KR20180080310A - 각막 장애의 치료를 위한 프로테아솜 조정 - Google Patents

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로스 엔젤레스 바이오메디칼 리서치 인스티튜트 엣 하버-유씨엘에이 메디칼 센터
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Abstract

윤부 줄기세포 결핍(LSCD)으로 인한 각막 흐림 또는 혼탁을 예방하거나 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물이 여기 개시된다. 본 발명은 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 각막 혼탁의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 각막 혼탁의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 이에 더하여, 본 발명은 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 각막 혼탁으로 고통받는 대상에게 투여함으로써 대상의 각막에서 케라틴 단백질을 감소시키는 방법을 포함한다.

Description

각막 장애의 치료를 위한 프로테아솜 조정
관련 출원의 상호 참조
이 출원은 2015년 11월 13일자 제출된 미국 임시출원 No. 62/255,338의 이익을 주장하며, 이것의 개시는 여기 참고로 포함된다.
기술분야
윤부 줄기세포 결핍(LSCD)으로 인한 각막 혼탁은 각막에 단백질 응집물의 비정상적 축적을 초래한다. 케라틴은 상피 세포에서 중간 필라멘트를 형성하는 일군의 단백질이다. 이들은 두 그룹으로 나눠지는데, 타입 I 케라틴(소형, 산성, K9-K20을 포함)과 타입 II 케라틴(대형, 중성 내지 염기성, K1-K8을 포함)이다. 이들은 보통 타입 I과 타입 II를 포함하는 쌍으로서 발견되며 고도로 조직-특이적이다. 각막 상피세포는 케라틴 K3/K12의 발현을 특징으로 하고, 결막 상피세포는 K13/K4의 발현을 특징으로 한다(Lin et al., 2010). LSCD의 경우, 각막 상피 케라틴 발현이 K12/K3에서 K13/K4 양성 세포로 이동하며, 이것은 중심 각막의 결막화를 시사한다(Bardag-Gorce et al., 2015 and Poli et al., 2015).
현재, 각막 수술이나 각막 이식 이외에 각막 혼탁에 대한 몇 가지 치료법이 있다. 유비퀴틴 26S 구성성 프로테아솜(CPR)의 기능장애는 케라틴 응집 및 축적을 야기한다고 밝혀졌고(Bardag-Gorce et al., 2004), 이는 상피세포 케라틴 클리어런스를 조절하는데 있어 CPR의 중요한 역할을 시사한다. 각막 혼탁을 예방하거나 치료하기 위한 프로테아솜 억제제 또는 프로테아솜 조정제의 사용 또는 각막에서 케라틴 단백질을 감소시키기 위한 프로테아솜 억제제 또는 프로테아솜 조정제의 사용은 본 분야에서 설명된 적이 없었다.
각막 흐림이나 혼탁을 예방하거나 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물이 여기 개시된다. 특정 구체예에서, 각막 혼탁은 윤부 줄기세포 결핍(LSCD)의 결과이다. 본 발명의 구체예는 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 각막 혼탁의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 본 발명의 구체예는 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 각막 혼탁의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 본 발명의 구체예는 각막 혼탁으로 고통받는 대상에게 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 투여하고, 그 결과 대상의 각막에서 케라틴이 감소되는 방법을 포함한다. 본 발명의 구체예는 각막 혼탁으로 고통받는 대상에게 충분한 양의 프로테아솜 조정제를 투여하고, 그 결과 대상의 각막에서 케라틴 13이 감소되는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 투여는 대상의 각막에서 케라틴 4의 감소를 가져온다.
한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 결막 단백질의 감소를 가져온다. 또 다른 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 결막 단백질 Muc5ac의 감소를 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 배상 세포(globlet cell)의 감소를 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 치료 후 72시간 넘게 CPR의 증가된 활성을 가져온다. 한 구체예에서, CPR의 증가된 활성은 치료 전 CPR의 활성과 비교하여 20%를 초과한다. 한 구체예에서, CPR의 증가된 활성은 치료 전 CPR의 활성과 비교하여 30%를 초과한다. 한 구체예에서, CPR의 증가된 활성은 치료 전 CPR의 활성과 비교하여 50%를 초과한다. 한 구체예에서, 방법은 IPR의 감소된 활성을 가져온다. 본 발명의 구체예는 대상의 각막에서 염증의 감소를 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 괴사인자 카파 B(NFκB)의 감소된 활성을 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 감소된 인터페론 감마를 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 감소된 종양 괴사인자 알파를 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 감소된 인터류킨을 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상의 각막에서 감소된 혼탁을 가져온다. 한 구체예에서, 방법은 대상에서 개선된 시력을 가져온다. 본 발명의 특정 구체예는 눈 자극, 눈 조직 또는 눈꺼풀의 발적, 눈 조직 또는 눈꺼풀의 종창, 눈 분비물, 흐린 시력 및 각막 혼탁으로 인한 시력 소실의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 후치쓰씨 이영양증, 원추각막, 과립형 이영양증, 격자상 이영양증 및 지도-점-지문 이영양증을 포함하는 각막 이영양증을 예방하거나 감소시킨다.
