시험했다(참고: 표 8). 아쿠아포린-Z의 수성 제제를 옵션 첨가제과 함께 7㎖/100㎖ PEI-AQP 조성물(실시예 1에 따라 제조)과 같은 MPD 용액에 첨가하였다(참고: 실시예 8. 또한, 서로 다른 농도의 TMC(유기 상)를 시험했다. 모든 조합이 잘 작동했다(참고: 표 8).
본원에 기술된 방법에 따른 HF 모듈의 제조에 사용되는 아쿠아포린-Z의 추가 수성 제제는 세제 가용화 아쿠아포린-을 포함한 PMOXA24-PDMS65 + PMOXA32-PDMS65 이중 블록 공중합체 블렌드로부터 형성된 소포를 포함한다. 상기 소포는 다음의 방법에 따라 제조한다.
주요 소포 형성 재료:
점성의 백색 액체로 구매하여 받은 대로 사용한 폴리(2-메틸옥사졸린)-블록-폴리(디메틸실록산) 이중 블록 공중합체 PDMS65PMOXA24(DB1).
점성의 백색 액체로 구매하여 받은 대로 사용한 폴리(2-메틸옥사졸린)-블록-폴리(디메틸실록산) 이중 블록 공중합체 PDMS65PMOXA32(DB2).
첨가제:
점성의 백색 액체로 구매하여 소수성 물질로 받은 대로 사용한 폴리(2-메틸옥사졸린)-블록-폴리(디메틸실록산)-블록- 폴리-(2-메틸 옥사 졸린) 트리 블록 공중합체 PMOXA12PDMS65PMOXA12(TB) 및 Sigma Aldrich로부터 구매하여 가교 결합제로 받은 대로 사용한 분자량 2500 Da의 비스(3-아미노프로필) 말단 폴리(디메틸실록산).
NaCl 8g, KC1 0.2g, Na2HPO4 1.44g 및 KH2PO4 0.24g을 800ml의 MiliQ 정제 H2O에 용해하고, pH를 HCL로 7.2로 조절하고, 부피를 1 L로 완료하여, 인산염 완충액 10mM(PBS)(pH 7.2, 136mM NaCl, 2.6mM KCl)을 제조했다. 또한, 세제 첨가제는 N, N-디메틸도데실아민 N-옥사이드 BioXtra(Lauryldimethylamine N-oxide) (LDAO)는 Carbosynth에서, Poloxamer PI 23은 Sigma Aldrich에서 물 내 30% 용액으로 구매했다.
점성의 백색 액체로 구매하여 소수성 물질로 받은 대로 사용한 폴리(2-메틸옥사졸린)-블록-폴리(디메틸실록산)-블록- 폴리-(2-메틸 옥사 졸린) 트리 블록 공중합체 PMOXA12PDMS65PMOXA12(TB) 및 Sigma Aldrich로부터 구매하여 가교 결합제로 받은 대로 사용한 분자량 2500 Da의 비스(3-아미노프로필) 말단 폴리(디메틸실록산).
NaCl 8g, KC1 0.2g, Na2HPO4 1.44g 및 KH2PO4 0.24g을 800ml의 MiliQ 정제 H2O에 용해하고, pH를 HCL로 7.2로 조절하고, 부피를 1 L로 완료하여, 인산염 완충액 10mM(PBS)(pH 7.2, 136mM NaCl, 2.6mM KCl)을 제조했다. 또한, 세제 첨가제는 N, N-디메틸도데실아민 N-옥사이드 BioXtra(Lauryldimethylamine N-oxide) (LDAO)는 Carbosynth에서, Poloxamer PI 23은 Sigma Aldrich에서 물 내 30% 용액으로 구매했다.
스톡 내 AqpZ 5mg/mL의 0.2% LDAO(상기 기재된 바와 같이 정제함)
제조 방법
1. 1 L PBS에 15 ML P123을 용해하여 P123 용액을 제조한다.
