KR20180091348A

KR20180091348A - 상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20180091348A
Application number: KR1020170016363A
Authority: KR
Inventors: 최영현; 정진우; 권다혜; 이기원; 김기영; 김성구; 김석만; 홍수현; 박철; 황혜진
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-06
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2018-08-16
Also published as: KR102011684B1

Abstract

본 발명은 상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 일 실시예에 따른 면역증강용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 사용하는 경우 대식세포가 증가 내지 활성화 되어 면역활성을 증진시킬 수 있고, 이에 따라 면역관련 질환을 예방 또는 개선하는 효과를 낼 수 있다.

Description

상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물 및 그 제조방법{EXTRACTS OF THE MORI FOLIUM HAVING IMMUNITY ENHANCING ACTIVITY AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 상엽 추출물의 면역증진 활성을 확인하고 면역 활성 증진을 위한 조성물 및 그 제조방법은 제공하기 위한 것이다.

면역 반응은 생체 자기 방어기작 중의 하나로 감염성 질환으로부터의 보호와, 외부물질과 자신을 생리적으로 인식하여 체내에 유입된 유해 물질의 중화 또는 제거하는 현상이다. 생체의 항상성 유지를 위하여, 면역에 관여하는 기관들이 면역계를 구성하며 이들이 서로 협동하고 집합적으로 작용하여 면역반응을 일으키며, 면역반응의 이상으로 인한 면역시스템에 불균형은 각종 난치성 질환의 발병과 진행의 원인이 된다(Ghazal, P., Dickinson, P. and Smith, C. L. 2013. Early life response to infection. Curr Opin Infect Dis 26, 213-218. , Sirisinha, S. 2011. Insight into the mechanisms regulating immune homeostasis in health and disease. Asian Pac J Allergy Immunol 29, 1-14.)

면역 기능을 증강시키기 위한 목적으로는 일차적으로 대식세포의 활성화를 촉진하는 물질 및 이의 활성기작에 대한 연구들이 진행되어오고 있다. 활성화된 대식세포는 항원의 흡수 및 세포독성의 기능이 현저히 향상될 뿐 아니라 인터루킨-1(Interlukin-1)과 같은 각종 물질을 분비하여 다른 면역 세포의 활성화를 촉진함으로써 면역계 전반의 활성화를 유도하게 된다.

면역 시스템과 관련된 세포 중에서 대식세포는 거의 모든 조직에 존재하며, 면역반응에 매우 중요한 역할을 수행한다.( Kudrin A, Ray A. Cunning factor: macrophage migration inhibitory factor as a redox-regulated target. Immunol Cell Biol 2008;86:232-8., Krneta T, Gillgrass A, Ashkar AA. The influence of macrophages and the tumor microenvironment on natural killer cells. Curr Mol Med 2013;13:68-79.)

골수로부터 생산되는 대식세포(macrophage)는 크게 3가지 기능을 한다. 첫째, 대식세포는 외부로부터 들어오는 이물질을 직접 흡입하는 식작용(phagocytosis)을 하며, 둘째로 함입된 병원체를 활성산소(superoxide)를 이용하여 분해 및 제거하며, 셋째로 외부 항원을 변형시킨 후 이를 세포표면으로 표현하여 T세포로 항원을 인식하도록 하고, 궁극적으로 항체를 형성시킨다. 또한 활성화된 대식세포는 T세포, B세포를 포함한 다른 여러 세포를 자극하며 새로운 반응을 유도한다.

대식세포의 식작용은 세포막에 존재하는 수용체 단백질들을 매개로 하여 이루어진다. 수용체 단백질로는 IgG를 인지하는 Fc 수용체와 보체(complement)를 인지하는 보체 수용체가 가장 잘 알려져 있으며(Aderem A and Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophage. Annu Rev Immunol 1999;17:593-623), 세포 내에 엑틴 필라멘트를 조절하는 작은 GTPase들 또한 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Caron E and Hall A.Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science 1998;282:1717-21).

대식세포는 림포카인, 엔도톡신 또는 RNA와 같은 인터페론 유도물질을 포함하는 외부자극에 의하여 활성화된다.

