KR20120092871A

KR20120092871A - 석이버섯을 이용한 세포면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR20120092871A
Application number: KR1020110012763A
Authority: KR
Inventors: 한상배; 김형숙; 김지연; 김영수; 홍진태; 김무성; 이상린
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2012-08-22

Abstract

본 발명에서는 내독소가 없어 독성 및 부작용이 없는 천연물질 유래의 세포면역 증강용 조성물을 제공하고자 석이버섯으로부터 추출한 유효한 성분인 글루칸을 추출하는 방법과 이를 이용한 세포 특히, 수지상 세포, 대식세포, 비장세포에 탁월한 면역효과를 갖는 세포면역 증강용 조성물에 관해 개시된다.

Description

석이버섯을 이용한 세포면역증강용 조성물{Composition for enhancing immuneresponse comprising extract from Umbilicaria esculenta}

본 발명은 석이버섯 추출물을 함유하는 세포면역증강용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 석이버섯으로부터 글루칸을 추출하는 방법과 추출된 글루칸을 이용한 세포면역 조성물에 관한 것이다.

최근 수십 년간, 식물, 버섯류, 조류, 및 이끼류를 포함한 식물 출처로부터 분리한 글루칸 다당류는 치료 특성이 광범위하고 독성이 비교적 낮기 때문에 생의학 분야에서 크게 주목을 받아왔다(Schepetkin 및 Quinn, 2006; Tzianabos, 2000; Wasser, 2002). 그 작용 기작은 아직 불분명하지만, 주요 기작들 중 하나는 면역계의 비특이적 활성화를 수반하는 것으로 보인다(Tzianabos, 2000). 실제로, 글루칸의 면역증강, 항암, 항 감염 및 다른 치료 효과는 대식세포 및 수지상 세포(DC)의 기능을 포함하는 선천 면역의 조절을 통해 일어나는 것으로 생각된다(Schepetkin 및Quinn, 2006).

대부분의 글루칸은 버섯류로부터 분리되었는데, 그 예로는 표고버섯 유래의 렌티난(lentinan) (Nakano et al., 1999), 치마버섯 유래의 시조필란(schzophyllan) (Okamura et al., 1986), 운지버섯 유래의 크래스틴(krestin) (Pang et al., 1998), 잎새버섯 유래의 그리포란(grifolan) (Okazaki et al., 1995), 및 별빛균핵버섯 유래의 스크렐로글루칸(scleroglucan) (Borchers et al., 1999)이 있다. 또한, 글루칸은 이끼류로부터도 분리되었는데, 그 예로는 아이슬란드 이끼 유래의 리체난(lichenan) 및 이소리체난(isolichenan) (Freysdottir et al., 2008; Ingolfsdottir et al., 1994; Olafsdottir et al., 1999), 및 Thamnolia subuliformis 유래의 탐놀란(thamnolan) (Olafsdottir et al., 1999; Olafsdottir et al., 2003; Omarsdottir et al., 2007)이 있다. 이끼 유래 글루칸은 수지상 세포, 대식세포 및 비장 세포의 면역 기능을 촉진했다(Freysdottir et al., 2008; Omarsdottir et al., 2007). 본 발명에서, 우리는 한국, 일본 및 중국을 포함한 극동 국가에서 식품 또는 약물에 전통적으로 사용되어온 식용 이끼인 석이 버섯(Umbilicaria esculenta)에서 분리한 글루칸의 면역조절 활성을 연구했다(Kim 및 Lee, 2006). 석이 버섯의 추출물 또는 제형은 혈전증(Kim 및 Lee, 2006), 멜라닌형성(Kim 및 Cho, 2007), 및 글루코시다제(Lee 및 Kim, 2000)의 억제 활성을 나타냈다. 이들 예의 하나로 공개특허 제10-2010-108864호에서는 석이버섯 가수분해 효소 추출물을 함유하는 황산화 조성물을 공개하고 있으나, 항산화 조성물에 관한것이고 본 발명에서와는 다른 추출방법을 공개하고 있다. 따라서, 석이버섯에서 분리한 글루칸의 면역조절 활성은 아직 보고되지 않았다. 본 발명자들은 특히 수지상 세포의 기능에 초점을 두면서 석이버섯으로부터 분리한 글루칸의 면역조절 활성을 연구했다.

본 발명은 따라서, 석이버섯으로부터 유효한 성분인 글루칸을 추출하는 방법과 이를 이용한 세포면역 증강용 조성물을 제공함에 그 목적이 있다.