2. 100 ML PBS에 5g LDAO를 용해하여 PBS에 5% LDAO 용액을 제조한다.
3. 제조 용기 무게 DB1은 제조한 제형의 0.5g DB1/L의 농도에 도달한다.
4. 동일한 제조 용기 무게 DB1은 제조된 제형의 0.5g DB2/L에서 농도에 도달한다(1:1 중량비 DB1 및 DB2).
5. 동일한 제조 용기 무게에서, TB 소수성 첨가제를 첨가하여 제조된 제형의 0.12g TB/L 농도에 도달한다.
6. 2단계에서 제조된 5% LDAO를 제조된 제형 100 mL/L의 비율로 첨가한다.
7. 0.1%의 최종 농도에 도달하도록 비스(3-아미노프로필) 말단 폴리(디메틸실록산)을 첨가한다.
8. AqpZ 원액을 첨가하여 준비된 제제 5mg/L의 농도 및 1/400 단백질:폴리머 비율에 도달한다.
9. 1단계에서 제조된 폴록사머 P123 용액을 첨가하여 6단계와 8단계에서 첨가된 LDAO, 비스(3-아미노프로필) 말단 폴리(디메실록산) 및 AQPZ의 부피를 뺀 원하는 제조 제형에 도달한다.
10. 제형을 달성하기 위해 실온에서 1분당 170회전(20시간 이하)으로 밤새 혼합물을 교반한다.
11. 다음 날 아침에 1단계부터 9단계 시퀀스에서 얻어 제조된 실시예 3 제제를 가져와서, 200nm 구멍 크기의 필터로 여과하여 살균한 다음 밀폐된 병에 넣고 12개월 넘게 실온으로 보관한다.
모듈 #72 및 #73은 아쿠아포린-Z의 이 제제를 사용하여 제조했다. 성능 결과는 표 8에 나와 있다. 시험한 다른 모든 모듈은 7mL/100mL 소포 AQP 조성물을 사용하여 코팅했다.
또한, 비교적 낮은 막횡단 압력으로 인해 모세관 힘이 존재하고 물로 채워진 포어를 유지하기 때문에 물은 섬유의 포어로부터 제거될 수 없다. 이러한 모세관 힘이 존재하여 지지체로부터 수상의 완전한 제거를 방지하므로, 계면 중합은 단계 III에서 막의 표면 상에 발생하도록 허용된다. 이 방법으로 TFC 층을 코팅하면 표 8에 열거된 만족스러운 결과의 정삼투 시험이 가능했다.
형성된 HF TFC 막의 정삼투 성능은 계면 중합 공정에서 형성된 폴리아미드 층의 특성에 의해 결정되었다. 상기 층의 특성을 조정하기 위해 물 및 유기 상의 조성을 변화시켰다. 목표는 역 염분 플럭스 Js<4g/m2h 및 가능한 한 낮은 특정 역 염분 플럭스 Js/Jw를 갖는 안정된 TFC/Aquaporin Inside™ 코팅을 얻는 것이었다. 0.6㎡ 모듈 코팅에 사용된 표준 프로토콜에서 2.5% MPD와 0.15% TMC가 사용되었다. 조사한 MPD의 농도는 2.5%와 5%였다. TMC의 농도는 0.1%부터 0.5%까지 다양했다. 얻어진 TFC 막의 정삼투 성능은 표 8에 나와 있다. 표 8에 나타낸 바와 같이 TFC/Aquaporin Inside™ 코팅은 열거된 모든 막 및 다양한 농도의 MPD 및 TMC 반응물에 대해 성공적이었다. 일반적으로 MPD의 농도가 증가함에 따라, Jw는 약간의 Js 감소를 증가시키며, 이것은 층의 높은 염분 보유와 반드시 연결되는 것이 아니라 막을 통과하는 보다 큰 물의 대류 플럭스와 관련이 있다. TMC의 농도를 0.1%에서 0.15% 및 0.2%로 증가시킴으로써, Js는 의미 있는 층이 더 가교 결합되고 더 많은 염을 거부하게 한다. 또한, TMC 농도의 증가는 추가로 Js의 감소를 유도했다. 그러나 Js와 함께 Jw도 감소했다. 상기 작용은 염 거부에 대한 층 선택성의 증가 없이 층 두께의 증가를 시사한다. 비교를 위해, 2개의 모듈(#15와 #16)은 누출된 막을 초래하는 진공 인가를 사용하지 않고 코팅되었다. 건조 단계 II 동안 수직 위치를 사용하여(참고: 도 2) 또한 진공이 적용되는 한 수용 가능한 성능을 나타냈다(참고: 표 8의 모듈 # 73 및 모듈 74 데이터).