활성화된 대식세포는 식작용과 종양세포 파괴기능이 항진되며, 세포의 크기가 증가하고 여러 가지의 물질을 다량 분비한다. 또한 활성화된 대식세포의 표면에는 클라스 I MHC 단백질, Mac-1 또는 Fc 수용체와 같은 표면 단백질이 증가한다.

또한 대식세포는 활성산소를 이용하여 세포 내 함입된 병원체를 분해한다. 따라서 대식세포의 활성산소 생성능이 감소 또는 소실되는 경우 심각한 면역질환이 발생될 수 있다. 뿐만 아니라 대식세포는 종양세포와 접촉하여 H₂O₂나 OH 라디칼을 분비하여 종양세포를 제거한다. 활성산소는 NADPH-옥시데이즈라는 단백질 복합체인 효소작용에 의해 생성되며, 대식세포가 활성화되면 도 1과 같이 세포내의 단백질인 Rac, p67phox, p47phox 및 p40phox이 막단백질인 Rap, p22 및 gp91 단백질들과 결합하여 활성산소를 생성시킨다(Babior BM. NADPH oxidase: anupdate. Blood 1999;93:1464-76).

또한 대식세포는 상기에 언급한 바와 같이 생체 내에서 양성적인 작용을 하지만 때로는 음성적인 작용을 하기도 한다. 즉 대식세포는 동맥혈관의 손상된 부위에 축적된 산화성 저밀도 지단백질(low density lipoprotein, LDL)을 탐식하여 거품세포로 전환되어 축적되게 된다. 거품세포들의 축적에 의하여 형성된 지질층은 평활근 세포(smooth muscle cell)의 이동을 초래하고, 이들은 단핵세포-주화성 단백질-1(monocyte-chemotactic protein-1: MCP-1)의 분비를 촉진하여 대식세포들의 소집을 증가시킨다. 거품세포들은 결국 자유 라디칼이나 산화질 단백질의 세포독성으로 인하여 지질을 방출하고, 혈관 손상 부위 내에 세포괴사 지질 핵을 형성시킨다. 이러한 과정이 반복되면서 동맥은 좁아지게 되고, 이로 인하여 혈액 응고, 심장질환 및 뇌졸증 등이 발생할 가능성이 증가되게 된다(Li AC,Glass CK. The macrophage foam cell as a target for therapeutic intervention. Nat Med 2002;8:1235-42).

이에 본 발명자들은 상엽 추출물이 면역 활성 증가에 미치는 영향을 연구하여 상엽 추출물의 대식세포에 대한 활성증가를 확인하고 이를 기초로 상기 상엽 추출물에서 면역 활성 효과를 극대화시키고 기타 부작용의 문제가 없는 조성물을 제공하기 위하여 본 발명을 완성하였다.

선행기술 1(KR 10-2005-0021026 A, 2005년 3월 7일 공개)은 장생도라지 추출물을 포함하는 면역계 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 면역계의 대식세포의 활성화를 통하여 각종 면역 관련 사이토카인의 생성을 증진하는 효과를 개시하고 있다.

선행기술 2(KR 10-2012-0092871 A, 2012년 8월 22일 공개)는 석이버섯을 이용한 세포면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 대식세포를 포함하는 세포의 면역 증진효과를 개시하고 있다.

KR 10-2005-0021026 A KR 10-2012-0092871 A

본 발명의 목적은 부작용이 없으면서도 대식세포를 증가 내지 활성화시켜 면역체계를 강화 또는 증진시키는 상엽 추출물을 제공하는 것이다. 특히, 상엽 추출물의 대식세포에 대한 활성화 효과가 극대화 되는 추출물 및 그 사용범위를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 상엽 추출물을 이용하여 제조한 식품 조성물 또는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 상엽 추출물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역증강용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.

상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나를 용매로 하여 추출되는 것일 수 있다.

상기 면역증강용 조성물은 대식세포의 활성을 촉진시키는 것일 수 있다.