이에 본 발명자들은 내독소가 없어 독성 및 부작용이 없는 천연물질 유래의 세포면역 증강용 조성물을 제공하고자 연구한 결과 석이버섯으로부터 추출한 글루칸을 실험을 통해 세포, 특히 수지상 세포, 대식세포, 비장세포에 탁월한 면역효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은;

석이버섯을 분말화 한 후 탈지하는 단계(S1);

상기단계(S1) 후 원심분리하고 잔류물을 추출하는 단계(S2);

추출물을 감압농축하고 에탄올을 첨가하여 침전시키는 단계(S3);

침전물을 원심분리하여 세척하는 단계(S4); 그리고,

상기단계(S4) 후 침전물을 물에 부유시키고 동결 건조하는 단계(S5)를 포함하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법을 제공한다.

상기단계(S1)에서의 탈지는 시료의 5배수 디클로로메탄을 가하여 12시간 탈지 후 여과하는데 1회 이상 행함이 바람직하고, 단계(S2)에서의 잔류물 추출은 약 80~100℃의 온수를 이용함이 바람직하며, 매회 1회 이상씩 연속 추출할 수도 있다.

상기 온도범위는 세포간 및 세포벽의 해당 용해성 글루칸류가 잘 용출되기 때문이고, 80℃ 이하에서는 용출이 잘 되지 않고, 100℃ 이상에서는 갈변과 함께 불순물 용출이 많아진다.

또한 상기단계(S3)에서의 에탄올 첨가는 얻어진 다당류에 1~3배 체적의 에탄올을 첨가함이 바람직한데, 1배수 이하에서는 해당 글루칸류 다당의 침전이 잘 일어나지 않고, 3배수 이상에서는 해당 글루칸류 이외의 성분 및 저분자 불순물들도 같이 침전되기 때문이다. 따라서 상기 범위가 최적의 해당 글루칸류를 회수하기 위한 첨가범위이다.

또한 상기단계(S4)에서의 세척은 에탄올로 1회 이상 행함이 바람직하다.

본 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 추출되는 글루칸을 제공하며, 또한 상기와 같이 석이버섯으로부터 추출된 글루칸을 유효성분으로 함유하는 세포면역 증강용 조성물을 제공한다. 상기에서의 세포는 수지상 세포, 대식세포, 비장세포 중 1종 이상일 수도 있다.