한 구체예에서, 대상은 각막 손상을 가지고 있었다. 한 구체예에서, 대상은 눈의 외상으로 인한 각막 손상을 가지고 있었다. 한 구체예에서, 대상은 어느 정도 수준의 눈물을 생성한다. 한 구체예에서, 대상은 쇼그렌 증후군을 가진다. 한 구체예에서, 대상은 결막염, 대상포진 또는 안부대상포진을 포함하는 눈 감염을 가지고 있었다. 한 구체예에서, 대상은 각막염으로 고통받고 있었거나 고통받고 있다. 특정 구체예에서, 대상은 눈의 염증을 가지고 있었다. 특정 구체예에서, 대상은 찰과상, 각막 조직을 손상시키는 물체, 콘택트렌즈의 사용, 자외선, 화상 흉터 또는 화학적 자극으로 인한 손상된 각막 조직을 가진다.
본 발명의 구체예는 대상에게 충분한 양의 프로테아솜 억제제 PS-341(보르테조밉/Velcade®)의 투여를 포함하는 각막 혼탁을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예는 대상에게 충분한 양의 프로테아솜 조정제의 투여를 포함하는 각막 혼탁을 치료 또는 예방하는 방법을 포함하며, 여기서 프로테아솜 조정제는 MG--132, 보르테조밉(PS-341), 디하이드로에포네마이신, 오프로조밉(ONX-0912),MLN2238, 에폭소미신, 카르필조밉(PR-171), ONX-0914(PR-957), PSI, MG-115, MG-262, AM 114, PI-1840, 키모트립신-유사(CT-L) 억제제, MLN9708, CEP-18770, 글리오톡신, 살리노스포라미드 A(NPI-0052, 마리조밉), 클라스토락타시스틴 β-락톤, 락타시스틴, Ixazomib®, 올레유로페인 또는 이들의 유도체 또는 유사체들이다.
한 구체예에서, PS-341은 24시간 내지 72시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 48시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 72시간 미만 동안 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 24시간 미만 동안 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 PS-341의 농도가 2.5 nM 내지 10 nM인 제제로서 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 PS-341의 농도가 2.5 nM인 제제로서 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 PS-341의 농도가 10 nM인 제제로서 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 PS-341의 농도가 10 nM 내지 1μM인 제제로서 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 대상의 체중 kg당 0.00125 내지 0.125 mg/mL의 용량으로 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 치료 전과 비교하여 치료 72시간 후 대상의 CPR 활성을 20% 넘게 증가시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 치료 전과 비교하여 치료 72시간 후 대상의 CPR 활성을 30% 넘게 증가시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 한 구체예에서, PS-341은 치료 전 CPR 활성과 비교하여 치료 72시간 후 대상의 CPR 활성을 60% 넘게 증가시키기에 충분한 용량으로 투여된다.
한 구체예에서, 프로테아솜 조정제는 경구 투여된다. 한 구체예에서, 프로테아솜 조정제는 국소 투여된다. 한 구체예에서, 프로테아솜 조정제는 안과용 용액, 안과용 현탁액, 안과용 연고, 안과용 에멀젼 또는 안과용 젤로서 투여된다. 한 구체예에서, 프로테아솜 조정제는 안내 투여된다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 이점들은 다음의 설명 및 첨부한 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 LSCD-유도 모델 혼탁 및 중심 각막에 PS-341의 적용을 설명하며, 이것은 중심 각막만 PS-341의 국소 적용에 노출되는 것을 보장한다.
도 2a는 정상 각막 상피(NE)에서 K13 염색을 도시한다.
도 2b는 각막 손상 후 3개월에 혼탁(DE)의 LSCD-유도 모델에서 중심 각막이 케라틴 13으로 덮힌 것을 도시한다.
도 3a는 각막 손상 후 3개월에 K13 수준이 증가된 것을 도시한다.
도 3b는 각막 손상 후 3개월에 K4 수준이 증가된 것을 도시한다.
도 3c는 각막 손상 후 3개월에 GAPDH 수준을 도시한다.
도 4는 각막의 병소 상피에서 CPR 활성이 유의하게 감소된 것을 도시한다.
도 5a는 고 용량의 PS-341로 치료된 경구 점막 상피세포에서 CPR 활성이 유의하게 감소된 것을 도시한다.
도 5b는 고 용량의 PS-341로 치료된 경구 점막 상피세포에서 K4 수준이 증가된 것을 도시한다.
도 5c는 고 용량의 PS-341로 치료된 경구 점막 상피세포에서 K13 수준이 증가된 것을 도시한다.
도 5d는 고 용량의 PS-341로 치료된 경구 점막 상피세포에서 베타-액틴 수준을 도시한다.