표 8
모듈
MPD(%)
TMC(%)
건조 방법
 Jw
(Lm2h) 		Js
(g/m2h) 		Js/Jw(-)
Rcal(%)
#8
2.5
0.15
수평,
진공 포함		 15.52
5.10
0.33
99.10
#9
2.5
0.15
수평,
진공 포함		 14.43
5.07
0.35
99.32
#12
5
0.15
수평,
진공 포함 		17.16
4.66
0.27
99.24
#13
5
0.15
수평,
진공 포함 		15.82
4.47
0.28
99.20
#17
2.5
0.1
수평,
진공 포함 		18.70
8.49
0.45
99.24
#18
2.5
0.1
수평,
진공 포함 		17.60
6.97
0.40
98.88
#21
2.5
0.2
수평,
진공 포함 		14.51
5.97
0.32
99.28
#22
2.5
0.2
수평,
진공 포함 		16.20
5.64
0.35
98.06
#19
2.5
0.3
수평,
진공 포함 		13.90
3.90
0.28
98.58
#20
2.5
0.3
수평,
진공 포함 		17.60
4.41
0.35
98.77
#30
2.5
0.4
수평,
진공 포함 		12.54
4.20
0.34
98.71
#32 2.5
0.5
수평,
진공 포함 		11.38
4.14
0.36
99.22
#71 2.5 0.15 수평,
진공 포함
11.65
3.11
0.27		 n.a.
#72
2.5
0.15
수평,
진공 포함
11.92
2.73
0.23 		n.a.
#73
2.5 0.15
수직,
진공 포함
15.38
6.59
0.43 		n.a.
#74
2.5
0.15
수직,
진공 포함
14.45
4.08
0.28 		n.a.
#15 2 0.05 수평,
진공 없음		 누출


#16 2.5 0.05 수평,
진공 없음 		누출
실시예 12. 자기조립 PEI/아쿠아포린-Z 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질된 섬유를 갖는 HF 모듈 세트의 저압 역삼투(LPRO) 성능 시험.
다수의 2.3m2 xevonta 저플럭스 투석기(HF 모듈)을 <B. Braun Avitum AG, Schwarzenberger Weg 73-79, 34212 Melsungen, Germany>로부터 구매하고, 이어서 본원에 기술된 바와 같이 내부 섬유 표면을 개질하도록 처리했다(참고: Https:/7www.bbraunxom/content/dam/catalog/bbraun/bbraunProductCatalog/CW_01_NEW/en- 01 / b43 / brochure-xevonta.pdf.bb-.25584796 / brochure-xevonta.pdf 및 상기 실시예 11).
개질된 모듈을 압력이 인가된 4bar의 급수로 500ppm NaCl 용액을 사용하는 저압 역삼투(LPRO, 수돗물 역삼투(TWRO)라고도 함) 작동에 사용했다.