본 발명에 의하면 식용할 수 있는 석이버섯으로부터 500㎍/㎖ 글루칸 까지의 농도에서는 내독소가 없었고, 추출된 글루칸의 직접적인 효과를 조사한 바 글루칸이 수지상 세포, 대식세포 및 비장세포를 활성화 했다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법과 이로부터 추출되는 글루칸은 면역증강용 조성물 및 약제제로서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 UE의 세포형 선택성의 그래프로서, A는 RAW 264.7 대식세포를 24시간 동안 UE로 처리하고 NO 생성을 측정한 것이고, B는 비장세포를 UE로 72시간 동안 처리하고 림프구 증식을 측정한 것이며, C는 미성숙 수지상 세포를 UE로 24시간 동안 처리하고 MHC-I 발현 수준을 측정한 것이다. LPS (1㎍/㎖)를 수지상 세포, RAW 264.7 세포 및 B 세포의 일반적인활성화 인자로서 사용했다. 유의성은 화학적으로 처리하지 않은 대조구(UN)에 대하여 ANOVA 테스트를 이용하여 결정했다(* p<0.01).
도 2는 UE에 의한 수지상 세포의 표현형 성숙 그래프로서, 미성숙 수지상 세포를 LPS (1g/ml) 또는 UE로 처리했다. 24시간 동안 배양 후, 수지상 세포를 MHC-II (A), CD40 (B), CD80 (C) 및 CD86 (D)에 대한 PE-접합 CD11c Ab 및 FITC-접합 Abs로 염색한 것이다. CD11c-PE를 이용하여 살아있는 수지상 세포를 측정했다. 결과는 평균 STD로 나타낸다. 또 다른 실험에서, UE 또는 LPS를 1,000units/ml의 PMB으로 2시간 동안 처리하거나 미처리 상태로 방치한 다음, 미성숙 수지상 세포와 함께 배양했다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PE-접합 CD11c Ab 및 FITC-접합 MHC-II Ab (E)로 염색했다. 세 번의 분리된 실험의 평균 형광 세기(MFI)가 도시되어 있다. 유의성은 화학적으로 처리하지 않은 대조구 (UN) (* p<0.01) 및 PMB로 처리한 군 (# p<0.01)에 대하여 ANOVA 테스트를 이용하여 결정했다.
도 3은 수지상 세포의 시토카인 유전자 발현에 대한 UE의 효과를 나타낸 것으로, A는 미성숙 수지상 세포를 LPS 또는 UE로 4시간 동안 활성화한 다음, 전체 RNA를 분리하고, RT-PCR을 실시하여 IL-12, IL-1β, TNF-α 및 IFN-α/β의 유전자 발현 수준을 조사한 것이고, B는 미성숙 수지상 세포를 LPS 또는 UE로 24시간 동안 활성화한 다음, 0.7㎎/㎖의 덱스트란-FITC로 37℃에서 1시간 동안 처리했다. 세척한 후, 수지상 세포를 PE-접합 항-CD11c Ab로 염색하고, 이중 염색된 수지상 세포를 유세포 분석법으로 분석한 그래프이다. 병행 실험을 4℃에서 실시하여 FITC-덱스트란의 비특이적 결합을 확인했다. 세 번의 분리된 실험의 평균 형광 세기(MFI)가 도시되어 있다. 유의성은 화학적으로 처리하지 않은 대조구(UN)에 대하여 ANOVA 테스트를 이용하여 결정했다(* p<0.01).
도 4는 UE로 처리한 수지상 세포를 이용한 T 세포의 Allo-자극을 나타낸 그래프. 미성숙 수지상 세포를 LPS 또는 UE로 24시간 동안 활성화하고, 40g/㎖ 미토마이신 C(MMC)로 1시간 동안 처리하여 증식을 방지했다. MMC로 처리한 수지상 세포 (300~10,000개)를 웰당 1 x 105 개의 T 세포에 첨가했다. 3일(A) 및 5일(B) 동안 배양한 후, 혼합 세포 집단을 [3H]-티미딘으로 표지하고 자동 세포 수집기를 이용하여 수집했다.
도 5는 MAPK 신호전달에 대한 UE의 효과 시그널. 2ng/㎖의 GM-CSF로 마우스의 BM 세포를 8일간 처리하여 상기 세포로부터 iDCs를 생성한 다음, LPS (1 μg/ml) 또는 UE로 15분 동안 활성화했다. 전체 세포 추출물을 분리하고 항-인산화-ERK, -JNK 및 -p38 항체로 블러팅했다.
도 6은 NF-κB 신호전달에 대한 UE의 효과 시그널. 마우스의 BM 세포를 2ng/㎖의 GM-CSF로 8일간 처리하여 상기 세포로부터 iDCs를 생성한 다음, LPS (1 ㎍/㎖) 또는 UE로 6시간 동안 활성화하고, 핵 추출물을 항-p50 및 항-p65 항체로 블러팅했다. UN은 화학적으로 처리하지 않은 대조구이다.

이하에서는 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

이들의 실시예는 오직 본 발명을 예시하기 위한 것이지 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[재료선택]

암컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스 (6-8 주령)를 한국생명공학연구원(대한민국, 충북)으로부터 얻었다. 마우스를 12 시간 명암주기로 21~24℃ 및 40~60% 상대 습도에서 특정 병원균이 없는 조건에서 사육했다. 모든 동물들은 실험 전에 최소한 1주간 순응시켰다. 본 연구에서 사용된 실험 과정은 충북대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았다. 마우스의 CD11c, CD40, CD80, CD86 및 MHC-I/II에 대한 항체는 BD Pharmingen (San Diego, CA, USA)로부터 구입했고, ERK, p38, JNK, p65 및 p50에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입했다.

[실시예] 석이버섯으로부터 미정제 글루칸(UE)의 분리

식용 이끼인 석이버섯으로부터 UE를 추출했다. 먼저, 석이버섯을 분말로 분쇄했다. 다음에, 그 시료를 디클로로메탄을 이용하여 3회 탈지했다. 원심분리 후, 그 잔류물을 온수(100℃)를 이용하여 매회 2시간씩 2회 연속적으로 추출했다. 그 추출물을 합치고 작은 체적으로 감압 농축했다. 얻어지는 다당류에 2배 체적의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 그 침전물을 원심분리하여 회수하고 에탄올로 2회 세척했다. 다음에, 상기 침전물을 물에 부유시키고 동결건조하여 미정제 글루칸을 얻고 이를 UE라고 명명했다. UE는 70.8%의 면역증강 글루칸을 포함했다(Megazyme, Wicklow, Ireland). LAL 테스트(Catalogue number 291-53101, Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan)로 측정시 500g/㎖ UE까지의 농도에서 내독소가 검출되지 않았다.

