KR20180089600A - 두나리엘라 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

두나리엘라 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두나리엘라 추출물을 포함하는 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

두나리엘라 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 조성물{A composition for preventing or treating bone diseases comprising Dunaliella extract}
본 발명은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 해양 미세조류인 두나리엘라(dunaliella) 추출물의 용도에 관한 것이다.
파골세포는 뼈가 성장하도록 하기 위하여 석회화한 연골 및 뼈조직을 녹이는 세포로서 다핵거대세포이다. 한편, 조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘형성과 같은 무기질화는 뼈의 강도를 유지시켜줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 한다. 파골세포는 조골세포에서 분비되는 RANKL(receptor activator of NF-kB ligand)와 M-CSF(macrophage colony stimulating receptor)가 파골세포 표면에 있는 수용체와 결합하게 되어 분화가 일어난다. 상기 조골세포와 파골세포의 상호작용의 균형이 깨지게 되면 전신적(systemic) 또는 국부적(local) 골 질환이 일어나며, 이런 질환은 대부분 파골세포의 수와 활성 증가가 주요 원인인 것으로 알려져 있다. 이러한 파골세포의 활성증가로 인해 야기되는 질환에는 골다공증(osteoporosis), 파제트병(Paget's disease), 치주질환, 골 성장장애, 골 전이암 및 류마티스 관절염 등이 있다. 또한, 나이든 사람에게 많이 나타나는 원활하지 못한 혈액순환으로 인하여 일시적 또는 만성적으로 산소장력(oxygen tension)이 정상 골보다 낮은 상태가 되는 현상인 저산소증(hypoxia)이 발생한 산소함량이 부족한 골에서 파골세포의 활성이 증가하여 골상태의 악화를 초래하기도 한다.
대표적인 대사성 골 질환인 골다공증은 낮은 골밀도와 뼈조직의 미세 구조상의 악화를 특징으로 하는 전신 골격 질환이며, 결과적으로 골취약성 및 골절 민감도의 증가로 이어진다. 세계보건기구(WHO) 정의에 따르면, 골다공증은 폐경 후 여성의 30%에 영향을 주며, 80세 이상의 여성 70%에 영향을 준다(J Orthop Trauma. 2008 Sep;22(8 Suppl):S59-65.). 또한, 다양한 질환의 치료에 정기적으로 사용되는 일부 약물들은, 골격에 해로운 영향을 미치거나 골다공증 질환을 유발한다. 골 흡수가 골 형성보다 더 큰 골다공증은 자연 외상성 골절의 발생 위험을 증가시키는 중요한 공중 보건 문제가 되고 있다. 이 질환은 파골세포 및/또는 조골세포의 활동을 통해서 치료될 수 있다. 따라서, 골 형성(조골세포) 촉진 및/또는 골 흡수(파골세포) 억제를 통해 작용하는 약물들은 바람직한 치료 방법이 될 수 있을 것이다.
최근에는 골다공증과 같은 파골세포에 의한 골 손상 치료에 포사맥스(Fosamax, 성분명: aledronate), 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate), 조메타(Zometa, 성분명: zoledronate) 등과 같은 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 계열의 치료제가 널리 이용되고 있다. 그러나 최근 비스포스포네이트 계열의 약제들을 복용하는 환자들에게서 턱뼈 괴사 (osteonecrosis), 중증 심방 세동， 뼈 또는 관절의 무력화, 근골격의 통증 등 다양한 부작용이 발생하는 사례가 해마다 증가하고 있다(Br J Cancer 98:1736―1740 (2008)). 또한 유방암， 전립선암 등에서 뼈로 전이된 암세포에 의해서도 파골세포의 형성이 촉진되어 심각한 골 질환들이 발생하는데 이를 치료하기 위한 약물은 개발되어 있지 않은 실정이다. 이와 같이， 기존의 비스포스포네이트 제제들의 단점을 보완하고， 독성이 없으며， 파골세포에 의한 골 흡수를 효과적으로 억제할 수 있는 약제들의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 해양 미세조류, 또는 식물성 플랑크톤은 대부분 해양 생물을 대표하며, 단세포 해양 미세조류는 카로티노이드, 지질, 다당류가 풍부한 공급원으로 알려져 왔고, 식품보충제 및 바이오연료 생산 분야에서 널리 연구되었다. 따라서, 미세조류는 식품, 사료, 천연 합성물, 또는 수경재배 분야와 바이오연료 분야에 적용될 수 있다. 호염성 미세조류인 두나리엘라(dunaliella)는 항산화 물질인 카로티노이드, 특히, 붉은색 색소를 띄는 β-카로틴 함량이 당근 대비 100배 이상으로 고농도의 염분과 강력한 자외선의 조건하에서 세포 자체의 보호 작용으로 선명한 붉은색을 띄는 녹조류이다. 일정 조건하에서 증식할 경우 고농도의 β-카로틴을 축적하며, 대량의 P-카로틴을 축적하는 능력을 가진다. 또한, 두나리엘라에는 진행성 실명의 원인을 예방 또는 치료하는 능력을 가지는 제아잔틴(zeaxanthin)도 포함하고 있다. 이에, 두나리엘라의 항암 효과(In Vivo. 2008 May-Jun;22(3):369-78.) 