막 시험은 500ppm NaCl로 수행된다. 이 농도를 얻기 위해 10g의 NaCl(99%)을 20L의 물에 용해한다. 15분 이상 혼합한 후 잘 제조한 용액의 전도도는 약 1100 ± 100 μS/cm이어야 한다. 도 3은 2.3m2 모듈 시험에 사용된 적용 LPRO 설정의 개략적인 설명을 도시한다. FV-유량계, P-압력계, C-전도도계.
사용된 설정의 개략적인 내용이 도 3에 도시되어 있다. 시험 구성은 랙에서 연속하여 시험하고 동일한 피드 용액에 연결된 1개 내지 최대 8개 모듈에 적용했다. 시험 전에 모든 모듈을 1시간 이상 역삼투 물(<10 μS/cm)로 세척했다. 그 후, 500ppm을 함유하는 피드 용액을 모듈마다 300~500mL/분의 유속으로 모듈에 도입하였다. 여과 압력(1 bar)은 밸브 3을 사용하여 조정하였다(도 3 참조). 그 후 시스템을 피드 용액 도입 및 새로운 압력 조정 후 적어도 1시간 동안 평형화시키고 잔류물과 투과물을 피드 저장소로 반송하고(참조: 도 3, 밸브 1 폐쇄 및 밸브 2 개방), 시료는 수집하지 않았다. 시스템의 평형화 후에, 투과물은 저장소로 재순환되지 않았지만, 밸브 2의 후속 폐쇄와 밸브 1의 개방에 의해 시료 수집이 시작되었다(도 3 참조). 시료를 수집하는 동안 수집 시간을 측정했고, 일반적으로 10에서 30초까지 다양했다. 각각의 투과물 시료의 수집된 부피는 투과물의 전도도와 함께 용적 실린더로 측정했다. 투과물 시료를 동일한 압력에서 4회 수집하였다. 이 후 압력은 2 bar로 증가하였고 투과물은 밸브 1을 닫고 밸브 2를 열어 피드로 재순환되었다(도 1 참조). 다시, 시스템을 약 1시간 동안 평형화시켰다. 절차는 1~4 bar에서 측정을 위해 반복했다. 시료 수집 시간과 부피를 측정하여 수학식 1에 따른 투과성 계수 A의 계산이 가능했다.
Figure pct00003
여기서:
A: 물 투과 계수( L/m-2h-1bar-1)
Figure pct00004
: 수집된 투과물의 부피(L)
Figure pct00005
: 투과물 수집 시간(h)
Figure pct00006
: 막횡단 압력(bar)
Figure pct00007
: 피드 삼투압(bar)
염의 공정 거부는 수학식 2에 따라 계산했다.
Figure pct00008
여기서:
RNaCl: 염의 공정 거부(-)
KF: 피드의 전도도(μS/cm)
KP: 투과물의 전도도(μS/cm)
염 투과 계수 B는 수학식 3으로부터 계산된다.
Figure pct00009
여기서:
B: 염 투과 계수 (L/m-2h-1)
RNaCl: 염의 공정 거부(-)
JW: 유수량 (L/m-2h-1)
k: 공급 측으로부터의 질량 전달 계수 (L/m-2h-1)
성능 결과는 아래의 표 9에 나와 있다. 결과는 음료수에 대해 일반적으로 인정되는 표준과 일치하여 우수한 재현성과 성능을 나타내었다.
표 9
모듈 번호 A 평균
LMH/
bar 		A std R 평균
% 		R std B 평균
LMH		 B std A/B
/bar
#42 1.19 0.18 82.99 0.41 0.86 0.07 1.39
#44 0.93 0.08 94.04 0.17 0.23 0.04 4.11
#45 0.97 0.07 88.07 0.50 0.44 0.07 2.19
#47 1.03 0.11 89.62 0.38 0.42 0.05 2.43
#48 0.79 0.06 94.12 0.08 0.19 0.03 4.18
#50 0.90 0.08 91.14 0.24 0.33 0.06 2.76
#51 0.82 0.07 92.25 0.18 0.24 0.03 3.38
실시예 13. 자기조립 PEI/아쿠아포린-Z 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질된 섬유를 갖는 HF 모듈 세트의 단일 패스 모드에서의 정삼투 시험.