[실험예 1] 아질산염 생성의 분석

RAW264.7 대식세포를 5 x 105 개 세포/㎖의 밀도로 도말한 다음, UE 또는 LPS를 이용하여 24시간 동안 자극했다. 분리한 상청액을 동일 체적의 Griess 시약과 합친 다음, 실온에서 10분간 정치했다. NaNO2-유래 표준 곡선에 대한 540㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 아질산염의 생성을 측정했다(Kim et al., 2010b).

[실험예 2] 림프구 증식의 분석

특정 병원균이 없는 C57BL/6 마우스(암컷, 6~7 주령)로부터 비장 세포를 얻고, 이를 용해 완충액으로 처리하여 적혈구를 제거했다. 10% 우태아 혈청(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2mM 글루타민 및 50M 2-머캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 비장 세포를 배양했다. 세포를 96-웰 평판바닥 플레이트에 웰당 2 x 105개 세포의 밀도로 접종하고, UE 또는 지질다당류(LPS)를 이용하여 자극했다(Kim et al., 2010b). 세포를 마지막 18일간 1 Ci/웰의 농도로 3H-티미딘(113 Ci/nmol, NEN, Boston, MA, USA)을 이용하여 펄스시키고, 자동 세포 수집기(Inotech, Dottikon, Switzerland)를 이용하여 3일간 수집했다. 상기 세포에 포함된 3H-티미딘의 양을 Wallac Microbeta 섬광 계수기(Wallac, Turku, Finland)를 이용하여 측정했다.

[실험예 3] 골수 유래 수지상 세포(DCs)의 생성

6~7 주령의 암컷 마우스로부터 얻은 골수(BM)로부터 수지상 세포를 생성했다(Kim et al., 2010c). 즉, 대퇴골 및 경골로부터 BM 세포를 추출하여 적혈구를 용해시킨 후, 전체 BM 세포(2 x 105 개 세포/㎖)를 2ng/㎖ GM-CSF를 함유하는 10 ㎖/dish의 완전 배지((R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 포함하는 100-mm2 배양 접시에서 배양했다. 3일째에, 2ng/㎖ GMCSF를 함유하는 또 다른 10㎖의 새로운 완전 배지를 첨가하고, 6일째에 상기 배지의 절반을 변화시켰다. 8일째에, 비부착성 및 느슨한 부착성의 수지상 세포를 강한 피펫팅을 통해 회수하여 미성숙 수지상 세포 (iDCs)로 이용했다. 상기 배지로부터 회수한 iDCs는 대부분 >85% CD11c+ 이었으나, CD3+ 및 B220+은 아니었다.

[실험예 4] 표현형 분석

수지상 세포의 표현형 성숙을 유세포 분석을 통해 분석했다(Kim et al., 2007). 세포를 FITC-접합 항-CD40, 항-CD80, 항-CD86또는 항-MHC와 PE-접합 CD11c 항체의 결합물로 염색했다. FACSCanto 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 세포를 분석하고, 그 데이터를 WinMdi 소프트웨어(Scripps, La Jolla, CA, USA)를이용하여 분석했다. 전방 및 측면 산란 파라미터를 이용하여 살아있는 세포를 측정했다. 요오드화 프로피듐(PI) 핵염색 방법을 이용하여 세포 생존율을 검사했다. 세포를 1g/㎖의 PI로 염색하고 FACSCanto 유세포 분석기를 이용하여 분석했다. PI로 염색된 세포는 죽은 세포로 간주했다.

[실험예 5] 세포내 이입의 분석

수지상 세포의 세포내 이입(endocytosis)을 분석하기 위하여, 4 x 105개의 수지상 세포를 0.7㎎/㎖ FITC-덱스트란(42,000 Da, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 세포를 차가운 세척 완충액(0.5% BSA 함유 PBS)으로 2회 세척하고 PE-접합 항-CD11c 항체를 이용하여 염색했다. 이중-염색된 수지상 세포를 유세포 분석법으로 분석했다. 4℃에서 병행 실험을 수행하여 수지상 세포에 대한 FITC-덱스트란의 비특이적 결합을 측정했다(Kim et al., 2010a).