및 항균 효과(Immunopharmacol Immunotoxicol. 2015 Feb;37(1):81-9.) 등 많은 효능이 보고된 바 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 파골세포 형성을 억제함으로써 골손실을 감소시켜 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 발병 또는 진행을 억제할 수 있는 천연물을 찾고자 예의 노력한 결과, 해양미세조류인 두나리엘라 추출물이 파골세포의 형성 및 활성을 억제함으로써 골질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 두나리엘라(dunaliella) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 두나리엘라 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 두나리엘라(dunaliella) 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "두나리엘라(dunaliella)"는 광합성을 통해 스스로 영양분을 만들어내며 편모가 있어 운동성을 가지는 식물과 동물의 장점을 모두 가지고 있는 호염성 미세조류이다. 당근 대비 수십배 이상의 β-카로틴을 함유할 뿐만 아니라, 알파-카로틴, 크립토크산틴, 리코펜, 베타인 등이 풍부하여 강력한 항산화제로서 인체 면역역 증진, 건강한 피부 및 눈을 유지시킨다. 최근에는 항암, 항균, 항염 효과에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나, 두나리엘라의 골질환에 대한 효능은 보고된 바 없다.
상기 용어, "배양"은 미생물과 같은 생물체나 기관, 조직, 세포 등의 생물체 일부를 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 조류는 대기나 수중의 이산화탄소 및 물을 원료로 광에너지를 이용하여 유기물을 합성하고 산소를 생산하는 광합성을 통해 생장하는 생물로, 본 발명의 두나리엘라는 호염성의 해양 미세 조류이다. 따라서, 배양 조건에 일정한 농도의 염분 및 광원이 필수이며, 본 발명에 있어서 두나리엘라 배양의 염분 농도는 10 내지 30%일 수 있으며, 구체적으로는 15 내지 25%, 보다 구체적으로는 18 내지 22%, 가장 구체적으로는 19 내지 20%일 수 있다. 또한, 광원은 주로 태양광의 자연광뿐만 아니라, 형광등, 할로겐 금속 램프, LED 광원 등의 인공광을 이용할 수 있다.
본 발명의 용어, "추출물"은 상기 두나리엘라를 배양한 배양액을 추출 처리한 것을 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물, 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 두나리엘라 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 침지 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 침지 추출을 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 두나리엘라 추출물은 여과된 해수를 이용하여 배양한 배양액을 침지 추출한 후 동결건조한 형태로 제조하고, 냉장보관 한 후 실험에 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하기 위해, 상기 조성물을 필요 이상의 파골세포 형성으로 인해 발생하는 골질환에 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "골질환"은 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 골량 저하 질환을 포함한다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 열화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미하는 것으로, 이의 비제한적인 예로는 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)관련 골재흡수 질병, 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis) 및 이들이 동시다발적으로 발생하는 대사증후군 및 이들로 인하여 발생하는 질환을 들 수 있고, 구체적으로는 골다공증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 조성물은 파골세포의 분화 표지마커로 알려져 있는 NFATc1, c-Fos, TRAP, DC-STAMP, Cathepsin K 및 c-src의 발현을 효과적으로 억제하므로 골질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 용어, "치료"는 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 두나리엘라 추출물의 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 두나리엘라 추출물을 처리하고 파골세포의 형성 양상를 확인하였다. 그 결과, 두나리엘라 추출물의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 감소하였으며, 특히 10 ㎛ 이상의 농도에서는 파골세포의 분화를 현저하게 감소시켜 파골세포 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 및 2).