도 6은 저 용량의 프로테아솜 조정제 PS-341로의 세포 치료가 PS-341로의 치료 후 72시간에 프로테아솜 활성의 반등을 초래한다는 것을 도시한다.
도 7a는 2.5 nM의 PS-341로 경구 점막 상피세포(OMECS)의 치료 후 72시간에 억제인자 카파 B의 발현의 감소된 수준을 도시한다.
도 7b는 2.5 nM의 PS-341로 OMECS의 치료 후 72시간에 K13의 발현의 감소된 수준을 도시한다.
도 7c는 2.5 nM의 PS-341로 OMECS의 치료 후 72시간에 K4의 발현의 감소된 수준을 도시한다.
도 7d는 2.5 nM의 PS-341로 OMECS의 치료 후 72시간에 폴리유비퀴틴화된 단백질의 수준을 도시한다.
도 7e는 2.5 nM의 PS-341로 치료 후 72시간에 OMECS에서 포스포릴화된 ERK의 감소된 수준을 도시한다.
간단히 말해서, 아래 더 상세히 설명된 대로, 윤부 줄기세포 결핍(LSCD)으로 인한 각막 혼탁을 감소시키는데 유용한 방법 및 조성물이 여기 설명된다. 각막 흐림 또는 혼탁을 가져오는 LSC의 결핍은 전 세계 수백만 명의 사람들에게 실명을 초래한다. 각막 문제는 녹내장, 백내장, 및 나이-관련 황반변성 후 실명의 4번째 주도적인 원인이다.
본 접근법의 몇 가지 특징이 주지되어야 한다. 이 방법은 각막 손상을 가진 및/또는 각막 혼탁으로 고통받는 대상에서 각막 혼탁을 예방하거나 치료하기 위한 프로테아솜 조정제의 투여를 포함한다. 이 방법은, 예를 들어 PS-341(보르테조밉 또는 Velcade®)와 같은 프로테아솜 조정제의 투여를 포함한다. 또한, 이 방법은 PS-341의 농도가 비독성이고 CPR의 활성화를 가져오는 제제로서 안과용 용액으로서 PS-341의 투여를 포함한다. 또한, 이 방법은 각막에서 염증의 감소, 케라틴 단백질, 특히 케라틴 13 및 케라틴 4의 축적의 감소를 초래하는, PS-341의 투여를 포함한다.
이 접근법의 이점은 매우 많다. 본 발명의 한 가지 중요한 이점은 각막 혼탁의 위험이 있거나 각막 혼탁으로 고통받는 환자의 시력의 개선이다. 다른 이점은 본 발명이 각막 혼탁의 치료에 대한 비-침습적 대안을 제공한다는 것이다.
정의
청구항 및 명세서에서 사용된 용어들은 달리 명시되지 않는다면 아래 제시된 대로 정의된다.
용어 "프로테아솜 조정제"는 대상에서 변경된 프로테아솜 활성 또는 프로테아솜 존재량을 포함하는, 변경된 프로테아솜 기능을 초래하는 임의의 화학 또는 약물 조성물 또는 물질을 말한다.
용어 "각막 혼탁"은 각막 흐림을 가져오는 결막화, 각막 흉터 및 각막 상태, 각막 투명도의 감소, 각막의 증가된 배상 세포, 각막의 증가된 결막 단백질, 각막의 증가된 Muc5ac 단백질 또는 각막의 증가된 케라틴 단백질을 포함한다.
용어 "치료"는 예방, 중증도 또는 진행의 완화, 관해, 또는 치유를 포함하여 질환 상태의 개선을 야기하기 위해 시도하기 위한 의학적 방법을 말한다.
용어 "생체내"는 살아있는 유기체에서 일어나는 과정을 말한다.
여기 사용된 용어 "포유류"는 사람 및 비-사람을 모두 포함하며, 제한은 아니지만 사람, 비-사람 영장류, 개, 고양이, 뮤린, 소, 말 및 돼지를 포함한다.
용어 "투여"는 숙주에 본 개시의 제제를 도입하는 것을 말한다. 제제의 투여의 한 가지 경로는 경구 투여이다. 다른 경로는 정맥내 투여이다. 그러나, 국소, 피하, 복강, 동맥내, 흡입, 질, 직장, 코, 뇌척수액에의 도입, 또는 체내 구획에의 설치와 같은 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다.
용어 "비히클 대조군"은 광범하게는 활성 성분이 투여되는 임의의 비활성 매체를 말하며, 제한은 아니지만 활성 성분을 위한 용매, 담체 또는 바인더를 포함한다.
용어 "유효량"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예를 들어 상태 또는 질환의 증상을 개선하기 위한 양이다.
용어 "제제"는 제약학상 허용되는 염, 제약학상 허용되는 부형제, 제약학상 허용되는 희석제, 제약학상 허용되는 담체 또는 제약학상 허용되는 애쥬번트를 포함하는 제약학적 제제를 포함한다.