[실험예 6] 시토카인의 분석

전체 RNA를 TRIZOLTM 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)을 이용하여 분리했다. RT-PCR을 위하여, 2g의 전체 RNA로부터 단일 가닥 cDNA를 합성했다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같았다(Kim et al., 2010a): IL-12, 센스, 5'-AGA GGT GGA CTG GAC TCC CGA-3', 안티센스, 5'-TTT GGT GCT TCA CAC TTC AG-3' TNF-, 센스, 5'-AGG TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG-3', 안티센스, 5'-AGA GAA CCT GGG AGT CAA GGT A-3' IL-1, 센스, 5'-ATG GCA ATG TTC CTG AAC TCA ACT-3', 안티센스, 5'-CAG GAC AGG TAT AGA TTC TTT CCT TT-3' IFN-, 센스, 5'-TCT GAT GCA GCA GGT GGG-3', 안티센스, 5'-AGG GCT CTC CAG AYT TCT GCT CTG-3' IFN-, 센스, 5'-CCA CAG CCC TCT CCA TCA ACT ATA AGC-3', 안티센스, 5'-AGC TCT TCA ACT GGA GAG CAG TTG AGG-3' -악틴, 센스, 5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3', 및 안티센스, 5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAACAG TCC G-3'. PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분획하고 5㎍/㎖ 브롬산 에티듐을 이용하여 염색했다. ImageJ 분석 장치(ImageJ, NIH, MD, USA)를 이용하여 밴드 영역을 분석한 후, 표적 mRNA의 발현 수준을 -악틴에 대한 상대적인 비율로서 계산했다. 배양 상청액내의 IL-2 및 IFN-의 시토카인 수준을 상업적인 면역분석 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정했다.

[실험예 7] 웨스턴 블럿

세포 파쇄물을 상기 설명된(Kim et al., 2010c) 바와 같이 제조했다. 세제 불용성 물질을 제거하고, 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분획하고 순수한 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 Tween 20 + TBS (TTBS)에 용해된 5% BSA로 1시간 동안 블로킹한 다음, 5% BSA (TTBS에 용해된)에 적절히 일차 항체와 함께 2시간 동안 배양했다. 블럿을 비오티닐화 항체와 함께 1시간 동안 배양한 다음, HRP-접합 스트렙타비딘과 함께 1시간 동안 배양했다. 강화 화학발광법(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 신호를 검출했다.

[실험예 8] 혼합 백혈구 반응(MLR)

상기 설명된(Kim et al., 2010c) 바와 같이, B220, GR-1 및 CD11c에 대한 비오티닐화 항체(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) 및 Dynabeads M-280 스트렙타비딘(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 음성 소모(negative depletion)를 통해 BALB/c 마우스의 비장으로부터 반응물 T 세포를 정제했다. 순도는 대표적으로 90% 이상이었다. C57BL/6 마우스의 BM 세포로부터 생성한 수지상 세포를 40 g/ml 미토마이신 C (MMC)를 이용하여 1시간 동안 처리했다. MMC로 처리한 300 내지 10,000개의 DC 세포를 U형 바닥부의 96-웰 플레이트에서 1 105개 T 세포(활성화: 반응 세포비 = 0.3-10)에 첨가했다. 동종이형 T 세포를 1 ㏐μCi/웰의 농도의 [3H]-티미딘(113Ci/nmol, NEN, Boston, MA, USA)을 이용하여 마지막 18시간 동안 펄스시킨 다음, 3일 및 5일째에 자동화 세포 수집기(Innotech, Dottikon, Switzerland)를 이용하여 수집했다. 상기 세포에 혼입된 [3H]-티미딘의 양을 Wallac Microbeta 섬광 계수기(Wallac, Turku, Finland)를 이용하여 측정했다.

[실험예 9] 통계학적 분석

데이터는 세 개 이상의 시료의 평균 +/- STD를 나타내고, 모든 실험은 3회 이상 수행했다. 표준 편차(STD) 및 p 값을 ANOVA (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)에 의해 측정했다.

[결과]

[UE의 세포형 선택성]

우선, 수지상 세포, 대식세포 및 비장 세포 (주로 B 및 T 세포 등)와 같은 몇 가지의 면역 세포에 대한 UE의 면역증강 활성을 조사하여 세포형 선택성을 측정했다. UE는 RAW264.7 대식세포에 의한 NO 생성(도 1A), 비장세포 증식(도 1B) 및 BM-유래 수지상 세포에서 MHC-I 발현(도 1C)을 증가시켰다. 비교를 위하여, LPS를 B 세포, 대식세포 및 수지상 세포의 일반적인 활성화 인자로서 사용했다. 이러한 결과로부터, UE는 대식세포, 비장 림프 세포 및 수지상 세포의 면역 기능을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 수지상 세포가 선천 면역 및 적응 면역을 연결하는 주요한 조절 세포였기 때문에, 후속 실험에서 우리는 수지상 세포의 성숙 및 기능에 대한 UE의 촉진 효과를 더욱 상세히 조사했다.