앞의 예와 같이 일련의 4 HF 모듈을 준비했다. 표준 막 시험은 1M NaCl을 유도 용액으로 수행되며, 사용하기 전에 제조된 용액의 전도도는 약 92.5±1.5 mS/cm이어야 한다. 표준화된 전도도가 10μS/cm 미만인 역삼투 물은 추가 공정 없이 피드 용액으로 사용된다. 도 4는 2.3m2 모듈 시험에 사용된 적용 단일 패스 시험 방법의 개략적인 내용이다. 범례: FV- 유량계, P- 압력계, C- 전도도계.
피드 용액은 60 L/h로 모듈에 도입하고, 유도 용액은 25 L/h로 도입하였다. 유도와 피드는 역류 흐름으로 연결되었다. 피드 용액의 압력과 모든 유입구의 유도 용액을 모니터링하였다. 시험은 피드 측으로부터 평균 0.2bar의 TMP로 수행했다. 시험은 1시간 동안 수행했다. 피드 용액(여기서는 역삼투 물)과 유도 용액(1M NaCl)은 재순환되지 않았다. 대신에, 피드 용액의 농축물을 잔량 기준으로 수집했다. 등식 4에 따라 막을 통과하는 플럭스를 계산하기 위해 모듈의 피드 유출량을 계산하여 모듈 피드 유입량에서 뺐다.
Figure pct00010
여기서:
Jw: 유수량(L/m2h)
QFeed: 피드 유속(L/h)
Qconcentrate: 농축물의 유속(L/h)
A: 막 면적(m2)
농축 피드 용액의 전도도를 측정하여 수학식 5에 따라 역 염분 플럭스를 계산하였다.
Figure pct00011
여기서:
Js: 역 염분 플럭스(L/m2h)
Qconcentrate: 농축물의 유속(L/h)
A: 막 면적(m2)
k: 전도도(μS/cm)
B: 비례 계수(NaCl 1mg/L 당 0.5362 μS/cm)
모듈에 대한 흐름의 유도 용액은 유도 펌프로 제어했다. 각각의 모듈은 3회 내지 5회의 연속 시험으로 수행하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 결과는 방법의 재현성이 높고 모듈이 성능을 유지한다는 것을 보여주었다.
표 10
모듈 번호
Jw
L/m2h 		Js, 총
g/m2h 		Js/Jw
g/L
날짜
56 10.59 2.34 0.22 11.01.2017
11.10 2.26 0.20 11.01.2017
11.73 3.02 0.26 12.01.2017
57 10.72 2.81 0.26 11.01.2017
11.73 2.62 0.22 11.01.2017
12.50 3.93 0.31 12.01.2017
12.36 3.11 0.25 12.01.2017
58 11.49 3.63 0.32 11.01.2017
11.61 4.32 0.37 11.01.2017
12.64 4.80 0.38 12.01.2017
59 11.71 2.70 0.23 12.01.2017
10.65 2.79 0.26 12.01.2017
11.50 3.63 0.32 13.01.2017
11.71 3.57 0.30 13.01.2017
11.54 3.46 0.30 17.01.2017
인용문헌:
본원에 인용한 참고 문헌은 여러 가지 목적을 위해 사용할 수 있도록 그 전체를 특별히 포함한다.