이 출원에서 사용된 약자는 다음을 포함한다:
CPR = 26S 구성성 프로테아솜
IPR = 면역프로테아솜
LSCD = 윤부 줄기세포 결핍
K13 = 케라틴 13
K4 = 케라틴 4
CEC = 각막 상피세포
CjEC= 결막 상피세포
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 대로 단수형 "한" 및 "그"는 문맥상 분명히 달리 표시되지 않는다면 복수의 언급을 포함한다는 것이 주지되어야 한다.
본 발명의 방법
본 발명에 의한 각막 혼탁의 치료를 위한 방법이 여기 설명된다. 본 발명의 상기 방법은 프로테아솜 조정제, 예를 들어 PS-341(보르테조밉 또는 Velcade®, Millennium)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 화합물
본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 상업적으로 이용가능한 프로테아솜 조정제를 포함한다. 본 발명의 상업적으로 이용가능한 프로테아솜 조정제는, 제한은 아니지만 MG-132, 보르테조밉(PS-341), 디하이드로에포네마이신, 오프로조밉(ONX-0912),MLN2238, 에폭소미신, 카르필조밉(PR-171), ONX-0914(PR-957), PSI, MG-115, MG-262, AM 114, PI-1840, 키모트립신-유사(CT-L) 억제제, MLN9708, CEP-18770, 글리오톡신, 살리노스포라미드 A(NPI-0052, 마리조밉), 클라스토락타시스틴 β-락톤, 락타시스틴, Ixazomib™, 올레유로페인 또는 이들의 유도체 또는 유사체들을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 제약학적 조성물
본 발명의 방법에서 사용된 프로테아솜 조정제는 제약학적 조성물로 조제될 수 있다. 이들 조성물은, 프로테아솜 조정제 중 하나 이상에 더하여, 제약학상 허용되는 부형제, 담체, 버퍼, 안정제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 재료들을 포함할 수 있다. 이러한 재료들은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체나 다른 재료의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어 국소, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 코, 근육내, 복강내 경로에 의존할 수 있다.
국소 투여를 위한 제약학적 조성물은 안과용 용액, 안과용 젤-형성 용액, 안과용 현탁액, 안과용 연고, 안과용 에멀젼일 수 있다.
경구 투여를 위한 제약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 제약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 페트롤륨, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 식염수 용액, 덱스트로오스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 안내 주사를 위해, 활성 성분은 발열원 무함유이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가진 비경구 허용되는 수성 용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정제, 버퍼, 항산화제, 및/또는 다른 첨가제들이 필요에 따라 포함될 수 있다.
개체에 주어져야 하는 본 발명에 따른 제약학상 유용한 화합물은 바람직하게 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"으로 투여되며, 이것은 개체에 이익을 나타내기에 충분한 양이다. 투여되는 실제 양, 및 투여 속도와 시간 과정은 치료중인 단백질 응집 질환의 성질 및 중증도에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투약량 등에 대한 결정은 일반의 및 다른 의사들의 책임범위 내이며, 전형적으로 치료되어야 하는 장애, 개별 대상의 상태, 송달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요인들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예들은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 조합하여, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
실시예
아래는 본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시형태들의 실시예이다. 이 실시예들은 단지 예시의 목적을 위해 제공되며 어떤 식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 사용된 수치와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험상의 오차 및 편차는 당연히 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는다면 본 기술분야 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 제약학의 종래의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명된다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds, Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)를 참조한다.
방법
LSCD의 토끼 모델
2.5-3kg 무게의 뉴질랜드 토끼를 사용했다. 이들은, National Academy of Sciences에 의해 설명되고 Institute of Laboratory Animal Resources Commission on Life Sciences National Research Council에 의해 공개된 대로, 동물관리지침에 따라서 유지했다. 수술에 의해 토끼에서 LSCD를 유도했다(실시예 1 참조). 간단히 말해서, 토끼를 진정시키고 360°층판상 덩이절제술(lamellar Lumpectomy)을 행한 후, 안과전문의가 안정한 LSCD를 확인할 때까지 3개월 동안 추적했다.
흔적 세포학
셀룰로오스 멤브레인(Millipore, Billerica, MA)이 혼합된 12mm 직경, 0.4μm 기공 크기의 Millicell® 배양 삽입물을 사용하여 각막 상피세포의 샘플을 제조했다. 이 삽입물을 수 초간 각막에 배치한 다음 서서히 제거했다. 다음에, 삽입물을 실온에서 1시간 동안 건조시켰다. 다음에, 삽입물을 10% 중성 완충 포르말린에 하룻밤 고정시키고, 면역조직화학 염색 분석 전 70% 에탄올에 보존했다. 이 멤브레인을 면역형광 분석에서 K13으로 염색했다.