[UE는 수지상 세포의 표현형 성숙을 유도함]

T 세포 활성화에 관여하는 MHC-II, CD40 및 CD80/86의 발현 수준을 측정하여 표현형 성숙을 조사했다. UE는 MHC-II (도 2A), CD40 (도 2B), CD80 (도 2C) 및 CD86 (도2D)의 발현을 투여량 의존적으로 증가시켰다. UE 또는 LPS로 처리한 수지상 세포는 긴 수지상 돌기(dendrite)를 갖는 성숙 형태를 나타냈으나, 처리하지 않은 수지상 세포는 짧은 수지상 돌기를 가졌다. 유세포 분석시 전방 및 측면 산란 값을 통해 확인되는 바와 같이, 성숙 수지상 세포는 크기 및 입도가 증가했다. UE 또는 LPS는 배양 동안 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(데이터 미도시). 이러한 결과는 UE가 수지상 세포의 표현형 성숙을 유도한다는 것을 증명한다.

글루칸 연구의 분야는 글루칸 제형에서 내독소인 LPS의 존재 때문에 좌절되어 왔다. UE에서 LPS 오염의 가능성을 배제하기 위하여, 우리는 LPS의 특이적 억제제인 폴리믹신 B (PMB)를 이용하여 UE를 처리했다. PMB는 UE로 처리한 수지상 세포가 아닌 LPS로 처리한 수지상 세포에 의한 MHC-II 발현을 강력하게 억제하였다(도 2E). 이러한 결과는 UE에 LPS 오염이 없고, DC 성숙이 글루칸 특이적이라는 것을 나타낸다.

[UE는 수지상 세포의 기능적 성숙을 유도함]

시토카인의 발현은 Th1 면역 반응의 유도시 주요 인자인 수지상 세포에 의한 IL-12 유전자의 발현을 강력하게 증가시켰다(도 3A). 또한, UE는 수지상 세포에 의한 IL-1β, TNF-α및 IFN- α/β와 같은 전염증성 시토카인의 유전자 발현을 증가시켰다. 미성숙 수지상 세포는 항원을 효율적으로 포착하고 높은 수준의 세포내 이입을 나타내지만, 성숙 수지상 세포는 항원 포착능이 감소되었다. DC 세포내이입에 대한 UE의 효과를 측정하기 위하여, 수지상 세포를 덱스트란-FITC로 처리하고, UE로 처리한 수지상 세포에서의 항원 흡수가 투여량 의존적으로 감소되었음을 관찰했다(도 3B). 유사한 결과가 LPS로 처리한 수지상 세포의 경우에도 얻어졌다. 수지상 세포에 대한 덱스트란-FITC의 비특이적 결합을 배제하기 위하여 저온에서 병행 실험을 수행했다. 수지상 세포에 의한 항원 흡수는 저온에서 억제되었는데, 이는 DC 세포내 이입이 특이적이고 활성인 과정이라는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 UE가 수지상 세포의 기능적 성숙을 유도한다는 것을 증명한다.

[UE로 처리한 수지상 세포는 강화된 동종이형 T 세포 증식을 나타냄]

UE에 의한 수지상 세포의 표현형 및 성숙은 UE로 처리한 수지상 세포가 동종이형 T 세포 반응 동안 촉진 세포로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 우리는 C57BL/6 마우스 유래의 수지상 세포 (H-2b) 및 BALB/c 마우스 유래의 T 세포 (H-2d)를 이용하여 혼합 백혈구 반응을 유도했다. 3일(도 4A) 또는 5일(도 4B) 후, UE로 처리한 수지상 세포는 동종이형의 T 세포 증식을 강력하게 강화했으나, 미성숙 수지상 세포는 이러한 반응에 약하게 영향을 미쳤다. T 세포 또는 MMC로 처리한 수지상 세포는 단독으로 증식할 수 없었다. 이러한 결과는 UE로 처리한 수지상 세포가 동종이형T 세포를 촉진하여 시토카인을 증식 및 생성하기 위한 능력이 높다는 것을 나타낸다.