상기 상엽은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하여 발효된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 면역증강용 약학 조성물은 상기 면역증강용 조성물을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 면역증강용 식품 조성물은 상기 면역증강용 조성물을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 면역증강용 조성물의 제조방법은 상엽을 건조하는 상엽 건조단계; 상기 상엽 건조단계를 거쳐 건조된 상엽을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 추출하는 상엽 추출단계; 상기 상엽 추출단계를 거친 상엽 추출물을 냉각하는 상엽 추출물 냉각단계; 상기 추출물 냉각단계를 거진 상엽 추출물을 2 내지 8배로 농축하는 상엽 추출물 농축단계; 상기 추출물 농축 단계를 거친 상엽 추출물을 1 내지 9℃에서 12 내지 48 시간 동안 정치(定置)하는 상엽 추출물 정치단계; 상기 정치단계를 거친 상엽 추출물에서 침전물을 회수하는 상엽 침전물 회수단계 및 상기 상엽 침전물 회수단계로 회수한 침전물을 건조하여 분말화 하는 상엽 추출물 분말 제조 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 면역증강용 조성물의 제조방법은 상기 상엽 건조단계 및 상엽 추출단계 사이에, 상기 상엽 건조단계를 거친 건조된 상엽에 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 접종하고, 배양하는 상엽 발효단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 면역증강용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.

본 발명에서 있어서 "면역증강용"이란 사전적 의미 외에 면역조절효과를 포함하는 것이고, 면역 조절 인자의 활성을 높여 면역 체계의 활성을 높이고 신생 혈관 생성 억제, 병원균에 대한 억지력 증가 등으로 면역 관련 질병을 예방하는 효과를 내는 것이고, 특히 대식세포의 활성을 높여 외부 병원균에 대한 방어, 사멸세포 제거 및 면역매개체의 분비 등의 효과를 내는 것으로 정의한다.

본 발명에 있어서, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 IL-1β에 의한 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, '치료'는 상기 조성물의 투여에 의해 IL-1β에 의한 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 행위를 의미한다.

본 발명에서 말하는 상엽은 뽕나무 Morus alba Linne 또는 산뽕나무 Morus bombycis Koidzumi(뽕나무과 Moraceae)의 잎이다. 일명 동상엽(冬桑葉)이라고도 한다. 잎으로 달걀모양 또는 넓은 달걀모양이고 3 내지 5개로 갈라진 것도 있으며 길이 8 내지 15cm, 너비 7 내지 13cm이다. 윗면은 황록색 또는 연한 황갈색이다. 잎 끝은 뾰족하고 아랫부분은 심장형으로 되어 있으며, 잎 가장자리는 거치가 있다. 아랫면에는 엽맥이 돌출되어 있고 작은 엽맥은 그물 모양이며 그 위에 털이 나 있다. 질은 부스러지기 쉽고 가볍다. 냄새가 거의 없고 맛은 담담하나 약간 쓰며 떫다.

상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나를 용매로 하여 추출되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “상엽 추출물”이란 상엽을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.

상기 상엽 추출물은 상엽 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수(C₁) 내지 (C₆)의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 바람직하게는 1: 3 내지 5 의 에탄올과 물의 혼합비를 가지는 혼합 용매로 용출할 수 있다. 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 12시간 내지 4일, 바람직하게는 24시간 동안 추출한 추출물 일 수 있다

여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 면역증강 효과를 나타낼 수 있는 상엽 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.

바람직하게는 상기 에탄올은 12 내지 22 중량%인 것일 수 있다. 상기 범위에 의한 추출물은 유효성분의 수득에 가장 유리할 수 있다.

상기 상엽은 뽕나무의 줄기, 뿌리, 열매 등에 비하여 대식세포의 활성을 높일 수 있으므로 면역 증가 활성 효과가 우수하다. 따라서, 바람직하게는 상엽에 대한 에탄올 추출물을 사용하는 것일 수 있다.

상기 발효에 사용하는 미생물로는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

다만 상기 범위에 의하는 경우 대식세포의 활성을 높여 우수한 면역 증강효과를 낼 수 있다.

바람직하게 상기 면역증강용 조성물은 병조희풀 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 말하는 '병조희풀'은 낙엽 관목으로 미나리아재빗과 에 속한다. 그 잎은 마주나고 3개의 작은 잎으로 구성되는 3출 겹잎이다. 작은 잎은 넓은 달걀꼴이며 3개 중 옆에 달린 2개는 작다. 잎은 위로 올라갈수록 커지는데 끝이 뾰족하고 거칠며 가장자리에 약간 붉은빛이 도는 거친 톱니가 드문드문 있으나 흔히 3개로 얕게 갈라진다.