각막 상피세포( CEC ) 및 섬유-혈관 판누스 조직(PT) 샘플링
토끼를 가볍게 진정시키고, 각막을 1분 동안 20% 이소프로필 알코올에 노출시켜 각막 상피를 풀어 각막 상피세포의 샘플을 제조했다. 다음에, 각막을 식염수로 3번 세척하고, 각막 표면으로부터 CEC를 수거하고, 안과의사가 크레센트 나이프 2mm 앵글드 더블 베벨(Katena products, Inc; Denville, NJ)을 사용하여 PT를 절단하고 제거했다. CEC를 PBS에 현탁하고 원심분리한 다음, 공급자(Sigma, St Louis, MO)에 의해 지시된 대로 20mM Tris-HCl pH=7.5; 글리세롤 10% EGTA 1mM; DTT 1mM; 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일을 함유하는 세포용해 버퍼에 재현탁했다. 5초간 소니케이션하여 세포막을 파괴했다. 다음에, 샘플을 -80℃에서 냉동하고, 생화학석 분석을 위해 모든 샘플 - 건강한 세포 및 LSCD의 상피세포 - 을 모집했다.
웨스턴 블롯 분석
Bio-Rad 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 세포용해된 각막 상피세포 샘플 및 수거된 경구 점막 상피세포 샘플로부터의 전체 단백질 중 2μg을 124-20% 구배 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분리했다. 다음에, 단백질을 25mM Tris-HCl(pH=8.3), 192mM 글리신 및 20% 메탄올 중에서 1시간 동안 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 전달했다. 멤브레인을 케라틴 K4 및 K13에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 검침했다. 염소 항-마우스 및 양 항-염소 항체(Bio-Rad, Hercules, CA)를 2차 항체로 사용했다. ECL 플러스(Amersham Bioscience Corp., Piscataway, NJ)를 사용하여 면역-검출을 수행했다. GS-800 이미징 농도계(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 밴드 비중 측정을 수행했다.
면역조직화학
정상 및 LSCD 병소 각막 상피세포 및 경구 점막 상피세포 견본을 10% 중성 완충 포르말린에 고정했다. 가공된 조직을 절편으로 만들고, 슬라이드를 면역형광 염색으로 염색했다. 케라틴 K4 및 K13에 대한 마우스 모노클로날 항체(Santa Cruz Biotechnology CA), 유비퀴틴에 대한 염소 폴리클로날(Santa Cruz Biotechnology)을 단일 및 이중 염색에서 사용했다. Alexa Fluor® 488에 콘쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 K4 및 K13이 검출되었다. 유비퀴틴은 Alexa Fluo® 568 당나귀 항-염소에 콘쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 핵 염색을 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Thermo Scientific, Waltham, MA)이 사용되었다. FITC 큐브 및 트리플 밴드 큐브를 가진 Nikon 400 형광 현미경을 사용하여 단백질 발현의 수준을 시험했고 FITC, Texas Rex 및 DAPI를 검출했다. Adobe Photoshop CS5를 사용하여 그림 가공 및 분석을 수행했다.
경구 점막 상피세포 분리, 세포 배양 및 프로테아솜 억제제 치료
6mm 직경 일회용 펀치 생검 기구(Biopunch HealthLink, Jacksonville, FL)를 사용하여 진정된 동물에 대해 경구 점막 생검을 수행했다. 생검 견본을 멸균 식염수로 세척하고 포비돈 요오드에서 살균하고 멸균 식염수로 다시 세척한 다음 DMEM 세포 배양 배지에서 세척했다. 다음에, 이전에 설명된 대로[21], 이 견본을 사용하여 경구 점막 상피세포를 분리했다. 간단히 말해서, 다진 견본을 37℃에서 1시간 동안 디스파아제 I과 함께 인큐베이션했다(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). 고유판으로부터 상피를 분리하고 트립신 분해하여 상피세포를 분리했다. 다음에, 분리된 1차 상피세포를 Transwell 삽입물(Corning Inc.) 위에 5 x 105 밀도로 파종하고, 미토마이신 C(MMC)-치료된 NIH/3T3 피더 세포와 함께 배양했다. 세포 배양 4일 후, 배지를 교환하고 EGF를 10 ng/mL 최종 농도로 첨가했다. 세포 배양 배지는 2일마다 교환했다. 세포 배양 2주 후 세포가 성장하여 유사 다층 조직을 형성했을 때, 프로테아솜 억제제(PS-341, 보르테조밉/Velcade®, Millennium Pharmaceutical, 고도 특이적 프로테아솜 억제제)를 24h 및 72h 동안 2.5, 5, 10, 20, 및 50 nM으로 세포 배양 배지에 첨가하여 프로테아솜 억제 또는 프로테아솜 활성화를 달성했다.