상기 용어, "개체"는 골질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은, 두나리엘라 추출물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 두나리엘라, 추출물, 예방 및 골질환은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 두나리엘라 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 두나리엘라 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 친환경적이며 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 골질환 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 건강기능식품은 골질환 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강기능식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 본 발명의 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 건강기능식품은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐 산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 일 예로 건강음료 조성물로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강음료 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 내지 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강음료 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 두나리엘라 추출물을 포함하는 조성물은 파골세포 분화를 억제하는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 천연물 유래의 물질로서 독성을 나타내지 않으므로, 골질환의 예방, 개선 또는 치료하기 위한 의약품 또는 건강기능식품에 적용하여 이용할 수 있다.
도 1은 두나리엘라 추출물 처리 후 분화된 파골세포의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그림이다.
도 2는 두나리엘라 추출물에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 카운팅 결과를 나타낸 그래프이다(***P<0.001 versus control).
도 3은 두나리엘라 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 두나리엘라 추출물 처리에 따른 파골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 Real-time PCR로 확인한 그래프이다(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus control).
도 5는 두나리엘라 추출물 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블랏 실험으로 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 두나리엘라 배양 및 추출물의 제조
호염성 미세조류인 두나리엘라를 배양하기 위해 해수를 사용하여 배지를 제조하였다. 구체적으로는, 질산칼륨(KNO3) 60 g, 황산제일철(FeSO4) 12 g, 황산마그네슘(MgSO4) 0.5 g, 황산망간(MnSO4) 0.5 g, EDTA 50 g을 물 1 L에 넣어 용해하여 배양 촉진액을 제조하고, 상기 제조된 배양액 1 ml를 여과된 해수 1 리터에 투입하여 배지를 제조하였으며, 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 자연광 또는 날씨에 따라 2500 lux 이상의 형광등의 인공광을 공급하였으며, 최적온도 28~30℃(15~40), 20% 이상의 염분 농도 및 대기중의 공기를 주입(2.0 L/분)한 조건에서 배양하였다.
상기 배양된 조류 배양액 중량 대비 10배의 70% 에탄올을 가하여 상온에서 침지 추출하였으며, 24시간 마다 침전물을 분리하여 3번 반복 추출하였다. 추출된 상층액은 Wattman No.2를 사용하여 감압 여과한 후, 동결건조하고 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.
실시예 2: 파골세포의 배양 및 분화
5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1cc 주사기를 이용하여 물로 세척하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 실시예 1에서 제조한 두나리엘라 추출물을 농도별(0, 1, 3, 10 및 30 ㎍/㎖)로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.
실시예 3: TRAP ( tartarate resistance acid phosphatase ) 염색 및 활성도 분석
다핵 파골세포는 실시예 1의 두나리엘라 추출물을 10분 동안 3.7% 포르말린으로 고정하고 0.1% Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액을 처리하여 붉게 염색하였다. 상기 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate)을 처리하여 37℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, RANKL에 의하여 유도된 붉게 염색된 파골세포에 두나리엘라 추출물을 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, 두나리엘라 추출물이 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 같은 골질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 세포독성 분석
포식세포는 1 x 104/well의 밀도로 96-well plate에서 두나리엘라 추출물과 M-CSF (30 ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여 두나리엘라 추출물을 농도 별(0, 1, 3, 10 및 30 ㎍/㎖)로 처리한 결과, 모든 농도에서 대조군 이상의 세포 생존률을 나타내어 세포독성이 전혀 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 5: Real-time PCR 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 NFATc1, c-Fos, TRAP, DC-STAMP, Cathepsin K 및 c-src의 양상을 확인하였다. 실험방법은 RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol(Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포 중 마커의 발현 수준을 0으로 하였을 때, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리(Vehicle)시 모든 마커들의 발현 양상이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명에 따른 두나리엘라 추출물 (30 ㎍/㎖)을 처리한 경우, 증가한 모든 파골세포 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 웨스턴 블랏 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 중 NFATc1의 단백질 발현 양상을 확인하고, 두나리엘라 추출물이 어느 경로를 경유하여 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1% deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리 (14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, NFATc1의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 두나리엘라 추출물을 처리한 결과 NFATc1의 단백질 발현이 현저하게 감소하여 아무것도 처리하지 않은 세포의 발현과 유사한 수준으로 회복시키는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 통계 분석
실험의 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 두나리엘라(dunaliella) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)관련 골재흡수 질병, 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 파골세포의 생성을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 파골세포 형성에 관여하는 전사인자의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 파골세포 형성에 관여하는 단백질의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 섬유성골이형성증(fibrous dysplasia), 페이젯병(Paget's disease), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 뼈의 종양성 파괴(neoplastic destruction), 암(cancer)관련 골재흡수 질병, 골용해(osteolysis), 골관절염(osteoarthritis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 건강기능식품.
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