[UE는 MAPKs 의 인산화 및 NF-B p50/65의 핵 전좌를 유도함]

NF-B 및 MAPK를 수반하는 신호전달 경로는 DC 성숙에 주요한 역할을 한다. 따라서, 우리는 UE로 처리한 수지상 세포에서 NF-B 및 MAPK의 활성화를 조사했다. 도 5에서 도시한 바와 같이, 미성숙 수지상 세포에서 인산화 ERK, JNK 및 p38 MAPKs의 기저 수준은 낮은 반면에, MAPKs의 인산화는 LPS 또는 UE에 노출시 수지상 세포에서의 기저 수준과 비교하여 매우 감소되었으므로, MAPK 경로가 UE-유도 DC 성숙에 관여한다는 것을 알 수 있다. 대부분의 NF-B 아단위체(subunit)는 IB/에 의해 세포질에 격리되고 IB/ 분해 후 핵 내로 전좌된다. 도 6에서 도시한 바와 같이, UE는 NF-B p50 및 p65의 핵 전좌를 유도하였는데, 이는 핵의 p50/p65 단백질의 수준의 증가를 통해 입증되었다. 이러한 결과는 UE가 MAPK and NF-b 신호전달을 통해 DC 성숙을 유도했다는 것을 암시해주었다.

[분석]

석이버섯(U. esculenta)은 다량의 -1,3-글루칸(UE)을 함유하는 식용 및 의료용 이끼이고, 우리는 UE가 면역증강 활성을 갖는다는 것을 확인했다. 일반적으로, 생리적 조건에서 항종양 면역은 선천 면역 및 적응 면역 모두에 의해 조정되고, 수지상 세포, 대식세포, T 세포, B 세포 등과 같은 다양한 면역 작용 세포(immune effector cell)에 의해 주로 매개된다. 본 발명에서, 발명자들은 면역 작용 세포에 대한 UE의 직접적인 효과를 조사했고, UE가 수지상 세포 및 대식세포, 및 비장세포(주로 B 및 T 세포로 구성됨)를 활성화했다는 것을 확인했다. 수지상 세포가 항종양 면역을 유도, 조정 및 조절할 수 있는 주요한 조절 인자이기 때문에(Banchereau et al., 2000), 후속 연구에서 우리는 수지상 세포에 대한 UE의 효과를 더욱 상세하게 조사하고자 시도했다. 수지상 세포는 종양 특이적 T 세포 반응의 개시에 중요한 전문적인 항원 제시 세포이다(Banchereau et al., 2000). 수지상 세포는 강력한 항원 흡수 기능을 갖는 미성숙 세포로서 신체를 통해 산란된다. 시토카인 또는 다른 염증성 매개체를 받는 때, 수지상 세포는 배수 림프절의 T 세포 영역으로 성숙 및 이동하고, 주요 조직친화성(MHC) 및 보조자극분자(co-stimulatory molecule)를 통해 T 세포를 감작한다(Bennaceur et al., 2008). 이러한 사실은 수지상 세포가 T 세포 활성화를 개시하는데 성숙 단계가 필수적이라는 것을 암시한다. 특히, DC 성숙은 항종양 면역을 유도하는데 있어서 중요한 단계이다. 고형암은 적은 수의 수지상 세포를 함유하고, 이들 중 대부분은 미성숙 세포이다 (Bennaceur et al., 2009). 이러한 미성숙 수지상 세포는 항종양 면역 반응을 유도할 수 없다(Harding et al., 1992). 또한, 종양은 VEGF, PGE2 및 IL-10과 같은 면역억제 인자를 방출함으로써 DC 성숙 및 기능을 저해한다(Gabrilovich et al., 1996; Kusmartsev and Gabrilovich, 2006; Menetrier-Caux et al., 1998; Nefedova et al., 2004; Rabinovich et al., 2007; Shurin et al., 2001). 과거 수십 년 동안, DC 성숙을 유도하는 면역조절 인자를 찾기 위한 많은 연구가 시도되어 왔다. 특히, 식물 유래의 다당류는 DC 성숙을위한 유망한 후보로서 제안되어 왔다. 예를 들어, 목질진흙버섯(Phellinus linteus), 털주름버섯(Agaricus blazei), 구름버섯(Coriolus versicolor), 동충하초(Cordyceps militaris) 및 참당귀(Angelica gigas)로부터 분리한 글루칸 다당류는 쥐과동물의 미성숙 수지상 세포의 표현형 및 기능적 성숙을 유도하는 것으로 확인되었다(Kanazawa et al., 2004; Kim et al., 2004; Kim et al., 2005; Kim et al., 2007; Kim et al., 2006). 여기서, 우리는 석이버섯 유래의 UE가 DC 성숙의 양호한 유도인자라는 것을 입증한다.