프로테아솜 활성
샘플 균질화물로부터 전체 단백질의 1μg을 사용했다. 반응 혼합물은 50mM Tris-HCl pH=8, 1mM DTT, 및 40μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC(Sigma Aldrich) 기질(키모트립신-유사 활성을 위해) 또는 40μM Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC(트립신-유사 활성을 위해) 또는 100uM Ac-Gly-Pro-Leu-Asp-AMC(Sigma Aldrich)(카스파아제-유사 활성을 위해)을 함유했다. 5mM ATP를 반응 혼합물에 첨가하여 20S 프로테아솜 활성으로부터 26S 프로테아솜 활성을 구분했다. 다음에, 혼합물을 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 100μM 모노클로로아세테이트 및 30mM 나트륨 아세테이트 pH=4.3을 첨가하여 중단시켰다. Perkin Elmer LS 30 분광형광계를 사용하여 AMC의 방출을 측정함으로써 형광을 결정했다.
통계
적어도 3번의 분리된 실험으로부터 데이터를 얻었다. 막대는 평균값±SEM을 표시한다. P 값은 원-웨이 ANOVA 및 다중 그룹 비교를 위한 스튜던트-뉴먼 쿨스에 의해 결정된다(Sigma-Stat softdish, San Francisco, CA). 통계적 유의성은 p= 또는 < 내지 0.05로 설정된다. 막대 그래프는 평균±SEM, n=3-4로서 표시되었다.
실시예 1: LSCD -유도 혼탁 모델
우리의 LSCD-유도 혼탁 모델은 윤부 줄기세포의 전체 제거를 달성하여 안정한 LSCD를 얻었다. 실험 프로토콜은 다음의 일정에 따라서 수행되었다: 1) 마취제의 투여. 2) 층판상 덩이절제술을 수행하여 LSCD의 생성. 3) 병리현상이 안정될 때까지 3개월 동안 추적. 4) 1개월 동안 72시간마다 미리-결정된 최적 용량의 PS-341의 국소 투여(도 1)에 의해 PS-341 치료제의 투여. 우리의 시험관내 연구에 기초하여, PS-341 최적 용량 1방울을 1개월 동안 72시간마다 투여했다. 각막은 계획된 추적관찰 일정으로 통상적으로 검사되었다. 5) 홍채 디테일의 시인에 기초하여 각막 혼탁의 등급을 결정하고 점수를 매겼다: 등급 0: 깨끗한 각막 홍채 디테일이 보임; 등급 1: 경미한 혼탁 또렷한 홍채 디테일; 등급 2: 중간도 혼탁 홍채가 잘 보이지 않음; 등급 3: 심한 혼탁 홍채가 보이지 않음 그리고 각막이 완전히 불투명함. 6) 토끼를 죽이고 각막 상피세포 및 섬유-혈관 판누스 조직을 포함하는 각막 조직을 수거하여 조직학적 분석한 후 PS-341의 효과의 점수를 매겼다(K4/K13 염색). PS-341의 국소 적용에 각막을 노출시켜 중심 각막의 PS-341 치료를 수행했다. 관상톱을 사용하여 PS-341 노출을 중심 각막에만 제한했으며, 이로써 내인성 K13 및 결막 상피 완전성에는 아무 영향 없이 오직 변형된 K13 및/또는 K4만이 처리된다(도 1).
실시예 2: LSCD -유도 혼탁 모델에서는 케라틴 13 및 케라틴 4로 중심 각막이 덮인다
LSCD-유도 혼탁 모델의 조직병리학 검사의 결과는 정상 각막은 결막쪽에서는 K13 양성으로만 염색된다는 것을 나타냈으며, 도 2a 및 2b에서 조직 절편의 상부의 세포질 세포 염색에 의해 나타낸 대로, K13은 LSCD 병소 각막의 중심 각막을 뚜렷하게 덮었다. LSCD 병소 각막의 결막-윤부 영역 및 중심 각막에서는 K4가 또한 검출되었다(데이터는 나타내지 않음). 이에 더하여, LSCD 병소 각막으로부터 수거된 판누스 조직은 K4에 대해 양성인 것으로 판명되었다(데이터는 나타내지 않음). 이 결과는 중심 각막이 LSCD를 가진 동물로부터의 각막에서는 K13 및 K4로 덮이지만 정상 각막에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 건강한 각막 상피세포(H-CEC)와 비교하여 병소 각막 상피세포(D-CEC)에서 추가의 고분자량 밴드와 함께 K13 및 K4 축적이 있었으며, 이것은 K13 및 K4 이식 후 변형을 시사하고, K13의 유비퀴틴화가 병소 상피에서 CPR 장애와 관련된다는 것을 암시한다(도 3a-3c). 또한, LSCD 병소 각막으로부터 수거된 판누스 조직(PT)은 증가된 K13 및 K4를 증명했다(도 3d-3f).
실시예 3: CPR 프로테아솜 활성은 LSCD 각막 상피에서 감소된다
LSCD 토끼로부터 수집된 각막 상피세포에 대해 이루어진 실험은 모든 CPR 활성이 각막 병소 상피(DE)에서 유의하게 감소되었던 것을 나타냈다(도 4).