상기 병조희풀을 사용하는 경우 상엽 추출물과 혼합되어 면역 활성을 진증시킬 수 있으며 그 향미를 높이는 효과를 가진다. 다만 상기 병조희풀은 자체의 독성이 있으므로 발효과정을 통하여 독성을 제거할 필요가 있다.

바람직하게 상기 병조희풀 추출물은 발효 추출법에 의해 제조된 병조희풀 발효 추출물인 것일 수 있다. 상기 병조희풀은 약한 독성이 있으므로 발효과정을 통하여 독성을 제거할 필요가 있다.

본 발명에서 말하는 병조희풀 발효 추출물은 쌀뜨물 100 부피부에 대하여, 1 내지 3 부피부의 당류 및 0.05 내지 0.25 부피부의 천일염을 첨가하고, 0.5 내지 2.0 부피부의 미생물액을 혼합한 혼합물에 병조희풀 분쇄물을 10 내지 30 부피비로 부피부로 침지시킨 후, 공기와 차단된 상온 분위기에서 3 내지 15일 발효시켜 수득할 수 있다.

상기 미생물은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

바람직하게 상기 면역증강용 조성물은 노간주나무 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 노간주나무는 두송(杜松)이라고도 불리우며, 측백나뭇과에 속한다. 잎은 좁고 가는 선형의 바늘잎이 한 마디에서 3개씩 돌려나는데 길이는 12 내지 20mm이고 끝이 뾰족하며 표면의 가운데에 흰색의 좁은 홈이 있다.

바람직하게 상기 노간주나무는 상기 병조희풀과 동일한 방법으로 발효된 것일 수 있다. 상기 노간주나무를 발효시키는 경우 상엽이 가지는 고유한 텁텁한 향을 제거하는 효과가 높고 향미가 증진될 수 있도록 하는 장점을 가진다.

본 발명에서 사용하는 '낭아초'는 장미과에 속한 여러해살이풀. 높이는 30~100센티미터 정도이고, 굵은 뿌리줄기에서 줄기가 나와 자라며 전체에 털이 있다. 잎은 어긋나고 깃꼴 겹잎이며 작은 잎은 5 내지 7개이다. 6 내지 8월에 노란 꽃이 총상(總狀) 꽃차례로 피고, 열매에는 가시 모양의 털이 있어 다른 것에 잘 붙는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 상엽 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 상엽 추출물은 바람직하게는 체중 1kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 바람직하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다. 본 발명의 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 식품조성물은 일반식품, 건강기능성 식품, 식품첨가제, 기능성 식품 첨가제를 포함하는 것으로 정의한다.

본 발명의 상엽 추출물을 식물조성물로 사용할 경우, 상기 상엽 추출물을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 일반 식품, 기능성 식품 또는 기능성 성분과 혼합 또는 첨가하여 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 종류는 특별한 제한은 없다. 상기 면역증강용 조성물의 첨가될 수 있는 일반식품 또는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 상엽 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 사용하는 경우 대식세포가 증가 내지 활성화 되어 면역활성을 증진시킬 수 있고, 이에 따라 면역관련 질환을 예방 또는 개선하는 효과를 낼 수 있다.

특히 본 발명의 상엽 추출물 및 그 유효범위에 의하는 경우 대식세포가 증가 내지 활성화가 극대화 될 수 있다.

본 발명에 의하는 경우 부작용 없이 면역 증진 효과를 낼 수 있으므로 면역 증진 등을 목적으로 하는 건강기능식품, 면역질환 개선을 위한 의약품 등으로 제공될 수 있다.