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Claims (30)

  1. 폴리알킬렌이민(PAI:polyalkyleneimine)과 세제 가용화(detergent solubilized) 막관통 단백질을 포함하는 자기조립 나노구조물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PAI는 폴리에틸렌이민(PEI:polyethyleneimine)인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 PEI는 평균 분자량이 약 2,000 Da와 약 10,000 Da 사이, 예컨대 약 3,000 Da와 약 5,000 Da 사이로서 실질적으로 선형 폴리머인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막횡단 단백질은 아쿠아포린 수분 통로인 것을 특징으로 하는 자기조립 나노구조물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세제는 LDAO, OG, DDM 또는 이들의 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자기조립 나노구조물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 자기조립 나노구조물을 포함하는 액상 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    완충액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 막횡단 단백질은 아쿠아포린 수분 통로인 것을 특징으로 하는 액상 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 액상 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
    폴리알킬렌이민 용액을 세제 가용화 막관통 단백질과 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 하는 액상 조성물의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 자기조립 나노구조물을 포함하는 분리막.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 막횡단 단백질은 아쿠아포린 수분 통로인 것을 특징으로 하는 분리막.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    제1항 내지 제5항에 따른 상기 자기조립 나노구조물을 포함하는 활성층을 구비한 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리막.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 활성층은 박막 복합 층인 것을 특징으로 하는 분리막.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 활성층은 상기 층상 증착 방법에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 분리막.
  15. 막 제조 공정 중에 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 액상 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 분리막 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 박막 복합층을 제조하는 동안 상기 액상 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 상기 층상 증착 방법으로 상기 활성층을 형성하는 동안 상기 액상 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분리막을 통해 수용액을 여과하는 단계를 포함하는 순수 여과액을 제조하는 방법.
  19. 삼투압에 의한 생성 용액 농축 방법에 있어서,
    상기 방법은 생성 용액으로부터 수분을 추출하기 위해 제10항 내지 제14항 중 어느 한 한의 분리막을 이용하는 단계를 포함하는 삼투압에 의한 생성 용액 농축 방법.
  20. 압력지연삼투를 이용한 염분차 전력 생산 방법에 있어서,
    상기 방법은 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 분리막을 이용하여 정수압을 증가시키는 단계 및 상기 정수압의 증가를 염분차 전력 공급원으로 이용하는 단계를 포함하는, 압력지연삼투를 이용한 염분차 전력 생산 방법.
  21. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 자기조립 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질된 섬유를 포함하는 중공 섬유(HF) 모듈.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 선택 층은 상기 섬유의 내면 상에 박막 복합체(TFC: thin film composite) 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 중공 섬유(HF) 모듈.
  23. 보호 쉘로 둘러싸인 섬유 다발을 포함하는 중공 섬유(HF) 모듈을 제조하는 방법에 있어서,
    상기 섬유를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 자기조립 나노구조물을 포함하는 선택 층으로 개질하는 단계;
    제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 액상 조성물을 포함하는 수성 MPD 상을 상기 섬유와 접촉시키는 단계; 및
    상기 자기조립 나노구조물을 포함하는 상기 선택 층을 형성하기 위해 상기 수상을 계면 중합 반응에서 유기 TMC 상과 반응시키는 단계를 포함하는 중공 섬유(HF) 모듈을 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 방법은 상기 섬유의 루멘(lumen)을 상기 수상과 접촉시키는 단계를 포함하는 모듈 제조 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 보호 쉘은 형상이 가늘고 길며, 상기 섬유 다발은 상기 보호 쉘의 내부에 길이 방향으로 배치되는 것을 특징으로 하는 모듈 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 방법은 상기 수상의 균일한 건조를 촉진하기 위해 상기 모듈의 상기 쉘 측면에 진공을 적용하는 단계를 포함하는 모듈 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 보호 쉘은 수상 건조 단계 동안 실질적으로 수평 배향으로 유지되는 것을 특징으로 하는 모듈 제조 방법.
  28. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    정삼투를 통해 순수(pure water)를 추출하기 위한 HF 모듈의 이용.
  29. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    혈액투석, 혈액투석여과 또는 혈액여과를 통해 환자의 손실된 혈장으로부터 순수를 다시 추출하기 위한 HF 모듈의 이용.
  30. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    수원(water source)을 역삼투로 정화하기 위한 HF 모듈의 이용.
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