실시예 4: K4 및 K13은 CPR에 대한 기질이다
K13 축적에서 CPR 기능장애의 역할을 더 입증하기 위해, 결막 상피세포와 유사한 K4/K13을 발현하는 토끼 경구 점막 상피세포(OMECS)를 배양하고, 세포를 수거하기 전에 24시간 동안 10 및 50 nM 최종 농도를 사용하여 고 용량으로 프로테아솜 억제제 PS-341(보르테조밉/Velcade®)로 치료했다. 도 5는 OMECS가 고 용량의 CPR 억제제로 치료되었을 때 키모트립신-유사 프로테아솜 활성이 감소되고, K4 및 K13이 변형되어 유의하게 축적되었음을 나타낸다. 더욱이, 프로테아솜 풀다운 분획은 K13에 대해 양성으로 염색되었다(데이터는 나타내지 않음). 이들 결과는 K4와 K13이 CPR에 대한 기질임을 증명했다.
프로테아솜에 의해 분해될 수 있는 모든 단백질이 유비퀴틴으로 택 표시되므로, 우리는 PS-341로 치료된 OMECS에서 케라틴이 유비퀴틴화되었는지 분석하기 위해 이중 염색 실험을 수행했다(데이터는 나타내지 않음). 유비퀴틴과 함께 K4 및 K13의 재현가능한 공-편재화가 있었으며, 이것은 K4와 K13이 모두 유비퀴틴화된 것을 시사한다.
실시예 5: 프로테아솜 억제제의 비 -독성 용량으로의 치료는 프로테아솜 활성의 반등 및 K13 및 K4 수준의 감소를 가져온다
프로테아솜 억제제 치료의 유익한 효과는, 배양된 토끼 경구 점막 상피세포에서 증명된 대로(도 6), 이 약물의 가역성과 PS-341 치료 후 72시간에 프로테아솜 활성의 반등에 있다. 경구 점막 상피세포는 2.5, 5, 10, 20 및 50 nM으로 24시간 및 72시간 동안 PS-341로 치료되었다. 24시간째에 모든 PS-341 용량이 CPR 키모트립신-유사 활성 감소를 초래한다(각각 9%, -41%, -59%, -84% 및 -86%). 72시간째에는 2.5 nM, 5 nM 및 10 nM이 프로테아솜 활성을 증가시킨 용량이었다. 2.5 nM은 프로테아솜 키모트립신-유사 활성에 가장 높은 증가를 나타냈으며, 이것은 치료되지 않은 세포보다 61% 더 높았다. 또한, 2.5 nM의 PS-341로의 치료는 최초 24시간 내에 IκB를 안정화함으로써 염증을 감소시켰고, 이것은 차례로 NFκB 활성화를 차단했으며(도 7a), 결과적으로 PS-341-치료된 OMECS에서 K13 및 K4 수준을 감소시켰다(도 7b 및 7c). 72시간 동안 2.5 nM의 PS-341로 치료된 세포의 웨스턴 블롯 분석은 유의한 폴리유비퀴틴화된 단백질 축적을 나타내지 않았고(도 7d), 포스포-Erk 수준에도 유의한 변화가 없었는데(도 7e), 이것은 세포자살 신호의 결여를 암시하며, 이 치료가 이런 매우 낮은 용량에서 독성 효과를 야기하기 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 저 용량의 프로테아솜 억제제로의 세포의 치료는 반등된 프로테아솜 활성의 연장된 증가를 가져옴으로써 케라틴 단백질의 분해를 초래한다.
본 발명은 바람직한 실시형태 및 다양한 대안의 실시형태를 참조하여 구체적으로 제시 및 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 형태 및 상세한 내용에 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌, 발행된 특허 및 특허출원은 모든 취지로서 그 전체가 참고로 여기 포함된다.
인용된 참고문헌들:
1. Bardag-Gorce F, Riley NE, Nan L, Montgomery RO, Li J, French BA, Lue YH, French SW. The proteasome inhibitor, PS-341 causes cytokeratin aggresome formation. Exp Mol Pathol. 2004; 76(1):9-16.
2. Bardag-Gorce F, Oliva J, Wood A, Hoft R, Pan D, Thropay J, Makalinao A, French SW, Niihara Y. Carrier-free cultured autologous oral mucosa epithelial cell sheet (CAOMECS) for corneal epithelium reconstruction: a histological study. Ocul Surf. 2015; 13(2):150-63
3. Lin CT, Hu FR, Kuo KT, Chen YM, Chu HS, Lin YH, Chen WL. The different effects of early and late bevacizumab (Avastin) injection on inhibiting corneal neovascularization and conjunctivalization in rabbit limbal insufficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010.
4. Poli M, Burillon C, Auxenfans C, Rovere MR, Damour O. Immuno-cytochemical Diagnosis of Limbal Stem Cell Deficiency: Comparative Analysis of Current Corneal and Conjunctival Biomarkers. Cornea. 2015; 34(7):817-23.