도 1은 WEMF 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 활성화 시험에 관한 것이다.
도 2는 WEMF 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 활성화 시험에 관한 것이다.
도 3은 RAW 264.7 대식세포에서 WEMF 처리에 따른 PEG2 및 TNF-α의 생성 증가 시험에 관한 것이다.
도 4는 RAW 264.7 대식세포에서 WEMF 처리에 따른 PEG2 및 TNF-α의 생성 증가 시험에 관한 것이다.
도 5는 RAW 264.7 대식세포에서 NO와 PGE 2 생성에 미치는 WEMF의 영향에 관한 것이다.
도 6은 RAW 264.7 대식세포에서 다양한 cytokine의 발현에 미치는 WEMF의 영향에 관한 것이다.
도 7은 RAW 264.7 대식세포에서 다양한 cytokine의 발현에 미치는 WEMF의 영향에 관한 것이다.
도 8은 WEMF의 RAW 264.7 대식세포에 대한 탐식 능력을 향상 효과에 관한 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명의 효과 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 수 있다. 이하의 실시예에서, 제1, 제2 등의 용어는 한정적인 의미가 아니라 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하는 목적으로 사용되었다. 또한, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 또는 구성요소가 존재함을 의미하는 것이고, 하나 이상의 다른 특징들 또는 구성요소가 부가될 가능성을 미리 배제하는 것은 아니다. 또한, 도면에서는 설명의 편의를 위하여 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다. 예컨대, 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 도면을 참조하여 설명할 때 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 도면부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

[ 제조예 : 상엽 추출물의 제조]

1. 상엽의 준비

뽕나무(M. alba L)의 잎인 상엽(Mori folium)은 바이오-포트 코리사사(부산, 한국)로부터 입수하였고, 동의대 한의대(부산, 한국), 생화학과의 S.H. Hong 교수에 의해서 인증받았다. 건조된 잎은 작은 조각으로 절단하고, 미세한 분말로 만든 후에, 3시간 동안 증류수(50g/500㎖)에서 가열하였다. 구체적인 방법은 본 발명에 기재된 면역증강용 조성물의 제조방법에 따라 제조하였다.

추출액은 불용성 물질을 제거하기 위해서 와트만 3호 여과지를 통하여 두 번 여과하고, 여액은 동결건조시킨 다음, 미세한 분말로 분쇄하였다. 상엽 추출물(WEMF)은 증류수로 100㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 저장액(stock solution)은 사용하기 전에 목적하는 농도로 배지에 희석하였다.

또한, 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 접종하여 5일간 발효시킨 상엽을 사용하여 상기 상엽 추출물의 제조방법과 동일하게 추출하여 발효상엽 추출물을 제조하였다.

[시약 및 항체]

세포배양을 위한 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin은 WELGENE (대구, 한국)에서 구입하였고, Escherichia coli 유래 lipopolysaccaride (LPS), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT), Griess reagent, sodium nitrite는 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA)에서 구입하였다. TNF-α 측정용 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서, PGE2 ELISA kit와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 항체는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)에서, extracellular signal-regulated kinase (ERK) 및 p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. c-Jun N-terminal kinase (JNK), phospho-JNK, phospho-ERK, phosphor-p38 MAPK 항체는 Cell Signaling (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 대식세포주 RAW 264.7은 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 구입하였고 5v% 미만의 CO₂, 37　에서 DMEM 배지에서 보관하였다.

[ 실험예 1: 상엽 추출물의 대식세포에 대한 활성증가 ]

1. RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성능 측정

Griess 시약을 사용하여 배양 상등액에서 NO의 생성능을 분석 하였다. 요약하면, 세포를 24 시간 동안 다양한 농도의 WEMF 또는 0.5 ng/ml LPS로 처리 하였다. 그 후, 상등액을 수집하고 어두운 곳에서 실온에서 10분 동안 동일한 부피의 Griess reagent와 혼합하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 측정하였다. 또한, NO의 농도를 아질산 나트륨의 공지 concen trations 의해 생성 된 표준 곡선을 참조(Lee H, Pyo MJ, Bae SK, Heo Y, Kim CG, Kang C, et al. Improved therapeutic profiles of PLA2-free bee venom prepared by ultrafiltration method. Toxicol Res 2015;31:33-40.)하여 산출 하였다. 한편, 신선한 배지를 모든 실험에서 블랭크로서 사용 하였다.

2. RAW 264.7 대식세포에서 PGE -2, TNF -α and IL- 1β 생성능 측정

PGE-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-10의 생산을 측정하기 위해, 세포를 위 NO 측정 분석과 같은 조건으로 배양하였다. PGE-2, TNF-α, IL-1β, IL-10의 생성능은 제조업체의 지침(Wang L, Xu ML, Liu J, Wang Y, Hu JH, Wang MH. Sonchus asper extract inhibits LPS-induced oxidative stress and pro-inflammatory cytokine production in RAW264.7 macrophages. Nutr Res Pract 2015;9:579-85)에 따라 선택적 ELISA 키트로 측정 하였다.