UE로 처리한 수지상 세포에서 몇 가지 표현형 및 기능적 변화가 관찰되었다. UE는 보조자극분자 (CD40 및 CD80/86) 및 MHC-I/II의 발현을 증가시켜서, T 세포에의 항원 제시를 증가시켰다(Grewal and Flavell, 1996). 또한, UE는 수지상 세포에 의한 시토카인 생성을 증가시켰다. DC-유래의 시토카인중에서, IL-12는 Th1 세포를 활성화할 수 있는 주요한 시토카인이다. 활성화된 Th1 세포는 IFN- 및 IL-2를 활성화하여, 세포독성 T세포 및 NK 세포와 같은 종양 작용 세포를 활성화할 수 있다(Gately et al., 1998). 또한, 수지상 세포에 의해 생성된 다른 염증성 시토카인(TNF-α및 IL-1)은 내피에 의한 부착 분자를 상향 조절할 수 있고, 이러한 분자는 종양 미세환경에의 단세포 및 다른 세포 유형의 동원(recruitment)에 기여한다(Iwasaki, 2007). 이러한 결과는 UE가 수지상 세포를 활성화하고, 종양 환경에서 항종양 작용 세포의 전체 활성화를 초래했다는 것을 암시한다. UE에 의해 유도된 DC 성숙은 적어도 두 개의 중요한 신호전달 경로, 즉 MAPKs 및 NF-B/Rel를 수반할 수 있다. 수지상 세포내의 이러한 조정된 과정은 IL-12 방출 및 높은 T 세포 자극 능력을 초래하여, 보호 면역 반응의 유도를 초래한다. 다른 결과는 UE가 MAPK 및 NF-b 활성화를 통해 DC 성숙을 유도한다는 것을 나타낸다.

본 발명에서 제기된 한 가지 의문은 UE에 LPS 오염이 없는지의 여부일 수 있다. 글루칸 연구의 분야는 글루칸 제형에서 내독소인 LPS의 존재로 인해 좌절되어 왔다. 이러한 LPS 오염의 가능성을 배제하기 위해, 본 발명에서 발명자들은 두 가지 상이한 방법으로 UE 순도를 확인했다. 첫 번째, LPS의 특이적 억제제인 폴리믹신 B (PMB)를 이용하여 UE를 처리했다. PMB는 UE로 처리한 수지상 세포가 아닌 LPS로 처리한 수지상 세포를 강력하게 억제했다. 둘째, Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 검사법을 이용하여 UE내 내독소 수준을 조사하고, 500㎍/㎖ UE까지의 농도에서 내독소가 검출되지 않았다는 것을 확인했다. 이러한 결과는 UE에 LPS 오염이 없었고 DC 성숙이 β-글루칸 특이적이라는 것을 암시한다.

일반적으로, 신체의 자연 방어는 암환자의 경우에 약화된다. 종양 조직을 침투한 수지상 세포는 보조자극 분자의 발현 감소 및 불완전한 시토카인 생성을 나타내는데, 이는 종양 유래의 인자가 DC 성숙을 저해한다는 것을 암시한다(Bennaceur et al., 2008; Bennaceur et al., 2009). 종양 미세환경에서 불완전한 수지상 세포는 암 면역요법의 성공을 제한하는 중요한 면역학적 문제이다. 본 발명에서, 발명자들은 UE가 MAPK 및 NF-κB 신호전달을 통해 수지상 세포의 표현형 및 기능적 성숙을 유도할 수 있음을 확인하였는데, 이는 UE가 DC 기반 암 면역요법의 효율을 향상시킬 수 있음을 암시한다.

Claims

석이버섯으로부터 추출된 글루칸을 유효성분으로 함유하는 세포면역 증강용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 세포는 수지상 세포, 대식세포, 비장세포 중 1종 이상임을 특징으로 하는 세포면역 증강용 조성물.
석이버섯을 분말화 한 후 탈지하는 단계(S1);
상기단계(S1) 후 원심분리하고 잔류물을 추출하는 단계(S2);
추출물을 감압농축하고 에탄올을 첨가하여 침전시키는 단계(S3);
침전물을 원심분리하여 세척하는 단계(S4); 그리고,
상기단계(S4) 후 침전물을 물에 부유시키고 동결 건조하는 단계(S5)를 포함하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기단계(S1)에서의 탈지는 디클로로메탄을 이용하여 1회 이상 행함을 특징으로 하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법.
제 3 항에 있어서 상기단계(S2)에서의 잔류물 추출은 80~100℃의 온수를 이용하며, 매회 1회 이상씩 연속 추출함을 특징으로 하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기단계(S3)에서의 에탄올 첨가는 얻어진 다당류에 1~3배 체적의 에탄올을 첨가함을 특징으로 하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법.
제 3 항에 있어서 상기단계(S4)에서의 세척은 에탄올로 1회 이상 행함을 특징으로 하는, 석이버섯에서 글루칸을 추출하는 방법.
제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법으로 추출되는 글루칸.