Claims (50)

  1. 프로테아솜 조정제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 각막 혼탁을 치료하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 대상은 윤부 줄기세포 결핍(LSCD)에 의해 야기된 각막 혼탁을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 대상은 외상으로 인한 각막 손상, 눈물의 감소된 생성 또는 감소된 눈물 수준, 눈 감염, 각막염, 눈의 염증 또는 각막의 염증, 콘택트렌즈의 사용으로 인한 각막 손상, 자외선 노출로 인한 각막 손상, 눈의 외상으로부터의 눈의 흉터, 화상으로 인한 눈의 흉터 및 화학적 자극으로 인한 각막 손상으로 구성되는 군으로부터 선택된 상태에 의해 야기된 각막 혼탁을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341(보르테조밉 또는 Velcade® Millennium)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 MG-132, 디하이드로에포네마이신, 오프로조밉(ONX-0912), MLN2238, 에폭소미신, 카르필조밉(PR-171), ONX-0914(PR-957), PSI, MG-115, MG-262, AM 114, PI-1840, 키모트립신-유사(CT-L) 조정제, MLN9708, CEP-18770, 글리오톡신, 살리노스포라미드 A(NPI-0052, 마리조밉), 클라스토-락타시스틴 β-락톤, 락타시스틴, 및 이들의 유도체 또는 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 올레유로페인인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 감소된 각막 혼탁을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 개선된 시력을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전 대상에서 26S 구성성 프로테아솜 활성과 비교하여 치료 후에 대상에서 증가된 26S 구성성 프로테아솜 활성을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전 대상에서 26S 구성성 프로테아솜 활성과 비교하여 치료 후 72시간에 대상의 각막에서 증가된 26S 구성성 프로테아솜 활성을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 전 대상에서 면역프로테아솜 활성과 비교하여 치료 후에 대상에서 감소된 면역프로테아솜 활성을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상의 각막에서 케라틴 단백질의 감소된 수준을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상의 각막에서 케라틴 13의 감소된 수준을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상의 각막에서 케라틴 4의 감소된 수준을 가져오는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 프로테아솜 조정제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 각막에서 케라틴 단백질 수준을 감소시키는 방법.
  16. 프로테아솜 조정제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 각막에서 26S 구성성 프로테아솜 활성을 증가시키는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 안과용 제제로서 조제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 안과용 제제는 안과용 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 안과용 제제는 안과용 현탁액인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18 항에 있어서, 안과용 제제는 안과용 연고인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18 항에 있어서, 안과용 제제는 안과용 에멀젼인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서, 안과용 제제는 안과용 젤인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 안내 주사로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, 체중 kg당 0.125mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, 체중 kg당 0.01 내지 0.5 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 72시간마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 48시간마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 24 내지 48시간마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 24시간 미만마다 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 비-독성 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 18 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, PS-341은 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 18 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, PS-341은 72시간마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 18 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, PS-341은 48시간마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 18 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, PS-341은 24시간마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 18 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, PS-341은 24시간 미만마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 프로테아솜 조정제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 각막 혼탁을 예방하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 대상은 외상으로 인한 각막 손상, 눈물의 감소된 생성 또는 감소된 눈물 수준, 눈 감염, 각막염, 눈의 염증 또는 각막의 염증, 콘택트렌즈의 사용으로 인한 각막 손상, 자외선 노출로 인한 각막 손상, 눈의 외상으로부터의 눈의 흉터, 화상으로 인한 눈의 흉터 및 화학적 자극으로 인한 각막 손상으로 구성되는 군으로부터 선택된 상태에 의해 야기된 각막 혼탁을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 PS-341(보르테조밉 또는 Velcade™)인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 38 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 MG-132, 디하이드로에포네마이신, 오프로조밉(ONX-0912), MLN2238, 에폭소미신, 카르필조밉(PR-171), ONX-0914(PR-957), PSI, MG-115, MG-262, AM 114, PI-1840, 키모트립신-유사(CT-L) 조정제, MLN9708, CEP-18770, 글리오톡신, 살리노스포라미드 A(NPI-0052, 마리조밉), 클라스토-락타시스틴 β-락톤, 락타시스틴, 및 이들의 유도체 또는 유사체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 38 항에 있어서, 프로테아솜 조정제는 올레유로페인인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, PS-341은 안과용 제제로서 조제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, PS-341은 안과용 용액으로서 조제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43 항에 있어서, PS-341은 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 43 항에 있어서, PS-341은 24 내지 72시간마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 43 항에 있어서, PS-341은 24시간 미만마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 프로테아솜 조정제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 각막 혼탁을 치료하는 방법으로서, 여기서 프로테아솜 조정제는 PS-341이고, 프로테아솜 조정제는 안과용 제제로서 조제되며, PS-341은 24 내지 72시간마다 체중 kg당 0.00125 내지 0.0125 mg/mL의 용량으로 투여되고, 상기 방법은 대상의 각막에서 케라틴 단백질의 감소된 수준을 가져오는 방법.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상은 토끼인 것을 특징으로 하는 방법.
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