3. RNA의 분리 및 역전사 중합효소의 연쇄 반응(RT- PCR )

RNA는 제조업체의 지침에 따라 TRIzol reagent를 사용하여 배양세포로부터 분리 한 후 cDNA를 생성하기 위해 M-MLV 역전사 키트를 사용하여 역전사를 진행하였다. 또한 PCR을 사용하여 RT-generated cDNA의 엔코딩을 진행하였다.

4. 단백질의 분리와 Western blot 분석

WEMF 처리에 따른 번역 수준에서의 유전자 발현 변화의 관찰을 위하여 준비된 세포들을 250 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 1% NP-40 와 0.1mM phenyl-methylsulfonylfluoride, protease inhibitor 등이 함유된 lysis buffer를 사용하여 용해시켰다. 분리된 단백질들의 농도를 측정한 후, Western blot analysis를 위해 동량의 단백질들을 sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis를 이용하여 분리하고 nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA)으로 전이시켰다. 각각의 membrane을 적정 항체 및 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Corp. Arlington Heights, IL, USA) 용액을 이용하여 단백질들의 발현 변화를 조사하였다.

5. 면역 형광 측정

RAW 264.7 세포의 탐식 능력은 제조업체의 지침에 따라 Phagocytosis Assay Kit (IgG-FITC) (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, USA)를 사용하여 검출하였다. 한편 phagocytosis의 범위는 620nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정 하였다.

6. 통계처리

모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)을 이용하여 Student t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

[실험결과 1: 상엽 추출물의 대식세포에 대한 활성증가 ]

1. WEMF 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 활성화

LPS는 그람 음성 박테리아의 세포 외막에 존재함으로써, iNOS, COX-2, macrophage-related cytokines와 같은 유전자의 전사를 자극하는 세포 신호 전달 경로의 활성화를 통하여 대식세포를 활성화시킨다(Ivashkiv LB. Inflammatory signaling in macrophages: transitions from acute to tolerant and alternative activation states. Eur J Immunol 2011;41:2477-481., Morris MC, Gilliam EA, Li L. Innate immune programing by endotoxin and its pathological consequences. Front Immunol 2015;5:680.).

이에 LPS를 양성 물질(positive substance)로 사용하여 대시세포를 활성화 시키고, WEMF에 의한 RAW 264.7 대식세포 활성화 여부의 조사를 위한 실험 조건 설정을 위하여 다양한 농도의 WEMF가 함유된 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포를 대상으로 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 도 1의 결과에서 알 수 있듯이, WEMF를 처리한 범위 특히 0.5 내지 2.0 ng/ml의 범위에서 세포독성이 없다는 것을 확인하였다. 한편, WEMF은 세포독성 없을 뿐만 아니라 도 2를 참조하면, WEMF가 대식세포의 활성화에 기여한다는 것을 확인할 수 있다.

2. RAW 264.7 대식세포에서 WEMF 처리에 따른 PEG2 및 TNF -α의 생성 증가

대식세포의 활성화에는 다양한 세포 내 신호전달계가 관여하고 있음은 여러 선행 연구에서 확인되었으며, 이들 신호계의 제어 현상에 대한 이해는 대식세포 활성 촉진 물질의 발굴 및 그들의 세포 내 역할에 대한 많은 정보를 제공하여 준다. 이러한 세포 내 신호전달계 중, MAPKs는 대식세포 활성을 포함한 세포 활성물질의 생성 및 다양한 생물학적기능을 조절하며(Rao, K. M. 2001. MAP kinase activation in macrophages. J Leukoc Biol 69, 3-10., Schorey, J. S. and Cooper, A. M. 2003. Macrophage signalling upon mycobacterial infection: the MAP kinases lead the way. Cell Microbiol 5, 133-142.), 세포의 증식 및 성장에 관여한다고 알려진 phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/Akt 경로 역시 대식세포의 활성에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ha, T., Liu, L., Kelley, J., Kao, R., Williams, D. and Li, C. 2011. Toll-like receptors: new players in myocardial ischemia/reperfusion injury. Antioxid Redox Signal 15, 1875-1893., Ha, T., Liu, L., Kelley, J., Kao, R., Williams, D. and Li, C. 2011. Toll-like receptors: new players in myocardial ischemia/reperfusion injury. Antioxid Redox Signal 15, 1875-1893.)

대식세포가 다양한 조직에 존재하고 염증성 자극을 포함한 인자들에 대한 생체방어 기능을 한다는 점에서 이러한 인자들에 의하여 활성화된 대식세포는 PEG2와 같은 염증성 매개인자나 TNF-α를 포함하는 cytokine의 생성을 촉진한다(Guslandi, M. 1998. Nitric oxide and inflammatory bowel diseases. Eur J Clin Invest 28, 904-907., Ritchlin, C. T., Haas-Smith, S. A., Li, P., Hicks, D. G. and Schwarz, E. M. 2003. Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest 111, 821-831.). 따라서 상기에서 WEMF 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 형태적 변화가 대식세포 활성화와 직접 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 PEG2 및 TNF-α의 생성에 미치는 WEMF의 영향을 조사하였다. 도 3 및 도 4의 결과에서 알 수 있듯이 LPS 처리군과 비교하여 WEMF의 처리에 따라 RAW 264.7 대식세포의 PEG2의 생성이 유의적으로 증가하였음을 알 수 있었으며, TNF-α의 생성 또한 WEMF의 처리 농도 의존적으로 증가된다는 것을 확인할 수 있다.

3. RAW 264.7 대식세포에서 NO와 PGE 2 생성에 미치는 WEMF의 영향

WEMF에 의해 NO와 PGE 2 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 적용하여, iNOS 및 COX-2의 발현의 조절과 관련이 있는지 여부를 조사 하였다.

그 결과 도 5를 참조하면, WEMF가 효과적으로 WEMF가 코딩하는 유전자의 발현을 유도하여 NO와 PGE-2의 생성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

4. RAW 264.7 대식세포에서 다양한 cytokine의 발현에 미치는 WEMF의 영향

한편 다양한 종류의 cytokine이 대식세포의 활성화에 관여하며, cytokine의 종류에 따라 다양한 면역반응을 매개함으로서 대식세포의 운명도 달라진다. 그러나 대식세포의 활성과 면역체계에 연관된 cytokine 신호체계 기전은 여전히 많은 부분이 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 WEMF가 함유된 배지에서 배양된 RAW 264.7 세포에서 분비되는 cytokine에 대한 기초 정보를 확립하기 위하여 cytokine array를 실시하였으며, 이를 LPS 처리군과 비교하였다.

도 6을 참조하면, TNF-α 및 IL (IL-1β, IL-6 및 IL-10)의 분비는 WEMF 및 LPS 처리 후 유의하게 증가되었다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 2.0 mg/ml WFRG 및 LPS 자극 세포의 배지에서 TNF-α의 농도는 각각 미처리 대조군 세포의 것보다 약 9.5배, 7.5 배 더 높았다. 또한 도 7를 참조하면, 사이토 카인 생산에서 얻어진 결과와 일치하게 TNF-α 및 IL의 mRNA 및 단백질 수준도 WEMF 처리 농도에 의존적으로 증가되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 WEMF가 RAW 264.7 세포에서 전사 및 번역 수준에서 사이토 카인 생산을 양적으로 조절한다는 것을 의미하는 것으로 볼 수 있다.

5. WEMF의 RAW 264.7 대식세포에 대한 탐식 능력을 향상 효과

식균 작용은 다양한 종류의 항균 및 세포 독성 반응을 일으키는 대 식세포의 주요 기능이므로(Schultze JL, Schmidt SV. Molecular features of macrophage activation. Semin Immunol 2015;27:416-23., McCabe A, MacNamara KC. Macrophages: Key regulators of steady-state and demand-adapted hematopoiesis. Exp Hematol 2016;44:213-22.) 우리는 대 식세포 식균 작용에 대한 WEMF의 영향을 조사하였다.

하기의 도 8을 참조하면, WEMF를 처리한 경우 RAW 264.7 대식세포의 식세포 성질이 극적으로 활성화 된다는 것을 알 수 있다.

[ 실험예 2: 복합추출물의 제조]

상기 상엽 추출물 A 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)로 발효시킨 발효 상엽 추출물 B를 제조하였다.

또한 이를 쌀뜨물로 발효시킨 노간주나무에 대한 열수추출물(추출물 C), 이를 쌀뜨물로 발효시킨 병조희풀에 대한 열수추출물(추출물 D), 낭아초 열수추출물(추출물 E), 녹두에 대한 열수추출물(추출물 F)를 제조하였다.

이후 상기 추출물을 하기의 [표 1]에 따라 혼합하여 실시예를 제조하였다.

	A	B	C	D	E	F
T1	500	-	-	-	-	-
T2		500	-	-	-	-
T3		500	500	-	-	-
T4	-	500	-	500	-	-
T5	-	500	250	250	-	-
T6	-	500	100	400	-	-
T7	-	500	400	100	-	-
T8	-	500	300	100	100	-
T9	-	500	300	100	-	100
T10	-	500	300	100	50	50

(단위: 중량부)

[실험결과 2: 복합추출물의 관능성 평가]

위 복합추출물 T1 내지 T10을 음료로 제조하고, 성인남녀 20인에 대한 관능성 평가를 수행하였다. 관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 [표 2]에 나타내었다.(하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다)

	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9	T10
향	2	2	4	4	7	6	9	9	9	10
맛	3	2	2	3	4	5	5	7	7	9
기호성	2.5	2	3	3.5	5.5	5.5	7	8	8	9.5

(단위: 지수)

상기 표 2를 참조하면, 상엽 추출물은 텁텁한 맛이 있고 기호성 있는 향이 나지 않는다. 발효에 의하는 경우 세포독성이 저감되는 장점이 있으나 향미가 높아지는 것은 아니라는 것을 확인할 수 있다.

또한 상기 발효된 상엽에 대한 향은 발효된 병조희풀만으로는 제거되지 않았고, 발효된 노간주나무 열수추출물을 함께 사용하는 경우 거의 나지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 낭아초 및 녹두 추출물을 사용하는 경우 음료의 풍미가 높아지면서 높은 기호성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 복합 추출물에 의하는 경우 상엽 추출물을 포함하여 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선 효과를 낼 수 있으면서도, 기호성이 높아 보급하기 용이한 식품 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다.

또한, 설명한 본 발명의 상세한 설명에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자 또는 해당 기술분야에 통상의 지식을 갖는 자라면 후술할 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 기술 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 기술적 범위는 명세서의 상세한 설명에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니라 특허청구범위에 의해 정하여져야만 할 것이다.

Claims

상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는
면역증강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나를 용매로 하여 추출되는
면역증강용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 면역증강용 조성물은 대식세포의 활성을 촉진시키는 것인
면역증강용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 상엽은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하여 발효된 것인
면역증강용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역증강용 조성물을 포함하는
면역증강용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 면역증강용 조성물을 포함하는
면역증강용 식품 조성물.
상엽을 건조하는 상엽 건조단계;
상기 상엽 건조단계를 거쳐 건조된 상엽을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용하여 추출하는 상엽 추출단계;
상기 상엽 추출단계를 거친 상엽 추출물을 냉각하는 상엽 추출물 냉각단계;
상기 추출물 냉각단계를 거진 상엽 추출물을 2 내지 8배로 농축하는 상엽 추출물 농축단계;
상기 추출물 농축 단계를 거친 상엽 추출물을 1 내지 9℃에서 12 내지 48 시간 동안 정치(定置)하는 상엽 추출물 정치단계;
상기 정치단계를 거친 상엽 추출물에서 침전물을 회수하는 상엽 침전물 회수단계 및
상기 상엽 침전물 회수단계로 회수한 침전물을 건조하여 분말화 하는 상엽 추출물 분말 제조 단계를 포함하는 것인
면역증강용 조성물의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 상엽 건조단계 및 상엽 추출단계 사이에,
상기 상엽 건조단계를 거친 건조된 상엽에 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 접종하고, 배양하는 상엽 발효단계를 더 포함하는 것인
면역증강용 조성물의 제조방법.